La présente invention concerne des cristaux de P-nicoti- namide adénine dinucléotide de type acide libre et un procédé de leur préparation. Le P-nicotinamide adénine dinucléotide (appelé ci-après "NAD") est présent comme coenzyme de diverses oxydoréductases dans presque tous les tissus des organismes vivants et il joue un rôle très important dans le métabolisme énergétique, la biosynthèse, etc. d'un organisme vivant. Donc, ces dernières années, les besoins en ADN se sont accrus non seulement pour l'utiliser comme réactif de recherche en biochimie et en physiologie, mais également comme composé chimique indispensable pour le diagnostic clinique enzymatique comme facteur de mesure de.l'activité enzymatique et de la concen- tration d'un substrat. A ce jour, pour obtenir le NAD sous une forme solide, on l'isolait d'un extrait de levure ou d'un bouillon de culture d'un micro-organisme selon divers procédés d'isolement tels que la chromatographie d'échange d'ions et on soumettait la solution de NAD obtenue à un traitement, tel qu'une lyophilisation ou une précipitation avec un solvant organique, suivi d'une séparation et d'un séchage du précipité. Le NAD solide ainsi obtenu est amorphe et très hygroscopique et il présente une déliquescence à l'air. Dans de nombreux cas, ce NAD amorphe contient encore des traces d'impuretés. Egalement, le NAD amorphe est instable et une diminution de la pureté par décomposition thermique lors du stockage et du transport est inévitable. On sait qu'un inhibiteur compétitif d'une enzyme est présent dans les fragments de décomposition thermique avec des traces d'autres impuretés. Il est donc bien connu que l'emploi en analyse enzymatique d'un tel NAD de faible pureté ne conduit qu'à des résultats entachés d'une grande erreur; voir par exemple Dalziel, J. Biol. Chem., Vol. 238, 1538 (1963). La cristallisation de NAD de type acide libre a été indiquée par A.D. Winer dans J. Biol. Chem., Vol. 239, PC3598 (1964). Cependant, ce procédé utilise une quantité importante d'un solvant et nécessite de plus une température très basse de -15'C. Les para- mètres standards de ce procédé ne sont pas définis et il n'est pas reproductible. Egalement, les cristaux décrits sont des cristaux de 249 1 928 NAD trihydraté sous forme d'aiguilles minces longues ou de prismes plats et on indique que le NAD cristallin prend un caractère amorphe dans l'humidité environnante et a une mauvaise stabilité. De plus, le procédé a comme inconvénient que le produit purifié obtenu par emploi d'un solvant contient une petite quantité du solvant insépa- rable. Egalement, l'emploi d'une quantité'importante de solvant est inéconomique et le procédé n'a pas d'importance pratique comme procédé industriel. On conna!t également les cristaux d'un sel métallique de NAD tel que le sel de lithium. Cependant, lorsqu'on désire le NAD sous forme de l'acide libre, on doit traiter à nouveau le sel métal- lique avec une résine échangeuse d'ions et, par conséquent, la puri- fication du NAD amorphe selon ce procédé a pour inconvénient d'accroître les stades opératoires. L'invention a pour objet de nouveaux cristaux de NAD de type acidelibre; du NAD cristallin ayant une grande pureté et une grande stabilité; du NAD amorphe ayant une grande pureté; et un procédé pour préparer du NAD très pur de façon simple avec un rendement élevé. