t 2020074 La présente invention concerne la préservation de boissons sujettes à pollution microbienne, tel3.es que la bière, le vin, les jus de fruits et les boissons sucrées. Son but principal est de protéger ces boissons contre la pollution causée par 5 l'action de champignons ou bactéries des types généralement rencontrés dans la bière, les vins, les jus de fruits ou les boissons sucrées non pasteurisés, en les additionnant de mélanges de deux ou plusieurs agents de conservation particuliers en quantités plus faibles que celles qu'il serait nécessaire d'employer si ces 10 agents de conservation étaient utilisés séparément. L'invention englobe des procédés par lesquels ce type de développement microbien est inhibé pendant la durée qui sépare la fabrication de la boisson et sa vente au consommateur, par l'introduction dans cette boisson de deux ou plusieurs de ces agents 15 de conservation en quantités faibles, mais efficaces, de même que les boissons protégéés obtenues par cette introduction. L'invention couvre également les mélanges de deux ou plusieurs des agents conservateurs, convenant comme agents de conservation nouveaux et plus efficaces pour les boissons non pasteurisées à base 20 de malt, les vins et les autres boissons. Il est sous-entendu que les expressions "boissons à base de malt" et "bière" englobent "aie", "porter", "stout", produits de fermentation du malt et diverses espèces de bière connues sous les dénominations de "lager", "bock", ou "pilsen". 25 Les agents de conservation qui sont utilisés dans la mise en pratique de l'invention sont des esters alkyliques de l'acide para-hydroxybenzoïque (parabens) dans lesquels l'alcool estérifiant contient de 1 à 8 atomes de carbone, les esters alkyliques de l'acide gallique, dont l'alcool estérifiant contient 30 de 3 à 12 atomes de carbone, l'acide sorbique et ses sels de métaux alcalins et alcalino-terreux, en particulier ses sels de sodium, potassium et calcium. Les esters méthyliques, propyliques , et heptyliques des parabens mentionnés ci-dessus se sont révélés être les plus 35 intéressants dans les combinaisons faisant l'objet de l'invention, et sont choisis pour cela de préférence. Dans ces combinaisons, les gallates de propyle et d'octyle sont les plus inté- BAD ORIGINAL 69 34227 2 2020074 cessants, et ils sont préférés pour cet'ère raison aux autres gal-lates précédemment indiqués. Dans le cas où. on utilise deux agents de conservation, la meilleure conservation a été obtenue par l'action combinée du gallate d'oetyle et du para-hydroxybenzoate 5 d'heptyle, et c'est pour^u^i les procédés et les compositions dans lesquels l'agent/de conservation comprend ces deux composés, que ce soit ou non en présence d'acide sorbique ou d'un de ses sels non toxiques, sont les formes de réalisation préférables de l'invention. 10 Dans la réalisation pratique de 1'invention deux ou plus de ces composés sont combinés évolution puis ajoutés à la boisson avant le conditionnement. Dans le cas de la bière, la solution peut être ajoutée dans une chaîne de brasserie au moyen d'une pompe proportionnelle ou d'un distributeur à débit calibré. 15 les quantités utilisées des divers additifs sont les suivantes, selon l'invention : Pour les esters d'acide para-hydroxybenzoïque dans lesquels les alcools contiennent de 1 à 6 atomes de carbone, 10 à 150 parties par million (ppm) devront être utilisées et de préférence 15 à 50 ppm par rapport à la 20 boisson dans laquelle les produits d'addition sont introduits. Pour les parabens dont les alcools contiennent 7 ou 8 atomes de carbones la quantité à utiliser de préférence est de 2 à 6 ppiiii, Pour les gallates dans lesquels les alcools contiennent de 3 à 6 atomes de carbone, 1 à 30 ppm devront être utilisées et, de pré-25 férence, 1 à 10 ppau Pour les gallates dont les alcools contiennent de 7 à 12 atomes de carbone, 2 à 6 ppm sont préférables. La quantité utilisée d'acide sorbique et ses sels de sodium ou potassium devra être de 10 à 150 ppm et de préférence de 20 à 80 ppm. 30 In brasserie, la conservation de la bière mise en réci pient comprend habituellement la pasteurisation et/ou la réfrigération entre l'instant de la mise en récipient et la consommation finale. La bière peut être contenue dans des bouteilles, des boîtes en métal ou en carton, des tonnelets ou même des ci-35 ternes mobiles ou autres récipients, et si une réfrigération est nécessaire pendant le.transport et/ou le stockage, elle augmente la prix de revient de la bière. De plus, la pasteurisation BAJD ORIGINAL 69 3422/ 3 2020074 de la bière peut altérer son goût naturel ; elle augmente également le coût de fabrication de la bière. La conservation d'autres boissons telles que le vin, les boissons sucrées ou les jus de fruits pose des problèmes semblables. 