La présente invention concerne des perfectionnements apportés à des enzymes et elle concerne en particulier la modification d'enzymes par fixation à des gangues solides insolubles dans l'eau, c'est-à-dire à un polysaccharide ou à un de ses 5 dérivés, à du "Nylon" ou à du verre. Plus particulièrement, la présente invention concerne 1'insolubilisation d'enzymes à l'égard de l'eau par la fixation chimique de ces enzymes sur un polysaccharide insoluble ou sur un de ses dérivés, sur du "Nylon" ou sur du verre, l'invention 10 vise à proposer des préparations d'enzymes sous une forme permettant de les réutiliser de façon répétée où de les utiliser continuellement, où. ces enzymes sont plus stables à la chaleur que les enzymes solubles correspondantes, et permettant de les régénérer lorsque l'activité enzymatique a diminué. 15 Un but de la présente invention consiste à proposer des préparations actives et insolubles dans l'eau d'enzymes chimiquement associées à des dérivés organo-métalliques d'un polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre". On peut obtenir les dérivés organo-métalliques du poly- 20 saccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre, en ou faisant réagir ce polysaccharide/ ses dérivés, le "Nylon" ou le verre avec un sel ou un autre dérivé d'étain, de titane, de zirconium ou de fer donnant un dérivé organo-métallique approprié. 25 "On autre but consiste à proposer un procédé permettant de régénérer de tels dérivés d'enzymes insolubilisées (après que leur activité a sensiblement diminué) et selon lequel on utilise,pour la régénération,un procédé essentiellement similaire à celui de l'association d'origine. 30 La présente invention propose des dérivés, insolubles dans l'eau, de l'amyloglucosidase, de la glucose-oxydase, de l'invertase, de la trypsine, de 1'a-amylase, de la glucose-isomérase, de la pronase, de la catalase, de la lactate-déhy-drogénase ou de l'uréase, chimiquement associées à des déri-35 vés d'étain, de titane, de-zirconium ou de fer d'un polysaccharide ou d'un de ses dérivés, de "Nylon" ou de verre. Selon la présente invention, la Demanderesse propose 72 04267 2 2124584 également un procédé pour la préparation d'une enzyme insoluble dans l'eau, selon lequel on fait réagir l'enzyme à un pH compris entre 3 et 7 avec un dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer, d'un polysaccharide ou d'un de ses dérivés, 5 de "Nylon" ou de verre. On peut effectuer la réaction à une température comprise entre 0° et 45°C, et comprise de préférence entre 0° et 20°C. La durée de la réaction peut se situer entre 1 mn et 18 heures, et de préférence entre 3 heures et 18 heures. 10 Le poids d'enzyme libre que l'on applique par gramme de dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer, peut se situer entre 20 et 1000 mg, et de préférence entre 40 et 250 mg. Le polysaccharide peut être de la cellulose,ou un de ses dérivés, qui peut être sous la forme de cellulose micro- 15 cristalline, de diéthylaminoéthyl-cellulose, de carboxyméthyl-cellulose, de sciure de bois, de morceaux de bois, de papier-filtre ou d'une membrane. Le polysaccharide peut également être du dextrane réticulé ou de l'amidon réticulé. La cellulose peut être présente à l'état brut ou naturel 20 et elle peut avoir subi une fabrication lui donnant diverses formes comme celles de feuilles, de tubes, de membranes, de fibres, de fils ou de matières tissées. On peut aussi chélater l'enzyme sur un titanate, un zirconate, un stannate ou un complexe de fer de la cellulose né ces 88.11*63 25 ou d'un de ses dérivés, qui contient encore les groupes hydroxyle^ On peut obtenir le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de -fer par la réaction du polysaccharide ou de son dérivé, de "Nylon" ou du verre avec un sel, de préférence un halogénure ou un sulfate, du métal. de 30 Ainsi, on peut faire réagir la cellulose avec des solutions/ TiCl4,TiCl5,ZrCl4,SnCl4,SnCl2,Ti2(S04)5, FeCl2, FeCl3 ou PeSO^ ou d'autres sels de ces métaux et puis sécher ou agiter à des, températures comprises entre 20° et 60°C et laver la cellulose jusqu'à ce qu'elle ne contienne plus de sels n'ayant pas réagi. 35 On peut faire réagir la cellulose microcristalline ou du verre avec une solution à 12,5 % en poids/volume de chlorure titaneux ou à 15 ^ en poids/volume de chlorure titanique et 72 04267 3 2124584 sécher par exemple durant 18 heures à 45°C. On peut faire réagir du "Nylon" avec une solution à 15 i° en poids/volume de chlorure titanique et sécher le "Nylon" à 45°C. 5 lorsque l'enzyme est l'amyloglucosidase, la pronase, la catalase, la lactate-déhydrogénase ou la glucose-oxydase, on peut la faire réagir dans un tampon d'acétate à pH 4,5 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou de son dérivé, du "Nylon" ou du verre. 10 lorsque l'enzyme est l'a-amylase, on peut la faire réagir dans un tampon d'acétate à pH 5,5 à 6,0 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou de son dérivé, du "Nylon" ou du verre. lorsque l'enzyme est l'uréase, on peut la faire réagir 15 dans un tampon de phosphate à pH 7,0 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre. lorsque l'enzyme est la glucose-isomérase, on peut la faire réagir dans du tampon tris à pH 7,0 avec le dérivé de 20 titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre. lorsque l'activité catalytique de l'enzyme a nettement diminué ou bien est épuisée, on peut retraiter l'enzyme insoluble de la même manière que l'on a traité la gangue insoluble 25 de cellulose, de "Nylon" ou de verre d'origine pour préparer l'enzyme insoluble. Par conséquent, et toujours selon la présente invention, la Demanderesse propose un procédé pour la régénération d'une enzyme insolubilisée, selon lequel on fait réagir 1'enzyme)inso-30 lubie et épuisée, avec un sel ou un dérivé de titane, d'étain de zirconium ou de fer, et l'on fait ensuite réagir le dérivé ainsi obtenu avec l'enzyme, le sel utilisé dans le procédé de régénération peut être le même que celui utilisé dans la préparation originelle de l'enzyme insoluble dans l'eau. 35 Un avantage particulier de la présente invention,destinée à produire des enzymes insolubles dans l'eau,est que l'on peut obtenir par un procédé rapide et unique, dans des conditions 72 04267 4 2124584 réactionnelles normales, un produit ayant une grande activité enzymatique, ce qui implique une rétention élevée de l'activité spécifique de l'enzyme libre. Un second avantage est que l'on peut appliquer le procédé à l'association d'une large gamme 5 d'enzymes à un grand nombre de matériaux différents de support, par exemple de la cellulose microcristalline, de la sciure de bois, des copeaux ou morceaux de bois, du papier-filtre, du coton hydrophile, du "Nylon" ou du verre. Un troisième avantage peut être constitué par la plus grande stabilité thermique de l'en-10 zyme insolubilisée par comparaison avec l'enzyme soluble, ce qui donne une plu^rande période possible d'emmagasinage, une plus grande rétention d'activité aux températures de service et ce qui permet d'utiliser l'enzyme pendant une période prolongée. Un quatrième avantage est que l'on peut simplement 15 régénérer l'enzyme insolubilisée, lorsque son activité a diminué jusqu'à un niveau peu économique,en appliquant un procédé qui est essentiellement le même que le procédé d'association d'origine sans dégrader de façon appréciable le matériau de support d'origine. 