-1- La présente invention a pour objet un procédé permettant de combiner un acide asiné ou un peptide à un autre peptide ou un autre acide aminé afin d'obtenir de" produits chimiquement plus purs et ne présentant aucune racémisation. particulier, la pré-5 sente iiivention concerne un procède dans lequel le groupe carboxy d'un acide aminé ou d'un peptide dont le groupe, amino est protégé, est transformé en ester de N-Iiydroxysuccinimide en préparant l'abord l'azide acylé, puis en faisant réagir l'aside acylé avec le ïï-hydroxysuccinimide, puis en combinant l'ester de ll-hydroxysucci-10 nimide de l'acide aminé ou du peptide avec un autre acide aminé ou un autre peptide. Ce procédé est utile pour synthétiser des peptides présentant une structure spécifique unique connue. Les protéines et les peptides dérivés de produits naturels se présentent en général avec une structure spécifique unique. 15 Par conséquent, l'un des critères de base de la synthèse des peptides, et en particulier des peptides biologiquement actifs apparentés à des produits naturels, est que toutes les réactions conduisent à lin produit ayant une configuration optique particulière. Les molécules des peptides et des protéines sont constituées, 20 en principe, de chaînes formées par des acides aminés qui sont reliés les uns aux autres par des liaisons amides Eoàï-CH-CG-NH-CH-a0-ira-CH-CC ÏÏH-CH-COOH ' !5 !n r s1- r 25 La principale réaction pour former ces chaînes est l'acyla- tion d'un groupe amino d'un acide arainé, par un groupe carboxy d'un second acide aminé. La formation de la. liaison amide à partir d'un groupe carboxy et d'un groupe amino ne se produisant pas spontanément, excepté à haute température, un de ces groupes doit 30 être converti en une forme qui est plus réactive. Des acides aminés, comportant au moins un groupe amino et un groupe carboxyle, peuvent prendre part aux réactions d'acyla-tion, de deux façons différentes, (1) comme réactif d'acylation (constituant carboxyle) ou (2) comme composé à àcyler (constituant 35 aminé). Il est donc nécessaire que des groupes de protection soient placés sur les groupes où une réaction n'est pas désirée. Il ne suffit pas de partir d'acides aminés optiquement purs, car ils peuvent facilement perdre leur pureté optique dans presque n'importe quel stade du processus de synthèse, étant donné i bad original 69 11269 2006153 -2- que la plupart des stades de synthèse de peptides, impliquent une réaction sur un groupe fonctionnel directement attaché à un centre asymétrique. Toutefois les acides aminés ou les peptides peuvent également perdre leur pureté optique pendant les stades 5 de protection ou d'élimination des groupes de protection des acides aminés ou des peptides. Il est donc difficile d'obtenir un produit spécifique ionique, non seulement par suite de la présence de groupes fonctionnels non protégés, mais également en raison de la possibilité de perte de pureté optique pendant le procédé de 10 synthèse. La séparation du diastéréo-isomère désiré à partir du mélange peut être facile à réaliser dans le cas d'un dipeptide, mais'elle devient de plus en plus difficile quand les stades synthétiques sont réalisés sur des chaînes de plus en plus longues. Il est donc extrêmement important d'Éviter que les peptides per-15 dent leur pureté optique lorsqu'on désire synthétiser avec succès des peptides biologiquement actifs» On sait bien que les asides acylés réagissent avec les acides aminés ou les peptides ayant des groupes amino libres, en vue de donner des peptides acylés et que la combinaison des azides ne 20 provoque pas de racémisation. Toutefois, on sait également que les. azides sont sujets à des transpositions. Il en résulte que, bien que les