FR 2480779 A2 19811023 FR 8009039 A 19800422 Vecteur contenant une séquence nucléotidique de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B et procédé de fabrica- tion d'une molécule immunogène mettant en oeuvre ce vecteur L'invention concerne un développement de celle qui a fait l'objet du brevet principal no 79 21811 du 30 août 1979, dans laquelle ont été définies des séquences nucléo- tidiques susceptibles de coder une protéine ayant des pro- priétés immunologiques spécifiques du même type que l'anti- gène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg). Parmi ces séquences nucléotidiques, qui comportent au plus de l'ordre de 1.200 nucléotides, figurent des fragments déterminés du génome du virus de l'hépatite virale B, désigné par l'abréviation DNA HBV, parmi lesquels le "gène S", qui est susceptible de coder la protéine de HBsAg qui a été reconnue responsable des principales proprié- tés immunologiques du virus de l'hépatite B; ces séquences nucléotidiques comprennent encore des fragments de beaucoup plus netite taille, susceptibles de coder pour les motifs antigéniques de l'antigène HBs (déterminants de groupe a et de sous type d, w, y et r) un vecteur en vue de leur expression dans un microorganisme ou dans des cellules encaryotes, à condition que la fusion génétique ait été effectuée en conservant la phase de lecture du gène S - De façon générale, l'invention concerne des tech- niques mettant en oeuvre les fragments d'ADN décrits dans la demande de brevet principal ou de fragments analogues doués des mêmes propriétés immunologiques. Elle concerne aus- si des vecteurs particuliers permettant cette expression, notamment sous la forme d'une protéine hybride dans laquelle un fragment protéique présentant les caractères immunolo- giques de HBsAG jouxte une molécule porteuse conférant à l'ensemble des propriétés immunogènes ou immunoréactives, susceptibles d'induire la production d'anticorps protecteurs à l'égard de l'infection virale dans l'organisme de l'hôte dans lequel cette protéine a au préalable été introduite. En particulier l'invention concerne un vecteur - phage ou plasmide - contenant au moins une partie de l'opéron lactose, plus particulièrement le promoteur et le gène Z de cet opéron, ce vecteur étant caractérisé en ce qu'il est modifié pour l'insertion, en phase, dans un site approprié du gène Z, tel que le site EcoRI de l'un quelcon- que des fragments d'ADN du brevet principal, notamment ceux contenant la plus grande partie du gène S". Elle concerne également ceux de ces vecteurs modifiés, dans lesquels une partie au moins du fragment d'ADN codant pour la plus grande partie de la 1 -galactosidase serait remplacée par un fragment d'ADN apte à coder pour toute autre molécule por- teuse non immunogène, ou dont les éventuelles propriétés immunologiques, si celles-ci existent, n'interfèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant les proprié- tés immunologiques de HBsAg, par exemple essentiellement celle qui s'étend dans la direction de la lecture à partir de son site HhaI. L'invention est également plus particulièrement relati- ve à une protéine hybride caractérisée en ce qu'elle contiet 1 ropriétés une séquence polypeptidique présentant îeslimunologiques spécifiques de HBsAg, jouxtant une séquence polyeptidique constituée par la majeure partie de la f galactosidase, qui joue le rôle de protéine-porteuse. L'invention ne s'étend pas seulement à cette molécule hybride particulière, dont le rôle essentiel est de consti- tuer un modèle d'une protéine construite selon les tech- niques du génie génétique et douée des propriétés immuno- gènes et immunoréactives caractéristiques de l'antigène HBsAg, mais également à toute autre protéine hybride dans laquelle toute ou partie de la partie Q-galactosidase peut être remplacée par toute autre molécule porteuse non immunogène, ou dont les éventuelles propriétés immunologiques, si celles-ci existent, n'interfèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant les propriétés immunologiques de HBsAg. