La présente invention concerne un procédé de producti d'un vaccin vivant atténué contre les oreillons,- ce vaccin étant non seulement nouveau, mais aussi plus efficace que ceux qui sont connus jusqu'à présent. 5 les oreillons consistent en une maladie infectieuse, qui est due à un virus spécifique et qui se déclare après une période d'incubation d'environ 3 semaines. Chez les enfant les symptômes principaux se traduisent par de la fièvre et l'inflammation de la glande parotide, et la maladie a d'habi-10 tude une évolution bénigne, avec un pronostic généralement favorable. Toutefois, en cas d'épidémies, elle se propage: rapidement chez des sujets qui vivent en groupes, par exemple dans les écoles et les garderies d'enfants, obligeant parfois à interrompre les cours pendant un certain temps. On rencontre 15 parfois des cas de méningite, de pancréatite et d'orchite, entre autres complieations.la grande majorité des cas de méningite consécutive aux oreillons se termine par un rétablissement complet au bout d'un mois, mais 1*électroencéphalogramme montre que des anomalies subsistent chez 20 certains patients, par exemple un retardement mental et des modifications du caractère, même un an après un rétablissement apparent. Chez les adultes, la maladie s'accompagne très souvent d'orchite, entraînant la stérilité. Par suite de ces dangers, on a recherché des mesures permettant de com-25 battre la maladie. la prophylaxie est naturellement un mode désirable d'action et on a étudié la possibilité d'une vaccination. Il est connu que les passages prolongés de virus des oreillons dans la cavité amniotique ou allantoïde 30 d'oeufs de poule fécondés, ou dans une culture de tissu de cellules d'embryon de poulet ou de cellules de rein de cobayeTproduit un vaccin vivant contenant le virus atténué des oreillons, dont la virulence est réduite, bien que ce vaccin reste capable d'immuniser l'homme contre la maladie, 35 Toutefois, ces vaccins connus ne sont pas toujours satisfaisants du point de vue de l'activité immunisante vis-à-vis des sujets recevant le vaccin. 72 15419 2 2134699 On a découvert le fait surprenant, et ceci fait l'objet de la présente invention, que si l'on soumet le virus sur des oreillons à des passages / une culture de cellules primaires de rein de boeuf, le virus dès oreillons peut être rapide-5 ment atténué au cours des passages. En effectuant l'atténuation du virus des oreillons dans cette culture spécifique de tissu, on a finalement réussi à obtenir un vaccin contenant le virus atténué des oreillons, ce vaccin étant doué d'une forte activité immunisante, sans produire de réactions se-10 condaires indésirables chez les sujets recevant ce vaccin. le principal but de la présente invention est d'offrir un procédé d'atténuation du virus des oreillons, conformément auquel une souche virulente de virus des oreillons peut être atténuée bien plus rapidement, comparativement 15 aux procédés connus d'atténuation du virus des oreillons. l'invention concerne aussi un procédé de production d'une forme nouvelle et efficace d'un vaccin vivant contenant le virus atténué des oreillons, la mise en oeuvre de ce procédé étant pratique et peu coûteuse. 20 l'invention concerne aussi un nouveau vaccin vivant renfermant le virus atténué des oreillons, ce vaccin exerçant un effet immunisant prononcé sans apparition de réactions secondaires indésirables après la vaccination. l'invention parvient aux buts qu'elle se propose 25 d'atteindre en soumettant le virus des oreillons à des passages dans une culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf, jusqu'à ce qu'une atténuation suffisante ait été obtenue. Conformément au procédé de l'invention^ on peut 30 utiliser toute souche virulente de virus des oreillons comme virus d'origine, A titre d'exemples de souches de virus des oreillons, on peut Indiquer la souche Torii, la souche Toyukura, la souche N° 44010, la souche N° 43080, la souche 43009, la souche de Bnders, etc. Parmi les nombreuses 35 souches de virus des oreillons utilisées dans la présente invention, la souche Torii de ce virus a été ■ utilisée 72 15419 2134699 de façon particulièrement avantageuse dans le procédé de l'invention pour produire le vaccin renfermant le virus atténué, La souche Torii du virus des oreillons a été isolée, au Japon, d'un prélèvement effectué dans