La présente invention a pour objet un nouveau polypep-tide répondant à la formule I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe- (I) 5 Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 ainsi que ses sels d'addition d'acides, et ses complexes de métaux lourds. L'invention concerne également les procédés permettant de préparer ce composé, ainsi que ses sels et ses complexes de 10 métaux lourds, et l'application en thérapeutique du nouveau poly-peptide, de ses sels et de ses complexes de métaux lourds, à .titre de principes actifs de médicaments. Le nouveau polypeptide de formule I peut être préparé selon les méthodes généralement connues pour la synthèse de 15 composés de ce type. Les acides aminés sont alors associés, dans l'ordre où ils figurent dans la formule représentée ci-dessus, soit isolément, soit par petites séquences peptidiques préalablement formées, la formation du pont disulfure étant réalisée à un stade approprié de la synthèse. 20 Le couplage des acides aminés et/ou des unités peptidi ques est effectué par exemple en faisant réagir un acide aminé dont le groupe a-amino est protégé et le groupe carboxylique terminal activé,avec un acide aminé ou un peptide ayant le groupe a-amino libre et le groupe carboxylique terminal libre ou protégé. 25 On peut également faire réagir un acide aminé ou un peptide dont le groupe a-amino est activé et le groupe carboxylique terminal protégé,avec un acide aminé ou un peptide ayant le groupe carboxylique terminal libre et le groupe a-amino protégé. Le groupe carboxylique peut être activé par exemple par 30 transformation en azide, en anhydride d'acide, en imidazolide, en isoxazolide ou en ester activé, ou par réaction au moyen du carbodiimide ou du N,N'-carbonyl-d'iimidazole. Comme méthode de condensation, on utilise de préférence la méthode de couplage au carbodiimide, à 1'azide, à l'ester 35 activé, à l'anhydride d'acide et la méthode de Merrifield. Au dernier stade de la condensation, il est conseillé d'utiliser des 70 03113 2 2034513 méthodes qui ne provoquent pas de racémisation ou qui ne provoquent qu'une racémisation peu importante, de préférence la méthode de couplage à 1'azide ou à l'ester activé, en employant, pour 1'activation, de préférence le N-hydroxy-succinimide. 5 Les groupes fonctionnels libres qui ne participent pas à la réaction peuvent, au cours de la synthèse du nouveau poly-peptide, être protégés de la manière suivante: Dans la séquence partielle A décrite ci-après, le groupe tert.-butyloxy s'est montré-approprié pour bloquer le 10 groupe £f-carboxylique; on peut cependant utiliser, dans le même but, d'autres groupes protecteurs, tels que le groupe méthoxy, éthoxy, tert.-amyloxy, amide ou benzyloxy. Pour bloquer le groupe imidazole du reste de l'histidi-ne dans la séquence partielle C décrite ci-après, le groupe 15 triphénylméthyle convient très bien; on. peut cependant utiliser également d'autres groupes protecteurs appropriés, tels que le groupe tert.-butyloxycarbonyle, tert.-amyloxycarbonyle, benzyloxy-carbonyle ou benzyle. Le groupe nitro convient très bien pour bloquer le 20 groupe guanidino du reste de l'arginine dans la séquence partielle C décrite ci-après; on peut cependant utiliser également d'autres groupes protecteurs appropriés, tels que le groupe tosy-le, p-nitro-benzyloxycarbonyle ou le groupe 2- (1-isopropyloxy-earbonyl)-3i^,5)É>-tétrachlorobenzoyle. Dans la synthèse, il est 25 également possible d'avoir recours à l'effet protecteur de la protonisation du groupe guanidino. Pour bloquer le groupe Lx) -amino du reste de la lysine dans la séquence partielle D décrite ci-après, on peut utiliser un groupe tert.-alcoxycarbonyle, de préférence le groupe tert.-30 butoxycarbonyle. Pour protéger les groupes mercapto dans les séquences partielles FI et F2 décrites ci-après, on utilise de préférence le groupe benzyle ou trityle. A la fin de la synthèse, on élimine habituellement les restes benzyles ou trityles,utilisés pour pro-35 téger les groupes SH au cours de la synthèse de la séquence partielle F, par traitement avec du sodium dans de l'ammoniac 70 03113 3 2034513 liquide. On a trouvé maintenant que l'on obtient des rendements particulièrement bons en produits finals en effectuant l'élimination des groupes protecteurs benzyles ou trityles ainsi que la préparation de la liaison S-S avant le dernier stade. 5 Au cours de la préparation du nouveau polypeptide de formule I, la transformation d'un groupe mercapto protégé ou d'un groupe amino protégé en groupe libre ainsi que la transformation d'un groupe carboxylique modifié en groupe carboxylique libre, peut être effectuée selon des méthodes connues par traite-10 ment avec des agents hydrolysants ou réducteurs. Les produits de départ utilisés dans la préparation du nouveau polypeptide de formule I sont connus, ou peuvent être préparés selon des méthodes connues appliquées dans la chimie des peptides, les acides aminés étant associés les uns aux autres, 15 soit un par un, soit par petites séquences peptidiques préalablement formées. Le nouveau polypeptide de formule I peut être obtenu ou utilisé soit tel quel, soit sous forme de ses sels ou de ses complexes de métaux lourds. Comme sels, on peut citer ceux qui 20 dérivent d'acides organiques, comme l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide succinique, l'acide benzoïque, l'acide salicy-lique, l'acide méthane-suifonique, l'acide toluène-suifonique ainsi que des acides polymères, comme l'acide tarmique et la carboxyméthylcellulose, et ceux qui dérivent d'acides minéraux, 25 comme les acides halohydriques, par exemple l'acide chlorhydri-que, ou l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Comme complexe de métal lourd on peut citer par exemple celui du zinc divalent. Le nouveau polypeptide de l'invention se signale par 30 d'intéressantes propriétés pharmacodynamiques. C'est ainsi qu'il abaisse le taux du calcium sanguin, en particulier les taux anormalement élevés, et, en tant qu'antagoniste de la parathormone, il produit un bilan positif du calcium dans l'os. L'activité biologique du nouveau polypeptide peut être 35 mise en évidence par l'hypocalcémie qu'il provoque chez le rat. On utilise des rats mâles pesant entre 100 et 130 g maintenus 70 03113 4 2034513 an «Jeune pendant 16 heures et hydratés avec une solution physiologique de chlorure de sodium. On prélève chez l'animal environ 1 ml de sang à partir du plexus véneux rétroorbitaire. On injecte ensuite dans la queue, par voie intraveineuse, 1 ml/kg d'une 5 solution du composé à essayer dans de l'acide acétique 0,2 N et une heure plus tard on prélève à nouveau du sang. Après coagulation on centrifuge les échantillons de sang, on sépare le sérum surnageant, on le dilue avec une solution à 0,25$ d'acide