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit. L'invention concerne un P-nicotinamide adénine dinucléotide tétrahydraté cristallin appartenant au système triclinique et au groupe spatial Pl ou Pl et ayant les constantes réticulaires suivantes a = 8,861 A, b = 11,181 ', c = 8,630 A, a = 90,82e, 103,400 et Y = 109,71 . Pour préparer les cristaux, on refroidit une solution aqueuse de NAD amorphe ayant une concentration de 20 à 60% p/v, à une température de O à 200C pour cristalliser le NAD tétrahydraté. L'opération esttrès simple et on obtient de façon économique avec des rendements élevés des cristaux de NAD ayant une grande pureté et une excellente stabilité. Les cristaux de l'invention sont très utiles pour obtenir du NAD amorphe très pur. 24 9 192 8 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre de plusieurs exemples de réalisation et en se référant aux dessins annexes sur lesquels: - la figure 1 est une microphotographie de NAD cristallin de l'invention grossi 400 fois; - la figure 2 est un spectre de diffraction des rayons X du NAD amorphe; - la figure 3 est un spectre de diffraction des rayons X du NAD cristallin de l'invention; - la figure 4 est un spectre d'absorption infrarouge selon la méthode de la pastille de KBr du NAD cristallin de l'invention, le pourcentage de transmission étant représenté en ordonnées et le nombre d'onde (cm) étant représenté en abscisses; - la figure 5 est un chromatogramme liquide sur colonne haute performance d'une poudre de NAD amorphe purifié obtenue selon un procédé de purification habituel dans lequel on ajoute du méthanol à une solution aqueuse de NAD pour le précipiter, le temps de rétention (min) étant représenté en abscisses; et - la figure 6 est un chromatogramme liquide sur colonne haute performance du NAD cristallin de l'invention, le temps de rétention (min) étant représenté en abscisses. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. On emploie comme matière de départ pour préparer le NAD cristallin de l'invention du NAD amorphe que l'on a préparé selon un procédé généralement connu, tel que la précipitation, à partir d'une solution aqueuse de NAD avec un solvant organique suivi d'une séparation et d'un séchage ou d'une lyophilisation de la solution aqueuse. Dans de nombreux cas, un tel NAD amorphe contient des impuretés. On peut éliminer les impuretés selon des procédés connus quelconques. Dans l'invention, il est souhaitable que la pureté enzymatique du NAD amorphe soit d'au moins 905%, car ce NAD cristallise facilement et le rendement de la cristallisation augmente. De préfé- rence, pour purifier le NAD amorphe, on traite une solution aqueuse de NAD amorphe avec une résine échangeuse d'anions poreuse faiblement basique transformée en la forme acétate, carbonate, phosphate, 249 1928 chlorhydrate ou 011 (base libre). Dans un mode de réalisation préférable, pour purifier le NAD amorphe, on fait passer une solution - aqueuse de NAD amorphe à travers une colonne d'une résine échangeuse d'anions très poreuse faiblement basique transformée en la forme acétate, telle que le Diaion WA 30 (fabriqué par Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), l'Amberlite IRA-93 (fabriquéepar Rohm & laas Co.), le Dowex HWA-1 (fabriqué par Dow Chemical Co.) ou la Duolite A-368PR (fabriquée par Diamond Shamrock Corp.). Comme le NAD est également adsorbé par cette résine échangeuse d'anions, on utilise de préférence la résine échangeuse d'anions en la quantité minimale nécessaire pour éliminer les impuretés. Les cristaux de NAD de l'invention obtenus à partir d'une solution aqueuse de NAD amorphe purifié selon ce procédé sont très purs et sont excellents comme germes de cristal- lisation du NAD. Lors de la cristallisation, il est nécessaire, pour produire les cristaux de l'invention, que la concentration d'une solution aqueuse de NAD soit comprise entre 20 et 60%. p/v et de préférence entre 40-et 505% p/v. Lorsque la concentration est infé- rieure à 207% p/v, la cristallisation se produit difficilement et le rendement est également très faible. Lorsque la concentration est supérieure à 607. p/v, la solution aqueuse est difficile à manipuler car elle est très visqueuse. On ajuste la concentration dans la gamme cidessus avant ou après la purification du NAD. On refroidit la solution aqueuse à une température de O à 200C, de préférence de 2 à 8VC pour la cristallisation. La cristallisation