la gorge d'un enfant 5 souffrant des oreillons, et sa sous-culture a été déposée dans la collection "American Type Culture Collection", Mary-land, Etats-Unis d'Amérique, où elle a été enregistrée sous le numéro ATCC VR-638. Les cellules primaires de rein de "boéuf que l'on 10 peut utiliser dans le procédé de la présente invention peuvent être préparées d'une manière connue. Le virus des oreillons est inoculé dans une culture de tissu qui contient ces cellules ainsi qu'un milieu convenable pour la culture du tissu, et la culture est effectuée au repos ou sous agitation 15 pendant environ 5 à environ 12 jours (habituellement environ taie semaine). La culture est conduite de façon pratique à une température d'environ 28 à environ 36°C, notamment à une température d'environ 29 à environ 32°C. Le liquide viral ainsi obtenu est ensuite inoculé dans une culture fraîche 20 de tissu contenant lesdites cellules en vue du passage subséquent, tel quel ou après une dilution convenable. A mesure qu'on répète ce passage, l'atténuation du virus des oreillons progresse rapidement. Parmi les milieux de culture de tissu que l'on peut . 25 utiliser, on mentionne par exemple la solution équilibrée de sels de Hanks, la solution de Earle, la solution de Gey, le milieu de culture de tissu ÎT° 199, le milieu de Eagle, etc. Ces milieux peuvent être additionnés, le cas échéant, d'ingrédients convenables, par exemple un hydrolysat de 30 lactalbumine, du sérum inactivé de veau, etc. De plus, on peut ajouter au milieu un ou plusieurs antibiotiques tels que des pénicillines (par exemple pénicilline G, pénicilline N, pénicilline 0 et pénicilline Y, etc.), la streptomycine, la dihydrostreptomycine, la néomycine ou la 35 kanamycine, en sorte que la culture peut être protégée de la prolifération de micro-organismes parasites par contamination accidentelle, comme cela est connu dans le cas de la cultu des virus. 72 15419 2134699 Le viras des oreillons est ainsi soumis à plusieurs passages dans une culture de tissu, contenant des cellules primaires de rein de boeuf, jusqu'à ce que le virus soit suffisamment atténué. Le virus des oreillons peut être 5 atténué bien plus rapidement par des passages dans la culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf comparativement aux procédés connus d'atténuation du virus des oreillons (voir la partie expérimentale décrite en détail ci-après). Cette atténuation du virus des oreillons peut encore 10 être facilitée par l'application de la dilution limite au cours des passages dans la culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf. Dans l'application de la dilution limite, le liquide de culture du passage précédent est dilué en série d'un facteur de dilution choisi 15 de 2 à 10.Chacun des liquides dilués est inoculé dans une culture fraîche de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf et cultivées de manière à déterminer la dilution maximale de prolifération du virus dans ce passage. Le liquide de culture obtenu à partir du liquide d'ensemen-20 cément de dilution maximale est utilisé comme virus d'ensemencement pour le passage suivant. La dilution limite peut être appliquée à un ou plusieurs passages quelconques de la série de passage^dans la culture de tissu contenant les cellules primaires de rein. 25 La série de passages/du virus des oreillons dans la culture de tissu de cellules rénales peut éventuellement être conduite avec intercalation dans la série d'un ou plusieurs passages dans une culture de tissu d'autres cellules animales. Ces autres cellules d'animal peuvent être par exemple 30 des cellules d'embryon de poulet, des cellules rénales primaires de porc, des cellules d'embryon de caille, etc. Il est particulièrement avantageux d'intercaler un total d'un à cinq passages sur des cellules d'embryon de poulet dans la série principale de passage sur des cellules rénales 35 primaires de boeuf. Dans le procédé de l'invention, le§£>assage§&u virus des oreillons sont poursuivis jusqu'à ce qu'on ait la certitude que le virus a été suffisamment atténué, certitude 5 72 15419 2134699 que l'on acquiert par inoculation à un animal ou un être humain séronégatif, sensible au virus des oreillons. Bien que le nombre des passages nécessaires pour obtenir une atténuation suffisante varie avec la virulence du virus 5 des oreillons utilisé initialement, avec les conditions de passage, etc., il est généralement recommandable d'effectuer au moins trois passages dans la culture de tissu contenant des cellules rénales primaires de boeuf ; toutefois, un nombre de passages supérieur à trente n'est généralement pas 10 recommandable^ parce qu'on court ainsi le risque.d'une suratténuation du virus. Par conséquent, le virus atténué des oreillons est utilisé comme virus d'ensemencement pour la production du vaccin conforme à l'invention, contenant le virus atténué. 