La présente invention concerne la production d'acide 1-glutamique par fermentation microbienne d'un milieu contenant du méthanol comme principale source de carbone, des sources minérales ou organiques d'azote, des sels minéraux et 5 divers aliments mineurs nécessaires à la croissance des microorganismes duction de l'acide 1-glutamique par fermentation, mais à notre connaissance il n'en existe aucun permettant la production dudit 10 acide à partir du méthanol. Par conséquent, le demandeur a. étudié ce domaine inconnu, c'est-à-dire l'utilisation du méthanol ets sur une grande échelle, des cultures isolées de micro-organismes provenant de sources naturelles et capables de produire de l'acide 1-glutamique par assimilation du méthanol. 15 L'invention a pour objets : la production d'acide 1-glutamique à partir du méthanol qui peut être préparé par synthèse à bas prix sur une grande échelle, en quantité suffisante pour l'industrie; la production dudit acide avec un bon rendement sans se heurter à diverses difficultés concernant la fermentation 20 et le génie chimique susceptibles de se produire quand on utilise des constituants du pétrole tels que les paraffines normales. sies parmi des douzaines de micron-organismes, sur la base de leur aptitude à croître dans un milieu contenant du méthanol et de leur 25 aptitude à produire par culture de l'acide 1-glutamique, dans la terre, les eaux-vannes, le compost, les huiles et le pétrole, en les agitant à 30°C pendant 40h dans un milieu ayant la composition ci-après : On connaît un certain nombre dé procédés de pro- Les souches à utiliser dans l'invention sont choi- 30 Méthanol 2,C# 0,256 0,7/S 0,3$ 35 Extrait de levure Biotine Chlorhydrate de thiaraine (ou thiamine-HCl) Fe++ Mn++ PH 0,05$ 0.01$ 1, 0jig/l 100 jig/l 2 ppm 2 ppm 6,0 - 8,0 69 09499 2 2005186 Les souches choisies ci-dessus ont été ensuite cultivées dans le m%me milieu mais sans thiamine. On a observé alors que certaines d*entre elles ne croissent pas dans un tel milieu et exigent de la thiamine pour leur croissance. Par conséquent, 5 les souches utilisées dans la présente invention comprennent des bactéries nécessitant ou non de la thiamine pour leur croissance. Ces souches sont décrites ci-après avec des détails sur leu^-5 caractéristiques mycologiques. SOUCHE n° M16-8 (ATCC - 21 369) 10 A„ Observations morphologiques : (Gélose inclinée, sels et méthanol (1%), (20 à 24h). Cellules végétatives : bâtonnets droits, 0,4 à 0,7 x 1 à 4 microns3 apparaissant isolément ou par paires, parfois allongés. Mobiles grâce à un seul flagelle polaire. Pas de formation de spore. 15 Gram négatif. B. Caractéristiques des cultures : 1c Gélose en bandes, sels et méthanol (1$^ (2 à 3 jours) Croissance modérée, filiforme, lisse, chatoyant, d'un blanc laiteux, opalescent, de butyreux à mucoïde. Milieu inchangé» 20 2o Colonie sur gélose, sels et méthanol Cl?©) ' (2 4 4 jours) Punctiforme à circulaire (après deux à l'.roia jours), convexes unie, lisse, chatoyant, non chromogène ou blanc laiteux, translucide ou opalescente 3o Gélose au méthanol exempte dfazote de Heinemann modifiée : pas de croissance. 4® Tige de gélatine avec 1$ de méthanol nutritif ajouté : 20 °C, (Un mois)o Croissance sur la surface de la tige at sur les parties supérieures et moyennes de celle-ci, mais croissance nulle ou limitée à la partie inférieure. Filiforme, pas d© liquéfaction. 5. Milieu gélose-gélatine de Frazier additionné de de méthanol ï croissance après 7 jours, mais pas de liquéfaction. 6» Bouillon de culture, sels et méthanol (1$) : 1 à 4 jours. OC Croissancê abondante, anneau ou pellicule après 2 à 3 jours, trouble0 Avec sédiment» 7<> Cette souche ne peut croître dans des milieux bactériologiques ordinaires mais croît si l'on ajoute 1 à 2% àe méthanol. ©AD DRfâïHAL 30 69 09499 3 2005186 G. Caractères physiologiques : 1. Relation avec l'oxygène libre : peut être anaérobie. 2. Température : température optimale de croissance 20 à 2Ô°C; croissance à 10°C et pas de croissance à 37°C. 5 3. pH pour la croissance : pH optimal 6,5 à 7,5; limites du pH 5,2 et 9,2. 4o Catalase : (activité) positive. 5. Oxydase : positive. 6. Teinture de tournesol ï pas de réaction. 10 7» Hydrolyse de l'amidon : négative. 8o Hydrolyse de la gélatine : négative. 9. Hydrolyse du Tween 80 : négative 10. Réduction des nitrates : positive,, mais sans gaz» 11. Production d'indol : néant. 15 12. Uréase : (activité) positive. 