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples préférés, en combinaison avec les dessins dans lesquels - les figures la à lh illustrent schématiquement les étapes successives de la fabrication d'un vecteur du type plasmide incorporant un fragment de HBV DNA, - la figure 2a à 2c illustrent schématiquement les structures initiales du vecteur utilisé (figure 2a) final du vecteur modifié obtenu (figure 2b) et celle de la proté- ine hybride résultant de l'expression de ce vecteur modifié dans E. Coli (figure 2c). Construction d'un bactériophaqe recombinant \ lac HBs - 1 Les produits au niveau des différentes étapes de cette construction sont visés dans les figures la à lh. Ils sont également visés par les n S la à lh. On a indiqué dans la figure la les positions du gène S et de certains sites d'enzyme de restriction. Après traitement de DNA+FBV avec l'enzyme de restric- tion HhaI, on sépare un fragment d'ADN (lb) contenant 1084 paires de bases, et plus particulièrement la totalité du gène S, par électrophorèse sur gel d'agarose et électro- élution (figure lb). On prépare, à partir de ce sous-fragment, traité au préalable par l'endonucléase S1, un sous-fragment (lc) (figure lc), résultant de l'allongement du sous-fragment (lb) à ses extrémités, par des éléments d'ADN dénommés "Eco RI linkers" de formule 'CGGATTCC, CCTTAAGG3' Le fragment obtenu est, après formation des extrémités cohesives EcoRI,cloné dans le plasmide pBR322. Le plash:idc3 obtenu dénommé ci-après pBRHBs (figure ld), ne contient qu'un seul site de restriction XbaI situé à proximité de la tête du gêne S. Par digestion du plasmide recombinant pBRHBs avec un mélange d'enzymesEcoRI et XbaI on produit un fragment d'ADN comprenant approximativement 980 paires de bases et comportant la majeure partie du gêne S. (figure le). Ce fragment est séparé et purifié par éléetrophorèse sur un gel d'agarose. Le fragment obtenu est à nouveau traité avec ureendonucléase Sl, puis à nouveau pourvu d'extrémités EcoRI au moyen des susdits "EcoRI linkers", puis soumis à un traitement avec l'endonucléase EcoRI pour reformer les extrémités cohésives correspondantes. Le fragment de la figure le qui comprend environ 980 paires de bases est alors inséré par fusion in vitro dans le site EcoRI du plasmide pBR322, pour former le plasmide pXbaHBs (figure if). Ce plasmide est cloné de façon usuelle dans le plas- mide pBR322. Plusieurs clones ont été obtenus. On extrait et purifie, après traitement avec EcoRI des ADN de trois de ces clones, les fragments pXbaHBs-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 (figure 1 g), également appelés ci-après "fragments HBs" (figure lh). Les séquences nucléotidiques des extrémités des susdits fragments (normalement obtenues à l'intérieur du gène S) sont déterminées en ayant recours à la procédure décrite par Maxam et Gilbert (Proc. Natn. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). Ces déterminations ont révélé que les séquences des nucléotides des extrémités terminales, correspondant au gène S n'étaient pas identiques dans les trois clones (figure lg), les différences sont vraisemblable- ment dues à des hétérogénéités produits au cours de la digestion par l'endonucléase Sl. Les trois fragments pXbaHBs-1, pXbaHBs-2, pXbaHBs-3 sont insérés par fusion in vitro dans le genome du bactério- phage;plac5-1 (21), lequel n'a qu'un seul site EcoRI situé à proximité de l'extrémité du gène lac Z. Du fait du cadre de lecture du gène lac Z, tel qu'il peut être déduit de la séquence d'amino-acidesde la betagalactosidase (23), on constate - et l'expérience le confirmera - que l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs-I dans le site EcoRI du gène lac Z de i plac5-1 doit conduire à la conservation de la phase de lecture adéquate du gène S. Au contraire, l'insertion du fragment HBs de pXbaHBs2 devait se révéler ne pas pouvoir être insérée dans le précédent vecteur avec conservation du cadre de lecture approprié. Il a néanmoins été utilisé comme témoin dans des expériences postérieures. Ces opérations ont été réalisées en ayant-recours à des techniques connues. En particulier les"fragments - HBs"de pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 ont été insérés au moyen d'une ligase dans l'ADN de plac5-1 qui avaient au préalable été clivés par EcoRI. Les mélanges des fragments de ADN obtenus ont été ensuite utilisés pour transfecter la souche C600RecBC rk-mk- de E. doli. Les clones de bactériophage devenus lac du fait de l'insertion des fragments MBs dans les sites EcoRI du gène lacZ sont amplifiés et puri- fiés selon la méthode décrite en (21). Les ADN des différents bactériophages ont été ex- traits