15 Le virus d'ensemencement est inoculé et cultivé dans une culture de tissu convenable pour la production du vaccin, par exemple une culture contenant des cellules d'embryon de poulet, des cellules rénales primaires de boeuf, des cellules rénales primaires de singe vert d'Afrique, des 20 cellules rénales primaires de porc, des cellules rénales primaires de cobaye, etc., d'une manière connue en soi. Il est recommandable de faire proliférer le virus dans un milieu de culture ne contenant pas de substances capables de se comporter comme un antigène, lorsque le vaccin résul-25 tant est inoculé dans un corps humain. Le cas échéant, le virus d'ensemencement peut être soumis à plusieurs passages dans la culture de tissu pour la production du vaccin, de manière à accroître le titre en virus du vaccin. On sépare du liquide de culture ainsi obtenu, les 30 matières solides telles que les cellules, les débris de cellule etc., par exemple par filtration ou centrifugation, et on peut utiliser le filtrat ou les liqueurs surnageantes comme produit de la présente invention, tels quels ou dilués avec un diluant convenable tel qu'une solution physiologique de 35 sel ou de l'eau distillée, selon son titre en virus. Bien que le vaccin contenant le virus atténué des oreillons puisse être utilisé tel quel immédiatement après sa production, on peut le conserver selon pratique ola-s-v- 72 15419 6 2134699 de conservation des vaccins vivants, sous une forme con- . gelée avec ou sans addition d'un ou plusieurs agents stabilisants tels que du saccharose, du lactose, des glutamates des phosphates, etc. A titre de variante, on peut le lyophi-5 liser avec ou sans addition d'un ou plusieurs agents stabi- . lisants tels que de l'albumine de sérum humain, de la gélatine, etc., en vue de sa conservation, et le produit lyophilisé peut être dissous au moment de la conservation,.-avec un diluant convenable tel qu'une solution physiologique ■10 de sel ou de l'eau distillée stérilisée. Pour effectuer une vaccination satisfaisante, il est nécessaire d'inoculer par personne un titre en virus 2 0 des oreillons, d'au moins 10 ' DICT^ (dose infectieuse en culture de tissu de 50 $), de préférence par voie sous-15 cutanée et en une seule fois. Une dose particulièrement avantageuse varie d'environ 10^'^ à environ 10^'^ DICT^q par personne. Une dose supérieure à la dose indiquée ne présente aucun danger de réaction^èecondaires indésirables, à cause de la grande sûreté du vaccin de l'invention, mais . 20 il est inutile d'inoculer une dose aussi forte, parce qu'on ne doit pas en attendre d'augmentation particulière quelconque de l'effet désiré de vaccination. Pour l'inoculation sous-cutanée, une dose du titre nécessaire en virus peut être contenue de façon pratique 25 dans un volume d'environ 0,1 à environ 1,0 ml, notamment de 0,25 à 0,5 ml d'une composition aqueuse. Ainsi, le vaccin de la présente invention est ajusté de façon pratique, au moment de l'utilisation, de manière que son titre en virus atténué des oreillons soit au moins égal à environ 30 105>° DICTp-^/ml, de préférence d'environ 10^'^ à environ 10 DICT^/ml, en présence d'un véhicule acceptable du point de vue physiologique tel qu'une solution physiologique de sel ou de l'eau distillée. 72 15419 7 2134699 On observe chez des sujets auxquels on a inoculé ce vaccin contenant le virus atténué des oreillons, une élévation remarquable du taux des anticorps dans lé sérum, qui les protège de l'infection par le virus des oreillons, cependant que l'on 5 n'observe aucune réaction secondaire indésirable telle que la fièvre et une lymphadénopathie. Ainsi, le nouveau virus des oreillons atténué conformément à la présente invention se caractérise par sa forte activité immunisante de même que par sa grande sûreté. 