OS i 2073429 La présente intention concerne des vaccins contre la diarrhée virale du veau, ainsi que les procédés de préparation de ces vaccins et les méthodes de leur emploi. L'invention concerne en particulier un procédé de 5 préparation de vaccins contre la diarrhée du veau par passage du virus de la diarrhée sur culture de tissu, qui peut être entre autres du tissu d'origine bovine ou porcine. L'invention concerne également un procédé polir immuniser des veaux nouveau-nés contre la diarrhée des veaux par 10 administration aux vaches pleines, préalablement à la mise bas, d'un vaccin préparé par passage répété jusqu'à 200 fois du virus de la diarrhée du ve&u sur culture de tissu." L'invention concerne en outre un procédé d'immunisation de veaux nouveau-nés contre la diarrhée des veaux par admi-15 nistration d'un vaccin préppré par passage, répété jusqu'à envircn 200 fois, du virus de la diarrhée du veau sur culture de-tissu. L'invention concerne également les vaccins préparés par les procédés suivant l'invention. La diarrhée des veaux nouveau-nés, encore appelée 20 entérite des veaux, est une maladie grave et contagieuse des veaux nouveau-nés. On trouve dans la littérature de nombreux rapports considérant l'E. coli comme agent responsable de la diarrhée des veaux nouveau-nés. Cette maladie ne peut cependant être reproduite par des E. coli isolés de cas de diarrhée néo-natale. 25 Smith et Halls(J.Path.and Bact.93 (1967),pages 499 à 529) ont en outre conclu de l'étude de 127 cas de diarrhée de veaux nourris au colostrum, répartis dans diverses parties du monde et sans relation épidémiologique entre eux, que dans 120 cas l'E. coli n'avait joué aucun rôle étiologique. 30 Plus récemment, Mebus et al.,(University of Nebraska Research Bulletin 233 de mars 1969) sont parvenus à établir que la diarrhée des veaux nouveau-nés est une entité clinique provoquée par un virus spécifique. Pour vérifier cette assertion, la maladie a été initialement reproduite expérimentalement par l'in-35 troduction de matières fécales de veaux nouveau-nés atteints de " la diarrhée des veaux à l'aide d'une canule dans le duodénum d'un veau nouveau-né sevré de lait maternel dès sa naissance. Cet animal présenta de la diarrhée 15 h après l'inoculation. Ses matières fécales sont prélevées et introduites, également par canule, 40 dans le duodénum d'un veau mis bas par hystérotomie et privé de 70 42105 2 2073429 colostrum» Les matières fécales diarrhéiques de ce veau ont été inoculées successivement de manière semblable et dans les mêmes conditions sous forme de filtrats exempts de bactéries par des canules duodénales à quatre autres veaux. Trois veaux gardés 5 dans une unité d'isolement ont été inoculés par voie buccale de filtrats exempts de bactéries obtenus après le sixième passage des virus dans .le tissu de veaux et l'on n'a. pu constater la présence d'Eo coli chez aucun, ni avant, ni pendant la période diar-rhéique. L'inoculation à l'aide de matières fécales de l'un de ces 10 veaux exempts d'E coli provoqua, donc après sept passages sur tissu, la diarrhée 16 h après 1'inoculâtiono Une coloration par immunofluorescence (telle que décrite par Mebus et al., cités ci-dessus) de fractions d'intestin grêle de veaux infectés de virus ayant subi sept passages sur tissu 15 produisit une fluorescence nette dans les cellules épithéliales des villosités intestinales. L'application de la technique de 1'immunofluorescence à des étalements séchés de matières fécales de veaux en pâture, nouveau-nés et atteints de la diarrhée des veaux a permis de détecter la présence de virus dans des troupeaux 20 de l'Etat de Nebraska et divers autres des Etats-Unis» L'origine virale de la diarrhée des veaux a ainsi pu être établie formellement o Les vaccins conformes à l'invention sont par conséquent préparés à partir de matières fécales de veaux infectés, qui sont 25 recueillies