2ÙiÙÛ2è La demanderesse a découvert que certaines poly-hydroxyphénylchroatones, par exemple la silymarine, ont un effet protecteur et stabilisateur sur les biomeœbranes intracellulaires» siège du cytométabolisme, et constituent, en raison de cette 5 action, des médicaments d'un grand intérêt. Les suggestions faites jusqu'à présent pour isoler ces composés en laboratoire ne peuvent trouver d'application à l'échelle industrielle, du fait que la matière première, c'est-à-dire le fruit du Silybum marianum Gaertn0, renferme jusqu'à 30% 10 d'huiles grasses ainsi que des produits secondaires difficiles à éliminer, et que l'on ne peut obtenir que des concentrés huileux dont le traitement ultérieur est extrêmement difficile. A ceci s'ajoute encore le fait que cet isolement est extrêmement long et qu'il nécessite l'utilisation de différents solvants que l'on 15 introduit isolément et successivement à plusieurs reprises pour éliminer les produits secondaires inactifs et les huiles grasses. C'est ainsi que la méthode classique de dégraissage par extraction nécessite plusieurs jours et est dans la plupart des cas insuffisante. 20 Si,par contre» on renonce à un dégraissage total et que l'on modifie la façon d'opérer de manière à pouvoir utiliser une matière première renfermant de 5 à 10^ de corps gras, le dégraissage peut s'effectuer par action d'une pression élevée9 de préférence en utilisant des presses hélicoïdales comme celles 25 que l'on emploie pour les graines oléagineuses, ce qui permet d'éliminer 20 à 25f6 de l'huile grasse sans perte de substance active. Cette méthode de dégraissage permet également d'éviter le broyage habituellement nécessaire, la pression élevée 30 et 1*écrasement dans la presse hélicoïdale provoquant un éclatement de l'édifice cellulaire suffisant pour faire passer rapidement et totalement les substances actives dans le produit d'extraction» Toutefoiss du fait de la présence de l'huile 35 grasse résiduelle, il fallait trouver un agent d«extraction daas lequel les huiles grasses comme les substances actives soient particulièrement solubles. A cet égard l'acétate d*éthyle s'est révélé être le mieux approprié. Il permet en effet une extraction totale en l'espace de 24 heures seulement, alors que l'ex*» 40 traction en laboratoire à l'aide d'acétone nécessite 14 jours. 69 18088 2 2010Ô2ê Bien que l'on obtienne après évaporation de 1*acétate d'éthyle une boue huileuse en partie grumeleuse renfermant de 20 à 300 de .substance actives il était toutefois nécessaire, afin, d'éviter des traitements répétés à l'aide de différents sol-5 v&ats, de tenter de séparer les substances actives des produits secondaires et des huiles .grasses à l'.ai&e d'im procédé de partage entre deux phases liquides en partie miscibles»» La découverte d'un système- de solvants approprié se heurta Ics.gtsnps au fait que dans - tous les systèmes à deux 10 phases étudiés, le coefficient de .partais G-^ «lu mélange constitué par les produits secondaires et l'huile grasse et le coefficient de partage des substances actives conduisaient à vm facteur d© séparation ^ si petit que le- nombre élevs des opérations.dgfeépara-tion nécessaires aurait entraîné des frais 'û * installation excessifse 15 Dans le système aétiiamol/sther de pétrole ■{ 40-60°) étudié en. dernier lieu, les coefficients - de partage Gg = 0,25 et Sy = 0,038 correspondant - à ma concentration d© 2}6 de la substance conduisaient à un facteur de séparation jh de lsor° dre de 6,5» ce qui aurait- encore nécessité théoriquement environ 20 20 opérations successives de séparation pour obtenir un enrichisse-aeat de 70 à 80$® toutefois la mise en setsvre pratique de cette séparation a tais en évidence .un déplacement très important entra les pïases du système, les essais- effectués pour le réduire par addition d'eau ont été couronnés de succès? 