20 On trouvera ci-après une description, donnée à titre illustratif mais non limitatif,des modes de réalisation de l'invention. Sels métalliques utilisés dans les Exemples : le chlorure titaneux (TiCl^) a été acheté chez Hopkin 25 & Williams sous forme d'une solution à 12,5 i° en poids/volume de qualité technique, le chlorure titanique (TiCl^) est également une qualité technique obtenue chez BDH (BDH Chemicals limited) sous forme d'une solution à 1 5 en poids/volume contenant 15 en poids/volume d'acide chlorhydrique. le sulfate 30 titaneux (TigCSO^)^) est une solution BDH à 15 i° en poids/volume contenant 23 $ d'acide sulfurique en poids/volume. le chlorure stannique (SnCl^.5 HgO), le tétrachlorure de zirconium (ZrCl^), le chlorure ferreux (FeG^^H^O) et le chlorure ferrique (FeCl^.ôH^O) sont des produits BDH de qualité 35 technique, le chlorure stanneux (SnClg^HgO) et le sulfate ferreux (FeSO^.THgO) sont des produits BDH "Analar" (de qualité analytique). 72 04267 2124584 EXEMPLE 1 On ajoute 1 ml d'une solution à 12,5 $ en poids/volume de chlorure titaneux à 100 mg de cellulose microcristalline ("Signacell", type 19, acheté à la "Signa" (London) Chemical 5 Co. England) dans un verre de montre de 5 cm de diamètre et l'on mélange bien durant une minute. On place ensuite la suspension dans une étuve à 45°C durant 16 heures. On transfère le solide résultant dans un tube à essai et on le lave ensuite par agitation durant dix minutes avec 10 ml de tampon d'acétate 10 (0,02 M,* pH 4» 5) et centrifugation. On répète deux fois encore le lavage au tampon d'acétate; après quoi la suspension a une. couleur crème. On ajoute à cette suspension 1 ml d'une solution d'amylo glycosidase dialysée du commerce (provenant d'Aspergillus niger 15 "Agidex",/Glaxo;activité : 67 unités/mg de protéine) avec 4 ml de tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,5) à 4°C et l'on soumet à une agitation magnétique à 0°-5°C durant 18 heures. On soumet le dérivé d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage par -10 ml de tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,5) et 20 10 ml d'une solution 1M de chlorure de sodium dans le même tampon. On lave finalement le dérivé d'amyloglucosidase deux fois avec du tampon d'acétate (0,02M; pH 4,5). Des lavages supplémentaires ne permettent plus d ' enlever^ par élution,de l'enzyme du dérivé d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau. 25 On répète l'expérience en utilisant des concentrations différentes de TiCl^, (6,25 $ en poids/volume ; 2,5'$ en poids/ volume ; 1,25 i° en poids/volume). On détermine de la façon suivante l'activité d'amyloglucosidase du dérivé insoluble dans l'eau. On met en équilibre 30 à 45°C dans un tube à essai soumis à une agitation magnétique 10 ml d'une solution d'amidon soluble (à 1 $ d'amidon BDH de qualité "Analar"). On ajoute 1 ml d'une suspension du dérivé insoluble dans l'eau et l'on prélève à des intervalles d'une minute des échantillons d'un millilitre que l'on ajoute à de 35 des tubes contenant du réactif/ Hegedorn et Jensen (Hegedorn H.C. et Jensen B.N. Biochem Z. 135 46 (1923)). On détermine les sucres réducteurs dans l'échantillon par le procédé de 72 04267 6 2124584 Hegedorn et Jensen et l'on compare avec une courbe étalon obtenue à l'aide de solutions de glucose. On trace, pour obtenir la vitesse initiale de réaction, la tangente au temps zéro de la courbe du glucose produit en fonction du temps. On définit 5 une unité d'activité d'amyloglucosidase comme étant la quantité d'enzyme qui libère des sucres réducteurs équivalant à 1 pmole de glucose en 1 mn à 45°C. On détermine le poids sec de la suspension du dérivé insoluble dans l'eau en séchant une partie aliquote (1 ml) dans un verre de montre dans une étuve à 60°C 10 durant 1 heure, en refroidissant dans un dessiccateur et en pesant. On détermine de la façon suivante la teneur en protéines du dérivé d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau. Dans un tube de verre, on ajoute à 2 ml de HC1 (6N) un échantillon d'un 15 millilitre de la suspension du dérivé servant à la détermination de l'activité. On ferme bien le tube et on le maintient à 110°C durant 18 heures dans une étuve. On ouvre ensuite le tube, on en centrifuge le contenu et l'on transfère à l'aide d'une pipette un échantillon de 2 ml du liquide surnageant dans une 20 bouteille d'échantillon de 5 ml. On évapore cette solution à siccité dans un dessiccateur à vide-et l'on dissout à nouveau le solide restant dans 2 ml d'eau distillée. On place 0,5 ml de cette solution dans un tube à essai et l'on ajoute 2 ml de réactif à la ninhydrine. Après avoir secoué à fond, on place 25 le tube dans un bain d'eau bouillante durant 20 mn. Après l'enlèvement du bain-marie, on ajoute 5 ml d'une solution 1:1 d'eau distillée et de n-propanol, on secoue bien et on laisse reposer durant 18 minutes. On lit l'absorption à 570 m(i, dans un spectrophotomètre (cuvettes de verre de 1 cm) en uti-30 lisant un échantillon ou témoin à blanc obtenu en suivant le même mode opératoire avec 0,5 ml d'eau distillée, et l'on compare avec une courbe d'étalonnage obtenue avec une solution M/1000 de leucine (BDH). (Moore S, Stein W.H. J. Biol. Chem. 176, 367 (1948)). 35 On détermine de façon similaire l'activité et l'acti vité spécifique de l'enzyme soluble. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau I. 72 04267 7 2124584 TABLEAU I 20 25 Pré- Sel para- tion nc Con- Unités cen- d'enzy-tra- më par tion mg de 6 en poids/ provolume) téines libres mg de protéines liées par g de so- • lide sec liées Unités d ' enzyme par mg Unités d ' enzyme par g de pro- de so-téines lide io de rétention de l'activité spécifique sec 10 1 TiCl^ 12,5 67 147 31,1 4570 46,5 2 TiCl 6,25 67 106 31,9 3380 44 3 TiCl3 2,5 67 . 88,5 30,3 2660 45,5 4 TiCl_ 3 1,25 67 69,5 33,8 2350 51,0 15 On considère qu'une unité d'amyloglucosidase est celle qui libère 1 micromole de glucose à 45°C en 1 mn. EXEMPLE 2 On utilise le même mode opératoire que dans l'Exemple 1, sauf qu'au lieu de la solution de chlorure titaneux, on prend des échantillons d'un millilitre chacun de chacun des sels suivants aux diverses concentrations indiquées ; chlorure titanique (15 ; 7,5 i° ; 3 i°, 1,5 i°\ 0,3 $ et 0,15 i°) ; sulfate titaneux (15$) ; chlorure stannique (1 % ; 5 i°, 10 $ et 20 $) ; chlorure stanneux (10 $) ; tétrachlorure de zirconium (1,5 $ ; 10 $ et 20 $); chlorure ferreux (0,1 % ; 1 $ ; 5 $ ; 10 $ et 20 $) ; chlorure ferrique ( 10 $) et sulfate ferreux (10 fa) . On détermine de façon similaire à celle décrite dans l'Exemple 1 les activités des enzymes et les teneurs en protéines des dérivés d'amyloglucosidase insolubles dans l'eau. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau II. 72 04267 8 2124584 Prépara- Sel tion associé n Con-cen-tra-tion du sel (* P/v) TABLEAU II Unités d'enzyme par g de solide Unités d'enzyme par mg de protéines liées $ de rétention de l'activité spécifique 5 TiCl4 15 3300 34,5 52,0 6 TiCl4 7,5 3020 32,5 49,0 10 7 Ti014 3 2800 30,5 46,0 8 TiCl4 1 » 5 2600 30,8 46,5 9 TiCl4 0,3 775 29,2 43,5 10 TiCl4 0,15 665 48,0 72,5 11 Ti2(S04)3 15 389 32,8 51,3 15 12 SnCl4 1 1080 53,0 83,0 13 SnCl4 5 1900 34,0 53,0 14 SnCl4 10 2100 36,0 56,0 15 SnCl4 20 1570 30,2 47,5 16 SnCl2 10 1325 29,4 45,0 20 17 ZrCl4 1 1680 36,6 55,0 18 ZrCl4 5 1550 31,6 47,5 19 ZrCl4 10 1820 33,8 51,0 20 ZrCl4 20 1700 27,5 41,0 21 FeCl2 20 1720 32,2 48,5 25 22 PeCl2 10 1470 37,2 56,0 23 PeCl2 5 1025 32,8 49,0 24 EeCl2 1 525 26,4 39,6 25 PeCl2 0,1 400 49,5 74,0 26 FeCl3.6H20 10 1430 41 61,5 30 27 PeS04.7H20 10 526 24,6 31,5 EXEMPLE 3 On agite les dérivés de titane de la cellulose microcristalline, préparés comme dans les exemples 1 et 2, avec diverses quantités (comprises entre 416 et 2500 unités) d'amyloglucosidase 35 dialysée du commerce (comme dans l'Exemple 1). L'association ou copulation et les autres modes opératoires sont par ailleurs identiques à ceux de l'Exemple 1. 72 04267 2124584 On détermine de façon similaire à celle décrite dans l'Exemple 1 les activités des enzymes et les teneurs en protéines des dérivés d'amyloglucosidase insolubles dans l'eau. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau III. TABLEAU III pré Unités mg de Unités Unités $*de réten para d'enzy protéines d'enzyme d'enzyme tion de l'ac tion me libre . d'enzyme par g de par mg tivité spéci n° appliquées libre ap- solide de fique 10 par g de pliquées sec protéines solide par g ae liées solide 28 4160 62,1 1895 30,2 45,5 29 8350 124,2 3340 40,5 60,5 15 30 16700 248,4 3920 30,8 41,5 31 25000 373,1 3250 27,2 41,0 32 4160 62,1 1270 27,0 40,5 33 8350 124,2 2550 36,6 55 34 16700 248,4 2640 32,2 48,5 20 35 25000 373,1 2300 27,8 41,5 25 30 35 Les préparations n° 28 à 31 ont été obtenues avec du dérivé préparé à l'aide de 15 $ en poids/volume de TiCl^ et les 'préparations n° 32 à 35 ont été obtenues à_ l'aide d'un dérivé préparé avec 12,5 $ en poids/volume de TiCl^. - .... EXEMPLE 4 On ajoute des parties aliquotes (1 ml) d'une solution à 12,5 $ de chlorure titaneux à quatre échantillons (100 mg) de cellulose microcristalline dans des verres de montre de 5 cm de diamètre et l'on mélange bien durant 1 minute. On place ensuite un échantillon dans une étuve à 60°C, un échantillon dans une étuve à 45°C, on laisse un échantillon à la température ambiante et l'on place un échantillon dans un dessiccateur à vide en utilisant des pastilles d'hydroxyde de sodium comme agent de dessiccation. On laisse tous les échantillons reposer durant 16 heures environ. On ajoute des parties aliquotes(l ml) de solution à 12,5 $ de chlorure titaneux à deux échantillons (100 mg) de cellulose 72 04267 10 2124584 microcristalline dans des tubes à essai. On agite un tube à .essai durant 16 heures environ à 45°C et l'on agite l'autre tube à essai durant 16 heures environ à la température ambiante. On lave tous les échantillons, on les associe ou copule avec de l'amylo-5 glucosidase et on lave à nouveau de façon similaire à celle décrire dans l'Exemple 1. On détermine comme décrit dans l'Exemple 1 les activités enzymatiques des dérivés d'amyloglucosidase insolubles dans l'eau. Les résultats obtenus sont présentés TABLEAU IV au Tableau IV. Préparation n° Conditions de réaction Unités d'enzyme par g de dérivé solide 36 Séché à 20°C 945 37 Séché à 45°C 4980 38 Séché à 60°C 6230 39 Séché sous vide à 20°C 1860 40 Agité à 20°C 1410 41 Agité à 45°C 1050 EXEMPLE 5 On garde des échantillons de 100mg d'amyloglucosidase insolubilisée, préparés de la façon décrite dans l'Exemple 2 avec (a) du tétrachlorure de zirconium, (b) du chlorure stan-25 nique et (c) du chlorure titaneux, sous 10 ml de tampon d'acétate (0,02 MjpH 4>5) à. 50°C pendant des périodes dont le maximum est de six jours. A des intervalles de 24 heures, on prélève des échantillons de 0,5 ml et l'on en .titre l'activité enzyma-tique en utilisant la méthode de détermination décrite dans 30 l'Exemple 1. On effectue une comparaison avec un échantillon de l'enzyme soluble. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau V. 72 04267 n 2124584 TABLEAU V Prépa- associé 0 24h 48h 72h 96h 120h 144 heures 42 ZrCl4 100 76,5 70,5 63 57,5 56,0 - 43 SnCl4 100 100 100 98 88,5 ' - 80,5 44 TiCl^ 100 95,5 - 87 75 78,5 75 45 enzyme soluble 100 93 81 - 76 - 69 10 EXEMPLE 6 On prépare comme dans l'Exemple 1, en utilisant une solution à 12,5 f° de TiCl^ comme sel associé , 100 mg d'amyloglucosidase insolubilisée et active (activité : 2000 unités par gramme de solide) en suspension dans 5 ml de tampon d'acétate 15 (0,02M ; pH 4,5). On sépare le dérivé par centrifugation et on le place sur un verre de montre. On ajoute 1 ml de solution à 12,5 $ de TiCl^ et l'on mélange la suspension, puis l'on sèche durant 16 heures environ à 45°C. On lave de façon normale le solide séché et- l'on en détermine ensuite l'activité enzymatique 20 de façon normale. L'activité est alors nulle. On redonne une activité enzymatique à un échantillon de 35 mg du dérivé en ajoutant 1 ml d'amyloglucosidase dialysée plus 4 ml de tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,5). On effectue un lavage comme décrit antérieurement et l'on titre le dérivé pour en déterminer l'ac-25 tivité enzymatique. On répète l'expérience en utilisant une enzyme insoluble préparée avec une solution à 15 °/° de chlorure titanique et l'on régénère avec (a) un millilitre d'une solution à 15 $ de chlorure titanique et ensuite avec (b) un millilitre d'une solution 30 à 7,5 $ de chlorure titanique. On détermine par les procédés décrits dans l'Exemple 1 toutes les activités enzymatiques et les teneurs en protéines. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau VI. 72 04267 12 2124584 Préparation n° 46 Enzyme initiale (associée à TiCl^) Après addition de TiCl^ Après régénération Préparation n° 47 10 15 20 Enzyme initiale (associée à TiCl^) Après traitement avec 1 ml de TiCl4) (15 36) Après régénération Après nouveau traitement avec 1 ml de TiCl4(7,5 ? Après régénération TABLEAU VI Unités d'activité enzymatique/g de dérivé 2000 0 7750 Unités Mg de pro- d'en- téines zyme/g liées/g de so- de solide lide 2800 0 5100 0 3010 Unités d'enzyme/mg de protéines liées $ de rétention d'activité 88,5 65,5 158,0 244,0 31,5 55,0" 35,1' 47,0 82,0" 55,0" + par mg de nouvelles protéines liées. 25 EXEMPLE 7 On immerge 100 mg de papier-filtre (Whatman n° 1) dans 5 ml d'une solution à 12,5 i° en poids/volume de chlorure titaneux durant 15 mn, après quoi on verse la liqugur surnageante. On sèche ensuite le papier durant deux heures/appliquant l'un 30 des modes opératoires suivants, (a) séchage à l'air à 20°C ; (b) séchage en étuve à 37°C ; (c) séchage.en étuve à 60°C. Une fois le séchage achevé, on lave le solide en l'agitant dans une solution de tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,5) jusqu'à disparition de la couleur bleue. On ajoute à 4°0 1 ml d'amylo-35 glucosidase (contenant 4,7 mg d'amyloglucosidase par ml ; activité spécifique : 74 unités/mg de protéines) et on laisse reposer durant 16 heures environ à 4°0. On lave avec une solution 72 04267 13 2124584 10 nc tampon et avec une solution de sel, de façon similaire à celle des exemples précédents, l'amyloglucosidase ayant subi l'association avec un sel. On détermine par les procédés décrits dans l'Exemple 1 les activités enzymatiques et les teneurs en protéines. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau VII. TABLEAU VII Pré- Tempé- Unités d'activité Unités d'ac- # de réten-para- rature totale/g de solide tivité spéci- tion de l'action de fique/mg tivité spéci- séchage, °C fique. 48 49 50 20 37 60 127 165 113 27,0 17,9 17,9 36.5 24.6 24,6 15 20 25 30 35 EXEMPLE 8 On active de façon similaire à celle décrite dans l'Exemple 1, à l'aide d'une solution à 12,5 $ en poids/volume de chlorure titaneux, 100 mg de (a) farine de bois* (obtenue chez H. Richardson & Sons Ltd., Marlow, Bucks ; granulométrie : 100-300 y) ou de (b) sciure de bois (obtenue chez H. Richardson & Sons Ltd., granulométrie 250-800 p.) ou (c) de la ouate de coton (ouate blanche non absorbante obtenue chez Eisons Scientific Apparatus, Loughborough) .On immerge... ensuite chaque échantillon à 4°C dans 1,0 ml de solution d'amyloglucosidase (activité : 74 unités/ mg de protéines î 4,7 mg/ml). On lave de façon similaire à celle antérieurement décrite l'amyloglucosidase insoluble. On détermine par les procédés décrits dans l'Exemple 1 les activités enzymatiques et les teneurs en protéines. Les résultats obtenus sont présentés au Tableau VIII. TABLEAU VIII Prépa- Support solide Unités d'activité mg de pro- _ $ de rération totale/g de solide téines liées/ tention n° g de solide de l'activité spécifi-que 40 51 Farine de bois 239 52 Sciure de bois 165 53 Ouate de coton 192 8,1 4,6 4,0 40,0 48,5 48,0 72 04267 14 2124584 EXEMPLE 9 On ajoute 1 ml d'une solution à 15 $ de chlorure titanique à 100 mg de fibres de "Nylon" ("Nylon 66" de I.C.I. (fibres) Ltd., Pontypool) dans un verre de montre de 5 cm de diamètre et l'on 5 mélange bien durant 1 mn. On sèche la suspension dans une étuve à 45°C durant 16 h environ, après quoi on lave, trois fois la poudre sèche avec 10 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) et l'on sépare par centrifugation. On prépare à partir de ce solide, par le procédé décrit 10 dans l'exemple 1, une amyloglucosidase insoluble. On répète l'exemple en utilièant 1 ml d'une solution à 7,5 $ de chlorure titanique. On détermine par le procédé décrit dans l'exemple 1 l'activité enzymatique de chaque dérivé d'amyloglucosidase insoluble ■15 dans l'eau. Les résultats obtenus sont présentés au tableau IX. TABLEAU IX Préparation Concentration de TiCl. Activité totale de l'enzyme N° (poids/volume) insoluble (unités/gramme de solide) 20 54 15 2780 55 7,5 1525 EXEMPLE 10. On ajoute 1 ml ou 0,5 ml d'une solution à 15 $ de chlorure titanique ou 1 ml d'une solution à 12,5 $ de chlorure titaneux 25 ou 1 ml d'une solution à 10 $ de chlorure stannique à 100 mg de poudre de verre "Pyrex" dans un verre de montre de 5 cm de diamètre et l'on mélange bien durant 1 mn.-On applique ensuite un mode opératoire similaire pour produire une amyloglucosidase insolubilisée en opérant comme décrit dans l'exemple 1. On répète 30 l'expérience avec un échantillon de verre sodique sous forme de particules sphéroïdales dont le diamètre moyen est de 105 microns, en utilisant 1 ml de solution à 15 $ de chlorure titanique ou bien 1 ml de solution à 12,5 $ de chlorure titaneux. On détermine par les procédés décrits dans l'exemple 1 35 l'activité enzymatique et la teneur en protéines des dérivés d'amyloglucosidase insolubles dans l'eau. Les résultats obtenus sont 'présentés au tableau X. 72 04267 15 2124584 TABLEAU X Prépa Type de Mélange Concentra Activité Pourcentage ration verre réactionnel tion des totale de rétention N° protéines Unités/ de l'activité 5 liées gramme spécifique mg/g de de solide solide 56 "Pyrex". 1 ml 15 7° 2790 10 TiCl^ 57 "Pyrex" 1 ml 12,5 1° 68,5 2300 50,5 TiCl^ 58 "Pyrex" 0,5 ml 79 2860 49,2 15 $ TiCl4 15 59 "Pyrex" 1 ml 10 io 29,6 1090 47,2 SnCl4 60 Sodique 1 ml 15 1° •_ 730 Tid4 61 Sodique 1 ml 12,5 1" 490 20 TiCl- 3 EXEMPLE 11 On active trois échantillons (100 mg) de cellulose micro-cristalline (19 P-) à l'aide d'une solution à 12,5 $ de chlorure titaneux en opérant de la façon décrite dans l'exemple 1. On 25 met les dérivés solides ainsi obtenus en contact avec des solutions d'amyloglucosidase (activité : 390 unités/ml) d'une façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1, sauf que la durée de contact est de (a) 3 heures, (b) 18 heures et (c) 42 heures. Les modes opératoires de lavage et de titrage sont les mêmes que ceux 30 décrits dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés au tableau XI. TABLEAU XI Activité totale du dérivé Préparation Temps de contact d'amyloglucosidase insoluble 35 N° (heures) dans lleau, unités/g de solide 62 63 64 3 18 42 1000 1010 -820 72 04267 16 2124584 EXEMPLE 12 On active deux échantillons de 100 mg de cellulose microcristalline (19 n) d'une façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1 en utilisant 1 ml de solution à 15 $ de chlorure 5 titanique. On met les dérivés solides ainsi obtenus en contact avec des solutions identiques d'amyloglucosidase (activité : 780 unités/ml) de façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1. Pour l'échantillon (a), le contact s'effectue durant 18 heures à 20°C, et pour l'échantillon (b), le contact s'ef-10 fectue durant 18 heures à 2°0. les procédés de lavage et de titrage sont comme décrits précédemment. Les résultats obtenus sont présentés au tableau ZTI. TABLEAU XII Préparation Température de Unités d'enzyme Unités d'enzyme jt- N° contact /g de solide /mg de protéines sec liées 65 20°C 2100 30,5 66 2°C 2300 35,5 EXEMPLE 13 20 On active des échantillons de 100 mg de cellulose micro cristalline (19 n) d'une façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1 à l'aide de 1 ml d'une solution à 15 $ de chlorure titanique. Après avoir lavé les dérivés métalliques de cellulose ainsi obtenus, en opérant de la façon décrite dans l'exemple 1, 25 on jette les liqueurs finales de lavage et l'on met à nouveau le solide ensispension dans des échantillons de 1 ml des solutions des tampons suivants : (a), (b) et (c) : tampons d'acétate ; 0,02 M ; pH 3,5 ; 4,2 et 4,9, respectivement ; (d) tampons de phosphate (0,02 M ; pH 6,8) et de borate (0,02 M ; pH 8,5). On 30 met ces suspensions en contact avec des échantillons de 1 ml d'amyloglucosidase (contenant 10 mg de protéines, 780 unités d'activité) dans chacun des tampons décrits ci-dessus durant 18 heures à 0°-4°C. On effectue ensuite le lavage et la remise en suspension de la façon décrite dans l'exemple 1, avec les solu-35 tions de lavage décrites dans cet exemple 1, et l'on mesure de la manière antérieurement décrite l'activité du dérivé d'amylo- 72 04267 17 2124584 glucosidase insoluble dans l'eau. lies résultats obtenus sont présentés au tableau XIII. . TABLEAU XIII Préparation pH de la solution de Activité totale de l'enzyme N° contact insoluble dans l'eau obtenue Unités/g de solide 10 67 3,5 1800 68 4,2 2050 69 4,9 2300 70 6,8 1600 71 8,5 1610 -RTRIvrPT.