éthylènediamine-tétra-acétiqUe et on détermine le taux de calcium 10 au moyen d'un spectrophotomètre d'absorption. La différence entre les valeurs trouvées avant et après administration de la substance, donne la mesure de l'hypocalcémie. Les activités sont calculées selon la méthode décrite par M.A Kumar et coll. dans J. Endocrin. jg, 469 (1965). Les résultats obtenus sont comparés à 15 ceux obtenus avec un échantillon étalon de thyrocalcitonine provenant du "Médical Research Council" (MRC); l'activité est exprimée en unité MRC par mg de peptide (10 milli-unités provoquent chez le rat une baisse de 10$, soit 1 mg/100 ml", du taux de calcium dans le sérum). Dans cet essai,le nouveau polypeptide de 20 l'invention possède une activité de 500- 100 unités MRC/mg de peptide. La dose à administrer dépend de 11 action désirée ainsi que du mode d'application. En général on obtient des résultats satisfaisants en administrant des doses quotidiennes comprises 25 entre environ 70-700 unités, soit en une seule fois, soit en plusieurs fractions. Pour l'application intramusculaire les formes d'administrations appropriées contiennent environ de 70-700 unités de substance active, en mélange avec un support liquide. Le nouveau composé peut être utilisé en thérapeutique 30 pour le traitement de tous les états dans lesquels on désire obtenir une baisse de la calcémie, comme par exemple les hyper-calcémies d'origines diverses, l'insuffisance de thyrocalcitonine endogène résultant d'une inactivité du tissu thyroïdien ou l'hyper-para-thyroï die. Le composé de l'invention est indiqué■également 35 pour le traitement de toutes.les ostéopathies provoquées par un catabolisme osseux trop élevé ou des ostéopathies dans lesquelles 70 03113 5 2034513 on désire provoquer une fixation accrue du calcium dans l'os, comme par exemple les ostéoporoses de diverses origines (telles que 1'ostéoporose post-climatérique, 1'ostéoporose post-traumatique, 1'ostéoporose provoquée par une eorticothérapie ou due à l'inacti-5 vité), les fractures, les ostéomalacies et le rachitisme. On pourra également utiliser le composé de l'invention en combinaison avec du calcium ou des phosphates. Le nouveau composé de l'invention ainsi que ses sels d'addition d'acides et ses complexes de métaux lourds peuvent 10 être utilisés comme médicaments, par exemple sous forme de préparations pharmaceutiques. Celles-ci renferment la substance active, en mélange avec un excipient minéral ou organique, approprié pour l'administration par la voie parentérale. Comme excipients, on utilisera des produits qui ne réagissent pas avec le nouveau com-15 posé, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, l'alcool benzylique, la gomme arabique, les poLy-alkylène-gl'ycols, la vaseline, le cholestérol ou d'autres excipients pharmaceutiques connus. 20 Les préparations pharmaceutiques liquides peuvent être par exemple des solutions, des suspensions ou des émulsions. On peut les stériliser et/ou leur ajouter des adjuvants, tels que des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants ou des émulsionnants. Elles peuvent également contenir d'autres 25 substances douées d'une action thérapeutique intéressante. Le nouveau composé peut également être administré sous forme de préparations à effet retardé. Le nouveau composé et ses sels peuvent aussi être utilisés comme produits, intermédiaires pour la préparation de produits 30 pharmaceutiques. 'Dans l'exemple suivant qui illustre la présente invention sans aucunement en limiter la portée, les températures sont exprimées en degrés centigrades. Les pouvoirs rotatoires ont été déterminés à la concentration de 1 mol/litre. Par ailleurs, 35 on fait usage des abréviations suivantes: 70 03113 z Bzl BOC Trt 5 OTB ONP OCP OSu OMe 10 OEt no2 Ser Asn Leu 15 Lys Thr Val . .. ' Ala Tyr 20 Trp Arg Phe Glu His 25. Fro- ■ ; -Gly Met Cys 6 2034513 benzyloxyearbonyl benzyl tert.-butyloxycarbonyl trityl =_triphénylméthyl tert.-butyloxy ester p-nitrophénylique 2,4,5-trichlorophénoxy N-hydroxy-succinimide méthoxy éthoxy nitro L-séryl L-asparaginyl L-leucyl L-lysyl L-thréonyl L-valyl L-alanyl L- tyr os y 1 L-tryp tophanyl L-arginyl L-phénylalanyl L-glutamyl L-histidyl L-prolyl glycyl L-méthionyl L-cystéinyl -4 O BOC- BOC- Partie 1 Bzl Bzl i Cys Ser Asn Leu Ser -NHNH0 H- Thr Cys Val Leu -OH Séquence partielle P2 Séquence partielle FI &Z± Cys Ser Asn Leù Ser Thr Cys Val Leu -OH Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu -OH Séquence partielle F BOC- Cys Ser Asn Leu Ser t 1 Thr Cys Val Leu 1 O tu CM H- Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu ÏO o UJ Jï» en UJ Partie 2 BOC Trt Trt- Ser Ala Tyr Trp -nhnh2 h- Lys Asn Leu Asn Asn Tyr -OMe Trt- —1 His Arg Phe -NHNHg Séquence partielle E BOC Séquence partielle D Séquence partielle C frt Trt- Ser Ala Tyr Trp Lys Asn Leu Asn Asn Tyr -OMe Trt- His Arg Phe BOC 1 Trt- Ser Ala Tyr Trp 1 Lys Asn Leu Asn Asn Tyr -nhnh. h- His Arg Phe Séquence partielle 150 DE c. Trt- Ser Ala Tyr Trp Lys Asn Leu Asn Asn Tyr His Arg Phe BOC ! h- Ser Ala Tyr Trp 1 Ly-s Asn Leu Asn Asn Tyr His Arg Phe Séouence partielle BQC. ABCDE Ser Ala Tyr Trp Lys Asn Leu Asn Asn Tyr His Arg Phe équence partielle ABCDEF Exemple Ser Ala Tyr Trp Lys Asn Leu Asn Asn Tyr His Arg Phe Partie 3 OTB BOC-Ser Gly Met Gly -OH H- Phe Gly Pro Glu Thr Pro Séquence partielle B BOC- Séquence partielle A QTB -Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro —1— Glu Thr Pro -Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro -NH, -NH, -NH 2 Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro -NH2 Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro -nh2 .S équence partielle ABC Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro -nhp Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro -NHg 70 03113 10 2034513 EXEMPLE: H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pr.o-Glu-Thr-Pro-NH2_ 5 On dissout, sous atmosphère d'azote, 3*3 S du dotria- contapeptide (séquence partielle ABCDEF) dans 100 ml d'acide trifluoroacétique, on abandonne pendant 15 minutes à 20° et on évapore à siccité. On dissout dans 300 ml d'acide acétique 0,2 N, on traite par 20 ml d'Amberlit-IRA-410 sous sa forme acétate, on 15 lyophilise,on lave à'11éther diéthylique et on sèche sur hydroxy-de de potassium sous vide poussé. On obtient ainsi 1'hexa-acétate décahydraté du H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe- ' Uly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp fondant à 220° (avec décomposition), ors 15 [ex]-j-j = -42° dans l'acide acétique IN. L'hydrolyse totale(acide chlorhydrique b N, pendant 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés: Alal,l' ArSl,0' Asp3,9' CyS//2l,6' G^"Lu1,2î Gly3,0' Hisl,l' LySl,l' LeU2,9' Metl,05 Phe2,0' Pro2,l' Ser3,8ï Tiru:*l,9' 20 Tyr2 Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie). Le dotriacontapeptide, utilisé comme corps de départ, peut être préparé de la manière exposée ci-dessous: §®guence_partielIe_A: H-Phe-Gly-Pro-Glu-(0TB)-Thr-Pro-NH2 On dissout à -5° 134 g de Z-Thr-NH-NH0 dans 2 litres 25 d'acide chlorhydrique 1 N et on ajoute 0,55 litre de nitrite de sodium 1 N. Au bout de 5 minutes, on ajoute du carbonate de potassium jusqu'à pH 9j on extrait 11azide ainsi obtenu avec de l'acétate d'éthyle et on ajoute une solution de 80 g de chlorhydrate de H-Pro-NH2 dans 100 ml d'eau, 500 ml de diméthylformamide 30 et 77 ml de triéthylamine. On évapore l'acétate d'éthyle à 20° sous pression réduite et.on abandonne pendant la nuit à une température de 25°. On évapore la solution restante sous pression réduite, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, on lave la solution successivement à l'eau, à l'acide chlorhydrique dilué 35 et avec une solution aqueuse de carbonate de potassium, puis on sèche sur sulfate de sodium. On évapore sous pression réduite, on 70 03113 11 2034513 dissout dans de l'acétate d'éthyle chaud et on refroidit. On PO obtient ainsi le Z-Tnr-Pro-NH2 fondant à 148"; = -72° d l'acide acétique à 95$- On dissout ensuite 90 g de Z-Thr-Pro-NH^ 2 dans 2 litres de dioxanne et 260 ml d'acide chlorhydrique 1 N et 5 on hydrogène à 20° sous pression normale et en présence d'un catalyseur au palladium. On filtre, on évapore la solution sous pression réduite, on lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle, ce qui donne le chlorhydrate de H-Thr-Pro-NH0 fondant à 21b°; -20 [ctjp = -64° dans l'acide acétique à 95%. On dissout le produit 10 obtenu dans 500 ml de diméthylformamide, 50 ml d'eau et 32 ml de triéthylamine et on ajoute 11b g de Z-Glu(0TB)-0CP et 800 ml de tétrahydrofuranne. On abandonne pendant la nuit à 20°, on évapore sous pression réduite et on cristallise le résidu dans de 1'éther diéthylique.On obtient ainsi le Z-Glu(0TB)-Thr-Pro-NH~ fondant 20 15 à 65° (avec décomposition); [a]^ = -18° dans le diméthylformamide. On dissout 80 g de Z-Glu(0TB)-Thr-Pro-NH2 dans 1,5 litre de dioxanne et 200 ml d'eau et on hydrogène à 20° et sous pression normale, en présence d'un catalyseur au palladium;On filtre la solution et on l'évaporé sous pression réduite, puis on ajoute 20 de 1'éther diéthylique au résidu. On obtient ainsi le H-Glu(OTB)- 20 Thr-Pro-NH2 fondant à 65° (avec décomposition); [a]^ = -28° dans le diméthylformamide. Le produit ainsi obtenu est dissout à 0° dans 700 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite.200 ml d'acétonitrile, 68 g 25 de Z-Phe-Gly-Pro-OH, l8 g de N-hydroxysuccinimide et 32 g de dicyclohexylcarbodiimide et on abandonne pendant la nuit à 20°. On filtre, on évapore sous pression réduite et on ajoute de l'acétate d'éthyle. On lave ensuite la solution à l'eau, à l'acide chlorhydrique dilué et avec une solution aqueuse de carbonate de 30 potassium, on sèche sur sulfate de sodium, on évapore sous pression réduite et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le Z-Phe-Gly- Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHp fondant à 120° (avec décomposition); 20 [aj^ = -66° dans le diméthylformamide. On dissout le produit ob-35 tenu dans 1500 ml de dioxanne et"300 ml d'eau, on ajoute 30 g de charbon palladié à 10$ et on hydrogène jusqu'à ce que l'absorption 70 03113 12 2034513 d'hydrogène cesse. On filtre, on évapore le filtrat et on cristallise le résidu dans du dioxanne. On obtient ainsi le H-Phe-Gly- Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHp (séquence partielle Ajjle produit fond à 20 153°; [aJD = -79° dans le diméthylformamide. 5 Séquence partielle B: BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH a) H-Met-Gly^OEt^JICl On dissout 65 g de BOC-Met-OH dans 900 ml de chloroforme, on refroidit à -10°, on ajoute 30 ml de N-méthylmorpîioline et 35*6 g de chloroformiate d'isobutyle. Au bout de 10 minutes, 10 on ajoute lentement une solution de 30 g d'ester éthylique de la glycine dans 200 ml de chloroforme et on laisse réagir pendant une heure à 20°. On extrait avec de l'hydroxyde d'ammonium 0,5 N, puis avec de l'acide sulfurique 0,2.N, on lave à l'éau jusqu'à neutralité, on sèche sur sulfate de sodium et on concentre. Après 15 cristallisation dans de 1'éther de pétrole, on obtient le BOC-Met- PO Gly-OET fondant à 49°; ta]j) = -19° dans l'éthanol. On dissout le produit dans 750 ml d'un mélange d'acide chlorhydrique 4 N et d'éthanol, on abandonne pendant une heure à 25°, on évapore, on lave le résidu avec de 1'éther diéthylique et on sèche jusqu'à 20 poids constant. On obtient ainsi le chlorhydrate de H-Met-Gly-OEt sous forme d'une huile. b) ÇOÇ^Ser-Gly-OEt On dissout 12,5 g de N-tert.-butyloxycarbonyl-serine dans 100 ml de chloroforme et on ajoute 6,1 g de N-méthylmorpho-25 line puis, goutte à goutte, 8,2 g de chloroformiate d'isobutyle. Après 10 minutes, on ajoute une solution de 6,6 g d'ester éthylique de la glycine dans 50 ml de chloroforme et on agite pendant une heure à la température ambiante. On lave le mélange réac-tionnel successivement avec de l'ammoniaque diluée et ensuite avec 30 une solution d'acide chlorhydrique, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore la phase organique. On obtient ainsi le BOC-Ser-Gly- 20 0ET sous forme d'une huile; [aj-p = -3° dans le diméthylformamide. c) B0Ç=Ser=Gly=NHNH2 On dissout 19, 4 g de BOC-Ser-Gly-OEt dans 270 ml 35 d'alcool éthylique, on ajoute 48,6 ml d'hydrate d'hydrazine et en abandonne pendant deux jours à la température ambiante. On évapore 70 03113 13 2034513 ensuite la solution et on cristallise le résidu dans un mélange d'alcool méthylique et d'éther diéthylique dans le rapport 1:3' on On obtient ainsi le B0C-Ser-Gly-NHNH2 fondant à 157°î [aJj-j = -5° dans le diméthylformamide. b d) BOC—Ser—Gly—Mefc—Gly—OKfc A 200 ml de diméthylformamide, on ajoute 25 ml d'une solution 4 N d'acide chlorhydrique dans de 1'éther diéthylique et on y dissout, à -10°, 11 g de BOC-Ser-Gly-NHNHg. On ajoute ensuite goutte à goutte, à -10°, ml de nitrite de tert.