25 Le système ternaire méthaaol/eau/éther de pétrole étudié• ensuite se révéla, utilisable6 Le m43.sr5.ge optimum méthanol/ cau/éther de pétrole s8avéra finalement être un mélange de méthanol et d'eau (S5.s 5) constituant la phas? inférieure, en équilibre avec de 1'éther de pétrole pur (40 - .60®)» lté système se trouvant 30 L'utilisation pratique ds système seloa 1*invention a permis de découvrir que d'une manière surprenante, il suffit 35 us 6 opérations successives pour obtenir un enrichissement en substance active de 70 à 80#© Lors de la mise en oeuvre de ce procédé de partage multiplicatif qui peut -être effectué par charges successives ou en continu, et s'effectue de préférence à contre-courants 40 les- substances actives ,s5 accumulent dass JU, phase inférieur-* et gAD ORIGINAL1 69 18088 3 2010026 peuvent être soutirées avec elles à la sortie de 1»installâtion„ Dans le cas d'opérations effectuées en continu, on utilise 6 étapes distinctes comportant chacune par exemple l'utilisation d'un séparateur centrifuge et d'unékulsificateur montés 5 l'un derrière l'autre de manière que la substance active purifiée s'écoule de façon continue avec la phase lourde, tandis que la phase supérieure, acheminée en sens inverse de la phase inférieure, s'écoule à l'extrémité opposée de l'installation après être passée par 6 étapes d,émulsification et de séparation® 10 On obtient un rendement du même ordre dans une installation à colonne comportant un nombre théorique de plateaux compris entre 10 et 12 (calculé à partir de la hauteur par imité de transfert)» Sans les deux façons de procéder on peut aussi 15 bien introduire la substance à l'entrée de l'installation, selon Jantzen, qu'au milieu, selon Van Dylc. Cette introduction se fait de façon à obtenir une solution à 2# dans la phase inférieure0 Apres la séparation, on recueille les substances actives purifiées par évaporation de la phase inférieure, sous forme 20 d'un produit sec de couleur beige. Ce produit renferme de 70 a 80$ de silymarine et peut être utilisé directement sous cette forme ou après une purification ou une séparation plus poussée. ]Da séparation par chromatographie en couche mince de la silymarine obtenue met en évidence, sur des plaques de 25 polyamide, en utilisant un éluant chloroforme : méthanol : méthyl- éthylcétone (60:14:26) et une solution révélatrice à 1$ de dinitro- phénylhydrazine, quatre substances 1, II, III et IV nettement séparées l'une de 1'autre« la structure de la substance présentant la 30 plus grande valeur de E^, que nous appelerons silymarine 1, a pu être élucidée. Cette substance présente la formule brute C25H22°10 et est ^ 5,7-dihydroxy-2-(3'-méthoxy-4*-hydroxyphényl)- chromanon-3-ol, substitué en position 7 par un reste CgHgO^. Son point de fusion est de 167°C0 vi les structures des autres substances II, III encore et IV n'ont pas/été élucidées; elles sont toutefois séparables par chromatographie en colonne et par cristallisation. Elles présentent toutes, comme la silymarine I, la meme activité pharmaco— logique» 40 leur grande similitude pharmacologique auto- 69 18088 4 2010026 rise donc à conserver pour le mélange des substances X II, III et IV obtenu selon le procédé de l'invention cette désignation ds silymarine et à désigner les composés isolés sous les termes de silymarine I, silymarine II, silymarine III et silymarine IV, 5 La silymarine I peut être séparée directement par cristallisation de la phase inférieure qui s'écoule de l'installation de séparation. À cet effet on concentre d'abord la phase inférieure après traitement au charbon actif de manière qu'après élimination du charbon actif, la silymarine I cristallise 10 lorsque l'on poursuit cette concentration. L'obtention des polyliydrozyphénylchromones, en particulier celle de la silymarine ou de ses dérivés, comprend ainsi, selon l'invention, les différentes étapes suivantes s 1. Extraction de la majeure partie des huiles grasses 15 sous pression élevée, de préférence dans uns presse hélicoïdale0 20 Epuisement total des résidus de pressage renfermant encore de l'huile à l'aide d'acétate d'éthyle, évaporation du solvant et récupération d'un premier extrait huileux et boueux. 3. Partage multiplicatif en continu de ce premier 20 extrait au moyen du système de solvants conforme à l'invention et récupération d'un produit sec renfermant de 70 à 80$é de silymarine. 