t 2047951 La présente Invention concerne tin procédé pour la culture de micro-organismes sur des hydrocarbures et plus spécialement la récupération de micro-organismes ne renfermant sensiblement pas d'hydrocarbure présent dans le substrat sur lequel ils sont développés. 5 la pénurie critique de produits alimentaires que l'on rencontre à la fois pour les êtres humains et pour les animaux dana certaines parties du monde pose un problème d*une importance croissante. Ii'emploi d'engrais ou de fertilisants et l'utilisation de techniques de culture améliorées ont augmenté fortement le rendement en 10 récolte par hectare de terre cultivée. Bien que cette productivité accrue ait eu pour conséquence l'obtention d'une plus grande quantité de nourriture pour un plus grand nombre d'êtres dans le monde, il existe encore un nombre alarmant d'êtres humains qui souffrent de oalnutrition. Pour remédier à la malnutrition, on a créé des 15 suppléments alimentaires à base de protéines et de vitamines, à la fois pour la consommation par les animaux et par les êtres humains. Les concentrés de protéines destinés à servir de suppléments alimentaires, que l'on trouve dans le commerce, renferment de la farine de poisson, de la farine d'arachides, de la farine de graines de 20 coton, de la farine de soja et des micro-organismes tels que des bactéries, des moisissures, des levures, etc... A cause de leur vitesse élevée de multiplication, les micro-organismes ont retenu de plus en plus l'attention comme source de protéines de bonne qualité. La faculté des micro-organismes de pro-25 voquer la métabolisation des hydrates de carbone est bien connue. Mais on sait également très bien que les hydrates de carbone sont des matières premières relativement coûteuses si le produit final désiré est un micro-organisme relativement peu coûteux. A cause de l'abondance de dépôts de pétrole brut relativement pau coûteux, des 30 travaux expérimentaux considérables ont été effectués en utilisant des hydrocarbures dérivés des pétroles comme seule source de carbone pour le développement des micro-organismes. Les recherches effectuées ont permis de constater qu'un certain nombre de micro-organismes se développaient sur des substrats dérivée des pétroles, allant des 35 hydrocarbures normalement gazeux, en passant par des hydrocarbures normalement liquides, jusqu'à des hydrocarbures, qui sont solides dans les conditions atmosphériques normales. Une difficulté rencontrée pour la culture d'un micro-organisme sur un hydrocarbure dérivé des pétroles ou sur un mélange d'hydrocarbures de ce genre est la 70 2T855 2 2047951 récupération d'un micro-organisme ne renfermant pas d'hydrocarbure absorbé ou adsorbé. Jusqu'ici divers moyens ont été utilisés pour tenter de récupérer un micro-organisme ne renfermant sensiblement pas de substrat 5 hydrocarboné. Suivant une médhode décrite dans le brevet de3 Etats Unis d'Amérique N° 3*186.922, le micro-organisme contaminé par des hydrocarbures est mélangé avec un agent tensio-actif, centrifugé, puis lavé en plusieurs stades avec de l'eau. Selon une autre méthode décrite dans le brevet des Etats Unis d'Amérique R° 3.268.419» 10 le micro-organisme contaminé par un hydrocarbure est traité au cours d'un premier stade d'extraction avec un solvant polaire, tel que l'éthanol ou l'isopropanol, et au cours d'un second stade d'extraction avec un solvant hydrocarboné comme l'hexane ou un mélange azéotropique d'hexane avec de l'isopropanol ou de l'éthanol. Selon 15 une autre méthode décrite dans le brevet des Etats Unis d'Amérique N° 3*264.196, le micro-organisme contaminé par un hydrocarbure est mélangé avec un milieu nutritif aqueux et est maintenu dans des conditions de fermentation active normales en présence d'un gaz contenant de l'oxygèhe libre, mais en l'absence d'hydrocarbure addition-20 nel. la fermentation est poursuivie jusqu'à ce que l'hydrocarbure ait été sensiblement épuisé. l'invention a pour but d'apporter des perfectionnements aux procédés existants* L'invention est matérialisée dans un procédé selon lequel on 25 soumet un micro-organisme contaminé par des hydrocarbures à un stade de maturation pendant lequel l'agent de contamination formé par l'hydrocarbure est nettement réduit ou supprimé, tout en augmentant simultanément le rendement en produit, en augmentant la teneur en protéines du produit, et, en réduisant la quantité de cendres nor-30 malement formée si la fermentation est poursuivie dans des conditions de fermentation active normales* Au cours du stade de maturation, le micro-organisme contaminé par des hydrocarbures est amené en contact avec un gaz contenant de l'oxygène libre, en présence d'un milieu nutritif aqueux et en l'absence d'hydrocarbure ajouté, 35 à une température inférieure à la température normalement utilisée pendant le stade de fermentation active du processus. La maturation du micro-organisme peut être effectuée dans le récipient de fermentation ou bien, si désiré, le micro-organisme contenant l'agent de contamination formé par l'hydrocarbure peut être séparé de la masse 70 21855 5 2047951 de fermentation, puis amené en contact dans un récipient séparé avec un gaz contenant de l'oxygène libre, en présence dû milieu nutritif aqueux. On a constaté suivant l'invention qu'un micro-organisme qui ne 5 