-bu-10 tyle, et à la solution ainsi obtenue on ajoute d'abord 18 ml de triéthylamine et ensuite une solution de 12 g de H-Met-Gly-OEt • HC1 dans 100 ml de diméthylformamide et 6,2 ml de triéthylamine. On agite pendant trois heures à la température ambiante-, on filtre après 12 heures et on évapore. On dissout le résidu dans du 15 chloroforme, on lave successivement avec une solution diluée d'am-s moniaque et d'acide chlorhydrique, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore. On obtient ainsi le BOC-Ser-Gly-Met-Gly-ÔEt; on [alp = -14° dans le diméthylformamide. e) BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (séquence partielle B) 20 On dissout 24 g de BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt dans 250 ml de dioxanne, on ajoute 75 ml d'hydroxyde de sodium 1 N, on agite la solution ainsi obtenue pendant une heure à 25°, on la traite par 150 ml de Dowex-50 (sous sa forme H ), on la filtre, on évaporé le filtrat et on cristallise le résidu dans un mélange 25 d'acétate d'éthyle et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH représentant la séquence partielle B; le 20 produit fond à 87°(avec décomposition); [a]D = -17° dans le diméthylformamide. Séguence partielle_Cj_ Trt-His (Trt)~Arg-Phe-NH-NH2 • HC1 30 a) Z-Arg(N02J-Phe-0Me . On dissout 51,8 g de H-Phe-OMe . HC1 dans un litre d'éther diéthylique et environ 50 ml d'eau glacée et, tout en agitant et en refroidissant, on ajoute du carbonate de sodium en quantité suffisante jusqu'à ce que toute l'eau soit fixée.On fil-35 tre et on évapore le filtrat jusqu'à poids constant, ce qui donne une huile incolore. 70 03113 14 2034513 On dissout 67,6 g de Z-Arg(N02)-0H dans 300 ml d'acéto-nitrilé et 150 ml de diméthylformamide et on ajoute 41,2 g de H-Phe-OMe. On refroidit ensuite à -20° et on ajoute une solution de 4^,4 g de dicyclohexylcarbodi'imide dans 100 ml d1 acétonitrile. 5 On laisse reposer le tout dans une glacière pendant 4 heures, tout en secouant de temps en temps. On sépare par filtration le précipité ainsi formé et on évapore le filtrat. On dissout le résidu d'évaporation dans 1 litre d'acétate d'éthyle et on lave à froid la solution ainsi obtenue successivement avec de l'hydroxyde de 10 sodium 1 N, de l'eau, de l'acide sulfurique 1 N, de l'eau et avec une solution saturée de chlorure de sodium. On sèche la phase d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium et on l'évaporé complètement. Après recristallisation, dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, on obtient le Z-Arg(N0pj-Phe-OMe l'on- PO 15 dant à 13I-I330; [ cij D = -7° dans le méthanol, -4° dans le diméthylformamide . b ) H=Arg(N022-Phe-0Me_2_0,5_H29__'_1,2_HBr On dissout 20 g de Z-Arg(N02)-Phe-0Me dans 50 ml d'acide acétique glacial et on ajoute 50 ml d'acide bromhydrique à 20 40$ dans l'acide acétique glacial, tout en refroidissant légèrement. On laisse ensuite reposer le tout pendant 1 heure à 20°, tout en secouant de temps en temps. Après avoir évaporé complètement, on dissout le résidu d'évaporation dans 200 ml d'eau et on lave à deux reprises avec de 1'éther diéthylique. On évapore com-25 plètement la phase aqueuse et on recristallise le résidu dans un mélange de méthanol et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le H-Arg(N0 )-Phe-0Me • 0,5 Hp0 • 1,2 HBr fondant à 165-167° (avec 20 décomposition); [aJp - +18° dans le méthanol, +14° dans le diméthylformamide. 30 c) Z-His(Z)-Arg(N02)-Phe-0Me On dissout 46,1 g de H-Arg(N02)-Phe-0Me • 0,5 H20 • 1,2 HBr dans 100 ml d'eau, puis on chauffe la solution ainsi obtenue et on la refroidit ensuite. Après addition de chloroforme et de glace, on règle le pH à 9 au moyen d1ammoniaque.On lave la phase 35 chloroformique encore une fois à l'eau, on la sèche ensuite sur carbonate de sodium et on la filtre. Au filtrat, on ajoute une 70 03113 15 2034513 solution de 44,5 g de Z-His(Z)-OH, de 12,1 g de N-hydroxysuccini-mide dans 200 ml d'acétonitrile puis on refroidit le tout à -20° et on ajoute une solution de 21,1 g de dicyclohexylcarbodii-mide dans 70 ml d'acétonitrile. On laisse reposer ensuite pen-5 dant 4 heures dans une glacière, tout en agitant de temps en temps. On sépare par filtration le précipité qui s'est formé et on évapore le filtrat. On reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle et on lave successivement avec une solution à 10$ de carbonate de potassium (pH/^/10j, de l'eau, une solution satu-10 rée de chlorure de sodium, de l'eau, une solution saturée de chlorure de sodium, de l'acide sulfurique (pH 3), de l'eau et avec une solution de chlorure de sodium. On sèche la phase d'acétate d'éthyle sur sulfate de sodium et on évapore complètement. On dissout la mousse beige claire ainsi obtenue à deux reprises avec 15 un peu de méthanol et on fait précipiter chaque fois par addition d'éther diéthylique. On sépare par décantation les phases éthé- rées et on sèche le précipité; on obtient ainsi le Z-His(Z)-Arg 20 (NOgJ-Phe-OMe sous forme d'une mousse amorphe; [oc]^ = -8° dans le méthanol, -8° dans le diméthylformamide. 20 û) H-Hi s - Ar g- Phe - OMe _ _ 4 _HC 1 On dissout 25 g de Z-His(Z,}-Arg(N02)-Phe-0Me dans 800 ml d'acide acétique glacial et on ajoute ensuite une suspension de 10 g de palladium à 10$ sur charbon actif dans 200 ml d'acide chlorhydrique 1 N. On hydrogène le tout pendant 2 heures et on 25 sépare ensuite le catalyseur par filtration. Au filtrat ainsi obtenu on ajoute à nouveau 5 g de palladium à 10$ sur charbon actif dans de l'eau et on hydrogène pendant 5 heures et demie. L'hydrogène absorbé correspond environ à 80$ de la quantité théorique. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore complètement le 30 filtrat ce qui donne le tétrachlorhydrate de H-His-Arg-Phe-OMe sous form'e d'une mousse amorphe. e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-0Me ^_HC1 ' On dissout 21,5 g de tétrachlorhydrate de H-His-Arg-Phe-OMe dans 100 ml de pyridine et environ 100 ml de diméthylformami-35 de. A une température d'environ +5", on ajoute de la triéthylamine jusqu'à pH 9 et on ajoute ensuite goutte à goutte, en l'espace de 70 03113 16 2034513 5 minutes, une solution de 29 g chlorure de trityle dans JOO ml de pyridine. L'addition terminée, on contrôle de temps en temps le pH et, le cas échéant, on règle à nouveau à environ pH 9 au moyen de triéthylamine. Au bout d'environ 4 heures on évapore le 5 tout, on reprend le résidu par du chloroforme et de 11 eau et on règle à pH 4 en ajoutant un peu d'acide chlorhydrique 1 N. On sépare la phase chloroformique, on la lave à deux reprises à l'eau, on la sèche sur sulfate de sodium et on l'évaporé complètement. On ajoute de l'éther au résidu d1évaporation et on sépare ensuite 10 1'éther diéthylique par filtration, ce qui donne le chlorhydrate de Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 (séquence partielle C) On dissout 17 g de chlorhydrate de Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe dans 200 ml de méthanol et on ajoute 40 ml d'hydrate 15 d'hydrazine. On abandonne ensuite pendant 2 jours à la température ambiante, on évapore, on dissout le résidu dans du chloroforme et on lave à deux reprises à l'eau. On sèche la phase chloroformique sur sulfate de sodium et on l'évaporé. On lave ensuite le résidu avec de 1'éther diéthylique et on le sépare par filtration; 20 on obtient ainsi le chlorhydrate de Trt-His(trt;-Arg-Phe-NH-NH0 l8 (séquence partielle C); [aj^ = -9° dans le diméthylformamide. Séguence partielle_D: H-Lys (BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe a) Z-Asn-Tyr-OMe On dissout 89 g de Z-Asn-OCP et 31 g de H-Tyr-OMe dans 25 500 ml de diméthylformamide, on abandonne la solution ainsi obtenue pendant la nuit,on fait précipiter en ajoutant de 1'éther, on sépare par filtration et on lave avec de 1'éther diéthylique. On dissout le produit dans du diméthylformamide, on fait précipiter par addition d'eau, on sépare par filtration, on lave à l'eau et 30 on sèche. On obtient ainsi le Z-Asn-Tyr-OMe fondant à 199°; [a]^= +6° dans le diméthylformamide. b) 5lAsn-Tyr-0Me_j_HCl On dissout 31 g de Z-Asn-Tyr-OMe dans 500 ml de dioxanne et 85 ml d'acide chlorhydrique 1 N et on hydrogène à une tempéra-35 ture de 25° en présence d'un catalyseur au palladium. On sépare le catalyseur par filtration, on évapore le filtrat, on lave le ré- 70 03113 17 2034513 sidu à 1'éther-diéthylique et on sèche. On obtient ainsi le on chlorhydrate de. H-Asn-Tyr-OMe; [etJD = +29° dans le diméthylformamide. » c) ZzèË:£zùëBi?