I 7.1 0Ô663 1 2085702 la présente invention concerne une nouvelle famille de substances antibiotiques et un procédé pour leur préparation. Spécifiquement, ces nouveaux antibiotiques sont des produits du type céphalosporine qui contiennent un substituant r.iéthoxy 5 à la position 7 du noyau "céphem"* Ils sont structuralement apparentés à la série des composés céphalosporines, n».is, 'h la différence de la céphalosporine 0 qui contient seulement une portion D-5-amino-5-carboxyvaléramido à la position 7, lea présents produits contiennent un substituant 7-méthosy ; 10 et, tandis que la céphalosporine G est substituée par un groupe acétoxyméthyle à la position 3 du noyau, les produits de la présente invention peuvent contenir, en plus du groupe acétoxyméthyle, une grande variété d'autres substituante. Des exemples de ces substituants sont, notamment, des groupes 15 méthyle, halogénométhyle, hydroxyméthyle, une portion acyloxy-méthyle de la variété aliphatique, acyclique et aromatique, earbamoyloxyméthyle, c&rbamoyloxyméthyle H-substitué et !T,N~ disubstitué, alcoylthiométhyle, thiométhyle'à substitution hétérocyclique, trialcoylammoniumméthyle, pyridiniumméthyle, 20 pyridiniumméthyle substitué au noyau, .thio-uroniumméthyle, «nidinothiométhyle oîi les deux atomes d'azote peuvent être substitués par 1 à 3 radicaux alcoyles, aminothiocarbonyl-thiométhyle, aainothiocarbonylthiométhyle N-substituéj ivojl-thiométhyle, oxythiocarbonylthiométhyle, alcarylstilfonyl-25 méthyle, azidométhyle, aminométhyle, amidométhyle. poly-hydroxybenzyle, N-alcoyl inférieur-indol-3-ylméthyle et thiocyanatométhyle. Ces produits peuvent être représentés comme suit t 0 OCH, il X s h00c-ch- ( chg ) - ^ \ i j H C&,ït 000H oîi R est de l'hydrogène, un halogène, par exemple le chlore, le 30 brome, le fluor ou l'iode, etc.»., un groupe hydroxy, anyloxy, par exemple alcanoyloxy inférieur comme acétoxy, n^pre-oionyloxy, 71 08668 2 ,2085702 etc..,, (aromatique monocyclique et bicycllque)-carbonyloxy» par exemple benzoyloxy, naphtoyloxy, etc.,., ear"boxyloxy à substitution hétérocyclique où l'hétérocycle est un hétérocycle hexagonal contenant de l'azote comme un noyau 4-pyridyle, etc.., 5 aralcanoyloxy comme phénacétyloxy, 3-phénylprûpionyloxy, 2-naphtylacétoxy ou hydrocinnanoyloxy, etc.,., cycloalcane» carbonyloxy contenant 5 ou 6 atomes de carbone dans le cycle, par exemple cyclbpentanecarbonyloxy ou cyclohexanecarbonyloxy, etc.., oc-méthoxy-p-sulfooxy-ciniiamoyioxy ou K-méthcxy-p-10 hydroxycinnamoyloxy, etc.,.; un radical carbamoyloxy ds la formule î -OOCNR^R2 où R* et R2 3ont choisis parmi l'hydrogkio, un groupe alooyle inférieur, par exemple méthyle, éthyle, n-propyle, tert-butyle, etc.., un groupe halogéno-alcoyle inférieur comme chlorométhyle, 2-chloroéthyle ou chloro-tert-butyle, etc.., 15 (alcoxy inférieur)-carbonyle comme é-fchoxycarbonyle, etc.»., aryle, par exemple aryle monocyclique ou bicyclique connue phényle, naphtyle, etc..*., alcarylsuifonyle, par exemple alcarylsulfonyle monocyclique comme p-tolylsulfonylef etc.», et benzhydryle, ou, pris en même temps que l'atome d'asote sur 1 2 20 lequel ils sont fixés, R et R peuvent être reliés pour former un hétérocycle monocyclique tel que pyrrolidinyle , pipéridino ou morpholino ; un radical thio de la formule i -3R^ dans laquelle R^ est un groupe alcoyle inférieur tel que méthyle, éthyle, n-propylet etc.., hétérocycle contenant 25 de l'azote, par exemple pyridyle, comme 2-, 3- ou 4-pyridyle, un groupe thiazolyle à substitution alcoyle inférieur comme 4-méthylthiazol-2-yle ou 4-éthylthiazol-2-yle, etc.., 1,3,4-tniadiazol-2-yle, un groupe 1,3,4-th±adiazol~2-yle à substitution alcoyle inférieur comme 5-méthyl-l,3,4-thiadiazol-2-yle, 30 etc.., 2-benzothiazolyle, un groupe 4-alcoyle inférieur-pyrimi-dinyle comme '4-méthylpyrimidin-2-yle ; un radical ammonium, par exemple tri-(alcoyle inférieur)-amiBonium comme triméthyl-ammonium ou triéthylammonium, etc..., ou un radical pyridinium de la formule ; V1 35 -H' \ ~\ t bad original 71 08668 3 2085702 dans laquelle Z* est l'hydrogène, un halogène ou un groupe trifluorométhyle, cyano, carboxy, carbamoyle, carbamoyle à substitution IT-alcoyle inférieur ou N,N-di(alcoyle inférieur) comme N-méthyl-carbamoyle, IT-éthyl-carbamoyle, 3J,H-diméthyl-carbamoyle, H,N-diéthylcarbamoyle ou N,îT-di—isopropylcarbamoyle, carboxyméthyle, alcanoyle inférieur comme acétyle ou propio-nyle, etc.., alcoyle inférieur comme méthyle, éthyle ou n-propyle, etc..., hydroxymé thyle ou sulfo, c'est-à-dire -SC^(OH) : 10 un radical thio-uronium de la formule : -S-C un radical amidinothio de la formule : -S-CK JTR4- * dans laquelle R^, R^et R^ sont identiques ou différents et 15 choisis parmi l'hydrogène ou un radical alcoyle inférieur comme méthyle, éthyle, n-propyle, etc...; un radical amino- s H 70 thiocarbonylthio de formule : -SCNR'R rj o dans laquelle R' et R sont identiques ou différents et choi-20 sis parmi l'hydrogène, un groupe alcoyle inférieur comme méthyle, éthyle, n-propyle, etc..., hydroxy-alcoyle inférieur comme 2-hydroxyéthyle, etc.., di-(alcoyl inférieur)-amino-alcoyle inférieur comme 2-(diméthylamino)éthyle, 2-(diéthyl-amino)éthyle, 2-(di-n-propylamino)éthyle ou 3-(diéthylamino)-25 propyle, etc..., morpholino-alcoyle inférieur comme 2-morpholino-éthyle, etc.., N-aryl-N-(alcoyl inférieur)-aminoalcoyle comme 2-(N-phényl-N-mé thylamino)éthyle ou, pris ensemble, les 7 o radicaux R et R peuvent être réunis avec l'atome d'azote sur lequel ils sont fixés pour former un radical morpholino, 30 pipéridino, pyrrolidinyle ou pipérazino de formule ï /~^ 9 -ïïr n-r" w dans laquelle R^ est un groupe alcoyle tel que méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, amyle, n-octyle, décyle, etc.., ou phényle ; aroylthio, par exemple aroylthio monocyclique comme benzoylthio ; un radical oxythiocarbonyl- 71 08668 4 2085702 thio de formule : S " 10 - S COR dans laquelle R^® est un groupe alcoyle inférieur comme éthyle, 5 n-propyle, isopropyle, n-butyle, n-hexyle, etc.., ou cycloalcoyle inférieur, c'est-à-dire cycloalcoyle contenant 5 ou 6 atomes de carbone dans le cycle comme cyclopentyle et cyclohexyle ; alcarylsulfonyle, par exemple alcarylsulfonyle monocyclique comme p-tolylsulfonyle, etc...; azido ; amino ; un radical 10 amido de formule : -NHR11 dans laquelle R^ est un radical acyle tel que, par exemple, alcanoyle inférieur comme acétyle ou propionyle ou aralca-noyle comme, par exemple, aralcanoyle monocyclique comme 15 2-phénylacétyle, etc„..î polyhydroxyphényle, par exemple di-hydroxyphényle comme 2,4-dihydroxyphényle ou un radical N-alcoyle inférieur-indol-3-yle comme N-méthylindol-3-yle, etc..., ou thiocyanato. Sont inclus aussi les sels, esters et amides pharmacologiquement acceptables des présents produits, 20 Ces composés comprennent des sels organiques et inorganiques comme, par exemple, des sels d'addition d'acides, des sels de métaux, des sels quaternaires et des sels d'aminés dérivés de hases organiques tertiaires contenant de l'azote. Des dérivés esters et amides appropriés comprennent les mono- et diesters 25 comme ceux dérivés d'alcanols, de cycloalcanols, d'alcools aromatiques et d'aralcanols et des mono- et di-amides comme ceux dérivés de l'ammoniac, d'alcoylamines inférieures, de di(alcoyl inférieur)amines, d'aralcoylamines et d'aminés hétérocycliques. Des exemples de ces dérivés et des procédés 30 pour leur préparation peuvent être trouvés ci-après dans la partie intitulée "Procédés synthétiques". Antibiotique 810A : Essentiellement, les produits de formule I ci-dessus comprennent deux groupes de produits de fermentation. L'un d'eux est un mélange de composés à partir 35 duquel deux produits distincts ont été isolés et identifiés. Ces deux produits sont caractérisés par la présence d'une portion a-mé thoxy-p-sulf ooxycirmamoyloxy ou a-méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxy à la position 3 du noyau céphem et corres- 71.08668 5 2085702 pondent à la formule plane suivante î 0 OCH, .S HOOC-CH-(CH0 ) ~-C-ÏÏH—f ^ \ O I 2'3—C -] jj // \\ .12 TP i i v1 \ w ---v. • I~*"e-* * ♦*««* n «*■*-» 2VV w——V.-V-. — - I \ / -4 OCE, ^ U 'i/ii •> 12 dans laquelle R est Tin groupe hydro:xy ou Eulfcc:-"„ c!er:t-û-dire -OSO^H. Ces produits sont formés simultanément par culture dans des conditions contrôlées d'une nouvelle souche 5 d'actinomycète appelée MA-2837 dans la collection de cultures de Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. Un échantillon de cette culture a été placé aussi en dépôt permanent avec la collection de cultures de la "Northern Utilisation Research and Development Branch" du "Department of Agriculture" des 10 Etats-Unis d'Amérique à Peoria, Illinois, et on lui a attribué le numéro de culture NRRL 3851• Vingt-cinq autres euXturee ont été identifiées aussi comme produisant ce mélange antibiotique (la), et ces cultures, ainsi que la culture MA-2837, sont décrites ci-après dans la partie intitulée "Le micro-15 organisme". Ci-après, le mélange antibiotique (la) comprenant ces deux produits sera appelé Antibiotique 810 A eu nr.^p?: n« ment 81OA. Antibiotique 842A î Le deuxième grcrip© *9 --e fermentation comprend l'acide p-(D-5-amino-5-cargoy.yvalerami-15 do)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (Ib, ci-après) et ses sels» Ce composé a In forz-il* suivante ï 0 OCE, ifs H00C-CH-(CH0 ) -J.-C-UH—f —f 0 - T? I l -N ^ l on2 / 0 Ce produit (Ib) est formé aussi par une nouvelle couche 1'actinomycète et un échantillon de ce aieroorgaaisme-1 zr.velé \ \ 71 08668 6 2085702 MA-2908, a été placé dans la collection de cxiltures de Merck & Go., Inc., Rahway, New Jersey, Un échantillon de cette culture a également été placé en dépôt permanent avec la collection de cultures de la "Northern Utilisation Research and 5 Development Branch" du "Department of Agriculture" des Etats-Unis d'Amérique à Peoria, Illinois., On a attribué à cette culture le numéro de culture NRRL v80?. En plus de son activité antibiotique, ce produit (Ib) eBt aussi un produit intermédiaire dans la préparation des dérivés 3-hydroxy, 10 3-acyloxy et carbamoyloxy correspondants. le procédé pour la préparation de ces dérivés est décrit ci-après dans la partie intitulée "Procédés synthétiques". Ci-après, dans la présente description, le produit Ib, c'est-à-dire l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl-7~méthoxy-15 3-céphem-4~carboxylique, sera appelé Antibiotique 842A ou simplement 842A. Activité Une difficulté majeure dans le traitement antimicrobien est la sensibilité de la plupart des antibiotiques à la 20 dégradation enzymatique. La Pénicilline G, par exemple, eet efficace contre une grande variété de micro-organiemes Gram- positifs et Grara-négatifs, mais en présence de rénicillinase elle est dégradée à une forme qui est Inefficace contre la plupart de ces agents pathogènes. 25 Une voie en vue de la résolution de ce problème a été la découverte de nouveaux antibiotiques oui contiennent le noyau "céphem" caractéristique de la céphalosporine C. La céphalosporine C possède une résistance, inhérente à la péni-cil3inase et est active contre des bactéries tant Gras-négatives 30 que Gram-positives j toutefois, el3e est seulement modérément active et il existe des enzymes autres que la pénicillinase qui ont pour effet de détruire son activité, Ces enzymes sont appelées céphalosporinases. Les produit? (I) de la présente . invention font montre d'une résistance non seulement h la 35 pénicillinase, mais également aux cépbalçeporixasee. Ils présentent une activité contre des bactéries tant Grsm-né'gatives que Gram-positives, mais l'ordre d'activité et 3.'éventail. d'organismes contre lesquels ils sont efficaces ne sont par BAD ORIGINAL 71 08668 7 2085702 identiques. L'Antibiotique 842A est caractérisé par une activité accrue contre des micro-organismes Gram-négatifs. A la différence de la céphalosporine 0 qui a une activité antibactérienne 5 relativement faible, ce produit présente un effet important in vivo sur les micro-organismes Gram-négatifs avec une puissance qui, en général, est supérieure à celle de la céphalo-thine. Cette activité comprend une efficacité in vivo contre Proteus morganii et une efficacité contre les bactéries 10 G-ram-négative s suivantes : Es chéri chia çoli, Proteus valgaris. Proteus mirabilis. Proteus morganii. Salmonella schottmuelleri. Klebsiella pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B et Paracolobactrum arizoniae » L'Antibiotique 842A constitue un mode de réalisation 15 préféré de la présente invention. En plus d'un effet G-ram-négatif généralement accru et d'une puissance accrue par rapport à céphalothine et d'une plus grande résistance aux céphalosporinases, le 842A est caractérisé par un bas ordre de toxicité et produit des taux sanguins rapides. En moins 20 de 6 heures après l'administration, la quasi-totalité est éliminée dans l'urine. -En outre, il est plus résistant à la dégradation enzymatique que la céphalosporine C, la résistance à cet antibiotique se développe lentement et il est bactéricide. Administré oralement, il fournit une protection contre les 25 infections dues à Paracolobactrum arizoniae 3270, Proteus vulgaris 1810 et Salmonella schottmuelleri 3010 j et quand il est administré par voie sous-cutanée, il est de deux à dix fois plus efficace que la céphalothine contre les mêmes infections. 30 L'Antibiotique 810A est un agent à large spectre qui présente un effet Gram-positif et G-ram-négatif sensiblement équilibré. Cet effet comprend une activité in vivo contre les micro-organismes G-ram-négatifs suivants : Proteus vulgari-s. Proteus mirabilis. Salmonella pullorum, Escherichia coli et 35 Klebsiella pneumoniae et une activité in vivo contre les organismes Gram-positifs suivants î Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes et Dinlococcus pneumoniae. Parmi les divers produits constituant l'Antibiotique 71 08668 8 2085702 81 OA, le composé acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3- (ct-mé thoxy-p-sulf ooxy-cinnamoyloxymé thyl ) -7 -me thoxy-3-céphem-4-carboxylique, correspondant à la formule la ci-dessus, où R est un. groupe sulfooxy, et ses sels comme le sel de sodium, constitue ion mode de réalisation préféré de la présente invention. Oe produit a la formule plane suivante : O NE, O ÇGH* " 1 " \ S* H0C-CH-CH2-CH2-CH2-C-NE COOH 0 GI^0C-C=0E OCH, 3 le Ce composé a une plus grande résistance aux céphalosporinases que la céphalothine et est caractérisé par un bas ordre de toxicité pour les souris. En outre, il est plus résistant 10 à la dégradation enzymatique que la céphalosporine 0 et il est bactéricide. Administré oralement, il protège contre les infections dues à Proteus vulgaris et, quand il est administré par voie sous-cutanée, il est efficace contre diverses infections G-ram-négatives et Gram-positives. 15 Les micro-organismes Cultures de 81OA t Le micro-organisme qui produit l'Antibiotique 81 OA a été isolé initialement sous la forme d'une colonie unique à partir de terre. Cette colonie a été passée sur une plaque à stries de la composition suivante : 20 Milieu A Extrait de levures 10,0 g Dextrose 10,0 g Gélose 20,0 g Eau distillée 1000,0 cm^ 25 Après plusieurs jours de culture, le micro-organisme produit l'Antibiotique 81OA. Cet antibiotique a été ensuite reproduit dans des fioles à secousses et ses différences avec les antibiotiques connus ont été déterminées par diverses études biologiques et chimiques. La comparaison de ces résultats 30 avec ceux obtenus dans le cas d'autres antibiotiques connus 71 08668 2085702 a montré que le 81OA était une entité nouvelle. Taxonomie et morphologie du 61OA î le micro-organisme (Culture MA-2837) qui produit 1*Antibiotique 81OA a été identifié comme Streptoayces griseus0 la ia^oncs&c. utilisée dana cette 5 détermination est décrite dans le :'Hanual of Eeterminative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition, C J '1."T'h0 ActXTXO— mycetes", Vol. 2, par S.A. Vaksman (1361 )• Sn utilisant ce mode opératoire, on a trouvé que la culture était une souche de Streptomyces gris eus qui ressembla beaucoup axi Str^ctomyess 10 griseinus dans la description, la production de mélanine et l'utilisation du carbone comme décrit dans "The International Journal of Systemic Bacteriology", 7ème édition (1957) parce que le groupe de cultures de Streptomyces griseus a été divisé en 1959» deux ans après la publication de cette 15 édition» Toutefois, tant dans l'ouvrage de Waksman que dans 1* "International Journal of Systemic Bacteriology", Streptomyces griseinus est défini comme la "couche de Streptomyces griseus génératrice de griséine" ou comme "produisant de la griséine ou des substances similaires à la gri-20 seine", Streptomyces griseus (MA-2837) est une souche qui diffère de la description classique de Bergey et de Waksman en ce qu'elle possède un mycélium aérien qui est principalement d'un jaune tirant sur le tan et d'un jaune verdâire sur certains milieux et avec tin modèle légèrement difféxnînt 25 d'utilisation du carbone. Waksman, aux pages 111 et 133 MA-2837 par rapport à Streptomyces griseus comme déci-it dans Bergey» et Waksman.2 et aussi la caractérisation de î-Iâ-2837 par rapport à Streptomyces griseinus comme décrit dans vraks-aan sont indiquées dans les Tableaux I et la ci-après» TABLEAU I Comparaison de caractéristiques culturales d'une culture de MA-2837 7. * O -2837 Streptcmvoes griseus (Bergey ) Streptomycee p griseue (Waksman") Streptomyces *" 2 griseinus (Waksman ) Les sporophores sont à ramification monopcde formant des touffes, avec des chaînes de spores droites ou légèrement flerueuses. Les spores sont sphériques ou ovales, de tre à 0.9 °,9p * U2fl de diamè- en x'naînee de 10 k 15 spores eu-•iron. Hyphes végétatives de V9 ^ de largeur (Glyoéiol-rélose à l'asparagine-ï?CX) . Mycélium aérien ; Abondant, pulvérulent, vert d'eau. Sporophores produits en touffes. Spores sphéri-ques ou en forme d'ellipsoïdes, 0,8 sur 0,8 à 1,7 micron. Développement végétatif 1 colonies lisses ou repliées , incolore, devenant ensuite d'une couleur chamois olivâtre » Sporophores droits produits en touffes» Spores sphériques à ovales, 0,8 sur 0,8 à .1,7 micron; surface lisse. Sporophores droits produits en bouquets ou en touffes, sans spirales. Spores en forme de bâtonnets, de 1,0 à 1 ,8 sur 0,8 à 1 ,0 jJ. , "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey, 7&me édition (1957). Waksman, S.A., "The Actinomycetes", Vol» 2 (1961)» TABLEATJ la Comparaison de caractéristiques culturales d'une culture de MA-2837 Milieu MA-2837 S. griseus TBergey) S. griseus S0 griseinus (Waksman) (Waksman) Pâte de tomate- Développement végétatif : Gélose à la fa Envers brun, plat, s'éta rine d'avoine lant. Mycélium aérien : Centre allant d'une couleur tan à jaune-grisâtre. Bord : jaune tirant sur le tan. Pigment soluble : Tan. Glycérol- Développement végétatif s Gélose à l'as- Envers couleur de tan, paragine plat, s'étalant. Mycélium aérien î farineux jaune tirant sur le tan. Pigment soluble s jaune .clair tirant sur le tan. Gélose Czapek-Dox (gélose au nitrate de sucrose) Développement végétatif : Envers orangé jaunâtre, plat, s'étalant. ■Mycélium aérien: farineux, jaune tirant sur le tan Développement mince, s'étalant, incolore,devenant , chamois-olivâtre Mycélium aérien Développement de support ridé,envers de couleur crème à brunâtre.Mycélium aérien de couleur M O CD CT\ ON OO ro o 00 ui "vJ o M TABLEAU la (suite) h-* O 00 ON ON 00 Gélose à l'albumine d'oeufs Gélose nutritive Gélose (plusieurs teintes mais principalement jaune tirant sur le tan au bord) croissance faible au centre et plus importante sur les bords. Pigment soluble: jaune clair tirant sur le tan. Développement végétatif : Envers d'un tan grisâtre, platf s'étalant. Mycélium aérien: d'un jaune tirant sur le tan, développement peu important au centre et plus important le long, des bords. Pigment soluble : jaune clair tirant sur le tan. Développement végétatif : Envers d'un jaune brunâtre . Mycélium aérien: velouté, d'un jaune tirant sur le tan, bord d'un jaune tirant sur le tan. Pigment soluble : brun clair. Développement abondant,presque transparent, de couleur crème, mycélium aérien farineux,blanc épais, farineux, vert d'eau, pigment insoluble. Développement abondant, presque transparent, de couleur crème. Mycélium aérien farineux, blanc à gris clair. Pas de pigment soluble. blanche à crème avec une teinte légèrement verdâtre. Pas de pigment soluble. ro ro o oo VJl VJ. o ro Gélose synthétique Colonne de gélatine Gélose nutritive à la gélatine Lait tour-nesolé lait icrémé » Développement floconneux de couleur crème se déposant dans le fond du tube. Liquéfaction complète. Développement végétatifs crème. Mycélium aérien : jaune pâle tirant sur le tan. Pigment soluble s néant. Liquéfaction de la gélatine î bonne. Anneau partiel. Développement végétatif; brunâtre « Mycélium aérien: p eu important sblanchâtre Peptonisation devenant alcaline. Anneau partiel. Développement végétatif: "brunâtre .Mycélium aérien : néant. Pigment soluble: brun clair. Pepto nisation devenant alcaline TABLEAU la (suite) à gris clair. Pas de pigment soluble. Développement mince ,incolore,s'étalant ,devenant chamois-olive . Mycélium aérien épais,farineux, vert d'eau. Développement superficiel jaune verdâtre ou de couleur crème avec une teinte brunâtre. Liquéfaction rapide. Anneau de couleur crème ;coagulation avec peptonisation rapide, devenant alcaline. Développement de couleur crème avec une teinte brunâtre. Mycélium aérien absent ou peu abondant ,blanc.Liquéfaction rapide. Développement de couleur crème.Coagulation et peptonisation. O CD ON ON 00 VjJ K> O 00 KJ] VJ O ro Gélose au luit écrémé Développement végétatif ; crène, plat, h ' étalant. Mycélium aérien: peu' dense blanc jaunâtre à crème. Pigment soluble: brun très clair.Hydrolyse de caséine Bouillon glucosé .'élose à 11 amidon rélose nutritive l'ami- ••'..•lieu à la pom- :.:e de terre /é.î.ose au r. a la te de calcium Développement végétatif : crème.Mycélium aérien: jatmo pâle tirant sur le tan. Pigment soluble 2 n é ar;t Hydrolys e b onne. Développement végétatif: brun.clair.Mycélium aérien modéré,couleur de tan. Léger brunissement de la poiame de terre. Développement végétatif: plat,s » étalant,translucide et incolore aux bords, opaque et Se couleur crème TABLEAU la (suite) "Pellide" abondant , jaunâtre avec une teinte verdâ-tre,beaucoup de replis. Développement -transparent mince, js1 étalant.L' amidon 'est kydrolysé. Développement jaunâtre ,ridé,0 ouvert d'un mycélium aérien farineux blanc. Développement élevé au centre,rayonné,de couleur crème à orangée,bord irrégulier. Développement transparent rcince, s'étalant, forte hydrolyse. Développement ridé, jaunâtre à brunâtre .couvert d'un mycélium aérien farineux blanc. Développement incolore ou de couleur crème.Mycélium aérien olive grisâtre.Hydrolyse rapide. Développement ridé, blanc jaunâtre. Mycélium aérien blanc grisâtre avee une teinte olive. O OO ON Os CD ro o 00 VJl VJ o 10 TABLEAU la (suite) "vj M O OD ON ON od Gélose nutritive à la tyrosine Peptone-fer-gé-lose à l'extrait de levures Production de E^S Culture inclinée sur sérum sanguin de Loeffler Intervalle de tera-p é rature (culture inclinée sur extrait de levu-res-dextrose-gs-lose-aux sels Développement microaérophile (colonne extrait de levu.res-dextrose-sels -40mm de hauteur; Réduction dçs m.-trates en nitnte au centre .Mycélium aérien. : modéré.,de couleur crème à jaune,bords d'un jaune tirant sur le tan. Pigment soluble: néant. Développement végétatifîplat, s'étalant,de couleur crème. Mycélium aérien;tan jaunâtre avec un reflet verdâtre,bor3s d'un jaune tirant sur le tan. Pigment soluble:brun très clair.Cristaux de tyrosine décomposés. Développement végétatif:de couleur crème.Mycélium aérien néant.Pigment soluble: néant. Mélanine négative. Négatif Développement végétatif:tan. Ilycélium aérien:légèrement jaunâtreoPigment soluble : brunâtre.Liquéfaction complète 28°C - bon développement 37°C - bon développement 50°C - pad de développement Bon développement couvrant la surface et le long de la ligne entière de repiquage. Négatif Température optimale 37°C Aérobie Positif Pigment soluble vert ou jaune produit sur les milieux malate et sùccinate de calcium. Pigment foncé produit souvent. Négatif Pas de pigment soluble sur les milieux malate ou sùccinate de calcium. Pas de pigment produit. ui Négatif. KD O 00 vjl o IV> Positif Positif 71 08668 16 2085702 10 15 20 Sauf spécification contraire, ces observations ont été effectuées après trois semaines d'incubation à 28°G. Le pH des milieux utilisés dans ces études était approximativement neutre, c'est-à-dire compris entre 6,8 et 7,2. Les essais physiologiques ont été effectués au bout de 7 et de 22 jours. Les couleurs utilisées dans la description sont conformes aux définitions du "Color Harmony Manual", 4ème édition, 1958, Container Corporation of America. . Utilisation des hydrates de carbone -par le 81 OA La culture de Streptomyces griseus (MA-2837) a été essayée aussi en ce qui concerne sa capacité d'utiliser ou d'assimiler divers hydrates de carbone en cultivant le microorganisme dans un milieu synthétique de base (T. G. Pridhaa et D. G-ottlieb, 1948) • contenant 1 $ de l'hydrate de carbone à * 28°C pendant 3 semaines, Le Tableau II ci-après indique, l'utilisation ou l'assimilation de ces sources d'hydrates de carbone par la culture de Streptomyces griseus (MA-2837). L'explication des signes du Tableau II est la suivante : + indique un bon développement, i indique un développement médiocre et - indique qu'il n'y a aucun développement sur l'hydrate de carbone particulier. TABLEAU II Culture 25 30 Hydrate de carbone Glucose Arabinose Xylose Maltose Mannose Fructose Mannitol de MA-2837 + + + + + Hydrate de carbone Lactose Inositol Sucrose Rhammose Eaffinose Cellulose Culture de MA-2837 + + + + + 35 Les caractéristiques décrites dans les Tableaux I, la et II ont été utilisées pour réduire la culture de Streptomyces griseus (MA-2837) à une classification d'espèce avec les critères décrits dans le "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition, pages 694-829 (1957) et dans "The Actinomycetes", Vol. 2, pages 61-292 (1961). Une comparaison de la culture (MA-2837) avec des espèces connues montre 71 08668 2085702 qu'elle est similaire à Streptomyces griseus. Il existe des différences morphologiques, comme, par exemple, dans la couleur du mycélium aérien qui, dans Streptomyces griseus, est principalement jaune tirant sur le tan et jaune verdâtre, mais, 5 compte tenu du nombre important de similitudes et des différences seulement assez petites, il n'y a pas de justification pour un nouveau nom d'espèce»' Comae résultat, le micro-organisme (MA-2837) qui produit l'Antibiotique 81 OA a été identifié comme une souche de Streptomyces griseus, 10 En plus de la culture précédente (MA-2837), 25 autres cultures ont été identifiées comme produisant l'Antibiotique 81OA» Elles comprennent s trois cultures de Streptomyces griseus, onze cultures de Streptomyces viridochromogenes. cinq cultures de Streptomyces fimbriatus. trois cultures de 15 Streptomyces halstedii. une culture de Streptomyces rochei. une culture de Streptomyces ciimamonensis et une culture de Streptomyces chartreusis » Ces souches de Streptomyces eont identifiées comme cultures MA-4160, MA-4174, MA-4174, KA-4177, MA-4178, MA.-4180, MA-4164, MA-4165, MA-4166, MA-41 67, MA-2892, 20 MA-3265, MA-4162, MA-4163, MA-4159, MA-4169, MA-4170, MA-4179, MA-4161, MA-4168, MA-4175, MA-4181, MA-2938, MA-4176 et MA-4173 dans la collection de cultures de Merck & Co, INC., Raîrway, New Jersey. Ces cultures ont été placéeB en dépôt permanent avec la collection de cultures de la "Northern Utilisation 25 Research and Development Branch" du "Department of A^rieultare" des Etats-Unis d'Amérique à Peoria, Illinois. les numéros de culture NRR1 attribués sont les suivants : Streptomyces griseus î 30 MA-4160 ÏIBHL 3951 MA-4174 ÏÏRE1 3953 MA-4171 imEL 3952 Streptomyces viridochromogenes : MA-4177 1TRR1 3570 35 MA-4178 KRBI 3971 MA-4180 îTiilOj 3972 MA-4164 NHR1 3966 MA-4165 lJRPJj 3967 71 0,8668 18 2085702 MA-4166 HHHL 3968 MA-4167 NRfîL 3969 MA-2892 NRRL 3962 MA-3265 NERL 3963 5 MA-4162 NRRL 3964 MA-4163 NRRL 3965 Streptomyces fimbriatus : MA.-4159 NRRL 3954 ' MA-4169 NRRL 3956 10 MA-4170 NRKL 3957 MA-4179 NRRL 3958 MA-4161 NRRL 3955 Streptomyces halstedil t MA-4168 NRRL 3959 15 MA-4175 * NRRL 3960 MA-4181 NRKL 39*1 Streptomyces rochei : MA-2938 NRRL 3973 Streptomyces cinnamonesia * 20 MA-4176 NRRL 3974 Streptomyces chartreusls î MA-4173 NRRL 3975 La caractérisation des çouches Isolées mentionnées ci-dessus par rapport à Streptomyces griseus» StreptomrceB 25 vlridochroitiogepes. Streptomyces fimbriatua. Streptomyces halstedil, Streptomyces rochei « Streptomyces cinnamonenflis et Streptomyces chartreusis est donnée ci-après dans les tableaux lia à Ile. BAD OR'OINA TABLEAU Ha Caractéristiques culturales de souches de Streptomyces griseus produisant l'Antibiotique 81OA Milieu MA-41 60 MA-4174 MA-4171 h-* Morphologie Pâte de to-mates-gélo-se à la farine d'avoine Glycérol-gélose à 1 ' asparagine Gélose de Czapek-Dox Extrait de levures-Dex-trose+gélose aux sels Pigment soluble sur peptone-fer-gélose à 1'extrait de levures Les sporophores forment des touffes avec des chaînes de spores droites ou légèrement flexueuses. Les spores sont sphériques ou ovales - de 0,9 a de diamètre à 0,9^ x 1,2 , en chaînes de 10 à 15 spores environ. 1 1 Développement végétatif Mycélium aérien : farineux, couleur de tan, avec un reflet verdâtre. bon, plat, étendu, couleur de tan Mycélium aérien : farineux, couleur de tan avec des reflets vert foncé» Pigment soluble : brun clair Mycélium aérien : farineux, couleur de tan avec des reflets vert foncé. Développement végétatif : bon, plat, couleur de tan Mycélium aérien farineux, couleur de tan avec un reflet verdâtre et des vecteurs de gris-vert; — Pigment soluble : brun clair Développement végétatif ï plat, étendu, transparent Mycélium aérien: modéré, couleur de tan Pigment soluble Mycélium aérien grisâtre pigment soluble Mycélium aérien : modéré, couleur de tan Pigment soluble : Développement végétatif : plat, étendu, couleur de tan Mycélium aérien : bon; farineux, beige Pigment soluble ï brun clair modéré, néant néant néant ro TABLEAU Ilb Caractéristiques culturales de souches de Streptomyces viridochromogenes produisant 11Antibiotique 81 OA Milieu MA-2892 MA-3265 MA-4162 MA-4163 Morphologie Pâte de to-mates-gélo-se à la farine d'avoine G-lycérol-gé-lose à 1'asparagine Gélose de Czapek-Dox Extrait de levures-gélose au dextrose Pigments soluble s sur peptone-fer-a l'extrait Les sporophores sont des vrilles courtes, compactes, présentes sous la forme de ramifications latérales sur des hyphes aériennes. Les spores ont des formes sphériques à ovales - de 0,9 à, 1,2 de diamètre et de 0,9 - 1 ,2 x 1,2 x 1,7 U. en chaînes de 10 à 15 spores environ. ' 5 spores Développement végétatif : envers brun Mycélium aérien: velouté ;gris foncé et blanc. Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif: envers brun foncé.Mycélium aérien: gris foncé et crème. Pigment soluble: brun clair. Développement végétatif: brun fonce Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble î brun foncé. Développement végétatif: brun fonce. Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble : brun clair. rélose le levures Développement végétatif : envers couleur de tan. Mycélium aérien : velouté;gris clair et blanc.Pigment soluble:néant. Développement végétatif: envers brun foncé.Mycélium aérien» gris clair. Pigment soluble : néant. Développement végétatif : brun foncé. Mycélium aérien : gris clair et blanc Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif: envers brun. Mycélium aérien : gris clair. Pigment soluble î néant. Développement végéta- Développement végétatif : envers brun foncé tif: envers brun. Mycélium aérien : ve- Mycélium aérien : louté, gris bleuâtre et velouté, gris moyen et blanc. Pigment solu- blanç.Pigment soluble : brun clair. ble : brun clair. Développement végétatif: envers brun foncé .Mycélium aérien: crème et gris clair. Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif: brun foncé Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif : brun foncé. Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble t brun clair. Développement végétatif : envers brun. Mycélium aérien: crème et gris. Pigment soluble : brun clair Développement végétatif : couleur de tan.Mycélium aérien: très peu abondant. Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif :brun foncé. Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble ; brun clair. \l K* O 00 ON ON OO ro O ro o 00 VJl o ro Brun foncé r TABLEAU Hb (suite) sj O c» ON ON 00 Milieu MA-4164 MA-4165 MA-41 66 MA-41 67 Morphologie Les sporophores sont des vrilles courtes, compactes, présentes sous la forme de ramifications latérales sur des hyphes aériennes. Les spores ont des formes sphéri-ques à ovales, de 0,9 à 1,2 }* de diamètre et de 0,9-- 1,2 sur 1 ,2 - 1,7 u , en chaînes de 10 à 15 spores environ. 1 Pâte de tomates-gélose à la farine d1 avoine Glycérol-gélose à l'aspara-gine Gélose de Czapek-Dox Extrait de levures-gélose au dextrose Mycélium aerien velouté,Bleu-gris et crème. Développement végétatif: envers "brun foncé .Mycélium aérien : gris foncé et crème. Développement végétatifs brun. Mycélium aérien: très peu abondant Pigment soluble : brun. 15 spores Développement végétatif envers brun foncé — Mycélium aérien : velouté, gris moyen et crème. Mycélium aérien : velouté, gris moyen et crème. ■Pigment soluble x brun clair Développement végéta- Développement végé-tif : envers brun tatif : gris foncé foncé .Mycélium aérien Mycélium aérien : gris moyen et crème, peu abondant, grisâtre . Développement végé-tatif: brun. Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble : brun. Mycélium aérien : velouté, gris foncé et crème. Développement végétatif: envers brun. Mycélium aérien: gris clair et crème Pigment soluble : brun clair. Développement végétatif: envers couleur de'tan. Mycélium. aérien :gris clair et crème. Développement végétatif: couleur dé tan. Mycélium aérien; très peu abondant.Pigment soluble: brun clair. Pigment tle sur g 0.3 SO.i.U-pop- ! cr- levuras Développement végétatif : brun foncé Mycélium aérien : très peu abondant Pigment soluble : brun clair Brun foncé ro ro o oo U1 o ro lilieu MA-4177 TABLEAU 11b (suite) MA-4178 MA-4180 Morphologie . Les sporophores sont des vrilles courtes, compactes, présentes sous la forme de rami-fications latérales sur des hyphes aériennes. Les spores ont des formes sphériques à ovales, ôe 0,9 à 1 ,2 |X de diamètre et de 0,9 - 12,2 sur 1,2 - 1,7 u T en chaînes de'" 10 h 1 KTîoref. environ. • 10 à 15 spores environ. Pâte de to- Développement végétatif : mates-gélose envers couleur de tan, à la farine Mycélium aérien : velou- d'avoine G-lycérol-gélose à l'aspara-gine • Gélose do G'zapek-Dox Extrait de levures-gélose au d oxtross ce, gris foncé et blanc. Développement végétatif : envers brun» Mycélium aérien; velouté, gris foncé. — Pigment soluble : brun clair Développement végétatif : Développement végétatif : envers brun. envers brun fonce» Mycélium aérien : gris Mycélium aérien : gris foncé foncé. — Pigment soluble : brun* clair Développement végétatif : envers brun. Mycélium aérien s velouté, gris foncé et crème. Développement végétatif ï envers brun foncé. Mycélium aérien : mélange de gris clair et foncé. Développement végétatif : cou.: aur oe tan Développement végétatif t brun foncé 2- xgm e nt s o lubl e sur. oeptoner-, fer-gélose à l'extrait de levures Développement végétatif : couleur de tan. Mycélium aérien î très peu abondant —————— — — Pigment soluble s brun clair Développement végétatif : Développement végétatif s brun foncé. brun. Mycélium aérien t peu Mycélium aérien i trèa abondant, grisâtre peu abondant Pigment soluble s bran clair Développement végétatif : brun. Mycélium aérien s très peu abondant. Brun foncé \l O 00 .On ON Oo tu ro ro o cb un o ro TABLEAU Ile Caractéristiques culturales de souches de Streptomyces finibriatus produisant l'Antibiotique 81OA Milieu MA-4159 MA-4169 MA-4170 MA-4179 MA-4161 Morpho- Les sporophores sont des vrilles courtes, compactes et quelques boucles, logie présentes sous la forme de ramifications latérales sur des hyphes aériennes» Les spores ont des formes sphériques à ovales,de 0,9 u. de diamètre et de 0,9 x 1,2^., en chaînes de 10 à 15 spores environ. Pâte de tomates gélose à la farine d'avoine Développement vé. gétatif: envers couleur de^tan. Mycélium aérien: modéré, gris clair. G-lycéroL Développement vé-gélose gétatif: bris-, à l'as- brun foncé, paragine G-élose Développement vé-de Cza- gétatif:gris-brun pek-Dox foncé.Mycélium aérien: très peu abondant.Pigment soluble: brun. Développement vé gétatif:envers couleur de tan. Mycélium aérien modéré, gris. clair. Pigment soluble : brun clair î- Développement vé -gétatif;envers couleur de tan. Mycélium aérien modéré,gris clair et crème. Développement végétatif ;envers couleur de tan. Mycélium aérien peu abondant, grisâtre. Les sporophores sont des crochets courts et des boucles,présent s sous la forme de ramifications latérales sur le mycélium aérien.Les spores sont en chaînes de moins de 10 spores -sphériques à ovales 0,9U de diamètre et 0,9 x 1 ,2 yx . Développement végétatif: couleur de tan Mycélium aérien : peu abondant, grisâtre. Développement vé gétatif: gris-brun foncé. - Développement vé- Développement gétatif: ^ris- végétatif: gris-brun fonce. brun foncé Développement végétatif :gris-brun foncé.Mycélium aérien; modéré, gris. Pigment soluble : brun. Développement végétatif :gris-brun foncé.Mycélium aérien: modéré, gris. Pigment soluble : brun. Développement végétatif : gris -brun foncé. Mycélium aérien: très peu abondant.Pigment soluble : brun. Développement végétatif: envers couleur de tan avec vecteur couleur de tan rougeâtre. Développement végétatif: couleur de tan. Mycélium aérien:très peu abondant.Pigment soluble : brun clair O Oo ON ON 00 ro VJ ro o 00 VJl vj O ro Milieu MA-4159 MA-4169 TABLEAU IIo (suite) MA.-4170 MA-4179 MA-4161 "^1 O 00 on on 00 Extrait de levure s-Dextroses-gélose aux sels Développement végétatif î gris-brun foncé Développement vé- Développement Développement gétatif : gris- végétatif î végétatif : brun foncé gris-brun foncé gris-brun foncé Mycélium aérien t, très peu abondant Pigment soluble : brun Développement végétatif î gris-brun foncé Pigment soluble sur peptone-fer-gélose à l'extrait de levures Brun foncé ro -f* N> O 00 o ro TABLEAU Ild Caractéristiques culturales de souches de Streptomyces halstedii produisant l'Antibiotique 81 OA Milieu MA-4168 MA.-4175 MA-4181 * • * Morphologie Pâte de to-mates-gélo-se à la farine d'avoine ŒLycérol-gélose à l'aspara-gine Gélose de Extrait de levure s- de:,;>-'trose+gelose au:: .sels Les sporophores sont des vrilles longues, peu serrées, présentes comme ramifications latérales sur des hyphes aériennes» Les spores sont sphériques à ovales - 0,9 u de diamètre et 0,9 x 1,2 U - en chaînes de plus de 10 spores. ' Développement végétatif t Développement végétatif ; Développement végétatif : envers brun» envers couleur de tan. envers brun. Mycélium aérien, t farineux, Mycélium aérien : gris Mycélium aérien î gris gris foncé. foncé et blanc, farineux. foncé et blanc. — Pigment soluble : néant Développement végétatif : envers brun à brun foncé. Mycélium, aériens farineux, gris foncé et blanc Développement végétatif : crème. Mycélium aérien : crème grisâtre Développement végétatif î couleur de t.m. Mycélium aérien s grisâtre, peu abondant. Pigment qoXu'Lle *?i\r pep'f.oi>e-for-çél^-se à — 1'extrait de ?: evures Développement végétatif t envers grisâtre. Mycélium aérien: farineux, principalement gris foncé mélangé de gris clair et de blanc• Pigment soluble : néant Développement végétatif î envers brun rougeâtre .Mycélium aérien: crème grisâtre. Pigment soluble : néant Développement végétatif : couleur de tan. Mycélium aérien : peu abondant, grisâtre. Pigment soluble z "néant — néant O CD ON ON CD Développement végétatif : envers grisâtre. Mycélium aérien : gris foncé, farineux. Développement végétatif : crème, Mycélium aérien : très peu abondant. Développèmêht végétatif : brun. Mycélium aérien : peu abondant, grisâtre. IV VJl O 00 o ro Caractéristiques culturales d'espèces de M-2938 Streptomyces rochei Milieu TABLEAU Ile Streptomyces produisant l'Antibiotique 81 OA MA-4176 MA-4173 Streptomyces cinnamonesis Streptomyces chartreusls :or?holo~ les sporophores forment des gxe vrilles compactes .présentes sous la forme de chaînes latérales de 10 à 15 spores envi-ron-sphérlques à ovales,de 0,9p de diamètre et 0,9 x 1 ,21* . CJ b % 0 ■z. Pâte de Développement végétatif t tomates- envers "brun rougeâtre. gélose à Mycélium aérien s gris moyen, la farine Pigment soluble î néant ri'avoine Glycérol- Développement végétatif: gélose â envers bran rougeâtre. l'aspa-'; Mycélium aérien:gris moyen, r'ifrine Pigment soluble S néant. Cclose de Développement végétatifs brun Czàpek- rougeâtre. Mycélium aérien t .Dox très p'?u abondant. Pigment eoluble î néant ixtraitde Développement végétatif : j.evures, couleur de tan. Mycélium : extrose-r aérien î grisâtre. gélose Pigment soluble t brun V7~; sels clair. Pigment soluble sur peptcne-fer-gélose à Réant l'extrait de levures Les sporophores sont des crochets,des boucles et un petit nombre de vrilles peu serrées, présentes comme ramifications latérales sur des hyphes aériennes.Les spores sont en chaînes de plus de 10 spores, sphériques à ovales,0,9 u de diamètre et 0,9x1 ,2 . ' Développement végétatif: couleur de tan. Mycélium aérien: beige avec une teinte rose; velouté. Pigment soluble : brun -Développement végétatif:envers brun rougeâtre foncé. Mycélium aérien: beige avec une teinte rose. Pigment soluble : brun. Développement végétatif : envers brun foncé, Myoélium aérien: modéré| beige avec teinte roBe. Pigment soluble : brun. Développement végétatif» bran Mycélium aérien : peu abondant, blanc crémeux. Pigment soluble » brun foncé. Brun foncé Les sporophores sont des vrilles compactes-,présentes comme ramifications latérales sur des hyphes aériennes.Les spores sont en chaînes de plus ' de 10 spores-,sphériques à ovales,0,9-1 ,2 u de diamètre et 0,9-1,2 x 1,2-1,7ji » Développement végétatif: brun clair avec des vecteurs de brun-orangé. Mycélium aérien : farineux; gris foncé avec une teinte bleu-vert. Pigment soluble : brun. Développement végétatif: brun Mycélium aérien : très peu abondant. Pigment .soluble : brun clair. Développement végétatif: brun-orangé. Myoélium aérien : très peu abondant. Pigment soluble » brun clair. Développement végétatif : brun Mycélium aérien : trèB peu abondant, Pigment soluble : brun. Brun foncé O Ûo ON ON 00 ro ro o oo ui o ro 71 08668 27 2Q85702 la description précédente des micro-organismes produisant l'Antibiotique 81OA est seulement une illustration du type des souches qui peuvent être utilisées et il y a lieu d.e comprendre que la présente invention n'est pas limitée à 5 un organisme satisfaisant à ces descriptions particulières. La présente invention comprend l'utilisation d'autres micro-organismes comprenant des souches d'actinomycètes isolées en provenance de la nature ou obtenues par mutation, par exemple, celles obtenues par sélection naturelle ou celles 10 produites par des agents de mutation, par exemple,- par irradiation par des rayons X, irradiation à l'ultraviolet, par des ypérites azotées, etc..., qui dans des conditions appropriées donneront un antibiotique identique. Culture de 842A : Le micro-organisme qui produit 15 l'Antibiotique 842A est une souche d'actinomycète inconnue antérieurement. Le germe isolé original a été obtenu sous la foime d'une colonie unique à partir de terre sur gélose inclinée et cultivé dans un milieu ayant la composition suivante : Milieu 33 20 Extrait de levures 10,0 g Glucose . 10,0 g Tampon phosphate * 2,0 enr MgS04.7H20 0,05 g Eau distillée 1000,0 cm^ 25 pH 6,5 * Tampon phosphate î 91,0 g Na2HP04 ' 95,0 g Eau distillée 1000,0 cm^ 30 Après plusieurs jours de culture, on a trouvé qu'au cune sporulation ne pouvait être détectée0 le micro-organisme avait produit un antibiotique qui a été distingué des antibiotiques connus d'après son profil dans diverses études biologiques et chimiques. La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus 35 dans le cas d'autres antibiotiques connus a montré que le 842A était une entité nouvelle. Taxonomie du 842A : Le micro-organisme (Culture MA-2908) qui produit le 842A a été identifié comme un nouvel 71 08668 28 2085702 actinomycète» La taxanomie utilisée dans cette détermination est décrite dans le "Manual of Determinative Bacteriology", de Bergey, 7ème édition; et dans "The actinomycetes", Vol. 2, "Classification, Identification and Description of Gênera and 5 Species", S.A. Waksman (1961). En utilisant cette méthode, on a trouvé que la culture appartient au genre Streptomyces et qu'elle possède beaucoup des attributs de l'espèce connue Streptomyces fradiae. Biochimiquement, elle est presque parfaitement identique à cette dernière. Morphologiquement, toutefois, il existe des 10 différences importantes. Par exemple, la couleur du mycélium aérien de S. fradiae est un rose coquillage tandis que la culture MA-2908 est habituellement de couleur crème. Egalement, le développement végétatif dans la culture MA-2908 présente des différences de pigments sur les divers milieux utilisés et, 15 comme spécifié ci-après, aucune sporulation n'a été détectée sur les milieux taxonomiques normaux. Sur la base de ces différences, on a attribué à la culture un nouveau nom d'espèce : Streptomyces lactamdurans. Le Tableau III ci-après décrit les caractères biochimiques de l'espèce Streptomyces lactamdurans 20 et ceux de l'espèce connue Streptomyces fradiae. Tout ce qui est indiqué dans le Tableau III a été observé après trois semaines d'incubation à 28°C, sauf spécification contraire. Le pH des milieux utilisés dans ces études était approximativement neutre, c'est-à-dire compris entre 6,8 et 7,2. Les 25 essais physiologiques ont été effectués au bout de 7 et de 21' jours, TABLEAU III Comparaison biochimique du 842A Essai Streptomyces Streptomyces 30 Lactamdurans fradiae Mycélium aérien droit, une certaine droit, filaments de ramification ramification Conidies aucune détectée en forme de bâtonnets Pigment soluble néant néant 35 Température optimale 28°C 25°C Invertase négatif négatif 71 08668 29 2085702 Réduction de nitrate négatif négatif Liquéfaction de gélatine positif positif Utilisation de cellulose négatif négatif Lait tournesolé peptisation al- peptisation &1- 5 câline câline Morphologie du 842A On n'a pas détecté de sporophores en effectuant la culture sur les milieux indiqués dans la description des caractéristiques de culture, même par des observations répétées pen-10 dant jusqu'à 8 semaines. Toutefois, des lamelles d'impression colorées montrent des filaments longs, dont "beaucoup sont segmentée en éléments de dimensions diverses, en général d'une forme large et ayant des dimensions de 0,9 sur 1,7 micron environ. Le mycélium aérien est court, droit, peu ramifié. Il 15 semble avoir à peu près les mêmes dimensions que le mycélium végétatif - 0,9p de largeur. Il est léger, farineux et s'enlève facilement au râcloir. Le mycélium végétatif est Gram-positif, et n'est pas acido-résistant. Il s'attache à la gélose et, dans certains 20 milieux, est enrobé dans la gélose. Il existe une certaine fragmentation en bâtonnets dans la culture en ballons à secousses, mais cette fragmentation n'est pas importante. Le mycélium végétatif provenant de ballons à secousses et fixes (milieu ensemencé, 4-6 jours, 28°G) présente quelcuos 25 "bourgeons" et des segments courts épaissis, presque en forme de "clubs", sur le mycélium, mais ils ne sont pas nombreux et leur signification, s'il y en a une, n'est pas connue. Pâte de tomates-gélose à la farine d'avoine Développement végétatif î smrers plat orangé, parais-30 sant sec, rugueux, Mycélium aérien î peu denos, créas. Pas de pigment soluble, Gélose de Czapek-Dox Développement végétatif s plat, orèma fcncss 35 Mycélium aérien s farineux; bla&a oriKieus Pas de pigment soluble. Glycérol-Gélose à l'asparaffine Développement végétatif s envers plat; jaune doré à 71 08668 30 2085702 orange Mycélium aérien : farineux, crème avec des tons pêche pâle. Pigment soluble : ambré pâle. 5 Gélose à l'albumine d'oeufs Développement végétatif : plat, crème à jaune Mycélium aérien î farineux, crème Pas de pigment soluble. Gélose au malate de calcium 10 Développement végétatif : envers plat, jaune bordé d'orangé Mycélium aérien : farineux, blanc à crème bordé de pêche Pas de pigment soluble. 15 Gélose nutritive à la tyrosiné Développement végétatif : plat; de couleur tain à orangé Mycélium aérien t peu dense» crème avec du blanc Pas de pigment soluble 20 Cristaux de tyrosine décomposés. Mélasse-gélose à 1'hydrolysat de levures Développement végétatif : envers plat, orangé Mycélium aérien î farineux, blanc crémeux Pas de pigment soluble. 25 Gélose nutritive Développement végétatif : plat; jaune doré Mycélium aérien : farineux, crème Pas de pigment soluble lait tournesolé 30 Anneau de croissance peu dense - développement végéta tif couleur de tan - pas de mycélium aérien Peptisation î réaction alcaline pH 7,3 - 7,4 (Témoin pH 6,7) Lait écrémé 35 Anneau de croissance peu dense, tan à orangé Développement végétatif - pas à? mycélium aérien Pigment soluble de couleur tan clair Peptisation - réaction alcaline pH 7,2 (Témoin pH 6,6) BAD ORIGINAL 71 08668 31 2085702 Gélose au lait écrémé Développement végétatif s plat, orangé Mycélium aérien : modéré, crème à corail pâle Pigment soluble couleur de tan clair 5 Hydrolyse de caséine. Colonne de gélatine Développement végétatif : peu dense crème à orangé en suspension dans tout le tube Pas de pigment soluble 10 Liquéfaction complète. Gélose nutritive à la gélatine Développement végétatif ï plat, orangé Mycélium aérien : peu dense, farineux, crème Pas de pigment soluble 15 Liquéfaction de la gélatine. Gélose nutritive à l'amidon Développement végétatif.: plat, orangé Mycélium aérien ; peu dense, farineux, crème rosâtre Pas de pigment soluble 20 Hydrolyse modérée de l'amidon. Gélose à l'amidon synthétique Développement végétatif î envers plat, crème bordé d'orangé. Mycélium aérien : farineux., blanc bordé de pêche 25 Pas de pigment soluble Hydrolyse modérée de l'amidon. Gélose au sérum sanguin de Loeffler Développement végétatif : crème à orangé Mycélium aérien ï néant 30 Pas de pigment soluble Pas de liquéfaction Peptone-fer-gélose à l'extrait de levures Développement végétatif' : crème Mycélium aérien : peu dense, blanchâtre 35 Pas de pigment soluble. Développement microaérophile (colonne extrait de levures-dextrose - 40 mm de hauteur) Bon développement à la surface et le long du quart supérieur de la ligne de repiquage. 71 08668 32 2085702 Température - Cultures inclinées sur extrait de levures-dextrose Bon développement à 28°C Développement peu dense à 37°C Pas de développement à 50°C 5 Extrait de levures - G-élose au dextrose Développement végétatif î plat, jaune doré Mycélium aérien .ï farineux, crème à rose clair pâle Pas de pigment soluble Tranche de pomme de terre 10 Développement végétatif : sec, plat, crème à orangé Mycélium aérien î peu dense, crème Pas de pigment soluble Réduction de nitrates en nitrites : négatif. Toutes les observations ont été effectuées après 3 semai nés 15 d'incubation à 28°C,. sauf spécification contraire. Les essais physiologiques ont été effectués à 7 et 21 jours. Les différences morphologiques entre les espèces Streptomyces lactamdurans et Streptomyces fradiae sont indiquées dans le Tableau IV ci-après. Les observations ont été ef-20 fectuées sur les milieux indiqués dans le Tableau IV à des intervalles de développement de 1 semaine, 3 semaines et 8 semaines. Le mycélium aérien de S„ lactamdurans est court et droit avec peu de ramification. Il semble avoir à peu près les mômes dimensions que le mycélium végétatif, c'est-à-dire^ 0,9 micron de largeur. Il est 25 léger, farineux et s'enlève facilement au râcloir. Le mycélium végétatif est (îram-positif; il n'est pas acido-résistant. Il s'accroche à la gélose et dans certains milieux y est enrobé. Il existe une certaine fragmentation en bâtonnets dans la culture en flacon secoué, mais pas dans une mesure importante. Le mycélium 30 végétatif provenant de flacons secoués et fixes (milieu ensemencé-4 à 6 jours, 28°C') présente quelques "bourgeons" et des segments courts épaissis presque en forme de "clubs" sur le mycélium, mais ils ne sont pas nombreux. Sauf spécification contraire, toutes les observations rapportées dans le Tableau IV ont été effectuées 35 après 3 semaines d'incubation à 28°C. Le pH des milieux utilisés dans ces études est approximativement neutre, c'est-à-dire compris entre 6,8 et 7,2„ Les essais physiologiques ont été effectués au bout de 7 et de 21 jours0 Les couleurs utilisées dans la description sont conformes aux définitions du "Color Harmony Manual", 4ème édition, 1S58, Container Corporation of America. TABLEAU 17 842A ; Comparaison morphologique des espèces Streptomyoes Milieu Streptomyces lactamdurans Gélose de Czapek-Dox Gélose nutritive Glycérol-gélose à l'aspara-gine Extrait de levures-gélose au dextrose Gélose a l'amidon synthétique Tranche de pomme de terre Colonne de gélatine lait tournesolé Développement végétatif : plat, crème foncé Mycélium aérien t farineux, "blanc crème Pas de pigment soluble Développement végétatif jplat, crème à jaune doré. Mycélium aérien: farineux,crème Pas de pigment soluble Développement végétatif : envers plat,jaune d'or à'orangé - Mycélium aérien î farineux, crème avec des tons pêche pâle Pigment soluble : ambré pâle Développement végétatif: plat, jaune d'or Mycélium aérien : farineux,crème à rose chair pâle Pas de pigment soluble Développement végétatif : envers plat, crème bordé d'orangé- Mycélium aérien : farineux, blanc bordé de pêche Pas de pigment soluble -Hydrolyse modérée de l'amidon. Développement végétatif : sec, plat, crème à orangé - Mycélium aérien : peu dense,crème Pas de pigment soluble Développement végétatif : peu dense, paillettes crème à orangé en suspension dans tout le tube - Mycélium aérien : Pas de pigment scluble - Liquéfaction complète Développement végétatif : couleur de tan, anneau de croissance peu dense Mycélium aérien : néant Pept.isat3.or. î réaction alcaline pH 7,3-7,4 (Témoin pH 6,7) lactamdurans et Streptomyces fradiae Streptomyces fradiae Développement végétatif : incolore Mycélium aérien : rose coquillage Développement végétatif: jaune-orangé Développement végétatif : couleur chamois Développement végétatif : couleur chamois Développement végétatif : incolore Mycélium aérien : rose coquillage Développement végétatif : orangé. Développement végétatif : crème à brun Développement végétatif î couleur crème 71 08668 2085702 Utilisation des hydrates de carbone par le 842A : La culture de Streptomyces lactamdurans (MA-2908) a été essayée aussi en ce qui concerne sa capacité d'utiliser ou d'assimiler divers hydrates de carbone, par culture du micro-organisme 5 dans un milieu synthétique de "base (T.G. Pridham et TJ.Gottlieb, 1948), qui contient 1 $> de l'hydrate de carbone à 28°C pendant 3 semaines. T,e Tableau V indique l'utilisation ou l'assimilation de ces sources d'hydrates de carbone par la culture de Streptomyces lactamdurans (MA-2908). L'explication des signes dans le 10 Tableau V est la suivante : + indique un bon développement, + indique un développement médiocre et - indique aucun développement sur l'hydrate de carbone particulier, TABLEAU V Hydrate de carbone Culture MA-2908 Hydrate de carbone Culture MA—2908 Glucose + Rhamnose — Arabinose + Cellulose - Maltose + Fructose + Raffinose + .Inositol - Sucrose - Acétate + Xylose + Citrate + Mannitol + Paraffin - Lactose - Blycerol + Mannose — . Les caractéristiques décrites dans les Tableaux III, IV et V ont été utilisées pour réduire la culture de Streptomyces lactamdurans (MA-2908) à une classification en espèce selon les 30 critères décrits dans le "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey, 7ème édition, pages 694-829 (1957) et dans "The Acti-nomycetes", Vol. 2, pages 61 à 292 (1961), Une comparaison des earactéristiqufes détaillées de la culture de Streptomyces lactamdurans avec celles d'espèces connues a montré que la culture est 35 biochimiquement semblable à celle de Streptomyces fradiae, Toutefois, comme indiqué ci-dessus, il existe des différences morphologiques importantes, par exemple dans la couleur du mycélium aérien §.• fradiae qui est rose coquillage au lieu de la couleur crème BAD ORlGJNAi. 71 08668 35 2085702 de la culture. De plus, tandis que le développement végétatif de £3, fradiae présente des différences de pigments sur les divers milieux, aucune sporulation n'est détectée avec la culture» Sur la base de ces différences et des caractéristiques décrites 5 dans les Tableaux précédents, on a attribué au micro-organisme produisant l'Antibiotique 842A (MA-2908) le nouveau nom d'espèce Streptomyces lactamdurans. la description précédente du micro-organisme qui produit l'Antibiotique 842A est donnée simplement pour illustrer le 10 type des souches de micro-organismes qui peuvent être utilisées et il y a lieu de comprendre que la présente invention n'est pas limitée aux organismes satisfaisant à ces descriptions particulières. La présente invention comprend l'utilisation d'au- * très micro-organismes, comprenant des souches d'actinomycètes iso-15 lées en provenance de la nature ou obtenues par mutation, par exemple celles obtenues par sélection naturelle ou celles produites par des agents de mutation, par exemple l'irradiation aux rayons X, l'irradiation à l'ultra-violet, les ypérites azotées, etc, qui dans des conditions appropriées donneront le produit 842A. 20 Etudes in vitro et in vivo Antibiotique 81ÏÏA - In vitro : la caractérisation biologique in vitro de l'Antibiotique 81OA a été établie par la méthode de diffusion dans la gélose par disques qur plaques. On effectue ces essais en plaçant des disques de 7 mm, imprégnés de 25 la solution d'antibiotique, sur la surface d'un milieu, dans des •a boîtes de Pétri, constitué de 5 cm de gélose nutritive Difco et *5 0^2 i* d'extrait de levures, ensemencé avec 5 ou 10 cm d'inoculum par 150 cm^ de milieu et mis en incubation à 25°C ou 37°C pendant 16 heures» Le mode opératoire et la philosophie de ces essais 30 sont décrits dans la publication : "Cross Résistance Studies and Antibiotic Identification", Applied Microbiology, Vol. j6, pages 392-398 (1958). Les Tableaux VI, VII, et VIII ci-après donnent les résultats de ces essais antibactériens et de "résistance croisée" et indiquent les organismes d'essai utilisés et 35 les conditions utilisées. 71 08668 36 2085702 TABLEAU VI Spectre antibactérien du 81OA ; activité in vitro i 1 ■ Conditions d'essai Diamètre de Organisme d'essai la zone d'in hibition. mm* Inoculum** Tempéra-cm3/150cm3 ture d'incubation, °C 81 OA 5mg/em3 Escherichia coli 5 25 15 Bacillus species 5 25 22 Proteus vul,e;aris 5 : ' 29 Pseudomonas aeruginosa 5 25 7 Serratia marcescens 5 25 7 Staphvlococcus aureus 5 25 26 Bacillus subtilis 5 25 33 Sarcina lutea 5 25 26 Staphvlococcus aureus 5 37 19 (résistant à la streptomycine-streptothricine) Streptococcus faecalis 15 37 7 Alcaligenes faecalis 5 37 25 Brucella bronchiseptica 10 37 21 Salmonella gallinarum 10 25 15 Vibrio percolans 10 27 36 Xanthomonas vesicatoria 5 25 15 * 7 mm «= dimension des disques (pas de zone d'inhi- bition observée) ** Culture d'une nuit diluée à une lecture de 60 m M. sur le colorimètre Lumetron 71 08668 37 2085702 TABLEAU VII Résistance "croisée" au 81OA ; étude in vitro ** Conditions d'essai Diamètre de Escherichia coli - Souche la. zone d'in hibition,mm* .Inoculum ** Température 81 OA cm3/150 cw3 d'incuba 5mgjém3 tion, °C Progénitrice sensible 5 ' 25 15 Résistant à la strepto mycine 5 25 13 Résistant à la steptothri- cine 10 25 17 Résistant k l'OXAMYCIHE 10 25 10 Résistant à la pléocidine 10 37 26 Résistant au chloramphéni- col 10 25 7 Résistant à la chlortétra- cycline 10 25 7 Résistant à l'oxytétracy- cline 10 25 7 Résistant à la Héomycine 10 37 20 Résistant à la Tétracy- . cline 10 25 7 Résistant à la Viomycine 10 37 17 Résistant à la polymyxine m cm o 13 Résistant au grisein 5 25 15 * 7 mm = dimension des disques (pas ds zens d'inhibition observée) ** Essais effectues contre une série de souches de E.coli isolées à partir de la même culture de dépaa !i après exposition aux antibiotiques individuels# *** Culture d'une nuit diluée à une lecture de t jO sur le colorimètre Lumetron 38 -71 08668 2085702 TABLEAU VIII ! Spectre d'effets spéciaux du 81 OA ; Etude in vitro. Escherichia coli W-MB-60 Conditions d'essai Diamètre de (avec addition spéciale indiquée) Inoculum** Températu-cm3/150 cm3 re d1 incubation, °C la zone d'inhibition, mm* Témoin (pas d'addition) 5 25 13 Tampon phosphate 0,1 M-pH 5 5 25 13 Tampon phosphate 0,1 M-pH 7 5 25 16 Tampon phosphate 0,1MM-pH 9 5 25 18 Plasma de sang humain 20 $ 5 25 15 Résine échangeuse de cations 5 25 12 (Dow ET 91—1 # ; concentration en gélose réduite à 1 # pour plaque de résine seulement) * 7 mm = dimension des disques (pas de zone d1lnhi- bition observée) ** Culture d'une nuit diluée à une lecture de 60 mp sur le colorimètre Lumetron i Antibiotique 810 A ; in vivo î la caractérisation biologique in vivo indique que le 81OA est un antibiotique à large spectre qui protège contre l'infection par trois espèces de Proteus. deux de Salmonella, une souche d'Escherichia coll. 30 deux de Klebsiella et trois organismes Gram-positifs î Sta-phylococcus aureus. Streptococcns pyogenes et Diplococcua pneumoniae. Procédés : Le procédé utilisé dans cette caractérisation est le suivant : Des souris suisses blanches femelles, d'un 35 poids moyen de 20 à 23 grammes, sont infectées par voie intré-péritonéale avec 3 à 20 fois le nombre d'organismes calculé comme étant mortel pour 50 $ des arimaux-témoins infectés (3 à 20 doses LDj-q)» Au moment de l'infection et de nouveau six 39 71 08668 2085702 heures plus tard, un traitement est appliqué par la voie indiquée» Des expériences de comparaison concernant la virulence de la culture et la toxicité de l1antibiotique pour des souris non infectées sont incluses dans les essais. Sept jours après l'in-5 fection, l'essai est considéré comme terminé et la quantité de l'antibiotique (I) qui serait nécessaire pour protéger 50 % des animaux infectés et traités est calculée par la méthode de Knudsen et Curtis ; J. Amer. .Stat. Assoc. Vol.42, page 282 (1947). Résultats î les résultats de ces essais sont donnés 10 dans le Tableau IV ci-après. Ces résultats montrent que l'antibiotique 81OA obtenu à partir de la culture MA-2837 est un agent à large spectre, fournissant une protection contre des organismes tant Gram-positifs que Gram-négatifs. Bien qu'il soit efficace quand il est administré ora-15 lement (p.o), on obtient les"meilleurs résultats par la voie sous-cutanée (s.c.) ou intra-péritonéale (i.p.). Le mélange antibiotique ne tue pas les souris non infectées quand deux doses contenant chacune 1 mg du produit sont administrées par voie intra-péritonéale ou quand deux doses de 18 mg chacune sont 20 administrées par voie sous-cutanée ou oraleè 71 08668 40 2085702 TABLEAU IX Activité in vivo du 81OA Organisme d'essai Voie de ED™ 50 en microfrrammes x Traitement deux doses Proteus vulgaris i.p. 33 s.c. 500 p.o. 12 100 Proteus mirabilis i.p. p.o. 200 5 000 Salmonella schottmuelleri i.p. 419 s.c. 9 000 Escherichia coli i.p. 3 750 Escherichia coli i.p. 1 330 Klebsiella pneumoniae • * •H 2 500 Salmonella «allinarum i.p. 1 670 Salmonella pullorum i.p. 625 Diplococcus pneumoniae i.p. 258 Staphvlococcus aureus i.p. 927 Streptococcus pyogenes i.p. 625 Antibiotique 842A ; in vitro : La caractérisation biologique in vitro a été établie -par la méthode de diffusion dans la gélose par disques sur plaqueso On effectue ces essais en 30 plaçant des disques de 7 mm, imprégnés de la solution d'antibiotique, sur la surface d'un milieu, dans des boîtes de Pétri, constitué de 5 cm^ de gélose nutritive Difco et 0,2 fo d'extrait de levures, ensemencé avec 5 ou 10 cm de suspension normale de cellules (OD = 0,22 à 660 mp) par 150 cm^ de milieu et avec 35 incubation à 25°C ou à 37°C pendant 16 heures comme indiqué# Le mode opératoire et la philosophie de ces essais sont décrits dans la publication : "Cross Résistance Studies and Antibiotic Identification", Applied Microbiology, Toi» 6, pages 392-398 (1958). TABLEAU X Speotre antibactérien du 842A j activité in vitro Organisme d'essai Conditions d'essai Ino culum Temp•d'in-om3/150oni3 Diamètre de la zona d'inhibition? mm* 842A (Ib) brut 8 mg/ cm3 Acide libre 166 ug/ em3 1 Sel de sodium 192 ug/ cm3 Escherichia coli Bacillus bp, Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Staphvloco'ccus aureus Bacillus eubtilis Sarcina lutea Sts.phylOGQGCus aureus "^Résistant a~la streptomj' cine et à la streptothri' cine) Streptococous faecallis Alcaligenes faecallis Bruce11a bronchiseptica Salmonella g-?ilinarum i/ibrio pereolans ïanthomonas vesicatorla 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25 25 37 25 25 25 25 25 37 15 37 5 37 10 37 10 25 10 27 5 25 16 7 21 7 7 7 16 9 7 7 22 28 20 37 12 20 8 22 7 7 7 13 10 11 7 27 24 21 30 19 18 7 24 7 7' 7 18 9 10 7 7 26 25 38 17 7 mm = dimension des disques (pas de zone d'inhibition observée) s 0 1 TABLEAU XI "Résistance croisée" du 842A ; étude in vitro Escherichia coli-Souche** Conditions d'essai Inoculum Temp.d'in-W/15Ccm3 Résistant Résistant Résistant Résistant Résistant à Progénitrice, sensible Résistant à la streptomycine Résistant à la streptothri-cine à l'OXMYCINE à la pl(5ocidine au chloramphé nicol à la chlortétra-cycline l'oxytétra-cycline à la néomycine à la tétra- cycline à la viomycine à la polymycine au grisein Résistant Résle tant Résistant Résistant Résistant ** Diamètre de la zone d'inhibition, mm* 842A (Ib) brut 8 mg/ cm3 Acide libre 166 ug/ cm? r 5 25 16 20 18 5 25 H 19 16 10 25 13 14 18 10 25 13 13 17 10 37 15 18 17 10 25 13 17 16 10 25 21 20 23 10 25 20 23 24 10 37 18 17 17 10 25 16 20 20 10 37 15 16 30 10 25 23 21 7 5 25 18 21 16 Sel de sodium 192 ixg/ cm3 \l O CD ON ON OO Essais effeotués contre une sérié de aouohes de E.eoli Isolées à partir de la aime culture de départ après exposition aux antibiotiques individuels 7 mm » dimension des disques (pas de sone d'inhibition observée) ro © CD U1 VJ O PO I I i r TABLEAU Xla Spectre d'effets spéciaux du 842A ; étude in vitro Escherichia coli W-MB-60 Conditions d'essais Diamètre de la zone d'inhibition,mn* (avec addition spéciale indiquée) Ino culum Temp o d•in-cm3/15 0 cm3 cuba t ion, °C. . 