La présente invention concerne un dosage cinétique ou par virage pour déterminer la quantité de substance enzymatique active dans un échantillon d'analyse. La présente invention a plus parti culièrement pour objet la detection des phosphatases dans un échantillon sous des conditions améliorées permettant à la fois leur analyse qualitative et quantitative. L'utilisation de chromogènes pour les dosages enzymatiques est bien connue de l'art antérieur. En général, un colorant pouvant être détecté, ou un composé ayant une couleur d'intensité mesurable est produit par une enzyme spécifiquement réactive avec le substrat chromogénique et on détermine ensuite l'activité de l'enzyme par analyse du produit de la réaction. A titre d'exemple de telles réactions, on peut citer la réaction du monophosphate de p-nitrophénol dans des conditions d'hydrolyse pour rompre la liaison phosphate et produire l'ion p-nitrophénolate qui absorbe la longueur d'onde de 405 nm. On détermine la quantité d'ion précité, spectrophotométriquement en mesurant la variation de densité optique à 405 film. En ce qui concerne l'exemple ci-dessus avec l'ion p-nitrophénolate, on doit noter qu'une telle réaction a été utilisée pour déterminer la phosphatase alcaline en employant du monophosphate de p-nitrophénol comme substrat, à un pH alcalin (9-10,5) avec du sérum ou des fluides corporels renfermant de la phosphatase alcaline. Un tel dosage présente cependant de nombreux désavantages, y compris une interférence potentielle de la bilirubine et de l'hémoglobine qui peuvent se trouver dans l'échantillon de sérum à analyser. La bilirubine et l'hémoglobine peuvent interférer dans le dosage du phosphate de o-nitrophenyle car elles absorbent dans la même région du spectre que l'ion p-nitrophénolate et une compensation entraîne une certaine inexactitude. La détermination de l'activité de phosphatase alcaline dans les sérums humains, et des isoenzymes qui lui est associée est importante, car on sait que des niveaux élevés de cette activité correspondent à des désordres hépatiques et du métabolisme osseux, tels que des affections hépatiques, des affections des voies biliaires, rachitisme, sarcome ostéologique, hyperthyroIdisme et analogues. I1 en résulte que différents procédés de dosage de l'enzyme phosphatase alcaline ont été étudiés au long des années. Parmi ces essais, on peut citer des procédés par décomposition de B-glycQrophosphate en glycérol, On a également utilisé un procédé avec le monophosphate de thymolphthaléine comme substrat pour le dosage de la phosphatase du sérum.Comme dans ce procédé, on effectue les mesures à une longueur d'onde de 595 nit, l'interférence de la bilirubine et de l'hémoglobine est réduite au minimum. Cependant, on ne peut pas utiliser le monophosphate de thymolphthaléine comme substrat dans un procédé de dosage cinétique car la thymolphthaléine présente des caractéristiques de couleur à un pH supérieur au pH optimum pour l'activité de la phosphatase alcaline. Par conséquent, il faut arrêter la réaction en ajoutant un alcali , avant de pouvoir évaluer la coloration. Une véritable analyse cinétique précise.pour déterminer la quantité de phosphatase alcaline dans le sérum est donc très utile pour établir un diagnostic. La présente invention a pour obiet un test pour établir un un tet cineficne diagnostic et notamment/dans lequel un-colorant discernable est obtenu à partir d'un substrat chromogénique par réaction avec l'enzyme à analyser, à une vitesse contrsiée mesurable sans interférence avec d'autres composés éventuellement présents. La présente invention vise également un test pour les enzymes phosphatases, utilisant le monophosphate de bleu de thymol comme substrat chromogénique. Comme signalé précédemment, la mesure de l'activité des phosphatases du sérum à la longueur d'onde de 405 nm présente des inconvénients dus notamment à l'interférence potentielle de la bilirubine et de l'hémoglobine. D'autres tests dans lesquels on effectue les mesures à d'autres longueurs d'onde du spectre neces- sitent l'addition d'alcali ou d'autres réactifs pour développer la couleur à évaluer. Ces procédés ne sont pas par conséquent des analyses cinétiques. La présente invention qui élimine les inconvénients précités, concerne plus particulièrement des dérivés du bleu de thymol et notamment les monophosphates de bleu de thymol. OH H (CH3)2CH CH3 (CH3) 2CH GH G 3 CH(CH3)2 C! )2 3 O HO C O i RO-P- ~~~ CH3 OH 3 'À O2 ÀÉ C Bleu de thymol Monophosphate de thymol R représente le sodium, le potassium, l'ammonium, le 2-amino2-méthyl-1,3-propanediol, dicyclohexylamine, la cyclohexylamine, ou le tri-(hydroxyméthyl)aminométhane ou analogues. Le chromophore produit par le monophosphate de bleu de thymol absorbe dans la région des longueurs d'onde de 600 nm et peut-être détecté immédiatement dans les conditions de réaction employées. Par conséquent, il s'agit d'une véritable réaction cinétique qui permet de s'affranchir des interférences par des quantités élevées de bilirubine, d'hémoglobine et de chylomicrons éventuellement présents. En outre, la fonction sulfonate du substrat