0S640 1 2125617 Des fermentations bactériennes sont très utilisées pour la préparation d'unQ&rotéase alcaline. L'élimination ou la destruction de spores bactériennes dans la préparation de protéases par fermentations bactériennes a été reconnue comme 5 une tâche nécessaire et difficile. On considère qu'il est contraire à la logique d'ajouter de grandes quantités de spores bactériennes à des détergents, parce que ces spores pourraient contaminer l'eau de lavage, et risqueraient de se retrouver sur le linge. On sait qu!à l'heure actuelle, la plu-10 part des produits détergents à base d'enzymes peuvent contenir environ 10 000 spores/g. Du fait même de leur nature, les spores bactériennes ont une très grande résistance à la destruction, les procédés qui détruisent les spores détruisent d'habitude l'enzyme ega-15 lement..l'élimination physique de spores est difficile à garantir et elle est également coûteuse. On donne ci-après une énumération de la plupart des moyens connus d'éliminer ou de détruire les spores, en même temps que leurs inconvénients. 1. la chaleur dégrade l'enzyme avant que'le 20 nombre de spores ne soit notablement réduit. 2. les oxydants tels que le chlore détruisent l'enzyme de même que les spores. 3. Une radiation ionisante émise par exemple par le cobalt-60 n'a pas une action complète et dégrade également 25 une partie de l'enzyme. 4. les agents mutagènes tels que la P-propiolactone, considérée comme "poison industriel", ne peuvent pas être utilisés pour un produit de consommation. D'autres n'agissent pas ou dégradent tout aussi bien l'enzyme. 30 5. Une filtration dans des conditions stériles est difficile à effectuer et coûte cher. 6. L'ultra-centrifugation est difficile à effectuer et nécessite un appareillage coûteux. la présente invention concerne la découverte et 35 l'utilisation de cultures de bactéries asporogènes pour produire un bouillon de fermentation sensiblement exempt de spores contenant l'enzyme appelé protéase. l'invention a plus 72 05640 2 2125617 particulièrement trait à la culture d'une bactérie choisie dans le genre Bacillus, dans des conditions réglées de fermentation, pour produire un bouillon de fermentation de titre élevé en protéase et sensiblement exempt de spores bactériennes viables. 5 Les quelques cellules végétatives viables qui peuvent être présentes dans le bouillon de fermentation sont facilement détruites sans affecter la protéase. La protéase contenue dans le bouillon de fermentation de la présente invention peut être isolée de ce bouillon par un^6pération de 10 séparation plus simple et plus efficace que cela n'a été possible dans le cas des bouillons antérieurs contenant la protéase et des spores bactériennes. Par culture d'un micro-organisme asporogène du genre Bacillus dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions 15 réglées, on obtient un bouillon de fermentation contenant la- protéase (enzyme) et ne renfermant pas de spores bactériennes viables que l'on puisse déceler. Le micro-organisme que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention est choisi dans le genre Bacillus. composé de bactéries que l'on rencontre 20 partout, comme cela est bien connu. Des exemples d'espèces appartenant à ce genre comprennent Bacillus subtilis. Bacillus bifidus, Bacillus cereus. Bacillus megatherium. etc. Bien qu'on ait choisi l'espèce Bacillus subtilis dans la description et les exemples qui suivent, on remarquera que d'autres 25 espèces du genre Bacillus peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention. On a constaté que l'espèce Bacillus subtilis. qui est un organisme non pathogène commun,est facile à traiter et produit aisément par fermentation des titres élevés de protéase. Pour faciliter la tâche des spécialistes 30 en ce domaine, une sous-culture asporogène de Bacillus subtilis a été déposée et on peut se la procurer dans la collection permanente de la'Northern Utilization and Research Division "Agricultural Research Service", U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amérique. Elle a été déposée 35 