842A (Ib) brut 8 mg/ cm3 Acide libre 166 ug/ cm3 Sel de sodium 192 ug/ cm5 Témoin (pas d'addition) 5 25 16 20 18 Tampon phosphate 0,1 M - pH 5 5 25 19 20 15 Tampon phosphate 0,1 M - pH 7 5 25 22 29 25 Tampon phosphate 0,1 M - pH 9 5 25 21 22 24 Plasma de sang humain 20 $ 5 25 17 22 21 * Résine échangeuse de cations (Dow ET 91) 1 # 5 25 20 21 18 * (Concentration en gélose réduite à 1 io pour plaque de résine seulement ) VI I_A O od on on CO •t* vol ro o c» ui vi o ro 71 086.68 2085702 Antibiotique 842A ; in vivo Quand le 842 est administré par voie sous-cutanée à des souris, il est généralement plus actif que la céphalothine et à peu près aussi actif que la céphaloridine, l'ampicilline et 5 la chloromécétine dans la protection contre l'infection par des organismes Gram-négatifs. Il est remarquablement non toxique et est éliminé rapidement dans l'urine, 79 i° environ du 842A injecté par voie sous-cutanée étant recueilli en moins de 4 heures. 10 Dans des études in vivo. l'Antibiotique 842A protège contre l'infection par trois espèces de Proteus. deux de Salmonella. une souche d*Escherichia coli. deux de Klebsiella et aussi contre Paracolobactrum arizoniae. Aerobacter aerogenes. Pasteurella multocida et Diplococcus pneumoniae 15 E400. la méthode utilisée dans ces études est la même que.décrit ci-dessus à propos de la caractérisation in vivo du 81OA. les résultats de ces essais sont décrits ci-après dans le Tableau Xlb : TABLEAU Xlb Activité in vivo du 842A Organisme d'essai EjD 50 par voie sous-cutanée x deux doses Proteus vul«aris 51 Pg Proteus mirabilis 276 ug Proteus morganii 3202 276 ug Salmonella schottmuelleri 103 ug Klebsiella pneumoniae AD 125 ug Klebsiella pneumoniae B 125 ug Paracolobactrum arizoniae 125 Kg Escherichia coli 200 ug Aerobacter aerogenes 49 ug Pasteurella multocida 57 ug Salmonella typhosa 34 ug Diplococcus pneumoniae E400 566 ug > 71 08668 45 2085702 Les antibiotiques Fermentation de 81OA : l'Antibiotique 81OA est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs aqueux appropriés dans des conditions contrôlées par inoculation avec 3a 5 culture de Streptomyces /griseus MA-2837» Des milieux aqueux comme ceux utilisés pour la production d'autres antibiotiques sont utilisables pour la production de l'Antibiotique 81OA. Ces milieux contiennent des sources de carbone et d'azote assimilables par le micro-organisme et des sels inorganiques. 10 En général, des hydrates de carbone comme des sucres, par exemple le glucose, l'arabinose, le maltose, le xylose, le mannitol, etc, et des amidons comme des céréales, par exemple de l'avoine, du riz, de l'amidon de maïs, de la farine de maïs, etc, peuvent être utilisés isolément ou en combinaison comme 15 sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de la source ou des sources d'hydrates de carbone utilisées dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients du milieu, maie, en général, la quantité d'hydrate de carbone varie habituellement entre 1 # et 6 # environ du poids du milieu. 20 Ces sources de carbone peuvent être utilisées individuellement ou plusieurs de ces sources de carbone peuvent être combinées dans le milieu. En général, n'importe quelle matière du type protéique peut être utilisée comme source d'azote dans la fermentation. Des sources appropriées d'azote comprennent, par exemple, 25 des hydrolysats de levures, de l'autolysat de levures, de la farine de soja, des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de maïs, des matières solubles de distillerie, de la pâte de tomates, etc... Les sources d'azote, isolément ou en combinaison, sont utilisées à raison de quantités comprises entre 30 0,2 et 6 environ du poids du milieu aqueux. Des exemples typique s des milieux utilisables pour la préparation de l'Antibiotique 81OA sont ceux indiqués ci-dessous, Ces milieux et d'autres décrits dans les Exemples ci-après sont seulement des exemples de la grande variété de milieux pouvant être utilisés et 35 ne doivent nullement être considérés comme limitatifs. 46 71 08668 2085702 Milieu I : Extrait de levures Difco 10,0 g Glucose 10,0 g Tampon phosphate* 2,0 cm 5 MgS04 . 71^0 2,05 g Eau distillée 1 000,0 on? Gélose Difco 25,0 g * Tampon phosphate KH2PO4 91,0 g 10 Ha^P04 95,0 g Eau distillée 1 000,0 caa? Milieu II : Extrait de boeuf 3,0 g Aminé NZ* 10,0 g 15 Dextrose 10,0 g NaOl • 5,0 g Eau distillée 1 000,0 o«? pH réglé à 7,2 à l'aide de KaOH * une caséine ayant subi une digestion enftym&tique 20 Milieu III î Dextrose 10*0 g Asparagine 1,0 g 0,1 g MgS04 . 7^0 ^ 0,5 g 25 Extrait de levures 0,5 g Oligo-éléments, mélange ff° 2* 10,0 cm' Eau distillée 1 000,0 cm3 pH réglé à 7,2 à l'aide de NaOH ♦Mélange N°2 d'oligo-éléments : 30 PeS04 . 71^0 1,0 g MnS04 . HjO 1,0 g CuCl2 . 2H20 25,0 mg OaC^ 100,0 mg H3B03 56,0 mg 35 (NH4)6Mo7024 . 41^0 19,0 mg Z11SO4 . 7^0 200,0 mg Eau distillée 1 000,0 cm^ 71 08668 47 2085702 10 15 Milieu IV : Jus V8 Farine de soja 4S de Staley Dextrose 5 Gélose Eau distillée complément à 1 pH 7,9-8,0 Milieu V î Autolysat de levures (Ardamine) Glucose Tampon phosphate* MgS04 . 7H20 Eau distillée pH réglé à 6,5 à l'aide de NaOH solution tampon phosphate î 100,0 cm*' 20,0 g 2,0 g 25,0 g ^ 000,0 cnr' 10,0 g 1°,0 g ^ 2,0 cnr' 0,05 g^ 1 000,0 cnr' 20 25 KB^PO^ ^2^04 Eau distillée Milieu VI : liqueur de macération de maïs (à l'état humide) Dextrose NaCl MgS04 . 71^0 Polyglycol 2 000 Eau distillée 91,0 g 95,0 g ^ 1 000,0 cm'' 40,0 g 20,0 g 2,5 g 0,5 g 0,25 ia en volume (ajouté dans chaque flacon individuellement ) 1 000,0 cm^ 30 pH réglé à 7,0 à l'aide de ITaOH Milieu VII : 35 I-asparagine L-histidine DL-phénylamine Glutamate monosodique NaCl X^HPO^ Ensemencement 5,0 g 4,0 g 5,0 g 2,0 g Production - 5,0 g 4,0 g 2,0 g 1,5 g 5,0 g 2,0 g 71 08668 48 2085702 Ensemencement Production CaCIL, . 21^0 0,4 g 0,4 g M11SO4 . 1^0 0,1 g 0,1 g FeS04 . 71^0 0,1 g 0,1 g 5 ZnS04 . 71^0 0,05 g 0,05 g MgS04 . 71^0 1,0 g 1,0 g ŒLycérol 20,0 g 20,0 g Sucrose 2,5 g 2,5 g Eau distillée 1 000,0 cm^* 1 000,0 cm?* 10 * pH réglé à 7,0 à l'aide de NaOH ** pH réglé à 7,1 à l'aide de NaOH Milieu VIII : Extrait de viande 0,3 $ NaCl 0,5 $ 15 Aminé NZ 1 * Dextrose * 1 56 pH 7,0 La fermentation est conduite à des températures comprises: entre 20 et 37°C environ ; toutefois, pour les meilleurs 20 résultats, il est préférable de conduire la fermentation à des températures comprises entre 22 et 30°C environ. Le pH des milieux nutritifs appropriés pour le développement de la culture de Streptomyces griseus (MA.-2837) et pour produire l'Antibiotique 810A doit être compris entre 5,5 et 8,0 environ» 25 On conduit commodément une fermentation d'Antibiotique . 810A sur une petite échelle en inoculant un milieu nutritif approprié avec la culture de production de l'antibiotique et en permettant à la fermentation de s'effectuer à une température constante comprise entre 24 et 28°C environ pendant une période 30 prolongée, par exemple pendant plusieurs jours. A la fin de la période d'incubation, on enlève le mycélium et on soumet le liquide surnageant à des essais. Dans la pratique, on conduit cette fermentation dans un flacon stérilisé avec développement des germes dans un seul, 35 deux, trois ou quatre étages. Le milieu nutritif pour l'étage d'ensemencement peut être une combinaison appropriée quelconque de sources de carbone et d'azote, par exemple l'un quelconque des Milieux I à VIII décrits ci-dessus. Le flacon d'ensemencement est 71 08668 2085702 secoué dans une chambre à température constante à 28°C environ pendant une période de 1 à 3 jours environ et on utilise le développement résultant pour inoculer soit un deuxième étage d'ensemencement soit le milieu de production. Les flacons 5 d'ensemencement des étages intermédiaires, quand ils sont utilisés, sont développés essentiellement de la même manière, c'est-à-dire que le contenu du flacon est utilisé pour inoculer le milieu de production, les flacons inoculés sont secoués à une température constante pendant plusieurs jours et à la fin de la période 10 d'incubation le contenu du flacon est centrifugé pour élimination du mycélium. Le liquide surnageant ou bouillon est ensuite concentré et purifié pour donner l'Antibiotique 81OA. Pour un travail sur une plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des réservoirs 15 appropriés comportant un agitateur et un moyen pour aérer le milieu de fermentation. Selon ce procédé, le milieu nutritif est préparé dans le réservoir et stérilisé par chauffage à des températures allant jusqu'à 120°C environ. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec 3a culture de production 20 et on permet à la fermentation de s'effectuer pendant taie période de plusieurs jours, par exemple de 2 à 4 jours tout en agitant et/ ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 24-28°C environ» Par des modifications dans le développement de 1'inoculum et des modifications dans le milieu de production, 25 il est possible d'améliorer la production selon un facteur atteignant plusieurs unités et d'augmenter la puissance de l'antibiotique» Méthode d'essai du 81OA utilisant Proteus vulgaris ! On a essayé commodément l'Antibiotique 81OA par une méthode à 30 disques sur plaques utilisant Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 et NRRL B-33-1) maintenu sous la forme d'une culture inclinée sur de la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 fo d'extrait de levures (Difco) comme organisme d'essai. Les géloses inclinées inoculées sont mises à incuber à 37°C pendant 18 à 24 35 heures et conservées à des températures de réfrigérateur jusqu'à utilisation, des cultures fraîches étant préparées chaque semaine. On prépare chaque jour 1'inoculum pour les plaques d'essai en inoculant un Erlenmeyer de 250 cm^ contenant 50 crn^ 50 71 08668 2085702 de bouillon nutritif (Difco) plus 0,2 d1extrait de levures (Difco) avec des raclures provenant de la culture inclinée, le flacon est mis en incubation à 37°C sur une.macine à secousses pendant 18 à 24 heures. La culture en bouillon est 5 ensuite réglée à un facteur de transmission de 40 % à une longueur d'onde de 660 mJA , en utilisant un Spectronic 20 de Bausch & Lonb, par l'addition à la culture d'une solution à 0,2 % d'extrait de levures. Du bouillon non inoculé est utilisé comme témoin pour cette détermination. Le bouillon réglé 10 (30 cm ) est utilisé pour inoculer 1 litre de milieu» On utilise comme milieu d'essai de la gélose nutritive (Difco) plus 0,2 % d'extrait de levures (Difco)» On prépare oe milieu, on le stérilise par passage à l'autoclave et on le laisse refroidir à 50°C. Après inoculation du milieu, on 15 place des portions de 10 cm dans des boites de Pétri stérile» et on permet au milieu de se «olidifier. On conduit les essais sur ces plaques par la méthode des disques sur plaques en utilisant des disques en papier-filtre de 1,27 cm. Les plaques d'essai sont mise» en incubation 20 pendant 20 à 24 heures à 37°C« Les résultats sont exprimée en mm de diamètre de zone d'inhibition. On les utilise pour déterminer les puissances relatives ou, quand on les compare 7 à un étalon de référence purifié, la puissance enjig/cm . Quand on conduit un tel essai d'une façon quantitative, on 25 peut détecter de 2 à 4 ^g/cm d'antibiotique. Méthode d'essai du 81OA utilisant Ylbrio Percolans On a effectué aussi des essais sur le 810A par la méthode des disques sur plaques contre Ylbrio percolans (MB-1272) en utilisant des disques en papier-filtre de 1,27 cm. On 30 prépare les plaques d'essai en utilisant de la gélose nutritive Difco plus 2,0 g/litre d'extrait de levures Difco à 10 crn^ par plaque. Une culture d'une nuit de l'organisme d'essai, Vibrlo percolans (MB-1272) dans du bouillon nutritif plus 0,2 fo d'extrait de levures est dilué dans du soluté physiologique 35 stérile de manière qu'on obtienne une suspension ayant un facteur.de transmission de 40 fo à une longueur d'.onde de 660 mfjt . Cette suspension est ajoutée au milieu à raison de 20 cm'' par litre avant la coulée des plaques. bad ORIGINAL 71 08668 51 2085702 les plaques d*essai sont maintenues à 4°C jusqu'à leur utilisation (5 jours au maximum). Après l'application de disques d'essai saturés d'antibiotique, les plaques sont mises en incubation à 28°C pendant une période de 8 à 24 5 heures. On observe le diamètre en millimètres des zones d'inhibition. Inactivation bactérienne aveo le 81OA î Une étude in vitro a été prévue pour déterminer la résistance de l'Antibiotique 810A à 1'inactivation bactérienne 10 par rapport à la céphalosporine C, à la céphaloridine et à la céphalothine. Cette étude a montré que l'Antibiotique 81OA est plus stable que ces dernières contre certains micro-organismes. la bactérie à effet dégradant utilisée dans cette étude est un organisme connu comme inactivant complètement la 15 céphalosporine C, à savoir Alcaligenes faecalis (MB-9). (a) Préparation de cellules bactériennes î On prépare les cellules d'Alcaligenes faecalis (MB-9) comme suit ï le contenu d'un tube en L est mélangé avec quelques cm de bouillon nutritif contenant 0,2$ d'extrait de levures. 20 la quantité de la bouillie prise par une boucle en fil de platine est étendue sur la surface d'une gélose nutritive inclinée et mise en incubation pendant 18 heures à 37°C. Toutes les cultures inclinées sont conservées à 5°C et utilisées moins d'une semaine après l'incubation,, La quantité du développement 25 superficiel de chaque culture inclinée prise par une boucle de fil de platine est transférée aseptiquement dans 50 cm de bouillon nutritif contenant 0,2 fo d'extrait de levures et on met en incubation en secouant pendant 18 heures à 28°C. la culture est ensuite centrifugée à 4000 tours par minute pen-30 dant 10 minutes, le liquide surnageant est séparé par décantation et la boulette résiduelle de cellules est lavée deux fois à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M stérile, pH 7,5 (6,8 g de phosphate de potassium et 7,1 g de phosphate acide de sodium par litre d'eau distillée), les cellules lavées sont 35 ensuite remises en suspension dans un dixième du volume initial d'une solution de 4 mg/cm^ d'antibiotique dans un. tampon phosphate 0,t M. le mélange d'essai est ensuite mis en incubation sans secousses dans un bain d'eau maintenu à 37°C 52 71 08668 2085702 pendant jusqu'à 4 heures. Les mélanges d'essai sont ensuite centrifugés à 2000 tours par minute pendant 10 minutes et ceci produit un liquide surnageant clair qui est décanté dans des tubes stériles et immédiatement congelé dans de la carboglace 5 jusqu'à ce qu'on soit prêt pour l'essai biologique, habituellement dans les 3 heures. Des témoins sont mis à incuber exactement de la même manière, à l'exception de l'absence de cellules. (b) Degré d'inactivation de l'Antibiotique 81OA : 10 Les liquides surnageant sont essayés en ce qui con cerne l'activité antibactérienne de la manière suivante : des disques en papier de 6,35 mm de diamètre sont humidifiés avec les liquides surnageants et placés sur la surface de plaques de gélose nutritive à l'extrait de levures (0,2 56) qui ont été 15 préalablement ensemencées de l'organisme d'essai approprié. Des plaques d'essai' utilisant B. subtilis (MB-964) sont ensemencées de la manière suivante ï 5 cm^ d'une suspension de spores lavés dans un soluté physiologique à 0,9 ^ sont ajoutés à chaque portion de 150 cm de gélose nutritive à l'extrait 20 de levures (0,2 $) dont on distribue ensuite 5 cm dans des boîtes de Pétri de 15 x 100 mm. Toutes les plaques d'essai sont conservées à 5°C et utilisées dans les trois jours. Les plaques d'essai sont mises en incubation pendant toute une nuit à 25°C avant mesure des zones d'inhibition autour des dis-25 ques d'essai. Des témoins exempts de cellules concernant chaque antibiotique sont essayés à des dilutions de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 et 1:32 de façon qu'on obtienne une courbe de référence normale. Des solutions des antibiotiques d'essai sont essayées 30 à la pleine concentration après incubation en présence des cellules bactériennes lavées. Tous les essais sont effectués en triple. (c) Résultats : On calcule les pourcentages d'inactivation en prenant la moyenne des trois zones d'inhibition ob- 35 tenues pour chaque essai et en déterminant la quantité d'antibiotique restant dans la solution d'essai comme indiqué par la courbe normale. Cette quantité est ensuite soustraite de la •Z concentration de départ (4 mg/cm ) et le reste est divisé par 71 08663 2085702 la concentration de départ et multiplié par 100 pour donner le pourcentage d'inactivation. Les Tableaux XII et XIII suivants présentent l1inactivation obtenue pour la céphalosporine C, la céphalothine et l'Antibiotique 81OA dans les 5 conditions décrites ci-dessus. TABLEAU XII Pourcentage d1inactivation après incubation avec des cellules bactériennes lavées (Essai sur des plaques contenant B. subtilis (KB-9b4) Antibiotique 3 heures d'incubation avec Alcaligenes faecalis 81 OA 0 Céphalosporine C 99 + Céphalothine 62,5 15 TABLEAU XIII Pourcentage d'inactivation après incubation avec des cellules bactériennes lavéea (Essai sur des plaques contenant Y. percolans (MB-1272) 20 25 810A G-ram-négative et résiste à la céphalosporine C. Dans la conduite de l'essai, des mélanges individuels des organismes et l'un des mélanges antibiotiques sont soumis à des prélèvements d'écbantil-30 Ions après 2 heures d'incubation et essayés en ce qui concerne l'activité antibiotique résiduelle,. Le mode opératoire est le même que décrit ci-dessus avec Alcaligenes faecalis» la source de la substance inactivante est une dilution 1 s 160 d'uii filtrat d'une culture à secousses pendant 18 heures à 37°C. d'Aerobacter 35 cloacae MB-2646 dans du bouillon nutritif contenant 0,2 % d'extrait de levures, le Tableau XIV f ci-après, indique le pourcentage d'inactivation de l'Antibiotique 81OA, de la céphalothine, de la céphaloridine et de la céphalosporine 0 sur 7ibrio percolans Antibiotique 3 heures d'incubation 81 OA Céphalosporine 0 Céphalothine avec Alcaligenes faecalis 0 99 + 50 On a détermine aussi la capacité de l'Antibiotique et de la céphalosporine C de résister à l'effet dégradant de la culture d'Aerobacter cloacae (MB-2646). Cette culture est 10 15 71 08668 54 2085702 (MB-1272) par cette méthode * TABLEAU XIV Pourcentage d1inactivation après incubation avec un extrait exempt de cellules (Essai sur des plaques contenant V. percolans (MB-1272) Antibiotique 2 heures d'incubation avec Aerobacter cloacae 81 OA 16 Céphalothine 66 Céphaloridine 96 Céphalosporine C 96 dessus, le Tableau XV ci-après indique la résistance relatibe de l'Antibiotique 810A à 1'inactivation enzymatique par Aerobacter cloacae. La concentration de départ est de 250 pg/»3. !.. résultats sont exprimés en jig/cm^# TABLEAU XV Activité antibiotique résiduelle (fi/t/om^) (Concentration de départ = 250 pg/çm^) 20 Antibiotique Organisme d'essai 2 heures d'incubation avec Aerobacter cloaetw* 810A B. subtilis 964 190 Céphalothine M 140 Céphaloridine t« 25 81 0A V.percolans % 1272 210 Céphalothine n 85 Céphaloridine n * Extrait exempt de'cellules 30 35 remment plus résistant que la céphalosporine G, la céphalothine, et la céphaloridine à 1'inactivation par Aerobacter cloacae. Fermentation de 842A : L'Antibiotique 842A est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutritifs appropriés dans des conditions contrôlées par inoculation avec l'organisme Streptomyces lactamdurans. Sn général, de nombreux milieux qui sont une source de carbone et d'azote peuvent être utilisés pour la production de 842A. Des exemples en sont les milieux aqueux et les sources 71 08668 55 2085702 d'hydrates de carbone et d'azote décrits ci-dessus à propos de la fermentation du 81OA. La quantité exacte des sources d'hydrates de carbone et d'azote dépendra des autres ingrédients compris dans le milieu de fermentation, mais en général la 5 quantité d'hydrate de carbone est habituellement de 1 à 6 $ environ du poids du milieu et la quantité d'azote disponible, isolément ou en combinaison, est habituellement comprise entre 0f2 io environ et 6 fo environ du poids du milieu. Les divers milieux décrits ci-après sont des exemples de ceux qui sont utilisables 10 pour la préparation de l'Antibiotique 842A. Ces milieux sont seulement typiques des milieux qui peuvent être utilisés et ne doivent pas être considérés comme limitatifs, MILIEU IX Levure dite Amber Yeast N° 300 10,0 g 15 Produits solubles de distilleries 20,0 g Dextrose 10,0 g Eau distillée 1 000,0 cvP pH 7,0 MILIEU X 20 Farifae de soja 4S de Staley 30,0 g Produits solubles de distilleries 7,5 g Cérélose 20,0 g NaCl 2,5 g CaOO^ (après pH réglé à 7,0) 10,0 g 25 Eau distillée 1 000,0 cm3 MILIEU XI Levure dite Amber Yeast N° 300 10,0 g Produits solubles de distilleries 20,0 g Eau distillée 1 000,0 on? 30 pH 7,0 La fermentation est conduite à des températures comprises entre 20 et 37°C environ, mais pour les meilleurs résultats il est préférable de conduire la fermentation à des températures comprises entre 24 et 32°C environ. Le pH des milieux 35 nutritifs appropriés pour le développement de la culture de Streptomyces lactamdurans (MB-2908) et pour la production d'Antibiotique 842A doit être compris entre 6,0 environ et 8,0 environ. 71 08668 2085702 On effectue commodément une fermentation à petite échelle d'Antibiotique 842A en inoculant un milieu nutritif approprié avec la culture produisant l'antibiotique et en permettant à la fermentation de se développer à une température 5 constante de 28°C environ sur un appareil à secousses pendant plusieurs jours. A la fin de la période d'incubation, on enlève le mycélium et on essaie le liquide surnageant. tteiris la pratique, cette fermentation est conduite dans un flacon stérilisé avec développement des germes dans un seul, 10 deux, trois ou quatre étages. Le milieu nutritif pour l'étage d'ensemencement peut être une combinaison appropriée quelconque de sources de carbone et d'azote, par exemple l'un quelconque des milieux IX à XI décrits ci-dessus. Le flacon d'ensemencement est secoué dans une chambre à température constante à 28°G envi-15 ron pendant ime période de 1 à 3 jours environ et on utilise le développement résultant pour inoculer soit un deuxième étage d'ensemencement soit le milieu de production; Les flacons d'ensemencement des étages intermédiaires, quand ils sont utilisés, sont développés essentiellement de la même manière, c'est-à-dire 20 que les contenus des flacons sont utilisés pour inoculer le milieu de production, les flacons inoculés sont secoués à une température constante pendant plusieurs jours et à la fin de la période d'incubation les contenus des flacons sont centrifugés pour élimination du mycélium. Le liquide surnageant ou bouillon est 25 ensuite concentré et purifié pour donner l'Antibiotique 842A. Pour un travail sur une plus grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des réservoirs appropriés comportant m agitateur et un moyen pour aérer le milieu de fermentation. Selon ce procédé, le milieu nutritif est 30 préparé dans le réservoir et stérilisé par chauffage à des températures allant jusqu'à 120°0 environ. Après refroidissement, le milieu stérilisé est inoculé avec la culture de production et on permet à la fermentation de s'effectuer pendant une période de plusieurs jours, par exemple de 2 à 4 jours tout en agitant 35 et/ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la te::.- rature à 28°C environ. Par des modifications dans le développement de l'inoculum et des modifications dans le milieu de product- •■■■'. "• 1 est possible aussi d'obtenir une amélioration de la pror' ' BAD ORIGINAL 71 08668 57 2085702 d'un facteur atteignant plusieurs unités et d'augmenter la puissance de cet antibiotique. Méthode de titrage du 842A utilisant Vibrio percolans î On a effectué des titrages par la méthode des disqties 5 sur plaques en utilisant des disques en papier-filtre de 1,27 cm. On prépare les plaques d'essai en utilisant de la gélose nutritive Difco plus 2,0 grammes par litre d'extrait de levures 3 Difco à 10 cm par plaque. Une culture d'une nuit de l'organisme d'essai, Vibrio percolans (MB-1272) dans du bouillon 10 nutritif plus 0,2 tft> d'extrait de levures est diluée dans du soluté physiologique stérile de manière qu'on obtienne une suspension ayant un facteur de transmission de 40 fo à une longueur d'onde de 660 m|i . Cette suspension est ajoutée au milieu à raison de 20 cm3 par litre avant la coulée des plaques. 15 les plaques d'essai sont maintenues à 4°C jusqu'à leur utilisation (5 jours au maximum). Après l'application des • disques d'essai saturés d'antibiotique, les plaques sont mises en incubation à 28°C pendant une période de 8 à 24 heures. On observe le diamètre en millimètres des zones d'inhibition. On 20 utilise ces résultats pour déterminer les puissances relatives ou, quand on les compare à un étalon de référence purifié, la puissance en pg/cm . Quand on conduit un tel essai d'une façon quantitative, on peut détecter de 1 à 2 pg/cm^ d'antibiotique. Inactivation bactérienne avec 842A : 25 Une étude in vitro a été prévue pour déterminer la résistance de l'Antibiotique 842A à l'inactivation bactérierne par rapport à la céphalosporine C, à la céphalorodine et à la céphalothine. Cette étude a montré que l'Antibiotique 842A est plus stable que ces dernières contre certains micro-organismes. 30 les bactéries à effet dégradant utilisées dans cette étude sont deux organismes connus comme inactivant complètement la céphalosporine C, à savoir Alcaligenes faecalis (K3-9) et Alcaligenes viscosus (MB-12). (a) Préparation de cellules bactériennes î 35 On prépare comme suit les cellules d'Alcaligenes viâco- sus (MB-12) et d'A.faecalis (MB-9) * Le contenu d'un tube en L est mélangé avec quelques cm^ de bouillon nutritif contenant 0,2 fo d'extrait de levures. La quantité de la bouillie prise par 71 08668 58 2085702 une boucle de fil de platine est étendue sur la surface d'une gélose nutritive inclinée et mise en incubation pendant 18 heures à 37°C. Toutes les cultures inclinées sont conservées à 5°0 et utilisées moins d'une semaine après l'incubation. la quantité 5 du développement superficiel de chaque culture inclinée prise par une boucle de fil de platine est transférée aseptiquement dans 50 cm' de bouillon nutritif contenant 0,2 fo d'extrait de levures et on met en incubation en secouant pendant 18 heures à 28°C. La culture est ensuite centrifugée à 4000 tours par minute 10 pendant 10 minutes. Le liquide surnageant est séparé par décantation et la boulette résiduelle de cellules est lavée deux fois à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M stérile, pH 7,5 (6,8 g de phosphate de potassium, c'est-à-dire KILjPO^, et 7,1 g de phosphate acide de sodium par litre d'eau distillée). Les cellules lavées 15 sont ensuite remises en suspension dans uix dixième du volume T. initial d'une solution de 4 mg/cm d'antibiotique dans un tampon phosphate 0,1 M, Le mélange d'essai est ensuite mis en incubation sans secousses dans un bain d'eau maintenu à 37°C pendant 4 heures. Les mélanges d'essai sont ensuite centrifugés à 2000 tours 20 par minute pendant 10 minutes et ceci produit un liquide surnageant clair qui est décanté dans des tubes stériles et immédiatement congelé dans de la carboglace jusqu'à ce qu'on soit prêt pour l'essai biologique, habituellement dans les 3 heures. Des témoins sont mis en incubation exactement de la même manière, 25 à l'exception de l'absence de cellules. (b) Degré d1inactivation de l'antibiotique 842A : Les liquides surnageants sont essayée en ce qui concerne l'activité bactérienne de la manière suivante : des disques en papier de 6,35 mm de diamètre sont humidifiés avec les liquides 30 surnageants et placés sur la surface de plaques de gélose nutritive à l'extrait de levures (0,2 qui ont été préalablement ensemencées avec l'organisme d'essai approprié. Des plaques d'essai utilisant B. subtilis (MB-964) sont ensemencées de la manière suivante : 5 cm^ d'une suspension de spores lavés dans 35 un soluté physiologique à 0,8 io sont ajoutés à chaque portion de 'A 150 cm de gélose nutritive à 2 % d'extrait de levures (45°C) 3 dont on distribue ensuite 5 cm dans des boîtes de Pétri de 15 x 100 mm. Toutes les plaques d'essai sont conservées à 5°C et 71 08668 59 2085702 utilisées dans les trois jours. Les plaques d'essai sont mises en incubation pendant toute une nuit à 25°C avant mesure des zones d'inhibition autour des disques d'essai. Des témoins exempts de cellules concernant chaque an-5 tibiotique sont essayés à des dilutions de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 et 1:32 de façon qu'on obtienne une courbe de référence normale. Des solutions des antibiotiques d'essai sont essayées à la pleine concentration après incubation en présence des cellules bactériennes lavées. Tous les essais sont effectués en 10 triple. (c) Résultats : On calcule les pourcentages d'inactivation en prenant la moyenne des trois zones d'inhibition obtenues pour chaque essai et en déterminant la quantité d'antibiotique restant dans la solution d'essai comme indiqué par la courbe 15 normale. Cette quantité est ensuite soustraite de la concentration de départ (4 mg/cm'*) et le reste est divisé par la concentration de départ et multiplié par 100 pour donner le pourcentage d'inactivation. Le Tableau XVI suivant montre 1'inactivation obtenue pour là céphalosporine 0 et pour l'Antibiotique 842A dans 20 les conditions décrites ci-dessus. TABLEAU XVI Pourcentage d'inactivation après incubation avec des cellules bactériennes lavées (Essai sur des plaques contenant B0 subtilis (MB-964) 25 Organisme dégradant 4 heures d'incubation Céph.C Antibiotique .842A Alcaligenes faecalis MB-9 99+ 0 30 A. viscosus MB-12 99+ 54,4 On a déterminé aussi la capacité de l'Antibiotique 842A et de la céphalosporine C de résister à l'effet dégradant de quatre autres cultures. Ces cultures sont les suivantes : 35 Escherichia coli 236, Proteus morganii 251, Proteus morganii 356 et Proteus mirabilis 241. CHacune est Gram-négative et résiste à la céphalosporine C, Pour conduire l'essai, des mélanges individuels des organismes et de l'un des antibiotiques s' ^ 71 08668 60 2085702 soumis à dos prélèvements d•échantillons après quatre heures d'incubation et essayés en ce qui concerne l'activité antibiotique résiduelle, le mode opératoire est le môme que dans la méthode d'essai décrite ci-dessus contre Alcallnenos faecalis 5 MB-9 et A.v1scosus MB-12. Le tableau suivant indique le pourcentage d'inactivation de la céphalosporine C et du 842A sur B.subtilis (MB-964) par cette méthode : ' TABLEAU XVII Culture Céph C Antibiotique 842A Escherichia coli 236 >99 38 Proteus morganii 251 >99 80 Proteus morganii 356 >99 69 Proteus mirabilis 241 72 » 5 Les résultats ci-dessus montrent que l'Antibiotique 842A est, apparemment, plus résistant que la céphalosporine 0 à 1*inactivation par A,faecalis. A.viscosus. Escherichia coli 236, 20 Proteus morganii 251, Proteus morganii 236 et Proteus mirabilis 241. L'Antibiotique 842A qui est obtenu par le présent procédé de fermentation est un composé amphotère avec un point isoélectrique apparent au pH 3,5 environ ; il est instable au-dessus 25 du pH 9,0, mais relativement stable au pH 1,5. Comme l'Antibiotique 810A et l'Antibiotique 842A et leurs sels inhibent efficacement le développement de diverses espèces de Salmonella. ils peuvent être utilisés comme désinfectants dans diverses applications domestiques et industrielles. 