et filtrées. Les matières fécales recueillies sont de préférence celles de veaux inoculés au préalable de filtrats exempts de bactéries de matières fécales contenant des cellules fluorescentes. Le passage du virus sur un ou deux veaux augmente le titre en virus des matières fécales récoltées et facilite, par 30 conséquent, la croissance subséquente des virus dans les cultures sur tissu, destinées à la préparation du vaccin» Lorsque le virus obtenu des matières fécales initiales est susceptible d'être cultivé sur tissu sans nouveau passage dans un veau, on peut évidemment employer ce matériav» Les matières fécales récoltées de cette 35 façon •'ont diluées à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate, centrifugées pendant 30 minutes environ à 1000 tours et le surnageant est filtré à travers un filtre bactériologique approprié» Le filtrat contenant les virus peut ensuite être ajouté à un tissu de culture en vue de la préparation du vaccin» 70 42105 3 2073429 Les tissus pour la culture servant à l'atténuation des virus comprennent toute une série de cellules primaires et de tissus cellulaires, bien que lfon préfère ceux d'origine bovine et porcine. Parmi ces matériaux, on peut citer les cellules rénales 5 de foetus bovins, les cellules du poumon de foetus bovin, les cellules de la glande thyroïde de foetus bovin, les cellules rénales du porc, les cellules de la membrane choroïde de foetus bovin., les cellules rénales d'agneav > le tissu rénal, bovin BR1A, le tissu trachéal d'embryon bovin EBTr (ATCC n° CCL 44), le tissu 10 rénaljclonique 21 de hamster nouveau-né BHKg^ ( ATCC n° CCL 10} ,1e tissu rénal de chien de Madin-Darby (ATCC n° CCL 22), le tissu rénal de callitriche VERO (ATCC n° CCL 81), le tissu rénal de porc PK-15 (ATCC n° CCL 33)> le tissu de testicules de cochon ST ifour-ni par le " National Animal Disease Laboratory" à Ames; Iowa), et 15 le tissu intestinal d'embryon humain de Henle HIS Hela et LLC-MKg (ATCC n° GCL 6, 2 et 7 respectivement). Tous ces substrats cités conviennent pour la culture de virus, mais d'autres cellules et tissus peuvent être employés. Les cellules primaires sont prélevées sur des animaux sains et cultivées suivant des procédés nor-20 malisés bien connus des spécialistes . Les tissus sont soit fournis par des dépôts publiques, soit cultivés et développés par des techniques connues. Pour préparer les vaccins suivant l'invention, les virus sont d'abord atténués par passage sur un tissu de culture. Les 25 cellules sont cultivées dans un milieu de croissance approprié, puis les substrats cellulaires sont lavés avec une solution physiologique exempte de sérum.. Les virus peuvent être soit ajoutés aux cellules, sur lesquelles ils sont adsorbés- soit ajoutés à un milieu de conservation approprié, qui est à son tour ajouté aux 30 cellules. Les cellules sont ensuite incubées à une température " de l'ordre de 25 à 40°C, dont on préfère la gamme de 30 à 37°C 40 Les milieux de conservation, dont le choix n'est pas 70 42105 4 2073429 critique, peuvent être choisis parmi ceux habituellement utilisés dans ce domaine, la seule condition étant qu'ils ne contiennent aucun produit susceptible d' inhiber la croissance des virus» On préfère un milieu de conservation exempt de sérum» Parmi les 5 milieux appropriés, on peut citer les solutions physiologiques de Earle ou de Hanks, contenant 0,5 % de lactalbumine, 0. 