et les orientations des fragments d'ADN insérés déterminées par analyse électrophorétique de leurs fragments de restriction BamHI. L'on peut ainsi déterminer que deux des dérivés des phages ÄlacHBs-1 et \lacHBs-2 correspon- dant au plasmide pXbaHBs-1 et pXbaHBs-2 contenaient un fragment HBs correctement orienté. La figure 2a est une carte schmratique du vecteur ? plac5-1, avant sa modification par le fragment HBs-1, issu du pXbaHBs-1; la figure 2c est une carte schématique d'une partie de ce même vecteur montrant la modification introduite dans son gène Z par insertion dans son site EcoRI du susdit frag- ment HBs-1; La figure 2c schématise les structures du polyéptide hybride obtenu comme résultat de l'expression du vecteur modifié de la figure 2b. L'expression a été obtenu par transfection d'une souche de bactérie de E. Coli, notamment d'une souche HfrZ lacX74. Des souches de E.coli, notamment une souche de E.coli Hfr/A lac X 74 ont été transformées par plac5-1, X lacHBs-1 et A lac HBs-2 respectivement. Après culture les cellules sont lyskes et les lysets obtenus analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (24) et les protéinss sont détectées par coloration au bleu de coomassie, On constate la présence d'une bande plus intense parmi les produits d'expres- sion de r plac 5-1 au niveau de la position correspondante, pour un témoin, à celle de la f-galactosidase (poids molé- culaire de 116 248) et d'une bande distincte parmi les produits d'expression de ? lac HBs-1 (non présent parmi les produits d'expression de AlacHBs-2) correspondant à une nouvelle protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 000-141000. Les protéines synthétisées par les bactéries trans- fectées tant par A lacHBs-1 que par Aplac5-1 sont marquées par la (35 S) méthionine. La mise en présence de ces protéines avec un sérum anti-HBsAg et la réalisation d'un autoradiogramme du gel de polyacrylamide SDS révèle la présence parmi les produits d'expression du seul ?\plac 5-1, d'une bande à laquelle ne correspond pas de bande équivalente parmi les produits d'expression des autres vecteurs. Cette bande disparaît de façon spécifique lorsque l'immunoprécipi- tation est réalisée en présence de HBsAg non marqué. Celui- ci se retrouve, lorsque l'opération d'électrophorèse susdite est effectuée en sa présence, dans la même bande que la susdite nouvelle protéine. On observe encore la même bande parmi les produits d'expression de ?lacHBs-l, lorsque l'immunoprécipitation est réalisée avec un antisérum à l'égard de la A -galactosidase. La structure présumée de la partie de protéine hybride obtenue, au niveau de la fusion entre le gène lacZ et le fragment HBs-1 résulte de la figure 2c qui fait apparaître le fragment " P-gal", correspondant à la bétagalactosidase (1005 acides aminés), le fragment HBsAg (192 acides aminés), ces fragments étant séparés par un acide aminé prolyle, cor_ respondant à une partie du "EcoRI linker" contenu dans le vecteur ilacHBs-1. Ces résultats démontrent que E.coli, ou tout autre microorganisme approprié, tel qu'une bactérie, peut être infecté par le ?lacHBs-1 et synthétiser une protéine ayant un poids moléculaire de l'ordre de 138000 et posédant les déterminants antigéniques à la fois de HBsAg et de la ( -galactosidase. Cette molécule est représentative des poly- peptides hybrides qui peuvent être obtenus par le procédé selon l'invention, dans leruel HBsAg est relié à une protéine support (résultant de la substitution partielle ou totale du fragment (- galactosidase), ces hybrides possédant néanmoins les propriétés antigéniques de HBsAg. Ces nouvelles molécules sont utiles pour la production de vaccins actifs contre l'hépatite virale B. - 2480779 Ci-après bibliographie à laquelle référence est faite dans la présente description. 1. Szmuness, W. Am. J. Path. 81, 629-649 (1975). 2. Summers, J., O'Connell, A. and Millman, I. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 72, 4597-4601 (1975). 3. Landers, T.A., Greenberg, HoD. and Robinson, W.S. Jo Virolo 23, 368-376 (1977). 4. Burrel, C.J., Mackay, P., Greenaway, P.J., Hofschneider, P.H. and Murray, K. Nature 279, 43-47 (1979)o 5. Charnay, P., Pourcel, C., Louise, Ao, Fritsch, A. and Tiollais, P. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 76, 2222-2226 (1979).o 6. Sninsky, J.J., Siddiqui, A., Robinson, W.So and Cohen, S.No Nature 279, 346-348 (1979). 