sous le U° NSEL B-3907. La culture mentionnée ci-dessus présente les caractéristiques suivantes, sur divers milieux gélosés : 72 05640 3 2125617 Milieu gélose HP* + 5 g/l de caséine 10 HP* + 1 g/1 d'élastine 15 20 CTRRL B-3907 La colonie centrale initiale est mucoïde et la périphérie prend une teinte saumon. Des secteurs mucoïdes apparaissent avec une disposition en rosette irrégulière. Les centres de la colonie initiale et les secteurs subissent plus tard une lyse totale. Les cellules sont très petites et très mobiles. La division en de nombreux secteurs en forme de larmes opposées prend l'aspect des pétales d'une fleur. Le centre dé la colonie et les secteurs sont le siège d'une lyse intense au bout de 3-4 jours. On note la présence de grandes zones d'hydrolyse de l'élastine. * Gélose "Hanson" de pigmentation. Elle contient les ingrédients suivants : 25 30 L-tyrosine 20 mg L-tryptophane 20 mg MnCl2 2 mg MgCl2 200 mg EeCl2.4H20 35 mg CaCl2 o o C\J mg G-élose nutritive "Difco" CM g Eau distillée, quantité suffisante pour 1 1 On ajuste le pH-à 6,9- -7,1 35 La bactérie décrite ci-dessus prend le G-ram, On donne ci-après quelques autres caractéristiques: Croissance à 60 °C Négative à 65°C Négative à un pH égal à 6,0 Positive 72 05640 4 2125617 dans NaCl à 10 $ Négative sur gélose nutritive Positive Action sur diverses substances • • 5 Xylose négative Mannitol négative Lactose négative Arabinose négative Citrate Positive 10 Nitrate Positive Hydrolyse de l'amidon Positive Hydrolyse de la caséine Positive Production de catalase Positive Production d'indole négative 15 Production d'uréase négative La protéase obtenue au moyen du procédé de l'invention est élaborée par un organisme asporogène du genre "Bacillus" lorsque cet organisme est cultivé dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies. Pour la production 20 de protéase à l'échelle industrielle, on préfère des conditions aérobies en immersion. Pour la.préparation de quantités limitées de protéase , on peut utiliser des cultures en surface ou des bouteilles. L'organisme est cultivé dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple un glucide assimi-25 lable, et une source d'azote, par exemple un composé azoté assimilable ou une matière protéinique. Les sources préférées de carbone comprennent le glucose, la cassonade, le saccharose, le glycérol, l'amidon, l'amidon de maïs, le lactose, la dextrine, les mélasses, les graisses, les huiles, etc. Les sources 30 préférées d'azote comprennent l'extrait soluble de maïs, la levure, la levure autolysée de brasserie, additionnée de lait en poudre, la farine de soja, la farine de graines de cotonnier, le lait/poudre, . le produit de digestion pancréatique de la caséine, les résidus-secs de distillation, les liqueurs peptonées 35 animales, les déchets de viande et d'os, l'azote minéral, la farine de poisson, le sang animal séché, etc. Des combinaisons de ces sources de carbone et d'azote peuvent être utilisées avantageusement. Des traces de métaux, par exemple de zinc, 72 05640 5 2125617 de magnésium, manganèse, cobalt, fer, etc., ne doivent habituellement pas être ajoutées aux milieux de fermentation, parce que l'eau de ville et des ingrédients non purifiés sont utilisés comme composants des milieux. 5 la production de la protéase peut être effectuée à toute température propice au développement du micro-organisme, par exemple entre environ 15 et 45°C, et de préférence entre 30 et 40°0. Ordinairement, on obtient la production optimale de la protéase entre environ 24 et 48 heures, le milieu 10 reste normalement à un pH de 6 à 8 pendant la fermentation. le pH final dépend en partie des tampons éventuellement présents et en partie du pH initial du milieu de culture. Il est préférable d'utiliser une ou plusieurs étapes d'ensemencement ou d'inoculation avant l'étape de 15 fermentation' du procédé pour réduire la durée du cycle de fermentation. le milieu utilisé pour cette étape d'ensemencement peut être analogue à celui que l'on utilise dans l'étape de fermentation. Pour mettre en évidence la