produits combinés soient optiquement purs, des impuretés chimiques sont présentes. Ceci est particulièrement le cas quand on combine des azides à des températures de 0°C environ et supé-25 rieures. Bien que certains azides acylés sont très réactifs, ceux provenant de chaînes do peptides plus longues peuvent nécessiter plusieurs jours pour se combiner à la température ambiante, et des rapports mentionnent des .températures aussi élevées que 4-0-50°C. Parmi les sous-produits observés le plus souvent lorsqu'on 30 combine des azides,'on peut citer les dérivés de l'urée formés à partir d'azides par réaction des dérivés isocyanate de la transposition de Curtius et du composant aminé. Une autre réaction secondaire très souvent rencontrée est la formation d'amides. On peut également obtenir d'autres produits d'acylation indésirés. 35 La Demanderesse a maintenant découvert qu'en laissant les azides acylés réagir d'abord avec le IT-hydroxysuccinimide à des températures inférieures en vue de former l'ester correspondant, on obtient non seulement un produit optiquement pur, mais pendant cette réaction la formation de sous-produits indésirés du type bad original 69 11269 2006153 -3- résultant de la combinaison des azides, est réduite au minimum. Les esters de N-hydroxysuccinimide, qui sont alors chimiquement et optiquement purs, peuvent être combinés à un peptide ou un acide aminé en utilisant les méthodes utilisées habituellement 5 dans la technique. Une fois que l'ester de ÎJ-hydroxysuccinimide est formé, la combinaison peut avoir lieu, si nécessaire à des températures supérieures. Cette technique est particulièrement intéressante dans le cas d'un composé aminé qui est relativement inactif ou quand des problèmes de solubilité se posent, c'est-à-10 dire que la liaison peptide désirée se forme seulement lentement, en nécessitant quelquefois des températures supérieures pour qu'une réaction importante ait lieu. Toutefois, quand on utilise des températures supérieures dans la combinaison habituelle des azides, la présence de réactions secondaires rend ce mode opéra-15 toire peu pratique. Le procédé de l'invention comprend les stades suivants qui ne sont pas nécessairement réalisés en séquence, et dans lesquels les produits intermédiaires ne sont pas nécessairement isolés : A. on traite un hydrazide d'acide aminé ou de peptide dont 20 le groupe amino libre est protégé, par un réactif produi sant un agent de nitrosylation, à une température comprise entre -60°C et 0°C, en vue d'obtenir l'azide acylé correspondant ; H. on fait réagir l'azide acylé du stade A avec le lî-hydroxy-25 succinimide à une température comprise entre -60°C et +20°C en vue de former l'ester de îf-hydroxysuccinimide correspondant ; et : C. on combine l'ester avec un acide aminé ou un peptide, à une température comprise entre -4-0°C et +50°C, en vue de 30 donner un produit combiné à terminaison peptide. On peut également réaliser la réaction sous la forme d'un procédé à deux stades, en ajoutant en même temps l'acide aminé ou le peptide nucléophile et le N-hydroxysuccinimide au mélange contenant l'azide acylé. La formation de l'ester dans ces conditions 35 es"b encore possible, étant donné que le ÏF-hydroxysuccinimide est un bon réactif nucléophile. Cette série de réactions peut être représentée de la façon suivante en utilisant, pour plus de simplicité, comme réactifs des acides aminés : Ip;-w v^rtiGiHAL 69 11269 2006153 P -HN-CH-CO-NH-m. S 1 _4_ (A) P1 -ÏÏM-GK-GO-W- R II 10 II + HO-] 0 .