renferme sensiblement pas d'agent de contamiTifl.tion hydrocarboné peut être obtenu au cours d'un procédé consistant à cultiver le micro-organisme consommant l'hydrocarbure à une température de 25°0 à 40°C environ en présence d'un milieu nutritif aqueux, d'un hydrocarbure et d'un gaz contenant de l'oxygène libre; à récupérer un 10 micro-organisme contenant une petite quantité d'hydrocarbure à titre d'agent de contamination; à amener le micro-organisme contaminé par l'hydrocarbure en contact, à une température inférieure à celle entretenant la fermentation active du micro-organisme, avec un milieu nutritif aqueux et un gaz contenant de l'oxygène libre, en l'absence 15 d'hydrocarbure ajouté, de sorte qu'on obtient un rendement accru en micro-organismes ne contenant sensiblement pas d'hydrocarbure de contamination, le micro-organisme ainsi obtenu ayant également une teneur accrue en protéines. La température réelle à laquelle la maturation est effectuée par le procédé suivant l'invention dépend 20 guelque peu du micro-organisme particulier cultivé et du milieu nutritif utilisé* Si le micro-organisme est cultivé de façon active à 25°C environ, la maturation doit être effectuée à une température inférieure à 25*C et de préférence à une température comprise dans une gamme allant de 10° à 20*C environ. Si le micro-organisme est 25 cultivé de façon active à 35°C environ, la maturation doit être effectuée à une température inférieure à 35°C* Si le micro-organisme est cultivé activement à 40°C environ, la maturation doit être effectuée à une température inférieure à 40°C* Il est préférable d'effectuer la maturation à une température qui est de 5 à 20°C infé-30 rieure à la température de fermentation active. Un développement approprié d'un micro-organisme exige non seulement une source de carbone aisément disponible, mais également la présence d'un milieu de nutrition aqueux. Le milieu nutritif aqueux utilisé suivant l'invention varie à un certain degré, selon le type 35 de micro-organisme utilisé et le type d'hydrocarbure. En général, le milieu nutritif est formé par un mélange de sels minéraux fournie sant des ions ammonium, nitrate ou nitrite, potassium, ferreux ou ferrique, calcium, magnésium, phosphate, sulfate, de même que des ions d*oligo-éléments renfermant du zinc, du manganèse, du cuivre 70 21855 4 2047951 et du molybdène. Etant donné que de l'eau est présente dans le mélange nutritif, la plupart des sels minéraux peuvent être incorporés au substrat selon une quantité suffisante par l'utilisation d'eau ordinaire. 11 est désirable toutefois d'ajouter des sels au 5 mélange, pour assurer leur présence selon une quantité suffisante pour le développement du micro-organisme. lie milieu nutritif est formé principalement par de l'eau, qui peut représenter de 50 à 99£ en poids au plus de mélange nutritif total. D'une façon générale on utilise de l'eau selon la quantité normalement employée lors de 10 la synthèse microbienne. Un milieu formé de sels minéraux type pour le développement de levures d'une souche de Candida tropicalis présente la composition suivante : Phosphate monopotassique acide, KHgPO^ ........... 2,0 g Sulfate de magnésium MgSO^.7H20 « 1,0 g 15 Chlorure de sodium ÎTaCl 0,2 g Chlorure de calcium CaClg.îîHjO ...• D-biotine . _ 5 ug Sulfate d'ammonium (HH^JgSO^ 0,66 g Acide borique, H^BO^ 1000 ug 20 Sulfate de cuivre CuSO^.ÇHgO ........... 80 ug Iodure de potassium, £1 200 ug Chlorure ferrique, FeCl^oôHgO ..•••••••• 400 ug Sulfate de zinc ZnSO^.THgO 300 ug Eaù distillée 1000 ml> 25 Un autre milieu type contenant des sels minéraux, pouvant être utilisé comme milieu nutritif pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, présente la composition ci-après : Phosphate diammonique, (KH^JgHPO^ 1,3 g Phosphate monopotassique acide, *V°4 1,3 g 30 Sulfate de magnésium, HgSO^.TH,,© 0,2 g Chlorure de calcium, CaClg.SHjO 0,02 g Chlorure ferrique, PeCl^.ôEgO traces Extrait de levure 1,0 g Eau distillée 1000 ml 35 Un milieu à base d'azote du commerce pour le développement de levure "Difco" qui peut être utilisé présente la composition type ci-après : 70 21855 5 2047951 Sela nutritifs Sulfate d'ammonium (Source d'azote)8, ...... 5 g Phosphate monopotassique acide 1 g Sulfate de magnésium 0,5 g 5 Chlorure de sodium 0,1 g Chlorure de calcium * 0,1 g Le milieu peut être trouvé dans le commerce sans la source d'azote ou les amino-acides» |rçifrin—ai 10 Monochlorhydrate de 1-histidine 10 mg dl-Héthionine 20 mg dl-Tryptophane .. 20 mg TM-tonrtTrçu Biotine 2 ug 15 Pantothénate de calcium 400 ug Acide folique 2 ug Inositol ............ 2000 ug Niacine 400 ug Acide para-aminobenzoïque (Difco) ......... 200 ug 20 Chlorhydrate de pyridoxine 400 ug Riboflavine 200 ug Chlorhydrate de thiamine 400 ug a Ce milieu peut être touvé dans le commerce sans source d'azote ou amino-acides. 25 Composés -Ponrai géant des oligo-éléments Acide borique 500 ug Sulfate de cuivre ............. 