30 Par exemple, le 810A présente une activité contre Salmonella schottmuelleri et S. gallinarum et le 842A présente une activité contre Salmonella schottmuelleri 3010, S. gallinarum et S.typhosa et cette propriété est indicative de leur utilité comme agents sanitaires dans des applications domestiques et industrielles. 35 Isolement et purification Antibiotique 810A : l'Antibiotique 810A peut être purifié par absorption sur une résine échangeuse d'ions, par exemple sur des résines synthétiques échangeuses d'anions dérivées BAD ORIGINAL 71 08668 61 2085702 de dextrose ou des copolymères acryliques ou des polymères réticulés non ioniques. L'antibiotique absorbé est élué de la résine ou du polymère à l'aide d'eau ou d'une solution alcoolique aqueuse d'un sel approprié corame le chlorure d'ammonium, le 5 chlorure de sodium, etc... Comme exemples des résines échangeusec d'ions et des polymères qui peuvent être utilisés, on peut mentionner, notamment, les milieux DEAE Sephadex A-25, Amberlite IRA-68 et Amberlite XAD-2 décrits ci-après. Si on le désire, l'éluat obtenu selon le mode opératoire précédent peut être encore 10 purifié par une deuxième et une troisième étapes d'absorption et d'élution. Des concentrés de tous les éluats sont ensuite obtenus pour donner le produit purifié. Constituants du 810A î l'Antibiotique 81OA peut être séparé en ses constituants, l'acide 7 |3-(D-5-amino-5-carboxy-15 valéramido)-3-(a -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et l'acide 7 p-(D-5-amino-.5-carboxyvaléramido)-3-(a-méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-oarboxylique, par des techniques chromatogra-phiques. Celles-ci comprennent t 20 (1) lia chromatographie sur une résine échangeuse d'anions fortement hydrophile comme celle dite DEAE Sephadex A-25*, développée avec un système bromure d'ammonium-acide formique. Diverses concentrations de ce système peuvent être utilisées, mais-dans la pratique, on préfère une solution 0,5 M de bromure 25 d'ammonium et 0,1 M d'acide formique. (2) la chromatographie sur une résine échangeuse d'anions faiblement basique comme celle dite Amberlite IEA-68**. C'est une séparation par groupes où la matière à l'état brut est introduite à rai pH de 3 à 3,5 environ et élué d'abord avec un 30 acide à un pH de 2 environ et ensuite avec lîaCl/HOl à un pïï de 1 environ. (3) la chromatographie sur un polymère polystyrène réticulé non ionique comme celui dit Amberlite XAD-2***» l'élution est effectuée avec un système aqueux approprie, nais, 35 en général, il est très avantageux d'utiliser un mélange d'eau et d'une alcoylcétone inférieure. Des exemples typiques des éluants qui peuvent être utilisés sont, notamment, une solution aqueuse à 10 fo de méthanol suivie d'une solution aqueuse à 50 % 71 08668 .2085702 de méthanol. En variante, une solution aqueuse à 20 % d'acétone peut être substituée à la solution aqueuse à 50 % de méthanol. * DEAE Sephadex A-25 est une résine synthétique échangeuse d'anions dérivée du polysaccharide dextrane à sa forme 5 chlorure, c'est-à-dire avec des ions antagonistes chlorure ; Pharmacia. Fine Chemicals, Inc0, 800 Centenial Avenue, Piscataway, New Market, New Jersey 08854. ** Résine synthétique échangeuse d'anions ; un copolymère acrylique réticulé contenant un groupe amino tertiaire faible-10 ment basique ; Rohm & Haas Co., Philadelphie, Pennsylvanie 19105» *** Polymère polystyrène réticulé non ionique absorbant f Rohm & Haas Co., Philadelphie, Pennsylvanie 19105. Les produits individuels obtenus par les teohniquee ci-dessus peuvent être purifiés par nouvelle chromatographie# Par 15 exemple, l'acide 713 -(D-5-amino-carboxyvaléramido)-3—(oc -méthoxy— p-suJfooxyc innamoylo xyméthyl ) -7-méthoxy-3-c é phe m-4-carboxylique (le) peut être repurifié par exposition de ce produit à la teeh-nique de purification décrite comme Méthode I ci-deseua, avec ensuite relargage sur l'absorbant Amberlite XAD-2 f et l'acide 20 7p> -(D-5-amino-5-carboxy-valéramido)-3-(ex -méthoxy-p-hydroxycinna- • moyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique peut être repurifié par nouvelle chromatographie sur une résine échangeuae d'anions Sephadex A-25 développée avec une solution 0,5 M de "bromure d'ammonium et 0,05 M d'acide acétique. 25 Antibiotique 842A : l'Antibiotique 842A peut être pu rifié par absorption sur une résine échangeuse d'ions, par exemple sur des résines composées de milieux d'échange ammonium quaternaire ou acide sulfonique. L'antibiotique absorbé est élué à l'aide de solution aqueuse ou d*une solution alcoolique aqueuse 30 d'un sel approprié comme le chlorure d'ammonium, le chlorure de sodium, etc... Des résines éehangeuses d'ions utilisables comprennent, par exemple, les résines polystyrène-acide sulfonique nucléaire (45 % ou 53 i° d'eau) ou polystyrène-triméthylbenzyl-ammonium (4*3 $ d'eau) qui sont connues sous les désignations 35 Dowex 5C et Dowex 1, respectivement. Si on le désire, l'éluat obtenu selon le mode opératoire précédent peut être encore purifié par une deuxième et une troisième étapes d'absorption et d'élution. Des concentres de tous les éluats sont ensuite obtenus pour donner le produit 842A purifié. BAD ORIGNAL 71 08668 63 2085702 Cotco.'- "î ions 'Antil;jotiquo biOA et sen constituants individuels et l'Antïbictique G\?k peuvent Ctre utilisés isol-'nant ou on combinaison co:?.n>2 ingrédient actif dnr.s l'une quelconque de 5 diverses préparations pharim.ceutiques. Ces antibiotiques et leurs sels correspondants peuvent être utilisés sous la forme de capsules ou de comprimés, de poudres, de solutions ou suspensions liquides ou d'élixirs. Ils peuvent ôtre administrés oralement ou par voie intraveineuse ou intramusculaire. Des véhicules appro-10 priés qui peuvent utilisés dans la composition comprennent, par exemple, la mannitol, le sucrose, le glucose ou des liquides stériles comme de l'eau, un soluté physiologique, des glycols et des huiles dérivées du pétrole ou d'origine animale, végétale ou synthétique, comme par exemple l'huile d'arachide, l'huile minérale 15 ou l'huile de sésame. Par ailleurs, en plus d'un véhicule, les présentes compositions peuvent comprendre aussi d'autres ingrédients comme des stabilisants, des liants, des anti-oxydants, des agents de conservation, des lubrifiants, des agents de mise en suspension, des agents de viscosité, des parfums, etc... De plus, 20 la composition peut comprendre aussi d'autres ingrédients actifs pour fournir un plus large spectre d'activité antibiotique. les doses à administrer dépendent dans une large mesure de l'état du sujet que l'on traite et du poids de l'hôte. la voie parentérale est préférée pour des infections généralisées 25 et la voie orale pour des infections intestinales. En général, les doses journalières sont comprises entre 15 et 175 mg environ d'ingrédient actif par kg de poids du corps du sujet en une seule ou plusieurs applications par jour. Des doses journalières préférées pour l'Antibiotique 810A ou ses constituants individuels 30 sont comprises entre 20 et 40 mg environ d'ingrédient actif par kg de poids du corps. Les doses journalières préférées pour l'Antibiotique 842A sont comprises entre 40 et 80 mg environ d'ingrédient actif par kg de poids du corps. Les présentes compositions peuvent être administrées 35 sous plusieurs présentations unitaires, par exemple des présentations solides ou liquides pour administration orale. Les compositions, en doses unitaires, qu'elles soient liquides ou solides, contiendront généralement de 15 à 700 mg environ bad original 64 7" 08668 2085702 d'ingrédient U. par rapport au poids total des compositions ; toutefois, tr-- .v-uéral, il est préférable d'utiliser des doses unitaires comprises entre 80 et 320 mg environ,. Dans l'administration parentérale, la ^'ésentation unitaire est habituellement 5 le composé pur dans une solution aqueuse stérile ou une poudre soluble destinée à être dissoute. Pour une présentation unitaire typique, on mélange 120 mg d'Antibiotique 810A ou 120 mg de l'un de ses constituants ou de l'un de ses sels avec 20 mg de lactose et 5 mg de stéarate 10 de magnésium et on place les 145 mg de mélange dans une capsule en gélatine N°3. D'une manière similaire, en utilisant une plus grande quantité de 1'ingrédient actif et moins de lactose, d'autres présentations peuvent être réalisées dans des capsules en gélatine N° 3 et, s'il est nécessaire de mélanger ensemble 15 plus de 145 mg des ingrédients, on peut utiliser des capsules plus grosses. D'une manière similaire, on peut aussi préparer d'autres présentations unitaires comme des comprimés et des pilules. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration. Capsule remplie à sec contenant 120 mg d'acide 7fï-(D-5-20 amino-5-carboxyvaléramido )-3-( a -méthoxy-p-sulfo oxyc innamoyl- oxyméthyl)-7-méthoxy-3-oéT>hem-4-carboxylique (le) __ Par capsule Acide 7 fi - ( D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3-(a -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)- 25 7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) 120 mg Lactose 20 mg Stéarate de magnésium 5 mg Capsule N° 3 145 mg L'acide 7£-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oc -30 méthoxy-p-sulfooxynnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxy~ lique (le) est réduit à l'état d'une poudre N° 60 et ensuite on fait passer le lactose et le stéarate de magnésium à travers une toile à tamis ÏT0 60 pour les ajouter à la poudre et les ingrédients combinés sont mélangés pendant 10 minutes et utilisés ensuite po/v 35 le remplissage de capsules en gélatine sèche N° 3. En substituant 40 mg d'Antibiotique 842A et 100 mg de lactose aux 120 mg d'ingrédients actif et aux 20 mg de lactose spécifié;; dans la formule ci-dessus, on obtient une capsule ©AD 71 08668 65 2085702 145 mg qui convient aussi pour administration orale. Comprimé contenant 250 mg d'acide 7 S -(D-5-amino-5-carboxy-valéramido)-3-(oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxv-3-oé-phem-4-carboxylique (le) 5 Par com-prims Acide 713 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamo3>-loxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) Phosphate dicalcique, U.S.P. 250 mg 192 mg 10 Stéarate de magnésium Lactose, U.S.P, 5 mg 65 mg le constituant actif est mélangé avec le phosphate dicalcique et le lactose. Le mélange est granulé avec un empois à 15 # d'amidon de maïs (6 mg) et grossièrement tamisé. Il est 15 séché à 45°C et tamisé de nouveau à travers de tamis IT0 16, On ajoute le reste de l'amidon de maïs et le stéarate de magnésium et on comprime le mélange pour obtenir des comprimés d'environ 1,27 cm de diamètre pesant chacun 800 mg. Solution parenterale contenant 500 mg d'acide 7j3 -(D-5-amino~5-20 carboxyvaléramido)-3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)- 7-méthoxy-3-céT?hem-4-carboxylique (le) Ampoule Acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( cc -méthoxy-p-sulfooxynnamoyloxyméthyl)-25 7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) 500 mg Ampoule : méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthcxy-3-céphsm~4-30 carboxylique (le) peut être administré isolément ou en combinaison avec d'autres ingrédients biologiquement actifs, par exemple avec d'autres agents antibactériens comme la linconyciae, une pénicilline, la streptomycine, la novobiocine, la gentamicine, la néorr.ycine, la colistine et la kanamycine, 35 En substituant une quantité équivalente d'acide 17 3- ( D-5-amino-5-carboxy valéramido ) -3-( carbar.oyloxymé^hyl ) -7-&s thozy-3-céphem-4-carboxylique (Ib) aux 500 3g d'acide 7 3-/D-5-aminû~5-carboxyvaléramido)-3-( a -méthoxy-p-sulfooxycinna!noyIcx;méthyl)-7- Diluant : Eau stérile pour injection L'acide 7 £-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(a - 66 71 08668 2085702 méthoxy-3-cépheip-4-carboxylique (le) spécifié dans la formule précédente, on obtient aussi une composition appropriée pour administration parentérale. Procédés synthétiques 5 Outre les produits de fermentation décrits ci-dessus, la présente invention comprend des dérivés dans lesquels la portion 3-carbamoyloxy du 842A est remplacée par une grande variété de substituants. En général, on effectue ce remplacement ou cette substitution en traitant simplement le 842A par un 10 réactif capable de transformer la portion 3-carbamoyloxy de façon à donner le substituant R désiré (voir la formule I, ci-dessus)» Toutefois, dans la pratique, avant le remplacement du radical 3-carbamoyloxy, il est fréquemment nécessaire de "protéger" les groupes amino et carboxy libres en traitant le 842A avec un 15 agent de blocage de l'azote comme N-(alcoxy inférieur)-carbonyl-phtalimide et un agent d'estérification de façon à former le diester d'acide 7 3-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3— (carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique correspondant (Composé II, ci-après). Les agents d'estérification appro-20 priés comprennent le phényldiazométhane ou le diphényldiazo- méthane et les composés du même genre. Egalement, d'autrea agents de blocage de l'azote qui peuvent être utilisés au lieu du N-(alcoxy inférieur)-carbonylphtalimide comprennent le tertbutyl-oxyazothydrure ou des halogénures de trihalogén 0 éthoxy-25 carbonyle comme le chlorure de trichloroétnoxycarbonyle et les composés du même genre, l'équation suivante dans laquelle l'agent de blocage de l'azote est un N—(alcoxy inférieur)-carbonylphtalimide illustre cette réaction ; toutefois, il y a lieu de comprendre que d'autres agents de blocage de l'azote 30 comme ceux mentionnés ci-dessus peuvent être substitués aux précédents dans la réaction par ailleurs similaire pour donner le dérivé N-substitué correspondant î 71 08668 67 2085702 o u OCIL HOOC-CH- ( CI^ ) 5-GiïII MHg R15R14C=JI. S 7/ \ N O - GH2OGîm2 + C2H50C-1T COOH Ib O !! OCRj HOOG-OH-(OHg)3-CKH- 0=0 0=0 0 \ // X s -R - CE^OGNH COOH 0 0=0^ >0=0 N ^i-CHgOCNI^ COOCHR13R14 ^ / II 10 où R^ ^R^ 4C=ÏÏ2 est le diazométhane ou un aryl-diazométhane comme le phényldiazométhane ou le diplienyldiazometliane, etc.., et b}^ et R^4 représentent chacun l'hydrogène ou le groupe phényle. Le composé (II) ainsi obtenu est la matière de départ dans les procédés synthétiques suivants. On obtient l'analogue 3-hydroxyméthyle du 842A en traitant le Composé II ci-dessus par un halogénure de nitro-syle comme le chlorure de nitrosyle dans un solvant approprié comme le chlorure de méthylène. L'équation suivante illustre ce procédé de préparation ; 71 08668 68 2085702 0 °™3 R1 3Rl4HCW)00-0H-(0H2)3-0-S!ili-î ^ \ O JL 0=C^ ^c=o .y N ^1-CH20CNH2 COO-CHR1 ¥ 4 \\ / II NOŒL/C^Clg O 9^3 H15R1 ^C-OOC-CH- ( CH2 ) j-C-JIH. 0=0^^0=0 0 COO-CHR1 V 4 III 1 *5 14- où R D et R sont tels que définis ci-dessus. Le diester ainsi obtenu, de préférence l'ester dibenzylique (Illa, ci-après), peut être transformé ensuite en l'amino-acide libre correspondant (IV, ci-après) par hydrogénation catalytique et traitement par l'hydrate d'hydrazine dans une solution "basique. Le déblocage par ce procédé s'effectue très commodément quand le réactif diester est l'ester dibenzylique (Illa), L'équation suivante illustre ce procédé de préparation : 71 08668 69 2085702 OCEL chgooc-ch-(ch2)3-c-hh- o=cr o=o o Illa X r^3\ I J-CH2OH COO—OI^ 0 °®3 « \ HOOC-CH-(GHg)3-C-MH 0=0^ 0=0 c w / MI^ÎIHg'HgO Base i OCEL î| -S MOOC-CH-(CELj )^-C-NH—5 —/ \ I îî ^J-CHgOH COOM IV où M est le cation dérivé d'un aétal alcalin ou d'un métal alcalino-terreux. On obtient commodément les analogues 3-carbamoyloxy ïï-monosubstitués et N,N-disubstitués du 842A en traitant le diester d1 acide 7 3-(D-5-phta3.oylairàno-5~oarboxyireJ.éraiTiiào} ~ 3- (hydroxyn:éthyl) -7-méthoxy—3-céphem-4-carbozylioue f de préférence sous la forme de son ester de dibenzhydryle (Illb, ci-après), par un halogénure de carbonyle comme le chlorure de 71 08668 70 2085702 carbonyle (c'est-à-dire le phoegène) ou le bromure de carbonyle, avec ensuite réaction de l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 3-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(halogénoformyl-oxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (V, ci-après) ainsi obtenu avec la mono-(alcoyl inférieur)-aminé; ci-(alcoyl inférieur)-aminé ou aminé hétérocyclique appropriée s oo^l où OOX2 est un halogénure de carbonyle comme le chlorure de 71 08668 71 2085702 10 carbonyle (c'est-à-dire le phosgène) ou le bromure de carbonyle et X est un atome d'halogène, par exemple le chlore, de 1 S 16 brome, etc..., HUE. R est une aminé primaire ou secondaire choisie parmi les mono-(alcoyl inférieur)-aminés, les di-(alcoyl inférieur)-aminés et les aminés hétérocycliques et 4 ç- 4 r R 5 et R représentent des groupes alcoyles inférieurs tels que méthyle, éthyle, n-propyle, n-butyle, etc..., et, pris ensemble, R1^ et R14 peuvent être combinés avec l'atome d'azote sur lequel ils sont fixés pour donner une aminé hétérocyclique choisie parmi la pyrrolidine, la pipéridine et la morpholine. Le produit (VI) ainsi obtenu peut être ensuite transformé en l'amino-acide libre correspondant par traitement par l'acide trifluoro-acétique dans le xylène et ensuite par l'hydrate d'hydrazine dans une solution basique : co-ooc-ch-(ch2)^-g-nh ? R15 -ŒLjOCBT^ R 000CH- VI 0 hooc-ch-Cch^-c-: ■NH- o=c c=o y h00ggp, s. -cilocn: cooh If. ^R 'R 15 16 \\ / Va ïïh2i'ih2,1^0 Base 71 08668 72 2085702 o !! OCEL MOOC-CH-(CH~) I 3 ^2 S ^ N ■N -CH200N' GOOM H 15 R 16 1 C 4 /T oîi M et E 3 et R sont tels que définis ci-dessus. Un autre procédé pour préparer les dérivés N-mono-substitués du 842A consiste à traiter le composé III, ci-après, ou un sel dibasique de ce composé, avec un isocyanate 5 approprié. Cette réaction est très avantageusement conduite en présence d'une base organique forte comme la triéthylamine et en présence d'un solvant inerte comme le diméthylformamide, le chlorure de méthylène, le tétrahydrofuranne ou l'acétoni-trile : CCH, il H13R1 ^COOC-GH- ( CHp ) ,-GNB I 3 jf 0=0^ ^c=o o4 \ j| + oc=aiR •HL ^-CHgOH COOCHR13R14 17 \ / III 0 II OCH, R1 V ^000C-CH- ( CHr, ) ,-CNH-! .H o=c 0=0 0^ s -GH 0CNHR C00CHR15R1 4 17 v 17 où R est \in groupe alcoyle inférieur, alcoyle inférieur halogène comme chlor orné thyle, 2-chloroéthyle ou chloro-i; butyle, etc. oo,. «lcoxy-carbonyle inférieur coa.-e »'tl* » bad °wG,nW" 71 08668 73 2085702 etc..., aryle monocyclique ou bicyclique comme phényle, naphtyle, etc..., alcarylsulfonyle monocyclique comme p-tolylsulfonyle, etc. ou benzhydryle. Des exemples typiques des isocyanates (c'est-à-17 dire OC-NR ) qui peuvent être utilisés dans la réaction 5 sont, notamment, l'isocyanate de méthyle, l'isocyanate d'éthyle, l'isocyanate de tert-butyle, l'isocyanate de chlorométhyle, l'isocyanate de j3-chlor oéthyle, le carbéthoxy-isocyanate, l'isocyanate de phényle et l'isocyanate de benzhydryle, les produits obtenus par ce procédé peuvent être 10 transformés ensuite en l'amino-acide libre correspondant par 5-6 procédé décrit précédemment, c'est-à-dire par traitement par l'acide trifluoro-acétique dans le xylène, suivi de la réaction du produit intermédiaire résultant avec l'hydrate'd'hydra-. zine en solution basique. 15 Les dérivés 3-acylés de la présente invention corres pondant à la formule I où R est un groupe alcanoyloxy inférieur, carbanoylozy à substitution aromatique, aralcanoyloxy ou cycloalcane-carbonyloxy sont obtenus commodément en traitant l'ester de dibenzhydiyle de l'acide 73-(D-5-phtaloylamino-20 5-carbozyvaléramiâo)-3 - (hydroxyméthyl)-7-méthozy-3-céphem-4-oarboxylique (Illb) par un halogénure d'acyle approprié. L'équation suivante illustre ce procédé de préparation î 71 08668 74 .2085702 18" où B. est un groupe alcoyle inférieur tel que méthyle, éthyle, etc..., aryle monocyclique ou bicyclique comme phényle, un hétérocycle azoté monocyclique comme 4-pyridyle, etc..., naphtyle, etc..., un radical aralcoyle inférieur monocyclique ou bicycli-5 que comme benzyle, ménaphtyle, etc.., ou cycloalcoyle contenant 5 ou 6 atomes de carbone dans le cycle comme cyclopentyle ou cyclohexyle et X est tel que défini ci-dessus. Ici encore, le produit ainsi obtenu peut être transformé en l'amino-acide libre correspondant par traitement par l'acide trifluoroacétique dans 10 le xylène, suivi de la réaction du produit intermédiaire résultant avec l'hydrate d'hydrazine dans une solution basique. On obtient commodément les analogues 3-méthyle du 842A par la réduction du 842A ou de l'un de ses sels, par exemple par l'hydrogénation catalytique d'un sel correspondant de métal 15 alcalin ou de métal alcalino-terreux. Des catalyseurs qui peuvent être utilisés dans ce procédé comprennent, par exemple, n'importe lesquels des métaux du groupe VIII du tableau périodique des éléments, par exemple, le palladium, le platine ou le nickel. L'équation suivante illustre ce procédé de 20 préparation s HOOC-CH-CCÏ^ )3-C-NH NH^ 0 II CH20CNH EL, / cat alys eur COOH 0 II H00C-CH-(CH2)3-C-NH ^2 0 COOH I 75 71 08668 2085702 les dérivés de 842A qui ne sont pas préparés par les procédés précédents peuvent être obtenus en traitant un analogue 3-acétoxyméthyle de 842A, par exemple un analogue-3-(alcanoyl inférieur)-oxyméthyle comme l'acide 73-(D-5-5 amino-5-carboxyvaléramido)-3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique par la thio-urée, la thio-urée N-subs-tituée, le thiol, le dithiocarbamate, le dithiocarboxylate, 1'aminé, la pyridine, la pyridine substituée au noyau, le sulfinate de métal alcalin, l'azothydrure, le polyhydroxy-10 benzène ou le N-(alcoyl inférieur)-indole appropriés. Les produits résultants peuvent être ensuite purifiés par des techniques classiques, par exemple par recristallisation à partir de solvants appropriés comme le méthanol et l'eau ou par fractionnement à l'aide d'une résine échangeuse d'ions appropriée. 15 En plus de l'analogue 3-acyloxyméthyle du 842A, on a trouvé que le 842A lui-même peut être utilisé comme matière de départ dans la réaction avec la thio-urée et les azothydrures de métaux alcalins, etc.*. Par exemple, le 842A peut être traité par la thio-urée, la thio-urée N-substituée, la thio-urée N,N-20 disubstituée, l'azothydrure de métal alcalin, le thiazole, le thiadiazole, l'agent d'halogénation ou le thiocyanate de métal alcalin appropriés pour donner les analogues correspondants 3-thio-uroniumméthyle, 3-azidométhyle, 3-thiazolylmercapto-méthyle, 3-thiadiazolylmercaptomé thyle, halogénométhyle et 25 3-thiacyanatométhyle du 842A. En principe, il est nécessaire seulement de combiner les matières de départ pour effectuer la Synthèse, mais dans la pratique il est habituellement souhaitable de catalyser I4 réaction par l'application de chaleur, par exemple en chauffant à des températures comprises entre 30 45°0 environ et 95°C environ pendant une période comprise entre 2,5 jours environ et quelques minutes. Une température opératoire préférée est comprise entre 75 et 80°C environ et on a obtenu aussi de bons rendements en chauffant les corps en réaction à 95°C pendant 8 minutes environ. Egalement, dans 35 certains cas, il est avantageux de protéger le groupe amino libre dans la chaîne latérale 5-amino-5-carboxyvaléramido du 842A en traitant ce dernier avec le tert-butoxycarbonyl-azothydrure ou un groupe de blocage similaire. L'acide 73- 76 71 08668 2085702 (D-5-Iï-tert-buto:Kycarbonylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(cr r-bamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique résultant peut être traité ensuite par la thio-urée, l'azothydrure le métal alcalin, le thiazole, le thidiazole, l'agent d'halosénation 5 ou le thiocyanate approprié de façon à introduire le substituant désiré dans la position 3 du noyau de 842AÇ sans le risque de réactions secondaires malencontreuses. Les produits intermédiaires ainsi obtenus peuvent être ensuite débloqués par traitement par un réactif approprié comme l'acide tri-10 fluoroacétique pour donner le produit désiré. Le dérivé 3-azidométhyle de 842A obtenu par le procédé précédent est transformé en son analogue 3-aminométhyle correspondant par réduction. Des moyens appropriés comprerjaent, par exemple, la réduction moléculaire et l'hydrogénation sur 15 tan catalyseur métallique approprié comme les métaux du groupe VIII du tableau périodique dss éléments. Des exemples typiques des métaux qui peuvent être utilisés comprennent, notamment, le platine, le palladium, le nickel et leurs combinaisons. On conduit très avantageusement la réduction ,1éculaire 20 du dérivé 3-azidométhyle en ajoutant de la poudre de zi^c à une solution acide du corps en réaction 3-azidométhyle. La solution résultante est ensuite traitée par l'hydrogène sulfuré ou une matière équivalente pour éliminer le zinc soluble de la solution sous la forme d'un précipité. Le produit ainsi 25 obtenu est l'analogue 3-aminométhyle sensiblement pur du 842Aa Les produits (I) de la présente invention forment line grande variété de sels pharmacologiquement acceptables avec des bases minérales ou organiques ; ces sels comprennent par exemple, des sels de métaux comme ceux dérivés d'hydroxydes, 30 carbonates et bicarbonates de métaux alcalins et alcalino-terreux et des sels dérivés d'aminés primaires, secondaires et tertiaires comme des monoalcoylamines, des dialcoyl-3 jines, des trialcoylamines, des (alcanol inférieur)-aminés, deo di (alcanol inférieur)aminés, des (alcoylène inférieur)dia: ■ es, 35 des N,N-diaralcoyl(alcoylène inférieur)-diamines, des ar?l-coylamines, des alcanols inférieurs aminés, des alcarol.K /■'-rieurs à substitution N,ïï-di(alcoyl inférieur)amino, des hckh-s alcanoïques inférieurs à substitutions amino, polya.n• 77 71 08668 2085702 nidino et des aminés hétérocycliqueù contenant de l'azote. Des exemples représentatifs de ces sels comprennent les sels dérivés d'hydroxyde de sodium, de carbonate de sodium, de bicarbonate de sodium, de carbonate de potassium, d'hydroxyde de potassium, 5 de carbonate de calcium, etc... et les sels dérivés d'aminés comme la triméthylamine, la triéthylamine, la pipéridine, la morpholine, la quinine, la lysine, la protamine, l'arginine, la procaïne, 1*éthanolamine, la morphine, la benzylamine, l'éthyl-ènediamine, la N,N'-dibenzyléthylènediamine, la diéthanolamine, 10 la pipérazine, le diméthylaminoethanol, le 2-amino-2-méthyl-1-propanol, la théophylline, la N-méthylglucamine, etc ... Les sels mentionnés ci-dessus peuvent être des sels monobasique s comme le sel monosodique obtenu, par exemple, en traitant un équivalent d'hydroxyde de sodium par un équivalent 15 de produit '(I) ou des sels dibasiques mixtes obtenus en traitant un équivalent du sel monobasique par un équivalent d'une base différente. En variante, on peut obtenir les sels dibasiques en traitant un équivalent d'une base ayant Tan cation divalent comme l'hydroxyde de calcium par un équivalent 20 du produit (I). De plus, on envisage aussi des sels et esters mixtes comme ceux obtenus en traitant le produit (I) par tux équivalent d'hydroxyde de sodium et ensuite par un équivalent d'acide lactique. Les sels de la présente invention sont des dérivés non 25 toxiques pharmacologiquement acceptables qui peuvent être utilisés comme ingrédient actif dans des présentations pharmaceutiques en doses unitaires appropriées. Egalement, ils peuvent être combinés avec d'autres médicaments pour donner des compositions ayant un large spectre d'activité. En outre, 30 les présents sels et aussi les dérivés esters et amides correspondants sont utiles comme produits intermédiaires pour la préparation du produit acide carboxylique représenté par la formule I ci-dessus. Et également, ces sels peuvent être utilisés pour préparer d'autres sels pharmaceutiquement acceptables. 35 En plus des sels, les présents produits (I) peuvent aussi être transformés en leurs mono- et diesters et mono- et di-amides correspondants, par exemple les esters de pivaloyloxy-méthyle ou de dibenzhydryle ou les esters d'alcoyles, de cyclo- 78 71 08668 2085702 alcoyles, d'arykes ou d'aralcoyles, par exemple les esters de méthyle, d'"éthyle, de cyclohexyle, de phényle et de ben-zyle ou les amides, diamines, N-alcoyle inférieur-amides, N,ÎT-di-alcoyle inférieur-amides, N-aralcoylamines, N,ïï-5 diaralcoylamides ou amides hétérocycliques comme les lî-méthyl et N-éthylamide, N,N-diméthylamide, N,N-diéthylamide, N-benzvl-amide, !T,ÎT-dibenzylamide, pipéridide, pyrrolidide ou raor-pholide, etc... Des procédés pour la préparation des dérivés esters et 10 amides mentionnés ci-dessus comprennent la réaction du produit acide carboxylique (I) ou de l'halogénure d'acide correspondant avec le méthanol, l'éthanol, le oyclohexanol, le phénol, l'alcool benzylique ou le dibenehydrol. D'une manière similaire, on peut obtenir les dérivés amides 15 en traitant l'halogénure d'acide correspondant par l'ammoniac ou l'alcoylamine, là dialcoyfamine, l'aralcoylamine ou l'amins hétérocyclique appropriées» Ces procédés et d'autres procédés classiques pour la préparation de ces esters et amides seront évidents pour l'homme de l'art. 20 les exemples qui suivent illustrent les procédés par lesquels les produits de la présente invention peuvent être obtenus. Toutefois, les exemples sont donnés seulement à titre d'illustration et il sera évident pour l'homme de l'art que la présente invention comprend d'autres produits fonction-25 nelement équivalents et des procédés pour leur préparation. Par conséquent, toute modification de cette synthèse qui entraîne la formation d'un produit identique doit être considérée comme constituant un procédé analogue, le procédé revendiqué est susceptible de nombreuses variantes et modifications et 30 par conséquent toute modification mineure ou extension de ce procédé est considérée comme à la portée de l'homme de l'art et comprise dans le cadre général de la présente invention. Exemple 1 Antibiotique 810A 35 Un tube lyophilisé de culture de Streptomyces griseus (MA-2837) est ouvert aseptiquement. On utilise le contenu pour inoculer quatre échantillons d'un milieu nutritif solide incliné ayant la composition suivante : 71 08668 79 2085702 Milieu I ï Extrait de levures Difco 10,0 g Glucose 10,0 g 3 Tampon phosphate* 2,0 cm 5 MgS04 . 