|L. 0 III -S* (B) N-hydroxysucc inimi dé 0 P1 -HET-CH-CO-O-IQ^ A1 r 0 IV 15 ou IV + H2-CH-CO-P2 ÎTH. 2 (C) P1 -HN-CÏÏ-CO-NH-CH-CO-P2 E' E V VI R et E sont chacun une chaîne laterale acide aminé ; P est un groupe de protection situé sur le groupe amino libre de l'acide aminé ou du peptide à combi-20 ner, et : 2 P est H ou un. groupe de protection situé sur le groupe carboxy libre do l'acide aminé ou du peptide à combiner. Pour éviter une auto-condensation dans le stade A, le groupe 25 amino libre attaché au carbone portant le groupe carboxy à active doit être protégé, les groupes de protection appropriés sont les groupes bonzyloxycarbonyle, bonzyloxycarbonyle substitué, et d'autres groupes de protection du type uréthane comprenant les groupes p-chloro- ou p-bromobenzyloxycarbonyle, allyloxycarbonyle 30 cyclopentyloxycarboiiyle , cyclohexyloxycarbonylc-, p-méthoxybenzyl-oxycarbonyle, phénylthiocarbonyle, etc. Le groupe de protection utilisé de préférence est le groupe tertio-butoxy-carbonyle. On peut également utiliser comme groupes de protection, les groupes p-toluènesulfonyle, benzylsulfonyle et phtalyle. Le groupe,carbo-35 xyle de l'acide aminé ou du peptide protégé est ensuite transformé en hydrazide par des méthodes connues dans la technique. Dans le stade A, on traite une solution de 1'hydrazide acylé de l'acide aminé ou du peptide protégé dans un solvant organique tel que le tétrahydrofuranne, le diméthylformamide, etc..., avec hd original 69 11269 2006153 -5- uri agent de nitrosylation tel que l'acide nitreux ou le chlorure de nitrosyle, en vue de former l'azide correspondant- D'autres agents convenant dans ce "but comprennent le nitrite d'isoamyle en présence d'un acide, par exemple, l'acide cblorhydrique ou tri-5 fluoroacétique dans un solvant tel que le diméthylformamide ou l'hexaméthylphosphoramide. La réaction est réalisée à une température comprise entre -60°C et 0°C environ. La température préférée est de -40°C environ. La réaction est habituellement complète au bout de 2 heures environ, mais elle peut être conduite pendant 1 10 à 3 jours sans obtenir une détérioration importante, avant de poursuivre en passant au stade B. Dans le stade B, on traite le mélange de réaction contenant l'azide acylé préparé dans le stade À par le N-hydroxysuccinimide et on neutralise la solution en utilisant une aminé organique, 15 telle que la N-éthylpipéridine, la îtf-méthylmorpholine, la N-éthyl-morpholine, la tributylaminé, la triéthylaminé, etc..., en vue de former l'ester correspondant du N-hydroxysuccinimide. Cette réaction a souvent lieu à basses températures telles que -40°C, mais des températures aussi élevées que +20°C peuvent être nécessaires 20 quand l'azide est légèrement inactif ou insoluble dans le solvant utilisé. Le produit de la réaction reste stable à une telle température basse pendant des périodes aussi longues qu'une semaine ou encore plus longues. On utilise de préférence des températures comprises entre -40°C et -10°C, et elles sont en général suffisan-25 tes pour effectuer la réaction. Dans le stade C, on fait ensuite réagir la solution nouvellement formée de l'ester d *.hy dr oxy suc c inimide de l'acide aminé ou du peptide protégé avec un peptide ou un acide aminé à des températures comprises entre -40°C et +50°C. On peut également utiliser 30 des températures supérieures, mais on utilise de préférence la température ambiante. Le groupe carboxy peut être protégé, quand cela est nécessaire, en formant l'amide de l'acide aminé, ou en 1'estérifiant en ester méthylique ou éthylique. On peut également utiliser les 35 esters benzyliques et benzhydryliques, ainsi que les dérivés ben-zyl-substitués tels que le p-nitrobenzyle, et le p-méthoxybenzyle. L'acide aminé ou le peptide contenant l'acide aminé contient dans certains cas d'autres groupes qui peuvent nécessiter une protection. Ces groupes sont par exemple le groupe hydroxy de la BAD ORIGINAL 69 11269 2006153 -6~ tyrosine et de la sérine; l'azote de l'imidazole de l'histidine; la liaison th.ioeth.er de la méthionine; et le groupe guanidino de l'arginine. Dans la plupart des cas on peut, si nécessaire, réaliser la protection en utilisant les méthodes décrites dans la lit-5 térature. Un groupe de protection préféré pour la cystéine est le dérivé acétamido-méthyle. On agite le mélange réactionnel jusqu'à ce que la réaction soit complète» La réaction de combinaison a lieu à un pl-î compris entre 7 et 8, on mesure le pH de la solution en utilisant un échan-10 tillon de la solution pour des réactions à la touche sur un papier indicateur de pH humide. On récupère le produit combiné par des méthodes connues dans la technique» Suivant la "basicité du réactif nucléophile, le pH utilisé pour que la combinaison ait lieu, peut s'étendre d'une valeur inférieure à 7 jusqu'à une valeur su-15 périeure à 8. Par exemple, quand le réactif nucléophile est une aminé basique faible, telle que l'acide 6-amino-pénicillanique ou l'aniline, la combinaison se produit à un pH aussi faible que 4- ou 5, ou à un pH aussi élevé que 8 ou 9- L'acide aminé ou le composant acide aminé des peptides qui 20 sont combinés, peuvent être, mais non nécessairement, n'importe quel acide aminé classique, par exemple l'alanine, l'arginine, 1'asparagine, l'acide aspartique. la cystéine, l'acide glutamique, la glutamine, la glycine, l'histidine, 1'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, 1'ornithine, la phénylalanine, la pro-25 line, la sérine, la thréonine, le tryptophanne, la tyrosine, la valine, etc. Les Exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention» EXEMPLE 1 50 Chlorhydrate de l'amide de L-tryptophanyl-L-méthionyl- L-phénylalanine On ajoute à une solution maintenue sous agitation de 1,0 millimole d'hydrazide de tertio-butoxy-carbonyltryptophane dissous dans 2,5 ml de diméthylformamide, et refroidie à -40°Ct 2 ml 35 d'acide chlorhydrique 2 R dans du tétrahydrofuranne (4 millimoles), puis 1,1 millimole de nitrite d!isoamyle.■Le spectre infra-rouge de la solution présente une nouvelle pointe à 4-,7,M. (azide acylé). Après deux heures à -4-0°C, on ajoute 115,1 mg (1 millimole) de N-hydroxysuccinimide cristallin à la solution, maintenue sous agi- bad original 1 69 11269 2006153 -7- tation, du produit de la réaction. On neutralise ensuite la solution avec la triéthylamine de sorte que la solution de la réaction présente lors d'essais à la touche sur le papier indicateur"humide un pH de 3,0, et l'on poursuit l'agitation à -40°C pendant 5 5 heures. Pendant la réaction, le pH tombe à 7,5 environ, valeur à laquelle il est maintenu en ajoutant de temps en temps une quantité supplémentaire de triéthylamine. Une nouvelle pointe apparaît dans le spectre infra-rouge à 5 M- (ion azide) tandis que la pointe à 4,7/^'(azide acylé) diminue. 10 On amène â la température ambiante la solution du tertio- butoxy-carbonyl-tryptophanyloxysuccinimide nouvellement formée et on la combine avec une solution de 0,425 g (0,95 millimole) de chlorhydrate du L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanine amide dans 5 ml d'eau et 1,5 ml d'éthanol. On réajuste le pH à 7,5 avec cLe 15 la triéthylamine et on agite le mélange pendant trois heures à la température ambiante. On élimine sous vide le solvant et on extrait trois fois le résidu avec de l'éthanol. Par élimination des solvants des extraits combinés, on obtient 0,492 mg de solide que l'on transfor-20 me en bouillie dans 10 ml d'acide acétique saturé de HC1 pendant trois minutes, on centrifuge et l'on fait décanter la partie qui surnage. On lave le précipité avec de l'acide acétique et de l'é-ther. On reprend dans du méthanol le résidu lavé et on le précipite