présence de-la protéase cl© 20 dans le bouillon/fermentation, on soumet des échantillons de ce milieu a divers essais bien connus dans le domaine des enzymes. Par exemple, on peut utiliser l'essai décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique ÎT° 3 409 719. Cette méthode d'essai y est appelée "Gelâtin Viscosity Method". Elle consiste 25 à faire entrer 10 ml de la solution d'enzyme en contact avec 250 g d'une solution à 14 $ de gélatine, à 37,5°C pendant une heure. Après cette période de contact, on mesure la viscosité-de la solution au moyen d'un viscosimètre et on compare le résultat avec un témoin. Une autre méthode convenable 30 de recherche de la protéase est décrite dans la revue "Journal of The American Oil Chemists' Society", "Volume 46, Octobre 1969, pages 511-514. Pour isoler la protéase du bouillon/*fermentation, on commence par éliminer la majeure partie des matières cel-35 lulaires et d'autres substances insolubles par diverses opérations bien connues en pratique pour obtenir un bouillon relativement clair contenant la protéase. Cette opération peut être conduite 72 05640 6 2125617 en soumettant le bouillon entier à l'une ou plusieurs des opérations suivantes, séparément ou en combinaison : floculation (opération préférée), filtration, centrifugation, etc. 5 Après avoir obtenu un bouillon limpide contenant la protéase, on peut ensuite isoler la protéase par concentration de ce bouillon au moyen de divers procédés connus en pratique. Par exemple, le bouillon limpide peut être concentré par évaporation, ultra-filtration (opération 10 préférée), précipitation avec un solvant organique miscible à l'eau ou un sel minéral, filtration, centrifugation, etc. Des solvants convenables comprennent les alcools méthylique, éthylique et propylique, l'acétone, le dioxanne, etc. le concentré liquide résultant contenant la protéase peut 15 ensuite être utilisé directement comme additif pour détergents. Le concentré liquide peut être soumis à un traitement ultérieur pour éliminer les restes d'eau et, peut-être même, de solvant, de manière à obtenir une préparation de protéase solide, stable et relativement anhydre. Par exemple, le 20 concentré de protéase peut être soumis à l'une ou plusieurs des opérations suivantes, séparées ou combinées : séchage par pulvérisation (opération préférée), lyophilisation, séchage en lit fluidisé, séchage au tambour, séchage avec transformation en pastilles, congélation par pulvérisation, hydra-25 tation à l'aide de sels minéraux,agglomération ,aggrégation,etc. Ces procédés sont bien connus dans le domaine des enzymes. La protéase solide obtenue peut ensuite être utilisée comme, additif pour des détergents après criblage et formulation de la préparation pour satisfaire à diverses normes. 30 L'utilisation d'une espèce asporogène de Bacillus dans le procédé de l'invention permet de simplifier l'opération de séparation de la protéase. Comme décrit ci-dessus, le nombre de spores bactérienne s, dans les procédés antérieurs, doit être notablement réduit dans ie produit à base de protéase." 35 L'élimination de ces spores est une opération difficile, inefficace et coûteuse. Etant donné que le procédé de la présente invention donne un bouillon de fermentation sensiblement exempt de 'spores bactériennes, les problèmes de l'élimination 72 05640 7 2125617 antérieure des spores n'existent pas. Les matières cellulaires végétatives viables qui restent dans le bouillon de fermentation au moment de la récolte peuvent être aisément détruites au moyen de nombreux biocides bien connus qui n'affectent pas la 5 protéase présente. Les biocides que l'on peut utiliser comprennent des sels d'ammonium quaternaire tels que le chlorure de dodécyl-triméthylammonium, le bromure de tétraméthylammonium, l'iodure de tétraéthylammonium, le fluorure de phényltriméthylammonium, le sulfate de benzyltriméthylammonium, le chlorure de tricapryl-10 méthylammonium, le nitrate d'octodécyltriméthylammonium, le chlorure de 1-hexadécylpyridinium, le chlorure de benzyl-diméthylphénylammonium, etc. La