augmente la solubilité dans l'eau et évite l'interférence des cations métalliques qui ont entraîné des difficultés dans d'autres procédés. On peut obtenir du monophosphate de bleu de thymol par réaction de bleu de thymol avec POC13, puis hydrolyser en acide de bleu de thymol phosphorique et neutralisation avec une base organique ou minérale pour former un sel. OH (CH3) 2CH CH (CH3) 2 CH3 O bleu de POU13 chlorure H2O 11 thymol pyridine acide > HO-P-O e C -O (CH3)2c OH oe ÉÉÂ O2 CH (CH3)2 CH3 oe O Il 'J C OH CH3 O o 3 n o Le monophosphate du bleu de thymol est attaqué par la phosphatase alcaline à environ pH de 10~2 pour donner un chromophore intense à 6QO nm, c'est- -dire le bleu de thymol qui est mesurable en continu et cinétiquement dans tout spectrophotomêtre équipé pour la mesure des vitesses de réaction, et adapté a fonctionner dans cette longueur d'onde. D'autre part, lorsqu'on utilise le monophosphate du bleu de thymol pour détecter une phosphatase acide à pH 4-5,5, il est nécessaire d'utiliser un tampon à pH plus élevé pour produire le chromophore du bleu de thymol en vue d'effectuer des mesures d'absorbance. Suivant le procédé de la présente invention, le monophosphate du bleu de thymol est hydrolysé par la phosphatase alcaline en bleu de thymol en présence d'un tampon de diéthanolamine phosphorylable à pH 10,2. La coloration qui en résulte est proportionnelle à l'enzyme présente et la variation moyenne d'absorbance par minute (AA/mn) est déterminée à la longueur d'onde de 600 nm. Dans ce procédé, il n'y a pas de période d'induction et l'activité de l'enzyme peut être déterminée dès su'il y a établissement d'une vitesse. La réaction s'effectue de la façon suivante monophosphate du bleu de thymol + ROH Mg++ bleu de thymol + RO-phosphate où ROH est un amino alcool ou de l'eau ALP est une phosphatase alcaline. Dans le procédé d'essai suivant la présente invention, on prépare une solution-substrat réactive renfermant du monophosphate de bleu de thymol, de la diéthanolamine ou autre amino-alcool phosphorylable approprié, ou de l'eau, des ions métalliques activeurs,par exemple l'ion magnésium et autres additifs de ce type n'ayant pas d'interférence avec la réaction mais qui peuvent être souhaitables comme stabilisants, agents tensio-actifs, agents antimicrobiens et analogues. D'autres tampons amino-alcool phosphorylables pouvant être utilisés sont par exemple le 2-éthylaminoéthanol, 3-diméthylamino-l, 2-propanediol, 2-méthylaminoéthanol, ceux qui sont cités par Elias Amador, Clinical Chemistry, 18, 94 (1972) et analogues. Le tampon amino-alcool est en quantité suffisante pour élever le pH du mélange réactionnel jusqu'à environ 10,2. L'activeur magnésium est utilisé en quantité suffisante pour activer l'enzyme phosphatase alcaline dans ltéchantillon à analyser. La concentration d'ion magnésium dans le réactif-substrat est d'environ 1,5 millimole par litre. La concentration de monophosphate de bleu de thymol dans le réactif n'est pas critique mais doit être suffisante pour permettre une réaction cinétique pendant un certain temps sans épuisement du substrat, et on préfère une concentration comprise entre 1 et 3 millimoles par litre. L'échantillon de sérum à analyser est mis en contact avec le réactif-substrat à une température déterminée qui peut être comprise entre environ 220 et environ 400C, et de préférence à 300C ou 370C. Bien que la température ait une influence sur la vitesse de réaction, une température particulière, dans les limites de stabilité de l'échantillon n'est pas critique. La variation moyenne d'absorbance par minute (hA/mn) à 600 nm est ensuite déterminée dans un spectrophotomètre adapté à mesurer l'absorbance à 600 nm et à maintenir une température constante dans le compartiment à cuvette. Par définition, une unité d'activité de phosphatase alcaline est la quantité d'enzymes qui hydrolysent une micromole de monophosphate de bleu de thymol en bleu de thymol, en une minute à 300C. L'activité de l'enzyme est calculée par la formule suivante U/litre = sA/mn x 106 x volume réactionnel x Tf 3,51 x 10 x volume d'échantillon = AA/mn x 106 x 2,05 x Tf 3,51 x 104 x 0,05 8 - /mn x 116 x Tf dans laquelle U/litre = unités d'activité d'enzyme par litre à 300C 106 = conversion des moles en micromoles 3,51 x 104 - pouvoir absorbant molaire du bleu de thymol à 600 nm Tf = facteur de température pour convertir à la vitesse à 300C volume réactionnel = 2,05 ml volume d'échantillon = 0,05 mi. Exemple de calcul A/mn à 600 nm = O,Q13 Température de réaction 300C, Tf = 1 Volume d'échantillon = 0,05 ml Volume de réactif = 2,0 ml U/litre = 0,013 x 1168 xl= 15,2 Les valeurs normales d'activité de phosphatase alcaline chez l'adulte sont de 5 à 23 U/litre, valeurs obtenues par ce procédé. Ce domaine de valeurs est basé sur les résultats obtenus avec 200 adultes cliniquement normaux. Les enfants présentent normalement des niveaux de phosphatase alcaline dans le sérum plus élevés en raison d'une croissance osseuse active. Les niveaux supérieurs normaux chez l'enfant peuvent être deux fois plus élevés que chez l'adulte. Si on le désire, on peut utiliser