13. Milieu citraté de Koser : pas de croissance 14. Halotolérance (tolérance des halogènes) : en général croissance dans les milieux contenant 2$ de NaCl; mais parfois croissance dans un milieu contenant 1# de NaCl, mais non 20 256 de NaCl. 15» Inhibition par la terramycine (10 mg/litre) ; néant. 16. Production d'acide à partir du glucose (procédé de Hugh et (Leifson) : néant. 17» Utilisation des hydrocarbures, hydrates de carbone, sucres 25 alcools, amino-acides, acides cliniques etc.: après 7 à 10 jours, croissance sur un milieu liquide de sels minéraux avec 1$ de méthanol comme seule source de carbone, mais pas de croissance avec d'autres sources de carbone. (Voir tableau I) 10. Milieu à base d'alcoylamine (mono éthy lamine et diméthy lamine ) 30 pas de croissance. 19® Incapable de photosynthèse. D. Source : terre, eaux-vannes et boue E. Teneur des acides désoxyribonucléiques (ADN) en GC (guanlne + cytosine) : 51, 9 moles % (par le procédé de Tm). 35 Si l'on se reporte à l'ouvrage Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7e édition (1957), la souche M16-Ô peut être classée dans le genre Pseudomonas. étant donné ses caractéristiques générales. Cependant, la teneur mesurée en GC de 69 09499 4 2005186 l'ADN de la souche est de 51,9 moles %, en dehors des limites imposées, 57 à 70, pour ce genre. Et, à ce point de vue, elle devrait être plutôt classée dans le genre Mèthanomonas. En toute rigueur, les micro-organismes qui appar-5 tiennent au genre Methanomonas sont des assimilateurs de méthane. Mais, dans un sens plus général, ce genre doit inclure les microorganismes assimilant le méthane et le méthanol. De même, des points de vue morphologiques et physiologiques, ainsi que de la • teneur de l'ADN en GC, ladite souche M16-8 devrait être classée 10 correctement dans ledit genre Methanomonas. Puisque cette souche M16-8 assimile seulement le méthanol, elle se différencie du Methanomonas methanica (ou Pseudomonas methanica)ou de la Methanomonas methanooxidans. et de nombreux autres qui ont été signalés comme assimilateurs de méthanol 15 et qui en même temps assimilent d'autres sources de carbones, par exemple, les sucres, alcools, acides organiques, hydrocarbures, alcoylamines etc. Par conséquent et pour conclure les demandeurs proposent de classer la souche M16-Ô dans le genre Methanomonas 20 et de lui donner de plus un nouveau nom d'espèce, methylovora. dénommant ainsi cette souche Methanomonas methylovora» Nota : les demandeurs connaissent une variété de cette souche qu'ils différencient sur la base du pigment produit. Cette variété apparaît en jaune clair sur la gélose avec sels et méthanol ou 25 sur la gélose synthétique au méthanol; et jaune sur la gélose avec aliments et méthanol0 SOUCHE n° M8-5 (ATCC - 21 370) A» Observations morphologiques (Gélose inclinée synthétique, méthanol (1%), 24 à 48 Jti) 30 Cellules végétatives : bâtonnets rectilignes 0,4 à 0,7 x 1,5 à 30 microns, apparaissant isolément ou par paires. On a observé parfois des cellules allongées ou filamenteuses. Douées de mobilité grâce & un seul flagelle polaire. Pas de formation de spores Gram négatif» 35 B„ Caractéristiques des cultures : 1o Gélose en bandes avec sels et méthanol (1$) î (2 à 3 jours). Croissance limitée, perlées, lisses, chatoyantes, non chromogènes translucideso Milieu inchangé. 69 09499 5 2005186 Croissance abondante avec addition de chlorhydrate de thiamine (0,2 à 1 mg/l) et caractères identiques â ceux de la M16-Ô, à savoir la Methanomonas tasthylovora. 2. Gélose en bandes, synthétique et méthanol [ifo) g 5 (2 à 3 jours) Croissance modérée, filiformes, lisses, chatoyantes, d^un blanc laiteux (parfois légèrement rosé), opalescentes, de butyreuse à muco!de0 Milieu inchangée 3o Colonies sur gélose synthétique ©t méthanol (1$) s tG (2 à 4 jours) De punctiforme à circulaire (après 2 à 3 jours3 convexes, lisses, unies, chatoyantes, d8un blane laitsusî, opalescentes0 4» Gélose, en tige, synthétique et méthanol (1$) S- (2 à 7 jours) Croissance sur la surface et le long ds la tige, filifcïiiss. 15 5» Milieu gélose-gélatine de Frazier additionné de 1$ de méthanol : (7 jours) Croissance satisfaisante, œais pas de liquêfastiono 6o Gélose au méthanol, esompte d8asot® modifié© d® Heines^aa § pas de croissanceo 20 7» Bouillon synthétique au siethanol-(1$) i (1 â 4 jours) Croissance abondants, anneau ou pelliculû, trouble» Un sédiment existe» 8» Cette souche ne peut croître dans les milieux bactériologiques ordinaires, maie croit si lBon ajoute 1 à 2% de 25 méthanol. - C. Caractères physiologiques 15 Relation avec 1*oxygène libre : peut être anaérobie c 2e Température : température optimale pour la croissance, 20 à 2Ô°G; croissance à 10°C; pas de croissance 6, 45°Co 3. pH pour la croissance S pH optimal,, 6,5 à 7S5 " valeurs limites 5,2 et 9,2. 