FR 2482959 A2 19811127 FR 8011232 A 19800520 Dans le brevet principal ont été décrits de nouveaux tripeptides de formule générale éventuellement leurs sels non toxiques, leur préparation et les rndica- ments qui les contiennent. Dans la formule générale (I), les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, R1 représente un radical hydroxy ou amino, et représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque R2 représente un atome d'hydrogène est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélamique, lorsque R2 représente un radical carbamoyle peut être sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso). Par reste d'acide gras, il faut entendre un radical alcanoyle contenant i à 45 atomes de carbone (éventuellement substitué par tm radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle), un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la paroi bactérienne des mycobactéries, des Nocardia ou corynébactéries. Les nouveaux produits de formule générale (I) sont particulière- ment utiles comme adjuvants immunologiques et comme immunostimulants. La présente addition a pour objet un procédé de préparation des produits de formule générale (I) par synthèse peptidique de Merrifield en phase solide. Ce procédé consiste essentiellement à fixer sur un support approprié l'aminoacide de formule générale dans laquelle R2 représente un atome dthydrogbne ou un radical carbamoyle, R4 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R5 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protec- teurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5J à condenser - soit un dérivé de l'acide D glutamique de formule génerale dans laquelle R5 est défini comme ci-dessus et R3 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 i 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophdnyle), puis après déblocage de la fonction amine protégée par le radical soit un dérivé de la L alanine de formule générale dans laquelle R5 est défini comme précddemment, puis, après déblocage des fonctions amines protégées par les radicaux > et/ou R4 acide de formule générale R' - CO - OH (v) dans laquelle R'-CO- représente le reste d'acide gras défini preeé- demment, soit un dérivé de a L alanine de formule générale dans laquelle R représente un reste d'acide gras, - soit le dipeptide de formule générale dans laquelle R est défini comme précédemment et R6 représente un 3 reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R6 représente un groupement protecteur de la fonction amine celui-ci peut être different du groupement protecteur R4 de l'aminoacide de formule générale (II), et que l'on fait ensuite éventuellement réagir l'acide de formule générale (V) après déblocage des fonctions amines protégées par les radicaux R6 et/ou R49 puis à séparer le produit obtenu de son support et à éliminer, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy. Selon lme variante du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié le dipeptide de formule générale dans laquelle R2, R3 et R4 sont définis comme ci-dessus et R7 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R7 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après ddblo- cage de la fonction amine protégée par R7, de condenser :: - soit un dérivé de la L alanino de formole générale (IV) puis, appris déblecage des fonctions amine. protégées par R5 e-tX R4, éventuellement l'acide gras de formule général (v), - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (VI), puis de séparer le produit obtenu de son support et d'éliminer, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy. Selon une variant du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié, le tripeptide de formule générale dans laquelle N , R3 et R4 sont définis comme ci-dessus et N représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine ces groupements peuvent être différents, puis après déblocage des fonctions amines protégées par % et/ou R4, de condenser l'acide de formule générale (vit), puis, de séparer le produit obtenu de son support et d'éliminer, si nécessaire. les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy Les supports qui conviennent particuliérement bien sont les polymères styrène-divinylbenzane chlorométhylés ou hydroxyméthylés. De préférence le copolyrnère styrène-divinylbenzène (98-2 ou 99-i) chlorométhylé est utilisé. La fixation de l'aminoacide de formule générale (II), du dipeptide de formule générale (VIII) ou du tripeptide de formule générale (lux) sur le support chlorométhylé s'effectue selon les méthodes habituelles, en particulier en faisant réagir l'aminoacide, le dipeptide ou le tripeptide en solution dans un solvant organique tel que l'méthanol et en présence d'un accepteur d'acide tel que la triéthylamine. I1 est particulièrement avantageux de chauffer le mélange réactionnel jusqu'à une température voisine de la température d'ébullition du solvant. Las groupements protecteurs des fonctions amines de ltamino- acide de formule générale (II), du dipeptide de formule générale (viii) ou du tripeptide de formule générale (IX) doivent être choisis de telle manière que leur élimination s'effectue sans toucher à la liaison aminoacide-support. En particulier les radicaux R5, R, et i doivent être différents du radical R4 lorsque ce dernier représente un groupement protecteur de la fonction amine et être tels que leur élimination s'effectue sans toucher au groupement protecteur R4 et à la liaison peptide-support. Généralement la fonction ester représentée par R3 est choisie de telle maniera que, lors de la coupure de la liaison peptide-support, le radical R3 peut être transformé en radical carboxy ou carbamoyle selon que la coupure sera une hydrolyse acide ou une ammonolyse. Plus particulièrement la liaison peptide-support qui est de nature benzylique, est coupée par traitement au moyen d'un mélange acide bromhydrique-acide trifluoroaeétique. Las tripeptides de formule générale (I) obtenus selon le procédé de la présente addition peuvent être éventuellement purifés par des méthodes physiques telles que la cristallisation ou la chromatographie et ils peuvent etre transformés en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases azotées. Las exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent la présente addition. Les produits obtenus peuvent former des complexes avec les métaux alcalins ou alcalino-terreux; il en résulte que les résultats des analyses élémentaires peuvent sensiblement s'écarter des valeurs théoriques. Cependant la structure des produits est confirmée par le rapport C/N qui est en accord avec la