¥r~c'Me 5 On dissout 34,6 g de chlorhydrate de H-Asn-Tyr-OMe et 57 g de Z-Asn-OCP dans 500 ml de diméthylformamide, on ajoute 6 ml d'acide acétique glacial et ensuite 14 ml de triéthylamine. On abandonne pendant 2 jours à 25° et on fait précipiter en ajoutant de 1'éther diéthylique. On dissout le précipité dans du 10 diméthylformamide, on fait précipiter par addition d'eau, on sépare par filtration et on lave à l'eau. On obtient ainsi le Z-Asn- po Asn-Tyr-OMe fondant à 220°; [a]^ = -4° dans le diméthylformamide . d) H-Asn=AsnITyr-0Me__1_CH^C00H 15 On dissout 42 g de Z-Asn-Asn-Tyr-OMe dans 750 ml de diméthylformamide et on ajoute 80 ml d'acide acétique IN. On hydrogène à 25° en présence d'un catalyseur au palladium, on sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat. On dissout le résidu dans de 1'eau chaude et on le lyophilise. On 20 obtient ainsi l'acétate de H-Asn-Asn-Tyr-OMe fondant à 168°; 20 [a]^ = -6° dans le diméthylformamide. e) Z-Leu-Asn-Asn^Tyr-OMe On dissout 40 g de Z-Leu-OCP et 33 g d'acétate de H-Asri-Asn-Tyr-OMe dans 500 ml de diméthylformamide, on laisse re- 25 poser pendant 2 jours à 25° et on fait précipiter en ajoutant de 1*éther. On dissout le produit dans le diméthylformamide, on fait précipiter par addition d'eau, on sépare par filtration et on lave à l'eau. On obtient ainsi le Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe fon-PO dant à 241°; [alD = -15° dans le diméthylformamide. 30 f) H-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe On dissout 34 g de Z-Leu-Asn-Asn-Tyr-QKe dans 500 ml d'un mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rapport 8:2 et on hydrogène à 20° en présence d'un catalyseur au palladium. On sépare le catalyseur par filtration et on évapore le filtrat. 35 On dissout le résidu dans de l'eau chaude et on le lyophilise. On 20 obtient ainsi le H-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe fondant à 175°; = -16° 70 03113 18 2034513 dans le diméthylformamide. g) Z-Asn-Leu-Asn=Asn-Tyr-OMe On dissout 45 g de Z-Asn-OCP et 26,5 g de H-Leu-Asn- Asn-Tyr-OMe dans 500 ml de diméthylformamide, on laisse reposer 5 pendant 2 jours à 25°, on ajoute goutte à goutte de 1"éther diéthylique, on sépare le produit par filtration, on le lave à 1'éther diéthylique et on le sèche. On dissout le produit dans du diméthylformamide, on fait précipiter par de l'eau, on sépare le produit par filtration et on le lave à l'eau. On obtient ainsi 20 10 le Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe fondant à 255°; ta]j) = -l8° dans le diméthylformamide. h) H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe •_ÇH^C00H On dissout 32,8 g de Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe dans 2 litres de diméthylformamide, on hydrogène à 20° en présence 15 d'un catalyseur au palladium et on ajoute 60 ml d'acide acétique 1 N. On filtre la solution et on évapore le filtrat. On dissout le résidu dans de l'eau chaude et on le lyophilise. On obtient ainsi l'acétate de H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe fondant à 210°; 20 [a]p = -19° dans le diméthylformamide. 20 i) Z-Lys(B0Cj-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe On dissout 12,6 g de Z-Lys(BOCJ-OCP et 11 g d'acétate de H-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe dans 500 ml de diméthylformamide, on laisse reposer la solution pendant 2 jours à 25° et on la verse goutte à goutte dans de 1'éther. On sépare par filtration, 25 on lave le produit à 1'éther et on le sèche. On dissout le produit dans du diméthylformamide, on fait précipiter par de l'eau, on sépare par filtration et on lave à l'eau. On obtient ainsi le PO Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-ïyr-OMe fondant à 242°; [ajjj = -20° dans le diméthylformamide. 30 j) (séquence partielle D) On dissout 11 g de Z-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe dans 300 ml de diméthylformamide et on hydrogène à 20° et à la pression ordinaire en présence d'un catalyseur au palladium. On filtre la solution et on fait précipiter le produit dans de 35 1'éther diéthylique. Après lavage à 1'éther diéthylique, on obtient le H-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe (séquence partielle D) 70 03113 19 2034513 20 fondant à 221°; [aj^ = -26° dans le diméthylformamide. Séguence partielle Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NH-NH2 a) H-Tyr-Trp-OMe On dissout 85 g de Z-Tyr(Z)-Trp-OMe dans un mélange 5 constitué de 1000 ml de dioxanne et d'eau dans le rapport 8:2 et de 145 ml d'acide chlorhydrique 1 N et on hydrogène en-présence d'un catalyseur au palladium jusqu'à ce que l'absorption d'hydrogène cesse. On sépare le catalyseur par filtration, on évapore la solution et on ajoute 500 ml d'eau. On lave la phase 10 aqueuse avec de l'acétate d'éthyle et on l'alcalinise avec du bicarbonate de potassium solide. On extrait à plusieurs reprises avec de 1'éther diéthylique et on évapore. On obtient ainsi le on H-Tyr-Trp-0Me fondant à 85°; [aJp = "2° dans le diméthylformamide . 15 b) Trt-Ser-Ala-OMe On dissout 60 g de chlorhydrate de H-Ala-OMe et 130 g de Trt-Ser-OH dans 1400 ml d'un mélange à parts égales d'acétonitrile et de diméthylformamide et on ajoute 60 ml de triéthylamine. On ajoute 52 g de N-hydroxysuccinimide, on refroidit la 20 solution à 0° et on secoue avec 97 g de dicyclohexylcarbodiimide pendant 5 heures. Après filtration, on évapore la solution, on ajoute de l'acétate d'éthyle et on lave avec de l'acide acétique dilué et une solution de bicarbonate de potassium. On sèche, on évapore et on traite par de l'éther diéthylique. On obtient ainsi |2C 'D 20 25 le Trt-Ser-Ala-OMe fondant à 146°; [a]^ = -56° dans le diméthylformamide . c) Trt-Ser-Ala-NH-NHg On dissout 82 g de Trt-Ser-Ala-OMe dans 800 ml de méthanol et on ajoute 80 ml d'hydrate d'hydrazine. Après avoir JO abandonné pendant 24 heures à 20°, on évapore et on lave le résidu à 1*éther diéthylique et à l'eau. On obtient ainsi le Trt-Ser-Ala- po NH-NH^ fondant à 126°;[a]^ = +38° dans le diméthylformamide. d) Trt-Ser-Ala-'i'yr-Trp-OMe On dissout 30 g de Trt-Ser-Ala-NH-NI^ dans 170 ml de 35 diméthylformamide, on refroidit à -20° et on ajoute 100 ml d'acide chlorhydrique 2 N dans dû dioxanne. Après addition de 8,5 ml de 70 03113 20 2034513 nitrite de tert,-butyle, on agite pendant encore 10 minutes à -20° et on réunit avec une solution de diméthylformamide contenant 31 g de chlorhydrate de H-Tyr-Trp-OMe et 50 ml de triéthylamine. Après avoir agité pendant. 