s'achève en 1 à 2 jours lorsqu'on laisse reposer la solution aqueuse et en plusieurs heures lorsqu'on agite doucement la solution aqueuse pour accélérer la croissance des cristaux. Il est utile d'employer comme germes, lors de la cristal- lisation, des cristaux de NAD préparés séparément. Dans le cas o on effectue la cristallisation en utilisant des germes, on peut obtenir le NAD cristallin désiré par refroidissement d'une solution aqueuse ayant une concentration de 20 à 607. p/v de NAD à une température de O à 200C sans soumettre le NAD à la purification au moyen d'une résine échangeuse d'ions telle que la résine échangeuse d'ions fortement poreuse précitée. Bien qu'il soit possible d'obtenir les cristaux désirés même lorsque la pureté enzymatique du NAD amorphe est faible, on emploie de préférence un NAD amorphe ayant une pureté enzymatique au moins égale à 90%7. et en particulier au moins égale à 93%, car la cristallisation se produit facilement et le rendement peut être accru. On sépare de façon habituelle les cristaux produits. Selon l'invention, on obtient les cristaux avec un rendement d'environ % ou plus. Les cristaux de NAD de l'invention ont les propriétés suivantes. Analyse pour C21H27014N7P2,4H20 (P.M.: 735,48): Théorique (%): C 34,29, H 4,80, N 13,33, P 8,42 Trouvée (%): C 34,57, H 4,73, N 13,28, P 8,40 Teneur en eau selon la méthode de Karl Fisher: 9,4% (valeur théorique: 9,8%). Système critallin: système triclinique Groupe spatial: Pi ou P1 Constantes réticulaires: a = 8,861 A o b - 11,181 A c = 8,630 A a = 90, 82 P 103,40 = 109,71 V = 779,01 A Densité: trouvée p = 1,550 théorique p = 1,567 (calculée pour Z = 1) Une photographie des cristaux de l'invention observés avec un microscope ayant un grossissement de 100 fois est illustrée par la figure 1. Egalement, le spectre de diffraction des rayons X et le spectre infrarouge des cristaux de l'invention sont respecti- vement illustrés par les figures 3 et 4. La figure 2 est un spectre de diffraction des rayons X du NAD amorphe. Le NAD cristallin de type acide libre ainsi obtenu ne présente pas les defauts d'un NADamorphe classique. Le NAD cristallin de l'invention est constitué de cristaux ayant 4 molécules d'eau de cristallisation et il est stable, non hygroscopique et fluide. Il a également une excellente stabilité au stockage, n'a pas d'odeur, a un bel aspect et par conséquent son intérêt commercial est grand. Les cristaux de l'invention conservent leur charpente cristalline, même lorsqu'on les soumet à une déshydratation forcée et on retrouve facilement les cristaux d'origine par réhydratation. En ce qui concerne la stabilité des cristaux de l'invention, il ne se produit absolument pas de diminution de la pureté enzymatique, même lorsqu'on maintient les cristaux par exemple à 370C pendant 24 jours, tandis que, dans les mêmes conditions, le NAD amorphe présente une diminution de la pureté d'environ 10% et perd sa pureté au cours du temps. Selon l'analyse enzymatique, le NAD cristallin de l'invention est du P-NAD pur à 100% et on n'a pas observé l'inclusion d'inhibiteurs enzymatiques tels que l'inhibiteur de la LDH (lactate- déshydrogénase). Selon la chromatographie liquide, un P-NAD du commerce contient des traces d'impuretés en particulier d'a-NAD et d'ADP-ribose (adénosine 5-diphosphate-ribose), mais ces impuretés n'ont pas été détectées dans le NAD cristallin de l'invention. La figure 5 est un chromato- gramme liquide haute performance d'un NAD amorphe du commerce que l'on a purifié par précipitation par addition de méthanol à partir d'une solution aqueuse de NAD amorphe traitée avec une résine échan- geuse d'ions et la figure 6 est un chromatogramme liquide haute performance du NAD cristallin de l'invention. Dans la figure 5, A est un pic d'AMP (adénosine 5-monophosphate) et B est un pic d'ADP-ribose. On détecte de 1'AMP et de l'ADP-ribose dans