40 ug ïodure de potassium 100 ug Chlorure ferrique ».c® 200 ag 30 Sulfate de manganèse 460 Molybdate de sodium 200 «g Sulfate de zinc 400 ug fllïï Ai***"*» 1 litre Les micro-organismes qui peuvent être cultivés par le procédé 35 suivant l'invention sont ceux qui, normalement peuvent assimiler du carbone à partir d'hydrocarbures, ou ceux qui ont été adaptés en vue d'assimiler du carbone à partir d'hydrocarbures, y compris les moisissures, les bactéries et les levures. A titre d'exemples type de moisissures, on peut citer celles de la famille des 70 21855 6 2047951 Aspergillaceaa,dont des genres convenables sont le Pénicillium et 1'Aspergillus. A titre d'exemples spécifiques de moisissures comprises dans ces genres, on peut citer les suivantes ; Pénicillium rocqueforti, Pénicillium glaucum, Pénicillium chrysogenum, 5 Pénicillium patulum, Pénicillium notatum, Pénicillium eapansum, Aapergillus fumigatus, Aspergillus carbonarious , Aspergillus niger, Aspergillus flavua, Aspergillus terreus et Aspergillus versicolor. Les bactéries qui peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention sont celles du groupe compre-10 nant les bactéries ci-après : Pseudomonadales, Bubacteriales et Actinomycetales. Les bactéries utilisées sont de préférence celles des familles Bacillaceae et Pseudonomadaceae, les espèces préférées étant les suivantes : Bacillus megateriu», Bacillus subtilis, et Pseudo*omas aeruginosa. 15 Les levures qui peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention sont de préférence celles de la famille des Cryptococcaceae et plus spécialement de la sous-famille des Cryptococcoideae• D'autres levures pouvant être utilisées sont celles de la famille des ascosporogènes, et plus spécialement de 20 la sous-famille des Ssccharomyooi&eae» Les genres préférés de la sous-famille des Cryptococcoideae sont les suivants % ïorulopsis et Candida. Les souches préférées âe levure sont : Candida utilis, Candida rugosa, Caadida lipolytiea, Candida tropioalis et Torulop-sis colliculosa. Panai ces l©mres» une souche de Candida tropica-25 lis est préférable, en particulier la souche de Candida tropicalis CS-8-17» qui a été isolée des sols imprégnés de pétrole. La souche Candida tropicalis CS-8-17 a été déposée auprès de l'organisme des Etats Unis d*Amérique dénommé American îype Culture Collection, Rockvill©, Maryland, Etats Unis d'Amérique. Cette souche est identi-30 fiée par la référence ASCC 20021• L'avantage qui résulte de l'utilisation d'un micro-organisme isolé à partir d'un sol imprégné de pétrole réside dans le fait que ce micro-organisme est déjà adapté en vue de la métabolisation des hydrocarbures, de sorte qu'un processus initial d'adaptation aux hydrocarbures a,® sst pas nécessaire. Si le 35 micro-organisme, en particulier la levure, a été développée dans un milieu contenant des hydrates de carbonee il est habituellement nécessaire d'adapter l'organisme en vue d'tsn développement sur le carbone fourni par l'hydrocarbure. Ce processus peut exiger Un lape de temps prolongé. Même des levures isolées à partir d'un sol lm- 70 21855 7 2047951 prégné de pétrole peuvent exiger un processus d'adaptation en vue de l'adaptation de la levure à un développement sur l'hydrocarbure particulier destiné à être utilisé comme charge au cours du processus de fermentation. 5 L'hydrocarbure qui est utilisé comme source de carbone pour le micro-organisme est un hydrocarbure aliphatique saturé ou non saturé ayant jusqu'à 30 atomes de carbone ou plus par molécule. Une charge hydrocarbonée préférée est formée par une fraction dérivée des pétroles, en particulier par une fraction formée essentielle-10 ment par un mélange d'hydrocarbures à chaîne linéaire. Les hydrocarbures à chaîne linéaire peuvent être présents sous forme d'olé-fines, de paraffines ou d'un mélange contenant à la fois des oléfi-nes et des paraffines. A titre d'exemples d'hydrocarbures individuels pouvant être utilisés, on peut citer le n-pentane, le 1-pen-15 tène, le n-hexane, le 1-hexène, le n-heptane, le 1 -heptène, le n-octane, le n-déeane, le 1-décène, le n-dodécane, le 1-dodécène, le n-tétradécane, le 1-tétradécène, le n-hexadécane, le n-octadé-cane, le n-eicosane, le n-tétracosane, le n-triacontane, etc... Les hydrocarbures qui sont liquides dans les conditions de fermen-20 tation utilisées sont préférables. Bien qu'on puisse utiliser les hydrocarbures individuels, il est préférable pour des raisons d'économie, d'employer des mélanges d'hydrocarbures. Ainsi, du kérosène du gas oil, des fractions de distillation moyennes, de la cire molle, etc..» peuvent être employés. De bons résultats ont été ob-25 tenus avec des mélanges d'hydrocarbures renfermant des essences légères (Cg à Ct j), des paraffines normales (Cg à C^), des paraffines normales (G^ à C^), des alpha-oléfines (C^q à C^g)» du kérosène (Cg à Cjg) et de la cire molle (C^ à seule ou en mélange avec de l'essence légère. La quantité d'hydrocarbures utilisée est 30 celle requise pour fournir une quantité suffisante de carbone pour assurer le développement du micro-organisme pendant la période de fermentation. La totalité de l'hydrocarbure peut être ajoutée au début de la période de fermentation, mais il est préférable d'ajouter l'hydrocarbure par fractions successives au fur et à mesure de la 35 fermentation. Il est préférable d'utiliser simplement la quantité requise pour assurer le développement désiré, afin d'éviter une période de maturation prolongée à la fin de la période de fermenta-tien active normale. En général, la quantité d'hydrocarbure^^ésente de 1 à 10jC en poids environ de la masse de fermentation (moût), les 70 21855 8 2047951 