7. Valenzuela, P. et al. Nature 280, 815-819 (1979). 8. Charnay, P. et al. Nuclo Acids Res 7, 335-346 (1979).o 9. Galibert, F., Mandart, E., Fitoussi, F., Tiollais, P. and: Charnay, P. Nature 281, 646-650 (1979). 10. Pasek, M. et al. Nature 282, 575-579 (1979).o 11. Vyas, G.N., Williams, E.W., Klaus, G.G.Bo and Bond, H.E. J. Immunol. 108, 1114-1118 (1972). 12. Peterson, D.L., Roberts, I.M. and Vyas, G.N. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 74, 1530-1534 (1977). 13. Hollinger, F.B., Dreesman, G.R., Sanchez, Y., Cabral, G.A. and Melnick, J.L. in Viral Hepatitis (eds Vyas, G.N., Cohen, S.N. and Schmid, R.) (Franklin Institute, Philadelphia, 1978). 14. Purcell, R.H. and Gerin, J.L. Am. J. Med. Sci. 270, 395-399 (1975). 15. Hilleman, M.R. et al. Am. J. Med. Sci. 270, 401-404 (1975). -;r -b 2480779 16. Maupas, P., Coursaget, P., Goudeau, A. and Drucker, J. Lancet, i, 1367-1370 (1976). 17. Emtage, J.S. et al. Nature 283, 171-174 (1980). 18.- Itakura, K. et al. Science 198, 1056-1063 (1977). 19. Goeddel, D.V. et al. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 76, 106-110 (1979). 20. Maxam, A.M. and Gilbert, W. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). 21. Pourcel, C., Marchal, C., Louise, A., Fritsch, A. and Tiollais, P. Molec. gen. Genet. 170, 161-169 (1979). 22. Bolivar, F. et al. Gene 2, 95-113 (1977). 23. Fowler, A.V. and Zabin, I. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 74, 1507-1510 (1977). 24. Laemmli, U.K. Nature 227, 680-685 (1970). 25. Burgess, R.R. J. Biol. Chem. 244, 6168-6176 (1969). 26. Bonner, W.M. and Laskey, R.A. Eur. J. Biochem. 46, 83-88 (1974' 27. Laskey, R.A. and Mills, A.D. Eur. J. Biochem. 56, 335-341 (1975). 28. Iwakura, Y., Ito, K. and Ishihama, A. Molec. gen. Genet. 133, 1-23 (1974). 29. Talwai, G.P. et al. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 73, 218-222 (1976). REVENDICATIONS 1 - Vecteur, notamment du type phage ou plasmide selon l'une quelconque des revendications du brevet principal, contenant au moins une partie de l'opéron lactose, plus par- ticulièrement le promoteur et le gène Z de cet opéron, ce vecteur étant caractérisé en ce qu'il est modifié pour l'in- sertion, en phase, dans un site approprié du gène Z, tel que le site EcoRI,de l'un quelconque des fragments d'ADN du brevet principal, notamment ceux contenant la plus grande partie du gène S". 2 - Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une partie du fragment d'ADN codant pour la plus grande partie de la Bgalactosidase est remplacée par un fragment d'ADN apte à coder pour toute autre molécule porteuse non immunogène, ou dont les éventuelles propriétés immunologiques, si celles-ci existent, n'interfèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant les proprié- tés immunologiques de HBsAg. 3 - Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le susdit fragment d'ADN de remplacement s'étend dans la direction de la lecture à partir du site HhaI antérieure- ment contenu dans le fragment d'ADN codant pour la plus grande partie de la 3-galactosidase. 4 - Vecteur selon l'une quelconque des revendications i à 3, caractérisé en ce que le vecteur est dérivé du plas- mide pBR322. - Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fragment inséré susdit est délimité par des extrémités EcoRI et qu'il contient un fragment originaire d'HBV DNA qui, dans celui-ci,correspond au fragment délimité par des sites HhaI et XBaI et con- tenant lui-même la majeure partie du gène S. 6 - La protéine hybride susceptible d'être codée par le fragment d'ADN inséré dans le susdit vecteur. 7 - Protéine hybride selon la revendication 6, conte- nant une séquence polypeptidique présentant les propriétés immunologiques spécifiques de HBsAg, jouxtant une séquence polypeptidique constituée par la majeure partie de la B-galactosidase. 8 - Protéine hybride selon la revendication 7, caractérisée en ce que tout ou partie de la partie galactosidase est remplacée par toute autre molécule porteuse non immunogène, ou dont les éventuelles proprié- tés immunologiques, si celles-ci existent, n'interfèrent pas avec celles de la partie peptidique présentant les pro- priétés immunologiques de HBsAg. 9 - Composition de vaccin contenant à titre de principe actif la protéine hybride selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.