un procédé par virage pour déterminer l'activité de phosphatase alcaline du sérum, en utilisant du monophosphate de bleu de thymol comme substrat. Dans ce cas, l'échantillon de sérum à analyser est ajouté à la solution substrat de monophosphate de bleu de thymol tamponnée par la diéthanolamine, et on termine la réaction au bout de dix mn par addition d'un réactif alcalin par exemple, 0,1M NaOH et 0,1M Na2CO3. On lit l'absorbance de l'échantillon à 600 nm et l'activité de l'enzyme est déterminée à partir d'une courbe-étalon préparée à partir de bleu de thymol-étalon. La courbe-étalon est obtenue en mesurant l'absorbance de dilutions d'un étalon connu et en relevant l'absorbance mesurée par rapport à l'activité d'enzyme calculée en unités par litre. On peut utiliser un procédé par virage pour la détermination de l'activité de phosphatase acide en employant du monophosphate de bleu de thymol comme substrat. Dans ce cas, on ajoute l'échantillon de sérum à analyser à une solution de monophosphate de bleu de thymol, tamponnée à un pH d'environ 5 et on termine la réaction par addition d'un réactif alcalin après vingt minutes de réaction. On mesure ensuite l'absorbance de l'échantillon à 600 nm et on détermine l'activité d'enzyme phosphatase acide à partir d'une courbe-étalon obtenue avec du bleu de thymol-étalon comme décrit ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants EXEMPLE I - Solution de sel de sodium, monophosphate de bleu de thymol. On fait réagir à température ambiante ordinaire, pendant deux heures et demie un mélange de 28 g de bleu de thymol, 10 ml d'oxychlorure de phosphore et 12 ml de pyridine dans 250 ml de dioxane sec. On verse le mélange réactionnel dans 500 ml d'eau et on agite pendant une nuit. On sépare le monophosphate du bleu de thymol sous forme de solution aqueuse à pH 8,12 après extraction avec un mélange 1/1 de n-butanol/éther de pétrole, éthylacétate et hexane. Le volume total est d'un litre. La concentration de monophosphate de bleu de thymol déterminée par hydrolyse totale en bleu de thymol par la phosphatase alcaline à pH 10, est de 15 mmoles/litre. Le rendement est approximativement de 25%. La solution, diluée dix fois à approximativement 1,5 mmole/ litre, est utilisée pour préparer le réactif servant à la détermination de la phosphatase alcaline. On mélange la solution diluée de monophosphate de bleu de thymol dans la proportion de 1/1 avec du tampon diéthanolamine l,0M au pH 10,2. La densite optique (D.O.) du réactif approprié, préparé fraîchement est de 0,042 à 600 nm. On mélange un échantillon (2 ml) du réactif utilisé avec 50 1 de Validate A (sérum de contrôle, General Diagnostics) et la vitesse de la réaction à 300C est observée dans un spectrophotomètre (Gilford 300-N) réglé à 600 nm. La vitesse est égale à 0,0308/mn. L'activité de l'enzyme, calculée, est de 36 unités par litre. EXEMPLE II - Monophosphate de bleu de thymol (sel d'aminoéthyl propanediol). On dissout 5 mmoles (2,33 g) de bleu de thymol dans 100 ml de tétrahydrofurane sec dans un ballon de 250 ml, à fond rond et à trois cols, équipé d'un agitateur mécanique et d'un condenseur à reflux protégé par un tube dessicateur, et on fait réagir avec 1 ml (11 mM) d'oxychlorure de phosphore et 1 ml (12 mM) de pyridine. On chauffe à reflux le mélange obtenu pendant une demi-heure et on filtre. On verse le filtrat tout en agitant dans un mélange de 120 ml d'acide chlor ydrique 2N et de glace pilée. Après plusieurs heures à température ambiante ordinaire, on prélève le précipité par centrifugation. On lave plusieurs fois le précipité avec de l'acide chlor ydrique 2N et de l'eau.On dissout ensuite le précipité dans une solution d'hydroxyde de sodium à pH 10,6 et on extrait la solution alcaline avec un mélange 1/1 de n-butanol/éther de pétrole, acétate d'éthyle et hexane. Après extraction, la phase aqueuse d'un volume de 275 mI présente un pH égal à 7,7. On ajuste le pH de la solution aqueuse à 4,0 avec de l'acide chlorhydrique et on extrait à l'éther. On ajoute un sel pour saturer la phase aqueuse. L'extraction à l'éther et à l'acétate d'éthyle provoque la séparation d'un solide rougeorange à l'interface des solvants. On recueille le solide sur un filtre à verre fritté, par aspiration, et on dissout dans l'éthanol. La solution du produit, filtrée pour éliminer les sels insolubles est traitée par 1'AMPD (2-amino-2-méthyl-l, 3-propanediol) alcoolique.L'addition d'éther et un refroidissement provoquent la séparation d'un précipité orange clair qu'on recueille sur un filtre poreux avec aspiration, et on lave le précipité avec de l'éther. On obtient des quantités supplémentaires de produit par d'autres dilutions du filtrat avec l'éther. La chromatographie en couche mince (gel de silice, 95% éthanol) du produit montre une seule tache jaune à Rf 0,33, tandis que le produit de départ (bleu de thymol) est à Rf 0,71 dans les mêmes conditions et devient bleu par exposition à l'ammoniac. Les spectres RMN sont conformes avec la structure du monophosphate. Une solution du produit à pH 10,2 dans un tampon diéthanolamine renfermant du chlorure de magnésium agit comme un substrat pour la phosphatase alcaline comme montré par spectrophotométrie, par la libération de bleu de thymol en plus de sérums contenant de la phosphatase alcaline. EXEMPLE III - Bleu de thymol phosphoryle. 