S 1 2010754 10 15 20 La présente invention concerne un nouvel antibiotique, plus particulièrement un nouvel antibiotique désigné ci-après par rifamycine L, de formule développée suivante Me Me • 25 30 35 0C0CH20H Le groupe des rl&mysinsB représ ente une catégorie bien connue de substances ayant une activité antibiotique dont certaines sont préparées directement par fermentation du microorganisme Streptomyces mediterranei ATCC 13685, alors que l'on prépare beaucoup d'autres dérivés par transformation» chimique, des rifamycines naturelles. L'une des ces substances èf-, la rifamycine B que l'on prépare par fermentation dans des conditions aérobies en immersion de Streptomyces mediterranei ATCC 136ûç conjointement avec d'autres-métabolites, dont on peutlisoleï^à l'état pur comme le décrit P. Sensi dans"Antibiotics Annual" 1959-&Ç.. page 262. L'une des ^opriétés de la rifamycine B est son activa-tion en solution aqueuse, c"est-à-dire sa transformation en une autre substance avea un degré supérieur d'activité antibiotique. On peut transformer le produit d'activation appelé rifamycine S par une douce réduction en une autre substance appelée rifa-mycineSV. On a élucidé la structure de toutes des rifaniycines et cette structure afait l'objet d'une publication par W. Oppolzer dans Experientia 20» page 356 (1964). Le procédé de préparation de la rifamycine L consiste à mëfctre en contact une rifamycine qui peut être la rifamycine S ou la rifamycine SV avec le mycélium de Streptomyces mediterranei ATCC 13685 qui a une activité enzymatique ; on opère dans un mélange d'eau et d'alcanol inférieur tamponné à pH 6 - 7 69 19396 2 2010754 environ pendant 2 à 20 heures et à la température de 23-35°C. A la fin de la transformation, on sépare le mycélium par fil-tration et on ajuste le filtrat à "pH 2 environ; on l'extrait ; par un solvant non miscible à l'eau tel qu'un alcanôl infé-5 rieur non miscible à l'eau, des acétates d'alkyle, -le chloroforme, etc. On extrait à son tour l'extrait organique- avec -un tampon phosphate de pH 7-7*5 environ, et on met de côté la couche organique contenant la rifamycine S et/ou SV qui n'a pas réagi. Après acidification à pH 2,0 environ, -on extrait " 10 à nouveau le mélange par un solvant non miscible à l'eau et on effectue une chromatographie de l'extrait sur du gel de silice. t La rifamycine L est une substance cristalline de point de fusion 152-153°C. La micro-analysé donne les valeurs suivantes (moyenne de trois déterminations) : 15 Calculé pour C-^H^NO-^ (Poids moléculaire 755*83) C 61,97 H 6,53 ' N 1,85 0 29,65 Trouvé C 61,82 H 6,60 N 1,85 0 29,73 ' Le spectre UV dans le tampon phosphate de pH-7,33 montre- un maximum d'absorption À à 412 m/u , E,'r„, = 242. * max / 1cm 20 Le spectre IR dans le chloroforme montre des maxima aux- longueurs d'onde suivantes, exprimées en cm"1 s 3400, 2800, 1750, 1700, 1685, 1635* 1610, *1595, 1570, 1540, 1455, 1405, 1370 1345, 1315, 1115* 1080, 1045, 1015, 973, 9^2, 900, 845. Un essai de potentiométrie avec NâOH 0,1 N commençant 25 à pH 2,2 donne un pKMCS de 2,75 Par une hydrolyse alealine douce la rifamycine L donne la rifamycine SV et de 1'acide glycolique/ ce qui constitue ainsi une preuve de cette structure chimique. L'activité in vitro de ïa rifamycine L est importante,- : 30 et cette activité est représentée dans le tableau suivant,qui donne la concentration d'inhibition minimum en y par ml dans le cas de certaines souches représentatives. -•* Staphylococcus aureus