théorie, par la teneur en aminoacides et par leur homogénéité en chromatographie sur couche mince de silicagel. Exemple i A une solution de 25 g de N w-t-butyloxyearbonyl Nt-benzyloxy- carbonyl L lysine dans 250 cm3 d'éthanolr on ajoute 150 g de copolymère styrène-divinylbenzène (98-2) chlorométhylé contenant i milliéquivalent de chlore par gramne.On agite le milieu réactionnel pendant 3 minutes à 200C, ensuite, on ajoute 9,2 cm) de triéthylamine et on agite le milieu réactionnel pendant 48 heures à 780C. La polymère est filtré, lavé successivement par 3 fois 750 em3 au total d'éthanol et 3 fois 750 cm3 au total de chlorure de méthylène, puis séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 C. On obtient ainsi 160,9 g de N&alpha;-t-butyloxycarbonyl N#-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère. L' acide D glutamique est accroché sur le dérivé L lysyl-poly mère en effectuant la suite d'opérations suivante dans un réacteur .rn4 d'un agitateur et à sa base d'un verre fritté. i) on effectue 3 lavages successifs du polymère par 100 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. Chaque addition de solvant est suivie d'une agitation de 3 minutes, puis d'un essorage. 2) le groupement protecteur t-butyloxycarbonvle de la lysine est ensuite éliminé par addition de 100 cm3 d'un mélange acide trifluoroacétiquechlorure de méthylène (i/i en volumes), agitation pendant 20 minutes puis essorage. 3) la résine est alors lavée successivement par a > 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 cm3 de méthanol c) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois. 4) On neutralise alors le polymère par addition de 100 cm3 d'un mélange chlorure de mdthylene-N-méthylmorphoMne (9/1 en volumes), agitation pendant 10 minutes puis essorage. 5) La résine est lavée ensuite par 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois. 6) On ajoute alors successivement a) 5,4 g de N-t-butyloxycarbonyl a-D glutamate de benzyle en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b) 3,3 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 50 em) de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 heures et essore. 7) On lave la résine successivement par a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 em) d'acide acétique c) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois. On obtient ainsi le Nw-(Ol-benzyl N-t.-butyloxycarbonyl. Y-D glutamyl) N-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère. L'alanine est accrochée sur le dipeptide-polymEre en répétant les opérations 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7. L'opération n06 est modifiée comme suit On ajoute successivement a) 3,03 g de N-t.-butyloxycarbonyl L alanine en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b) 3,3 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 50 em3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 heures et essora On obtient ainsi le N&alpha;;-[O-benzyl N-(N-t.-butyloxycarbonyl L alanyl)-y-D glutamys N#-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère L'acide palmitique est accroché sur le tripeptide-polymère en répétant les opérations i, 2, 3, 4, 5, 6 et 7. L'opération n06 est modifiée comme suit On ajoute successivement a) 4,2 g d'acide palmitique en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b) 3,3 g de dicyclohexylearbodl-imide en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 heures et essore. On obtient ainsi le N&alpha;-[O-benzyl N-(N-palmitoyl L alanyl )- Y-D glutamyl] NE-benzyloxycarbnnyl L lysyl-polymère Ce polymère est mis en suspension dans 130 cm3 d'acide trifluoreacétique contenu dans un réacteur muni d'un agitateur et à sa base d'un filtre en verre fritté. Dans cette suspension, on fait passer un courant d'acide bromhydrique pendant 90 minutes. Ensuite, on essore la résine et on la lave 3 fois par 300 cm3 au total d'acide acétique en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de l'acide acétique et en essorant à chaque fois. les filtrats sont réunis et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 500C.L'huile ainsi obtenue est reprise dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Un précipité se forme que l'on sépare par filtration et lave 2 fois par 60 em3 au total d'éther. Il est hygroscopique et est dissous dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 7 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 500C et on charge sur une colonne de 2,6 cm de diamètre contenant 70 g de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm). On élue successivement par 700 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/1 en volumes) 1700 cm3 d'un mélange acétate d éthyle-acide acétique (8/2 en volumes) 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7/3 en volumes) 2400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1/1 en volumes) 600 cm3 d'un mélange -acétate d'éthyle-acide acétique (2/8 en volumes) et 1100 em3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 53 à 70 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 500C. On obtient ainsi 1,28 g de solide amorphe que l'on dissout dans 50 em3 d'acide acétique contenant 2,4 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 500C et charge sur une colonne de 1,5 cm de diamètre contenant 24 g de gel de silice neutre (0,04-0,OG3 mm). On élue successivement par 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7/3 en volumes) 150 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (6A1 en volumes) 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-aeide acétique (l/i en volumes) 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (4/6 en volumes) 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (3/7 en vnlumes) 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-aeide acétique (2/8 en volumes) 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1/9 en volumes) et 200 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 25 à 42, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50CC. le solide amorphe obtenu est repris dans 30 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé par 20 em) d'acétate d'éthyle et 20 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 500C, on obtient 0,52 g de N&alpha;-[N-(N-palmi- toyl L alanyl)-Y-D glutamyl]L lysine Rf = 0,30 tsilieagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes Analyse : Calc. % = C 54,13 H 8,63 N 8,42 Tr. = 54,9 8,6 8,7 Cendres sulfuriques : 1,7 % Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants ê Ala 0,99 (théorie = i) Glu 1,00 (théorie = i) lys 1,02 (théorie = 1) Exemple 2 En opdrant, comme précédemment, à partir