10 ' Ii'efficacité et la sûreté du vaccin contenant le virus atténué des oreillons selon l'invention sont illustrées en détail par les exemples et l'essai décrits ci-après. les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif. Dans les exemples qui suivent, les pourcentages sont 15 exprimés en volume/volume, sauf indication contraire, les cellules d'embryon de poulet que l'on utilise doivent donner une réaction négative dans le test C0FA1 (voir P.S. Sarma et Collaborateurs, "Virology", 2^, pages 313 et suivantes, (1964)). Exemple 1 20 On prélève dans des conditions aseptiques les-reins de boeufs dont l'état de santé est normal. les reins de boeufs sont lavés avec la solution équilibrée de sels de Hanks (l) puis hachés, le tissu haché est mis en suspension dans environ 50 fois son volume d'une solution de Hanks additionnée de 0,25 % de 25 trypsine, et on fait digérer la suspension sous agitation, les cellules libres résultantes sont recueillies par centrifugation "à 1000 tours/minute pendant 5 minutes, et diluées avec une quantité suffisante de la solution de lactalbumine de Hanks (2) contenant 10 fo de sérum de veau inactivé, pour que la suspension 15 30 résultante de cellules contienne environ 5 x 10 cellules par ml. On fait incuber la suspension au repos dans des flacons de 50 ml de capacité, à 36°C. Au bout de 7 jours, lorsque les cellules ont proliféré sur la paroi intérieure des flacons, on les lave trois fois avec le milieu de culture de tissu ÎT° 199 (3), pour 35 obtenir une culture de cellules primaires de reins de boeufs. On inocule 5 ml de liquide, dilué 100 fois, contenant la souche Torii du virus des oreillons après deux passages dans 72 15419 8 2134699 la cavité amniotique d'oeufs fécondés de. poule, dans la culture de cellules de rein de boeuf, et on laisse reposer le mélange à 37 °C pendant 60 minutes. On jette le liquide de culture et on lave les cellules cinq fois avec le milieu de culture de tissu 5 N° 199. Ensuite, on ajoute au flacon 5 ml du milieu de culture du tissu H0 199 contenant 2 i° de sérum de veau inactivé, et on effectue l'incubation au repos à 32°C pendant 7 jours. On „ . pour séparer centrifuge la culture résultante a 3000 tr/mn .pendant 5 minutes/ une liqueur surnageante qu'on utilise ensuite comme virus.d'en- 10 semencement dans le prochain passage, après dilution à 100 fois son volume avec le milieu de culture de tissu ET0 1 99- On effectue ainsi 15 passages sur la culture de tissu de rein de-boeuf, et on centrifuge le produit de la quinzième culture pour obtenir un virus atténué d'ensemencent nt, destiné à 15 produire un vaccin contenant le virus des oreillons. On prélève dans des conditions aseptiques des embryons de poulet d'oeufs au dixième jour d'incubation et, après décapitation et éviscération, on les traite, de la.même manière que pour la préparation de la culture de cellules 20 de rein de boeuf pour obtenir une culture de cellulesd'embryon de poulet. On inocule 10 ml du virus d'ensemencement dilué 100 fois dans la culture de cellules d'embryon de poulet contenue dans des fioles de Roux de 500 ml de capacité et on ajoute 25 dans chacune des fioles 50 ml du milieu de culture de tissu N° 199 exempt de sérum. On fait incuber les fioles au repos à 32°C pendant sept jours. On centrifuge la culture résultante à 3000 tours/minute pendant 5 minutes pour obtenir une liqueur^ surnageante qui est un vaccin contenant le virus atténué des 30 oreillons, la liqueur surnageante a un titre en virus des oreillons de 10^'*' DICT^/ml, déterminé par une méthode spéciale utilisant des cellules primaires de rein de singe vert d'Afrique, comme décrit, par exemple, dans "Amer. J. Epidermiol.", 8£, pages 176-183 (1969). 35 Pour conserver le produit, on le congèle à -70°0. Après 100 jours de conservation, on le décongèle et on le dilue à 5 fois son volume avec une solution physiologique de sel. le vaccin dilué est inoculé par voie sous-cutanée dans un 72 15419 2134699 membre sapérievir pour démontrer l'effet désirable d'immunisation chez les sujets vaccinés, sans aucun signe de réactions secondaires indésirables, telles que fièvre et lymphadénopathie. Remarques : 5 (1) La solution équilibrée de sels de Hanks, contient les ingrédients suivants ; NaCl 8,0 g EC1 0,4 g Ca012 - 0,2 g 10 MgSO^YE^O 0,2 g Ns^HPO^^O 0,06 g KE^PO^ ' , 0,06 g d-glucose 1,0 g UaHCO^ 0,25 g 15 Rouge de phénol 0,02 g On ajuste à un volume total d'un litre avec de l'eau distillée (triple distillation). (2) On prépare la solution de lactalbumine de Hanks en dissolvant 5 g d'hydrolysat de lactalbumine dans la 20 solution équilibrée de sel de Hanks à un volume total de 1000 ml. (3) Le milieu de culture de tissu H° 199 est une solution aqueuse stérile dont le pH est ajusté à 7,2 et contenant des amino-acides, des bases puriques, des bases pyrimidiques, 25 des vitamines, des sucres, des nucléotides, des sels minéraux, etc. Des détails de la composition sont données par J.3?. Morgan et Collaborateurs, dans "Proc. Soc. Exp. Mol. Med." 73, pages .1 à 8 (1950). 