-R 14 On ajoute 1 ml d'une solution à 12,5 $ de chlorure titaneux à 100 mg de cellulose microcristalline ("Sigma CelPjtype 38) 15 dans un verre de montre de 5 cm de diamètre et on mélange bien durant 1 mn. On place ensuite la suspension dans une étuve à 45°C durant 16 heures environ. On transfère le solide résultant dans un tube à essai et on lave ensuite par agitation durant 10 mn avec 10 ml d'un' tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) et l'on centri-20 fuge. On répète deux fois le lavage avec 10 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5). On ajoute à cette suspension 1 ml d'une solution à 10 mg de pronase par millilitre (provenant de Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Grande-Bretagne) avec 4 ml de tampon 25 d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) à 4°0 et l'on soumet à 18 heures d'agitation magnétique. On soumet le dérivé de pronase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage avec 10 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) et 10 ml de solution 1 M de chlorure de sodium dans le même tampon. On lave finalement le dérivé de pronase deux 30 fois avec 10 ml de tampon d'acétate (0,02 M; pH 4,5). On effectue une expérience témoin dans laquelle on met une partie aliquote similaire de pronase en contact avec 100 mg de cellulose seule au lieu du complexe de cellulose et de titane. On établit l'activité enzymatique des deux préparations par une modi-35 fication du procédé Y. Ngrahashi [Methods in Enzymology, 19 (1970) 651] en utilisant de la caséine comme substrat. On agite 100 mg 72 04267 18 2124584 de chaque préparation, en suspension dans 2 ml de tampon d'acétate (0,02 M, pH 4,5), à 40°C avec une partie aliquote (2 ml) de solution de caséine dans du tampon de phosphate^O,1 M ; pH 6,5),également à 40°C. Cette combinaison donne un pH de 5,8. Au bout de 5 10 mn, on ajoute 4 ml d'acide trichloracétique 0,11 M dans de l'acétate d'ammonium 0,22 M et de l'acide acétique 0,33 M à cha--que suspension et, après centrifugation, on mesure à 275 mu la densité optique du liquide surnageant. Après une telle incubation, les liquides surnageants provenant des préparations de pronase in-10 soluble présentent à 275 mp. une-densité optique de 0,370 (cellu-lose-titane-pronase) à comparer avec une densité optique de 0,170 (cellulose-pronase) et une densité optique de 0,125 pour un témoin à blanc utilisant les réactifs. Ces activités, mesurées à pH 5,8, restent virtuellement constantes après deux nouveaux la-15 vages avec du tampon d'acétate(0,02 M, pH 4,5), et les liqueurs de lavage ne présentent aucune activité. EXEMPLE 15 On prépare comme dans l'exemple 14 des lots de 100 mg du complexe cellulose-titane. On mélange 1 ml d'une suspension à 16 mg 20 par millilitre de lactate-déhydrogénase. (150 |i/mg) de coeur de boeuf provenant de Koch-light Laboratories Ltd. avec 4 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) à 4°C ; on rajoute cette suspension à 100 mg de complexe cellulose-titane et l'on soumet à 18 heures d'agitation magnétique. On lave ensuite,par le mode opératoire 25 décrit dans l'exemple 14,1a préparation de lactate-déhydrogénase insoluble dans l'eau. On effectue une expérience témoin dans laquelle on met une partie aliquote similaire de lactate-déhydrogénase en contact avec 100 mg de cellulose seule au lieu du complexe de cellulose et de titane. 30 On met chaque préparation (100 mg) en suspension dans 1 ml de tampon d'acétate(0,02 M, pH 4,5), on ajoute 1 ml d'une solution 0,001 M f"pyruvate de sodium et 0,01 ml d'une solution (à 3,9 mg par millilitre) de sel de sodium réduit de dinucléotide de nico-tinamide et d'adénine, et l'on fait incuber le tout à 23°C durant 35 15 mn. Après une centrifugation, on mesure à 340 mu les densités optiquegftes liquides surnageants. Les liquides surnageants provenant des préparations de lactate-déhydrogénase insoluble montrent 72 04267 19 2124584 une densité optique (à 340 m[i) de 0,150 (cellulose-titane-lactate-déhydrogénase) à comparer avec une densité de 0,700 (cellulose-lactate-déhydrogénase) et une densité de 1,12 pour le témoin à blanc avec les réactifs. Les activités mesurées à pH 4,5 res-5 tent virtuellement constantes après de nouveaux lavages avec du tampon d'acétate de sodium(0,02 M, pH 4,5), et les liqueurs de lavage ne présentent pas d'activité. EXEMPLE 16 On prépare comme dans l'exemple 14 des lots de 100 mg de 10 complexe de cellulose et de titane. On mélange 1 ml d'une suspension de 20 mg de catalase par millilitre (3750 unités par milligramme ; produit cristallin) de foie de boeuf provenant de Koch-Light Laboratories Ltd. avec 4 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5) à. 4°0, on ajoute cette suspension à 100 mg de complexe 15 de cellulose et de titane et l'on soumet à 18 heures d'agitation magnétique. On lave ensuite, par le mode opératoire décrit dans l'exemple 14, la préparation de catalase insoluble dans l'eau. On effectue une expérience témoin dans laquelle on met une partie aliquote similaire de catalase en contact avec 100 mg de cellulose 20 seule au lieu du complexe de cellulose et de titane. On met 100 mg de chaque préparation en suspension dans 1,0 ml d'eau distillée et l'on ajoute 5,0 ml de peroxyde d'hydrogène à 0,2 et 4,0 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 4,5). On retire au bout de 1 à 10-mn des parties aliquotes (1,0 ml) que 25 l'on mélange immédiatement avec 0,2 ml d'un mélange d'acide sul-furique et d'acide trichloracétique, le mélange étant préparé par la dissolution de 40 g d'acide trichloracétique dans de l'eau pour obtenir 100 ml de solution à laquelle on ajoute ensuite 17 ml d'acide sulfurique concentré. On mélange ensuite des échantillons 30 avec 1,0 ml de solution à 10 $ d'iodure de potassium et on laisse à l'obscurité durant 15 mn. On titre l'iode libéré,à l'aide de thiosulfate de sodium N/100, en utilisant de l'ami'don comme indicateur. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau XIV ci-après. On effectue également un titrage à blanc en utilisant 35 de l'eau distillée, mais pas d'enzyme, et l'on obtient une valeur de 6,20 ml. 72 04267 20 2124584 TAKLBAU XXV 10 Temps (minâtes) Volume de titrage (ml) Cellulose-titane- Cellulose-catalase catalase 1 4,90 f 6,10 2 4,00 6,10 3 3,00 6,00 4 2,10 5,90 5 1,50 5,80 10 1,40 5,70 EXEMPLE 17 On ajoute 1 ml de solution à 15 $ de chlorure titanique à 100 mg de cellulose microcristalline (19 f-0 dans un verre de 15 montre de 5 cm de diamètre et l'on mélange bien durant 1 mn. On sèche la suspension durant 16 heures environ à 45°C. On transfère le solide résultant dans un tube à essai et on le lave par agitation durant 10 minutes avec 10 ml de tampon d'acétate (0,02 M* pH 6,0) et l'on centrifuge. On répète deux fois de plus ce lavage. 20 On ajoute à cette suspension 1 ml d'une solution d'a-amy- lase (3,2 mg de protéines par millilitre ; amylase bactérienne liquide "Hovo" "BANL" 120, de Globe Products Ltd., Accrington, Grande-Bretagne) avec 4 ml de tampon d'acétate (0,02 M ; pH 6,0) et l'on agite durant 18 heures à 4°C(. On soumet le dérivé d'a-amy-25 lase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage avec 10 ml de tampon d'acétate (pH 6,0 ; 0,02 M) et 10 ml de solution M de chlorure de sodium dans le même tampon, avant deux lavages finals avec des tampons d'acétate (0,02 M ; pH 6,0). On détermine de la façon suivante l'activité de l'a-amylase insoluble dans l'eau. On 30 fait incuber à 30°C durant 3 mn 1 ml de la suspension avec 1 ml d'une solution, mise antérieurement en équilibre, à 1 $ d'amidon soluble dans du tampon cP acétate (pH 5,5). On ajoute 2 ml de réactif à base de 3,5-dinitrosalicylate [obtenu à partir de 1 g d'acide dissous dans un mélange de 20 ml de NaOH 2N et 50 ml d'eau 35 contenant 30 g de sel de Rochelle, le tout dilué à 100 ml par addition d'eau] et l'on place le tube dans un bain-marie bouillant 72 04267 21 2124584 durant 10 mn. Après un refroidissement rapide, on centrifuge le contenu du tube et on lit à 520 mp. la densité optique du liquide surnageant que l'on compare à celle d'un témoin préparé comme ci-dessus, mais qui contient du tampon d'acétate à la place de 5 l'enzyme. Une unité d'a-amylase se définit comme étant la quantité d'enzyme nécessaire pour libérer en 3 mn à 30°C, pH 5,5, du sucre réducteur équivalant à 1 mg de maltose. les résultats obtenus sont présentés au tableau XV. TABLEAU XV 10 Préparation mg de protéines Activité d,a-amylase totale N° liées/g de solide du dérivé insoluble, unités/g de solide . 