quantité préférées pour obtenir un développement le plus favorable de Candida tropicalis (CS - 8 - 17) allant de 3 &, 5& en poids environ. Etant donné que les micro-organismes soumis au stade de cul-5 ture du processus sont formés de cellules vivantes, leur développement dépend, comme cela est le cas pour d'autres organismes vivants, d'un apport adéquat de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, d'azote et de traces d'autres éléments, y compris le sodium, le potassium, le magnésium et le fer* Du carbone est nécessaire pour le développe-10 ment et pour les besoins énergétiques. De l'azote est nécessaire pour la synthèse de la protéine et d'autres matières azotées* D'autres éléments sont nécessaires pour former la structure minérale de la cellule» Dans le cas présent, le carbone et l'hydrogène sont fournis par 1'hydrocarbure; l'oxygène est fourni par l'introduction 15 d'air, et l'azote est fourni par l'emploi de sels d'ammonium ou d'autres sels minéraux azotés dans le milieu nutritif» Des traces d'autres éléments nécessaires au développement du micro-organisme peuvent être fournies sous forme d'impuretés dans les sels minéraux, ou bien ces éléments peuvent être ajoutés directement en quantités 20 extrêmement faibles. Fréquemment, des quantités suffisantes d'éléments présents sous forme de traces ou oligo-éléments existent dans l'eau ordinaire (eau du robinet). Le développement du micro-organisme peut être amélioré par l'addition de stimulateurs de croissance connus, tels que des ex-25 traits de malt et des produits d'autolyae des levures. L'extrait de malt renferme une concentration élevée en hydrate de carbone, qui déclenche un développement rapide du micro-organisme » l'extrait de malt ©st obtenu par extraction de la fraction soluble dans l'eau provenant de grain ayant subi une germination, puis év^poration de 30 l'extrait à siccité à de basses températures pour conserver les constituants azotés et l'hydrate d© carbone* Les extraits de levure sont les fractions solubles dans l'eau d© la levure ayant subi une autolys©, concentrées pas5 un processus préservant les constituants therœo^iastables, contenant des amino-acides? de l'acide nicotinique 35 et de la riboflavine, conjointement à des tfaees de métaux® Les au-tolyeats d@ levure sont produits par hydrolyse enzymatiquie et conservent la totalité des amino-acides présents dans la protéine initiale» De tels autolysats renferment d@s taux élevés d'azote total, d'azote sous forme amlno, de peptones, de peptides et de 70 21855 9 2047951 vitamines B sous forme de complexes. La biotine est un constituant important des extraits de levure. Toutes ces matières en solution dans le milieu nutritif dans lequel le micro-organisme est développé sont absorbées par la cellule par diffusion à travers une membrane 5 semi-perméable, à savoir la paroi de la cellule. Des matières insolubles et éventuellement des molécules plus grosses de substance soluble sont entraînées à travers la membrane par des systèmes en-zymatiques complexes. La quantité de stijnulateur de croissance utilisée représente 0,1 à 1,0$ en poids environ (à sec) sur la base du 10 poids de la masse de fermentation (moût) une quantité préférée lors de l'emploi de Candida tropicalis (OS - 8 - 17) étant d'environ 0,1# en poids. fous les micro-organismes assurent la métabolisation de substan ces contenant du carbone pour produire le protoplasme, en vue d'as-15 surer une augmentation de taille et une reproductions L'assimilation, qui est une réaction endothermique, est le procédé selon lequel les cellules de micro-organismes sont produites à partir de substances nutritives présentes dans le milieu» tandis que la dissimulation, qui est une réaction exothermique, est la décomposition 20 ou transformation du substrat pour abandonner d© 19 énergie ©n vue d'une utilisation par l'organisme. La somme de Le pH optimum du milieu nutritif aqueux dépend à un certain degré de la nature du substrat et du micro-organisme particulier cultivé* Le pH est habituellement compris dans me gamme allant de 70 21855 10 2047951 1,5 à 8 environ. Dans le cas de substrats formés par des sels minéraux, le pH optimum pour la plupart des cultures de levure ®st un pH voisin de 7. Quand on utilise un substrat à base d'azote pour la .levures le développement optimum d'une levure de la souche Candida 5 tropicalis est obtenu à un pH qui va de 3 à 5 environ, un pH de 3 environ étant préférable. Bien qu© las gammes optimales de pH pour les moisissures soient également comprises entre 3 et 5 environ, les bactéries exigent habituellement un pH plus élevé, de l'ordre de 6 à 8 environ® Afin de maintenir le pH à tout niveau désiré, on peut 10 ajouter au milieu nutritif aqueux, de façon continue ou par petites fractions séparées, n'importe quelle natière alcaline convenable, comme de la seude,de la potasse, du phosphate disodique acide, de l'hydroxyde d'ammonium et d© l'ammoniac. La température optimum pour le développement du micro-organisme 15 dépend de l'organisme particulier utilisé» mais elle est habituellement comprise dans un© gamme allant d® 25 à 40®C environ. Quead on utilis© un© souche de Oandida tropicalis » la gamme de tssapératures préféré© est d© 25° à 35®0 envi^os.» Oqsus© indiqué pr Jeéd©sœ»9at, l'oxygène constitue l'un â©g