de matières premières convenables, les produits suivants sont préparés - N w-[N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl L lysine fondant à 180-1860C (fusion pâteuse) - acide N-(N-lauroyl L alanyl-Y-D glutamyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique - acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique - acide N- [N-(N-octanoyl L alanyl)-Y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 160-1640C (fusion pâteuse) - acide N-[N-(N-palmitoyl L alanyl)-&gamma; ;-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique. REVENDICbTIONS 1 - Un procédé de préparation d'un tripeptide de formule générale dans laquelle les symboles R, identiques ou différents, représentent .un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras qui est un radical alcanoyle contenant i à 45 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle, alcényle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, R1 représente un radical hydroxy ou amino, et R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle étant entendu que l'alanine est sous forme L l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque R2 représente un atome d'hydrogène est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélamique, lorsque R2 représente un radical carbamoyle peut être sous forme D,D ; L,L ; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), par synthèse peptidique de Merrifield caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié l'aminoacide de formule générale dans laquelle R2 est défini comme ci-dessus, R4 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R5 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5 condense un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale dans laquelle R5 est défini comme ci-dessus et R3 représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5 ,un dérivé de la L alanine de formule générale :: dans laquelle R5 est défini comme précédemment, puis, après déblo cage des fonctions amines protégées par les radicaux R5 et/ou R4, 5 /ou R4, l'acide de formule générale R' - CO - OH dans laquelle R'-CO- représente le reste d'acide gras défini précédemment, coupe la liaison entre le peptide obtenu et son support, élimine les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 2 - Un procédé de préparation d'un tripeptide tel que défini dans la revendication i par synthèse peptidique de Nerrifield carac- térisé en ce que l'on fixe sur un support approprié l'aminoacide de formule générale dans laquelle R2 est défini comme ci-dessus, 24 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R5 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5, condense un dérivé de 1 t acide 1 > -glutamiaus de formule générale dans laquelle R5 est défini comme ci-dessus et R3 représente ou un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), puis après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5, un dérivé de la L alanine de formule générale dans laquelle R représente un reste d'acide gras, coupe la liaison entre le peptide obtenu et son support, élimine les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 3 - Un procédé de préparation d'un trîpeptide tel que défini dans la revendication 1 par synthèse peptidique de Merrifield caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié l'aminoacide de formule générale dans laquelle R2 estdéfini comme ci-dessus, R4 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R5 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R5, condense le dipeptide de formule générale dans laquelle R3 est défini comme précédemment et R6 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R6 représente un groupement protecteur de la fonction amine celui-ci peut être différent du groupement protecteur défini par R4 précédemment, et qu'on fait réagir ensuite l'acide de formule générale R' - CO - OH dans laquelle R'-CO- est défini comme précédemment, après déblocage des fonctions amines protégées par les radicaux R6 et/ou R4, coupe la liaison entre le peptide obtenu et son support, élimine les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 4 - Un procédé de préparation d'un tripeptide tel que défini dans la revendication 1 par synthèse peptidique de Nerrifield caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le dipeptide de formule générale dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, R3 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R4 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R7 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R7 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R7, on condense un dérivé de la L alanine de formule générale dans laquelle R5 est défini comme précédemment, puis après déblocage des fonctions amines protégées par les radicaux R5 et/ou R4 l'acide de formule générale R' - CO - OH dans laquelle R' - CO- représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 5 - Un procédé de préparation d'un tripeptide tel que défini dans la revendication 1 par synthèse peptidique de Merrifield caractérisé en ce que Iton fixe sur un support approprié le dipeptide de formule générale dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, R3 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R4 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R7 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R7 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R7, on condense un dérivé de la t alanine de formule générale dans laquelle R représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carb'oiy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 6 - Un procédé de préparation d'un produit tel que défini dans la revendication I par synthèse peptidique de Merrifield caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le tripeptide de formule générale dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle, R3 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R8 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R4 et R8 représentent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements peuvent être différents, puis après déblocage des fonctions amines protégées par R8 et/ou R4, condense 11acide de formule générale R' - CO - OH dans laquelle R-CO- représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support et élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy, puis isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 7 - Procédé selon la revendication 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 caractérisé en ce que le support est un copolymère styrène - divinylbenzène chloro- méthylé ou hydroxyméthyle.