4« Séparation éventuelle de la silymarin® I par cristallisation de la phase inférieure et récupération des autres polyhydroxyphénylchromones à partir des eaux-mères« 25 EXEMPLE : 1) Dans une presse hélicoïdale pour graines oléagineuses, on débarrasse sous pression élevée 100 kg de fruits secs de Silybum marianum de la plus grande partie de leurs huiles grasses?, On obtient environ 75 à 80 kg de résidu de pressage, renfermant de 30 5 à 10$ d'huile résiduelle» 2) On soumet 80 kg de ce résidu de pressage à une extrae» tion à l'acétate d'éthyle jusqu'à épuisemento Après évaporation de l'acétate d'éthyle on obtient de 5 à 6 kg d'un résidu se® constitué par une boue huileuse en partie grumeleuse renfermant de 20 35 à 30?É de substance active» 3) On dissout ce résidu sec, dans la proportion de 2$, dans la phase inférieure du système laéthaiiol/eau (95s 5)/éther de pétrole (40 - 60°) amené à l'équilibre, et on le soxiaet à une centrifugation pour en séparer les matières solides floconneuses© 40 le volume final de la phase inférieure est d3environ 300 pitres® ÇAD ORIGINAL 69 18088 2010026 On monte en série 6 séparateurs centrifuges distincts adaptés à la séparation de deux liquides en intercalant à abaque fois entre eux une étape d*émulsification, et l'on fait circuler la phase inférieure en sens contraire de la phase supérieure, 5 l'étape d*émulsification servant à émulsionner ensemble les deux phases de manière à permettre les échanges de matières,, Dans, l'étape de séparation suivante l'émulsion est à nouveau séparée en phases lourde et légère. La circulation des deux phases se fait de manière que la phase supérieure qui vient d'être séparée arrive 10 chaque fois à l'étape d*émulsification précédente en sens contraire de la phase inférieure» Les phases supérieure et inférieure sont d'abord introduites en continu et en 3«b~ contraire dans le dispositif de séparation, sans charge de substance active, de manière que l'éqiii» 15 libre des phases s'établisse» On introduit alors en continu dans la phase inférieure, au fur et à mesure de son écoulement, la solution à 2?6 de substance active. Lors de son introduction à l'entrée de la phase inférieure, il faut prendre soin que le rapport en volume global de 1 ;1 de la phase supérieure à la phase inférieure 20 ae soit pas Modifié» La vitesse d'écoulement des deux phases dépend dans une large mesure du rendement des agrégats d'émulsion et des séparateurs. Le réglage optimum peut être déterminé par détermination quantitative gravimétrique du taux de transfert du produit » 25 La phase inférieure recueillie à la sortie du dispositif de séparation (environ 300 litres) est séchée sous un vide de 20 n.m de mercure et donne une poudre beige ou brunâtre avec un rendement en poids de 3,1 kg. Cette poudre renferme entre 70 et 80JÉ de substance active (silymarine), ce qui correspond à un 30 rendement en substance active de 2,2$ rapporté au produit de départ© 4) Dans le cas où l'on veut récupérer directement la silymarine I à partir de la phase inférieure, on reoueille cette phase inférieure à la sortie du dispositif de séparation (environ 300 litres), on l'additionne de ï^ de charbon actif, puis on 35 la concentre sous un vide de 20 ai de mercure jusqusà 100 litresc La solution encore chaude est filtrée sur filtre-presse, puis à nouveau concentrée. A paruir d'un volume compris entre 50 et 30 X3.œ très, une sristailisation croissante s'amorce. Suivant le degré de concentration on obtient ua produit de cristallisation dont la 0012= 40 leur varie entr® le blanc et l^oere© 89 18088 s* 9 2010026 Ce p.rod'uit de cristallisation présente un point de fusion compris entre 167 et 169° « Il est constitué par de la silymarine I dont le degré de pureté est compris entre 95 et 100$o Les eaux-mères qui rèsteni après séparation dm pro-5 duit de cristallisation, et qui renferment de la silymarine II, IIÏ et IV, sont concentrées à see sous un Tide de- 20 mm de mercure0 les polyhydroxyphénylchrcaiion&s obtenus selon le procédé de l'invention ont montré, dès les premiers essais expérimentaux effectués sur animaux* une action protectrice prononcée 10 contre les lésions hépatiques» Le degré d'une lésion hépatiquef provoquée par exemple par du tétrachlorure de carbone 8 pemt St-re déterminé entre autres par la durée du soismeil provoqué par l'feiaxQbarbital. Du fait que les cellules hépatiques endoasiagées ne perev-ent pas décomposer assez rapideaeat l'hexobarfeital, la - du?