72 1,01 170 EXEMPLE 18 15 On prépare 100 mg d'un dérivé de cellulose et de titane en opérait, de la façon décrite dans l'exemple 17. On ajoute 1 ml d'une solution de glucose-isomérâse (ne comportant pas /clllules brutes , et provenant de L'actobacillus brevis' } contenant" 578' mg de protéines)dans 4 ml de tampon 20 tris(0,02 M, pH 7,0) à une suspension de ce dérivé et l'on agite durant 18 heures à 4°C. On soumet les dérivés de glucose-isomérâse insoluble dans l'eau à un mode opératoire de lavage similaire à celui décrit dans l'exemple 17, en utilisant du tampon tris(0,02 M; pH 7,0) à la place du tampon d'acétate, et l'on détermine de la 25 façon suivante l'activité du dérivé. On fait incuber un échantillon de 1 ml de la suspension d'enzyme avec 2,4 ml de tampon tris(0,05 M ; pH 7,0) et 0,6 ml d'une solution de MnSO, (10~^ M) et de CoClg (10 M) dans de l'eau durant 10 mn à 40°G. On ajoute 2 ml d'une solution aqueuse 2M de glucose "Analar" et l'on fait 30 réagir tout en agitant à 50°C dans un bain-marie. On prélève des échantillons (1 ml ou 4 ml) au bout de 30 mn, 60 mn et 120 mn, et l'on arrête la réaction par l'addition de 0,067 ml-0,27 ml de solution à 10 d'acide trichloracétique. On laisse les solides se déposer, on enlève le liquide surnageant et on le dilue de 35 façon appropriée dans le même tampon. On prélève des échantillons de 1 ml de ces liquides surnageants et l'on en titre le fructose par une variante du procédé de Yaphe et Arsenoult (Yaphe W. et 72 04267 22 2124584 Arsenoult G.P. Anal. Biochem. J_2» 143 (1965)). On définit une unité d1activité de glucose-isomérâse comme étant la quantité d'enzyme nécessaire pour produire 1 p.mole de fructose à partir de glucose en 30 mn dans les conditions du titrage. Les résul-5 tats obtenus sont présentés au tableau XVI. TABLEAU XVI Préparation mg de protéines Activité de glucose-isomérâse liées/g de solide totale du dérivé insoluble, unités/g de solide. 10 73 21,3 1169 EXEMPLE 19 On prépare 100 mg d'un dérivé de cellulose et de titane en opérant de la manière décrite dans l'exemple 17 et on lave en opérant encore deux lavages à l'aide d'un tampon de phosphate 15 (pH 7,0 ; 0,02 M). On ajoute à une suspension de ce dérivé une solution de 30 mg d'uréase provenant de haricot sabre,teneur nominale : 2800 unités/g (provenant de Sigma (London) Chemical Co.) dans 5 ml de tampon de phosphate (0,02 M ; pH 7,0) et l'on agite du-20 rant 18 heures à 4°C. On soumet les dérivés d'uréase insoluble dans l'eau à quatre lavages avec 10 ml de tampon de phosphate (0,02 M ; pH 7,0) après quoi on ne peut plus déceler d'enzyme dans les liqueurs de lavage, et l'on détermine de la façon suivante l'activité d'uréase du dérivé insoluble dans l'eau. On ajoute 25 1 ml à 3 /» d'urée à 1 ml de la suspension d'uréase et l'on agite durant 5 mn à 30°C dans un tube à essai, après quoi on ajoute 2 ml de phénate de sodium, et l'on dilue de façon appropriée l'échantillon dans du tampon. On détermine l'ammoniaque de cet échantillon par le procédé de Fawcett et Scott (Fawcett J.K., et 30 Scott J.E., Jv Clin. Path. 13, 156, 1960). Une unité d?activité d'uréase s'est définie comme étant la quantité produisant 1 mg d'azote ammoniacal en 5 mn à 30°C, pH 7,0. Les résultats obtenus sont présentés au tableau XVII. 72 04267 23 2124584 TABLEAU XVII Préparation Protéines liées Activité totale du dérivé N° mg/g de solide d'uréase insoluble, unités/g 5 74 10,2 32,2 EXEMPLE 20 On prépare 100 mg d'un dérivé de titane et de cellulose microcristalline en opérant de la façon décrite dans 1?exemple 17. On ajoute à une suspension de ce dérivé une solution de 2 mg 10 de glucose-osydase (qualité II de Boehringer Marinheim, 20 'unités par milligrammè) dans 2 ml de tampon de phosphate (0,1 M ; pH 4,5) et l'on agite durant 3 heures à 4°C. On soumet le dérivé de glucose-osydase insoluble dans l'eau à cinq cycles de lavage avec 10 ml de tampon de phosphate 0,1 M, pH 5,1 et 10 ml de solu-15 tion 0,5 M de chlorure de sodium dans le même tampon, puis à deux lavages avec 10 ml de tampon de phosphate(0,1 M, pH 5,1). On remet le dérivé de glucose-oxydase insoluble dans l'eau en suspension dans 2 ml du même tampon et l'on titre l'activité en opérant de la façon suivante. 72 04267 24 2124584 On met en équilibre dans un ballon à 25°C un. mélange de solution à 0,5 g/l de 2,2'-azo-di-(3^thylbenzothiazoline-6-sulfonate d'ammonium) (Boehringer-Manhheim) dans 25 ml de tampon de phosphate (0,1 M ; pH 1,0). On ajoute une solution de 5 2 mg/ml de peroxydase (qualité II de Boehringer-Mannheim) dans 100 ni de tampon de phosphate 0,1M ; pH 7,0), et l'on détermine à 41^m^ la densité optique du mélange réactionnel dans un spectrophotomètre "TJnicam SP 500". On ajoute une partie aliquote (100 |il) du dérivé de glucose-oxydase insoluble dans l'eau 10 et, après cinq minutes d'agitation à 25°C, on arrête la réaction par une centrifugation rapide. On lit immédiatement à 415 mji les densités optiques des liquides surnageants. On détermine AE/mn et l'on calcule l'activité d'après l'équation : Activité de glucose-15 oxydase totale, Unités/g de matière AE/mn x 30,2 sèche = 38 .x p oïl p est le poids sec du dérivé présent dans l'échantillon, 20 déterminé par le procédé décrit dans l'Exemple 1. le résultat obtenu figure au Tableau XVIII. TABLEAU XVIII Préparation n° Activité de glucose-oxydase totale du dérivé insoluble dans l'eau, 25 unités/g de solide 75 176 EXEMPLE 21 On prépare 1 g de dérivé de cellulose microcristalline et de titane en opérant de façon similaire à celle décrite dans 30 l'Exemple 17. On ajoute,à une suspension de ce dérivé, une solution de 500 mg de trypsine brute provenant de pancréas dans 10 ml de tampon de succinate (0,1 M ; pH 5,0) et l'on agite à 4°C durant 18 heures. On lave le dérivé de trypsine insoluble dans l'eau en opérant de façon similaire à celle décrite dans 35 l'Exemple 20, en remplaçant le tampon de phosphate, chaque fois où il est utilisé dans l'Exemple 20,par du tampon de succinate (0,1 M ; pH 5,0). On détermine de la façon suivante l'activité 72 04267 25 2124584 du dérivé de trypsine insoluble dans l'eau. On mélange 2 ml d'une suspension du dérivé avec 2 ml d'albumine à 2 $ à 30°C et l'on fait incuber durant 10 mn. On ajoute 5 ml d'acide trichloracétique à 5 ^ et on laisse s'effectuer une sédimen-5 tation. A une partie aliquote (2 ml) du liquide surnageant, on ajoute 4 ml de solution 0,5M d'hydroxyde de sodium et 1,2 ml de réactif normal de phénol de Eolin dilué par deux volumes d'eau. On détermine à 700 m^i la densité optique. Une unité d'activité de trypsine se définit comme étant la quantité d'enzyme qui donne 10 dans les conditions du titrage une solution dont la densité optique à 700 mp,.est égale à 1,0. Le résultat du titrage est présenté au Tableau XIX. TABLEAU XIX Préparation Activité de trypsine totale du dérivé insoluble . 