gamme usuelle requise pour l'action biocide efficace est comprise entre 0,01 et 10 g/l de bouillon entier. On préfère un'taux de 1 g/l. Pendant le 15 traitement avec le biocide, la température peut varier de 5 à 50 °C, la gamme préférée allant de 30 à 35°C. La durée d'exposition au biocide dépend de la quantité de cellules viables dans la solution. On a constaté qu'une durée de 30 minutes est suffisante pour la plupart des solutions. Il est avantageux de traiter avec 20 le biocide le bouillon entier de fermentation, bien que le traitement au biocide puisse être effectué à tout stade subséquent avant l'obtention du produit final renfermant la protéase. L'utilisation du biocide, au stade où le bouillon de fermentation est entier,offre, comme autres avantages,de réduire les chances 25 d'un développement secondaire, d'une contamination et d'une putréfaction pendant la séparation de la protéase. Une souche asporogène d'un organisme du genre Bacillus qui est capable de produire des titres élevés de protéase dans une fermentation, peut être obtenue au moyen 30 d'un procédé de sélection qui sera décrit plus loin. Ce procédé est décrit dans son application à l'organisme Bacillus subtilis mairie même procédé, avec les variantes dont disposent les spécialistes en ce domaine, peut être appliqué au choix d'autres organismes asporogènes du genre Bacillus ayant la 35 caractéristique avantageuse de produire des titres élevés en protéase. Les produits et les procédés de l'invention sont illustrés par les exemples suivants, donnés à titre non limitatif. 72 05640 8 2125617 Tous les pourcentages sont exprimés en poids et les quantités de solvants sont exprimées en volume, sauf indication contraire. Exemple 1 Sélection d'un Bacillus asporogene A. Conditions de sporulation et de pigmentation Un milieu gélosé donnant une "bonne population de spores avec B, subtilis sur des boîtes de Pétri, a la composition suivante î Bouillon nutritif "Difco"* 4 g MgS04 6 mg CaClg 555 mg PeC^.i^O 1 mg Dextrose 0,~1 g KC1 0,5 g Gélose bactériologique "Difco"* 15 g Caséine 5 g Eau distillée, quantité suffi sante pour 1 litre * Difco Laboratories, Détroit, Michigan. Le milieu gélosé est introduit à la pipette 20 dans des boîtes de Pétri de 8,89 cm de diamètre, en quantité de 16 ml par plaque. Après solidification de la gélose, les plaques sont séchées dans un incubateur à 35°C. En utilisant des cure-dents stériles, on inocule les plaques de gélose en - stries à partir de 12 gouttelettes espacées, avec une suspension 25 de cellules de B. subtilis. Les colonies prennent des formes relativement circulaires au bout de quatre jours d'incubation à 34°C, et il y a des spores abondantes sur les colonies bactériennes de couleur saumon. Un milieu gélosé analogue pour pigmentation et 30 sporulation peut être conçu pour chaque espèce de Bacillus. La sporulation est plus abondante sur la gélose qu'elle ne l'est dans des milieux liquides, et la récolte de spores est bien moins contaminée par les ingrédients du milieu. La durée d ' incubation peut varier de 2 à 6 jours et la température né-35 eessaire pour obtenir la sporulation optimale, selon l'espèce de Bacillus, peut varier de 25 à 45°C. B. Préparation d'une suspension de spores " De l'eau distillée stérilisée est placée au moyen d'une pipette à la surface de plaques de gélose, obtenues 72 05640 g 2125617 comme décrit ci-dessus, et on recueille, à l'aide d'une tige de verre à embout de caoutchouc, une récolte de spores et de 9 cellules. Cette récolte contient habituellement environ 1,5 x 10 spores et 1,7 x 10^ cellules végétatives par ml. 5 On filtre la suspension et on la lave 10 fois sur un filtre "Millipore " de porosité égale à 0,22 p. (Millipore Filter Corporation, Bedford, Massachusetts) et on la remet en suspension après chaque filtration au moyen d'une baguette de verre à embout de caoutchouc, le lavage final est effectué — 2 V O 10 avec un tampon au phosphate 10 M, à un pH égal a 7,0. la récolte totale de cellules est ensuite mise en suspension _3 dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 