4o Catalase î positive. 5» Oxydase s positive. 6. Teinture de tournesol : pas de réaction® 7o Hydrolyse de 1*amidon l négative„ êo Hydrolyse de la gélatine ; négative® 9° Hydrolyse de Tween âO ï négative. 30 35 BAD OB»Ginal 69 09499 6 2005186 10« Réduction des nitrates : positive, mais pas de dégagement de gaz. 11. Production d'indol : néant. 12. Uréase : positive. 5 13« Milieu citraté de Koser : croissance nulle. 14° Halotolérance : croissance sur un milieu contenant 2$ de NaCl» 15- Inhibition par la terramycine (10 rag/l) ; néant. 16. Production d'acide à partir du glucose (procédé de Hugh 10 et Leifson) : Néant. 17- Utilisation des hydrocarbures, hydrates de carbone, sucres, alcools, amino-acides, acides organiques etc î au bout de 7 * 10 jours, croissance sur des milieux liquides contenant des sels minéraux et 1$ de méthanol comme seule source de carbone 15- et 500 microgrammes par litre de chlorhydrate de thiamine, mais croissance nulle en l'absence de l'un ou de l'autre (voir tableau I). 1âo Milieu type alcoylamine (monoéthylapine et diéthylamine) i pas de croissance. 20 19® Incapable de photosynthèse. D. Source : terre, eaux-vannes et boue Puisque la souche MÔ-5 a des caractéristiques identiques à celles de la souche M16«»Ô quand elle ©st incubée dans des milieux contenant du chlorhydrate de tMaaine (100 microgrammes ^ par litre ou plus), elle a été dénoramée Methanomonas methylovora var» thiaminophila. SOUCHE n® M135-7 (ATCC - 21 371 A» Observations morphologiques : (gélose inclinée, synthétique, contenant, du méthanol (1j6), 24 à 48 h}= Cellules végétatives : bâtonnets, 093 à 0,7 x 1,5 à 4,5 microns, apparaissant isolément ou prr paires. On a obseryé parfois des cellules allongées ou filamenteuses. Douées de ■a c mouvement grâce à un seul flagelle polaire.» Pas de formation de spores. Gram négatif. BAD ORIGINAU 09499 7 2005186 Caractéristiques des cultures ï 1o Gélose en bandes synthétique, avec méthanol (1$) î (1 à 3 jours) Croissance modérée, filiformes, lisses, chatoyantes, dfun blanc laiteux, opalescentes. Milieu inchangé» 2. Gélose en bandes additionnée de sels et de méthanol (1$) : (au bout de 7 jours). Croissance nulle ou faible Croissance modérée avec addition de chlorhydrate de thiamine (500 pg/l) ou d'extrait de levure (0,01 à 0,1$). 3. Colonies sur gélose synthétique avec méthanol (1$) : (1 à 3 jours) Punctiformes à circulaires (après 2 à 3 jours), convexes, unies, lisses, chatoyantes, d'un blanc laiteux, opalescentes. 4. Tige de gélose synthétique, avec méthanol (1$) : (1 à 7 jours) Croissance sur la surface et le long de la tige, filiforme. 5. Bouillon synthétique avec méthanol (1$) : (1 à 4 jours) Croissance abondante, anneau ou pellicule, trouble. Un sédiment existe. 6„ Milieu gélose-gélatine de Frazier additionné de 1$ de méthanol (7 jours) Croissance satisfaisante, mais pas de liquéfaction. 7. Gélose au méthanol, exempte d'azote, midifiée de Heinemann : pas de croissance. $o .Cette souche ne peut pas croître sur les milieux bactériologiques ordinaires, mais croît si l'on ajoute 1 à 2% de méthanol. Caractères physiologiques î' 1. Relation avec l'oxygène libre : peut être anaérobie. 2. Température : optimale pour la croissance, 20 à 37°C, pas de croissance à 10°C et à 45°C. 3. pH pour la croissance : optimal 7 à S ; limités î 5,2 et 9,5. 4. Catalase : positive. 5* Oxydase î positive. 60 Teinture de tournesol : pas de réaction. 7. Hydrolyse de l'amidon : négative. 69 09499 ô 2005186 Ôo Hydrolyse de la gélatine : négative. 9. Hydrolyse du Tween-80 : négative. 10. Réduction des nitrates : négative. 11« Production d'indol : néant 5 12. Uréase : positive0 13. Milieu citraté de Koser : pas de croissance. 14® Halotolérance ï croissance sur un milieu contenant 2% de NaCl. 15» Inhibition par la terramycine (10 mg/l) : néant® 10 16. Production d'acides à partir du glucose (procédé de Hugh et Leifson) : Néant. 17. Utilisation des hydrocarbures, hydrates de carbone, sucres, alcools, amino-acides, acides organiques etc. : après 7 à 10 jours, croissance sur milieu liquide contenant des 15 sels minéraux et 1$ de méthanol comme seule source de car bone et 500 microgrammes par litre de chlorhydrate de thiamine. Mais croissance nulle avec d'autres sources de carbone et en l'absence de méthanol ou de chlorhydrate de thiamine (voir tableau 1). 