15 n° dans l'eau, unités/g de solide 76 737 EXEMPLE 22 On prépare 1 g de dérivé de cellulose microcristalline et de titane en opérant de façon similaire à celle décrite dans 20 l'Exemple 17. A une suspension de ce dérivé, on ajoute une solution de 100 mg d'invertase (provenant de levure de boulangerie) dans 10 ml de tampon de succinate (0,1 M ; pH- 5,0) et l'on agite à 4°C durant 18 heures. On lave le dérivé d'invertase insoluble dans l'eau en opérant de façon similaire à celle dé-25 crite dans l'Exemple 21 et avec les mêmes tampons, et l'on calcule l'activité du dérivé à partir des déterminations des sucres réducteurs libérés à partir d'une solution à 1 $ de saccharose dans un tampon de succinate (0,1 M ; pH 5,0) à 55°C. Une unité d'activité d'invertase se définit comme étant la quantité qui 30 libère une pm de glucose à partir de saccharose en une minute à 55°C et à pH 5,0.Le résultat obtenu est présenté au tableau XX» 72 04267 2124584 TABLEAU XX Préparation n° Activité totale nette d'invertase du dérivé insoluble dans l'eau, unités/g de solide 5 77 745 EXEMPLE 25 Préparation de membranes contenant des enzymes immobilisées, en utilisant du chlorure titaneux. On immerge deux morceaux de membrane de dialyse 10 (5cm x 5 cm) que l'on a fait bouillir au prélable dans de l'eau, dans une solution à 12,5 $ en poids/volume de chlorure titaneux durant 16 heures à la température ambiante tout en agitant. On lave ensuite les deux morceaux dans 50 ml de tampon d'acétate^, 02M ; pH 4,5), puis en. utilisant 2 x 25 ml de ce tampon 15 d'acétate. On immerge ensuite une membrane dans 4 ml d'une solution contenant, par ml, 4,2 mg de glucose-oxydase (qualité II de Boehringer Mannheim) dans du tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,5) cependant que l'on monte l'autre membrane dans une cellule de "perspex". On expose ensuite un côté de cette membrane 20 (qui sera le côté revêtu d'enzyme) à une solution d'amyloglucosidase ("Agidex 3000" de Glaxo, provenant d'Aspergillus Niger). Cette solution d'amyloglucosidase a été préparée par dialyse d'un extrait brut tout d'abord contre de l'eau, puis contre un tampon d'acétate (0,02M j pH 4,5). 25 Après avoir laissé reposer les deux membranes à 4°C durant 16 heures, on lave ces deux membranes de façon poussée dans un tampon similaire d'acétate (6 x 50 ml) avant de les utiliser. On place la membrane comportant de la glucose-oxydase 30 dans un tube à essai sec et propre et l'on ajoute 100 ni de tampon "tris" (2-amino-2-hydroxyméthylpropane- 1 ,3-diol) ;(0,5M ; pH 7,0). On ajoute ensuite une partie aliquote (1000 pl) d'une solution de glucose dans du tampon tris (0,5M ; pH 7,0), on secoue bien la solution et la membrane et on laisse ensuite reposer 35 à 37°C durant 30 mn. Après cette période d'incubation, on retire une partie aliquote (500 pl) du tube à essai et l'on ajoute cette 72 04267 27 2124584 partie à 2500 (j! d'une solution (à 500 mg/l) de 2,2'-azo-di-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate d'ammonium) (Boehringer-Mannheim)dans du tampon tris (0,^ ; pH 7,0) et 50 |il de solution contenant par ml 2 mg de peroxydase dans du tampon tris 5 0,5 M, pH 7,0).On secoue bien la solution et l'on enregistre l'absorbance à 415 mii. Une comparaison avec un échantillon témoin de glucose-oxydase montre que la membrane est aussi active que 4,6 |0g de glucose-oxydase. EXEMPLE 24 10 Hydrolyse d'amidon et fractionnement simultané par la membrane préparée dans l'Exemple 23. On monte la membrane contenant de l'amyloglucosidase dans une cellule en "perspex" et l'on expose le côté de la membrane comportant l'enzyme à une solution, ayant au préalable subi 15 une dialyse, d'amidon dans du tampon d'acétate (0,02M ; pH 4,45 ; 102 iig/ml). L'autre côté de la membrane est au contact du tampon seulement. Après 30 mn d'incubation à 37°C, on analyse cette solution de tampon pour y déterminer la teneur en glucose à l'aide d'un équipement d'analyse automatique "Technicon Autoanaly-20 ser". On enregistre une forte augmentation de la concentration du glucose qui diminue jusqu'à une valeur constante lorsqu'on fait passer de la solution fraîche de tampon dans la cellule. Le tracé de la courbe indique que dans les "conditions de régime 25 permanent et constant", la cellule produit du glucose à raison de 0,3 Hg/ml. EXEMPLE 25 Cet exemple montre l'application d'un dérivé particu-laire d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau à une hydrolyse 30 continue de l'amidon. On produit un échantillon (1,3 g) d'un dérivé d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau en utilisant de la cellulose microcristalline, une solution à 15- i° de chlorure titanique et de l'amyloglucosidase ("Agidex 3000", Glaxo) par un procédé 35 similaire à ceux décrits en général dans les Exemples 1 et 2. On applique ce dérivé à l'hydrolyse continue, en une période de 8 jours dans un réacteur à lit fluide et à courant ascendant, 72 04267 28 2124584 d'un hydrolysat à 5 $ d'amidon dans du tampon d'acétate (0,i|m; pH 4,5). Ce réacteur consiste en un tube chemisé (12,5 mm de diamètre interne), de 2 m de hauteur, l'alimentation étant fournie par une pompe péristaltique à la base du tube. On maintient 5 à l'état fluidisé le lit de particules d'amyloglucosidase insoluble dans l'eau grâce au courant ascendant de la solution et il n'est pas nécessaire d'utiliser un support du lit. On maintient constante la température du tube par un réglage thermostatique de la chemise ou enveloppe d'eau qui entoure ce tube. 10 Après une période initiale au cours de laquelle se produit un peu de perte des particules fines, le lit atteint une profondeur définissable d'environ 100-110 cm, avec une nette interface entre le lit fluide pouvant réagir d'une part, et le liquide limpide produit d'autre part. On analyse des échantillons prélevés à des 15 intervalles de 24 heures pour y déterminer les sucres réducteurs par la méthode de Hegedorn et Jensen (Hegedorn H.C. et Jensen B.ÏT., Biochem Z. 135, 46 (1923)) et l'on exprime au Tableau XXI les résultats obtenus,en termes d'équivalents de dextrose pour l'alimentation et pour le produit. 20 . TABLEAU XXI Temps Débit (ml/mn) Hauteur du fo d'équivalents de dextrose (.jours) lit (cm) Entrée Sortie 25 30 0 5,2 110 42,0 79,6 1 4,2 120 39,0 79,2 2 3,4 11 5 37,6 82,0 3 2,9 1 32 37,6 81,2 4 2,0 100 41,0 91,6 5 2,0 103 38,4 94,4 6 2,0 106 37,4 87,8 7 2,0 108 35,8 85,2 8 2,1 115 33,2 82,2 L'activité initiale de la totalité du lit du réacteur équivaut à 1660 unités. 