71^0 0,05 g Eau distillée 1 000,0 cm3 Gélose Difco 25,0 g * Tampon phosphate : 91,0 g 10 Na2ÏÏP04 95,0 g Eau distillée 1 000,0 cm3 On prépare les milieux solides inclinés en plaçant 14 cm du milieu dans un tube à culture de 22 x 75 mm» On bouche ensuite le tube avec du coton, on le chauffe à 120°C pendant 15 15 minutes pour effectuer la stérilisation et on laisse solidifier le milieu dans une position inclinée; Les milieux solides inclinés inoculés sont mis en incubation à 28°C pendant une semaine et ensuite conservés à 4°0 jusqu'à utilisation. La culture sur l'un de ces milieux solides inclinés est ensuite 20 utilisée pour inoculer des fioles d'Erlenmeyer (250 cm ) munies de chicanes contenant 50 cm du Milieu II, ci-après, par ad-dition de 5 cm de milieu stérile, raclage de la surface de la culture inclinée pour mise en suspension du développement et introduction aseptique à la pipette de 1 cm de la suspension 25 dans chacune des trois fioles d'ensemencement. Le Milieu II a la composition suivante : Milieu II ï Extrait de boeuf 3,0 g Aminé ÎTZ* 10,0 g 30 Dextrose 10,0 g NaCl 5,0 g Eau distillée 1 000,0 cm3 pH réglé à 7,2 à l'aide de NaOH * Caséine ayant subi une digestion enzymatiquee 35 La fiole d'ensemencement est secouée sur un appareil rotatif à secousses tournant à 220 tours par minute avec une course de 5 cm environ pendant 3 jours. La culture dans la fiole d'ensemencement est utilisée ensuite pour inoculer II 71 08668 80 2085702 fioles d'Erlenmeyer de 2 litres munies de chicanes contenant *Z - chacune 350 cm de Milieu III en utilisant un inoculum à 2-3 i°« Le Milieu III a la composition suivante : Milieu III : 5 Dextrose 10,0 S Asparagine 1,0 g K2HPO4 0,1 g MgS04 , 7^0 0,5 g Extrait de levures 0,5 g 10 Mélange N° 2 d*oligo-éléments* 10,0 __3 cm Eau distillée 1 000,0 cm3 pH réglé à 7,2 à l'aide de HaOH ♦Mélange d'oligo-éléments N° 2 15 PeSO^ , 71^0 1,0 6 MnSO^ , HgO 1,0 g CuCl2 ; 2^0 25,0 mg OaOlg 100,0 mg H5B03 56,0 mg 20 (î®4>6*!07°24 * 4H2° 19,0 mg ZHSO4 . 200,0 mg Eau distillée 1 000,0 „3 cm On secoue ensuite les fioles sur un appareil à secousses tournant à 135—150 tours par minute avec une course de 5 cm 25 environ pendant 4 jours à 28°C. A la fin de la période d'incubation, on combine le contenu des II fioles et on effectue lës essais. Les essais sur le bouillon combiné centrifugé indiquent une zone d'inhibition de 22 mm (disques de 1,27 cm) contre Proteus vulgaris sur une plaque d'essai normale. Cet 30 antibiotique est identifié comme étant du 810A, c'est-à-dire un mél- :ge antibiotique comprenant de l'acide 7 P-(D-5-amino-5-carbcxyvaléramido)-3-(a -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et de 1' acide 7 (3-(D-5-amino-5- rboxyvaléramido)-3-(a -méthoxy-p-hyâroxyc innamoyloxyméthyl)-35 7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (la). Ex' ar>le 2 Antibi otique 810A Un 1 ul> bad otoon* 71 08668 81 2085702 est ouv. rt sev: >v±ir.;nent et on utilise le contenu poar inoculer le-s écIV-ntlllons eu milieu ir- ...ritif solide incliné décrit cowuo l'ilÀc:;- I dans 1: 1 „ Ces échartillont; font mit; un incubation h 2CeO pondant uns ser.vr-inc, r.r-rùs • q-j-oi on les conser-.-e à 4e 0o ; partie ds 1e. ev.lturs au.'- l'un'ds cce milieu.-; incliné ri est ensuite ut: lieée pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer d1 enecr.cnc-vr^nt à chicanes, d'une cr.pacité de 250 cm"', contenant 50 onJ du milieu c écrit co*xr.e 1-Iilieu II dans l'Exemple 1. Ce milieu inoculé cet rais en incubation h 2&°0 pendan V deux t1 cv.ro sur un appareil rotatif à secousses tournant à 220 {.ours par minute avec une course de ' 5 cm 'environ. On lave ensuite asoptiquement l'inoculum en séparant par centri-fugation le mycélium, en décantant le liquide surnageant, en effectuant une renise en suspension drms un volune égal do solut physiologique, une nouvelle centrifugîition et une nouvelle mise en suspension dans une solution à 0,9 r> de chlorure de sodium. Le mycélium lavé est utilisé ensuite pour inoculer (inoculum 'Z à 2 5») deux fioles d'Erlenneyer à chicanes de 250 cm de caracit 3 contenant chacune 50 cm d'un milieu de production chimiquement défini qui a été stérilisé à 12G°0 pendant 15 minutes. Le milieu de production chimiquement défini a la composition suivante : Milieu de production î L-proline 15,0 g Glycérol 20,0 g Sucrose 2,5 g Glutamate monosodique 1,5g NaCl 5,0 g I^HP04 2,0 g CaCl2 0,4 g MnCl2 . 4H20 0,1 g FeCl^ o 6H20 0,1 g ZnCl2 0,05 g MgS04 . 7H20 1,° g ^ Eau distillée 1 000,0 cm"' Les fioles de production sont ensuite secouées à 220 tours par minuta sur un appareil à secousses d'une course de 2 cr. environ pendant 4 ,iourc a 28CC. Des essais sont effectuas au bout de 3 et de 4 ;îours« Les échantillons sont centrifugés et BAD ORIGINAL | 71 08668 2085702 le c liquides Eumage&nts sont essayés rn v la iiù'ihcdQ des disques sur plaquas en boîtos (le Pétri» 3'r: utilisant des disques de 1,27 cm, cct-: touillons donnent dors zonas d'inhibition contre i?'qt."i:s yni-^rin (M.B~'."38) de 21 r:n après 3 jours et 'de 26 itjd 5 -après 4 joiircu Le produit est identifié eoniac étant de l'Aniihio-■ tique 810A. Eronnle 3 Ant 'jT iot.1 que 81 OA Un tube lyophilisé de grircj.in (MA-4125a) 10 est ouvert aseptiquement et le contenu est transféré sur des milieux solides inclinas de la composition suivante î Milieu IV : Jus 73 100 cm3 Farine de soja 4S de Gtaley - 20,0 g 15 Dextrose 2,0 g Gélose 25,0 .g Eau distillée complément à 1 000, 0 cm pH 7,9-8,0 Les cultures sur milieux inclinés ainsi obtenus sont 20 utilisées ensuite pour inoculer plusieurs fioles d'Erlenmeyer 3 3 (250 cm ) contenant chacune 50 cm du Milieu V, ci-après. Milieu "V" : Autolysat de levures (Ardamine) 10,0 g Glucose 10,0 g -z 25 Tampon phosphate* 2,0 cm MgS04 . 7H20 0,05 g Eau distillée 1 000, 0 cm3 pH - réglé à 6,5 à 11 aide de NaOH * Solution tampon phosphate 30 KH2P04 91,0 g Na2HP04 95,0 g Eau distillée 1 000,0 cm3 Les fioles d'ensemencement sont secouées pendant un jour à 220 tours par minute à 28°0. 35 Les contenus des fioles sont utilisés ensuite pour ino- culer 39 fioles d'Erlenmeyer (250 cm) sans chicanes contenant 3 3 40 cm du Milieu VI ci-après , à raison de 3,5 cm d'inoculum par fiole. BAD ORIGINAL 71 08668 83 2085702 Milieu VI : Liqueur de macération de maïs (état humide) 40,0 g Dextrose 20,0 g NaCl 2,5 g 5 MgS04 . 71^0 0,5 g/ litre Polyglycol 2000 0,25 en vol» (ajouté dans chaque fiole indi-10 viduellement) Eau distillée 1 000,0 cm3 pH - réglé à 7,0 à l'aide de NaOH Les fioles de production sont secouées sur un appareil rotatif à secousses d'une course de 5 cm environ à 220 tours 15 par minute et à 24°C pendant 40 heures, après quoi les contenus des fioles sont combinés, une portion est prélevée pour essai et le reste est livré pour des études d'extraction» L'échantillon pour essai est acidifié au pH 4,0 à l'aide "d'acide chlorhydrique, filtré, dilué à 1:4 dans un tampon phosphate 20 5,0 et placé sur des plaques contenant Proteus vulgaris MB-838 en utilisant des disques de 1,27 cm» La zone d'inhibition est de 26,5 mm. Le produit est identifié comme étant de l'Antibiotique 81 OA, mais il consiste principalement en acide 7p-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-25 méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique avec suelement des traces d'acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oc ^méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique • Exemple 4 : Antibiotique 81 OA 30 Une culture inclinée sur milieu V8 de Streptomyces griseus (MA.-4125A) est utilisée pour inoculer 50 cm de Milieu V dans une fiole d'Erlenmeyer à chicanes de 250 cm3. Milieu V : Autolysat de levures (Ardamine) 10,0 g 35 Glucose 10,0 g 3 Tampon phosphate* 2,0 cm rr: 04 . 71^0 0,fF ■ 1 î • 1 t 1 I ■ - i 64 71 08668 2085702 pH réglé à 6,5 à l'aide de NaOH * Tampon phosphate : KH^C^ 91,0 g Na2HP04 95,0 g 5 Eau distillée 1 000,0 g La fiole est ensuite seoouée sur un appareil rotatif à secousses à 220 tours par minute pendant 1 jour à 28°C. On utilise 3 cm de cet inoculum végétatif pour inoculer une fiole d'ensemencement contenant 50 cm du milieu synthétique "5 10 suivant (Milieu VII) dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 cm à chicanes : Milieu VII : Ensemencement Production L-asparagine 5,0 g 5,0 g 15 L-histidine 4,0 g 4,0 g DL-phénylalanine 2,0 g Glutamate monosodique 1,5 g NaCl 5,0 g 5,0 g E2HP04 2,0 g 2,0 g 20 CaClg, 2^0 0,4 g 0,4 g MnS04, ELjO 0,1 g 0,1 g PeS04, THgO 0,1 g 0,1 g ZnS04, 7^0 0,05 g 0,05 g MgS04, 71^0 1,0 g 1,0 g 25 G-lycérol ' 20,0 g 20,0 g Suer ose 2,5 g 2,5 g ? Eau distillée *1 000,0 cm5 **1 000,0 cm' * pH réglé à 7,0 à l'aide de NaOH ** pH réglé à 7,1 à l'aide de NaOH 30 La fiole d'ensemencement est secouée de nouveau à 220 tours par minute pendant un jour à 28°C. Ce germe synthétique est utilisé ensuite pour inoculer plusieurs fioles d'Erlenmeyer 3 3 de 250 cm sans chicanes contenant 38 cm de Milieu de produc- tion VII, ci-dessus, à raison de 1,5 cm d'inoculum par fiole, 35 Les fioles de production sont secouées à 220 tours par minute et à 24°C et leurs contenus sont ensuite combinés et essayés au bout de 4 et de 5 jours. Dans l'essai, le bouillon entier est acidifié au pH 4,0 à l'aide d'acide chlorhydrique et le bouillon 71 08668 65 2085702 ent ébruite filtré c-t' dilué à 1:4 dr::~ un tr-nr-on. pkcspM+e 5,C0 L1 erseni ert effectw; sur Proteus ir1!".^ts ME~c-;:E en ut j lisant des à i:3 de 1,27 c:r« U:'-e sor..o c 1 i:i'.iiio:-: co :?:î,5 r. et obtenue ",rcc ce bouillon do fermentation après 4 iorjn d'iaeu-5 baticr. et le produit ainsi obtenu e^t identifié eon^e étant du P1CA« Erronvplo 5 p Y« r" *p "v^ -. - " ^iVt "] ï * *"* i~ ~ -î o "b î ^ P 1 C i. ^ ^"pp cï"1 c1" „ tu art,s 10 Et°T'Q A î Terne •■>tr,t ion Eta.-re 1 : Le contenu d'un tube lyophilise de r.'trc-rtc--mvees frri:-ers (MA-2837) est mis en suspension dans 2 cn^ de Kilieu I (décrit dans l'Exer.ple 1) et 1'inoculum résultant est utilisé pour inoculer des échantillons solides inclinée du mène 15 milieu. Ces cultures sur1 milieu incliné sont mises en incubation à 28°C pendant 5 jours ou jusqu'à ce qu'el3.es soient bien sporu-lées et ensuite on ajoute à ces cultures 1"0 cmJ du Milieu VIII ci-après. Milieu VIII : 20 Extrait de viande 0,3 $£■ NaCl 0,5 1o Aminé îTZ 1 Dextrose 1 io pH 7,0 25 Chacune des cultures sur milieu solide incliné est raclée pour formation d'une suspension et la suspension est utilisée conraé inoculum dans l'Etage 2, ci-après. Etage 2 : La suspension obtenue dans l'Etage 1 est 30 utilisée pour inoculer une fiole d'Erlemr.eyer à chicanes de 3 3 250 cm contenant 50 cm de I-lilieu VIII stérilisé (décrit dans l'Etage 1). .la fiole inoculée est ensuite placée sur un appareil rotatif à secousses tournant à 220 tours par Minute et mise en incubation pendant 48 heures à 28°C. 35 Etage 3 : le contenu d'une fiole à inoculum de l'Eta ge 2 est utilisé toit inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicanes 3 * de 2 litres contenant 500 es du milieu. identifié corae Milieu VIII dans l'Etage- 1. La fiole inooulée est enëuite placée f BAD ORIGINAL 71 08668 86 2085702 • dut un appareil rotatif à secousses'tournant à 220 tours par minute et mise en incubation pendant '18 heures' à 28°C. ' 'M/' • 4 : Un inoculuis" de 500 cinJ de la culture résultante co l'Etage 3 est utilisé pour inoculer un fermenteur en 5 acier inoxydable de 757 litres coîitenant 467 litres d'un milieu VIII stérile (décrit clans l'Ktoge 1 )« On laisse s'effectuer la fermentation à mie teopérat'orô de"28°C en agitant (130 tours par minute) tout en maintenant un courant d'air de 0,283 m^'par minute pendant 65 heures. Durant la fermentation, un agent 10 antimous ses-, le Polyglycôl 2000, est ajouté en petites quantité pour empêcher une formation excessive de mousses. Etage 5 : Un inoculum "de 378,5 litres de la pousse résultante de l'Etage 4 est-utilisé pour inoculer un fermenteur en acier inoxydable de 5678 litres contenant 4542 litres de 15 Milieu IX, ci-après. Milieu IX ; Liqueur de fermentation de maïs 4 % Dextrose 2 $ pH réglé à 7,2 à l'aide de HaOH 20 On laisse s'effectuer la fermentation à une température de 28°C, en agitant (120 tours par minute). Tout en maintenant un coirrant d'air de 1 ,566 m par minute pendant 30 à 36 heures,» Pendant la fermentation, on ajoute du Polyglycol 2000 en petite quantité pour empêcher une formation excessive de mousses. 25 On récolte la production et on détermine l'activité par des essais par disques sur plaques. En utilisant des disques de 1,27 cm, ce bo\iillon donne une zone d'inhibition de 32,5 mm. contre Proteus vulgaris M33-838 quand la récolte est effectuée au bout de 31 heures. 30 Etape B : Isolement du mélange antibiotique 81OA Du bouillon filtré (4 069 litres) de l'Etape A, Etage 5, est récolté après 36 heures et le pH est-réglé d'un niveau de 7-8 à la valeur 3,0 dans le fermenteur par l'addition d'acide phosphoriqûe0 On sépare le mycélium par passage à travers 35 un filtre-presse du type à plaques perforées et on s'en débarrasse. Le bouillon filtré est ensuite passé à travers un lit de ; 378,5'litres de résine absorbante Amberlite XAD-2 à un débit de 37,85 litres par minute . Le bouillon usé est essayé et mis au BAD ORIGINAL 71 08668 87 2085702 rebut et le lit de résine est lavé à l'aide de 2 volumes d'eau» l'antibiotique est élué du lit de résine à l'aide d'une solution aqueuse à 60 $ de méthanol à un débit de 18,925 litres par minute. Quarante fractions, chacune de 18,925 litres, sont 5 recueillies et essayées. les fractions 2 à 40 sont combinées et le méthanol est éliminé par évaporation sous vide. Le concentré final (157,1 litres) est réglé au pH 3,5 par l'addition d'hydroxyde d'ammonium et maintenu congelé. Des échantillons sont soumis à des essais biologiques 10 par la méthode des disques sur plaques contre Proteus vulgaris. Bouillon filtré s Des essais effectués sur 4 012 litres de bouillon filtré donnent les diamètres suivants de zones t Bouillon filtré Dilution Diamètre de zone 15 1î2 26,8 mm 1:4 23,8 mm 1:8 21,1 mm Bouillon usé et eau de lavage s Dix fractions de 378,5 litres chacune donnent à l'essai un résultat nul sans dilution; 20 L'eau de lavage donne à l'essai un résultat nul. Fractions d'élution : Des essais sont effectués sur toutes les fractions. Les diamètres des zones sont indiqués dans le Tableau ci-dessous î Fractions d'élution Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 1 0 21 33 mm 2 28 mm 22 33 3 35 23 34 4 34 24 34 5 36 25 33 6 36 26 34 7 36 27 32 8 38 28 33 9 38 29 32 10 36 30 32 11 36 31 32 71 08668 2085702 Tableau (suite) Fractions d•élution t ï î Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 12 38 32 30 13 40 33 30 14 37 34 30 15 36 35 28 16 37 36 27 17 38 37 28 18 36 38 26 19 36 39 26 20 35 40 26 Eluat combiné et concentré d'éluat : On effectue aussi des essais sur 738,1 litres d'éluat combiné et sur 157,1 litres d'Antibiotique 810A sous la forme d'un concentré d'éluat. 20 Eluat combiné Concentré d1éluat de 81OA Dilution Diamètre de zone Dilution Diamètre de zone 1:5 28,8 mm 1:10 27,0 mm 1:20 23,8 mm 1:40 21,0 mm 1:16 27,25 mm 1:32 24,5 mm Quantité totale de matières solides aux titrages 30 Bouillon filtré 119 kg 738,1 litres d'éluat combiné 7,23 kg 157,1 litres de concentré d'éluat 7,20 kg Etape G î Absorption sur une résine échangeuse d'anions Le concentré de l'Etape B (78,350 litres) est dilué à 35 117,335 litres à l'aide d'eau et adsorbé sur un lit de 22,5 litres de résine échangeuse d'anions faiblement basique (résine Amberlite IRA-68 sur le cycle chlorure) au pH 4,0 et à un débit de 7,570 litres par minute. Ceci est suivi d'un 71 08668 '89 2085702 rr.r 45 litres d'eau, aprèo quoi le lit de racine est élu/' à l'aide d'une solution 1 I-T de nitrate de sodium et 0,1 K d'ac;te te de sodium (pli 7,5) à un débit de 1 ,5 litige vr-.y minute. On recueille ensuito ai:: fractions d'éluat de 18,9?5 5 litres et on rVle le p'I L 4 à l'aide d'acide chlorhydrique des le recueil. Toutes 1 - s fractions sont soumises h des essais biologiques par lu méthode des disques sur plaques contre Proteus •yul^.3-.-» n comme suit : 10 Solution de charge Fraction d'élution : Dilution 1 : 10 Dilution Diamètre Fraction Diamètre Fraction Diamètre de zone de zone de zena 1:10 28,5 mm 1 27 mm 6 25 rnm 1 :20 26,5 BEI. 2 30 mm 7 23 mm 1 :40 24 3 28,5 mm 8 22 mm 4 26 mm 9 21 mm 5 26 mm 10 17,5 mrn 20 Le courant usé donne un résultat de 25 mm sans dilution et l'eau de lavage donne un résultat de 23 mm sans dilution. Etape D : Adsorntion sur une résire échangeuse d'anions les fractions 1 à 10 de l'étape C sont combinées et introduites dans un lit de 4 5 litres d'adsorbant Amberlite XÀD-2 25 au pH 3,0 et à un débit de 5 litres par minute0 Le lit de résine est lavé à l'aide de 90 litres d'eau au même débit. L'antibiotique est ensuite élué de la résine par une solution à 25 fo d'acétone et d'eau à un débit de 5 litres par minute. On recueille 16 fractions de 18,925 litres. 30 Toutes les fractions sont essayées par la méthode des disques sur plaqu.es contre Proteus vulgaris comme suit : La charge (190 litres) donne les diamètres de zones suivants : BAD OBtGlNAL 71 08668 30 • 2085702 r>oiut- nn rlo '■ ''O DilutionI Diamètre de zone » 1 :5 30 inm 1 si O 27,5 r,im 1:20 24,2 raa Les diamètres de zones des fractions d'élution sont 10 indiqués dans le tableau suivant : 15 20 Fraction d'élution Fraction d'élution Fraction Dilution Diamètre ■Fraetion Dilution Diamètre de zone de zone 1 1:10 20,5 mm 9 1:10 25 mm 2 1 ï 10 29 mm 10 1:10 26,5 mm 3 1 :10 29 mm 11 1 :5 26 mm 4 1 :10 29 mm 12 1 :5 28 mm 5 1 :10 28 mm 13 1:5 27,5 mm 6 1:10 27 mm 14 1 :5 25 mm 7 1 :10 26 mm 15 1 :5 25 mm 8 1 :10 26 mm 16 1 :5 24,5 mm Les fractions d'élution 2 à 16 ci-dessus sont combinées 25 et l'acétone est éliminée par évaporation sous vide à un vol-ume final de 17,4 litres. Le concentré de 17,4 litres est réglé au pH 4,0 à l'aide d'hydroxyde d'ammonium et séché par congélation pour donner 620 g d'antibiotique 810Ar c'est-à-dire d'un mélange constitué essentiellement d'acide 7(3-(D-30 5-amino-5-carboxyvaléramiào)-3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyl-oxyméthyl)-7-méthoxy~3-céphem-4-carboxylique et d'acide 7 (3-(D-5-amino-5-carboxyvaléraiaido)-3-( a -méthoxy-p-hydroxy-cinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphen-4-carboxylique0 Ce produit sec a une puissance à l'essai biologique de 320mcg/cm3 35 pour une zone de 25 mm. Etape E : Acide 7[3-(D-5-arnino-5-carboxyvaléraniido)-3-( oc - méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-c é p h e n-4-carboxylieue r Bad original k 71 08668 2085702 Une colonne chromatographique de 2,54 cm de diamètre est garnie à une hauteur de lit de 100 centimètres de résine échangeuse d'anions DEAE Sephadex A-25 dans un système contenant 0,5 M de bromure d'ammonium et 0,05 M d'acide acétique. 5 le mélange d'Antibiotique 81OA (10,0 g) obtenu dans l'Etape D 3 est dissous dans 18 cm d'une solution 0,5 M de bromure d'ammonium et 0,05 M d'acide acétique et introduit dans la colonne. Une solution d'élution est refoulée à travers le lit à raison de 81 cm /h et des fractions de 10 cm d'éluat sont 10 recueillies à la machine0 le courant d'éluat est contrôlé par un réfractomètre différentiel, l'enregistrement du réfracto-mètre indique des pics de masse aux tubes 19,36,79,109 et 206; Des essais par disques sur plaques contre Proteus vulgaris (MB-838) sont effectués sur une fraction sur trois en utilisant 15 des disques de 1,27 cm de diamètre tamponnés au pH 7,0. les diamètres des zones sont indiqués dans le tableau suivant (les fractions 1 à 66 donnent un résultat nul). Fraction Diamètre Fraction Diamètre Fraction Diamètre 20 de zone de zone de zone 69 18 mm 122 29 204 40 + 72 24 125 28 207 40 + 75 26 128 27 210 40 + 78 31 131 26 213 40 + 25 81 — 134 24 216 40 + 83 35 137 21 219 . 40 86 37 140 20 222 38 89 38 150 18 225 35 92 38 160 20 228 32 30 95 40 + 170 29 231 31 . 98 40 + 180 35 234 27 101 40 + 183 38 237 24 104 40 + 186 40 240 . 23 107 40 + 189 40 + 243 19 35 110 40 + 192 40 + 246 17 113 40 195 40 + 249 0 116 38 198 40 + 252 0 119 33 201 40 + 71 08668 2085702 On combine les fractions 80 à 133 et on combine les fractions 170 à 230. On répète l'essai ci-dessus et on combine les fractions 82 à 130 d'une part, 180 à 234 d'autre part. 5 Les fractions contenant le premier constituant actif des deux essais ci-dessus sont combinées et adsorbées sur un lit de 100 cm^ de résine Amberlite XAD-2, Le lit est lavé à l'aide de 1 volume d'eau et ensuite élué à l'aide de 3 volumes d'une solution à 90 i» de méthanol et d'eau# Le méthanol est éliminé 10 par évaporation sous vide et le concentré aqueux est séché par congélation pour donner 810 mg d'un produit identifié comme étant l'acide 7(3-{D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( a-méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. La puissance biologique de ce produit déterminée par la méthode 15 des disques sur plaques contre Proteus vulgaris est de 18 pg/cm^ donnant une zone de 25 mm. L'analyse par adsorption d'ultraviolet donne les résultats caractéristiques suivants : Adsorption d'ultraviolet dans HC1 0,1N 305 524 max 1 cm 20 Adsorption d'ultraviolet dans BTaOH 0,1N \ 328 564 max 1 cm Etape F : Acide 7 (3 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7- méthoxy-3-céphem-4-carboxylique 25 Les fractions provenant êtes deux essais sur Sephadex A-25 contenant le deuxième constituant actif sont combinées et * adsorbées sur un lit de 100 cm de résine Amberlite XAD-2. Le lit est lavé à l'aide de 1 volume d'eau et ensuite élué à l'aide de 3 volumes d'une solution à 90 fi de méthanol et d'eau. 30 Les éluats riches sont combinés et le méthanol est éliminé par évaporation sous vide0 Le concentré aqueux est séché par congélation et donne 720 mg d'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)- 3-( 4-carboxylique (le). L'analyse par adsorption U.V. donne les 35 résultats caractéristiques suivants : Adsorption U.V. dans HCl 0,1N : 287 mm E^ 432 max 1 cm Adsorption U.V. dans NaOH 0,1N : \ 280 mm E^ 432 max 1 cm 71 0 8 6 6 o 2085702 6 : Isoler.ent de l'acide 7 ? —(---■5"5mino~5--carboxyvaléramiâo)--5— ( ce -r: ' oxv-r-^-i.-l:'>oxyeA::namoylox;\:.thyl)-7~?.'5ihozy—3- v — ' -cri" ?!"■" : i^ue d ." r.'-'T aîi/^e "nti "i ~iotique c i GA 5 le :\ .-.g* antibiotique o î GA compre-ïj-nt de l'acide 7 S -(r~5-?~x::o-5 et de l'acide 7 6 «(^-p-a^ino-S-cai^on^valéramido }-;*-(o: -£éthox;*-p->yârcxycinr.ar.oylnéthyl)-7-:~éthoxy-3-eéphe:s--4~ car-10 boxyli'rae (20,0 g) provenant de l'Exenple 5, Htape D, est disscua dans l'eau (200 en"') et le r.ïï de la solution ent ré BAD ORIGINAL 71 0866d 94 2085702 i'i'U'sc* Volume Unit' 's biologique r totale s Produit ou Prodvi";s Charge 20 g 200cm" 60 000 unités 1a et 1b 5 Solution usée et 500cm3 eau de lavage 7 500 unités 1b Eluat à l'acide 1000cm3 formique 4,52 g 20 000 imités 1b 1er éluat à l'a 10 cide chlorhy- drique 500cm3 1 000 unités 2c-ms éluat à l'a cide chlorhy 500cm3 drique 2,10g 10 000 unités 1 a 15 Ces fractions sont recueillies par adsorption sur de la résine Amberlite XAD-2 pour séparer l'acide 7 (3-(D-5-amino-5-earboxyvaléramido)-3-( oc -méthoxy-p~sulfonyloxycinnamoyloxy-méthyl)-7-méthcxy-3-eéphem-4-carboxylique (le) et ce dernier 20 est élué par une solution à 50 de méthanol et d'eau pour donner le produit (le) sensiblement pur. Exemple 7 Isolement de l'acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( ce -méthoxy-p~sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3- 25 céphf'm-4-carboxylinue à partir de l'Antibiotique 81 OA. le mélange antibiotique 810A d'acide 7P-(D-5-amino-5-earboxyvalcramido)-3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-méthyl)-7-méthoxy-3~céphem-4-carboxylique (le) et d'acide 73_(D-5-amino-5-carboxyvaIéramido)~3-(a; -méthoxy-p-hydroxy-30 cinnamoj'-lox3/méthyl)-7-méthoxy-3-ccphem-4-carboxylique (5,0 g) obtenu selon l'Exemple 5> Etape D, est dissous dans une solution à 20 $> d'acétone et d'eau (20 cm ) et le pH est réglé à 4,0. Cette solution est introduite dans un lit de 5,08cm de diamètre x 100 cm de hauteur d'adsorbant Amberlite XAD-2 35 dans une solution à 20 c/o d'acétons et d'eau0 Une solution à 20 fo d'ac'tone et d'eau est refoulée à travers le .lit à raison de 880 cm"/h et des fractions de 20 cm sont recueillies automatiquement. bad original i 71 08668 95 2085702 Des essais par disques sur plaques contre Proteus vulgaris (MB-838) sont effectués sur une fraction sur trois en utilisant des disques de 6,35 mm. les diamètres des zones sont indiqués dans le tableau suivant s Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre j de zone 1-41 0 131 0 221 18 44 12 mm 134 0 224 18 10 47 22 137 0 227 18 50 25 140 8 230 17 53 29 143 11 233 17" 56 31 146 13 236 15 59 35 149 13 239 15 15 62 30 152 15 242 15 65 28 155 15 245 15 68 27 158 16 248 14 71 25 161 17 251 14 74 24 164 18 254 14 20 77 21 167 17 257 13 80 20 170 18 260 13 83 19 173 20 263 12 86 16 176 21 266 12 89 14 179 21 269 12 25 92 13 182 21 272 11 95 13 185 21 275 . 11 98 13 188 22 278 10 101 13 191 23 281 10 104 14 194 23 284 9 30 107 13 197 23 287 8 110 13 200 22 290 0 113 11 203 24 293 0 116 10 206 24 296 0 119 9 209 24 299 0 35 122 8 212 24 302 0 125 8 215 24 128 8 218 19 330 zéro 71 08668 96 2085702 10 15 20 25 On combine les fractions 44 à 90, on élimine l'acétone par évaporation sous vide et le concentré aqueux est séché par congélation pour donner 3,3 g d'acide 7 £-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) brut. On combine les fractions 150 à 225 et par traitement similaire on obtient 700 mg d'acide 7 [3-(D-5-amino-5-carboxy-valéramido )-3- ( et -méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxy lique • En répétant l'essai ci-dessus, on obtient 3,1 g d'acide 7 p-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(oc -méthoxy-p-sulfooxy-oinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) brut et 400 mg d'acide 7 {3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)- 3-( a -méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-cépheift- 4-carboxylique• Les deux quantités "d'acide 7$-(D-5-amino-carboxy- valéramido)-3-(a -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (le) obtenues selon le procédé précédent sont combinées et on introduit les 6,4 g de matière sur un lit de 5,08 cm de diamètre sur 100 cm de hauteur, d'adsorbant Amberlite XAD-2 dans une solution à 5 fi de méthanol et d'eau. Une solution à 5 fi de méthanol et d'eau est refoulée 7 à travers le lit à un débit de 880 cm /h et des fractions de •k 20 cm sont recueillies automatiquement. On recueille 287 fractions et on soumet une fraction sur quatre à des essais par la méthode des disques sur plaques contre Proteus vulagris (MB-838) en utilisant des disques de 6,35 mm. Les résultats des essais sont résumés dans le Tableau ci-après. Les fractions 1 à 50 ne sont pas soumises à des essais. 30 35 Fraction Diamètre de zone Fraction Diamètre de zone 51 ' 23 mm 115 20 55 26 119 20 59 23 123 19 63 18 127 18 67 12 131 19 71 0 155 16 71 08668 97 2085702 gabion (suite) .?3-»-'.Cti03ï i>ia:r.ètre do nono rr.';c~. ion Dianotro de Kor.s 5 75 0 139 17 79 0 143 15 83 7 147 16 87 9 151 15 91 13 155 13 10 95 19 159 11 99 21 163 9 103 22 167 0 107 22 171 0 111 21 287 zéro 15 On combine les fractions 95 à 159» on élimine le méthanol par évaporation sous vide et le concentré aqueux est séché par congélation pour donner 700 mg d'acide 7 (3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( 3-( oc -méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphera-4-carboxylique (le) donnent les résultats suivants d'adsorption : 25 Adsorption U.V0 dans HC1 0,1 H max 285 E'" >160 1 cm Adsorption U.V. dans ITaOH 0,1 N max 277 E , 166 i cm Quand on l'essai avec des disques de 1,27 cm de dia-30 mètre par la méthode des disques sur plaques contre Proteus vul/raris. l'acide 7 B ~(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-( oc -méthoxy-p-sulf ooxycinnamoyloxyméthyl) -7-2iéthoxy-3-eépneni- 4-carboxylique (le) donne une zone de 25 mm à 88 mcg/cm et 1 ' acide 7 |3 - ( D-5-anino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( oc -méthoxy-p- 35 hydroxycin:ia.'noyloxyœéthyl)-7-aéthoxy-3-cépheia-4-carboxyliaue •z donne une zone de 25 ma à 167 mcg/cm . 71 Q8668 98 2085702 Excelle 8 AntiblotInije G42A Etnpo Jl i Production en fioles rrcouées Un tube lyophilisé de culture de fitrentomyces 5 laotcjndurans (KA-2908) est ouvert aseptiqueaont. On utilise ensuite le tube pour inocular une -fiole d'Erloimeyer à chicanes 3 3 de 250 cm contenant 50 cm de milieu nutritif V en brisant le tube dans de la gaze stérile et en transférant la pastille aseptiquement dans la fiole, le milieu V a la composition 10 suivante : Milieu 7 : Autolysat de levures (Ardaraine) 10,0 g Glucose 10,0 g •3 Tampon phosphate* 2,0 cni 15 MgS04 , 7H20 0,05 g Eau distillée 1 000,0 cm3 pH 6,5 *Tampon phosphate m2P0A 91,0 g 20 ïïa2HP04 95,0 Eau distillée 1 000,0 en? Cette fiole d'ensemencement est secouée à 28°C sur vin appareil rotatif à secousses avec une course de 5 cm environ IL pendant 3 jours. Des portions de 5 cm (10 ^ d'inoculum) de 25 cette culture sont ensuite transférées, à l'aide de pipettes stériles, dans quatre fioles d'ensemencement de deuxième étage de mène capacité et contenant le même milieu que décrit ci- dessus et ces fioles sont ensuite secouées de la manière indiquée ci-dessus. Les fioles d'ensemencement de deuxième étage sont 30 ensuite combinées aseptiquement dans une seule fiole et on utilise le mélange pour inoculer 11 fioles d'Erlenmeyer de 2 " 3 litres pourvues de chicanes, contenant chacune 350 cm de Milieu IX avec 2 a 3 f<> d'inoculum, à l'aide de pipettes stériles. Le Milieu IX a la composition suivante : 35 Milieu IX : Levure dite Amber Yeast N° 300 Matières solubles de distillerie Dextrose 10,0 g 20,0 g 10,0 g BAD ORIGINAL 71 08668 99 2085702 Eau distillée 1 000,0 cm? pH 7,0 Les fioles de production sont ensuite secouées à 28°C sur un appareil à secousses tournant à 145 tours par minute 5 avec une course de 5 cm environ pendant 4 jours. A la fin de la période d'incubation, les contenus de 10 de ces fioles sont combinés et un échantillon est centrifugé pour élimination du mycélium. La présence dans le bouillon d*Antibiotique 842A, 10 c'est-à-dire du produit acide 7 (3-(D-5-amino-5-carboxyvaléra-mido ) -3- ( carbamoyloxyméthyl ) -7-méthoxy-3-cé phem-4-carboxy lique (Ib) est déterminée par des essais de diffusion dans la gélose effectués avec des disques en papier-filtre de 1,27 cm de diamètre tre.mpés dans le bouillon et déposés sur la surface de T. 15 plaques d'essai contenant 10 cm de gélose nutritive (Difco) plus 0,2 % d'extrait de levures (Difco) ensemencées avec 1"'inoculum bactérien. Les zones d'inhibition sont mesurées en mm après incubation pendant toute une nuit à 28°C. Les essais effectués sur le bouillon recueilli après fermentation pendant quatre 20 jours indiquent une zone d'inhibition de 31,5 mm de diamètre sur des plaques ensemencées avec Vibrio percolans (MB-1272). Etape B î Adsorption sur une résine échangeuse d'anions Le bouillon filtré est réglé au pH 7,0 à l'aide d'acide 3 3 chlorhydrique dilué et on en adsorbe 2900 cm sur 100 cm d'une 25 résine échangeuse d'anions fortement- basique ayant une matrice styrène-divinylbenzène (résine Dowex 1x2, cycle chlorure) 7 à 10 cm /minute. Le liquide usé est recueilli en fractions de 500 cm . La colonne de résine est lavée à l'eau et éluée à l'aide d'une solution à 3 i» de NH.Cl dans du méthanol à 90 fom L'éluat • x 30 est recueilli en fractions de 100 cm . Des essais par disques sur plaques contre Yibrio percolans (MB-1272) sont effectués sur toutes les fractions ? les diamètres des zones sont indiqués dans le tableau ci^dessous : lOO 71 08668 2085702 Bouillon filtré Fraction usée Fraction d'élution Dilution Diamètre Fraction Diamètre Fraction Diamètre de zone de zone de zone néant 26,5mm 1 0 1 25 1:2 24 2 16 2 29 1:4 20 3 23 3 29 4 25 4 26,5 5 27 5 22 6 27 6 18 7 15 8-10 0 Ces essais indiquent que 60 % de l'activité se trouve 15 dans le liquide usé et environ 18 ^ dans les éluats. De plus, ils indiquent que la capacité de.la résine est seulement de deux fractions ou un volume de "bouillon égal à 10 fois le volume dè la résine, les fractions d'élution 1 à 4 sont combinées et concentrées pour élimination du méthanol. les fractions usées 3 *5 20 à 6 sont combinées pour donner 1960 cm de solution. Une portion de 3 1860 cm de la solution est réglée du pH 7,2 au pH 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium dilué et adsorbé sur 100 cm d'une résine échangeuse d'anions fortement basique ayant une matrice styrène-divinylbenzène (résine Dowex 1 x 2, cycle chlorure) à raison de 25 14 cm par minute. Le liquide -usé'est recueilli en quatre fractions égales et les essais indiquent que 5 $ de l'activité est présente. La colonne est lavée à l'eau et éluée à l'aide d'une solution aqueuse à 5 % de chlorure de sodium. L'éluat est re- 3 cueilli en fractions de 50 cm et essayé. Les essais indiquent 30 que 90 % de l'activité est présente dans les fractions 3 à 16, qui sont donc combinées. Etape 0 : Adsorption sur une résine échangeuse de cations Une portion de 50 cm d'un concentré tel que préparé dans l'Etape B est diluée à 500 cm , réglée du pH 8,8 au pH 2,0 35 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué et adsorbé sur 25 cm d'une résine échangeuse de cations fortement acide du type sulfonate ayant une matrice styrène-divinylbenzène (résine Dowex 50 x 2, cycle hydrogène) à raison de 2,5 cm par minute. La colonne 71 08668 101 2085702 est lavée à l'aide de 25 cr? d'eau c-t ensuite éluée à l'aide de pyridina à 2 fi jusau'à ce que le pli de l'effluent de la. colonne Konte à 7 (54 cra-' ) • Des essais concciv,-ant la fraction usée et l'éluat indiquent 9 fi de l'activité dans la fraction 5 usée et 90 fi dans 3.'