72 15419 2134699 Exemple 2 Dans cet exemple, on soumet une souche Torii de virus des oreillons à trois passages en appliquant la dilution limite à chaque passage. Ainsi, on dilue le liquide de la souche 5 Torii passée deux fois dans la cavité amniotique d'oeufs de poule contenant un embryon, avec le milieu de culture de tissu H° 199, par dilution triple en série de 1:3^ à 1:3^ et on inocule 0,2 ml de chacun des liquide s "dilués dans une culture de cellules de rein de boeuf contenue dans 20 flacons de 10 50 ml de capacité, cette culture ayant été préparée de la même manière que dans l'exemple 1, et on procède à.l'incubation pendant 7 jours, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. les cultures résultantes sont centrifugées indépendamment à 3000 tr/mn pendant 5 minutes, et on. prélève les liqueurs 15 surnageantes que l'on congèle ensuite à -70°C pour leur conservation. la dilution maximale pour la propagation du virus dans ce passage est déterminée de la manière suivante : Les cellules séparées des liquides comme indiqué ci-dessus, et restant dans les flacons, sont lavées deux 20 fois avec la solution équilibrée de sels de Hanks. Ensuite, on ajoute à chaque flacon 3 ml d'une suspension à 0,5 ^ d'éry-throcytes de cobaye dans la solution équilibrée de sels de Hanks et on maintient les flacons respectifs au repos à la température ambiante pendant 45 minutes. On jette la 25 suspension d'érythrocytes contenue dans chaque bouteille et après trois lavages avec la solution équilibrée de sels de Hanks, on examine au microscope les cellules contenue^àans chaque flacon pour observer l'adsorption d'érythrocytes de cobaye sur les cellules, de manière à déterminer la dilution 30 maximale pour la propagation du virus. Parmi les liqueurs surnageantes conservées comme indiqué ci-dessus, on ne décongèle que celles qui proviennent du liquide d'ensemencement du virus à ia plus forte dilution. Les liquides décongelés sont dilués avec le milieu de culture 4 13 35 de tissu N° 199 par dilution triple en série de 1:3 à 1:3 . On inocule 0,2. ml fie chacun. des liquides dilués dans une culture 72 15419 n 2134699 fraîche de cellules rénales de boeuf contenue dans 10 flacons de 50 ml de capacité, et on les fait incuber dans les mêmes conditions que ci-dessus. On détermine de nouveau la dilution maximale pour la propagation du virus de la manière indiquée 5 ci-dessus et on utilise les liquides de culture obtenues à partir du liquide d'ensemencement du virus de dilution maximal, comme virus d'ensemencement dans le passage suivant, après une triple dilution en série. On effectue ainsi trois passages sur la culture de 10 cellules de rein de boeuf en appliquant la dilution limite à chaque passage, et on centrifuge la culture du troisième passage pour obtenir un virus atténué"d'ensemencement destiné à la production d'un vaccin renfermant le virus des oreillons. Le virus d'ensemencement est inoculé dans une 15 culture de cellules d'embryons de poulet contenue dans des fioles de Roux et la culture est effectuée de la même manière que dans l'exemple 1, mais en utilisant un milieu de culture de tissu N° 199 exempt de sérum, ce qui permet d'obtenir un vaccin contenant le virus atténué des oreillons. Ce vaccin a un A 8 20 titre en virus des oreillons de 10 ' LICT^/ml, déterminé de la même manière que dans l'exemple 1. . . En opérant comme indiqué, dans l'exemple 1, .on con gèle le produit en vue de sa conservation, puis on le décongèle et on l'utilise pour la vaccination j il donne une immunisation 25 satisfaisante chez les sujets vaccinés. Exemple 3 On inocule 0,2 ml d'un liquide dilué cent fois provenant de la souche Torii du virus des oreillons traité par deux passages dans la cavité amniotique d'oeufs de poule 30 contenant un embryon, dans une culture de cellules de rein, de boeuf contenue dans des fioles de 50 ml de capacité, culture que l'on prépare de la même manière que dans l'exemple 1, et on procède à l'incubation pendant 7 jours dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. On centrifuge la culture ré-35 sultante à 3000 tr/minute pendant 5 minutes pour séparer une liqueur surnageante que l'on utilise comme virus d'ensemencement dans le passage suivant, après dilution à 100 fois son volume, au moyen du milieu de culture de tissu M0 199. 