14 g (32 mM) de bleu de thymol séché sur du pentoxyde phosphoreux, sous vide, pendant deux heures, sont mis en suspension dans 200 ml de tétrahydrofurane sec dans un ballon à fond rond, à trois cols, de 500 ml, et on fait réagir avec 3 ml d'oxychlorure de phosphore (33 mM) et 5 ml de pyridine sèche. On chauffe le mélange à reflux pendant une demi-heure, on verse ensuite dans HC1 2N et de la glace pilée en agitant. La gomme rouge sombre formée est agitée plusieurs fois avec des volumes frais d'HCl 2N, et séparée chaque fois par centrifugation. On dissout le précipité dans NaOH 2N et on extrait la solution (pH 6,0) avec n-BuOH/éther de pétrole (1/1), l'acétate d'éthyle et l'éther, et ensuite on acidifie jusqu'à pH 2,5 et on extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle.L'addition de sel à la phase aqueuse provoque la séparation d'un solide visqueux rouge prélevé dans le méthanol et séché sur un tamis moléculaire 3A (Linde) pendant une nuit. La solution de méthanol est évaporée, le résidu est trituré avec de l'acétate d'éthyle et de l'éther et le solide est recueilli sur un filtre de verre avec aspiration. Après séchage, le solide contaminé par des sels minéraux pèse 14,5 g. La trituration dans l'acétate d'éthyle et l'éther, conduit à un échantillon sans produit de départ. Une solution du produit (1 mg/50 ml) dans un tampon de phosphate à pH 7,0 montre un maximum d'absorption à une longueur d'onde de 271 nm. Le coefficient d'extinction E du monophosphate du bleu de thymol à 271 nm est de 4,963; à 405 nm e égale 7,910.Un échantillon de 2 mg du solide dans 2,9 ml de tampon diéthanolamine (pH 10,2) donne avec 0,1 ml de sérum de contrôle (Validate A) une vitesse d'absorption (hA/mn) à 600 nm de 0,0180/mn alors qu'avec un échantillon de 5 mg la vitesse est de 0,028/mn. EXEMPLE IV - Monophosphate de bleu de thymol dans un tampon diéthanolamine. 30 millimoles (14 g) de bleu de thymol sont mises en suspension dans approximativement 200 ml de tétrahydrofurane sec, dans un ballon fond rond et à trois cols, de 500 ml, équipé d'un agitateur et d'un tube dessicateur, et on fait réagir pendant deux heures à température ambiante ordinaire avec 3 ml d'oxychlorure de phosphore et 5 mi de pyridine. On filtre le mélange réactionnel et on concentre le filtrat sous pression réduite, à 50-75 ml. On verse le concentré dans de l'eau glacée et on laisse reposer pendant une nuit. On centrifuge la suspension, à pH 1,5. On melange les couches supérieures, on ajuste à pH 7,0, on sature avec du sulfate de sodium, et on extrait trois fois avec l'éther. La phase aqueuse apres élimination de l'éther, sous pression réduite, est placée dans une grande capsule d'évaporation et lyophilisée pour donner 66,5 g d'un solide orange qui renferme des sels minéraux. Le solide orange est ensuite mis en suspension dans de l'éthanol absolu et après élimination des sels par filtrage, la solution est concentrée à 6,0 g de résidu orange qui est repris dans un tampon diéthanolamine 1,OM (2,250 ml) à pH 10,2 pour donner une concentration de 2,6 mg/ml ou 4,8 mmole/litre. Un volume d'essai de 2,9 ml montre une absorbance de 0,131 à 600 nm et une vitesse de 0,37/mn à 300C avec 0,1 ml de "Lederzyme Control Sera" (Lederle).Lorsqu'on refroidit de 20 à 80 pendant une période de six mois, le substrat tamponné montre une augmentation d'absorbance à 600 nm jusqu'd approximativement 0,550 en raison d'une hydrolyse progressive, mais, activité vis-à-vis de la phosphatase alcaline reste inchangée. Le substrat tamponné et gelé reste inchangé pendant la même période de stockage, c' est-à-dire son absorbance n'augmente pas de façon notable. EXEMPLE V - Monophosphate de bleu de thymol dans une formulation lyophilisée. 14 g de bleu de thymol sont mis en suspension dans 250 ml de tétrahydrofurane sec dans un ballon à fond rond, à trois cols, de 500 ml et on fait réagir pendant 2-3 heures à température ambiante ordinaire avec 3 ml d'oxychlorure de phosphore et 4 ml de pyridine. On filtre le mélange, on verse le filtrat dans de l'eau et on laisse au froid pendant une nuit. On ajuste le pH du mélange aqueux à 10 avec de l'hydroxyde de potassium aqueux, on extrait deux fois avec du butanol, une fois avec un mélange (1/1) de butanol-éther de pétrole, et deux fois avec de l'éther. La chromatographie en couche mince montre encore une impureté à déplacement rapide. On traite le mélange aqueux avec du sulfate de sodium et on extrait deux fois avec du butanol. La chromatographie en couche mince montre essentiellement une tache, pas de produit de départ et seulement une légère quantité d'impureté à déplacement rapide. Une extraction supplémentaire de la solution aqueuse avec de l'éther est suivie par un traitement avec de la Célite qu'on élimine par filtration. On ajuste le pH de la solution à 8, par addition d'acide chlorhydrique aqueux. Un mélange de 0,25 ml de ce substrat et 2,65 ml