1 fa d'extrait de levure, de la pénicilline et de la streptomycine, de même que la base 199 de Earle ou de Hanks, contenant 0,5 % d'hydrolysat de lactalbumine, de la pénicilline et de la strepto-10 mycine» Les cultures d'atténuation des virus peuvent être réalisées dans des flacons stationnaires ou des flacons soumis à un mouvement circulaire» A la fin de chaque passage, le milieu et les cellules 15 sont recueillis et ajoutés à de nouvelles cellules pour un nouveau passage. On réalise un nombre de passages approprié pour obtenir le vaccin souhaité. Pour l'administration aux vaches, un vaccin obtenu avec des virus ayant subi un nombre de passages limité est satisfaisant, pour autant que 85 % ou plus des cellules' 20 présentent une fluorescence. Pour l'administration aux veaux, le nombre de passages nécessaire à la préparation d'un vaccin approprié est déterminé par une inoculation d'un vaccin, préparé à partir de virus ayant subi un nombre déterminé de passages, à des veaux susceptibles de contracter la maladie- Le nombre de pas-25 sages approprié est celui pour lequel le vaccin inoculé dans le duodénum d'un véau nouveau-né sevré de colostrum ne provoque pas lui-même une maladie clinique, mais permet d'empêcher cette maladie, lorsque le veau est inoculé ensuite avec un filtrat, exempt de bactéries, de matières fécales contenant des virus virulents. 30 Lorsque" le virus est suffisamment atténué, il peut être cultivé dans une culture sur tissu. A cette fin, le virus est soit ajouté directement aux cellules, sur lesquelles il est adsor-bé, soit ajouté à un milieu de conservation approprié, de préférence exempt de sérum, qui est ensuite ajouté aux cellules. Les 35 cellules sont incubées et on poursuit l'incubation à 25-40°C jusqu'au moment d'obtenir une teneur en virus correspondant à au moins 10^ doses d'infection/ml. Le vaccin destiné aux vaches peut être inactivé par voie chimique et on peut lui ajouter un adjuvant pour en améliorer l'antigénicité.. A cette fin, on peut employer tous les adjuvants 70 42105 5 2073429 connus, y compris 1Thuile de carthtme, l'adjuvant incomplet de Freund, l'adjuvant à l'alginate et l'adjuvant à l'hydroxyde d'aluminium. Le vaccin destiné aux veaux peut être employé à l'état liquide, ou être lyophilisé et reconstitué au moment de l'inocula-5 tion à l'aide d'un véhicule approprié, tel que de l'eau stérile» Pour 1 immunisation directe de veaux nouveau-nés, on doit employer un vaccin atténué ou un vaccin vivant modifié, capable de créer cette immunité sans provoquer la maladie; un tel vaccin nécessite jusqu'à 200 passages d'atténuation» Pour obtenir un ré-10 sultat optimum, il faut immuniser les veaux rapidement après la naissance, c'est-à-dire avant qu'ils n'aient été exposés à un contact avec des virus virulents. Pour l'immunisation de veaux par administration du vaccin à la vache pleine, le vaccin doit posséder un titre d' au moins 10^ doses d'infection/ml - et de préférence 15 même plus. Les vaccins sont administrés par voie parentéralej de préférence par voie sous-cutanée ou intramusculaire, 60 à 90 jours avant la mise bas. Les exemples non limitatifs ci-après sont destinés à illustrer les procédés et produits de l'invention» 20 . EXEMPLE 1 Des cellules de poumon de foetus bovin, obtenues par des techniques bien connues de foetus bovins de 8 à 9 mois, sont cultivées dans des flacons de Roux, contenant de l'hydrolysat de lact-albumine de Earle et 10 % de sérum de veau. Préalablement à l'ino-25 culation, les couches mono cellulaires sont lavées deux ou trois fais à l'aide de la.solution physiologique de Hanks» - Après l'inoculation par un filtrat de matières fécales de veau, on permet aux virus d'être adsorbés pendant 2 heures à 37°Cj le flacon étant incliné chaque demi-heure pour redistribuer le produit inoculant» 30 On ajoute ensuite un milieu de conservation, formé de la solution physiologique de Earle, contenant 0,5 % de lactalbumine et 0,1 °,b d'extrait de levure, ainsi que de la pénicilline et de la streptomycine» On incube les cellules à 37°C jusqu'au moment où se manifeste sur le substrat un effet cytopathologique ou qu'on obtient 35 avec des anticorps spécifiques une fluorescence» v Lorsque 85 à 100 % des cellules de la couche mono cellulaire présentent me fluorescence,les cellules &le. liquide sont recueillis par congélation et décongélation. le volume est ensuite