la préparation du commerce, mais on n'en détecte pas dans le NAD cristallin de l'invention. Les conditions de la chromatographie liquide haute performance sont les suivantes: Colonne: /u-Bondapak NH2 (4 mm de diamètre intérieur et 30 cm de longueur) Solvant: NH 4H2P4 0,1 M (pH 3,5) Débit: 2,0 ml/min Vitesse d'enregistrement: 1,0 cm/min Détection: UV 254 nm, 0,5 de l'échelle totale des unités d'absorbance Concentration de l'échantillon du NAD: 1,0 mg/ml Le NAD cristallin de l'invention est très pur, environ à 100%, et il ne contient pas d'impuretés provoquant des erreurs dans l'analyse enzymatique. Egalement, il est stable au cours du stockage 2 4 91 92 8 ou du transport et il est inutile de maintenir la température basse nécessaire dans le cas du NAD classique. De plus, le procédé de l'invention a pour avantage,en ce qui concerne la production indus- trielle, qu'il est inutile d'effectuer une opération classique de purification avec des additions répétées d'une quantité importante d'un solvant et qu'on peut obtenir les cristaux à partir d'une solution aqueuse de NAD sans emploi de solvant. Lorsqu'on désire du NAD amorphe très pur, on peut facilement pour l'obtenir dissoudre le NAD cristallin de l'invention dans de l'eau puis soumettre la solution aqueuse obtenue à une lyo- philisation ou ajouter la solution aqueuse à un alcool tel que le méthanol pour précipiter le NAD. Par exemple, on dissout les cristaux de l'invention dans de l'eau chaude pour préparer une solution aqueuse ayant une concentration de 10 à 50%L p/v en NAD et on refroidit immé- diatement la solution aqueuse à la température ordinaire, par exemple entre 18 et 250C, pour éviter la décomposition thermique du NAD. On lyophilise ensuite la solution aqueuse ou on la verse dans un alcool en agitant pour précipiter le NAD qu'on sépare et qu'on sèche. Il ressort de la description précédente du NAD cristallin et du procédé de sa préparation que le procédé de préparation du NAD amorphe utilisant les cristaux de l'invention est très supérieur à un procédé classique en ce qu'il permet d'obtenir de façon simple des produits très purs. L'invention concerne donc également un procédé pour purifier le NAD amorphe. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 On purifie par chromatographie d'échange d'ions un extrait contenant du NAD obtenu à partir des cellules d'un micro- organisme et on ajoute la solution aqueuse de NAD obtenue à 9 fois son volume de méthanol pour précipiter le NAD. On filtre le précipité, on le lave avec une petite quantité de méthanol et on le sèche sous pression réduite pour obtenir une poudre de NAD amorphe purifié. La pureté enzymatique de la poudre est de 92%. On utilise comme matière de départ la poudre de NAD amorphe ainsi obtenue. 2 4 9 19 2 8 On fait passer une solution aqueuse de 100 g de la poudre dissous dans 200 ml d'eau, à travers une colonne de 1,5 cm de diamètre - intérieur garnie de 20 ml d'une résine échangeuse d'anions très poreuse faiblement basique transformée en la forme acétate (commer- cialisée sous le nom de "Diaion WA 30" fabriquée par Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) à partir du sommet de la colonne à une vitesse spatiale de 1 h Ensuite, on fait passer à travers la colonne 40 ml d'eau désionisée et on recueille 220 ml de la fraction contenant le NAD dans l'éluat On refroidit la fraction à 50C et on la laisse reposer à cette température. Après 16 h. des cristaux servant de germes cristallins commencent à apparaître au fond du récipient et on agite ensuite doucement la fraction à 50C pendant 5 h pour former des cristaux. On sépare les cristaux par filtration en s'aidant du vide, on lave avec une petite quantité d'eau et on sèche sous vide pour obtenir 90 g de NAD tétrahydraté cristallin. La pureté enzymatique des cristaux est de 100% (pour la forme sèche). Exemple 2 On purifie par chromatographie