de tampon diéthanolamine 1M, présente une absorbance de 0,082 à 600 nm, à 250C. A la même température avec 0,1 ml de sérum de référence (Validate A Control Serum, General Diagnostics) la vitesse mesurée est de 0,0388/mn. Un échantillon de solution de substrat est traité avec de l'aminoéthylpropanediol à pH 11 et des parties aliquotes de 0,2 ml sont prélevées à la pipette et mises dans des tubes pour lyophilisation. Le réactif lyophilisé reconstitué avec 2,9 ml de tampon diéthanolamine 1M, présente une absorbance de 0,288 à 600 nm. La vitesse de l'absorbance, avec 0,1 ml de Validate A, à 250C, est de 0,0313/mn. Des tubes renfermant des réactifs lyophilisés sont conservés à température ambiante ordinaire pendant plusieurs mois, sans modification appréciable d'absorbance ou d'activité. EXEMPLE VI - Monophosphate de bleu de thymol/formulations lyophilisées de tampon. A. Une solution de monophosphate de bleu de thymol au potassium, pH 7,6 (0,3 ml et 2,6 ml de tampon diéthanolamine 1M donne une densité optique de 0,035 et une vitesse d'absorbance de 0,0312/mn avec 0,1 ml de Validate A à 250C) est traitée avec de l'aminométhylpropanediol (5,25 g), du citrate de sodium (0,1 g), de l'hexahydrate de chlorure de magnésium (0,03 g), on ajuste le pH à 10,2 avec de l'acide chlor ydrique et on dilue avec de l'eau à 50 ml dans un flacon gradué. Des parties aliquotes de 1,2 ml sont prélevées à la pipette et mises dans des tubes à essai pour lyophilisation.Des échantillons lyophilisés reconstitués avec 2,9 ml d'eau présentent une absorbance à 600 nm de 0,143 et une vitesse d'absorbance de 0,0310/mn avec 0,1 ml de Validate A, à 250C. B. Une solution de 200 mg du sel de dicyclohexyl-ammonium de monophosphate de bleu de thymol, dans 50 ml de tampon aminométhylpropanediol 0,6M, est utilisée pour lyophiliser des parties aliquotes de 1 ml dans des tubes à essai. Les échantillons lyophilisés présentent un aspect vitreux mais sont stables lorsqu'on les conserve à température ambiante ordinaire. Immédiatement après lyophilisation, le contenu d'un tube est reconstitué avec 2,9 ml d'eau, et présente une absorbance à 600 nm de 0,202 et une vitesse avec 0,1 ml de Validate A, de 0,0475/mn. Après un mois à température ambiante ordinaire, on ajoute 2,9 ml de tampon diéthanolamine aux deux tubes, et les absorbances à 600 nm sont respectivement de 0,188 et 0,194.Après trois mois à température ambiante ordinaire, l'absorbance est de 0,195. EXEMPLE VII - Formulations lyophilisées de monophosphate de bleu de thymol. A. Une solution aqueuse de monophosphate de bleu de thymol, tris-tamponné, pH 8,9, est lyophilisée en parties aliquotes de 0,3 ml pour donner des résidus oranges, visqueux. Après reconstitution avec 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M, la solution présente une densité optique de 0,196 à 600 nm et donne une vitesse de 0,0584/mn avec 0,1 ml de Validate A, à 250C. B. On ajoute du mannitol, 70mg/ml, à une solution aqueuse de monophosphate de bleu de thymol, tris-tamponnS, pH 8,9. On lyophilise des parties aliquotes de 0,3 ml et on obtient un solide orange. Après reconstitution avec 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M, le réactif présente une densité optique à 600 nm de 0,166 et donne une vitesse d'absorbance de 0,0552/mn avec 0,1 ml de Validate A, à 250C. Le pH est égal à 10,19. C. On ajoute de l'oxyde de magnésium à une solution acide de monophosphate de bleu de thymol, à pH 9,7, qui est ensuite lyophilisée en parties de 0,5 ml. On obtient des tampons oranges, duveteux qui, par dissolution dans 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M, Dré- sentent une densité optique de 0,154 à 600 nm et une vitesse de 0,0573/mn, à 250C, avec 0,1 ml de Validate A. Le pH est égal à 10,21. D. Une solution de mononhosphate de bleu de thymol tristamponné, est enrichie avec environ 35 de polyvinylpyrrolidine solide et lyophilisée en parties aliquotes de 0,3 ml en tampons compacts qui se dissolvent lentement dans 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M (pH 10,19). La densité optique du réactif à 600 nm est de 0,087 et la vitesse de réaction avec 0,1 ml de Validate A, à 250C, est de 0,0582/mn. EXEMPLE VIII - Solution de monophosphate de bleu de thymol au sodium. On disperse 30 mmoles (14 g) de bleu de thymol (Eastern Chemicals) dans 250 ml de dioxane sec, dans un ballon à fond rond, à trois cols, de 500 ml équipé d'un agitateur et d'un tube à dessécher, on fait réagir avec 5 ml d'oxychlorure de phosphore et 6 ml de pyridine, à température ambiante ordinaire, pendant environ trois heures. On verse l'ensemble du mélange dans 500 ml d'eau. On ajuste le pH à 10 par addition d'hydroxyde de sodium aqueux à 20%, et on ajoute du chlorure de sodium pour saturer la phase aqueuse qu'on extrait successivement avec deux volumes de butanol/éther de pétrole (1/1), un volume de butanol/acétate d'éthyle (1/1), et un volume de butanol. Après extraction, le DH de la phase aqueuse est égal à 6,5.On rend de nouveau alcalin (pH 10) avec de l'hydroxyde de sodium et on lave avec de l'éther pour éliminer les solvants résiduels. En laissant reposer