élé-20 mente essentiels nécessaires pour favoriser le développasse -tu micro=-organisaeo Bi@a qu'on puis©© utiliser de l'osygène purs il ©st préférable g p©ur fies rmiasas éewaoaiifa©®, de fournir 1® assène sous fana© d'air» Afin d'assurés? vst dévsloapaœsnt oritlwm. du eicro= organisme, l'air doit être foœm pas? pulvérisation fia© à travers 25 le substrat9 tout en assurant une agitatioa à une vitesse suffisante pous? former un tourbillon-dans 1® liquida. Selon le profil ma la forma do l'appareil d® fermentation, ©a peut utiliser diverses têtes fie pulvérisation d'air, y compris des tête® à un seul orifice, du type en fosse d© d@mi=oous,«n0 ou ©n forai© d© couronne complète, de® 30 orifices étant prévus pour la sorti© d'air directement vers le dessus ©t (on) vers 1s dessous, ©t du typ® percolateur en verra fritté avec divers types d'hélices ou d'impulaours pour déplacer l'air vers 1® haut. Lorsqu'elles sont utilisées, les héli-ses peuvent tourner à des vitesses allant d® 200 à 1000 tours/minute ou plus, 35 la vitesse particulière étant choisi® pour provoquer un tourbillon dans le liquide. Quel que soit le type d® tête de pulvérisation utilisé, l'opération doit être telle qu'on évite une formation excessive de mousse, étant donné que cette formation de mousse tend à enrober le micro-organisme et à l'isoler d© la source de produit BA0 ORIGINAL 70 21855 ii 2047951 nutritif soluble nécessaire à son développement. Bien que la quantité d'air utilisée dépende à tin certain degré de la taille et de la forme de l'appareil de fermentation» des résultats satisfaisants sont obtenus avec des flacons de fermentation d'une capacité de 14 5 litres renfermant 7 litres de moût, en utilisant de l'air stérile selon des débits al1ant de 2 à 10 litres par minute. D'une façon particulière, les Micro-organismes se développent pendant la période de fermentation selon un diagramme de développement caractéristique qui peut être exprimé comme suit : 10 1. Phase stationnaire initiale - au cours de cette phase, le nombre des micro-organismes demeure constant. 2. Phase de retard. Pendant cette période, la vitesse de multiplication augmente avec le temps. 3. Phase de développement logarithmique* La vitesse de multi-15 plication demeure constante; le temps de génération ou de formation est le même pendant toute cette période. 4. Phase de développement négative. Pendant cette phase, la vitesse de multiplication diminue et le temps de génération ou de formation augmente. Les organismes continuent d*augmenter en nombre 20 mais à une vitesse plus faible que pendant la phase logarithmique. 5. Phase stationnaire maximum. Le nombre des organismes vivants demeure constant, c'est-à-dire que la mortalité est égale à la vitesse de reproduction. 6. Phase de mortalité accélérée. Le nombre des micro-organis-25 mes diminue avec une rapidité croissante. La mortalité moyenne augmente jusqu'à un maximum. 7. Phase de mortalité logarithmique. Au cours de cette période, le taux de mortalité est constante - Selon l'invention, la fermentation active est interrompue à 50 la fin de la phase de développement logarithmique et l'ensemble est soumis à un traitement de maturation à une température inférieure à celle qui entretient une fermentation active.Pendant le traitement de maturation, 1'hydrocarbure est fortement réduit ou supprimé, tandis que le rendement en produit est accru, la teneur en protéines 35 est augmentée et la quantité de cendres qui est normalement formée si la fermentation n'est pas interrompue à ce moment est réduite. La maturation décrite ci-avant est effectuée à une température inférieure à la température à laquelle une fermentation active est assurée. 40 A la fin de la pîmse d© maturation au cours du procédé suivaat 70 21855 12 2047951 l'invention, le produit est séparé du milieu nutritif par centrifu-gation, puis lavé de une à trois fois avec de l'eau ordinaire ou eau du robinet et finalement séché dans des conditions suffisamment douces pour éviter une autolyse, mais dans des conditions suffisam-5 ment sévères toutefois pour assurer la récupération d'un micro-organisme non viable ne contenant pas plus de 10$ environ d'humidité et habituellement de 3 à 5# environ d'humidité. Dans le cas de bactéries, la températur^de séchage peut atteindre 100°C. La température de séchage utilisable pour la plupart des levures pour assu-10 rer la récupération de cellules non viables dans un four est comprise dans une gamme allant de 50 à 75°C environ. Si l'on assure un séchage par pulvérisation, la température de l'appareil de séchage peut Ôtre de l'ordre de 150°C environ sans effet défavorable sur la qualité de la levure. Lors du séchage d'une souche de Candida 15 tropicalis, des cellules non viables ont été récupérées en utilisant une température de séchage de 608C dans un four. Afin d'illustrer les résultats perfectionnés obtenus par le procédé suivant l'invention, des exemples comparatifs sont donnés ci-aprèsî la maturation décrite dans l'exemple N°1 est effectuée à 20 une température inférieure à la température de fermentation active, tandis que la maturation est effectuée selon l'exemple Iî°2 à la température de fermentation active. Dans les exemples comparatifs, on a utilisé une souche Candida tropicalis de levure, c'est-à-dire la souche Candida tropicalis