20 18. Milieu à base d'alcoylamine (monoéthylamine et diméthy 1- amine) : croissance au bout de 7 jours seulement avec addition de chlorhydrate de thiamine (500 microgrammes/l). D. Source : terre, eaux-vannes et boue 22 Avec les propriétés décrites ci-dessus, la souche M135-7 peut être classée correctement dans le genre protaminobacter, d'après le manuel de Bergey sus-mentionné. » La souche M135-7 douée de mouvements est achromogène et assimile seulement le méthanol. Ses caractéristiques la dis-tinguent du Protaminobacter ruber et d'autres espèces connues du genre protaminonobacter. Par conséquent, les demandeurs proposent une nouvelle espèce pour cette souche, la dénommant donc Protaminobacter thiaminophagus » 35 Nota : les demandeurs connaissent une variété de cette espèce, qu'ils distinguent en se basant sur l'activité de l'uréase. Cette variété est caractérisée par une activité négative de l'uréase. BAU ORIGINAL 69 09499 9 2005186 10 25 SOUCHE n°HÔ9-3A (ATCC - 21 372) A» Observations morphologiques î- (Gélose inclinée avec sels et méthanol (1$), 20 à 24 h) Cellules végétatives : bâtonnets rectilignes ou légèrement incurvés, en général de 0,4 à 0,7 x 1 h 2,5 microns, apparaissant isolément ou par paires. Pléomorphe ; des cellules allongées et cellules renflées (1 à 1,5 x 2a5 & 5 microns) de forme irrégulière ont été observées. Sont douées de mouvementé Pas de formation de spores. Gram négatifs B. Caractéristiques des cultures : 1. Gélose en bandes avec sels et méthanol (1 fa) î {2 à 3 jours) Croissance abondante, filiformes à s'élargissant, lisses, chatoyantes, blanches, opaques à opalescentes, butyreuseso ^ Milieu parfois marron après 10 jours. 2. Colonies sur gélose additionnée de sels @t da méthanol (1$) î (1 à 3 jours) Circulaires ou irréguliêres, convexes ou saillantes, ondulées ou unies, lisses, chatoyantes, d'un blanc laiteux ou blanc 20 grisâtre, opaques, butyreuses. 3. Tige de gélose synthétique avec méthanol (1$) : (1 à 5 jours) Croissance sur la surface et le long de la tige» 4* Bouillon avec des sels et du méthanol (1$) : (1 à 4 jours) Croissance modérée, anneau ou parfois pellicule, trouble, un sédiment existe. 5» Milieu gélose et gélatine de Frazier, additionné de 1$ de méthanol : ( 7 jours K Croissance, mais sans liquéfaction.» 6. Gélose au méthanol exempte d'azote, codifiée de Heinemann: 2q pas de croissance® 7« Cette souche ne peut pas croître sur des milieux bactériologiques ordinaires, mais croît si l'on ajoute 1 â 2% de méthanol. C. Caractères physiologiques : 35 1. Relation avec l'oxygène libre : peut être anaérobie. 20 Température ; température optimale de croissance 20 à 2Ô°C| pas de croissance à 10°C et à 40°Co -î BAB QRIGINM- 69 09499 10 2005186 3. pH pour la croissance s pH optimum 6,5 & 7,5; limites 5,2 et 6,5. 4» Catalase : positive» 5. Oxydase : positive» 5 6. Teinture de tournesol i pas de réaction* 7» Hydrolyse de l'amidon : négative» 8. Hydrolyse de la gélatine : négative - 9. Hydrolyse du Tween-80 : négative® 10.Réduction des nitrates : positive gens dégagement 10 gazeux. 11«Production d'indol : négative. l2 13.Milieu citraté de Koser î pas de croissance. 14»Halotolérance : croissance sur un. milieu' contenant 2# de 15 NaCl 15 "Inhibition par la terramycine (10 rn"/'x ) % néant. 16.Production d'acides à partir du gluncne- (procédé d© Hugh et Leifson) : Néant. 17«Utilisation des hydrocarbures, hydrates de carbone, sucres, 20 alcools, amino-acides, acides organiques etc. S après 7 à 10 jours, croissance sur un milieu liquide contenant des sels minéraux et 1$ de méthanol conta© seule source de carbone, mais pas de croissance avec d'autres sources de carbone, [voir tableau I)0 25 18.Milieu à base d'alcoylamines (mono éthy lamine et diéthy l' aminé) î après 2 à 3 jours, croissance sur un milieu gélose-diméthylamine, mais pas de croissance sur un milieu gélose-monoéthylamine. Chromogénèse s blanc ou blanc laiteux. 19»Milieu gélose et amide (formamide ou reétamide) : pas de 30 croissance. B® Source i terre, eaux-vannes et boue D?après ces caractéristiques, la souche M89-3A peut être également classée dans le genre Protarir^c-ba'gtsr» Cependant, cette souche se distingue de la seule sspèco non doué© de mouvement, le P« alboflavus. qui croît- sur ïss milieux biologiques ordinaires, assimilant les acidsc organiques, les composés aminés, les aminés et l'éthanol# Par conséquent, les demandeurs proposent une nouvelle espèce pour la souche M89-3A, la dénommant' Protaminobacter candidus® 35 8*0 69 09499 n 2005186 Nota : les demandeurs connaissent deux variétés de cette espèce qui se différencient en se basant sur la réduction des nitrates et l'activité de l'uréase. La variété A ne réduit pas les nitrates et l'uréase a une activité positive; 5 la variété B réduit les nitrates et l'activité de l'uréase est négative. Cette variété de l'espèce a un aspect plus grossier et terne sur les milieux de gélose contenant des sels ou du méthanol ou de gélose synthétique contenant du méthanol. 