en ajoutant du chloroforme. On filtre le précipité, et on ob-25 tient 178 mg de chlorhydrate de L-tryptophanyl-L-méthionyl-L- aspartyl-i-phénylalanine amide {0,28 millimole : 29,6 70 de rendement) basé sur le tripeptide. /âlpha7p- -17,5° (c = 2 % dans le méthanol). Analyse : Calculé pour C2gH^0gNgSCl : 30 0 = 55,01 ; H = 5,89 ; 0 = 15,16 ; N = 13,27 ; S = 5,06 ; Cl = 5,60. •Trouvé: C = 54,21 ; H = 5,67 ; 0 = 14,40 ; N = 12,95 5 S = 4,87 ; Cl = 5,82. EXEMPLE 2 35 Tertio-butoxy-carbonyl-L-méthionyl-(j.T- On ajoute à une solution, maintenue sous agitation, de 8.AD ORIGINAL 69 11269 2006153 -8- 206,5 mg (0,2 millimole) de t-butoxy-carbonyl-L-Tnéthionyl-(N-£ -carbobenzoxy)-L-lysyl-L-seryl-L-arginyl(chlorhydrate)-L-asparagi-nyl-L-leucyl-hydrazide dissous dans 1 ml de diméthylformamide et refroidie à -40°0, 0,267 ml (0,8 millimole) d'acide chlorhydrique 5 3 N dans le tétrahydrofuranne, puis 0,209 millimole de nitrite d'isoamyle. Après deux heures et 4l> minutes, on ajoute 46 mg (0,4 milliraole) de N-hydroxysuccinimide cristallin à la solution d'azi-de maintenue sous agitation. On neutralise la solution avec de la triéthylamine afin qul-un essai à la touche de la solution réac-10 tionnelle sur du papier indicateur de pH humide indique un pH de 8,0 environ, et l'on continue à agiter à -40°0 pendant 40 minutes. Pendant la réaction, lu pH peut tomber à 7>5 environ ot on le maintient en ajoutant de temps en temps une quantité supplémentaire de triéthylamine. 15 On amène progressivement à 0°G la solution du succinimidc- ester de peptide nouvellement formée, et on la fait réagir avec me solution de 202,7 mg (0,187 millimole) de chlorh.ydra.te du L-thréor±yl-(iT- £ -carbobenzoxy)-L-lysyl-L-aspartyl-L-arginyl(chlorhydrate )-3-acétamidométhylène-L-cystéInate d'éthyle dans 0,5 ml de 20 diméthylformamide. On ajuste à nouveau le pH à 7S5 avec de la triéthylamine (0,5 ml) et on agite le mélange pendant 22 heures à la température ambiante. On élimine par filtration les matières insolubles. On lave la dispersion deux fois avec 0,1 ml de diméthylformamide et on la 25 transforme en bouillie avec 0,1 ml du diméthylformamide. On ajoute dvj l'acétate d'éthyle (8 ml) en petites portions au filtrat combiné. On obtient un précipité qui se solidifie après agitation pendant quelques minutes. On soumet le produit à un vieillisrsement dans un bain de glaco et on lu centrifuge. On le délaye ensuite 30 doux à trois fois avec l'acétate d'éthyle et on le sèche avec de l'azote; on obtient 340 mg (rendement de 86,3 /0 de produit poly-peptide. EXEMPLE 3 ?ortio-butoxy-carbon7fl-S-acétamidométh77-lène-L-cystéinyl-(F^ h. -35 carbobenzoxy)-L-lysyl-L-asparaginyl-r-;lyc7/'l-L-glutaminyl-L-thréo-nyl-L-asparaginr^l-S-acétamidométhylène-L—cystéinyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-séryl-L-tyrosinate d'éthyle. On ajoute à une solution, maintenue sous agitation, de 66,6 mg (70 micromoles) du t-butoxy-carbonyl-S-acétamidométhylène-L- £AD 69 11269 2006153 -9- cystéinyl-(H- £ -carbobenzoxy)-L-lysyl-L-asparaginyl-glycyl-hydra-zide, dissous dans 3 ml de diméthylformamide et refroidie à -40°C, 0,120 ml (360 micromoles) d'acide clilorhydrique 3 dans du tétrahydrofuranne, puis 0,015 ml (110 "licromolos) de nitrite d'isoamy-5 le. Après deux heures, on ajoute 20,7 mg (180 micromoles) de ÎT-hydroxysuccinimide cristallin à la solution d'azide maintenue sous agitation, tout en maintenant la température à -40°C. On neutralise la solution avec de la triéthylamine jusqu'à ce qu'un essai à la touche effectué avec la solution de réaction suï5 le 10 papier indicateur de pH humide indique un pH de 8,0, et l'on continue à agiter à -40°C pendant 1 heure. Pondant la réaction, on maintient le pH entre 7>5 et 8 en