à température ambiante ordinaire, pendant une nuit, un précipité orange se sépare de la phase aqueuse saturée toujours à pH 10. On recueille des solides par centrifugation et on lave deux fois dans des tubes centrifugés avec une solution saturée de chlorure de sodium Le solide jaune-orange se dissout facilement dans l'eau et légèrement dans l'éthanol absolu. Le produit apparaît essentiellement homogène en chromatographie en couche mince (Si02;.95% EtOH), excepté une trace d'impureté de Rf plus élevé. On dissout les solides dans l'eau, on traite avec une petite quantité de charbon et de Célite, on dissout ensuite à 4,5 litres avec de l'eau et on ajuste le pH à 10. La concentration du substrat est déterminée par digestion avec de la phosphatase alcaline à 300C pendant 30 mn, au bleu de thymol et mesurée à 600 nm, et donne environ 2,5 mmoles/litre. Le rendement total est de 37,5% du rendement théorique basé sur 30 mM de produit de départ. Après dilution avec un volume égal de tampon diéthanolamine 0,6M (pH 10,2), (1 mi de solution de substrat et 1 ml de tampon), le réactif présente une densité optique de 0,048 à 600 nm et une vitesse de 0,0758/mn avec 0,1 ml de sérum de contrôle Validate A (Lot 2685063, titré à 31 unités de phosphatase alcaline par SMA 12/30 Technicon Standard). EXEMPLE IX - Sel de dicyclohexylammonium de monophosphate de bleu de thymol. On fait réagir 28 g (60 mM) de bleu de thymol dans 250 ml de tétrahydrofurane sec, dans un ballon à fond rond, à trois cols, de 500 ml pendant deux heures, à température ambiante ordinaire, avec 6 ml d'oxychlorure de phosphore et 8 ml de pyridine, puis on filtre. On verse le filtrat dans 500 ml d'eau. On ajoute de l'hydroxyde de sodium pour terminer la dissolution et on ajuste le pH à 10 avant d'extraire trois fois avec du butanol/éther de pétrole (1/1). La chromatographie en couche mince montre la présence d'impuretés dans le mélange. Après avoir laissé au réfrigérateur pendant une nuit et après filtration de la Celite, on ajuste le pH à 8,6, on sature avec 200 g de sulfate de sodium et on extrait plusieurs fois avec du butanol/éther de pétrole (1/1), et une fois avec du butanol jusqu'à ce que la chromatographie en couche mince montre une très faible quantité d-'impuretés à déplacement rapide. On acidifie le mélange aqueux à pH 2,5 avec de l'acide chlorhydrique 6N et on extrait avec du butanol (plusieurs portions). On mélange les extraits organiques, on sèche sur "Drierite" (sulfate de calcium anhydre), on filtre et on fait réagir avec 32,6 g (180 mM) de dicyclohexylamine. Après dilution avec de l'éther, à un volume d'environ 2 litres, un précipité orange se sépare qu'on recueille sur un filtre avec aspiration. Le solide pèse 1,3 g. La chromatographie en couche mince montre essentiellement une tache (Rf 0,5, éthanol et gel de silice, avec le méthanol on obtient Rf 0,75). EXEMPLE X - Sel de cyclohexylammonium de monophosphate de bleu de thymol. On met en suspension 30 millimoles (14 g) de bleu de thymol dans 250 ml de dioxane sec dans un ballon à trois cols, à fond rond, de 500 ml, équipé d'un agitateur mécanique et on fait réagir avec 3 ml d'oxychlorure de phosphore et 4 ml de pyridine sèche. On agite le mélange réactionnel dans des conditions ambiantes ordinaires pendant deux heures jusqu'à atténuation de l'exothermicité, puis on filtre et on verse le filtrat dans 500 ml d'eau sous agitation et on agite le mélange pendant une heure à une heure et demie. On ajuste le pH à 10 par addition d'hydroxyde de potassium aqueux à 50%. On ajoute du sulfate de sodium (100 g) avant d'extraire le mélange deux fois avec du butanol/acétate d'ethyle (1/1), deux fois avec le butanol/éther de pétrole (1/1), et deux fois avec de l'éther. (La chromatographie en couche mince révèle la présence d'une certaine quantité de bleu de thymol dans la phase aqueuse). On ajoute une autre portion de 100 g de sulfate de sodium, à la phase aqueuse et on ajuste le pH à 2,3 en ajoutant de l'acide sulfurique aqueux.On extrait la solution saturée deux fois avec de l'éther et trois fois avec du butanol. On mélange les extraits au butanol, on dilue avec de l'éther, on sèche sur tamis moléculaire 3A et on fait réagir avec une solution éthérée de 9 g (environ 90 mM) de cyclohexylamine. Après renos à température ambiante ordinaire pendant une à deux heures, il se forme dans le ballon un précipité qu'on recueille par filtration et qu'on lave avec de l'éther. Après séchage, le solide orange pèse 5,0 g et présente une contamination par le bleu de thymol en chromatographie en couche mince. Le filtrat et l'éther lavés au repos, à froid, donnent un précipité orange pesant 1,1 g. Ce précipité ne renferme pas de particules minérales et pratiquement pas de bleu de thymol. (Après un mois à température ambiante ordinaire, on détecte du bleu de thymol par chromatographie en couche mince, ce qui indique une décomposition). Le composé orange devient brun par chauffage à partir d'environ 2650C. Un échantillon de 4 mg dans 2,9 ml de tampon diéthanolamine présente une densité optique de 0,061 à 600 nm et donne avec 0,1 ml de Validate A une