72 04267 29 2124584 ' EXEMPEE 26 On active de façon similaire à celle décrite dans l'Exemple 1, en utilisant 1 ml d1une solution à 15 $ de chlorure titanique, des échantillons (100 mg) (a) de cellulose microcristal-5 line (19 microns), (b) de carboxyméthylcellulose fine ayant une capacité de 0,72 milliéquivalent/g et provenant de Sigma (london) Chemical Co. et (c) de diéthyl-amino-éthyl-cellulose fine, ayant une capacité de 0,90 milliéquivalent/g et provenant de Sigma (London) Chemical Co. On met les dérivés solides ainsi obtenus 10 en contact avec des solutions de 10 mg d'amyloglucosidase (qualité II, provenant de la moisissure Ehizopus genus et obtenue chez Sigma (London) Chemical Co) dans 1 ml de tampon d'acétate 0,02 M j pH 4,5 en opérant de façon similaire à celle décrite dans l'exemple 1. 15 Les procédés de lavage et de titrage des dérivés d'amylo glucosidase insoluble' dans l'eau sont identiques à ceux décrits ci-dessus. Les unités d'amyloglucosidase sont comme défini . à l'Exemple 1. Les résultats obtenus ici sont présentés au Tableau XXII. 20 TABIîEAU XXII Prépa- Protéines liées Activité to- ration mg/g de solide taie du déri- n° Support solide vé, unités/g de solide 25 78 Cellulose microcristalline 27,40 745 79 Carboxyméthyl-cellulose 30,80 545 80 Diéthyl-ami rio-éthyl-cellulose 7,80 311 EXEMPLE 27 30 On mélange 100 mg de dextrane réticulé ("Sephadex G-. 25", particules fines, de Pharmacia (G-.B.) Ltd., Londres, Grande-Bretagne) avec 1 ml de solution à 15 i° de chlorure titanique. On suit ensuite le mode opératoire décrit dans l'Exemple 17 pour la production d'un dérivé d'a-amylase bactérienne insoluble dans 35 l'eau. Les tampons d'acétate que l'on utilise ici comportent 0,02 M et sont à pH 5,5. 72 04267 30 2124584 On détermine de la façon décrite dans 11Exemple 17 l'activité, le poids sec et la teneur en protéines de l'a- amylase insoluble dans l'eau, les résultats obtenus figurent au Tableau XXIII. 5 TABLEAU XXIII Prépa- mg de protéines mg de protéines Activité d'oc- ration libres appliquées/ liées/g de so- amylase totale n° g de solide lide du dérivé inso- lubie dans l'eau; unités/g 81 636 73,0 307 EXEMPLE 28 On prépare un dérivé d'amidon insoluble dans l'eau en mettant 100 g d'amidon soluble en suspension dans 500 ml d'étha-15 nol contenant 3 g d'hydroxyde de sodium et en réticulant à l'aide de 39,8gd'épichlorhydrine. On agite cette suspension à la tem-^ pérature ambiante durant 16 heures, on neutralise à l'acide sulfurique et filtre. On lave le solide avec trois fois 400 ml d'un mélange 1:1 en poids/volume d'eau et de méthanol et avec 20 deux fois 400 ml de méthanol et l'on sèche sous vide à 45°0. On mélange un échantillon (100 mg) de la poudre résultante avec 1 ml d ' une solution à 15 i° de chlorure titanique et 1 ' on suit ensuite le mode opératoire décrit dans l'Exemple 17 pour la production d'un dérivé d'une a-amylase bactérienne insoluble dans 25 l'eau. Les tampons d'acétate que l'on utilise ici comportent tous 0,02 M et sont à pH 5,5. On détermine de la façon décrite dans l'Exemple 17 l'activité, le poids sec et la teneur en protéines du dérivé d'a-amylase insoluble dans l'eau. Les résultats ainsi obtenus figurent au Tableau XXIV. TABLEAU XXIV Prépa- mg de protéines mg de protéines Activité d'a-ration libres appliquées/ liées/g de amylase totale n° g de solide solide du dérivé insoluble dans l'eau,. unités/g de solide 82 636 316 727 72 04267 31 2124584 REVENDICATIONS 1. Proc.édé de préparation d'une enzyme insoluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'on fait réagir l'enzyme, qui est notamment choisie parmi l'amyloglucosidase, la glucose-oxydase, 5 l'invertase, la trypsine, l'a-amylase, la glucose-isomérâse, la pronase, la catalase, la lactate-déhydrogénase -et l'uréase, a/£)H compris entre 3 et 7»avec un dérivé de titane , d'étain, de zirconium ou de fer d'un polysaccharide ou d'un dérivé de polysaccharide, de "Nylon" ou de verre. 10 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction à une température comprise entre 0° et 45°C et notamment entre 0° et 20°C. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la durée de la réaction se situe entre 15 1 mn et 18 heures et notamment entre 3 heures et 18 heures. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le poids de l'enzyme libre que 1'on applique par gramme de dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer se situe entre 20 et 1000 mg et notamment 20 entre 40 et 250 mg. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est de la cellulose ou un dérivé de cellulose qui se trouve sous la forme de cellulose microcristalline, de diéthylaminoéthyl-cellulose, 25 de carboxyméthyl-cellulose, de sciure de bois, de morceaux ou copeaux de bois ou de papier-filtre ou d'une membrane. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est du dextrane réticulé ou de l'amidon réticulé. 30 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications pré cédentes, caractérisé en ce qu'on obtient le dérivé de titane, d'étain,de zirconium ou de fer par la réaction du polysaccharide ou de son dérivé, du "Nylon" ou du verre avec un sel du métal, et notamment avec un halogénure ou un sulfate'de ce métal. 35 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on fait réagir la cellulose avec une solution de TiCl^, TiCl^, 72 04267 32 2124584 ZrCl4, SnCl4, SnClg, Ti2(S04)3, PeCl2, FeCl^ ou FeS04, l'on sèche ou agite à des températures comprises entre 20° et 60°C et l'on lave cette cellulose jusqu'à ce qu'elle ne contienne pas de sels n'ayant pas réagi. 5 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on fait réagir la cellulose microcristalline ou le verre avec une solution à 12,5 $ en poids/ volume de chlorure titaneux ou à 15 % en poids/volume de chlorure titanique et l'on sèche à 45°C. 10 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on fait réagir du "Nylon" avec une solution à 15 i° en poids/ volume de chlorure titanique, et l'on sèche à 45°0. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est 1'amylogluco- 15 sidase, la pronase, la catalase, la lactate-déhydrogénase ou la glucose-oxydase et on la fait réagir dans un tampon d'acétate à pH 4,5 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou de son dérivé, du "Nylon" ou du verre. 20 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est l'a-amylase que l'on fait réagir dans un tampon d'acétate à un pH compris entre 5,5 et 6,0 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre. 25 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est l'uréase que l'on fait réagir dans un tampon de phosphate à pH 7,0 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" ou du verre. 30 14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est la glucose-isomérâse que l'on fait réagir dans du tampon "tris" (2-amino-2-hydroxyméthyl-propane-1,3-diol) à pH 7,0 avec le dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer du polysaccharide ou d'un de ses dérivés, du "Nylon" 35 ou du verre. 72 04267 33 2124584 15. Procédé pour la régénération d'une enzyme insolubilisée préparée avec de la cellulose microoristalline ou aveo du verre par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 7 à 9 ou 11 à 13, caractérisé en ce qu'on fait réagir 5 l'enzyme insoluble épuisée avec un sel ou un dérivé de titane, d'étain, de zirconium ou de fer et l'on fait ensuite réagir le dérivé ainsi obtenu avec l'enzyme. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le processus de régénération est le même que celui 10 utilisé pour la préparation, effectuée à l'origine, de l'enzyme insoluble dans l'eau.