10 M contenant 0,15 mole de KC1 et 50 [ig/ml de lysozyme à un pH égal à 8,33, dans 45 ml de solution. le traitement au lysozyme est effectué 15 pendant une heure à 25°C et détruit les cellules bactériennes végétatives, les spores intactes sont lavées six fois avec de l'eau distillée et stérilisée . l'opération de lavage est nécessaire pour éliminer les inhibiteurs de germination, et, par exemple, 25 à 30 lavages peuvent être nécessaires avec 20 certaines espèces du genre Bacillus. la proportion de lysozyme et la durée du traitement peuvent varier selon les nécessités, pour effectuer la lyse de la totalité des cellules végétatives des diverses espèces de Bacillus. C. Germination des spores 25 la suspension de spores, obtenue comme indiqué ci- dessus, est chauffée à 80°C pendant 10 minutes pour rompre la phase latente. A la fin du chauffage, les spores sont séparées par filtration au moyen d'un filtre "Millipore" de 0,22 [i. Avec l'aide d'une baguette de verre à embout de caoutchouc, les spores 30 sont mises en suspension dans une portion de 50 ml de bouillon d'infusion cerveau-coeur' "Difco" (Difco laboratories, Détroit, Michigan) auquel on a ajouté 100 [ig/ral de 1-alanine et 100 jig/ml d'adénosine. On agite la suspension au moyen d'un mélangeur à turbulence pour rompre les amas de spores, puis on la fait 35 incuber à 25°C pendant 15 minutes. On filtre de nouveau les avec un filtre de 0,22ji et spores /on les remet en suspension dans 50 ml de bouillon d'infusion coeur-cerveau additionné de 100 (Jg/rnl de 1-alanine, 72 05640 10 2125617 100 [ig/ml d'adénosine et 100 [ig/nil de chloramphénicol. le chloramphénicol est ajouté pour empêcher la croissance végétative des spores germées. D'autres antibiotiques que l'on pourrait utiliser comprennent 1'érythromycine, le 5-fluoro-uracyle et la tétra-5 cycline. la suspension est réfrigérée dans l'attente du traitement de mutation. l'étape de germination des spores, décrite ci-dessus, peut varier entre des espèces individuelles de Bacillus. la durée et la température du traitement à la chaleur varient 10 respectivement de 10 à 60 minutes et de 60 à 100°C et elles sont faciles à établir par un spécialiste en ce domaine, l'utilisation du milieu d'infusion cerveau-coeur pour la germination est habituellement efficace, bien que les additifs et/ou les concentrations nécessaires pour la germination optimale 15 puissent varier, les périodes d'attente entre le lavage et la remise en suspension dans le milieu frais doivent être brèves, parce que des inhibiteurs de germination sont continuellement libérés par les spores en cours de germination dans le milieu environnant. Par conséquent, le nombre de cycles de 20 germination fractionnée (remises en suspension dans le milieu frais) peut varier d'une espèce de Bacillus à une autre. D. Mutation la suspension réfrigérée (environ 50 ml) de spores ' germées obtenue comme indiqué ci-dessus, est traitée avec 25 50 [J-g/ml de N-méthyl-N'-nitro-ÏT-nitrosoguanidine (NTG-), plus 5 ml de tampon d'acétate à un pH égal à 5,5. Des échantillons de la suspension traitée de spores sont prélevés au bout de 10, 22 et 34 minutes et filtrés avec un filtre "Ealge" à pores dç 0,2 |i. (Malge Company, Division of Bit ter 30 Pfaudler Corporation, Rochester, New York), lavés puis conservés dans un tampon de phosphate 0,1 M froid, à un pH égal à 7,1. le traitement de mutation des spores germées d'autres espèces de Bacillus peut être effectué avec la substance FDG-35 ou avec d'autres mutagènes chimiques bien connus dans le domaine des mutations, par exemple l'acriflavine, l'orangé d'acridine, l'oxyde nitreux, le -5-bromuracile, le phénol, le 72 05640 n 2125617 1—oxyde de 4-quinoléine, et la (3-propiolactone, ou avec des radiations ionisantes. Pour une mutation efficace, on doit s'attendre à ce que les doses et la durée du traitement varient d'une espèces de Bacillus à une autre, le tampon utilisé 5 pour le lavage et la conservation, de manière à maintenir la viabilité maximale après mutation, peut aussi varier, les spécialistes dans le domaine de la mutation pourront effectuer les réglages nécessaires par des procédés classiques, en tenant compte de ce qui précède. 