72 15419 12 2134699 On inocule 0,2 ml d'une dilution au centuple du liquide viral obtenu en effectuant deux passages avec la culture de cellule de rein de boeuf de la manière indiquée ci-dessus, .fait ' et on /passer le virus sur une culture de tissu formée de cel- 5 Iules d'embryon de poulet dans des fioles de 50*ml de capacité, dans les mêmes conditions que ci-dessus. On centrifuge la culture résultante à 3000 tr/mn pendant 5 minutes pour obtenir une liqueur surnageante que l'on utilise comme virus d'ensemencement dans le passage suivant.. 10 En opérant de la même manière, on conduit à deux reprises un cycle de culture alternée de la souche Torii dans la culture de cellules de rein de boeuf et la culture de cellules d'embryon de poulet avec deux passages consécutifs dans chaque cas, et on centrifuge la culture du dernier 15 passage à 3000 tr/mn pendant 5 minutes, pour obtenir un virus atténué d'ensemencement destiné à produire un vaccin contenant le virus des oreillons. le virus d'ensemencement est inoculé dans une culture de cellules d'embryon de poulet contenue dans des fioles de 20 Roux, et on procède au même traitement que dans l'exemple 1, en utilisant un milieu de culture de tissu ÏTG 199 exempt de sérum, de manière à obtenir un vaccin contenant le virus atténué des oreillons. Ce vaccin a un titre en virus des oreillons 4- 8 de 10 ' DICT^Q/jni, déterminé de la même manière que dans l'exem-25 pie 1. En opérant comme indiqué dans l'exemple 1, on congèle le produit en vue de sa conservation et on le décongèle, puis on l'utilise pour la vaccination, de manière à conférer une immunité satisfaisante aux- sujets vaccinés. 13 72 15419 2134699 Exemple 4 le liquide de la souche Torii de. virus des oreillons traité par deux passages dans la cavité amniotique,d1 oeufs de poule contenant un embryon est dilué avec le milieu de culture 7 13 5 de tissu N° 199 par triple dilution en série de 1:3 à 1:3 et on inocule 0,2 ml de chacun des liquides dilués dans une culture de cellules de rein de boeuf contenue dans 20 fioles de 50 ml de capacité chacune, cette culture étant préparée de la même manière que dans l'exemple 1, puis on procède à l'i.n-10 cubation pendant 7 jours dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. En ce qui concerne les cultures résultantes, la ' dilution maximale.pour la propagation du virus est déterminée de la même manière que" dans 1 ' exemple 2. On inocule 0,2 ml d'une dilution au centuple du liquide 15 de culture obtenu à partir-du liquide, renfermant le virus d'ensemencement, de la dilution maximale dans line culture fraîche de cellules de rein: de boeuf et on procède à l'incubation pendant 7 jours dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 . On centrifuge la culture résultante à 3000 tours/minute 20 pendant 5 minutes pour obtenir une liqueur surnageante que l'on utilise comme virus d'ensemencement dans le passage suivant, après dilution avec 100 fois son volume de milieu pour culture de tissu N° 199. On effectue de cette manière 17 passages sur la culture 25 de cellules de rein de boeuf en appliquant la dilution limite au premier passage et au sixième. la culture obtenue au 17e passage est centrifugée à 3000 tours/minute pendant 5 minutes en donnant un virus atténué d'ensemencement destiné à la production du vaccin renfermant 30 le virus des oreillons. le virus d'ensemencement est inoculé dans une culture de cellules d'embryon de poulet contenue dans des fioles de Ro\t.c et traitée de la même manière que dans l'exemple 1 par 1'utilisation d'un milieu de cultiire de tissu N° 199 exempt de sérum, 35 de manière à obtenir un vaccin contenant le virus atténué des oreillons. Ce vaccin a un titre en virus des oreillons de 105'5 