éluat. L'éluat est identifié co:-.:.e le sel de pyridinium de l'Antibiotique £42h* Le produit 842A est amphotore avec un point icoélectrique j p par ent au pH '5,5 environ» Le produit est instable au-dessus du pH 7, mis stable au pH 1,5» L'éluat ainsi obtenu 10 est r%lo au pli 8,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium dilué et concentré sous vide pour élimination de la pyridine. Le produit ainsi obtenu est identifié comme le sel monosodicue de l'Antibiotique 842A. La niasse moléculaire est de 468, basée sur la formule empiriqueo 15 Analyse pour C^ gl^îT^SOgîTa : Calculé : C, 41,0 fi ; H, 4,5 ^ ; N, 1?,0 fi ; S, 6,8 ; O, ?0,8 ; îTa, 4,9 Trouvé : C, 39,31 fi • H, 4,76 % j N, 11,16 € -, S, 6,46fi 0, 34,12 fi ; ITa, 4,19 fi. 20 Dans des études'in vitro, ce produit, c'est-à-dire l'Antibiotique 842A, empêche le développement des bactéries Grain-négatives suivantes : Escherichia coli, Proteus vulgaris. Alcali.p-cres faecalis. Brucella bronchisentica, Salmonella gallinarum. Vibrio percolans et lanthomonas vc-sicatorla. 25 Egalement, le produit empêche le développement- des bactéries Gram-positives suivantes : Staphylococcus aureus, Sgrcina lutea et Bacillus subtilis. Dans des études in vivo sur des souris, l'Antibiotique 842A présente aussi les activités suivantes. L'administration 30 est effectuée par injection sous-outanée0 A la fin de la période d'essai, habituellement sept jours après l'administration, la quantité de produit nécessaire pour protéger 50 fi> des souris (EDç.q) contre cette injection par ailleurs mortelle, est calculée BAD ORIGINAL 1 71 08663 102 2085702 EB-n P^r voie sou:>- Protous vul.p;?ris Protev" rnrabilis 5 • Protonf: r.:orf;anii 3202* 5a3_none~.U.a n ch o 11 muelier 1 Klcbfn.e3.la pneumoniae AD Klebsie'.i_3a •pneunonin.e B Paraco3.cb°ctrur.i .arizoniae 10 Escherichia coli Aerobacter aero/rere s Pasteure3.1a multocida Salnonc.lla tyohosa Djnlococons -nneur-iorilae E400 15 * la céphaloridine et la céphalothine ne fournissent pas de protection à 400 mg x 2 doses0 En plus des essais in vivo du produit comme mentionné ci-dessus, une souche isolée de Proteus morganii 356 résistant aux céphalosporines et capable de dégrader la céphalosporine C a 20 été utilisée dans un essai de protection des souris de la même manière que rapporté ci-dessus. La dose ED^q pour ces essais est la suivante î 25 30 Exemple 9 Antibiotique 842A Production en fioles secouées On prépare 1'inoculum comme décrit dans l'Exemple 8. 35 Deux fioles d'ensemencement de deuxième étage sont mises en commun et le bouillon est utilisé pour inoculer (à raison de *2. 1 cm par fiole) 62 fioles d'Erlenmeyer (250 cm ) contenant cha-3 cune 50 cm de Milieu X. Le Milieu X a la composition suivante : cutanée x deu?r doges 51 pg 276 pg 276 pg 103 pg 125 pg 125 pg 125 pg 200 pg 49 pg 57 pg 34 pg 566 pg Infection Antibiotique EDj-q nar voie sous- cutenée x 2 doses (moyenne de 2 essais) Proteus morganii 356 Proteus morganii 356 Proteun moritanii 356 842A Céphalothine Céphaloridine 273 pg 20 000 jig 9 270 pg bad original 71 08668 103 2085702 Milieu X î Farine de soja 4S de Staley 30,0 g Matières solubles de distilleries 7,5 g Cérélose 20,0 g 5 NaCl 2,5 g CaCO^ (après pH réglé à 7) 10,0 g Eau distillée 1000,0 cm3 Les fioles sont secouées à 28°C sur un appareil à secousses tournant à 220 tours par minute avec une course de 10 5 cm environ pendant 5 jours. A la fin de la période d'incubation, les contenus de 60 de ces ballons sont combinés et un échantillon est centrifugé pour élimination du mycélium. On détermine la présence d'Antibiotique 842A en suivant le mode opératoire décrit dans l1Exemple 1 par des essais 15 de diffusion dans la gélose effectués à l'aide de disques d'essai en papier-filtre de 1,27 cm. Après incubation pendant 4 jours, les essais du bouillon donnent une zone d'inhibition de 33 mm contre Vibrio percolans (MB-1272). Exemple 10 20 Antibiotique 842A Fermentation Stade 1 : Un tube lyophilisé de culture de Streptomyces lactamdurans (MA-2908) est utilisé pour inoculer 50 cm de Milieu V stérile dans une fiole d'Erlenmeyer de 200 cm à 25 chicanes. Milieu V î Autolysat de levures (Ardamine) 10,0 g Glucose 10,0 g 3 Tampon phosphate* 2,0 cm 30 MgS04 . 71^0 0,05 g Eau distillée 1 000,0 cm3 pH réglé à 6,5 à l'aide de ÎTaOH * Tampon phosphate : KE^PO^ 91,0 g 35 Na2HP04 95,0 g Eau distillée 1 000,0 cïïP La fiole est placée sur un appareil rotatif à secousses tournant à 220 tours par minute avec une course de 71 08668 2085702 5 cm environ et mise à incuber pendant 72 heures à 28°C. Stade 2 t Un inoculum de 10,0 cm du développement végétatif résultant est utilisé ensuite pour inoculer une fiole d'Erlenmeyer à chicanes d'une capacité de 2 litres con-3 5 tenant 50 cm du Milieu V stérilisé décrit ci-dessus. lia fiole inoculée est placée ensuite sur un appareil rotatif à secousses tournant à 220 tours par minute et mise en incubation pendant 48 heures à 28°C. Stade 3 : On utilise ensuite le contenu de la fiole 10 d'inoculum pour inoculer Tin fermenteur en acier inoxydable de 189,25 litres contenant 160 litres du même Milieu V que décrit ci-dessus. Le milieu inoculé est mis en incubation à 28°C pendant 48 heures tandis qu'on l'agite tout en maintenant m courant d'air de 85 litres par minute à travers le bouillon en 15 fermentation. Pendant la période de fermentation, on ajoute de petites quantités de Polyglyctil 2000 pour empêcher la formation de mousses. Stade 4 î Un inoculum de 43 litres du développement résultant est utilisé ensuite pour inoculer un fermenteur en acier 20 inoxydable de 757 litres contenant 467 litres d'un Milieu XII stérile ayant la composition suivante ï Milieu XI : Levure dite Amber Teast N° 300 10,0 g Matières solubles de distillerie 20,0 g 25 Eau distillée 1 000,0 cm^ pH 7,0 On permet à la fermentation de s'effectuer à une température de 28°C en agitant et en maintenant un courant d'air de 283 litres par minute pendant 72 heures. Pendant la fermen-30 tation, un agent antimousses, le Polyglycol 2000, est ajouté en petites quantités pour empêcher une formation excessive de mousseso On effectue la récolte et on détermine l'activité par la méthode des disques sur plaques. Le bouillon de fermentation est ensuite filtré à travers de la terre d'infusoires à un pH 35 de 7,8 et le produit ainsi obtenu est identifié comme étant du 842A selon le mode opératoire décrit dans l'Exemple 10 Des essais par disques sur plaques à une dilution 1:10 donnent une zone d'inhibition de 21,5 mm contre Vibrio percolans (MB-1272). 71 08668 105 2085702 Exo'-rlo i 1 Purification ; sel mononodique de l'acide 7 [3-(D-5-ainxr>o-5-cnrboxyvc.lérar..iào)-3-(c:-rtomoyloxy.-'îéthyl)-?-; 'éthoxy-3- oérhe^-^-oarboyylicme 5 Adsorr>t:i or. sur carbone : Quatre lofcs de ferr.entation -- - -j récoltas corme à 11 exemple S sont ad sorbe's chacun sur 100 cm d'une résine échangeuse d'anions fortement basique ayant une matrices de gtyrène-divinylbenzène (résine Dcvrex 1x2, cycle chlorure) et élues avec une solution aqueuse à 1 f> de chlorure •5 10 de soâiumo L'éluat est recueilli en fractions de 50 cm et essayée Les fractions d'élution provenant de 4 lots sont réglées au pli 5 à l'aide d'acide chlorhydrioue dilué et com- 3 ' 3 binées pour donner 4300 cm de solution. On agite 4200 cm de cette solution avec 42 g de carbone (Darco G-60) pendant 1/2 15 heure, le carbone est recueilli par filtration et lavé à l'eau0 Le filtrat et l'eau de lavage sont dépourvus d'activité. Le gâteau de carbone est élué deux: fois avec ixne portion de 1 litre de solution aqueuse à 60 fo d'acétone par agitation du mélange pendant 1/2 heure et filtration chaciue foisa Les éluats sont 3 3 20 concentrés sous vide à 108 cm et 100 cm , respectivement. Les essais indiquent que le premier éluat contient 76 fo de 1' activité, ayant une puissance qui atteint 18 fois celle de la matière de départ, et que le deuxième contient 17 f> de l'activité, ayant une puissance qui atteint 14 fois celle de la matière de départo 25 Les deux concentrés sont combinés et concentrés encore à 61 cm et réglés du pH 4 au pH 5 à l'aide d'hydroxyde de sodium dilué0 •2 Ce concentré contient 40 mg/cm de matières solides sèches et donne une zone de 25 mm contre î-IB-1272 à -une dilution de 1:100 *Z (400 mcg/cm ). Le produit est identifié comme le sel monosodique 30 de l'acide 7(3-(D-5-aïïiino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxy-méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (la). Exemple 12 Purification j sel monosodique de l'acide 7 j3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxynéthyl)-7-méthoxy-3-céphem-35 4-carboxylioue Adsor-otjon sur toi : Une portion de 22 cm de l'éluat obtenu selon l'Exemple 8, Etape B, est réglée au pH 7,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium dilué et chromatographie sur une - BAD ORIGINE- 71 08668 106 2085702 colonne contenant 388 cm' de BioGel P~2. la colonne est développée à l'aide d'eau, l'effluent est contrôlé avec un réfractoirj-tre différentiel et dos fractions de 5 cm' sont recueillies et soumises à doc essais "biologiquec# la bio-5 activité apparaît dans les fractions 47 à 63 tandis que le chlorure de sodium apparaît clans les fractions 62 à 72. On combine les fractions 50 à 60, on effectue de nouveaux essais et on concentre à sec les fractions combinées pour obtenir 10,8 mg de résidu identifié comme le sel monosodique de l'acide 10 7 j3 - ( D-5-amino-5-carbo>iyvaléramido )-3-(carbamoylozyméthyl)-7— méthoxy-3-céphem~4-carboxylique (Ia)0 lors de l'essai contre -z Vibrio percolans. ce produit donne une zone de 25 mm à 8 mcg/cm . Exemple 13 Acide 7 j3 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxy- 1 5 méthyl)-7-^"thoxy-5-oéphein-4-ogrboxyliaue Procédé de fermentation modifié Etape A : cultures inclinées Un tube lyophilisé de cultures de Strer>torayces lactamdurans (MA-2908) est ouvert aseptiquement et l'organisme 20 transféré à un milieu de la composition suivante : Milieu XII : 1 f> de mélasse Blackstrap 1 % de levure dite National Brewer's Yeast 2,5 f» de gélose Difco, pH 7,0 25 Complément en eau Les cultures inclinées sont mises en incubation pendant 7 jours à 28°C, Quand on les conserve à froid, les cultures inclinées sont stables pendant plus de 13 semaines. Etape B : Etages d'ensemencement : Système à 2 étages 30 Premier ensemencement : le premier ensemencement est inoculé directement de la culture inclinée de l'Etape A à 40 cm^ de "1 f> Primary Dried Yeast N.F, ", pH 7,0 (provenant de la Yeast Product Corporation) dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ern^ à chicanes. Les fioles sont ensuite secouées sur. un appareil rotatif 35 à secousses tournant à 220 tours par minute avec une course de 5 cm environ à 28°C pendant une période de 2 à 3 jours. ■ Deuxième ensereonconert : Un inoculum de 2,5 f provenant du premier étage d'ensemencement est ajouté dans une fiole conteBAD ORIGINAL 71 08668 107 2085702 nant un autolysat de levures à 2 fo Fleischmann S-150, pH 7,0. Le développement dans cet étage est d'une légèreté caractéris-tique et l'incubation, conduite comme dans le premier étage, n'est pas prolongée au-delà de 48 heures. 5 Etape C î Milieu de production Le milieu de production contient par litre d'eau distillée : 30 g de matières solubles de distillerie ; 7,5 g de Primary Dried Yeast H.F; et 0,25 i» (en vol/vol) d'agent antimousses Mobilpar-So Le milieu est réglé au pH 7,0 à l'aide 10 d'une petite quantité de solution concentrée de NaOH, distribué dans des fioles d'Erlenmeyer et passé à l'autoclave pendant 15 ou 20 minutes à 121°C. Après refroidissement, le milieu reçoit un inoculum de 2,5 $> de la semence obtenue dans l'Etape B; La durée de l'incubation peut varier de 50 à 100 heures environ, 15 mais une période d'incubation de 72 heures environ est préférée. Le volume des milieux dans chaque fiole peut varier de 30 à 3 3 50 cm , mais on utilise habituellement 40 cm ; La quantité d*inoculum peut varier de 1 5» à 5 /», mais dans la pratique on utilise généralement une quantité de 2,5 /a, 20 Etape D î Essai Quand la fermentation est terminée, les cellules sont éliminées par centrifugation et le bouillon est dilué à l'aide d'un tampon phosphate, au pH 7,0. La concentration en acide 7 p-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-25 méthoxy-3-céphem-4-carboxylique dans, le bouillon de fermentation est déterminée par la méthode normale d'essai biologique, à l-'aide de disques. L'organisme d'essai utilisé est Vibrio percolans (ATCC 8461). Des disques en papier-filtre sont plongés dans les bouillons dilués et placés sur la surface de boites de Pétri 30 contenant de la gélose qui a été inoculée avec l'organisme d'essai Yibrio percolans (ATCO 8461). On place aussi sur ces boîtes de Pétri des disques qui ont été plongés au préalable dans des solutions normales contenant des concentrations connues de 842A. Les disques sont mis en incubation pendant toute une nuit à 28°C 35 et on note les diamètres des zones d'inhibition. On calcule la concentration de 842A dans le bouillon fermenté par interpolation d'après la courbe normale qui donne la relation entre les diamètres de zones et les concentrations connues de solutions nor- 71 08668 ,os 2085702 "5 maies de Streptomyces lactamd-grans MB-2908 a produit 78,6 |ig/cm de 842A dans le procédé modifié de fermentation. Exemple 14 SE1 disodique de l'acide 7 |3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-5 3-(N,N-diméthylcarbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique Etape A : Acide 7 f3-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléra-mido)-3-(carbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique 10 On dissout de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléra- mido)-3-(car bamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-car boxylique (2,005 g, 4,27 moles) dans une solution aqueuse à 10 $> de phosphate acide dipotassique (26 cm ). Le mélange est ensuite filtré et la matière solide résultante est lavée à l'aide d'une 15 solution aqueuse à 10 $ de phosphate acide dipotassique (2 cm ); 3 Au filtrat, on ajoute 10 cm d'acétone. La solution devient légèrement trouble et a un pH de 8,45. A cette solution, on ajoute une solution aqueuse à 50 % de phosphate tri-potassique de façon à régler le pH à 9»18. On ajoute ensuite du 20 N-éthoxycarbonylphtalimide (1,492 g, 6,69 moles) dans de l'acétone (5»0 cm ) en une période de 5 minutes. On règle le pH à 9,0 par l'addition de petites quantités de solution aqueuse à 50 fo de phosphate tripotassique pendant l'heure et demie suivante. Le mélange est ensuite évaporé pour élimination de 25 l'acétone et le pH est réglé à une valeur de 2 à 2,5 à l'aide d'acide chlorhydrique 2,5N. Le mélange est ensuite traité par rz extraction par quatre portions d'acétate d'éthyle (25 cm ) et les extraits jaune pâle combinés sont lavés à l'aide de 25 cm d'eau, séchés pendant toute une nuit à l'aide de sulfate de 30 sodium anhydre et évaporés pour donner 2,356 g d'une mousse jaune. La résonance magnétique nucléaire et 1'électrophorèse confirment que le produit ainsi obtenu est de l'acide 7 |3-(D-5-phtaloylaminô-5-carboxyvaléramido)-3-(car bamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-car boxylique. 35 Etape B : Ester de dibenzhydryle de l'acide 7f3-(D-5- phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyl-oxyméthyl)-7-méthoxy-5-céphem-4-carboxylique Une solution d'acide 7 p-(D-5-phtaloylamino-5-carboxy- 71 08668 109 2085702 vrl^r-'^.icx>)-3~(onrb"roylo".yn''tliyl)--7- Après cb'-ncton pendant toute une nu.it h la tRH3'»srv..ture ambiante, 5 Ha solvtioii est évaporée pour donner 1 ,053 g de résidu identifié cor.-;e l'ester de dibenzhydryle de l'acide 73-(D-5~ phta-loylanino-ç-esrljoxyvaloranido) -3- ( earb r.Hoylo: Et-re 0 : Ester de dibenzhydryle de l'acjde 7B-(E-phtalcyl~ 10 anin o-5-oarbo^j'valér ;\nîido ) -3- ( hydr oxyiaé t byl ) - 7-néthc>:y-3-eé'Dhert-4-r'arboxyli^ue L'ester de dibenzhydryle d'acide 7 3-(D-5-phtaloyl-araino-5-carboxyvaléramido )-3-( c ar b air o ylo xym é t hy 1)-7-mé t a o ::y- 3-cépher.-4-carboxyliaue (0,5 g) obtenu dans l'étape B est *5 15 dissous dans du diexanne purifié (5 cm ) contenant 1,5 équivalent de Pyridine. On ajoute une solution de chlorure de nitro-syle (1,3 équivalent) dans le chlorure de méthylène et on agite la solution dans un bain de glace pendant une heure. Le produit ainsi obtenu est une solution de 1'ester de dibenzhydryle 20 d'acide 7 B-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-hydroxy-méthyl)-7-inéthoxy-3-céphem-4-carboxylique qui est utilisée directement dans l'étape suivante0 Etape D : Ester de dibenzhydryle de l'acide 7B-(D-5— phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(chlorocar-25 b o ny 1 - o xy m é t hy 1 ) - 7-m é t ho xy- 3 - c é p h en- 4 - carboxylique On fait barboter un excès de phosgene dans une solution agitée de l'acide 7 p-(D-5-phtaloylamino-5~carbox3'rvaléra-mido)-3-(hydroxyméthyl)-7-néthoxy-3-céphe!ï>-4-carboxylique obtenue 30 dans l'étape C et le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant toute une nuito On élimine le phos-gène en excès en faisant barboter de l'azote sec à travers la solution pendant plusieurs heures. Le produit ainsi obtenu est identifié eo-r.ne l'ester de dibenzhydryle d'acide 73 -(D-5-phtaloyl-35 amino-5-carboxyvaléramido)~3-(chlorocarbonyloxyméthyl)-7~néthoxy-3-céphem-4-carboxylique 0 BAD OB1GINAL 71 08668 "° 2085702 Etrr-.e E ; Ester de dibenîrb-dryle de l'acide 7P-(D-5~ phtaloyl":nino-5-carboryvpl dininthyl~cr)xl)a^oyloxyrîothyl)-7-n-ithoxy-3- çé-phcr>~4— c -t "b o - ■ ■■ ■■ 1 i c vie 5 L'ester de dibenzhydryle d'acido 7 B-(D-'J-phtaloyl- amine—5—carboxyvaléramido)—3--(chlorocsrbonyloxyméthyl—7—méthoxy— 3-c«5phen-4-carbozylique obtenu relon l'étape D est refroidi dans un bain de glace et on ajoute 2,5 équivalents de diméthyl-anine• Le mélange est agité à la températtire ambiante pendant 10 une heure et le chlorhydrate d'araine en excès est séparé par filtrationo Le produit ainsi obtenu est identifié comme l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 -(D-5-phtaloylamino~5-carboxyvaléra-mido ) -3- ( N, K-dimé thylcarbamoyloxynétîiyl)-7-iîiéth05gr-3-céphem-4~carboxyliqti.e o 15 Etape F : Sel disodique de l'acide 7 (3-(D-5-phtaloylamino- 5-carboxyvaléranido ) -3- ( N, ÎT-dimé thy lcarbamoyl- méthyl)-7-métho;-:y-3-céphem-4-carborylinue. L'ester de dibenzhydryle d'acide 7P-(D-5-phtaloyl-amino~5-carboxj'valéramido)--3-(li!',N-diméthylcarbamoyloxyméthyl)-20 7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu dans l'Etape E est rz dissous dans de l'anisol (3,5 cm ) et traité par l'acide tri-fluoro-acétique (10 cm ) à la température ambiante pendant 10 minutes» L'acide trifluoro-acétioue et l'anisol sont ensuite éliminés sous pression réduite tandis qu'on maintient la tempé-25 rature au-dessous de 40°C et le résidu est repris dans 25 cm de chloroforme et traité par 20 cm d'eau contenant 0,120 g de bicarbonate de sodium. Le mélange est agité pendant 0,5 heure à la température ambiante et la phase organique est séparée et lavée à l'eau. La phase aqueuse combinée est ensuite lavée deux 30 fois au chlorure de méthylène et lyophilisée pour donner le sel disodique d'acide 7j3 ~(D-5-phtaloylaiaino~5-carboxyvaléramido)-3-(H,N-diméthylcarbamoyloxyiiiétb.yl)-7-méthoxy--3-céphem-4-carboxy-lique, Eta-pe g : Sel disodique de l'acide 7(3-(D-5-amino-5~ 3 5 carboxyvaléramido ) -3- ( N, îT-diméthylcarbamoyl- oxyméthyl ) "thoxy-5-c /r>hem-4-carboxyli que Le sel disodique d'acide 7 j3-(D-5-phtaloyl?~mino-5-carboxyvaléramido)-3-( IJ,N-diméthylcarbanioyloxyméthyl)-7-méthoxy- BAD ORIGINAL 71 08668 1,1 2085702 3-céphem-4-carboxylique obtenu dans l'Etape F est dissous dans l'eau. On ajoute ensuite un équivalent d'hydrate d'hydrazine et le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant toute une nuit; la solution aqueuse est traitée 5 par extraction à l'acétate d'éthyle avant lyophilisation pour donner le sel disodique d'acide 7B -(D-5-amino-5-carboxyvaléra-mido)-3-(N ,N-dimé thylcarbamoyloxymé thyl)-7-méthoxy-3-c éphem- 4-carboxyliqueà Exemple 15 : 10 Sel disodique de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)- 3-(pipéridinocarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-5-céphem-4-C3rboxyliaue Etape A î Ester de dibenzhydryle d'acide 7P -(D-5-phtaloyl-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(pipéridinocarbonyl-oxyméth.vl)-7-méthoxy-5-céphem-4-carboxylique 15 En. substituant une quarfcité équivalente de pipéridine à la diméthylamine de l'Exemple 14, Etape E, et en suivant le mode opératoire décrit, on obtient l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 -(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(pipéridino-carbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, 20 Etape B : Sel disodique de l'acide 7 |3-(D-5-amino-5-carboxy- valéramido)-3-(pipéridino c ar bonyloxyméthy1) -7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique En substituant l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 3-(D- 5-phtaloylamino-5-car boxyvaléramido)-3-(pipéridonocarbonyloxy-25 méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu selon l'Etape A à l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 |3-(D-5-phtaloylamino*-5-càrboxyvaléramido)-3-(N,ïï-diméthylcarbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem~4-carboxylique spécifié dans l'Exemple 14, Etape F, et en suivant la méthode de dé-estérification décrite, on obtient le 30 sel disodique d'acide 7(3 -(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(pipéridinocarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-car boxylique qui, quand il est traité par l'hydrate d'hydrazine selon le procédé décrit dans l'Exemple 14, Etape G-, donne le sel disodique d'acide 7 3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-pipéridinocarbonyl-35 oxyméthyl)-7-méthoxy~3-céphem-4-carboxylique. Exemple 16 : Sel disodique de l'acide 7£-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(pyrrolidinylcarbonyloxvméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboyylique 71 08668 "2 2085702 Etape A. : Ester de dibenzhydryle de l'acide 7(3 -(D-5- phtaloylamino-5-carboxyvaïéramido)-3-(pyrroli-dinylcarbonyloxyméthyl ) -7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique En substituant une quantité équivalente de pyrrolidine à la diméthylamine de l'Exemple 14, Etape E, et en suivant le mode opératoire décrit, on obtient 1'ester de dibenzhydryle de l'acide 7(3-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(pyrroli-dinylcarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique; Etape E : Sel disodique de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(pyrrolidinylcarbo^y1-oxvméthyl)-7-méthoxy-3-c éphem-4-carboxvliq ue En substituant l'ester de dibenzhydryle de l'acide 7p -(D-5-phtaloylamino-5-car"boxyvaléramido)-3-(pyrrolidiny1-carbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu selon l'Etape A à l'ester dô dibenzhydryle de l'acide 7(3 — (D-5— phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(N,N—diméthylcarbamoyl-oxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique spécifié dans l'Exemple 14, Etape F, et en suivant la méthode de dé-estérifi-cation décrite, on obtient le sel disodique de l'acide 7f3-(D-5-pht aloylamino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( pyrrolidinyIcarbonyloxy-méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique qui, quand il est traité par l'hydrate d'hydrazine selon le procédé décrit dans l'Exemple 14, Etape G, donne le sel disodique de l'acide 7(3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( pyrrolidinylcarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique« 'Exemple 17 Sel disodique de l'acide 7 (3 -(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-5-(morpholinocarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-5-céphem-4-oarboxyliaue Etape A : Ester de dibenzhydryle de l'acide 7fJ-(D-5- phtaloylamino-5~carboxyvaléramido)-3-(morpho-linocarbonyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4- carboxylique En substituant une quantité équivalente de morpholine à la diméthylamine de l'Exemple 14, Etape E, et en suivant le mode opératoire décrit, on obtient l'ester de dibenzhydryle de l'acide 7(3 -(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(morpholinocarbonyloxyméthyl)~7-méthoxy-3-céphem-4-earboxylique. 71 08668 113 2085702 E1:e-v>o B : 3el dirodiquo de l'acide 7p -(I>-5-a,"}iriO-5- carboxrnr : lérar-ide J-^-^morphûlinocarbcnylcxy^v'-tlrrl)» 7—r 'J ' ■• • • — '—o '' ' ■ - noryllr^e En substituant l'ester de dibenzhydryle de l'acide 5 7 - ( D-5-phtaIcylr:i],iino-5~carbozyval'/rsJr:iâo ) -3- (morpholinocar— bonylo:-yméthyl)~7-Héthoxy~3-céphar-4~carboî,'y.licue obtenu celon l'Etape A à l'eu ter de dibenzhydryle de l'acide 7 P -(D-5-phta-loylenino-5-oarboxyvalérc^aido)~3--0 V~—iim-thylearbamoyloxy-méthyl)-7-métho::y-3-céphca-4-carbo>ryliqtie cpcc'ifié dans 10 l'Exemple '14, Etape I?, et en .suivant la méthode 'de dé-c s tarification décrite, on obtient le sel disodique de l'acide 7p-(.D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléraniido)-3-(mcrpholinocarbonylozy-néthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique qui, quand il est traité par l'hydrate d'hydrazine selon le procédé décrit dans 15 l'Exemple 14, IT-tepe fi, donne le sel disodique de l'acide 7 P ~(E-5-amino-5-carboxyvaléraœido ) -3- ( morpholinocarbonyloxymétîiyl ) -7-méthoxy-3-céphera-4-carboxy lique. Exemple 18 Sel disodique de l'acide 7 0-(D-5~amino-5-carboxyvalérai?.ido)- 20 5-(acéto"VT.éthvl)-7-Tnétho>"'-3-cér"'''.er-4-c?rbo:-r;rllaue Etape A : Ester de dibenzhydryle de l'acide 7p-(D-5- phtaloylamino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( acétoxy- méthyl)-7-méthox"-3-céphem-4-cerboxTrliritie On ajoute un excès de chlorure d'acétyle, en agitant, s 25 l'ester de dibenzhydryle d'acide 7 P~(E-5-phtalo;ylamino-5-carboxyvaléramiûc)-3-(hydroxynéthyl)-7-methoxy-3-céphesi-4-carboxylique obtenu dans l'Exemple 14, Etape C. le rélange est abandonné à lui-même pendant plusieurs heures à la température ambiante, le mélange est ensuite concentré sous vide pour élini-30 nation du chlorure d'acstyle en excès et du solvant. le résidu, ainsi obtenu est l'ester de dibenzhydryle de l'acide 73 -(B-5-phtaloyla:i)ino-5~carbox3>valérariido)~3~(acétoxyméthyl)-7-méthox3r-3-céphem-4-carboxylique0 l'ester de dibenzhydryle de l'acide 7 j3-(D-5-phtaloyl-35 anino-5-carboxyvalc ramido)-3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3- cépher:i~4-enrboxylique peut être obtenu aussi en substituant du cétène au chlorure d'acétyle et en suivant par ailleurs le mode opératoire dr'crit dans la présente Etape A0 ORIGINAL 71 08668 114 2085702 Etape Pi : Sol disodique de l'acide 7 jâ ~(D-5~phtaloylar.ir.o-5~c ar b oxyv r lé ra «o d o ) -3- ( acé t oxym é thyl )-7-rn étl'ioxy -rreyvXiTns L'ester de ditznzhydryle u1 acide 7 8-(D-5-pfctaloyi*vï,ino-5 5-carboxyvaléra^xdo ) -3- ( • .c a t oxynéi] ,y 1 ) -7-métl ïOxy-3-c6p}\e®-4-car-"boxyliqua obtenu dans l'Etave A est dissous dans du dioxanne et le mélange est soumis à la méthode do dé-estérifieation décrite dans 11Exemple 14, Etape F. On obtient ainsi un résidu comprenant le sel disodique de l'acide 7p. -(D-5-phtaloylsmino-5-carboxyvaléramido)-1 0 3- ( acé toxymcthyl ) -7-rnét hoxy-5-céphein-4-earboxylique • Etape O : Sel disodique de l'acide 7p-(D-S-amino-S-carboxy-valérami do) -o-( acétoxy nié thyl)-7-méthoxy-3- c éph em- 4 - ca rb o xy 1 i r. u e Le sel disodique de l'acide 78 -(D-5-phtaloylamino-5- 15 carboxyva.léramido)--3-(aci'toxyméthyl)-7-méthoxy-3--céphem-4-carboxy- lique obtenu dans l'Etape B est dissous dans du chlorure de méthylène et la solution est traitée par extraction par une solution à 5 %> de bicarbonate de sodium; Le mélange résultant est ensuite acidifié au pE 2 à l'acide eulfurique et traité par extraction à 20 l'acétate d'éthyle. Après séchage, l'extrait est concentré sous vide et le résidu est dissous dans l'eau0 On ajoute ensuite un équivalent d'hydrate d'hydrazine et le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant toute une nuit. La solution aqueuse est traitée par extraction à l'acétate d'éthyle 25 avant lyophilisation pour donner le sel disodique de l'acide 7j3-(D-5-amino-5-carboxyvaléranido)-3-(acétoxyrtiéthyl)-7-m.éthoxy-3- céphem-4-carboxylique. D'une manière similaire à celle décrite dans l'Exemple 10, on peut obtenir tous les dérivés à substitution 3~acyloxy-30 de la présente invention. Par exemple, en substituant l'halogénure d'acyle approprié au chlorure d'acétyle de l'exemple 18, Etape A et en suivant le mode opératoire décrit dans les Etapes A, B et C de cet exemple, on peut obtenir tous les dérivés correspondants à substitutions 3-alcanoyloxy, 3-aromatique-35 carbonyloxy, 3-aralcanoyloxy et 3-cycloalcane-carboxyloxy de la présente invention. L'équation suivante et le Tableau XVIII illustrent ce procédé et les produits ainsi obtenus0 BAD ORIGINAL t 71 08668 115 2085702 COONa 71 08668 2085702 TABLEAU XVIII Ex. X R19 19 Cl 20 Br 21 01 22 Br 23 G1 24 Cl 25 Cl S 26 Cl 27 Br • OHJ-OH-A \ r~^ " s =J 71 08668 117 2085702 pp. Sel i': o de 11 aci.' c 7^~(5->-'-m:\nG~5~C:-ïhoxyvaXér--r;ido)~3-~ ('T-: 3—cérl:caria-—"'.jrue jvt"---? A : V7ati.-r do d ilx r.^hydryl'- à s l'acide 7 3- (/3-5-p£taloyl~ 5 aniino-D~cr;rl2o:.y."alcJ*r.,!iJ •.. :;)~3-(I.-?^iylc:irbar\-oyloxy~ r T1 )-7-- M-hcr cc'^c:'-' -carhorylique L'enter de àiV.nzh.yàrylo d'acide 7P-(d-5-phtaloyl-auinc-5-carbo-yvaléramido )-3~(hydro:7:mé thyl)-7-mé tho::cy~3-céphen-^-cnrcoryliqne (250 Kg) est rais en svts pension dans du 10 Qj.Ki''tiiy3.for.ra2:iide (5 e:ir ) . Le mélange de réaction est placé sous azote et agité par des ondes ultrasonores• On ajoute ensuite de la triéthylamine (0,20 cri ) et de l'isocyanate de -Z ^ méthyle (0,625 cm) et, après dissolution, le mélange est abandonné à lui-même pendant 0,5 heure. 15 On ajoute de l'oxyde d1éthyle au mélange, et, après cen- trixugation, on décante l'éther. On ajoute une quantité supplémentaire d'oryde d'éthyle au résidu huileux et la solidification du produit est facilitée par grattage. La matière solide résultante est recristallisée à partir d'un mélange chaud de 20 méthanol et d'isopropanol (180 mg) en deux récoltes et ces deux récoltes combinées sont recristallisées de nouveau pour donner un produit identifié comme l'ester de dibenzhydryle de 1 ' a cide 7 S- (D-5-phtaloylaraino-5-carboxyv aleramido ) -3- (17-méthylcarbamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-cépheni-4-earboxylieue. 