10 E. Sélection les souches de B. subtilis en cours de sporulation, décrites ci-dessus, donnent une pigmentation de couleur saumon très foncé, après 3 à 4 jours d'incubation à ,34°.0 sur le milieu défini ci-après, mais on ne rencontre pratiquement pas 15 de pigmentation avec des éléments isolés oligosporogènes ou asporogènes. Gélose de pigmentation-sporulation différentielle pour Bacillus subtilis EDI 5g" 20 1-tyrosine 20 mg 1-tryptophane 20 mg KnCl2 ■2 mg MgCl2 200 mg FeCl2.4H20 35 mg 25 CaClg 200 mg Gélose nutritive "Difco" 23 g Eau distillée, quantité suffisante pour 1 litre pH ajusté à 6,9-7,1. le milieu indiqué ci-dessus est un milieu de choix pour B. siïbtilis et B. cereus. On peut choisir, pour chaque souche de Bacillus,un milieu gélosé analogue au milieu défini ci-dessus, qui donne une pigmentation abondante avec le type à l'état naturel, orangé ou saumon ou brun, 35 et qui ne parvient habituellement pas à produire une pigmentation notable avec les formes mutantes asporogènes et oligosporogènes. l'incorporation d'élastine ou de caséine,dans cette même gélose,aide habituellement à effectuer une sélection 72 05640 12 2125617 secondaire pour un essai de production de protéase des formes mutantes en voie de sporulation, c'est-à-dire que les colonies produisant ls^protéase sont entourées d'une zone claire sur la gélose à la protéine. 5 II y a lieu de remarquer que le procédé de la présente invention, bien qu'il soit décrit en détail dans son application particulière à la forme nouvelle ERKL B-3907 de Bacillus subtilis. n'est pas limité à ce micro-organisme particulier ou aux micro-organismes définis par les caractéris-10 tiques de cultare données dans le présent mémoire, l'invention s'adresse également à d'autres souches ou formes mutantes dudit micro-organisme,., qui peuvent être produites par des opérations bien connues en pratique, par exemple en soumettant le micro-organisme nouveau à une irradiation aux rayons X ou 15 aux rayons ultraviolets, à la moutarde azotée, à l'action de bactériophages, etc. Comme cela est vrai d'une façon générale dans les procédés microbiologiques, la culture bactérienne de production de protéase ne doit pas être transférée (recultivée) trop 20 fréquemment, car ceci peut réduire sa production de protéase. Exemple 2 Préparation de protéase par un Bacillus asporogène A. Fermentation On utilise une suspension de Bacillus subtilis 25 NREL B-3907 pour inoculer 100 ml d'un milieu primaire d'ensemencement contenu dans une fiole conique d'un litre. On stérilise le milieu à 121°C pendant 30 minutes puis on le refroidit à 28°C avant l'inoculation, le milieu primaire d'ensemencement contient 37 g /l de bouillon d'infusion cerveau-coeur. 30 On ajoute l'agent anti-mousse nïD-104tt (vendu par la firme Drew Chemical Co.) au milieu à un taux de 0,5 ml/l. la fiole contenant le milieu primaire d'ensemencement inoculé est mise à incuber sur une secoueuse mécanique à va-et-vient (90 courses/mn) dans une pièce réservée à cet 35 usage, dont la température est réglée à 28°C. l'incubation dure 12 heures et les cellules de B^ Subtilis se trouvent alors à un stade de multiplication active. 72 05640 13 2125617 la culture primaire à'ensemencement décrite ci-dessus est utilisée comme inoculum pour une cuve d'ensemencement secondaire ayant un volume utile de 250 litres. Le milieu d'ensemencement secondaire a la même composition, en ce qui 5 concerne les éléments nutritifs, que le milieu d'ensemencement primaire. Avant l'inoculation du milieu d'ensemencement secondaire, ce milieu est stérilisé à 121°C pendant 30 minutes, puis refroidi à 28°C. la cuve d'ensemencement secondaire, après inoculation, 10 est aérée avec de l'air stérilisé à un débit de 200 litres/mn, et agitée à une vitesse de 280 tr/mn pendant 16 à 18 heures. le milieu d'ensemencement secondaire décrit ci- dessus est utilisé pour inoculer une cuve de fermentation contenant un milieu renfermant les ingrédients suivants : 15 . Amidon 50 g Farine de soja 20 g Caséine 10 g Phosphate disodique 3,3 g Agent anti-mousse "ED-104"* 0,5 ml 20 Eau de ville, quantité suffisante pour 1 litre On ajoute de l'hyiroxyde de sodium pour ajuster le pH à 10. * Produit vendu par la firme Drew Chemical Company. 