vitesse de 0,0427/mn à 250C. Le produit orange est hygroscopique. EXEMPLE XI - Solution du sel de sodium de monophosohate de bleu de thymol. On fait réagir, comme précédemment décrit, 14 g (30 mM) de bleu de thymol dans 250 ml de dioxane sec, avec 4,5 ml d'oxychlorure de phosphore et 6 ml de pyridine, pendant deux heures à température ambiante ordinaire. On filtre le mélange et on hydrolyse dans 500 ml d'eau et on ajuste le pH à 8 par addition d'hydroxyde de sodium. Après saturation avec du chlorure de sodium, on extrait le mélange trois fois avec du butanol/éther de pétrole (1/1), on ajuste le pH à 2 et on extrait le produit dans plusieurs parties de butanol qu'on mélange et lave avec des solutions de sel saturées avant d'extraire avec de l'eau (deux fois) et de l'hydroxyde de sodium 0,1N (deux fois).On mélange les extraits aqueux, on ajuste le pH à 10, on lave avec de l'éther, on évapore jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de solvants, dans un évaporateur rotatif, et on obtient 475 ml de solution rouge sombre, limpide. Un mélange de 0,2 ml de solution rouge et de 1,8 ml de tampon diéthanolamine 1M présente une densité optique à 600 nm de 0,088 et donne avec 0,1 ml de sérum de référence Validate A une vitesse de 0,0577/mn, à 250C. EXEMPLE XII - Sel d'ammonium du monophosphate du bleu de thymol. On fait réagir 14 g (30 mM) de bleu de thymol dans 250 ml de dioxane sec, à température ambiante ordinaire, avec 4,5 ml d'oxychlorure de phosphore en présence de 6 ml de pyridine. On procède comme ci-dessus excepté que la phase de butanol renfermant le produit de réaction est extraite avec plusieurs parties d'ammoniaque diluée (500 ml de 100 ml d'ammoniaque avec 400 ml d'eau). On lave les extraits alcalins (pH 11,5) avec du butanol (deux fois) et avec de l'éther (trois fois) et on évapore dans un dessicateur rotatif jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'effervescence. La chromatographie en couche mince montre qu'il n'y a pas de bleu de thymol dans l'échantillon. Un échantillon de la solution (0,2 ml avec 1,8 ml de tampon diéthanolamine 0,6M) présente une densité optique de 0,083 à 600 nm et donne une vitesse de 0,0486/mn, à 250C, avec 0,1 ml de Validate A. EXEMPLE XIII - Sel de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane de monophosphate de bleu de thymol. Le produit de la réaction, à température ambiante ordinaire, de 14 g de bleu de thymol dans 250 ml de dioxane sec avec 4,5 ml d'oxychlorure de phosphore et 6 ml de pyridine est hydrolysé et traité comme précédemment. On sèche la solution du produit dans le butanol, sur tamis moléculaire 3A, et on fait réagir avec un excès de base tris. On extrait le sel obtenu dans plusieurs parties d'eau. Les phases aqueuses mélangées tpH 8,8) sont lavées avec du butanol/acétate d'éthyle (1/1) et avec de l'éther avant de réduire par aspiration d'eau, à environ 700 mi de liquide ambré clair présentant une activité de substrat intense, avec la phosphatase alcaline.Un réactif de 0,3 ml de substrat et 1,7 ml de tampon diéthanolamine 0,6M présente une densité optique à 600 nm de 0,059 et donne une vitesse de 0,0600/mn, à 250C, avec 0,1 ml de Validate A. Des parties aliquotes, lyophilisées, de 0,3 ml de substrat en présence de mannitol donnent des tampons solides oranges qui, par reconstitution avec 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M, présentent une densité optique de 0,166 à 600 nm, pH 10,19 et donnent une vitesse d'absorbance de 0,0552/mn, à 250C, avec 0,1 ml de Validate A. EXEMPLE XIV - Formulation lyophilisée du sel de sodium de monophosphate de bleu de thymol. On utilise 20 ml d'une solution du sel de sodium de monophosphate de bleu de thymol pour dissoudre un gramme de mannitol et 0,5 g de AMPD (2-amino-2-méthyl-1,3-propanediol), on ajuste le pH à 10,22 et on porte le volume à 25 ml avec de l'eau. Un volume d'essai de 0,5 ml avec 1,5 ml de tampon diéthanolamine 0,6M présente une densite optique de 0,042 à 600 nm et donne une vitesse de 0,0563/mn avec 0,1 ml de Validate A, à 250C. On lyophilise des parties aliquotes de 0,5 ml dans des petits tubes à essai. Le substrat lyophilisé est reconstitué avec 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M. La densité optique à 600 nm est de 0,079 et la vitesse avec 0,1 ml de Validate A, à 250C, est de 0,0537/mn (0,0718/mn à 300C). EXEMPLE XV - Formulation lyophilisée du sel de cyclohexylammonium de monophosphate de bleu. de thymol On prépare une solution de base pour lyophilisation avec 20 ml de sel de cyclohexyiammonium de monophosphate de bleu de thymol, 1,5 g de mannitol et 0,5 g de AMPD (2-amino-2-méthyl-l,3- propanediol). Le pH de la solution est ajusté à 10,29 et on dilue à 25 ml. On utilise des parties aliquotes de 0,8 ml pour lyophilise sation dans de petits tubes à essai. Le substrat lyophilisé est reconstitué avec 2 ml de tampon diéthanolamine 0,6M. La densité optique à 600 nm est de 0,054 et la vitesse avec 0,1 ml de Validate A, à 30cC, est de 0,0679/mn. Après un mois à température ambiante ordinaire, un échantillon reconstitué de façon analogue présente une densité optique à 600 nm de 