ajoutent de temps en temps encore de la triéthylamine. On amène à la température ambiante la solution du succinimide-15 ester du peptide actif nouvellement formé et on la fait réagir avec 90 mg (74 micromoles) de L-glutaminyl-L-thréonyl-L-aspaginyl-S-acétamidométhylène-L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-séryl-L-tyrosinate d'éthyle. On ajuste le pH à 7*5 avec de la triéthylamine. Après agitation pendant 24 heures, on concentre le mélange, 20 on le filtre et on le lave avec de l'eau et du diméthylformamide. Le résidu séché, 112 mg (81 % de rendement) donne des résultats, à l'analysé des acides aminés à l'aide d'un appareil Spinco, conformes à la séquence ci-dessus. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et 25 représentée qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. bad original 69 11269 2006153 -10- 1. Procédé de préparation de peptides, caractérisé par le fait qu'il comprend les stades suivants: (A) on traite un hydrazide d'acide aminé ou de peptides dent le groupe amino terminal 5 est protégé, avec, un agent de nitrosylation à une température comprise entre -60°G et 0°C, en vue d'obtenir l'azide acylé correspondant ; (B) on fait réagir l'azide acylé obtenu au stade (A) avec du ïï-hydroxysuccinimide à une température comprise entre -60°C et +20°C en vue de former le N-hydroxysuccinimide-ester cor-10 rsspondant; et (C) on combine cet ester avec un acide aminé ou un peptide à une température comprise entre -/+0°C et +50°G afin d'obtenir comme produit final un peptide combiné. 2. Procédé selon la Eevendication 1, caractérisé par le fait que le TT-hydroxysuccinimide-ester est formé en présence de l'aci- 15 de aminé ou du peptide. 3. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que le groupe amino de 1'hydrazide de l'acide aminé ou de peptide utilisé comme matière de départt est protégé par un groupe t-buto-xy-carbonyle. 20 4-. Procédé selon la Revendication 1 , 'caractérisé par le fait que l'agent de nitrosylation dans le stade A est un mélange de nitrite d'isoamyle et d'acide chlorhydrique anhydre dans un solvant organique. 5- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait 25 que les réactions des stades A et B ont lieu à -40°G. 6. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que la réaction du stade A est réalisée à -40°0 et celle du stade B entre -10°G et +10°C. 7- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait 30 que la réaction du stade C se produit à la température ambiante. 8. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que la réaction de combinaison du stade C se produit à un pH compris entre 7 et 8. 9. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait 35 Que l'on ajuste à l'aide d'une aminé organique le pH de la réaction de combinaison du stade 0 entre 7 et 8. 10. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que 1'aminé organique utilisée pour ajuster le pH est la triéthylamine . . . sad original 69 11269 2006153 -11- 11. Procédé selon la Revendication 1, caractérisé par le fait que 1 ' aminé organique utilisée pour -njustar le pH est la N-éthyl-ffiorpholine. 12. Procédé selon la Aevendication '■, caractérisé par le fait 5 que (A) on traite 1.. t-butoxy-carbonyltryptopliane-acyl Lydrazide avec un agent de nitrosylation à une température comprise entre -60°C et +20°G, en vue de former l'azide acylé correspondant; (3) on fait réagir l'azide acylé avec le U-hydroxysuccininide ù une température comprise entre -50°C et 0°C en vue de donner le t-10 butoxy-carbonyl-tryptophanyloxy-succinimide; et (C) on combine le produit du stade B avec le L-méthionyl-L-aspartyl-L-phénylalanino amide à la température ambiants- en vue d'obtenir le -polypeptide correspondant. pad original