DICT^/ml, déterminé de la même manière que dans 72 15419 2134699 l'exemple 1. En opérant comme indiqué dans 11 exemple 1 , on congèle le produit en vue de sa conservation, puis on le décongèle et onjL'utilise pour la vaccination de manière à conférer une 5 immunité satisfaisante aux sujets vaccinés. Exemple 5 En opérant comme indiqué dans l'exemple 4, on soumet une souche Torii de virus des oreillons à 12 passages dans la culture de cellules de rein de boeuf en appliquant la 10 dilution limite au première passage et au sixième. la culture obtenue après le douzième passage est centrifugée à 3000 tours/minute pendant 5 minutes pour donner un virus atténué d'ensemencement destiné à produire un vaccin contenant le virus des oreillons. 15 Le virus d'ensemencement est inoculé dans une culture dè cellules d"1 embryon de poulet contenue dans des fioles de même Roux et traitée de la/manière que dans 1'exemple 1,en utilisant un milieu de culture de tissu ÏT° 199 exempt de sérum, de manière à obtenir un vaccin contenant le virus atténué des 20 oreillons. Ce -vaccin a un titre en virus des oreillons de 6 3 . 10 ' DICT^/ml, déterminé de la même manière que dans l'exemple 1 . En opérant comme indiqué dans 1'exemple 1, on congèle le produit en vue de sa conservation puis on le décongèle 25 et on l'utilise pour la vaccination, de manière à conférer une immunité satisfaisante aux sujets vaccinés. Exemple 6 On inocule 0,2 ml d'un liquide dilué au centuple de la souche de Torii du virus des oreillons traité par deux passages 30 dans la cavité amniotique d'oeufs de poule contenant un embryon, dans une culture de cellules d'embryon de poulet contenue dans des fioles de Roux de 50 ml de capacité, cette culture étant préparée de la même manière que dans l'exemple 1, puis on procède à l'incubation pendant 7 jours dans, les mêmes 35 conditions que dans l'exemple 1. Le liquide viral obtenu dans la culture mentionnée ci-dessus est inoculé et cultivé dans une culture de cellules 72 15419 15 2134699 de rein de boeuf avec application de la dilution-limite de la même manière que dans l'exemple 2. On inocule 0,2 ml de la dilution au centuple du liquide de culture obtenu à partir du liquide viral d'ensemencement 5 de dilution maximale et on procède à l'incubation dans une culture fraîehe de cellules d'embryon de poulet. On conduit de la sorte, à six reprises, un cycle de culture alternée de souche Torii dans la culture de cellules d'embryon de poulet et dans la culture de cellules de- rein 10 de boeuf, à raison d'un passage à chaque fois, en appliquant la dilution limite aux premier, deuxième, quatrième et cinquième passages dans les cultures de cellules de rein, de boeuf. La culture obtenue dans le dernier passage est centrifugée à 3000 tours/minute pendant 5 minutes en donnant un virus 15 atténué d'ensemencement pour la production d'un vaccin contenant le virus des oreillons. Le virus d'ensemencement est inoculé dans une culture de cellules d'embryon de poulet contenue dans des fioles de Roux et traitée de la même manière que dans l'exemple 1 en 20 utilisant un milieu de culture de tissu U° 199 exempt de sérum, en sorte qu'on obtient un vaccin contenant le virus atténué des oreillons. Cs vaccin a un titre en virus des oreillons 6 5/ de 10 ' DlCTp-Q/ml, déterminé de la même manière que dans 1'exemple 1. 25 En opérant comme indiqué dans l'exemple 1, on congèle le produit en vue de sa conservation puis on le décongèle et on l'utilise pour la vaccination, de manière à conférer une immunité satisfaisante aux sujets que l'on vaccine. Test 30 On compare l'atténuation du virus des oreillons obtenue par passages sur des cellules de rein de boeuf à celle que l'on obtient par passages sur des cellules d'embryon de poulet et sur les cellules primaire du rein de cobaye, les cellules d'embryon de poulet et les cellules primaires 35 de rein de cobaye étant utilisées comme exemples représentatifs des cellules connues à l'heure actuelle pour l'atténuation du virus des oreillons. 72 15419 16 2134699 On soumet une souche Torii du virus des oreillons traitée par deux passages dans la cavité amniotique d'oeufs de poule contenant des embryons, à 15 passages sur des cellules de rein de boeuf dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1. 