CS-8-17. Cette levure a été isolée 25 par un processus de culture par enrichissement à partir d'un sol imprégné de pétrole au voisinage de puits de pétrole en exploitation 9 en Pennsylvanie. Le micro-organisme a été caractérisé et identifié selon la classification indiquée dans l'ouvrage de langue anglaise intitulé "The Yeasts" de MM. J. Lodder et N. J.W. Kreger-30 Vas. Slg» Horth Holland Publishing Co, Amsterdam, 1952, Interscience Eublishers, Inc. New York. On a constaté que le micro-organisme était identique, en ce qui concerne toutes ses caractéristiques physiologiques à l'organisme Candida tropicalis ATCC 14-10 obtenu de 1'American Type Culture Collection, Washington D.C., Etats Unis 35 d'Amérique. Du point de vue morphologique, le micro-organisme isolé suivant l'invention est similaire au Candida tropicalis ATCC 1410 et il en diffère principalement par la taille des cellules. Les cellules des souches de Candida tropicalis CS-8-17 sont plus petites que les cellules de la culture type. L'examen des colonies de la souche 70 21855 13 2047951 Candida tropicalis CS-8-17 isolées selon l'invention sont grosses, blanches, opaques, relevées et lisses. Bien que la eouche de Candida tropicalis CS-8-17 isolée selon l'invention semble être physio-logiquement la môme que Candida tropicalis ATCG 1410 s? la souche 5 Candida tropicalis obtenue de 1'American Type Culture Collection n'a pas pu être adaptée aisément à un développement entretenu dans un milieu nutritif à base de sels minéraux contenant des paraffines normales en C^q à C^ comme seule source de cardon® o ïl semble que la souche Candida tropicalis (ATCC 1410) puisse être acclimatisée 10 en vue de l'assimilation des hydrocarbures si la technique d'alimen tation est progressive et s'étend sur une grande période de temps. A cet égard, la théorie est basée sur cette constatation que la flore microbienne normale du sol s'acclimate à l'utilisation des hydrocarbures du fait du long temps de séjour dans le sol saturé de 15 pétrole. L'exemple ïï°1 illustre le procédé suivant l'invention,. On comprendra que cet exemple IT°1 n'est donné qu'à titre non limitatif0 L'exemple N°2 est donné à titre comparatif et ne correspond pas au procédé suivant l'invention. 20 EXEMPLE N° 1 On introduit 7 litres d'un milieu nutritif minéral aqueux dan® un flacon de fermentation en verre Pyrex d9uae capacité de 1.4 litros équipé d'une tête en acier inoxydable. Cette tête présente des orifices pour l'addition des substances nutritives ©t pour le prélèvg= 25 ment d'échantillons, un arbre d'agitateur,, un conduit d°injection d'air, des déflecteurs et us passage pour le thermomètre„ Le milieu nutritif introduit dans l'appareil de ferm©atation présent® la com-= position suivante : Phosphate monopotassiqu© acide, EHgPQ^ oooo-eoooo 2„0 g 30 Sulfate de magnésium, 23gSO^®7HgO «80o 0 g Chlorure de sodium, HkCl • •«••©«•oo».. e0o0ao 1000 ug Sulfate de cuivre, CuSO^.©oooooo©©ooqooooo 80 ug Iodure de potassium, El 200 ug Chlorure ferrique, FeC1^.6H,,0 oa 400 Sulfate de zinc, ZnSO^. THgQ 800 40 ug ug Eau distillée 1000 ml 70 21855 14 2047951 l'appareil de fermentation est placé dans im bain d'eau qui est ajusté de façon à maintenir le milieu de fermentation à 29 - 1°£ L'appareil de fermentation est équipé d'hélices ou impulseras reliés à un mécanisme d8entraînement capable d'assurer la rotation de ces 5 hélices à des vitesses allant jusqu'à tCQG tours-minute. L'air qui est introduit dans l'appareil de fermentation par la tête d'injection arrive à travers un tube formant filtre en acier inoxydable garai de laine de verre Pyrex pour éliminer les particules de poussière, de même qu© les miero-organigiass qui se trouvent dans l'air® 10 L'appareil de fermentation, qui renferme les 7 litres d® mi lieu nutritif, est ensuite îmoeulé avec 25 g de levure humide (humidité 73$) d® la souche Candida tropicalis CS-8-17» la densité cellulaire de la levure dans 1°appareil de fermentation est ainsi d'environ 6,75 g d® matière sèeh© peur 7 litres» soit enviroa 1 g 15 par litrs «, La souche de Canâida tropicalis (GS-8-17) utilisée âme cet exempl® est maintenue à titr© d© culture -de base dans me eonditi©a immobile à 25°C sur ea milieu formé par 97^ en volt®» â'tm milieu à "base d'azote du eoaaaeree (Difc©) et 3fo @n volume d'un mélaage 20 d'hydrocarbures renf©rmaat 93s7f« ea poids de paraffines normales C9 à C13, la districutioa des paraffines normales éteat g©&siblem@n» la suivante s*= Paraffines aoggj'l®a % en Poids 25 0g traees °-j0 6g8 ^ 30 '12 32 £ 35 Û& ©ffeetu© la f®mQîatatios> active psadaat 15 h©or®s à 23®C avee m "débit d'aération d*©aviron 5 Xîtess j-ar mimât© et wm vi-tes©® tes agitateurs &@ 500 à 900 tours/Elsmt®® Peadaat o&tto période d® 15 heures, on ajoute au.total 88,7 si du aélaag® ds parafa, fisaes &oraal©s «sa. Cg à indiqué .ei=©V2ïat» par fractions d!envi= roa 6 ml, à des intervalles d8ua@ hmirSo gmâaut les 3 prsaières heures d@ fermentation aetiv®, @a a ajouté an total 4,3 ml d'une . solution aquouse d© sulfate d9asmoriius. e©2it@Qaat 47,88 d'azote par al, par fractions de 1,5 aal ©aviron. A des intervalles d'une heure, pendant le a 12 îieurss suivantes de fermentation activa, on a B*D ORIGfMAL 70 21855 15 2047951 ajouté au total 55 ml d'hydrosyde d'anmonlum contenant environ 50 mg d'azote par