réduit de moitié dans une ultra« centrifugeuse, les cellules et le liquide étant conservés à -60°C. 40 Pour déterminer la force du vaccin, ce mélange cellules- 70 42105 6 2073429 liquide est décongelé et étudié tel quel., et mélangé à une quantité égale d'un adjuvant à base d'huile de carthame. Ces vaccins sont injectés par voie intramusculaire à des vaches gravides, 60 jours avant la mise bas o On injecte le liquide de culture sur 5 tissu, décrit ci-dessus, tel quel à huit vaches, mélangé à une quantité égale d'adjuvant à sept vaches, tandis que six vaches sont inoculées avec 5 ml d.'adjuvant mélangés à 5 ml d'une suspension virale, préparée à partir des matières fécales de veaux présentant de la diarrhée néo-natale , comme décrit par Mebus et al. pour la 10 préparation de 1'antigèneo Pour la comparaison, 39 vaches sont laissées sans vaccination. Pour la mise, bas, les vaches sont amenées dans une ferme dans laquelle la diarrhée des veaux nouveau-nés constituait depuis plusieurs années un grave problème et où cette maladie s'était à ce moment déclarée. L'efficacité des vac-15 cins est déterminée par le nombre de veaux présentant de la diarrhée et par l'analyse des matières fécales des veaux présentant la diarrhée, pour déterminer la présence de virus. Le virus est identifié par immunofluorescence. Les résultats constatés sont repris dans le tableau lo 20 TABLEAU 1 Efficacité de divers vaccins contre la diarrhée des veaux Nombre de Nombre de Nombre de vaches veaux nés veaux diar-Vaccin rheiquet liquide de culture sur tissu 8 8 7 (87,5 $) 25 liquide de culture sur tissu + adjuvant 7.73 (W- .3 %) virus fécal + adjuvant 6 64 (66,6$) pas de vaccin 39 39 39 (100%) Tous les veaux non vaccinés présentaient de la diarrhée ; 7 des 8 veaux, dont les mères avaient été vaccinées à l'aide du tissu de 30 culture, développaient de la diarrhée l 4 des 6 veaux, dont les mères avaient été vaccinées à l'aide du virus fécal combiné avec un adjuvant, développaient la diarrhée et 3 des 7 veaux, dont les mères avaient été vaccinées à l'aide de tissu de culture combiné avec 1'adjuvant, développaient également de la diarrhée. Il ressort 35 de ces résultats que tous les vaccins possèdent une certaine efficacité, même dans des cas de contamination aussi sévère et probablement exagérée. Les résultats les meilleurs sont obtenus avec les liquides et cellules de culture sur tissu, employés conjointement avec des adjuvantso 70 42105 7 2073429 En se basant sur ces résultats, l'efficacité des vaccins provenant de cultures sur tissu et combinés avec un adjuvant est étudiée sur un troupeau de ferme, où la diarrhée des veaux nouveau-nés présentait depuis deux ans un sérieux problème-et où le virus 5 avait également été détecté par immunofluorescence» Les vaches étaient sélectionnées pour la vaccination de manière à disposer par semaine de 5 vaches vaccinées mettant bas. Ces vaches étaient vaccinées à 30 jours d'intervalle entre le 90ème et 30ème jour avant la mise bas. Le cdLostrumcfe ces vaches vaccinées; récolté pen-10 dant les cinq jours après la mise bas était ensuite donné comme alimentation à des veaux âgés de O à 13 jours. Le lait provenant de vaches vaccinées et récolté entre le' 6ème et le lOème- jour après la mise bas était donné à des veaux âgés de 14 à 28 jours. Cette façon de procéder permet d'évaluer l'intervalle nécessaire entre 15 la vaccination et la mise bas, de même que l'effet de 2 doses successives de vaccin. Les résultats obtenus sont repris dans les tableaux 2 et 3° Le tableau 2 indique .la fréquence de la diarrhée pour les veaux, ayant reçu le colostrum de vaches non vaccinées et de 20 vaches, qui ont obtenu une dose de vaccin. Le tableau 3 indique la fréquence de la diarrhée pour les veaux ayant reçu du colostrum de vaches auxquelles 2 doses de vaccin ont été administrées. TABLEAU 2 Fréquence de la diarrhée de veaux nés de vaches