5 A titre d'essai témoin , cette souche Torii est soumise à 15 passages sur les cellules d'embryon de poulet ou les cel-.primaires Iules/ae rem de cobaye dans les memes conditions que ci-dessus On détermine la réduction de la virulence du virus des oreillons au cours des passages, en fonction des milieux respec 10 tifs sur lesquels on effectue les passages, en procédant de la manière suivante : Les liquides viraux respectifs des première, cinquième, septième, dixième et quinzième cultures sont inoculés dans les glandes parotides de singes rhésus à une dose de 5 x 10^ 15 DICT,_q par animal. On détermine la réaction clinique, le titre en anticorps correspondant au virus des oreillons des sérums des animaux et les virus des oreillons isolés de prélèvements effectués dans la gorge, pour les divers animaux inoculés. - réaction clinique : on observe une augmentation de 20 volume des glandes parotides et d'autres symptômes attribués • à l'inoculation, pendant les 3 semaines qui suivent l'inoculation. - titre des anticorps correspondant au virus des oreillons on recueille des échantillons de sérum d'animaux 21 jours 25 après 11 inoculation et on détermine le titre de neutralisation par les anticorps, sur les échantillons respectifs, d'après la méthode de Buynak et Collaborateurs, décrite dans "Proc. Soc. Exp. Biol. Med." 125. pages 1068-1071 (1967). - isolement du virus des oreillons de prélèvements ef-30 fectués dans la gorge : pendant 17 jours comptés à partir du cinquième jour qui suit l'inoculation, on effectue des prélèvements dans la gorge de tous les animaux et on les examine d'après la méthode de Francis et Collaborateurs décrite dans "Amer. J. Epidemiol.", 8£, pages 176-183 (1969). 35 Les résultats sont récapitulés sur le tableau I suivant. 72 15419 17 2134699 TABLEAU I Etat des Isolement de | divers virus de prélè: passages vements effec du liqui Réaction Titre de neutralisation tués dans la de viral clinique par les anticorps gorge : BK-1 + 1 256 + EK-5 "" 1 64 - BK-7 - 1 32 - BK-10 - 1 16 - BK-1 5 - . 1 16 - CE-1 + 1:256 4* | CE-5 + 1:64 + CE-7 - 1 32 -f* CE-10 - 1:16 - 0E-15 - 1: 8 GPK-1 + 1 256 + GPK-5 + 1:128 + G-PK-7 + 1: 64 + GPK-10 + 1; 64 GPK-15 - 1:32 + i k 72 15419 18 2134699 KEVBKDICATIOMS 1. Procédé de production d'un vaccin contenant le virus atténué des oreillons, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre le vaccin des oreillons à des passages dans 5 une culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf,jusqu'à ce qu'une atténuation suffisante ait été atteinte. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que le virus des oreillons est soumis à au moins trois 10 passages. 3. Procédé d'atténuation du virus des oreillons, consistant à soumettre le virus des oreillons à des passages dans une culture de tissu et à interrompre ces passages lorsqu'une atténuation suffisante a été atteinte, caractérisé par le 15 fait que les passages sont conduits dans une culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé par le fait que les passages sont effectués à une température d'environ 28 à environ 36°C. 20 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 3, caracté-' risé par le fait que les passages sont effectués avec au moins une application de la dilution limite. 6. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 3, caractérisé par le fait que les passages sont effectués avec 25 intercalation de 1 à 5 passages dans une culture de tissu contenant des cellules d'embryon de poulet. 7. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on effectue au moins trois passages dans la culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf. 30 8. Vaccin contenant le virus atténué des oreillons, caractérisé par le fait qu'il est constitué par (a) le virus vivant des oreillons soumis à des passages dans une culture de tissu contenant des cellules primaires de rein de boeuf jusqu'à ce qu'une atténuation suffisante ait été atteinte, et 35 (b) un véhicule acceptable du point de vue physiologique. 9. Vaccin suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que son titre en virus des oreillons est au moins 72 15419 19 2134699 3 0 3 5 égal à 10 ' DICTc-, par exemple compris entre environ 10 ' et environ 10 ' DICT^q par ml à l'état dilué sous une forme inoculable. 10.. Yaccin suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que le virus vivant des oreillons a été soumis à au moins trois passages.