ml, par fractions d'environ 4»5 ml» La quantité totale d'azote ajoutée à l'appareil de fermentation pendant la période de 15 heures de fermentation active est d'environ 3 g» le pH de la 5 masse de fermentation est maintenu à 3 environ pendant la fermentation active par l'addition d'hydroxyde d'ammonium. A la fin de la période de fermentation active de 15 heures, la densité cellulaire est d'environ 7,2 g de matière sèche par litre, la teneur en protéines étant d'environ 40,6# en poids, la teneur en cendres d'environ 10 12,7# en poids, et la teneur en hydrocarbures résiduels d'environ 0,03 ml pour 100 ml de moût ou de bouillon de culture» A la fin de la période de fermentation active, la masse de fer mentation (moût) est soumise sans être enlevée de l'appareil de fermentation à une période de maturation de 12 heures pendant la-15 quelle on n'ajoute ni hydrocarbure, ni azote.l'hydrocarbure qui reste dans le moût au début de la période de maturation représente environ 0,03 ml d'hydrocarbure pour 100 litres de moût. Pendant la période de maturation, la température du moût est réduite au-dessous de celle qui est capable d'entretenir une fermentation active, c'est-20 à-dire au-dessous de 25°0 environ. Dans cet exemple, la température pendant la maturation est maintenue à 10°C environ, avec un débit d'aération d'environ 0,5 litre par minute et une vitesse de l'hélice agitatrice d'environ 450 tours/minute pour contrôler la formation de mousse. Un débit d'aération réduit est utilisé pour éviter la 25 formation d'une mousse excessive. Une vitesse d'hélice réduite est utilisée pour éviter une désintégration possible de la matière cellulaire. A la fin de la période de maturation de 12 heures, seules des traces d'hydrocarbures demeurent dans le moût, c'est-à-dire que la quantité est inférieure à 0,01 ml d'hydrocarbure pour 100 nul de 30 moût. Les cellules de levure sont récoltées par eentrifugation du mpût pour recueillir une pâte de levure. Cette pâte de levure est lavée avec de l'eau et soumise à une eentrifugation(habituellement environ 3 fois) jusqu'à ce qu'on obtienne la pureté désirée. On sèche ensuite les cellules de levure mouillée à une température infé-35 rieure à 100°C environ, par exemple à 60°C environ, pour conserver la oualité du produit. La teneur en humidité du produit séché (Candida tropicalis CS-8-17) est inférieure à 10# en poià» du produit, le rendement en produit est de 7,7 g par litre, la teneur en protéines du produit est égale à 43,8# en poids et la teneur en cendres est 70 21855 16 2047951 égale à 13,8# en poids. EXEMPLE H° 2 (ki procède comme décrit dans l'exemple N°1, mais on effectue la maturation pendant 12 heures à une température de fermentation 5 active de 29°C - 1°Ç,avec une vitesse d'agitation égale à 800 tours/minute pour contrôler la formation de mousse. Le rendement en produit après la fermentation active et la période de maturation est égal à 7,1 g par litre. Ainsi, on ne note pas d'augmentation de rendement quand la maturation est effectuée à une température 10 de fermentation active. La teneur en protéines du produit après la fermentation active est égale à 4?,0$; après la maturation, la teneur en protéines du produit est égale à 43,3ce qui représente une augmentation de 2,3#. La teneur en cendres du produit après la fermentation active est égale à 12,7#î après la maturation, la te— 15 neur en cendres du produit est égale à 15#» ce qui représente une augmentation de 2,3#* Les conditions de fermentation et de maturation correspondant aux exemples et 2 et les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après î 20 TABLEAU TgYBiMPT.'fl 1 2 Fermentation active Temps, heures 15 15 25 Température, °G 29^1 29^1 Aération, 1/m 5 5 Agitation, tours/minute 500-900 500-900 Caractéristiques du produit Rendement (à sec), g/1 7,2 7,1 30 Protéines, # en poids 40,6 41,0 Cendres, $ en poids 12,7 12,7 Hydrocarbure résiduel ml/100 ml de moût 0,03 0,04 Période de maturation Temps, heures 12 12 35 Température,°0 10 29-1 Aération, 1/m 0,5 0,5 Agitation, tours/minute 450 800 70 21855 17 2047951 TABLEAU (Suite) 1 2 Caractéristiques du produit 5 Rendement (à sec), g/1 7,7 7,1 Protéines, # en poids 43,8 43,3 Cendres, # en poids 13,8 15.0 Hydrocarbure résiduel, ml/100 ml de moût traces 0P02 Effet de la maturation 10 Augmentation de rendement, g/1 0,5 0 Augmentation de la teneur en protéines, # en poids 3,2 2,3 Augmentation de la teneur en cendre? # en poids 1,1 2,3 Les données qui figurent dans le tableau montrent que la matu-15 ration effectuée à une température inférieure à la température de fermentation active fournit un rendement accru, une augmentation de la teneur en protéines et une réduction de la quantité de cendres formée par rapport aux résultats obtenus lorsque la maturation est effectuée à la température de fermentation active® Quand la matura-20 tion est effectuée à 29°-1°C, le rendement en produit est le même, c'est-à-dire 7,1 g par litre, que celui obtenu à la fin d® la période de fermentation active. Bien que la maturation à 29®-1®0 donne un produit ayant une teneur accrue en protéines „ 1* augmentation n'est pas aussi importante que celle obtenue quaad la matura-25 tion est effectuée à une température inférieure à la température de fermentation active. On remarquera ®n outre que la