éâ fis. seaaieil ©et considérablement augmentée. Mais si l'on administra auparavant de la silymarine, oa observe une réduction.de 59? 2$ fia astte prolongation ds la durée du sommeil, e8est~à-dire une aetioia de la silymarine antagoniste de celle du tétrachlorure ds carbone.; 29 Un foie endommagé par du tétracIiLorure ds carton# ne peut également plus décomposes/ que ^..nière réduits 1*acide p-hydroxyphénylpyruviqus, qui doit par ©aiw^çaoïat se trouver en plus grande quantité dans l0ua?±n@o Des rs/l-.» non traités ont éliminé, en l'espace de 4 heures, 10$ de la srëninistrée, tandis que gjj des "rats intoxiqués -par du ié'yi'SLuhJ.or-m'e de- carbone en éliminaient 2C$; cependant, ■ si on leur avait administré auparavant de la silymarine l'élimination redevenait h.o?m&1cs 38esi"à=dire comprise entre 8 et 10JÈ» Gea' animaux se comportèrent. comme si le tétrachlorure de carbone n'avait donné lieu.à aucune lésion hépatique® *50 Dans le test à l3 alcool alljlique .de E&S&' la silymarine provoque un© réduction d5 env 5Gp des aires de nécrose» Bans des essaie à 1 * Sa lésion hépatique qui se deTeloppe 4G pa^ administration prolossée. d® est également coe= gAD ORKàlNAL 69 18088 7 2010026 "battue par 1*administration simultanée de silymarine„ Selon la dose de silymarine, on a pu observer une forte inhibition de la perte de poids et un prolongement considérable du temps de survie,, Sur ces entrefaites on a pu expliquer, en particulier 5 grâce à des études effectuées au microscope électronique, sur quoi repose cette protection qui, de façon surprenante, s'exerce avec efficacité et d'une manière égale vis-à-vis des intoxications les plus variées» Des lésions expérimentales au tétrachlorure de car-10 bone provoquent dans les foies des rats une modification hiàologi-. que comparable à celle observée dans l'hépatite de l'homme. Des clichés réalisés au microscope électronique montrent des modifications de structure dans, les cellules parenchyxnatiques, une destruction et un gonflement affectant la surface et l'intérieur des mito-15 chondries et une diminution du réticulum endoplasmatique, des raba-somes et du glycogène. Ces altérations sont à attribuer a* fait que le tétrachlorure de carbone endommage les membranes extra et intracellulaires qui entourent la cellule et les différentes particules endoplasmatiques, étant donné que toute altération de ces 20 biomembran.es modifie le déroulement normal d'une ou plusieurs fonctions partielles et conduit à une émission de ferments et d'autres produits, «t à une pénétration des produits nocifs» Dans les foies des rats auxquels on avait administré ie la silymarine avant le tétrachlorure de carbone il n'a plus été 25 observé de lésions des organicules de la cellule parenehymatiquej les mitochondries et le réticulum endoplasmatique présentaient une structure normale et le glycogène était distribué normalement dans les cellules parenehymatiques® La silymarine a donc empêché que les biomembranes soient endommagées et que 1'ultrastructure et le 30 métabolisme des cellules soient modifiés» Cette action protectrice de la sylimarine vis—à—vis de la structure cellulaire et du ejtométabolisme s'est également trouvée confirmée par de nombreux-autrës essaiso D'autre part des lésions déjà existantes on pu être 35 restaurées par la silymarine» On a pu prouver, par microscopie électronique, que la structure des mitochondries êt du réticulum endoplasmatique, très endommagée après administration d* «,-amani-tine, était complètement restaurée par la silymarine® Cette restauration de l'intégrité signifie que la silymarine n'exerce 40 pas seulement une action protectrice mais encore \me action stabi 69 18088 8 2010026 lisante,. Cette action directe sur les éléments structuraux des cellules du foie constitue donc un principe thérapeutique complètement nouveau, 5 Dans plus de 600 cas d'hépatite chronique9 d'états post-hépatitiques