25 le milieu de fermentation est stérilisé à 121°C pendant 60 minutes, puis refroidi à 35°C avant l'inoculation avec 5 ^ en volume du milieu d'ensemencement secondaire décrit ci-dessus. Pour la fermentation de 5 000 litres, le volume, après stérilisâtion»est de 4750 litres et le volume 30 d'inoculum d'ensemencement est de 250 litres. Après l'inoculation, la température de fermentation est réglée à 35°C, le débit de l'air est de 2,7 mètres cubes par minute et la vitesse d'agitation est de 195 tr/mn. l'agent anti-mousse indiqué ci-dessus est ajouté suivant les besoins pour inhiber 35 la formation de mousse, la fermentation est poursuivie jusqu'à ce que la concentration désirée en protéase ait été atteinte, le taux de protéase dans le bouillon de fermentation peut être déterminé par titrage de la protéase comme décrit précédemment. En général, la fermentation est terminée au bout 72 05640 14 2125617 de 24 à 48 heures. La variation du titre de protéase dans un milieu de fermentation, comme décrit ci-dessus, est la suivante : 5 Temps de fermentation (heures) Activité relative de la protéase (f>) 24 28 36 68 84 100 B. Séparation de la protéase d'un bouillon de 10 fermentation On ajoute 0,1 f° de chlorure de dodécyltriméthyl- ammonium à un bouillon entier de fermentation renfermant la protéase, comme décrit ci-dessus. Le bouillon entier est ensuite transvasé de l'appareil de fermentation dans une 15 cuve; on ajoute un agent de floculation, par exemple le -produit "Drewfloc" 412 de la firme Drew Chemical ou le produit KC-5" de la firme Rohm and Haas, en proportion de 0,1 à 4,0 /» ea volume, puis on filtre le bouillon et on le clarifie par addition d'auxiliaires de filtration tels 20 que le produit "Super-Cel" de la firme Johns-Mannville, en proportion de 0,1 à 10 f en poids pour former un bouillon limpide et brillant contenant la protéase. Le bouillon limpide est concentré par ultra-filtration au moyen d'un appareil de traitement "Osmotik" construit par la 25 firme Havens International, San Diego, Californie, à environ 5-8 f du volume initial de filtrat recueilli. Ce concentré de protéase contient environ 65 à 85 f° de la protéase initiale recueillie et peut être utilisé directement comme additif pour détergents. En outre, ce concentré de protéase peut être 30 séché par pulvérisation pour former une préparation de protéase sèche et sensiblement stable, sensiblement exempte de spores. Comme décrit ci-dessus, cette préparation peut être utilisée dans divers milieux pour lesquels les protéases se sont montrées intéressantes. 35 Exemple 3 dans l'exemple 2 par une autre culture de Bacillus. sélectionnée En remplaçant la culture de B. subtilis utilisée 72 05640 15 2125617 d'après le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, on obtient ■un bouillon de fermentation contenant une protéase et étant sensiblement exempt de spores bactériennes viables. Ce bouillon est traité au moyen des opérations décrites dans 5 l'exemple 2 et donne une préparation de protéase sensiblement exempte de spores. Propriétés de la protéase alcaline Propriétés iomunologiques* Réaction en croix avec des anti-sérums relatifs 10 aux types Ylll/Sarlsberg de subtilopeptidase sur des plaques de gélose à double diffusion de Ouchterlony. * Déterminées au moyen de la méthode décrite dans • ■ — - —* un article de 0. Ouchterlony, "Progress in Allergy", , 1-78 (1958), S. Karger, éditeur, Bêle/New York. 15 Rapport activité d'estérase/activité de protéase* - 5,61 * l'activité de protéase est déterminée au moyen de la méthode décrite par 1. Keay et Collaborateurs, "Biotechnology and Bioengineering", Volume 12, pages 213-249 (1970). • 20 l'activité d'estérase est déterminée par hydrolyse d'ester méthylique de tosylarginine (10 ) en solution