2 heures, on évapore la solution 5 et on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle. On extrait par lavage avec de l'acide acétique dilué et de 1 ' ammoniaque,on sèche sur sulfate de sodium et on évapore. On obtient ainsi le Trt-Ser- 20 Ala-Tyr-Trp-OMe fondant à 143°; [a]^ = +16° dans le diméthylformamide . 10 e) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NH-NH2(séquence partielle E) On dissout 30 g de Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-OMe dans 300 ml de méthanol et on ajoute 30 ml d'hydrate d'hydrazine. On abandonne la solution pendant 24 heures à 20° et on évapore. On traite le résidu par de 1'éther diéthylique et de l'eau. On obtient 15 ainsi le Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NH-NH_(séquence partielle EJ fondant PO à 196°; [&]•£) = +10° dans le diméthylformamide. Séquence partielle Fl: H-Thr-Cys(BzlJ-Val-Leu-OH a) H-Cys(BzlJ-val-Leu20Me_2_HBr 0n~dissout 21,0 g de Z-Cys(Bzl)-OCP et 12,3 g de chlcr-20 hydrate- de H-Val-Leu-OMe dans 120 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 5*9 ml de triéthylamine, on laisse reposer pendant 16 heures à 25°, on ajoute de l'acétate d'éthyle, on lave à l'acide chlorhydrique dilué, on sèche sur sulfate de sodium, on évapore à siccité et on cristallise le résidu dans un mélange 25 d'acétate d'éthyle et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le PO Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe fondant à 160°; [a]^ = -28° dans le diméthylformamide. On dissout le produit dans 210 ml d'une solution à 40% d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial. On abandonne pendant 1 heure à 25°* on évapore à siccité et on cris-30 tallise le résidu dans un mélange d'isopropanol et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le bromhydrate de H-Cys(Bzl)-Val-Leu- 20 OMe fondant à 168°; [aJD = +14° dans le diméthylformamide. b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-0Me_^_l,3_HBr On dissout 20 g de Z-Thr-NHNH2 dans 350 ml de diméthyl-35 formamide, on refroidit à -20°, on ajoute 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 2 N dans du dioxanne et ensuite 10 ml de 70 03113 21 2034513 nitrite de tert.-butyle. On laisse reposer pendant 10. minutes à 20°, on ajoute 45 ml de triéthylamine et 25,5 g de bromhydrate de H-Cys(BzlJ-Val-Leu-OMe et on secoue le mélange ainsi obtenu pendant 16 heures à 0°. On évapore à siccité, on dissout le rési- 5 du dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau, on lave la phase organique à l'acide chlorhydrique dilué, on la sèche sur sulfate de sodium et on l'évaporé. Après cristallisation du résidu dans l'acétate d'éthyle, on obtient le Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-0Me fon-20 dant à 208°; [ctj^ = -27° dans le diméthylformamide. 10 On dissout 20 g du tétra-peptide obtenu ci-dessus dans 200 ml d'un mélange à parts égales d'acide trifluoroacétique et d'acétate d'éthyle. Dans la solution ainsi obtenue,on fait passer pendant 1 heure à 0° un courant d'acide bromhydrique gazeux. On évapore la solution et on cristallise le résidu dans un mélange 15 de méthanol et d'éther diéthylique. On obtient ainsi le H-Thr-Cys- on (Bzl)-Val-Leu-OMe • 1,3 HBr fondant à 202°; [etj D = -10° dans le diméthylformamide. c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-0H (séquence partielle FI) On dissout 372 g de H-Thr-Cys(Bzl;-Val-Leu-0Me • 1,3 20 HBr dans 1800 ml de méthanol, on ajoute 900 ml d'hydroxyde de sodium 2 N, on abandonne pendant 1 heure à 25°, on ajoute 240 ml d'acide acétique glacial et on laisse reposer pendant 2 heures à 0°. On sépare par filtration la masse cristallisée qui s'est déposée, on la lave d'abord avec de l'acide acétique 1 N puis à l'eau 25 et on sèche à 50° sous vide poussé. On obtient ainsi le H-Thr-Cys (BzlJ-Val-Leu-OH (séquence partielle Fl) fondant à 20 219°; [a]D = -53° dans l'ammoniaque IN. Séquence partielle_F2: BOC-Cys(BzlJ-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe _^_HC1 30 On dissout 43 g de chlorhydrate de H-Leu-Ser-OMe et 53 g de BOC-Asn-ONP dans 400 ml de diméthylformamide, on ajoute 22 ml de triéthylamine, on laisse reposer pendant 16 heures à 25°, on évapore à siccité et on recristallise le résidu dans du méthanol. On obtient ainsi 51*6 g de BOC-Asn-Leu-Ser-OMe fondant 20 35 à 190°; fet]D = -24° dans le diméthylformamide. On dissout le produit ainsi obtenu dans 500 ml d'une solution 4 N d'acide 70 03113 22 2034513 chlorhydrique méthanolique et on laisse reposer pendant une heure à 25°. On évapore à siccité, on dissout le résidu dans du méthanol et on fait précipiter avec 1'éther diéthylique. On obtient ainsi le chlorhydrate de H-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 180°; PO 5 [a]D = -23° dans le diméthylformamide. b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe__-_HCl On dissout 39,5 g de BOC-Ser-NH-NHg dans 500 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20°,on ajoute 200 ml d'une solution 2 N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et ensuite 10 20 ml de nitrite de tert.-butyle. Au bout de 10 minutes, on ajoute, à une température de -20°, 40 ml de triéthylamine et 38 g de chlorhydrate de H-Asn-Leu-Ser-OMe, puis on agite pendant 16 heures à 0°, on évapore à. siccité et on reeristallise le résidu dans un mélange de chloroforme et d'éther diéthylique. On ob- 20 15 tient ainsi le BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 135°; = -22° dans le diméthylformamide. On dissout le produit ainsi obtenu dans 420 ml d'une solution 4 N d'acide chlorhydrique méthanolique et on laisse reposer pendant 1 heure à 25°. On évapore a siccité et on recristallise le résidu dans un mélange de méthanol 20 et d'acétate d'éthyle. On obtient ainsi le chlorhydrate de H-Ser- 20 Asn-Leu-Ser-OMe fondant à 155° (avec décomposition); [et]D = -15° dans le diméthylformamide. c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH=NH2 (séquence partielle F2) On dissout 18,5 g de chlorhydrate de H-Ser-Asn-Leu-Ser-25 OMe et 18 g de BOC-Cys(Bzl)-0NP dans 100 ml de diméthylformamide, on ajoute 10 ml d'eau, 3,5 ml d'acide acétique et 5,6 ml de triéthylamine et on laisse reposer pendant 1b heures à 25°. On