ATCC 6538 0,02 £tem en présence de sérum bovin " ' 0;02' " 35 Staphylococcus aureus Tour 0,05 ": Streptococcus pyogenes C 203" 0,02 - % Streptococcus faecalis ATCC 10541 0,2 Diplococcus pneumoniae UC 41 0,02 ' r Mycobacterium tuberculosls ATCC 9360 0,1 69 19396 3 2010754 De même, la rifamycine L in vivo confirme sa bonne activité antibiotique. Dans l'infection expérimentale provenant de Staphylococcus aureus Tour, la IE^q en mg/kg en administration sous-cutanée à des souris est de 24,6 ( 28,8-21,1). Le com-5 posé est pratiquement exempt de toxicité. La en sous-cutané chez les souris est supérieure à 500 mg/kg. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. 10 Exemple On utilise des-tranches de gélose et de farine d'avoine ensemencées avec Streptomyces mediterranei ATCC 13685 pour inoculer 800 ml d'un milieu de eulture réparti en huit flacons Erlenmeyer et contenant" la composition suivante : 15 Extrait de boeuf 5 g Peptone 5 g Autolysat de levufre 5 g Hydrolysat de caséine enzymatique 3 g Glucose 20 g 20 NaCl 1,5 g Eau distillée complément à 1000 ml pH 7*3 ; stérilisation 15 minutes à 120°C» On procède à 1 ' incubation des flacons sur un agitateur à secousse rotatif*à 500 tr/mn et à la: température de 28 °C. Après 48 heures 25 on utilise les cultures ainsi obtenues pour inoculer 8 litres d'un milieu ayant la composition suivante réparti dans deux ffermenteurs de 10C litres : Glucose 90 g (nh4)2so4 15g 30 KHgPO^ 2 g MgS04r7H20 1 g CaCO-j .17 g Diéthylbarbiturate de sodium 2 g cuso4,5h2o 0,0035 g 35 FeSO^HgO o,01 g ZnS0^,7H20 0,05 g tenS0^,4l^0 0,004 g 69 19396 h 2010754 On ohauffe les fermenteurs à 28°C et on agite mécaniquement le milieu à 800 tr/mn, et on introduit toutes les,minutes de l'air stérile à raison de 1 litre par litre de culture. Après 48 heures, on centrifuge le mycélium qui a poussé, 5 on le lave avec une solution tampon au phosphate M/15 pH 6,5 et on le met à nouveau en suspension dans 8 litres de là même solution tampon. On ajoute à la suspension 1,6 g de rifamycine S dissous dans 80 ml d'éthanol. On laisse le produit se transformer pendant 6 heures 10 puis on sépare le mycélium par filtratipn après addition de Hyflo. On lave le mycélium à l'eau et :on mélange les eaux de lavage et le filtrat clair; on acidifie- à pH 2,0 avec HC1 et on procède à l'extraction par l'acétate d'-éthyle. On concentre sous vide jusqu'à 500 ml la solution d'acé-15 tate d'éthyle contenant différentes rifamycines et on l'extrait à nouveau avec le tampon phosphate M/15-, pH 7,38. On met de côté la solution organique utilisée contenant de la rifamycine S non transformée. On extrait à nouveau les rifamycines B, L et lesjautTBB tjipeuvent être présentes dans de l'aeétate d'éthyle 20 provenant de la solution tampon acidifiée à pH 2,0. On effectue la séparation et la purification finale de la rifamycine L par absorption de la solution concentrée sur une colonne de gel de silice de 60 cm (diamètre 6 cm) et par élution à l'acétone. 25 On recueille des fractions de 100 ml. On recueille et on concentre à 10 ml les fractions qui présentent en chroma-tographie en couche mince seulement une tache fluorescente à la lumière de Wood (Rf = 0,9, gel de silice adsorbant» Merck et solvants acétone). 30 Après addition de 100 ml d'hexane et précipitation de la rifamycine L on obtient un poids de 0,53 S après séchage. On obtient des résultats entièrement comparables en utilisant comme.matière première la rifamycine SV à la place de la rifamycine S.