dans le tampon de chlorhydrate de tris 0,1 M. Protéase alcaline : type A Remarque : les protéases alcalines peuvent être divisées en 25 deux types, A et B, d'après leur Rapport s d'activité protéase: estérase. Stabilité maximale du pH : 9,0-10,0 pH optimal : 9,6 Effets de l'acide nitrilotriacétiaue (M'A) et du tripolyphosphate 30 de sodium (STP) sur, la stabilité à un pH égal à 9.0 10 minutes (témoin) ; activité 100 f 50 minutes (pas d'addition) ; activité 65 f° 50 minutes, 0,1 fo de NTA ; activité 75 f° 50 minutes, 0,1 fo de STP ; activité 68 fo 72 05640 16 2125617 RBTOI1MCATI0IT3 1. Procédé de préparation de protéase, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une bactérie asporogène choisie dans le genre Bacillus. dans un milieu nutritif aqueux 5 dans des conditions aérobies. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que les bactéries asporogènes du genre Bacillus sont choisies dans l'espèce Bacillus subtilis. 3. Procédé suivant la'revendication 1, caractérisé 10 par le fait que les bactéries de 1'espèces Bacillus subtilis ont les caractéristiques d'identification de Bacillus subtilis HER1 B-3907 et de ses formes mutantes. 4. Procédé de préparation de protéase, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver une bactérie asporogène choisie 15 dans le genre Bacillus. dans un milieu nutritif aqueux contenant une source de glucide assimilable et d'azote assimilable, dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité importante de protéase ait été conférée à ce milieu, puis à isoler la protéase ainsi produite. 20 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé par le fait que la récupération de lq^rotéase du milieu de fermentation consiste : (a) à ajouter une quantité biocide efficace d'un sel d'ammonium quaternaire au bouillon de fermentation ; 25 (b) à ajouter au bouillon une quantité efficace d'un agent de floculation ; (c) à filtrer et clarifier le bouillon de manière à obtenir un bouillon limpide contenant la protéase ; et (d) à concentrer le bouillon limpide pour obtenir 30 un concentré liquide contenant la protéase, sensiblement exempt de spores viables de Bacillus 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que la séparation de la protéase du milieu de fermentation consiste î 35 (a) à ajouter une quantité biocide efficace d'un sel d'ammonium quaternaire au bouillon de fermentation ; (b) à ajouter au bouillon une quantité efficace d'un agent de floculation ; 72 05640 17 2125617 (o) à filtrer et clarifier le bouillon pour obtenir un bouillon limpide contenant la protéase ; (d) à concentrer ce bouillon limpide pour obtenir un concentré liquide contenant la protéase ; et 5 (e) à sécher le concentré par pulvérisation pour obtenir une préparation sèche , sensiblement stable, de protéase qui est sensiblement exempte de spores viables de Bacillus . 7. Bouillon de fermentation obtenu au moyen d'un procédé conforme à la revendication 1, caractérisé par le fait 10 qu'il contient une^rotéase, et qu'il est sensiblement exempt de spores viables de Bacillus. 8. Procédé de sélection de bactéries asporogènes, choisies dans le genre Bacillus. caractérisé par le fait qu'il consiste : 15 ' (a) à inoculer et cultiver des bactéries du genre Bacillus dans de la gélose pour sporulation j (b) à séparer les cellules bactériennes de cette gélose et à traiter les cellules avec une quantité efficace d'un lysozyme pour détruire les cellules végétatives ; 20 (c) à laver les spores restantes de Bacillus avec de l'eau distillée stérilisée ; (d) à faire germer les spores lavées de Bacillus par mise en suspension de ces spores dans un milieu de germination ; 25 (e) à provoquer la mutation des spores germées ; (f) à semer les spores après mutation sur une gélose différentielle de pigmentation et de sporulation ; et (g) à sélectionner les formes mutantes non pigmentées asporogènes et oligosporogènes de Bacillus. 30 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait qu'on utilise la IT-méthyl-lI'-nitro-U~nitroso-guanidine pour effectuer la mutation des spores germées.