évapo- * re ensuite à siccité et on recristallise le produit dans du méthanol. On obtient ainsi 25,1 g de BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe 20 30 fondant à 182°; [ci]^ = -17° dans le diméthylformamide. On dissout le produit dans 200 ml de diméthylformamide, tout en chauffant légèrement. On ajoute ensuite 200 ml de méthanol et 20 ml d'hydrate d'hydrazine et on laisse reposer pendant 16 heures à 30°. On fait précipiter avec de 1'éther diéthylique, on lave le précipité 35 avec un mélange à parts égales d'éther diéthylique et de méthanol et on sèche le produit ainsi obtenu; le BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu- 70 03113 ° 2034513 on Ser-NH-NHg fond à 224°; fet]^ = -13° dans le diméthylformamide. F: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH On dissout 18, 4 g de BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NHg (séquence partielle F2) dans 150 ml de diméthylformamide, on 5 refroidit à -20°, on ajoute 40 ml d'une solution 2 N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et 15 ml de nitrite de tert.-butyle. Au bout de 10 minutes, on ajoute, à -20°, 28 ml de triéthylamine et 16,2 g de H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-0H (séquence partielle Fl) puis on agite pendant 16 heures à 25°. Après cela on filtre, 10 on évapore la solution et on lave le résidu avec de l'acide acétique 1 N. On obtient ainsi le BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-. Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH fondant à 217°; [a]^° = -17° dans le diméthylformamide. On dissout le produit ainsi obtenu dans 5 litres 15 d'ammoniac désséché et on ajoute du sodium métallique jusqu'à coloration bleu foncé, tout en agitant et en maintenant l'ammoniac à 1"ébullition. Pour décolorer, on ajoute du chlorure d'ammonium. On évapore à siccité et on lave le résidu à fond avec de l'acide acétique 1 N et avec de l'acétone. Après séchage, 20 on obtient le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH fondant 20 à 248° (avec décomposition); [a]D = -4l° dans un mélange de diméthylformamide et d'eau dans le rapport 3:1 • On dissout le nonapeptide ainsi obtenu dans 5 litres d'ammoniaque 0,01 N et on ajoute sous agitation de l'eau oxygé- 25 née 1 N jusqu'à réaction négative au nitroprussiate. On ajoute ensuite 200'ml d'acide acétique glacial, on filtre et on lyophi- 1 f lise. On obtient ainsi le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- 0H (séquence partielle F) fondant à 238° (avec décomposition); 20 [a]p = -18° dans un mélange de diméthylformamide et d'eau dans 30 le rapport 3:1. §®3H§!3£§2P§rkielle_AE£ H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro-NHg a) H-Ser-Gly=Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 *_HC1 On dissout 6,7 g de BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (séquence 35 partielle B), -12 g de H-Phe-Gly-Pro-Glu(0TB)-Thr-Pro-NH2 (séquence partielle A)et 2,1 g de N-hydroxysuccinimide dans 50 ml .de diméthyl- 70 03113 24 2034513 formamide et 20 rai d'acétonitrile, on refroidit à 0°, on ajoute 4,0 g de dicyclohexylcarbodiimide et on laisse reposer pendant 16 heures à 0°. On évapore le solvant, on lave le résidu à l'eau, à 11éther diéthylique et à l'acétate d'éthyle et on le 5 recristallise dans du chloroforme. On obtient ainsi le BOC-Ser- Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHp fondant à 121° (avec 20 décomposition); = -47° dans le diméthylformamide. On dissout le produit dans 250 ml d'une solution 8 N d'acide chlorhydrique dans du dioxanne et on agite pendant 2 heures à 25°. On évapore 10 à siccité et on traite le résidu dans de 1'éther diéthylique. On obtient ainsi le chlorhydrate de H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro- PO Glu-Thr-Pro-NH2 fondant à 130° (avec décomposition); [a]D = -48° dans le diméthylformamide. b ) H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu^Thr-Pro--NH2 15 (séquence partielle ABC) On dissout 9,9 g de Trt-His(Trt)-Arg-i-Phe-NH-NH2 (séquence partielle C) dans 100 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20°, on ajoute 15 ml d'acide chlorhydrique 2 N dans du dioxanne puis 1,16 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 10 minu--20 tes à -20°, on ajoute 28 ml de triéthylamine et 10,0 g de chlorhydrate de H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, on agite pendant 4 heures à 0°, on filtre et on évapore à siccité. On dissout le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol dans le rapport 8:2, on lave à l'ammoniaque diluée et à l'eau 25 jusqu'à neutralité, on sèche sur sulfate de sodium, on concentre jusqu'à un volume de 100 ml et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique. On dissout de nouveau le précipité dans du diméthylformamide et on fait précipiter par addition d'éther diéthylique. On obtient le Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly- 30 Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp fondant à 168° (avec décomposition); 20 - = -^3° dans le diméthylformamide. On dissout le produit ainsi obtenu dans 500 ml d'un mélange d'acide acétique et d'eau dans le rapport 8:2 et on chauffe pendant 20 minutes à 90°. On évapore, on lave le résidu à 1'éther diéthylique et on le sèche 35 sur hydroxyde de sodium sous vide poussé. On obtient ainsi le triacétate de H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- 70 03113 ^ 2034513 20 Pro-NHg fondant à 180° (avec décomposition); = -66° dans l'acide acétique. Séquence partielle DE: Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn- Asn-Tyr-NHNHg 5 a) Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe On refroidit 50 ml de diméthylformamide à -20°, on ajoute 8,2 ml d'une solution 2,3 N d'acidé chlorhydrique dans du dioxanne et on y dissout 4,3 g de Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-NH-NH2. On ajoute ensuite goutte à goutte, à une température de -20°,. 1,3 ml 10 d'un mélange à parts égales de nitrite de tert.