non vaccinées ou 25 vaccinées une seule fois Nombre de veaux Nombre dé veaux diarrhéiquss 180 87 (48;3 $ } TABLEAU 3 Fréquence de la diarrhée de veaux nés de vaches vaccinées 2 fois 30 Nombres de veaux Date de mise bas Nombre de veaux diarrhéicues 253 30.8 - 24» 10 69 (27,3 $>) Il ressort de ces résultats que la fréquence de la diarrhée des veaux nouveau-nés est réduite de 48,3 % pour 180 veaux à 2753 % pour 253 veaux, par le vaccin administré plus d'une fois. 35 Une amélioration plus conséquente peut encore être obte^- nue en veillant à alimenter tous les veaux nouveau-nés avec du colostrum provenant de vaches vaccinées, dès que possible après la naissance. Pour des raisons de force majeurej certains veaux de l'expérience décrite plus haut ont dû attendre jusqu'à 12 heures avant d'être nourris» Il est possible que certains animaux aient 70 421 OS 8 2073429 déjà été contaminés avant de recevoir du colostrum.» Dans aucun des animaux vaccinés dans les essais décrits ci-dessus, on n'a pu observer un effet défavorable» EXEMPLE 2 5 D'autres vaccins destinés à être administrés à des vaches pleines sont préparés à partir de virus atténués, qui peuvent être cultivés sur des cellules ou tissus d'origine bovine, porciçte ou autres, par un éventuel passage, pour autant que de besoin,.dans des veaux. Le nombre de passages nécessaires pour'obtenir un vac-10 cin adéquat est celui qui permet d'obtenir 85 à 100 $ de cellules présentant une fluorescence » EXEMPLE • 3 On prépare un vaccin poir 1' immunisation directe des veaux en atténuant le virus par 37 passages, suivant le mode opératoire 15 de l'exemple 1, dans des tubes stationnaires, sur des cellules de tissu rénal de porc PK-15 (ATCC n° CCL 33)• EXEMPLE 4 D'autres vaccins pour veaux peuvent être préparés par atténuation de virus, éventuellement adaptés à une croissance sur 20 cultures de cellules ou tissus d'origine bovine, porcine ou autres, par un premier passage dans des veaux» Le nombre de passages nécessaires pour obtenir un vaccin adéquat est déterminé par les propriétés infectieuses et antigéniques du "produit obtenu» EXEMPLE 5 25 On récolte 10 ml de matières fécales d'animaux présen tant la diarrhée des veaux nouveau-nés, que l'on réfrigère, ou congèle rapidement. La présence des virus dans les matières fécales est vérifiée par la technique des anticorps fluorescents ou à l'aide d'un microscope électronique» Les matières contenant les virus» 30 sont diluées avec trois fois leur volume de solution physiologique tamponnée au phosphate, le mélange est centrifugé et filtré sur un-filtre bactériologique.. On utilise des filtres Seitz de 5 (i, puis de 1 (i et enfin de 0,5 p.» 30 ml de cette solution sont ensuite introduits dans le duodénum d'un veau. Au lieu de filtrer les ma-35 tières, on peut également introduire directement la totalité des matières fécales» On récolte les matières fécales de l'animal dès que la diarrhée s'est déclarée. Ces matières fécales sont traitées d'une façon identique à celle décrite ci-dessus et injectées deux fois 40 ou plus dans le duodénum. Après chaque passage sur un veau, on 70 42105 9 2073429 prépare un filtrats avec lequel on inocule des cellules rénales bovines ou des cellules de poumon bovines, dans des tubes ou flacons pour cultures stationnaires ou maintenues en mouvemento On réalise jusqu'à quatre passages sur ces cellules, qui sont chaque 5 fois examinées pour détecter un éventuel effet de trouble cytopa-thologique, qui est confirmé par la technique aux anticorps fluorescents. Lorsque ces observations sont négatives, les cellules sont éliminées, et dans le cas de la présence de virus, on effectue de nouveaux passages. 