d'échange d'ions un extrait contenant du NAD obtenu à partir des cellules d'un micro-organisme et on lyophilise l'éluat pour obtenir du NAD amorphe purifié ayant une pureté enzymatique de 91%. On répète le mode opératoire de l'exemple 1, si ce n'est qu'on emploie une solution aqueuse de 500 g du NAD amorphe ci-dessus dissous dans 1 litre d'eau et l'Amberlite IRA-93 (fabriquée par Rohm & Haas Co.) comme résine échangeuse d'ions pour obtenir 455 g de NAD tétrahydraté cristallin ayant une pureté enzymatique de 100%. Exemple 3 Dans 200 ml d'eau, on dissout 100 g d'une poudre de NAD amorphe (pureté enzymatique 93,5%) préparée de la même façon que dans l'exemple 1. On ajoute à la solution aqueuse obtenue 5 mg de NAD cristallin obtenu dans l'exemple 1 comme germes de cristallisa- tion. On agite ensuite la solution aqueuse à 5C pendant 6 h, on sépare les cristaux obtenus et on les sèche. Le rendement du NAD cristallin est de 91,5 g et la pureté enzymatique est de 99,8%. Exemple 4 On répète le mode opératoire de l'exemple 3, si ce n'est qu'on utilise une solution aqueuse à 507. p/v de NAD amorphe obtenue par dissolution dans l'eau de 39 g de NAO amorphe ayant une pureté enzymatique de 92% pour obtenir 35 g de NAD cristallin. Les cristaux ainsi obtenus contiennent 9,4% en poids d'eau et 90,5X en poids de NAD. On dissout 35 g des cristaux dans 100 ml d'eau distillée à 460C. Immédiatement après la dissolution, on refroidit la solution aqueuse à 20C. On filtre la solution aqueuse sur une membrane filtrante (commercialisée sous le nom de "Millipore Filter" fabriquée par Millipore Corporation) ayant une taille des pores de 0,22 /um et on lyophilise pour obtenir 32 g de NAD amorphe très pur. La poudre de NAD amorphe ainsi obtenue contient 2,.87 en poids d'eau et 97% en poids de NAD. La pureté enzymatique de la poudre est de 99,8% (pour la forme sèche). Exemple 5 Dans 200 ml d'eau distillée à 460C, on dissout 26 g du NAD cristallin obtenu dans l'exemple 4 etimmédiatement après la dissolution, on refroidit la solution aqueuse à 200C. On filtre ensuite la solution aqueuse sur une membrane filtrante ayant des pores de 022/um et on ajoute le filtrat à 1,8 litre de méthanol en agitant. On recueille le précipité obtenu avec un appareil de décantation, on lave avec une petite quantité de méthanol et on sèche sous pression réduite pour obtenir 23 g de NAD amorphe très pur. La poudre de NAD amorphe ainsi obtenue contient 95,07. en poids de NAD et 3,07% en poids d'eau. La pureté enzymatique de la poudre est de 97,9% (pour la forme sèche). Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. P-Nicotinamide adénine dinucléotide tétrahydraté cristallin, caractérisé en ce qu'il appartient au système triclinique, au groupe spatial Pi ou P1 et qu'il a les donstantes réticulaires O 0 O suivantes: a = 8,861 A, b = 11,181 A, c = 8,630 A, = 90,82, = 103,40 et - = 109,71 . 2. Procédé pour préparer du P-nicotinamide adénine dinucléotide cristallin, caractérisé en ce qu'il consiste à refroidir une solution aqueuse ayant une concentration de 20 à 60%5 p/v de P-nicotinamide adénine dinucléotide amorphe à une température de O à 20 C. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le enicotinamide adénine dinucléotide amorphe a une pureté enzymatique d'au moins 90%. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le Pnicotinamide adénine dinucléotide amorphe a été purifié par traitement avec une résine échangeuse d'anions très poreuse faible- ment basique de type acétate. 5. Procéddé pour préparer un P-nicotinamide adénine dinucléotide amorphe très pur, caractérisé en ce qu'il consiste à dissoudre dans l'eau du P-nicotinamide adénine dinucléotide tétra- hydratd cristallin et à récupérer le P-nicotinamide adénine dinucléotide sous une forme solide soit par lyophilisation, soit par précipitation avec un alcool puis à séparer et à sécher le précipité.