10 SOUCHE n° M224-3 (ATCC - 21 373) A. Observations morphologiques : (gélose inclinée.nutritive, 20 & 24 heures) Cellules végétatives: bâtonnets légèrement incurvés, 0,5 ^ à 10x1,7 à 30 microns, qui forment un anneau fermé pendant leur croissance. Ces anneaux croissent en formant des masses qui se subdivisent à nouveau en éléments en fome de bâtonnets comme ceux du début. Parfois, pendant la croissance, les bâtonnets forment des hélices par enchaînement. On observe parfois des cellules avec une extrémité renflée arrondie» Non douées de mobilité, pas de formation de spores. Gram négatif. B. Caractéristiques des cultures : 1. Gélose en bandes nutritive î (1 à 2 jours) Croissance modérée, filiformes, rugueuses ou légèrement ondulées, ternes, blanches à ivoire, visqueuses. Milieu inchangé. 20 Gélose nutritive en bandes et méthanol (1$) ; (1 à 2 jours) Croissance et caractéristiques identiques à celles de 1. Parfois la teinte est comprise entre blanc légèrement jaunâ-■ tre et marron clair jaunâtre avec des cultures anciennes. 3. Gélose en bandes additionnée de sels et de méthanol : (au-délà de 10 jours) : Croissance nulle ou faible. 4» Gélose en bandes synthétique, avec du méthanol : croissance tardive : après 2 à 3 jours, croissance modérée, perlées à O C filiformes (3 à 5 jours) rugueuses à lisses, blanches ou ivoire , opaques, butyreuses. Milieu inchangé. 5» Colonies sur gélose nutritive : (1 à 2 jours).: Circulaires, convexes, unies, lisses, ternes, opaques. 20 25 30 69 09499 2005186 12 6. Colonies sur gélose synthétique avec méthanol s (3 à 5 jours) Punctiformes & circulaires. D'autres sont semblables à 5» 7. Bouillon nutritif î ( 1 à 3 jours). 5 Croissance faible ou modérée, pas da pellicule, granulaires Sédiments floculants en quantité limitée» Ô. Milieu gélose-lait î (2 à 5 jours). Croissance, blanches, sans liquéfaction. 9. Culture sur pommes de terre : (3 à 5 jours) 10 Croissance tardive, filiformes, ternes, blanches. Milieu inchangé. 10o Tige de gélatine nutritive : (à 20°C, un mois) Croissance sur la surface et le long de la tige, filiformes Pas de liquéfaction. ^ C. Caractères physiologiques : 1o Relation avec l'oxygène libre : peut être anaérobie. 2. Température : température optimale de croissance 20 à 2Ô°C; croissance à 10*C, mais pas de croissance & 45°C. 20 3. pH pour la croissance î pH optimal 7 à 7,5; limites 5,5 et 9,2c 4* Catalase : positive. 5« Teinture de tournesol ï pas de réaction les 25 premiers jours et, ensuite réaction légèrement alcaline. 25 69 Hydrolyse de l'amidon : négative. 7» Hydrolyse de la gélatine ï négative. 8. Hydrolyse du Tween-80 : négative. 9» Réduction des nitrates : négative. 10» Production d'indol : négative. 2o 11» Production de HgS : négative 12. Production d'acétylméthylcarbinol : négative. 13# Rouge méthyle : négative 14» Uréase : positive 15» Milieu citraté de Koser : croissance 2^ 16. Halotolérance : croissance sur un milieu avec 1$ de NaCl, mais non avec 7$ de NaCl. 17» Inhibition par la terramycine (10 mg/l) : douteuse. 69 09499 13 2005186 1Ôo Production d'acides à partir d®s hydrates de carbone (procédé de Hugh et Leifson) ; Production d'acides, mais non ds gaz, par oxydation et fermentation & partir des hydrates de carbone ci-après S 5 arabinoses galactose, xylose, glucose et mannitolo Aucune production d'acides ou de gag par oxydation à partir des hydrates de carbone ci-après î sucrose, amidon et glycérol» 19» Utilisation des hydrocarbures8 hydrates de carbone, 10 sucres, alcools, amino&cides, acides organiques etc« : (7 k 10 jours)» Croissance sur des milieux liquides contenant des sels minéraux ainsi que du chlorhydrate de thiamine (500 jig/l), du glucose, de la xylose, de la mannite5 de la glycérines 15 du méthanol, de l*êthanol, de 1» ac étaldéhyde, un acétate, un pyruvate, un lactate, un malates un fumarate, un succi-nate, de la 1-alaiaine et de l'acide 1-glutami que„ Croissance limitée sur les mêmes milieux contenant du lactose, un citrate, de l5acide dl-aspartiqueo 20 Pas de croissance sur d'autres substrats (voir tableau I) 20» Milieux à base d'alcoylamine (monoéthylamine et diméthyl-amine) : au bout de 7 jours» Pas de croissance même avec addition de chlorhydrate de thiamine (500 microgrammes par litre) dans les milieux de 25 culture» De Source : eaux-vannes» Avec