et de cirrhose du foie, on a pu observer, après administration quotidienne de 0,2 g de silymarine pendant en moyenne 5 semaines, une régression de plus de 60#, les examens fonctionnels du foie les plus importants ont révélé une régression 10 en moyenne deux fois supérieure à celle constatée dans un groupe de comparaison soumis à tin traitement usuel. Dans le cas de fois gras la biopsie a permis de constater une gaérison dans 67# des cas après un traitement à la silymarine, et dans seulement 40# des cas dans un groupe de comparaison, 15 Dans tous les cas on a observé en peu de temps une amélioration de l'état général, une diminution du météorisme et de la sensation de tension dans la partie droite de 1'épigastre, ainsi qu'une augmentation de l'appétit, du poids et des forces® Il n'a pas été observé d'action secondaire même après un traitement 20 de longue durée0 69 18088 9 2010026 BEVBtDICATIOliS 1» Procédé d'obtention de polyhyâroxyphénylehromones qui présentent la propriété de stabiliser la structure cellulaire et le cytométabolisme, caractérisé par le fait que l'on soumet des 5 fruits secs de Silybum marianum Gaertne à une pression mécanique élevée, de préférence dans une presse hélicoïdale, de manière à en extraire la majeure partie de l'huile grasse, que l'on soumet le résidu de pressage renfermant encore 5 à 10# d'huile à une extraction totale à l'aide d'acétate d'éthyle, que. l'on élimine l'acétate 10 d'éthyle par évaporation, que l'on dissout le résidu sec formé d'une boue huileuse en partie grumeleuse renfermant 20 à 30# de substance active dans la phase inférieure d'un système de solvants approprié à la séparation des produits secondaires indésirables et constitué par exemple essentiellement de méthanol et d'éther de 15 pétrole, cette dissolution se faisant à raison de 2# en poids de résidu sec, qu'on soumet la solution obtenue à une centrifugation de manière à la débarraser des particules solides floconneuses, qu'on lui fait subir dans ce système de solvants un partage multiplicatif et de préférence continu à contre-courant, et qu'enfin, 20 soit on soumet à une concentration sous vide la phase inférieure recueillie, ce qui permet d'obtenir une poudre renfermant 70 à 80# de polyhydroxyphénylchromones, soit on sépare directement la silymarine de cette phase inférieure par cristallisation» 2„ Procédé selon la revendication 1, caractérisé par 25 le fait que l'on utilise pour la séparation un système de solvants ternaires méthanol/eau/éther de pétrole (40-60°) dans la proportion en poids 95/5/100o 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'on utilise un dispositif de 30 séparation constitué de plusieurs, par exemple six paires d'émulsi-ficateurs et de séparateurs, l'acheminement se faisant de manière que la. phase supérieure séparée dans un séparateur parvienne en sens contraire de la phase inférieure, à l'étape d'émulsification qui la précède à chaque fois, et que l'on introduit de manière 35 continue la solution à 2# de substance active dans la phase inférieure au fur et à mesure de son écoulement, en prenant soin que le rapport des volumes globaux de la phase supérieure à la phase inférieure reste toujours égal à 1/10 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 40 précédentes, caractérisé par le fait qu'à la sortie du système, on 69 18088 io 2010026 mélange la phase inférieure avec environ 0,5# de charbon actif, qu'on la concentre ensuite sous un vide de 20 mm Hg jusqu'à 1/3 de son volume initial, que l'on filtre la solution encore chaude sur un filtre-presse et qu'on la concentre à nouveau jusqu'à 1/6 5 à 1/10 de son volume initial de manière à provoquer, la cristallisation de la silymarine, que l'on sépare ensuite,, 5. Médicament présentant une action stabilisante vis-à-vis de la structure cellulaire et du cytométabolisme, caractérisé par le fait qu'il renferme une ou plusieurs des poly- 10 hydroxyphénylehromones obtenues selon l'une au moins des revendications précédentes» 6. Médicament présentant une action stabilisante vis-à-vis de la structure cellulaire et du cytométabolisme, caractérisé par le fait qu'il renferme de la silymarine0