10 EXEMPLE 6 Les virus sont atténués 40 fois à 37°C dans des cellules rénales porcines PK-15 • On effectue ensuite' 135 passages supplémentaires à 37°C sur des cellules rénales bovineso Pour ces passages sur reir. bovin,,3e virus est d'abord inoculé tous les 3 ou 4 jours 15 dans un flacon de 240 ml a raison de 1 ml de liquide infecté de culture sur tissu» Préalablement à l'inoculation, les cellules sont lavées trois fois avec une solution physiologique de Hank» Au début, on laisse le virus pendant 2 heures pour en assurer l'absorption, avant d'ajouter le milieu de conservation, et plus tard 20 on n'attend qu'une heure» Approximativement après le 70ème passage sur rein bovin, le virus est repiqué chaque jour» A partir du I20ème passage, on n'attend plus l'adsorption du virus. Les flacons sont lavés} puis on y ajoute le milieu de conservation et on inocule les cellules du liquide contenant les virus. 25 les liquides provenant des cultures sur tissu des 80ème à 175ème passages, recueillis 5 jours après l'inoculation, sont mélangés avec line quantité égale d'adjuvant à base d'huile de car-thame et inoculés à des vaches pleines. La fréquence de la diarrhée de veaux nés de ces vaches est réduite d'environ 50 % et leur 30 mortalité est pratiquement éliminée complètement» EXEMPLE 7 Les virus sont atténués par 40 passages à 37°C sur cellules rénales de porc PK-15, 85 passages à 37°C sur cellules rénales bovines et 17 passages à 3l°C sur cellules rénales bovines» 35 Le liquide de culture sur tissu obtenu à ce moment est recueilli^ pour être inoculé, à raison de 12 ml, dans le duodénum dî-un veau né par opération césarienne et sevré de colostrum; aucune maladie ne se déclare» • EXEMPLE 8 40 On récolte et traite,comme décrit à l'exemple 5, des 70 42105 10 2073429 matières fécales d'animaux en pâture, présentant la diarrhée du veau nouveau-né, qui sont ensuite introduites deux fois dans le duodénum- Le filtrat fécal obtenu est ensuite soumis à des passages successifs dans des tubes en mouvement et contenant des 5 cellules rénales bovines. A partir du troisème passage, on emploie des flacons stationnaires. On effectue 163 passages à 37°C et le-liquide de culture sur tissu, contenant des virus, est mélangé à un adjuvant et injecté à des vaches pleines, permettant ainsi une protection efficace des veaux en réduisant la 1C mortalité due à la maladie et en abaissant fortement la fréquence des cas de diarrhée. EXEMPLE 9 Du liquide de culture sur tissu, contenant des virus atténués par 114 passages à 37°C, est encore incubé 16 fois 15 à 31°Co Le liquide est ensuite injecté à des veaux âgés de 4 heures. A l'âge de 28 heures, ces veaux vaccinés sont exposés à des virus virulents sans développer de maladie. EXEMPLE 10 On prépare un vaccin par 1 à 4 passages, duodénaux 20 de matières fécales provenant de veaux diarrhéiques, lers matières fécales obtenues du dernier veau étant incubées sur du tissu de testicule de cochon jusqu'au moment où le liquide de culture sur tissu injecté dans le duodénum de veaux ne provoque plus la maladie . 70 42105 2073429 REVENDICATIONS 1«~ Procédé pour l'atténuation du virus de la diarrhée du veau, comportant le passage du virus de la diarrhée du veau dans une culture sur tissu appropriée pour la croissance du virus 5 un nombre de fois suffisant pour que le virus produise une immunité sans provoquer la maladie. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est atténué par un nombre de passages sur culture de tissu d'origine bovine ou porcine, pouvant atteindre 200, ces 10 passages s'effectuant entre 25-40°C. 3o«= Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le virus est atténué à 30-37°C par culture sur tissu rénal bovin. 4»- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en 15. ce que le virus est atténué à 30-37°C par culture sur cellules rénales porcines ou bovines. 5«— Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le virus est atténué par culture sur cellules de testicules de cochon. 20 6.- Vaccin contre le virus de la diarrhée du veau, pré paré par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5.