les propriétés décrites ci-dessus, la souche M224-3 peut être classifiée correctement dans le genre Microcyclus. Les bactéries qui appartiennent à ce genre sont nouvelles 30 et peu courantes# Le manuel de Bergey décrit seulement une espèce, à savoir le Mycrocyclus aqua-tieus. La souche M224-3 ne peut croître sur un milieu à base de sels minéraux contenant 1$ de méthanol, que si X5on ajoute & ce milieu de l'extrait de levure (0,01$ ou plus) ou du J chlorhydrate de thiamine (50 microgrammes par litre ou plus); et, en trois jours environ, la souche produit des acides à partir du glucosee A ce point de vue, cçest une nouveauté pour cette souche M224-3, qui se différencie de l'espèce M« Aquaticus. BAD ORIGINAL 69 09499 14 2005186 Far conséquent2 les demandeurs ..proposent une nouvelle, espèce pour la souche IK24-3S la dénommant Mlcrocvclus ebjCTeuSo Les méthodes utilisées «enTerr": 'fit.r© décrites 5 comme suit Milieu synthétique avec méthanol : le milieu -s base a la même ce»'" • riWfrim. *M\ mmaa»——BMO——i——mam composition que le milieu utilisé pour la sélection des souches» Milieu gélose°méthanol exempt dTazote£. modifié, de Heinemann : 10 G9est le milieu gélose-glucose exempt, d'à,.. -:1® Heinemann, dans lequel le glucose est remplacé par %?j ^thanolo Milieu sels + méthanol s ifo de méthanol ajctivi dans le milieu de 1° Bworkin et Foster Mo Bworkin et Foster, J. Bacteslolo« ?Zr Cî-é~659 (1956) 15 — Milieu gélose + amide s milieu de Peter ïïir&chi et Conti Perter Hirschi et S.F. Conti. Archiv fur Itikr-vbiqlogie. LÛt 358-36? (1964). Milieu gélose + alcoylamine : milieu de den Docren de Jong 20 den Dooren de Jong, Zentra Bakteriol» Parasitent, lié partie, 71, 218 (1927). En ce qui concerne les autres» milieux nécessaires pour les essais, on utilise un milieu classique avec addition de 1$ de méthanol. 25 On procède à la culture à 2S°C, sauf indication contraire a TABLEAU! 30 35 Croissance Sub s t M16-8 M8-5 Glucose Fructose - - - _ _ Sucrose - = » — - Lactose - - ~ _ Xylose - «=> «, - . + Mannitol - - + Glycérol - - - + Méthane - _ _ _ _ ORIGINAL 69 09499 2005186 15 Substrat M16-8 Mg-5 M135-7 M89-3A M224-3 10 15 20 25 n-propane Butane Méthanol Ethanol n-propanol Formaldéhyde Acétaldéhyde Acétone Phénol Benzène Naphtalène Kérosène Formiate Acétate Pyruvate Oxalate Lactate Malonate Propionate Malate Fumarate Succinate Gluconate Citrate + + + + + + + + + + 30 35 ld-glycine 1-alanine 1-leucine ld-isoleucine 1-arginine ld-méthionine Acide ld-asparatique Acide 1-glutamique 69 09499 2005186 16 Croissance Substrat M16-Ô MÔ-5 M135-7 MÔ9-3A M224-3 ld-trypt-ophane Lysine 10 (Milieux à base d,alcoylamine utilisés) Monométhylamine - - Diméthylamine - - Monoéthylamine - - -h ± + 15 (Milieux à base d'amide utilisés) Formamide Acétamide Comme on l*a vu ci-dessus, les souches de microorganismes choisies pour l*objet de l,invention appartiennent à 20 un des genres Methanomonas, Protaminobacter et Microcyclus et elles peuvent croître par assimilation de méthanol et en produisant de l?acide 1-glutamique. Avec les progrès de la taxonomie des bactéries dans lravenir, on peut définir un nouveau nom générique pour les 25 bactéries utilisant le méthanol (à ce sujet, les demandeurs ont admis comme probable un nom, le genre methylomonas)« Cependant, 1?existence et les caractéristiques des souches M16-8, M&-5, M89-3A et M135-7 et les objectifs de la présente invention resteront indépendants de toute modification de la classification 30 taxonomique. Certaines des souches sus-mentionnées exigent de la thiamine pour leur croissance et d*autres non, mais ces deux variétés sont utilisables dans la présente invention® Quand on utilise les souches exigeant de la thiamine, l*acide 1-glutamique 35 se produit seulement en présence d?une quantité appropriée de thiamine, pure ou mélangée,. Si, par contre, on utilise des souches ne nécessitant pas de thiamine, la présence de thiamine n'est pas absolument nécessaire pour leur croissance, mais une petite quan- "eopY 69 09499 2005186 17 10 20 25 tité de celle-ci favorisera toujours le métabolisme et influera favorablement sur la production d'acide 1-glutamique. Pour étudier plus en détail l'influence de la thiamine, on a fait des expériences avec les souches décrites ci-dessus, cultivées sur un milieu de base ayant la composition ci-après : Méthanol 2,0$ K2HP04 0,7$ KHgPO^ 0,2$ MgS04,7H20 0,05$ Biotine 10 ]ig/l ++ Mh 2 ppm 15 Fe** 2 ppm 40 ml de chacun des milieux ci-dessus ont été versés dans une fiole de Sakaguchi de 500 ml, et, après stérilisation, ont été cultivés en agitant à 29®C