25 Etape B : Gel disodique de l'acide 73-(D-5-phtaloylar;ino- 5-carboxyvaléramid o ) -3~(lT-m£thylcarbaiaoylo:-:ymsthyl- 7- L'ester de dibenzhydryle d'acide 7p-(D-5-phtaloyl-amino-5-carboxyvaléraiaiâ o ) -3- (K-néthylcar'banoyloxyméthyl ) -7-30 méthoxy-3-céphem-4-carbozylique obtenu dans l'Etape A est T7 dissous dans de l'anisol (3,5 cm ) et traité par l'acide tri-fluor o-a c é-1 iqu e (10 eni^) à la température ambiante pendant 10 minutes. L'aciclo trifluoro-acétique et l'anisol sont ensuite éliminés sous pression réduite tandis qu'on maintient la 35 température au-dessous de 40°C et le résidu est repris dans 25 cm^ de chloroforme et traité par 20 enr^ d'eau, contenant 0,120 g de bicarbonate de sodiumo Le mélange est agité pendant 0,5 heure- à la température ambiante et la phase organique bad otwî»*m- 71 08668 118 2085702 est r : ' 'v et lavée à l'eau. La r:o aqueuse combinée est ensuite lavée deiu: foin au chlorure de méthylène et lyophilisée peur donner le sel disodique de 11 acide 7j3-(D-5-phtnloylanitto-^-carboxyvaléranic! o ) -3- (iï-mo tliylcarbarùoyloxyraé tJ îyl ) 5 7-mé thox;r-3-céphem-4-carboxylique. Etape G : Sel disodique de l'acide- 76-(I)-5~amino~5-carboxy~ valéramido)-3- (IT-né thyl earbarroylozymé thyl) ~7~méthox3r~ 3-céphem-4-carboxyliouc ^ Le sel disodique d'acide 7|3~(E~5~plrfcaloylamino-5-1 0 carhoxj'valérariiido ) -3- (H-méthylcarbamoyloxyrfxéthyl ) -7 -méthoxy-3-ccpher.i-4-carboxylique obtenu dans l'Etape -B est dissous dans de l'eau. On ajoute ensuite 1 équivalent d'hydrate d'hydrazine et le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant toute une nuito La solution aqueuse est 15 traitée par extraction à l'acétate a'éthyle avant lyophilisation pour donner le sel disodique de l'acide 7|3-(D-5-anino-5-carboxyvalé ramid o )-3-( 1T-:ï] é thyl car bamoyloxyiné thyl )-7-méthoxy-3-cépheni-4-carboxyliqueo En suivant le mode opératoire décrit dans l'exemple 28, 20 on peut obtenir tous les dérivés 3-(H-monosubstitué carbamo3~l-oxyméthyle) de la présente invention. Ainsi, en substituant l'isocyanate approprié à l'isocyanate de méthyle de l'exemple 28, étape A, et en suivant le mode opératoire décrit dans les étapes A, B et C de cet exemple, on peut préparer tous 25 les dérivés 3-(carbamoylox3roiéthyle substitué) de la présente invention, l'équation suivante illustre la réaction de l'exemple 28, étapes A, B et 0 et, en même temps que le Tableau IX, ci-après, les matières de départ de ce procédé et les produits qui en dérivent : bad original 71 08668 119 2085702 HOOCCF5 Base 71 08668 120 2085702 TABLEAU XIX Ex. 0=C=NR3 R1? Base M 29 ososdfohgchg Cl -ohgchgcl NaHCO, j -Na 30 0=0=1103201 -chgcl EHC03 -K 31 0=CMSrC(CH,), 5 3 -O(GE3)3 NaHCO^ -Na 32 0=C=3ÏC2H5 -C2H5 khco3 -K 33 o=c=îto(ch5)2oh2ci -0(CR3)2CH201 NaHCO, 3 -Na 34 0=C=NC00C2H5 -C00C2H5 NaHC03 -Na 35 0=C=NS02-^^-CH3 -802-Q- OH, NaHCO-3 -Na 36 0=0=*-^ ' o NaHCO^ -e 37 0=C=^CH— 2 NaHCO, 3 -Na Exemple 58 Acide 7 0- (D—5-amino-5 -carboxyvaléramido ) -3 -pyr idinium-iaé thyl ) -7-mé thoxy-5-cephem-4-carboxyligue Une solution d'acide 7(3- (D-5-amino-5-carboxyvalérami-5 do)-3-(acétoxyméthyl)-7-méth.oxy-3-c'éphem-4-carboxylique (1 ,0 g) est portée au pH 2,5. On ajoute de la pyridine (8 cm^) et la solution est chauffée à 60°G pendant deux heures. Le mélange de réaction est ensuite lyophilisé et le résidu est dissous dans l*eau et passé à travers une résine échangeuse d'anions 10 p oly s t yr ène -1 r imé t hylb enzylammonium (45 de HgO). Le mélange résultant d'acide 7(3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-5-(pyridiniumméthyl)-7-méthoxy-3-eéphem-4-carboxylique est dilué à l'aide d'eau et des fractions choisies sont lyophilisées pour donner de l'acide 7f3-(D-5-amino-5-carboxyvaléra- 1 5 mido ) -5-(pyridiniumméthyl)-7 -méthoxy-5-céphem-4-carboxylique sensiblement pur. En substituant une quantité équivalente de triméthyl-amine et de triéthylamine à la pyridine dans le procédé précédent et en suivant par ailleurs le mode opératoire décrit, 71 08668 121 2085702 on cttic-nt de ~j 'acide 7?-(-)~5-arâno-^-carbo: yv.\Lérar:ioo)~ 3-(trj r-é t:.yl-..r- : o:ii vvxflé tliyl)-7~';-éth.; ;.-3-oérH;cr>-'-carhonyli'jvie et de l'acide 73-(S-5~;v:ino-5-c-,7/cor;^aléra.";iâo)-;>~(t:.-i-éthylvn;; -.c-ûi ir/j-é i;hyl)-7thoxy-;>--o-c:..rhoreylique » 5 Oii peut obtenir tons les dérivés 3-pyricl i :*îiu: -raé thyl g de la pivsente invention on eubctiiuar.t la pyridine aonoruoa-tituco ait noyai?, ayproprit o k la pyridine spécifiée corr.r> corps en réaction dano l'e^onîpl.G précédente L'équation suivante et le tsbleau annexé illustrent.ce procédé de préparation et 10 les produits ainsi obtenus : ° f tt „a T:T L OCE-r 3 H000-GH- (Cïï2 ) 5-0J,!- iîH„ 0 y? 0 !i GE^coch.. + K cooh 06H, hooc -ch- ( 0ho ) .. -g2ïh-i l'o NIL O S s "O -ch, coch K + TABLEAU ZZ Ex. 39 3 -? 40 3-01 41 3-3r 42 3-1 43 ' 4-or3 44 3-COOH 45 4-GOOïI 46 3~00IÎHo 47 4-CO:ÏÏI„ 48 49 4-cc:n:G0 5C T : y 4„ocr(ch X Ex. "3 ]2 52 53 54 55 56 57 53 59 60 61 62 63 64 3-co:t(c2h5)2 3-Cïï2c00h 3-coch^ 4-gogh3 2-GHj 2-0oH_ ^ O 3-CH^ 4-02E5 3—o-ipoh 4-01*2 oh 4~oh^GI:-.OE~ t- C. *) 3-?03H ■y.^n-r BAD ORIGINAL 71 08668 122 2085702 L~^"7;3-(D-5-a:r.inrj"5-ea.rboz3rvulérauido)-4~carl?o::::y"7-;.iétho.:;y-3~ C''"Ph.a' 3—ylv'tyl 7':r~\'? Ilr.c solution û*acide 7(P-5-nrAno-S'-c?xbo:cjrvriléiv-v:iclo )-3~(ncî'"uO"y;::'i;t" :./l )-7"uéthory~; 4-cai"boaylique (1,0 g) et do thio-urée (1,0 g) dans 25 en'3 d'eau est maintenue à "57°C pendant 5 jours. On ajoute de l'acétone (200 cmJ) et le mélange est refroidi dans un "bain de glace, Le produit résultant est ensuite séparé par filtration et fractionné.à . travers une réeine échangeuse d' anioxi3 polystyrène-triméthyl-bensylarononium (43 f de îL,0) • Des fractions choisies sont lyoplvil.isées et le produit brut est ensuite re cristallisé à partir d'un mélange de méthanol et d'eau pour donner de la S -/~7 3- ( B-5-ar.iin.o- 5 - carb onyvalé raraid o ) -4—carboxy-7 -né thosy-3 -c eph e:a-3~ylné thyl_7-i sothio-uré e sensiblement pure. En substituant -une quantité équivalente de IT-méthyl-thio-urée, U-éthylthio-urée, 17-propvlthio-urée, LT, IT-dimé thyl-■ thio-urée, ïTjlI-diéthjalthio-urée et I:I,U-dipropylthio-urée à la thio-urée spécifiée dans le procédé précédent et en suivant par ailleurs le mode opératoire décrit, on obtient la IT-iiéthyl-S-/7 7 3-(D-5-amino-5-carljox3nraléramido)-4-carboxy-7-méthoxy- 3-céphem-3-ylraéthyl_7ieothio-urée, .la H-éthyl-S-/" 7S-(B~5-amino-5-carboxyvaléra;nido)-4-carboxy-7-nétho:>:y-3-céphe:ri-3-ylmétfryl_7inothio-urés, la ÎT-propyl-S-^" 7 j3~ (D-5-amino-5-carboayvalérnmido)~4-ce^boxy-7-métho";r-3-ca'phe:"i-3~ylnéthyl_7-isothio-urée, la H ,ï!-diné th^l-S-^"-70-(D-5-amino-5-carboxy-valéramido)-1-carboxjr-7-méthoxy-3-céphem-3-ylniéthyl)isothio-urée, la lT,I:j-diéthyl-3-^~73-(D-5-amino-Ç-carbozyvalcranido)- 4-carboxy-7 -nié thoxy-3-c éphem-3 ~yl:r.é thyl_7 is othio-ur s e et la IT,I.T-dipropyl~8-/~ 7 j3- (.D-5-am5j3.o-5-Cf.rboî:yvalcramido)-4-C3.rboxy-7 -inéthoxy—3-ccphem-3—ylr.:é thyl_7 is othio-urée. Exemple 66 Acide 7 3- (D-5_amino-5-carboxy"valéramido) -3 - ( é thyl t h i orné thyl ) - 7— riéthoxv—3—cé'ohen—■ca rboxvlioue Un mélange c.1 acide 73—CO-5-air:ino-5-carbo:r.yvaléramido)-" 3-(acétozyrr.éthyl)-7-;''îétriozy-3-cépher.-4-ccroo:':ylique . (0,654 g) et d'éthanethiol (0,37 cm-;) dans im mélonge de 1 partie d'acétone et 1 partie d'eau (10 c a'") est. agité à la tempéï-ature bad or/g; 71 08668 123 2085702 ambiante et on ajoute une solution à 10 f d'hydroxyde de sodium (2,0 cm-^) en agitant. Le mélange est ensuite chauffé dans un tube scellé pendant 100 heures et le mélange résultant est concentré sous vide. Le résidu est dissous dans l'eau et 5 fractionné à travers une résine échangeuse d'anions polystyrène-triméthylbenzylammonium (43 e/° de H^O). Des fractions choisies sont combinées et lyophilisées pour donner de l'acide 7(3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(éthylthioraéthyl)-7-niéthoxy- 3-céphem-4-carboxylique • 10 En substituant une quantité équivalente de méthanethiol, de propanethiol, de pyridine-2-thiol, de pyridine-3-thiol, de pyridine-4-thiol, de benzothiazole-2-thiol, de 4-méthyl-pyrimidine-2-thiol et de 2-méthyl-3,4-thiaâiazole-5-thiol à l'éthanethiol spécifié dans le procédé précédent et en suivant 15 par ailleurs le mode opératoire décrit, on obtient l'acide 7 {3- (D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- (mé thylthiométhyl) -7 -méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, l'acide 70-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(propylthiométhyl)-7-méthoxy-3-céphem- 4-carboxylique, l'acide 70-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-20 3-(2-pyridylthiométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, 1'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(3-pyridyl-thiométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, l'acide 70-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(4-pyridylthiométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, l'acide 70-(D~5-amino-5-2 5 carboxyvaléramido ) -3- (2-benzothiazolylthiométhyl) -7 -méthoxy- 3-céphem-4-carboxy lique, 1 ' acide 7 (3- ( D-5-aminocarb oxyval é - r amid o ) -3 - ( 4-mé thylpyrimidin-2 -yl thi omé thyl ) -7 -mé thoxy-3-cépnem- 4-carboxylique et l'acide 70-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(2-méthyl-3,4-thiadiazol-5-ylthiométhyl)-7-méthoxy-3-céphem- 30 4-carboxylique. Exemple 67 5-/" 7 3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-4-carboxy-7-méthoxy-3-céphem-3-ylméthyl 7l'T. IT-dimé thyldithio carbamate Une solution d'acide 7(3-(D-5-amino-5-carboxyval:'rami-35 do)-3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (6 »82 g) et de IT,îT-diméthyldithiocarbamate de sodium (2,86 g) dans ■7. 60 cm d'eau est chauffée à 50°C pendant 24 heures. Le produit est lyophilisé et ensuite fractionné à travers u^~ résine 71 08668 124 2085702 échangeuse d'anions polystyrène-triméthylbenzylammonium (43 ia de E^O). Des fractions choisies sont ensuite lyophilisées pour donner du S-/~70-(D~5-amino-5-carboxyvaléramido) -4-carboxy-7-méthozy-3-céphem-3-ylméthyl_/~N,ïï-diméthyldithio-5 carbamate• En substituant une quantité équivalente des corps en réaction suivants : N-méthyldithiocarbamate de sodium, N,N-diéthyldithiocarbamate de sodium, N,N-di-n-propyldithiocarba-mate de sodium, H-méthyl-N-(2-diméthylaminoéthyl)dithiocarba-10 mate de sodium, N-éthyl-N~(2-diéthylaminoéthyl)dithiocarbamate de sodium, N-(2-di-n-propylamlnoéthyl)dithio carbamate de sodium, N-raéthyl-N-(2-morpholinoéthyl)dithiocarbamate de sodium, N-méthyl-N-(3-diéthylaminopropyl)dithiocarbamate de sodium, N-phényl-N-(2-méthylaminoéthyl)dithiocarbamate de 15 sodium, N,N-tétraméthylènedithiocarbamate de sodium, îî,îf-pentaméthylènedithiocarbamate de sodium, N,N-bis-(2-hydroxy-éthyl)dithiocarbamate de sodium et le sel de sodium de 4-méthyl-pipérazinodithiocarboxylate au diméthyldithiocarbamate de sodium spécifié dans le procédé précédent, en omettant 20 le bicarbonate de sodium, mais en suivant par ailleurs le mode opératoire décrit, on obtient le S-/"70-(D-5-amino-5-carb02yvaléramid0)-4-carboxy-7-méthoxy-3-céphem-4-ylméthyl_7-N-méthyldithiocarbamate, le S-£"7p-(D—5-amino-5-carboxy-val éramid o ) -4- car boxy-7 -méthoxy-3 -c éphem-3 -ylmé thyl_7-N, N-25 diéthyldithiocarbamate, le S-/~7|3-(D-5-amino-5-carboxy-vàléramido ) -4-car boxy-7-mé thozy-3-c éphem-3 -ylmé thyl_7 -H", N-di-n-propyldithiocarbamate, le S-/~ 70-(D-5-amino-5-carboxy-valéramiâ0)-4-carb0xy-7-méth03y-3-céphem-3-ylméthyl_7-lî-méthyl-(2-diméthylaminoéthyl)dithiocarbamate, le S -^70 30 (D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-4-carboxy-7-méthoxy-3-céphem-3-ylméthyl_7-N-éthyl-N-(2-diéthylaminoéthyl)dithiocarbamate, le S-/" 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-4-carboxy-7-mé thoxy-3-céphem-3-ylmé thy 1_7-IT-(2-di-n~propylaminoé thyl)-dithiocarbamate, le S—73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -35 4-carboxy-7-méthoxy-3-céphem-3-ylméthyl_7"-N-méthyl-If- (2-morpholinoéthyl)dithiocarbamate, le S-/~ 73~(D-5-amino-5- carboxyvaléramido)-4-carboxy-7-Eiéthoxy-3-céphem-3-ylméthyl__7- N-méthyl-N-(3-diéthylaminopropyl)dithiocarbamate, le S-/- 70- 71 08663 2085702 (D-.'5-''-:i:i.no-!:)-car'bor;rvr ?/'ra^iôo)-4-c-ir ooxy-?~nt thoxy- 3~o-'p3ieri~ 3-yÂO'^uhylJ/-"'.-phén.yl--J.'«-(2-L:t'tii:'r'.'îï- ir oé tï\yl)Citbioc: leb'^ato, le 8-/~7 £- ( c—h -carbox;lérr.niid o ) ~carbo:-:y -7~ ].r'tho-~-~3-c 'pl-.er.-3-yD.r:.«'tbylJ7-*" f3;~t-'tror.étI-yloneditVdooarbu:.iate, 5 le B~/~7 ê - ( J aino-;5-cn.ï'boxyvp.lv v'auiido ) -~v-cftrtozy-7- r.o thcr ;y-3~c-' pi; or-~3-y!::ic thy -pontnmotjiylunedithiocarbariato, le S-/ 72- (î:—5-crûino~5 -or rboxyvaloranido ) -/1. -car'bo:::y-7 -me th oxy-3-c ^phci.i-3-yl'ï;é thyl_7 -77 , I7-bi h- (2 -hydroxyéthyl ) dithio-carbr.Ks.te et 2 e S~£~ 7 p- C3-5-amino-5-carboryvslércur.ido ) -4-1 O caii.io:',y-7-m6thoxy-3-céphem-5-ylméthyl_y—t-u'éthyl-pipérasirLO-dithiccarbozylate. Exemrle 68 Acide 7j3-(D-5-aMtto-5-ca.-rboxyvaléra-m±do)-3-(benzoylthio- mc thyl ) -7 -m ét h oit-? - c é pho -i-4 - c nrb or.-rlia ue 15 Un mélange d'acide 73-(3-5-amino-5-carboxyvaléramido)- 3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3-céph.era-4-carboxylique (0,654 g), de bicarbonate de sodium (0,504 g) et d'acide thiobenscxaiie ZI (0,414 g) dans 5,0 cm d'eau est chauffé à 50°G pendant toute une nuit .sous une atmosphère d'azote. Le produit est 20 précipité par l'addition d'acétone et cristallisé à partir d'un mélange d'alcool et d'eau pour donner de l'acide 73-(3-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3~(benzoylthiométhyl)-7~méthoxy-3-cépheni-4~carboxylique. En substituant une quantité équivalente d'éthylxan-25 thate de potassium, de n-propyl~xanthate de potassium, d'isopropyl-xanthate de potassium, de n-butyl-xanthate de potassium, de n-hexyl-xanthate de potassium, de cyclopentyl-xanthate de potassium et de cyclohexyl-xantliate de potassium à l'acide tîiiobenzoïque spécifié dans le procédé précédent, et 30 en suivant par ailleurs le mode opératoire décrit, on obtient 1'acide 7 3-(D~5-anino-5-carboxyvalér;?niido)-3-(éthoxythio-carb onyl thiomé tiiyl) -7-methoxy-3-céphem-4-carboxylique, 1'acide 7 3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(n-propoxy-thicc:-rbonylthioniéth2rl)-7-:néth oxy-3-céphem~4-carboxylique, 35 1 ' acide 73- ( j)-3-anin0~5-carb0î:yT,',alér?i!ai 1 ' acide 7 3- (:û-3-anino-5-carb02yvolorar.iido)-3-(n-br.toxy-thiocr. rb onylthiomé thyl) -7-mé thoxy-3-céphe::—l-carboxylique, BAD ORIGINAL 71 08668 126 2085702 1 ' ; iei.de 7 3- • ( min o~5-caruoxyvalé ramid o ) -3- (n~ho xyloxy-thiQcard)cnylthiométhy.l)~7-^thoxy-3~cépha^-4-car"bo">H/Iique, 1 ' acide 7 3-(D~5~ai.iino~5-cnrboxyvaléraiî\iào) -3~ ( cyclopentyl-oxythiocarboiiylthior;.o thyl )~7-m(HàiCc:y~3"Céphem-4-carbory lique 5 et l'acide 7p-(D-5-am:uio-5-carboxyvalorc'i.:ido)'-3--.(eyclohexyl-oxyihiocarbonylthioïr:éthyl)-7-^éthoxy~3-céphem~4--carboxylique. Exe-nple 69 A eide 7 P- (3~5-amino~5-carboxyvaléranid o ) -3- ( toluène-p- si^lfonvlmcth''l)~7-^othoxy-5-QHphoa-4-carboxylique 10 Un mélange d'acide 7(D~5-anino-5-carboxyvaléran±- do)-3- (acétoxynéthyl) -7-méthoxy~3-céphem~4-carboxyl.ique (0,654 g) N ^ et de toluène-~p-sulfinate de sodium (1 ,0 g) dans 5>0 cm d'eau est chauffé à 50°0 pendant 24 heures. Le mélange est concentré-sous vide et cristallisé à partir d'un, mélange de méthanol 15 et d'eau pour donner de l'acide 73~(D-5-amino-5-carboxy-valéranid o)-3-(t oluène-p-sulfony 1m é thyl)-7-mé thoxy-3-céphen-4~carbox;/lioue. Exemple 70 Acide 7 jB-(h-3-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(azidoiné thyl)-7- 20 méthox.y-3-céphem-4-carboxyliqiie Un mélange d'acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(acétoxyméthyl)-7-méth.oxy-3-céphem-4-carboxylique (2,0 g) et d ' azothydrure de sodium (1,0 g) est dissous dans 10 cm'' d'eau et chauffé à 50°C pendant toute une nuit. Le mélange 25 est ensuite lyophilisé pour donner de l'acide 70-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( asidomé thyl ) -7 -mé thoxy-3 -céph.em-4-carboxylique brut. En variante, au lieu de traiter l'acide 7|3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(acétoxyraéthyl)-7-méthoxy-3-30 céphem-4-carboxylicue par l'azothydrure de sodium, il est possible de le remplacer par le 842A lui-même dans un procédé par ailleurs analogue pour obtenir un produit identique. L'exemple suivant illustre ce procédé de préparation : De 1'acide 7H~(D-5~amino~5-carboxyvaiérauido)-3-35 carbamoyloxyréthyl ) -7 -mé thoxy~3~eé phe'ji-4-carboxylique (100 mg) dans une solution tampon phosphate 0,5 K (5 cnr5, obtenue par addition de 3,5 g de phosphate diacide de sodium et de 3,4 g de phosphate disodique dans 100 cm3 d'eau suivie original 71 08668 127 2085702 de l'addition d'assez d'acide chlorhydrique pour porter le pH à 5) est chauffé en présence d1azothydrure de sodium (20 mg) à 95°C pendant 8 minutes. La chromâtograpliie préparatoire sur couche mince donne 20 mg d'acide 7(3-(D-5-5 amino-5-carboxyvaléramido)-3-(azidométhyl)-7-méthoxy-3- céphem-4-carboxylique comme indiqué par identification infrarouge et.de résonance magnétique nucléaire. Le traitement de cette matière par l'acide trifluoro-acétique (1,0 cnr ) à 0°0 pendant 5 minutes suivi du refroidissement dans un volume 10 important d'éther et de 1 ' évaporation du solvant donne 15 mg d'acide 7 P- (D-5-amino-5-car"boxyvaléramido ) -3- (azidométhyl) -7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique sous la forme d'une poudre "blanche• Cette matière possède une bio-activité contre diverses souches de bactéries. Ce produit est caractérisé par les 15 résultats suivants : Chromatographie sur couche mince : conduite sur des plaques de cellulose dans un solvant acétonitrile aqueux à 75 *f° i la valeur de Rf pour ce produit est de 0,7 ; le Ef pour le sel disodique de 842A est de 0,3. 20 Ultra-violet î le maximum pour a est de 263 milli- microns (m^i.) ; le coefficient d'extinction moléculaire est de 3400 environ (théorique t 8000) ; à 1'infra-rouge dans le nujol, on trouve 1780 cm , ce qui indique la présence d'un noyau de {3-lactame ; également, le produit donne un résultat 25 positif à l'essai à la ninhydrine, ce qui indique la présence d'une chaîne latérale oc-aminoadipoyle. Essai biologique : les dimensions des zones autour des disques dans le tableau suivant sont exprimées en mm pour 100 y /cm3 d'antibiotique. 30 Organisme Sel disodique Acide 7(3-(B-5-amino~5-carboxy- de 842A valéramido)-3-(azidométhyl)-7- •2 (100 Y /cm) méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (100 /cm3) Escherichia coli W-HB-60 18 21 35 Pseudomonas stutzeri MB—1231 22 . 20 Vibrio percolans HB-1272 18 16 (5 f/cm3) 71 08668 128 2085702 Exemple 71 Acide 7 3- (D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- (aminométhyl)-7- mé t h oxy-3 -céphem-4-carbo xyl ia ue L'échantillon brut d'acide 7^(D-5-amino-5-carboxy-5 valéramido)-3-(azidométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu dans.l'exemple 70 est hydrogéné sur de l'oxyde de platine dans une solution méthanolique aqueuse contenant de l'acide acétique. On sépare le catalyseur par filtration et on concentre la solution. Une solution du résidu est ensuite 10 fractionnée à travers une résine échangeuse d'anions polyetyrè-ne-triméthylbenzylammonium (43 % de E^O) et des fractions choisies sont combinées et lyophilisées pour donner de l'acide 7{3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(aminométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 15 L'acylation de l'acide 7P-(D-5-amino-5-ca.hoxy-' valéramido)-3-(aminométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique avec un halogénure d'acyle, un halogénure de propionyle ou un halogénure de 2-phénylacétyle donne les dérivés N-acylés correspondants î acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-20 3-(acétamidométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(propionamidomé ti iyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et acide 7 f3- ( D-5 -ar Ino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( 2 -phény lac é t amid omé thyl ) -7 -méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 25 En variante, au lieu du procédé catalytique spécifié ci-dessus, l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramldo)-3-(azido-méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique peut aussi être réduit en 1'aminé correspondante par hydrogénation moléculaire. L'exemple suivant illustre ce procédé de préparation. 30 On dissout de l'acide 7f3-(D-5-amino-5-carboxyvaléra- mido)-3-(azidométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique dans une solution de 90 fo d'acide acétique et 10 fo d'eau. Le mélange est refroidi à 0-5°G et on ajoute de la poudre de zinc (30 mg). Après 10 minutes, on filtre le mélange et on le traite à 35 l'hydrogène sulfuré pour éliminer le zinc soluble. Le mélange résultant est ensuite dilué à l'aide d'un volume important d'eau et lyophilisé pour donner de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(aminométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4- 71 08668 129 2085702 carboxylirae s&nsihlrnçnt pur. Ce produit est c-.ractérisé -c.r le" r .'.'Mil i--.tr: f'.-: v nts ; Ohm tf> rh:î c "V" co"c'i" -inco : ei.?eetuée j;uv de a plaques oo collujoro dr..:i" un solvant aeéioniti'ile o queux à 5 75 '-J » -n- v-leur ue ilf potir oo prcîtiit est de 0,2 ; le Pa pour le s»cl àisodiqus de £421 est de 0,3. ïïlt;-' ".-'iolot : le ■laximum pour À est 25J np. j le coefficient drextinction moléculaire est de 3500 environ (théorique GÛ00) ; à l'infra-rouge dnns le nujol, on trouve 10 17^0 cm"1, ce qui indique la présence d'un noyau de 3-lac-tame ; égalaient, le produit donne un. résultat positif à l'essai h la ninhydrine, ce qui indique la présence d'une chaîne latérale gamma-aniinoadipoyle. Es:--j b.i olcu'.Hue : Les dimensions des zones autour 1 5 âes disques dans le tableau suivant sont exprimées en mm t>ovir des concentrations égales d'antibiotique. Organisme Sel disodique Acide 73-(?-5-amino-5-corho:iy- de 842A valéramido)-3-(aminométhyl)-7- riéthoxy-3-cé'i?hem-4-corhox'''llo'ae 20 Yibrio percolans h3-1272 .18 20 (5 y/cm3) Salmonella gallinarum I-IS-12G7 27 21 (100 y/cm3) Pseudomonas 25 stutzeri MB—1281 21 21 (100 y/cm3) Jl. xemple 72 Acide 7'--(D-5-amino~5-carba;-:yvaléramido)-3-~(2,4~dihydrox3'-«. ben%yl)-7--; a thoxy-3~eénher.-4-caroQxyligue Un mélange d1 acidc 73-(j)-5-amino-5~carboxyvalér'>mido)-30 3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3~céphem-4~carboxylique (0,554 g), de résorcinol (1,1 g) et d'eau (10 cm"') est chauffé à 50°G pendant 2 jours» Le mélange de réaction est ensuite lyophilisé pour donner de l'acide 73-~(ï)-5-a;nino-5~carboxyvaléoramido)-3-(2,4-di-hydroxy!:en3yl) -7-mé thoxy-3-céphem-4-car boxylique 35 brut. l:xomole 73 Acide 73-(D—5-amino-5-carboxyvaléramido)-3—("-:.: -'thylindcl—3— ylnéthyl)—^ -v.i-'tVra.y—3—cér-he''1—4—carbo^yliquo bad ork3înal 71 08668 130 .20,85702 Une solution de K-mcthylindole (0,655 g) dans de 11 acétone (5 cmj) est ajoutée h ure solution. d'acidc 7{5~(D-5-amino-5-carbo.;'yvaléranida)-3-(ae-'toxymvéihyl)-7-nétho-:-:y~3- ccphem~4-carboxylique (0,654 g) dans de l'eau (5 cm"') à 50°0. Le mélange est chauffé pendant 4-' heures e'i; le solvant est ensuite éliminé sous vide et le résidu est trituré avec de l'éther pour donner de l'acide 7£-(D-5-an&no-5-oarboxyvalé-ramid o ) -3- (F -mo tbylind ol-3-ylmé thyl ) -7 -mé tlioxy-3 -c éphem-4-carboxylique "brut. Ere: ' le 74 Sel disodique de l'acide 7 B—(D—5—t :mino-5-carboxyvaléramido)- 3~(hydroxyméthyl)-7-néthoxy~3~cét;hem~4--c:~.r boxylique Etape A : Ester de dibenzyle de l'acide 7p-(D-5-pbtaloyl- amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbanoyloxyméthyl)- 7~méthoxy-3-oéahem-4-crnr"boxylici:ie Une solution d'acide 7(3-(D~5-phtaloylaminû-5-carboxy-valéramido)-3- ( carbamoyloxyméthyl ) -7 -né thoxy-5-céphen-4—carbo-xyliaue (0,653 mg) (Exemple 14» étape A) dans du méthanol est traitée par un léger excès de phényldiazoraéthane fraîchement préparé. Après abandon pendant toute une nuit à la température ambiante, la solution est évaporée pour donner 1,053 g de résidu identifié comme l'ester de dibenzyle de l'acide 7 j3-(D-5~phtaloylamino~5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxy-méthyl)-7-»éthoxy-3~céphem-4-carboxylique. Etane B : Ester de dibenzyle de l'acide 7j3-(D-5-phtaloylamino-5-carb oxyvaléramido)-3-(hydroxyméthyl)-7-m éthoxy- 3-céphem-4-carboxyrli"ue L'ester de dibenzyle d'acide 73-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyva léramid o ) -3- ( carbamoyloxyrné thyl) -7-mé thoxy-3-céphen-4-carboxylique (0,5 g) obtenu dans l'étape A est dis-sous dans du dioxane purifié (5 cm ) contenant 1 ,5 équivalent de pyridine. On ajoute une solution de chlorure.de nitrosyle (1 ,3 équivalent) dans du chlorure de méthylène et on agite la solution dr:ns un bain de glace pendant une heure • Le pro BAD ORIGINAL 71 08668 131 2085702 Etape C ï Sel disodique de l'acide 7 (S- (D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido ) -3- (hydroxyiaé thyl ) -7-méthoxy—3- céphem-4-carboxylique Une solution de 10 io de palladium (0,5 g) sur carbone 5 est ajoutée, en même temps que 0,5 cmJ d'acide acétique glacial, à l'ester de dibenzyle d'acide 7P-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(hydroxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu dans l'Etape B. Le mélange est hydrogéné sous une pression de 2,81 kg/cm tandis qu'on agite pendant 10 deux heures ; le catalyseur est éliminé par filtration à travers de la terre d'infusoires et le solvant est éliminé par concentration sous vide. Le résidu est dissous dans du chlorure de méthylène et 'la solution est traitée par extraction par une solution à 5 "f° de bicarbonate de sodium. Le mélange résultant est 15 ensuite acidifié au pH 2 à l'aide d'acide sulfurique et traité par extraction à l'acétate d'éthyle. Après séchage, l'extrait est concentré sous vide pour donner un résidu identifié comme le sel disodique d'acide 7j3-(D-5-phtaloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(hydroxyméthyl)-7-Ktéthoxy-3-cépheni-4-carboxylique. 20 Etape D : Sel disodique de l'acide 7B-(D-5-amino-5-carboxyvalérami-do)-3-(hydroxyméthyl)-7~méthoxy-3-cépheni-4-oarboxylioue Le sel disodique d'acide 7P-(D-5-ph.taloylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(hydroxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique obtenu dans l'Etape E est dissous dans l'eau. 25 On ajoute ensuite un équivalent d'hydrate d'hydrazine et le mélange est abandonné à lui-même à la température ambiante pendant toute une nuit, la solution aqueuse est traitée par extraction à l'acétate d'éthyle avant lyophilisation pour donner le sel disodique d'acide 7{3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)~3-30 (hydroxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. Exemple 75 Purification ï sel monosodique de l'acide 7|3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-céphein- . 4-carboxylique 35 Le sel monosodique d'acide 7'3-(D-5-amino-5-carboxy- valéramido)-3-(carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy~3-céphem-4-carboxylique (1,0 g) préparé selon l'exemple 12 est dissous dans 20 cm3 de n-butanol aqueux à 1 ?! et chromâtographié sur ■5 une colonne contenant 2 530 cm de Sephadex G--10, un gel 71 08668 132 2085702 de dextrane modifié sous la forme de perles. La colonne est *5 développée avec du n-butanol aqueux à 1 f» à raison de 10 cm 3 par minute et des fractions de 10,5 cm sont recueillies automatiquement, l'effluent est contrôlé avec un réfracto-5 mètre enregistreur et les fractions sont soumises à des essais biologiques, la bio-activité apparaît dans les fractions 99 à 122 et ces fractions sont combinées et concentrées à sec pour donner 670 mg de produit contenant principalement le sel monos odique d ' acide 7 (à- (D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3-10 (carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. la colonne est ensuite étalonnée par chromatographie s ur un mélange de Blue Dextran 2000 et de chlorure de sod.lv. •.= dans des conditions identiques, le ELue Dextran 2000 est dct-o-té dans les fractions 85 à 93 et le chlorure de sodium est 15 détecté dans les fractions 140 à 155, ce qui indique que le produit bio-actif peut être séparé des impuretés de cette nature. Exemple 76 Acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-méthyl-7-métho3y-20 3-céphem-4-carboxylique - Un catalyseur à 10 $ de palladium sur charbon est mis % en suspension dans de l'eau (80 cnr) et traité à l'hydrogène, le catalyseur est ensuite séparé par filtration et mis de 7 nouveau en suspension dans l'eau (50 cnr), et à ce mélange 25 (2,67 g) on ajoute le sel de sodium de 842A (1,0 g) dans de 7 lreau (10 cm ). le mélange résultant est secoué pendant 24 heures à la température ambiante. le catalyseur est séparé par filtration et lavé une fois à l'eau (50 cm ). l'eau de lavage et lé filtrat combinés 30 sont ensuite concentrés à sec pour donner un rendement de 52,8 °/o en acide 7f^(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)~3-méthyl-7-méthoxy-3-cé'phem-4-carboxylique (528 mg). 1'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-méthyl-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ainsi obtenu est comparé 35 à la matière de départ par chromatographie sur couche mince. On utilise des plaques de gel de silice, avec la phase supérieure constituée de 4 parties d'alcool n-butylique, 1 partie d'acide acétique et 4 parties d'eau, le produit d'hydrogéno- 71 0866d 2085702 35 ly>-c présent matière do C et car flucr cli lof di o'i'''.L ot 1'•? 3-:-7éthjl-7~. Hesure c- doits t.'.c'Len av: e xzi d'hl'^ (il?) p3.uïr é-lovi- 'are la • 'T'r:. ! •. : or.•' .* • :: " 1- ninh.ydrj.v_e •-.•sccnoc à 3 'ultrr-viol^tc. le tableau ::.uivnrl: in-■"fôrenoas c.-bî'cryé os ontrr- 3.c roi de sodiwn de roéuit r.-yj do 7 g- ( >>~5 -r.:.:in e-. î -carbexyvvJ.ér:.'' nie. 0}-ét]HJxy-3-o-'i>hei::—4~cr- rboz;rl:'.n un. Gel de sodium de P42A Acide 7 *-— (' —3—aaino—5 —av.rboxy— val é rar:id o ) -3-né thyl-7 -lié thoxy- i-r-.-'-p'! e- •-rbonylicue 10 20 Bio-activi- 5 |Ac/cn-; doraient té . une zone do 25nm contre Yibrio percc3.ans L.3-1 272 Ghronatogra- Rf 0,1 ninhydrine phie sur (positif) couche nince Ultra-violet env. 15 |Ag/ (négatif) tache Ultra-violet À naxinun 266 nm E1^ 142 1 cm Inactif à ?0 ^Lg/cra^ (moins 7' d'activité initiale) Rf 0,25 ninhydrine. (positif) u3.tra-violet (positif) Rf 0,35 ninhydrine (positif) ultra-violet (négatif) À maximum 265 nm jj] /0 1 i cm 00 25 30 Exemple 77 S-/[~7p~0)-5-anino-5-carboxyvaléranido)-4-carboxy~7-:n-éthoxy~ 3-coT>»ier:-3-:,'l-nét»h:'l 7thio-nronina On chauffe de l'Antibiotique 842A (1G0 mg) pendant 8 minutes avec de la thio-urée (26 ng) à 95°C dans une solution de tampon phosphate 0,5 K (5 cm'5 ; obtenue en ajoutant 3,5 g de phosphate diacide de sodiun et 3,4 g de phosphate disodicue 3 dans 100 cm d'eau, avec ensuite addition d'assez d'acide chlorhydrique pour porter le pH à 5). 'électrophorèse de la solution au pH 7 montre que le dérivé de thio-uronium est une entité non raobile tandis que le G42A a un Rf de 0,2 environ, le înélcsige est purifié par absorption sur une résine échangeuse de cations polystyrène-acide sulfonique nuel''.-.ire sur le cycle hydrogène (Do~~ex 50) pour élimination du tampon v-fcos-phate. On effectue 1'élution en utilisant une solution 0,1*7 de pyridine. le pH est réalé à 8 " 3.'aide d'hydroxyde de sodiun 11: et évaporé sous vide pour élimination de la pyridine rési- ra,d orîg'nâî, 71 0866d 2085702 ûucllo, L:'. lyophi Ij sation donne u^e poudre couleur de 'tvn identii o comm? '''lent du o-/_ 7;'î--(a--3-'^mino-3--C"Lm:-c:;yvâ3 ér-mi- do)-4~e' :,/uoxy-7--nïétho:'y-3-a'phem~/;~yl~méthylJ7"La;Lo-uronia: i. do produit c f; "t caractérisé par les résultats suivants : 5 Chromatographie mi?' couoro -mmee : cci/duit'? sur dos plaques do celJ.aloso dans "U.