0,075 et donne une vitesse de 0,0674/mn avec 0,1 ml de Validate A, à 300C. EXEMPLE XVI - Phosphatase alcaline du sérum-dosage cinétique. Un substrat pour doser la phosphatase alcaline par un procédé cinétique, est préparé avec la composition suivante monophosphate de bleu de thymol : 1,5 millimole/litre tampon diéthanolamine (pH 10,2) : 0,5 mole/litre chlorure de magnésium : 1,5 mmole/litre On place 2 ml de la composition ci-dessus dans une cuvette de 1 cm, dans un spectrophotomètre, et on porte à 300C. On ajoute 0,05 ml du sérum à analyser. L'absorbance mesurée à 600 nm est de 0,0327 au bout d'une minute, et de 0,437 au bout de cinq minutes. A partir de ces deux valeurs, la variation d'absorbance (hA/mn) est par conséquent de 0,022. La quantité d'enzyme phosphatase alcaline, calculée, est de 26 unités nar litre. EXEMPLE XVII - Phosphatase alcaline du sérum-dosage par virage. On prépare de façon identique à celle de l'exemple XVI, un substrat pour le dosage de la phosphatase alcaline par un procédé de virage. On place 1 ml du réactif dans un tube approprié de 10 ml pour la mesure de l'échantillon à analyser, et un ml de réactif dans un second tube pour une mesure à blanc. Les tubes sont placés dans un bain-marie à 370 pendant 5 mn. On ajoute l'échantillon de sérum (0,1 ml) à analyser, dans le tube à échantillon, et 0,1 ml d'eau dans le tube de mesure à blanc. Après 10 mn d'incubation, à 370C, on ajoute 3,0 ml d'une solution alcaline 0,1M NaOH et O,iM Na2CO3, pour arrêter la réaction.On utilise la solution à blanc pour régler le spectrophôtomètre à la valeur d'absorption 0, puis on mesure l'absorption du tube à échantillon, et on trouve 0,329 à 600 nm. On détermine une activité de phosphatase alcaline égale à 38 U/litre avec une courbe-étalon construite à partir de concentrations connues de bleu de thymol. EXEMPLE XVIII - Phosphatase acide-dosage par virage. On prépare un réactif renfermant 1,2 mmole/litre de monophosphate de bleu de thymol, du tampon citrate 0,05M, pH 5,0, et 0,1% de détergent non-ionique, Tergitol NPX (Union Carbide Corp.). On met 1 ml de cette solution de substrat réactif dans chacun de deux tubes à essai qu'on chauffe à 370C pendant 5 mn. A l'un des tubes à essai, on ajoute 0,2 ml d'un échantillon de sérum renfermant une quantité élevée de phosphatase acide. Ensuite, on laisse reposer le mélange à 370C pendant 20 mn, et on ajoute 3,0 ml de réactif alcalin (0,1M Na2CO3 + 0,1M NaOH) pour arrêter la réaction. On fait incuber le second tube (blanc) pendant 20 mn à 370C puis on ajoute 3,0 ml du réactif alcalin et immédiatement apures, 0,2 ml de l'échantillon de sérum. On mesure l'absorption de chaque solution, à 600 nm, par rapport à l'eau distillée. L'échantillon de sérum à analyser présente une absorption de 0,364. Le blanc présente une absorption de 0,111, ce qui indique une augmentation nette de 0,253 unité d'absorption. L'activité de phosphatase acide du sérum, calculée à partir d'une courbe-étalon, est égale à 6,5 U/litre. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples donnés ci-dessus, elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1.- Composés pour l'analyse d'enzymes phosphatases alcalines, caractérisés en ce qu'ils ont pour formule dans laquelle R est choisi dans le groupe comprenant le sodium, le potassium, l'ammonium, le 2-amino-2-méthyl-1,3-propanediol, la dicyclohexylamine, la cyclohexylamine, et le tris(hydroxy methyl)aminom^than. 2.- Composition pour l'analyse d'enzymes phosphatases alcalines, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé suivant la revendication 1, un tampon phosphorylable en quantité suffisante pour donner un pH d'environ 10,2 et un activeur de phosphatase alcaline en quantité suffisante pour activer ladite phosphatase alcaline. 3.- Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le tampon phosphorylable est la diéthanolamine. 4.- Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que l'activeur est un composé de magnésium, minéral. 5.- Procédé pour analyser des enzymes phosphatases alcalines d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met ledit échantillon en contact avec une composition suivant la revendication 2 qui libère un colorant, à une vitesse mesurable, et on mesure avec un spectrophotomètre la vitesse de formation du colorant. 6.- Procédé pour analyser des enzymes phosphatases alcalines d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met ledit échantillon en contact avec une composition suivant la revendication 2, on ajoute un alcali, et on détermine l'absorbance du mélange obtenu. 7.- Procédé pour analyser des enzymes phosphatases acides d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met ledit échantillon en contact avec une composItion comprenant des composes de formule dans laquelle R est choisi dans le groupe comprenant le sodium, Le potassium, l'ammonium, le 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, la dicyclohexylamine, ia cyclohexylamine et la tris(hydroxymethyl)ami- nomethane, un tampon en quantIté suffisante pour obtenir un pM acide, on ajoute un alcali et on détermine l'absorbance du mélange obtenu.