pendant 4â h. Ensuite, on a ajouté trois fois du méthanol à 2$ pendant l'opération, d'après la quantité consommée. Le pH a été maintenu à 7,5 en ajoutant une solution d'urée à 25$. Le bouillon de culture ci-dessus est dilué avec 20 fois son volume d'eau. Ensuite la croissance est mesurée par l'intermédiaire de la densité optique à 610 millimicrons; et la quantité d'acide 1-glutamique formée est mesurée par détermination microbiologique avec le Lactobacillus arabinosus» Les résultats sont récapitulés ci-après : COPY Chlorhydrate de thiamine Influence de la thiamine ajoutée sur la production d'acide l-»glutamique M16-S Methanomonas methylovora M8-5 Methanomonas methylovora var thiamino-phila M135-7 Protaminobacter thiamino-phagus Më9-3A Protaminobacter candidus M224-3 Mycrocyclus eburnaus ns/l 0D x20 L-GA g/dl 0D x20 L-GA g/dl 0D x20 L-GA g/dl 0D xZO L-GA g/dl 0D x20 L-GA g/dl 0 0,71 0,34 0,15 0 0 0 0,65 0,35 0 0 10 0,72 0,37 0,21 0,03 0,30 0,16 0,67 0,33 0,00 0,02 50 0,74 0,44 0,42 0,13 o, 46 0,25 0,63 0,44 Os35 0,11 100 0,05 0,50 Os57 0,17 0,60 0,34 0,72 0,52 0,3* 0,13 500 0,03 0,47 Q,72 0,43 0,73 0,5?* 0,69 0,47 0,45 0,13 1000 0,00 QM 0,90 0,55 0,â3 0,(:7 0,71 0, 0;„50 0,12 2000 Qs75 0„35 0,95 0,32 0t *0 ''>,70 0 j '.-v 0,52: 0S09 4000 0,76 Cl g 25 00Ô5' 0S3Ô 0,70 Û,$9 y,63 0,40 0,51 otoê L-GA - aeide lf-glutami que OD ■ *= danâité optique O* O O -fc» vO sO 09- NO O O Cn —■* 00 a» 69 09499 19 2005186 Comme cela est évident d'après les résultats ci-dessus de 1*expérience, la production d'acide 1-glutamique est influencée par la quantité de thiamine présente dans le milieu. Par conséquent, une quantité appropriée de thiamine est indis-5 pensable ou avantageuse pour la production en quantité importante de cet acide. Inaptitude des micro-organismes à croître et & produire cet acide, après addition de thiamine varie d'une souche à l'autre. Ils ne croissent pas avec une quantité trop faible de thiamine, et une quantité excessive de celle-ci a pour consé-10 quence une diminution du rendement en acide. En choisissant la quantité à ajouter, les micro-organismes peuvent être étudiés expérimentalement en fonction de leurs conditions de culture. En utilisant les souches de culture décrites ci-dessus, on peut décrire ci-après plus concrètement le procédé 15 selon l'invention. On peut introduire le méthanol constituant la source principale de carbone dans le milieu uniquement au début de l'opération, mais il est préférable de démarrer avec une faible concentration de méthanol au début et d'ajouter des doses additionnelles 20 pendant l'opération, en fonction de la consommation. Des sources d'azote très variées sont utilisables , à savoir le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, la solution aqueuse d'ammoniaque et l'urée. D'autres substances contenant de l'azote telles que 25 les aminoacides, la liqueur résultant de la macération du maïs, l'hydrolysat de graines de soya, les bouillons, les peptones, l'extrait de levure et d'autres matières nutritives organiques conduisent aux résultats habituels ainsi que les oligoéléments classiques, les vitamines et autres aliments secondaires essentiels 30 pour la croissance des microbes de manière connue. On peut ajouter ^ ^ | | ,| ,|~r|, également des ions métalliques tels que Fe , Mn , Zn , Co , Ca , Pb etc ou de l'eau (eau de rivière, eau de mer, etc.), contenant de tels ions métalliques si on le désire. Les ingrédients les plus appropriés parmi ceux sus-mentionnés sont choisis par des 35 expériences qui sont effectuées avec diverses souches dans leurs conditions de culture. 69 09499 20 2005186 Lorsqu'on utilise de la thiamine elle doit être chimiquement pure ou mélangée avec une matière existant dans la nature. On obtient les mômes résultats dans les deux cas. Ces matières sont 19extrait de levure, l'extrait de foie, l'extrait de son de riz etc» La thiamine employée dans l'invention contient également des dérivés de la thiamine, qui agissent sur les microorganismes employés ici» Le pH du milieu de culture doit être maintenu entre 5 et 9 et est maintenu au départ entre 5,5 et Ô. La température 0 doit être maintenue entre 16 et 37°C, et de préférence entre 25 et 34°C. Mais certaines souches peuvent croître et produire de l'acide à une température inférieure. La fermentation est exécutée en présence d'air et nécessite en général 1 à 3 jours et parfois 2 à 4 jours pour des 5 résultats optimaux. L'acide 1-glutamique formé dans le milieu décrit ci-dessus après fermentation est récupéré à partir du mélange fermenté par un procédé connu tel qu'un traitement