Ï1 O Xvant neétonitrilo aqueux à 25 la valeur de Ilf pour ce produit est de 0,15 j le Rf pour le sel disodique de Ci2A est do 0,3o Ultra-vl olo t : le maxir.nuri pour À est de 263 mp. ; le 10 coefficient d'extinction moléculaire est de 570C environ (théoriaue ï 80CG) ; à 1'infra-rouge dans le nujol, on trouve —1 1780 cm , ce qui indique la présence d.'un noyau de 6-lactame; également, le produit donne un résultat positif à l'essai à la ninhydrine, indiquant la présence d'une chaîne latérale 15 ic-aminoa? ipoyle. E le c t ro phoro s e : l'introduction d'une charge positive dans le produit est confirmée par 1'électrophorèse à 1000 volts en utilisant un tampon phosphate 0,05 II au pH 7 ; le Rf pour le prodxiit est de 0,01 ; le Rf pour le sel disodique de S42A 20 est de 0,4» Essai biologique : les dimensions des zones autour des disques dans le tableau suivant sont exprimées en ram pour des concentrations égales d'antibiotique. Organisme Sel disodique 3-/~7S-(S-5-amino~5-carboxyvaXé- 25 de 842A ramido)-3-carboxy-7-méthoxy-3- (100 f/c:a^) céphe;a-3— yl-raéthyl_7-thio~ uronium (1 C0 Y/c-y^) Vibrio percolans B 1272 y 35 27 30 Salmonella gallinarum i-xB-1207 27 23 Pseudomonas stutzeri i;B~1231 22 22 .• .rot eus 35 vulgaris i 3-838 27 17 Erourplo- 7 P. Acide 73-(l>-5-^miriO~5-carboxyvalérai;ixdo)~3-(4-méthylthiazoX-P. —y In: e r c t o. thyl ) —7 —' '' th oxy—cé^hc:~~4—carbor-ryl io.u-e : -Au UfL iJii J Wl 71 08668 135 2085702 Etape A ï Acide 7P- (D-5-H-tert-butoxycarbonylamino-îj-carboxyvalé-ramido ) -3- ( carbamoyloxyrnéthyl ) -7 -mé t hoxy-3 -céphem-4~ carboxylique Le sel disodique de 842A (1,0 g) est dissous dans une *3T 5 solution à 5 i= de phosphate dibasique de potassium (31 ,6 cm ) et on ajoute de l'acétone (20,8 cnr3) en agitant. Le pH de la solution est ensuite réglé entre 9,5 et 9,6 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on ajoute du tert-butoxycarbonylazothydrure •z (1,0 cm ) en agitant. On continue l'agitation pendant 4 à 6 10 heures à la température ambiante tout en maintenant le pH entre 9,0 et 9,6 par addition d'hydroxyde de sodium. Le mélange de réaction est ensuite agité pendant toute une nuit, le pH tombant à 8,5 au bout de ce tamps. On règle de nouveau le pH à 9f6 à l'aide d'hydroxyde de sodium et on continue l'agitation 15 pendant trois heures supplémentaires tout en maintenant le pH entre 9,0 et 9,6. Le mélange résultant est ensuite traité par extraction par un demi-volume d'acétate d'éthyle et on se débarrasse de l'extrait. On ajoute un demi-volume d'acétate d'éthyle et on 20 règle à 2,5 le pH de la couche aqueuse à l'aide d'acide chlorhydrique concentré dans un bain de glace pour maintenir la température au-dessous de 5°C. Après séparation de l'acétate d'éthyle, la solution aqueuse est traitée encore deux fois par extraction par des demi-volumes d'acétate d'éthyle au pH 25 2,5. D'après des mesures à l'ultra-violet, 50 f de l'absorbant d'ultra-violet de départ se trouve dans les extraits et 22 i° dans la phase aqueuse usée. Les extraits sont combinés et concentrés à sec pour donner 645 mg d'acide 7(3-(D-5-N-tert-butoxycarbonylaiaino-5-carboxyvaléraniido ) -3- ( carbamoyloxyrné thyl ) -30 7-niéthoxy-3-céphem-4-carboxylique ayant un dixième de la puissance biologique de la matière de départ. On effectue des chromatographies sur couche mince en utilisant des plaques de gel de silice G-.î1. d'Analtech et comme phase supérieure un système 4s1:4 de n-butanol, acide 35 acétique et eau. Le produit a un Rf de 0,54 par détection à l'ultra-violet et est négatif à la ninhydrine. La matière de départ a un RF de 0,1 et est positive à l'ultra-violet et à la ninhydrine. 71 08668 136 2085702 On élimine le groupe protecteur tert-butoxycarbonyle d'un échantillon de 10 mg de l'acide 7f3-(D-5~F-tert-butoxy-carbonylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyrnéthyl)-7— mcthoxy-3-céphem-4-carboxylique en dissolvant la matière dans •z 5 de l'acide trifluoroacétique (0,2 cnr) et en abandonnant la solution à,elle-même à la température ambiante pendant 5 minutes, la solution est ensuite concentrée à sec à la température ambiante, la chromatographie sur. couche mince comme décrit précédemment donne une tache pour ce produit avec un 10 Rf de 0,1 qui est positive à l'ultra-violet et à la ninhydrine. » Etape B ï Acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(4- mé thylthiaz ol-2-ylmercapt omé thyl)-7-méthoxy-3-céphem- 4-carboxylique De l'acide 7P-(D-5-4T-tert-butoxycarbonylamino-5-15 carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (100 mg) dans 5 cm d'un tampon au pH 7 (une solution 0,5 M d'un mélange de 3,5 g de phosphate diacide de sodium, 3,4 g de phosphate disodique dans 100 om^ d'eau) contenant du 2-mercapto-4-méthylthiazole (50 mg) est chauffé 20 à 95°C pendant 8 minutes. On obtient ainsi de l'acide 7p-(D-5-N-tert-butoxycarbonylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(4-mëthylthiazol-2-ylmercaptométhyl)-7-méthoxy-3-cépheni-4-car-boxylique qui, par traitement par X'acide trifluoro-acétique (0,2 cm^), donne de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléra-2 5 mido)-3-(4-méthylthiaz ol-2-ylmèrcapt ométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 0e produit est caractérisé par les résultats suivants : Chromatographie sur couche mince : conduite sur des plaques de cellulose dans un solvant aoHonitrile aqueux à 30 25 tfo ; la valeur de Rf pour ce produit s^t de 0,6 ; le Rf pour le sel disodique de 842A est de 0,3. Ultra-violet : le maximum pour A est de 269 ; le coefficient d'extinction moléculaire est de 2000 environ (théorique : 8000) j à 1'infra-rouge dans le nujol, on trouve 35 1780 cm""^, ce qui indique la présence d'un noyau de P-lactame également, le produit donne un résultat positif à l'essai à la ninhydrine, indiquant la présence d'une chaîne latérale oc-aminoadipoyle. 71 08663 1 37 2085702 .Crr^i : ï.e-3 di-?.e:n3io:..-3 dot- zona?; rr'-to'or d"C".' die-:.tu :: 0 \ns ) CxY"-V.ir;:ie ;>el disodique AciûG 7 (!*"!>-anino—l:-c'-Tbo.:j- de C42A valéra:'iiùc)--3—(4-méth7lth:v-'2oX-2-(1G0 Y/cri?). yl-\:er capt o--•.•.*• thyl ) -7- r é tho:~~3- Or ch.R?i- oxy3.iqug (1 00 y/c Xseudo^onas stutzeri i„3-1231 22 13,5 Escherichia coli J-IIB-60 18 14 Yibrio percolons MB-1272 23 20 TÎXO: TOlo 7 9 Acide 7g-(D-5-anîino-5-carhoxyvaléxT.:T.ido)-3-(1,3,4-thiadiaaol- 2-ylmerc En substituant le 2-mercapto-1 ,3,4-thiadiazole au 2-mercapto-4-aéthylthiazole de l'exemple 78, étape S, et en suivant par ailleurs le mode opératoire décrit, on obtient 1 ' acide 7 P- ( D-5 -amino-5- carboxyvaléramido ) -3- ( 1 , 3,4-thiadis -zol-2 -ylîiercapt or.é thyl ) -7 -méthoxy-3-cépheni-4-carboxylicue. Exemple 80 Acide 7p-(D-5-amino-5-carbox3rvaléraîaido)-3-(thiocyans>tonéthyl)- 7-!nctho::y-?-c'phen-4-carboxyliovie On ajoute de l'Antibiotique S42A (100 ng) à une solution 'X 0,5 K de tampon phosphate (5 cnr) constituée dé 3,5 g de phosphate diacide de sodium et de 3,4 g de phosphate disodique dans 100 cm d'eau et le pH du mélange est porté à 5 par addition d'acide chlorhydrique• 0n ajoute du thiocyanate de sodium (20 mg) et le mélange est chauffé à 95°0 pendant 8 minutes 0 0n obtiexit ainsi de l'acide 7S-(B-5-apiin<>-5-carboxy-valerawid o ) -3- ( thiocyanatomé thyl ) -7 -mé thoxy-3~céphem-4-ca:cho:ry lique. Exemple 81 Acide 73- (B-5-aRino-5-carbo:^Traléranido) -3-( chlorocicthyl)-7-Héthor.y-3-cô^h -o?ylioue BAD OBK51HA1- 71 08668 1 38 2085702 ;'t;q k : ïïc-tf-j- de dibonshydrvlo de l'acide 7'3-('>)-5-N'-tert- bu toxycarbonyJ,-' nino-5-c-- -.vooxyvalé?"- miù o ) -3-( carbamoyl- ox'ri-1 é•!;'' ,r3.)—'7— mé +.hv—c*oîton—4—C-"rbo"Tlifug A une violation d'acide 7L5-(î)-5-jT-tert-bivcoxyenrbonyl-amino~5~carboxyvalérTmidc) -3-( earbamoyloxyué tir,-"1) -7 --méthoxy-3-céphe: :—4-eaid)o::ylique (1 5,0 g) dans l'acétate cl1 éthyle (500 c:P) t on ajoute du diphonyldia.iiométhane (5,5 g) dans 70 crP d'éther. le mé lance est chauffé à 40°0 tandis qu'on l'agite et il est ensuite traité après 30 minutes à l'aide de diphénylcîiazométliane supplémentaire (5,5 g) dans de l'éther (70 cra^1). Après trois heures, le solvant est éliminé sous vide et remplacé par un mélange de méthanol (500 cm"') et d'eau (20 en'). La solution méthanolique aqueuse est traitée par extraction quatre fois à l'hexane et ensuite évaporée sous vide. Le résidu est dissous dans de l'acétate d'éthyle, séché sur du sulfate de sodium et évaporé sous vide pour donner l'ester de dibenzhydryle d'acide 7P-(D-5-IT-tert-butoxycarbonyl-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-cépheri-4-ca.rboxylique. Etape B : Ester de dibenzhydryle de l'acide 73-(D-5-lï~tert- butoxycarbony3,araino-5-carboxyvaléramido)-3-(chloro- mé thyl, ) -7 -métho:c/-5-céphe'i-4-carboxyllcue L'ester de diben;;hydry3.e d'acide 73-(B-5-K-tert-butoxycarbony3-amino-5-carbox;rval^ramido)-3-(ca.rbanioy3.oxy- méthj'l)-7-méthox.y~3-céphen>-4-carboxylique (1 mmole) est dissou.s dans du chlorure de méthylène (5 cm"5) et le mélange est refroidi à 0°G. On ajoute de 3.a collidine (1 mmole) et ensuite on ajoute goutte à goutte une solution de penta-chlorure de phosphore (0,6 mmole) dans du chlorure de méthylène (5 cyùJ). Le mélange est ensuite agité pendant une heure- dans un bain de glace à 0°C et la, solution résultante est traitée par extraction au bicarbonate de sodium, à l'acide chlorhy-drique dilué et à l'aide d'une so3_ution saturée de chlorure de sodium. Le mélange est évaporé à sec et ensuite isolé par chromatogi-aphie sur une colonne de gel de silice refroidie, en utilisant du chloroforme comme rluant. Le produit ainsi obtenu est 3.'ester de dibenzhydryle de l'acide 73-(D-5-ïï-tert-butoxycarbonylaraino-5-carboxyvaléramic o)-3-(chloro- BAD ORIGINAL 71 08668 139 2085702 méthyl)-7-niéthoxy-3-céphem-4-carboxylique. Etape G î Sel d'acide trifluoro-acétique de l'acide 7{3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(chlorométhyl)-7- méthoxy-3-cé-phem-4-carboxyllque 5 Une solution de l'ester de dibenzhydryle d'acide 7j3- (D-5-N-tert-butoxycarbonylamino-5-carboxyvaléramido)-3-(chloro-méthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique (1 mmole) dans de l'anisole (13 cm^) est versée dans 6,5 cm^ d'acide trifluoro-acétique froid (0°C) tandis qu'on agite. Après 5 mi-10 nutes, la solution est versée, tandis qu'on agite, dans une solution d'éther (1800 cm^) maintenue à 0°C. I»e précipité solide qui en résulte est ensuite recueilli et séché pour donner, du trifluoro-acétate d'acide 7 P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(chlorométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 15 Les composés nouveaux de la présente invention ont été décrits comme ayant le radical 5-amino-5-carboxyvaléramido dans la configuration p par rapport au noyau céphem. Bien que ce soit basé sur des informations couramment disponibles, et supposé correct, la demanderesse ne désire pas être limitée 20 par cette désignation de configuration spatiale dans le cas où des informations ultérieures prouveraient qu'elle est incorrecte. les organismes suivants dont il est question dans la présente description sont en dépôt dans la collection de cultures de 1'American Type Culture Collection, où ils sont dispo-25 nibles sous les désignations ATCC suivantes : Escherichia coli W-MB-60 ATCC 9637 Proteus vulgaris MB-838 ATCC 21100 Alcaligenes faecalis MB ATCC 212 Alcaligenes viscosus MB-12 ATCC 337 30 Vibrio percolans MB-1272 ATCC 8461 Bacillus subtilis MB-964 ATCC 6'633 Egalement, dans la présente description, plusieurs des matières utilisées sont désignées par le nom commercial. Ces matières ont la composition suivante et peuvent être trouvées 35 chez les fournisseurs suivants : Amber Yeast N° 300 : fraction de levure à bière auto-lysée ; Amber Laboratories, Jumeau, ï/isconsin. 71 08668 140 2085702 Mobil par-S : additif anti-mousse à base d'huile (composition inconnue) ; Mobil Oil Company, 150 E. 42ème Hue, New York. Polyglycol 2000 : additif anti-mousse ; polymère 5 polypropylène-glycol ayant une masse moléculaire moyenne de 2000 j Dow Chemical Company, Midland, Michigan, Biogel P-2 ï milieu de filtration gel ; un polyacryl-amide sphérique réticulé avec du méthylène-bis-acrylamide ; Bio-rad Laboratories, Richmond, Californie. 10 Dowex 50 : résine échangeuse de cations polystyrène- acide sulfonique nucléaire ; Dow Chemical Company, Midland, Michigan. Plaques G .-F. d'Analtech : gel de silice avec liant sulfate de calcium e.t un indicateur fluorescent, 250 microns 15 d'épaisseur j Analtech Inc., T00 South Justison Street, Wilmington, Delaware, 19801. 71 08663 U1 2085702 iî ,7j j " c: i o trn acide 73-(à-;5~ ::adno~\-C' -'fco:::" ;lérar'ïiôo)-a-révhoxy~:>"C-''~hf-:::~4-;r-ruo:.'yl3a uo r-uboiiitui dans la position 3 pur im croup o ::;c'thyle, halogérora-thyle, hydro;-^ ■••• othyle, 5 eylozy-éthyle, cari5.-.noylo::y -'thyle, c:.rn-c,oyio-"y;'éthyle l.~-Siicatitu' ou lT/r-àir>ubstiirc.é, alcoylthio/ùéthylo, tLionotî.-yle bétérocyclique, tri-alcoylarprAvrâminéthyle, pyriôinitiant thyle, pyridini--.a;-iéthyle eubstitud an noyau, tliic-uroniu..-clthyle, aridinotbicaéthyle dans lequel les deux t.toises d'azote pewent 10 étro cùbstitriés par là; ardicauz alcoyle, aninctbxocarbcryl-thionéthyle, e^inothiocarbQnyltMOiaéthyle 17-substitué, aroyl-thioniéthyle, diverses portions oxythiocarbonyltMo^cthyle, alcarylsulf or_ylnisthylo, azidomothyle, aninoaéthyle, amido-ractlxyle, polyhydrox:/benzyle, IT-alcoyl inférieur~indol~3~ 15 ylraéthyle ou thiooyanatoraéthyle. 20 Un composé de formule ï 0 H HOOC-GH- ( GEL ) ^-0171 mi2 ^ IT CH2R COOH dans laquelle R est de l'hydrogène, un halogène ou un groupe hydroxy, alcanoyloxy inférieur, aromatique-carbonylozy, hé t e r o cy cl i que - carfc ony1 oxy, aralcanoyloxy, cycloalcane- 20 carbonyloxy, a-méthoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy, «-raéthoxy- p-hydroxyeinna-nojéLoxy ; un radical carbanoyloxy de la 12 12 formule î -00CKR R où R et R représentent de l'hydrogène, ma groupe alcoyle inférieur, halogéno-alooyle inférieur, (alcoxy inférieur)carbonyle, aryle, alcarylsulfonyle, benz-25 hydryle ou, pris en rvi&ae temps que l'atome d'azote sur lequel ils sont fixés, un hétérocycle choisi parmi les groupes pyirrolidinyle, pipéridino et norpholino ; un radical thio ' ^ *Z ' de formule -SR-3 dans laquel3.e R""1 est tin groupe alcoyle inférieur ou. un hétérocycle choisi parai les groupes pyridyle, thiazolyle alcoylé, 1 ,j5,4-thiadiazol-2-yle, 1 ,3,4-thiadiazol-30 2-yle alcoj'lé, 2-benzothiasolyle et 4-alcoyl inférieur- bad original 71 0866d 142 2085702 ])jrridi:'iind.ia-2-yle ; tri (alcoyl inférieur )anr.ciiu-radical Wj-riûiniu'n do foruule : ; un 10 dans laquelle est de l'hydrogène, un halogène ou un grour t ri fluoroaé thyle, cyano, oartorry, oarbaiaoyle, .i-T-alcoyl inf érieur-carbanoyle, I.r,IT-di-alcoyl inf é rieur-carbaraoyle, carboxynéthyle, alcanoyle inférieur, alcoyle inférieur, hydroxy iéthyle ou sulfo ; thic-uroniua ; un radical amidino-thio de fornule : .4 dans laquelle R , alcoyle inférieur formule : 3—C R5 et R6 lïR' 1TE5R6 15 sont de l'hydrogène ou un groupe un radical aminothiocarbonylthio de S " 7 8 -S CER R 7 8 dans laquelle R et R représentent de l'hydrogène, un groupe alcoyle inférieur, hydroxy-alcoyle inférieur, di-(alcoyl inférieur)-amino-alcoyj.e inférieur, norpholino-alcoyle inférieur, IT-aryl-iï-alcoyl inférieur-arninoalcoyle ou, pris en même temps que l'atome d'azote sur lequel ils - sont fixés, un hétérocycle choisi parmi les groupes raorph.ol.ino, pipéridino, pyrrolidinyle ou un radical piperazino de formule : w o ÎT-R dans laquelle R-' est un groupe alcoyle inférieur ou phényle 20 aroylthio ; un radical oxythio eai-bcnyl thio de formule : o II -S COR 10 BAD ORIG.'NAL 7108668 143 2085702 dans laquelle r'® est un groupe alcoyle inférieur ou cycloalcoyle inférieur ; alcarylsulfonyle ; azido ; amino ou un radical amido de formule : -NHR11 5 dans laquelle r'est un groupe alcanoyle inférieur ou aralca-noyle ; polyhydroxyphényle ; N-alcoyl inf érieur-indol-3-yle ou thiocyanate ; et les sels, esters et amides non toxiques pharmacologiquement acceptables, monoalcoylamides, dialcoyl-amides, aralcoylamides et dérivés amides hétérocycliques con-10 tenant de l'azote de ce composé. 3. Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un groupe alcanoyloxy inférieur, aromatique-carbonyloxy, 4-pyridylcarbonyloxy, aralcanoyloxy, cyclopentane-carbonyloxy, cyclohexanecarbonyloxy, cc-méthoxy-p-sulfooxy-15 cinnamoyloxy ou oc-méthoxy-p-hydroxy cinnamoyloxy. 4» Un composé selon la revendication 2, caractérisé 1 2 en ce que R est un radical carbamoyloxy de formule -00CNR R 1 2 dans laquelle R et R sont des radicaux identiques ou différents, choisis parmi l'hydrogène et les groupes alcoyle 20 inférieurs, halogéno-alcoyle inférieurs, (alcoxy inférieur)-carbonyle, phényle, p-tolylsulfonyle, benzhydryle ou, pris en même temps que l'atome d'azote sur lequel ils sont fixés, un hétérocycle choisi parmi les groupes pyrrolidinyle, pipéridino ou morpholino. 25 5« Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un radical de formule : dans laquelle X^ est de l'hydrogène, un halogène ou un groupe trifluorométhyle, cyano, carboxy, carbamoyle, N-(alcoyl inférieur)-carbamoyle, N,N-di-(alcoyl inférieur)-carbamoyle, 30 carboxyméthyle, alcanoyle inférieur, alcoyle inférieur, hyâroxyméthyle ou sulfo. 6. Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un radical de formule ï 71 08668 144 2085702 -s-c NR4 *NR5R6 A f" C dans laquelle R, R et R sont de l'hydrogène ou des groupes alcoyles inférieurs. 7. Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est un radical de formule : S Il 7 o" -SCNR'R 7 fl 10 dans laquelle R' et R représentent de l'hydrogène, un radical alcoyle inférieur, hydroxy-alcoyle inférieur, di-alcoyl inf érieur-amin oalc oyle, N-phényl-N-alcoyl inf é rieur-ami.no-alcoyle ou, pris en môme temps que l'atome d'azote sur lëquel ils sont fixés, un hétérocycle choisi parmi les groupes mor-15 pholino, pipéridino, pyrrolitlinyle, ou un radical pipérazino de formule î r~\ 9 -N N-Ry w g dans laquelle R est un groupe alcoyle inférieur ou phényle. 8. Un composé selon la revendication 2,de formule : 0 Il \ .S H00C-CH-(CHg )3-C-NE *82 J ^-ch2r COOH dans laquelle R est un groupe hydroxy, alcanoyloxy inférieur, 20 carbamoyloxy ou N,N-di-alcoyl inférieur-carbamoyloxy } et les sels, estérs et dérivés amides de ce composé. 9. Un composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R est un groupe carbamoyloxy et les sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux de ce composé. 25 10. Le sel monosodique du composé de la revendication 9. 11. Un composé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R est un groupe iT,N-diméthylcarbamoyloxy. 71 08668 us 2085702 120 Un co-rpoc' selon !'• rc-vonrxict!tion '?■, eax*~atérisé en ce qu:; R est un grcap- hydroxy0 1;î. Tin -.-t'lange •nitinioti':--.-' obtenu en cultivant dans tin ;.'.il'~ c i nutritv? '.^iucx: dans '"or: "C-::ài"î:ioa" aérobies, uns nouvelle r Of che c.c- t re t1; cci"rco. s jiVuCvr*evrr* f i rTbri ' ■J" : ■?-« ■?tre : •• •■»--.»»««s h.* "Lrtedii , Btreoto yees yoa-al, ^tree"ay^ce?-: ci: ou Stra'Tfcor'rceg cb-:-vi:.y:\: vis. 1 4. lin né lange antibiotique co&^rcniant de 3. * acide 7 8- (D-5-a:,iino-5-ca id^oxyvalérar-ido ) -;;~(K-né thoxy-p-sulfcxy-cinna? ;oyloxyr.éthyl)~7-tfétb.oxy-3-c::p]ve::i-4-carbo:rylique et de 1 ' acide 7 p- ( ^-5-araino~5-earl oxyval érar! 15 o )(c:~né thoxv-p—hydroxy cinnar.ioy!oxyrié thyl ) -7—Mé th oxy-3-cép!.eni~4-c;arboxylique. 15. Un composé selon la revendication 2, de formule : 0 CGIi ii i s HOOC-GH- (OlLj ) 3-G-mî-~C ^ HHg o ^-^2oo-c=o: COOH 1 2 dans laquelle R est tin groupe hydroxy ou sulfoxy ; et les sels, esters et dérives amides non toxiques, pharoacologique- rnent acceptables de ce corrposé. 16. Un produit selon la revendication 15, caractérisé 1 2 en ce que R est im groupe sulfoxy et les sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux de ce composé. 17o Un produit selon la revendication 15, caracté-12 risé en ce que R est un groupe hydroxy et les sels de tiétaux alcalins et de métaux alcalino-terreux de ce composé. 18. le sel de sodium du composé de la revendication 16, 19o Une composition pharraacetitique conprenant de 15 à 700 n:g d'un composé selon la. revendication 2„ 20. Une composition pharmaceutique comprenant de 15 à 700 ng environ d'acide 73-(£-5-an;:Lr.o-5-cartoxyvaléranido)-7-Eiétho;-ry-J-céphor.-4-carbo:-2*liquo substitué dons la position 3 par un groupe hyàx-oxynéthyle, alcanoj-le inférieur-oxynéthyle, carbanoyloxynéthyle ou ïT, îl-di-alcoylo infcric-ur-carbarioyl- bad original 71 08668 2085702 oxyinctïiyle j et lot! sels, estera et dérivés amides âe co composé f et un véhicule plrirnaecutiquevent acccotable. 21. Une composition. pbaï'.-nacfcutique ce. ;prenant oc 11 acide 7 c- ( D-5 -a^ino-5 - car b oxy va 1 é randd o ) - j- ( c 1 rbamoyloxyué - 5 thyl)-7-méthoxy-3-oéphe:r.~4-cerboxylicmG ou un sel de cet aoi.'Je 3 à une concentration d'au moins 1 à 2 roicrogrammeo par cm conne déterminé par titrage par disques sur plaques avec Vibrio percolans ; et un véhicule pharmaceutiqucmeni" acceptable. 22. Une eonposition pharmaceutique comprenant de 15 10 à 700 mg environ d'acide 7(D-5-atnino-5-carboxyvaléraiaido)- 3~(a-iactho::ry~p-sixlfoo:xycinnamoyloxy!nc-thyl)-7~iacth.oxy-3~céphe2i~ 4-carboxylique, d ' acide 7 3- ( h-5-arninc~5-carboxy/aléramido ) -3~ (o:-métho>:y-p~hydroxy cinnairxyloxymé thyl ) -7 -méthoxy-3-céph em-4-carboxylique ou d1 un mélange de ces acides ou d'un sel, ester 15 ou dérivé ataide de ces amides ; et un véhicule pharmaceutique-ment acceptable. 23. Une composition pharmaceutique compx,enant de 1 ' acide 73- (h-5-amino-5-carboxyvaléramido )-3- (cc-métiioxy-p-sulfooxycinnamoyloxy;.! éthyl)-7-né thoxy-3-c éphe m-4-carboxylique 20 ou un sel de cet acide à une concentration d'au vaoins 2 à 4 microgramra.es par cm comme détermine au titrage par disques sur plaques avec Proteus vulgaris ; et un véhicule pharmaoeu-tiqueiaent acceptable. 24. Un procédé de production d'un acide 73-0-D-5-25 amino-5-carboxyvaléramido)-7~niéthoxy-3-copheni-4-carboxyliqiie, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies, un micro-organisme capable d'élaboré!1 un acide 7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 25. Un procédé selon la revendication 24, pour pré-30 parer l'acide 76-(D-5-aaino-5-carbo:-:;,!valéramido)-3-(carbamoyloxyrné thyl) -7-niothoxy~3~céphera-4-carboxyXique, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif r.-quetix dans des conditions aérobies un nouvel actinomycète capable de produire le produ.it désiré. 35 26. Un procédé selon la, revendication 25, caractérisé en ce que l'actinomycète est Streptomycer-; lac t'amd u r ans o 27. Un procédé selon La revendication 25, caractérisé en ce que lo milieu nutritif aqueux contient de 1 g 6 ç,'> en poids BAD ORIGINAL 71 08668 ht 2085702 d'hydrate de carbone et de 0,2 fi> à 6 $ en poids environ d'azote disponible. 28. Un procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la fermentation est conduite à une température com- 5 prise entre 20 et 37 °C environ. 29. Un procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que le pH du milieu nutritif aqueux est compris entre 6,0 et 8,0 environ. 30. Un procédé de préparation d'un mélange d'acide 10 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido )-3-(oc-méthoxy-p-sulfoxy- cinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique et d'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(œ-méthoxy-p-hydroxycinnamoyloxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif aqueux 15 dans des conditions aérobies, un actinomycète capable de produire le produit désiré. 31. Un procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'actinomycète est une nouvelle souche de Streptomyces griseus. Streptomyces virldochromogenes. 20 Streptomyces fimbriatus. Streptomyces halstedii. Streptomyces rochei. Streptomyces cinnamonensis ou Streptomyces chartreusis « 32. Un procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'actinomycète est une nouvelle souche de Streptomyces griseus. 25 33. Un procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que le milieu nutritif aqueux contient de 1 à 6 fi environ en poids d'hydrate de carbone et de 0,2 k 6 fi environ en poids d'azote disponible. 34. Un procédé selon la revendication 30, caractéri-30 sé en ce que la fermentation est conduite à une température comprise entre 20 et 37°G environ. 35» Un procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que le pK du milieu nutritif aqueux est compris entre 5,5 et 8,0 environ. 35 36. Un procédé de préparation d'un sel d'acide 7 0- (D-5-ainino-5-carboxyvaléramiào ) -3- (hydroxyinéthyl) -7-raéthoxy— 3-cfephe"-A-4-earboxy]ique, caractérisé en ce qu'on traite un diester d'acide 73-(D-5-amino-5-carboxyvalcramidr>)-3- 71 08668 148 2085702 (carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-céphem~4-carboxylique dans lequel le groupe 5-amino a été bloqué, par un halogénure de nitrosyle pour former le diester correspondant d'acide 7(3-(D~5-a.mino-5 - car b oxyval c r amid o ) -3 - ( hydroxymé thyl ) -7 -mé thoxy-3-céphem-4-carboxylique, qui, lorsqu'il est soumis à une hydrogénation catalytique et à un traitement par un agent de déblocage, donne le produit désiré. 37. Un procédé pour la préparation d'un sel d'un composé de formule : hooc-gh- ( ch0 ) _-c-hh- l 23 îih2 COOH 1 C 4 g 10 dans laquelle R 3 et fi sont des groupes alcoyle inférieurs ou, pris en même temps que l'atome d'azote sur lequel ils sont fixés, un hétérocycle mononucléaire choisi parmi la pyrrolidine, la pipéridine et la morpholine, caractérisé en ce qu'on traite un diester d'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxy-15 valéramido)-3-(hydroxymétliyl)-7-méthoxy~3-céphem-4-carboxylique dans lequel le groupe 5-amino a été bloqué, par un halogénure de carbonyle et ensuite par une aminé primaire ou secondaire appropriée pour former le diester correspondant d'acide 7 P-(D-5~âmino-5-carboxyvaléramido)-3-(carbamoyloxyrné thyl)-7-20 méthoxy-3-céphem-4-carboxylique qui, par dé-estérification et traitement par un agent de déblocage, donne le produit désiré. 38. Un procédé pour la préparation d'un sel d'un composé de formule : 0 II hooc—ch-(chs)_-CMï—i 0 l * ■> n nhg ^ n v ^JI-ch20cnhr17 cooh 1 17 dans laquelle R ' est un groupe alcoyle inférieur, halogéno- 71 08668 2085702 !eo;-?-e 'inf' rioiir, (• c-o\y inférieur") c'-r-bcnylc ■ryle, aie--rT~:V:u '•."le OU 1 • >" *",1" ■ r c:. rir •' en c~ ru'0":; tr-vite un «;;»1 dibor:ic;ve ou un ù;l oî'ter d 'c.cide 7c--('' -• ■ : .\r. 5-cr-rl.orvv. ■'î" . i'.c)(hydro:.yvr' t}.;yl)~7-;-.ét h.o::y-'.'-co^Ler.-..;-5 carocrcyliqtio d'ins 1 oc uni le xrrvape 5-a'.ino a et'' bloou" , p?r 1 'isccysnate' -approprié, avae ensuit.:, d 59c Un procédé pour la préparation d'un sel d'un 10 conposé de formule : II0C0-CTI- ( GII.j ) CI7H • J " i n:-1 OGH- HIL ,18 0 "O 0 - OH C Cil .18 COOH dans laquelle II est un groupe alcoyle inférieur, aryle, un hétérocycle azoté mononucléaire, un groupe aralcoyle ou cycloalcoyle, caractérisé en ce qu'on traite un dierjter d ' acide 73- (D-5-aminc-5-car'boxy/aléranid.o) -3— (kyâro.^y.nétliyl ) -7-15 ]nétIiO}:y-5-céphem-4-carboxyliqtie dans lequel le gï'oupe 5-ar.iinc a été bloqué, par l'halogénure d'acyle approprié, avec ensuite dé~estérification du produit intermédiaire diester résultant et traitement par un agent de déblocage pour forner le produit dé s iré. 20 - 40. Un procédé pour la préparation d'un composé de fomiule : O OC h K00C-CH- ( CIL, ) 3-0iÏÏÏ na- COOH 20 dans laquelle R est un radical amidinothio de formule : BAD ORIGINAL 71 08668 150 2085702 "^ïïxi5a° 4 6 dnns loquelle R , S et R sont de 1 'hydrc»;;':ne ou an radier;] 5 alcoyle inférieur ; ur. -3 dan:' 3.aquelle il est un groupe alcoyle inférieur ou un hétéro-cycle choisi parmi les f •troupe s ' yyridyle, thiazolyle alcoyl1':, 1 ,3,4-thiadiasol~2-yle, 1 t3,4-thiadiazol-2-yle alcoylé, 2-ben.iiothia2o3.ylo ou 4-olcoyle inférieur-pyridinidin-2-yle ; 10 un radical, arninothiocarbonylthio de formai e : s " 7 8 -sœïr'r 1 O dans laquelle r et r sont de l'hydrogène, un groupe alcoyle inférieur, hydroxy-alcoyle inféi'ieur, di-slcoyl inferieur-15 anino-alcoyle inférieur, norpholino-alcoyle inférieur, lï-aryl-11-alcoyl inférieur-anino-alcôyle, ou, pris en môme temps que l'atome d'azote sur lequel ils eent fixés, un hétérocycle choisi parni les groupes iTiorpholino, pipéridino, pyrrolidinyle ou im radical pipérazino de formule : w 9 9 20 dans laquelle R est un groupe alcoyle inférieur ou phényle ; aroylthio ; un radical oxythiocarbonylthio de formule : S " 10 -S COR dans laquelle r'® est un groupe alcoyle inférieur ou cyclo-25 alcoyle inférieur ; alcarylsulfonyle ; azido ; polyhydroxy-phényle ; I\-alcoyl inférieur-indol-o-yle ; tri-alcoyl infér-ieur-am:;ioniu3 ou un radical pyridiniu-a de fomrale : A J V dans Laquelle x'' eet de l'h.ydrogène, un halogène ou. un groupe trif luororaétliyle, cye.no, carho:-?/, carbamoyle, ïT-uleoyie infé-rieur-carbamoyie, NfN-di-alcoyle .inférieur-carbanoyle, BAD Origine 71 08668 151 2085702 carboxyméthyle, alcanoyle inférieur, alcoyle inférieur, hydroxy-méthyle ou sulfo ; caractérisé en ce qu'on traite l'acide 7 P- (D-5-aiïiino-5-carboxyvaléramido ) -3- ( a cyl oxym é thyl ) -7-méthoxy— 3-céphem-4~carboxylique par la thio-urée, thio-urée ïï-subs-5 tituée, thio-urée ïï,ïï-disubstituée, le thiol, le dithiocarbamate, l'acide thiobenzoïque, le dithiocarboxylate, le sulfi-nate de métal alcalin, l'azothydrure, le polyhydroxybenzène, le ïï-alcoyl inférieur-indole, la tri-alcoyl inférieur-amine ou la pyridine appropriée. 10 41. Un procédé selon la revendication 39» caractérisé en ce que la matière de départ est un acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(alcanoyl inférieur-oxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-cephem-4-carboxylique. 42. Un procédé selon la revendication 39, caractérisé 15 en ce que la matière de départ est un acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(acétoxyméthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique. 43• Un procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que l'acide 7(3-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-20 (azidométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ainsi obtenu est réduit pour donner l'acide 7 j3- (D-5-amino-5-carboxy-valéramido)-3-(aminométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique correspondant. 44* Un procédé pour la préparation d'un composé de 25 formule : O ™ 11 HOOG-CH-(CH,),-GHH. I 3 HHg ^™ oh21ïhr1 1 COOH dans laquelle R* ^ est un groupe alcanoyle inférieur ou aral-canoyle, caractérisé en ce qu'on traite un acide 7p-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido ) -3- (aminométhyl ) -7 -mé thoxy-3-cé'phem-4-carboxylique par l'halogénure d'acyle approprié. 30 45« Un procédé pour la préparation de l'acide 7î3-(D-5-nmno-5-carboxyvaléramido)-3~méth;-". -7-méthoxy-3-céphem- 71 08668 152 2085702 4-carboxylique, qui comprend la réduction de l'acide 7(3-(D-5-araino-5-carboxyvalé ramido)-3-{carbamoyloxyrnéthyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique ou d'un sel de cet acide. 46. Un procédé pour la préparation d'un composé 5 de formule s COOH 21 dans laquelle R est un groupe thio—uronium, azido, thiazolyl-mercapto, thiadiazolylmercapto, 3-thiacyanate ou un radical de formule : -S-C ■ caractérisé en ce qu'on traite l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxy-10 valéramido ) -3- ( carbamoyloxyrné thyl ) -7 -mé thoxy—3-céphem-4- carboxylique par la thio-urée, un azothydrure de métal alcalin, le mercaptothiazole, le mercaptothiadiazole, un thiocyanate de métal alcalin, une thio-urée N-substituée ou une thio-urée ïï,N-disubstituée appropriée. 15 47. Un procédé pour la préparation de l'acide 7{3- (D-5-amino-5-carboxyvaléramido)—3-(aminométhyl)-7-niéth.oxy-3— céphem-4-carboxylique, caractérisé en ce qu'il comprend la réduction de l'acide 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaléramido)-3-(azidométhyl)-7-méthoxy-3-céphem-4-carboxylique.