Maturation à 29«-1 ®C fournit un produit ayant us® toaeœ? ®s e@aàre@ plus élevée et que l'augmentation de la teneur en eesteas plm© dix double de celle obtenue quand la maturation est effectué© à H0®€fo 30 La quantité de Candida tropicalis (CS-=8-17) obt®me au cous=s du procédé suivant l'invention peut varier légèrement &°ua@ fermentation à une autre. La levure produite va normalement renfermer environ 10# en poids d'humidité et 90$ en poids de matière sèche. Des analyses types de la matière sèehe correspondant à la levure produi-35 te donnent les résultats ci-après 70 21855 18 2047951 Candida tropicalis (CS-8-17) 10 i» en poids Carbone 48,2 Hydrogène 7,1 Azote total 7,0 Protéines 43,8 Cendres totales 13,8 Phosphore 4,2 Graisse 3,4 Fibres 3*8 Des analyses types servant à déterminer la distribution des amino-acides dans la fraction protéines de Candida tropicalis CS-8-17 dorment les résultats ci-après » Amino-acides Caadida tropicalis (CS-8-17) 15 20 25 Lysine Histidine Arginine Acide aspartique SJaréonine Sérine Acide glutamique Preline ŒLyoine Alanine Semi-cystine VaXlne Méthionine Isoleucine Leucine Syxoeine Biénylalanin© Ehryptophane Total 100,00 35 Des modifications peuvent être apportées aux modes de mise en oeuvre décrits, dans le domaine des équivalences techniques, sans s'écarter de 1*invention. 30 70 21855 19 2047951 REVENDICATIONS 1 •- Procédé consistant à cultiver un micro-organisme consommant des hydrocarbures à une température de fermentation active en présence d'un milieu nutritif aqueux, d'un hydrocarbure et d'un gaz 5 contenant de l'oxygène libre, caractérisé en ce qu'on récupère un micro-organisme contenant une petite quantité d'hydrocarbure à titre d'agent de contamination, on amène le micro-organisme contaminé par l'hydrocarbure en contact, à une température inférieure à celle qui entretient une fermentation active du micro-organisme, avec un 10 milieu aqueux et un gaz contenant de l'oxygène libre, en l'absence d'hydrocarbure ajouté, et on récupère un rendement accru en microorganisme ne contenant sensiblement pas d'hydrocarbure de contamination, le micro-organisme ainsi récupéré ayant une teneur en protéines plus élevée que celle du micro-organisme contaminé par l'hy-15 drocarbure. 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est une bactérie. 3.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ce micro-organisme est une levure. 20 4.- Procédé suivant la revendication 3» caractérisé en ce que la levure consommant l'hydrocarbure est cultivée à une température de fermentation active de 25° à 40°C environ, la levure contaminée par l'hydrocarbure étant amenée en contact à une température inférieure de 5 à 20°C à la température de fermentation active avec le 25 milieu nutritif aqueux et le gaz contenant de l'oxygène libre, en l'absence d'hydrocarbure ajouté. 5.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la levure contaminée par l'hydrocarbure est amenée en contact avec le milieu nutritif aqueux et le gaz contenant de l'oxygène libre, 30 en l'absence d'hydrocarbure ajouté, à une température de 10° à 2O°0 environ. 6.- Procédé suivant la revendication 4 ou 5» caractérisé en ce que la levure est de la famille Cryptococcaceae. 7.- procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que 35 la levure est de la sous-famille Cryptococcoideae. 8.- Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la levure est du genre Candida. 9.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que la levure est de la souche Candida tropicalis. 70 21855 20 2047951 11.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est une fraction liquide des pétroles formée essentiellement par un mélange d'hydrocarbures à chaîne linéaire* 5 12.- Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la fraction liquide des pétroles est un mélange de paraffines normales en Cg à C^. 13.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le pH du milieu nutritif aqueux est oom-10 pris dans une gamme allant de 1,5 à 8 environ. 14»- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le gaz oontenant de l'oxygène est de l'air. 15.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la levure consommant des hydrocarbures de la souche Candida tropi-1 5 calis est cultivée à une température d'environ 28° à 30°C en présence d'un milieu nutritif aqueux dont le pH est maintenu dans une gamme allant de 3 à 5 environ, la charge hydrocarbonée étant constituée par un mélange de paraffines normales en Cg à C^ et d'air, on recueille une levure de la souche Candida tropicalis contenant 20 la petite quantité de charge hydrocarbonée à titre d'agent de contamination, on amène la levure contaminée par l'hydrocarbure en contact, à une température de 10° à 20°C environ, avec le milieu nutritif aqueux dont le pH est maintenu dans une gamme allant de 3 à 5 environ et avec de l'air, en l'absence de charge hydrocarbonée 25 additionnelle, et on recueille tin rendement accru en Candida tropicalis ne contenant sensiblement pas d'hydrocarbure de contamination, la levure Candida tropicalis ainsi recueillie ayant une teneur en protéines plus élevée que celle de la levure contaminée par l'hydrocarbure. 30 16.- Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que le pH du milieu nutritif aqueux est maintenu dans les deux cas à 3 environ.