-butyle et de dioxanne, on ajoute d'abord 3,5 ml de triéthylamine puis 4,5 g de h-Lys(B0C)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-0Me dans 200 ml de diméthylformamide. On agite pendant 3 heures à la température ambiante et ensuite on filtre. On évapore le filtrat et on pulvérise le 15 résidu avec de l'acétate d'éthyle. Après filtration et lavage à l'acétate d'éthyle et à l'eau, on obtient le Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp- Lys(BOC)-Asn~Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe fondant à 240° (avec décomposi-20 tion); = "2° dans le diméthylformamide. b) !rt-Ser3Ala-Tyr-Trp-Lys(B0C)-Asn-Leu=Asn-Asn-Tyr;:NHNH2 20 (séquence partielle DE) On dissout 6 g de Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(B0C)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-OMe dans 60 ml de diméthylformamide, on ajoute 6 ml d'hydrate d'hydrazine et on laisse reposer pendant 2 jours à la température ambiante. On évapore ensuite le solvant, on triture 25 le résidu avec de l'eau et on le lave à l'eau et à 1'éther. On obtient ainsi le Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr- 20 NHNH2 (séquence partielle DE) fondant à 244°; [a]-p = -9° dans le diméthylformamide. Séguence ga-rtielle_ABCDEj> H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC )-Asn-Leu-Asn-3° Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 a) Trt-Ser-Ala=Tyr-Trp-Lys(BCC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly=Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 On dissout 10,5 g de Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOCj-Asn-35 Leu-Asn-Asn-Tyr-NHNH2 dans 200 ml de diméthylformamide, on refroidit à -20° et on ajoute une solution d'acide chlorhydrique dans du 70 03113 26 2034513 dioxanne. On ajoute ensuite goutte à goutte 1 ml de nitrite de tert.-butyle et on réunit avec une solution contenant 10,5 g de H-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 et 15 ml de triéthylamine dans 100 ml de diméthylformamide. Au bout 5 de 2 heures on fait précipiter la solution par de 1'éther et on lave au chloroforme et à l'eau. On obtient ainsi le Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC )-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly- OQ Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg fondant 242°; = -^3° dans le diméthylformamide. 10 b) H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(B0C ) ^Asn~Leu—Asn—Asn—Tyr—His—Arg—Ph.e= Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (séquence partielle ABCDE) On dissout 15 g de Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-15 Pro-NH2 dans 500 ml d'acide acétique à 80$ et on abandonne pendant 2 heures à 40°. On évapore et on traite par de 1'éther; on obtient ainsi le diacétate de H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu- Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro- 20 NH2 (séquence partielle ABCDE) fondant à 238°; [ot]^ = -23° dans 20 l'acide acétique. Séguence partielle ABCDEF: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val- Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 25 ' On dissout 1 g de nonapeptide (séquence partielle F) dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 1,5 g de N-hydroxysuccinimi-de et 0,52 g de dicyclohexylcarbodiimide,on agite pendant 6 heures à 25°, on filtre et on évapore le filtrat jusqu'à siccité. On lave le résidu avec de l'acétate d'éthyle et de 1'éther diéthyli-30 que et on le sèche. On obtient ainsi le B0C-Cys-Ser-Asn-Leu-3er-Thr-Cys-Val-Leu-0-Su fondant à 242°. On dissout le produit ainsi obtenu dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 3,1 g de diacétate de tricosapeptide (séquence partielle ABCDE) et 1,2 g de N-hydroxysuccinimide et on agite pendant 16 heures à 25°. On éva-35 pore à siccité, on lave le résidu à 1'éther diéthylique, au chloroforme et à l'acétone. On obtient ainsi le dotriacontapeptide 70 03113 27 2034513 brut protégé que l'on dissout dans 50 ml d'un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau dans le rapport 70:30:5. On verse la solution ainsi obtenue sur une colonne de gel de silice de 5 cm de diamètre et 100 cm de hauteur,' équilibrée avec le mélange indi-5 qué ci-dessus. L'élution est effectuée avec des concentrations ■ croissantes de méthanol. On évapore les fractions réunies qui contiennent le peptide pur, puis on lave à 1'éther diéthylique et on sèche sur hydroxyde de potassium sous vide poussé. On obtient ainsi l'acétate trihydraté de BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-10 Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser- Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHp (séquence partielle ABCDEF) 20 fondant à 240° (avec décomposition); [a]^ = -40° dans un mélange d'acide acétique 1 N et de méthanol dans le rapport 2:1. L'hydrolyse totale (acide chlorhydrique 6 N, pendant 15 16 heures) donne la composition suivante en acides aminés: Alai,l' ArEl,o' ftsp3,9' CyS//2lJ6J Glul,2' Gly3,0' Hlsl,I* Leu2,9' Lyslj0' Mefcl,0' Phe2,0' ?ro2,l' Ser3,8' Thrl,9' Tyrl,9' Val 0,9 (Trp 1,0 par spectrophotométrie). 70 03113 28 2034513 REVENDICATIONS 1.- Nouveau polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-5 Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe- (I) Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 ainsi que ses sels d'addition d'acides et ses complexes de métaux lourds. 2.- Un procédé de préparation du nouveau polypeptide de 10 formule I spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre des méthodes généralement connues pour la synthèse de composés de ce type, et, le cas échéant, on transforme ensuite le polypeptide ainsi obtenu en ses sels d'addition d'acides ou en ses complexes de métaux lourds. 15 3-- Un procédé de préparation du nouveau polypeptide de formule I spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on élimine les groupes protecteurs à partir du polypeptide de formule BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-20 Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe- Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH^ et, le cas échéant, on transforme ensuite le polypeptide ainsi obtenu en ses sels d'addition d'acides ou en ses complexes de métaux lourds. 25 4.- Un procédé de préparation du nouveau polypeptide de formule I spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on condense le BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, après activation préalable, avec le H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOCJ-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-30 NH2, et, à partir du composé ainsi obtenu qui répond à la formule BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Lys(BOC)-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 on élimine les groupes protecteurs, et, le cas échéant, on trans-35 forme ensuite le polypeptide ainsi obtenu en ses sels d'addition d'acides ou en ses complexes de métaux lourds. 70 03113 29 2034513 5.- Un médicament exerçant, notamment, une action hypocalcé-miante et caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, un nouveau polypeptide répondant à la formule H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Gys-Val-Leu-Ser-Ala-5 Tyr-Trp-Lys-Asn-Leu-Asn-Asn-Tyr-His-Arg-Phe- Ser-Gly:—Me t-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 à l'état de base libre, ou sous forme d'un sel d'addition d'acides ou de complexe de métal lourd acceptables du point de vue pharmaceutique. 10 6.- Une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient, outre le principe actif spécifié à la revendication 5, les excipients et véhicules acceptables du point de vue pharmaceutique .