par une résine échangeuse d'ions, une cristallisation etc<> 0 Les exemples ci-après permettront de mieux comprendre l'invention mais il est bien entendu qu'ils ne sont pas limitatifs. EXEMPLE 1 On prépare un milieu de culture d'ensemencement ayant la composition ci-après : 5 K2hp°^ 0,2$ kh2po4 0,7$ MgS04,7H20 0,05$ (nh4)2so4 0,3$ 0 Biotine 2 yg/l Thiamine-HCl 100 yg/l 5 Extrait de levure 0,01$ Fe 2 ppm Mn 2 ppm 69 09499 2T 2005186 Ce mélange est mélangé à 2$ de méthanol, inoculé avec les souches M16-8, M89-3A et M224-3 respectivement, et cultivées en agitant à 27°C pendant 18 h. Le bouillon de culture d'ensemencement ainsi 5 obtenu est transféré (10$ en volume) dans un milieu de culture principal ayant la même composition (30 ml) dans une fiole Sakaguchi de 500 ml, où on le cultive en agitant à 27°C On ajoute de l'ammoniaque aqueuse à 15$ pendant la fermentation pour maintenir le pH entre 6 et 8,5 ®t pour four-10 nir de l'azote; et on ajoute du méthanol en maintenant le taux dans la culture k 2$ pour compenser sa consommation» Au bout de 48 h de fermentation, le rendement en acide 1-glutamique formé dans le milieu est indiqué pour diverses souches, au tableau II. ^ ^ TABLEAU II Souche Teneur en au départ méthanol introduit ultérieurement Acide 1—glu— tamique Croissance de la souche 20 (vol.$) (volo$) (g/dl) (x20) 0D à 610 milli-microns M16-8 ( Methanomonas methylovora) 2 8 1,05 0,90 25 M89-3A (Protaminobacter candidus) 2 8 0,26 0,73 M224-3 2 (Microcyclus eburneus) 8 0,21 0,47 30 EXEMPLE 2 On prépare un bouillon de culture d'ensemencement ayant la i^ême composition que dans l'exemple 1, sauf qu'on utilise les vitamines ci-après à la place de l'extrait de levure : -jV 5 -?* " eopyf 69 09499 2* 2005186 Riboflavine 1900 p.g/1 Pyridoxine 1000 jig/l Panthoténate de calcium 10C0 m/1 Acide nicotinique $*g/l 5 Acide aminobenzoïque 100 »ig/l Acide folique :50 |ig/l Après 48 h de fermentation de la -flêrm manière que dans 18exemple 1, la quantité d'acide l-glutamiqua formée dans le mélange est indiquée au tableau III0 TABLEAU III Souche Teneur en méthanol Acide 1-glutamique 15 (vol*$) (g/dl) M16-8 (Methanomonas methylovora) 6 0,24 M89-3A (Protaminobacter candidus) 6 0,31 20 M224-3 (MIcrocycIus eburneus 6 0,2? EXEMPLE 3 40 ml de bouillon de culture ajaaé la composition 25 ci-après sont stérilisés dans une fiole de i&kaguchi de 500 ml : KH2P04 0,25l K2HPO4 0,7$ 30 KgS04,7H20 0,05f. Extrait de levure 0,03$ Mn"*"*" 2 ppm Fe 2 ppm 69 09499 2005186 23 On ajoute du chlorhydrate de thiamine en quantité indiquée sur le tableau IV. Les diverses souches indiquées sur la tableau IV sont inoculées. Le milieu est maintenu à 28°C et on ajoute du méthanol pour ramener sa teneur & 2%, au bout de 8, 16, 24 et 30 h. Le pH est ajusté au voisinage de 7,5 en ajoutant de l*urée à 20$. La quantité d,acide 1-glutamique formée au bout de 60 h de culture dans le bouillon est indiquée au tableau IV. 10 TABLEAU IV 15 Souche Teneur en chlor- Acide hydrate de thiamine 1-glutamique Croissance de la souche (pg/D M&Î.5 (Methanomonas methylovora 2.000 var. thiaminophila) 0 (g/dl) 0,91 0,02 (x20) 0D 4 610 mp. 0,84 0,20 20 M135-7 (Protaminobacter thiaminophagus) 1.000 0 0,86 0,10 0,92 0,38 69 09499 24 2005186 REVENDICATIONS 1 » Procédé de préparation diacide 1-glutamique par culture d*un micro-organisme en présence d*air sur un milieu nutritif comprenant une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable et des aliments secondaires, caractérisé en 5 ce que ladite source de carbone est constituée principalement par du méthanol et que ledit micro-organisme est capable de former de l'acide 1-glutamique en assimilant ledit méthanol constituant la source de carbone. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en 10 ce que ledit micro-organisme est une bactérie des genres Methanomonas, Protaminobacter et Microcyclus. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu nutritif est maintenu pendant la culture & un pH compris entre 5 et 9 et à une température entre 16 et 37°Co 15 4® Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration dudit méthanol est maintenue à un niveau où il est efficace en régénérant ledit milieu nutritif avec ledit méthanol pendant ladite culture» 5 « Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 20 que la concentration d*azote est maintenue par régénération dudit milieu nutritif avec ladite source dTazote pendant ladite culture. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu contient de la thiamine en quantité choisie de manière à augmenter le rendement en ledit acide 1-glutamique.