5 Pour la bière qui ne peut pas être pasteurisée ou réfri gérée pendant 1'emmagasinement, on sait que l'on peut ajouter un agent de coie ervation chimique tel que les heptyl- et octyl-parabens soit seuls (brevet des Etats-Unis d'Amérique 'ET0 3 175 912) soit associés avec un bromacétate de benzyle ou certains composés 10 biguanidiques (brevet des Etats-ïïais d'Amérique N° 3 389 999). L'addition à la bière d'esters d'autres acides hydroxy-benzox-ques a également été étudiée (M. Loncin, "Le Petit Journal du Brasseur", 410-13 et 427-431). En général, la bière contenant un agent de conservation 15 aura une durée de conservation d'environ cinq à six mois, c'est-à-dire que le produit fini pourra être emmagasiné à la température ambiante pendant cette période de temps sans qu'aucun effet nui-sible&affecte le goût, l'arôme, la limpidité et les propriétés moussantes de la bière. Dans,la conservation d'autres boissons, 20 il est également nécessaire de maintenir le goût, l'arôme et la limpidité désirables et- une durée de conservation importante. Pour obtenir ce degré de protection, les parabens ont été ajoutés à la bière et à des boissons similaires à des concentrations allant de 200 à 2000 parties par million quand l'alcool avait 1"à 6 atomes 25 de carbone et 10 à 20 parties par million quand l'alcool contenait 7 ou 8 atomes de carbone. Pour ce dernier type d'esters de l'acide gallique, 10 ou plus de 10 parties par million ont été utilisées comme agent de conservation. Pour l'acide sorbique et/ou ses sels de métaux alcalins, 300 à 400 parties par million 30 ont été utilisées. Malheureusement, la présence de ces produits en grandes quantités, comme indiqué, a fréquemment provoqué des changements indésirables dans le goût et les autres caractéristiques de nombreuses boissons, et en particulier dans la bière en boîte et en bouteille. 35 La présente invention diffère de ces procédés par le fait qu'on ajoute à la bière non pasteurisée ou à une autre boisson nécessitant un agent conservateur, un ou plusieurs esters 69 3422/ 4 2020074 d'acide gallique et/ou un ou plusieurs esters d'acide para-hydroxybenzoïque en quantités plus faibles qu'il conviendrait de le faire, pour l'un ou l'autre de ces agents de conservation utilisés seuls ; et pour certaines boissons, on ajoute en supplément 5 une quantité relativement faible d'acide sorbique ou d'un de ses sels non toxiques. Par ce procédé, la bière ou une autre boisson est protégée contre la pollution microbienne pendant le temps souhaité, en même temps que les changements de goût et d'autres caractéristiques ci-dessus mentionnées sont évités. Si --ssoin est, 10 une petite quantité d'hydroxytoluène butylé de l'ordre de 1 à 8 parties par million, de préférence 2 à 6 parties par million, peut également être ajoutée . ce composé se comporte comme un antioxydant améliorant la conservation de la couleur et de la limpidité de la boisson, et, pour certaines boissons, renforce l'action 15 de conservation de la combinaison des agents de conservation. Pour illustrer la façon dont ces composés sont utilisés en combinaison, des solutions-mères concentrées de chacun d'eux peuvent être fraîchement préparées dans l'alcool, le propylène-glycol, la glycérine ou dans un autre solvant convenable sous forme 20 de solutions individuelles des agents chimiques, ou sous forme de solutions combinées, puis ajoutées à la boisson pendant sa fabrication par addition quantitative dans la conduite au moyen d'une pompe proportionnelle ou d'un distributeur à débit calibré. Les exemples suivants illustrent l'efficacité comparée 25 de certains des composés de conservation seuls ou en combinaisons. Sauf indication contraire , toutes les bières de ces exemples sont des bières pasteurisées. Ces bières sont inoculées avec des cultures pures,.manipulées de façon aseptique et lavées de bactéries ou de levures polluantes de la bière, immédiatement après que 30 les composés d'addition ont été introduits soigneusement dans les bouteilles de bière. Tous les échantillons sont mis à incuber à 28°C, ce qui est proche de la température optimale de croissance des organismes souillant la bière Les échantillons sont examinés chaque semaine en vue d'une estimation visuelle du développement 35 microbien, et lorsque ce développement est constaté, on le confirme par un examen microscopique, et/ou en faisant des numérations approchées sur lame pour établir que le trouble est causé par des 69 34227 5 2020074 organismes et qu'une multiplication cellulaire importante est produite. les bières utilisées dans les exemples sont toutes des bières totalement fermentées qui ne contiennent qu'environ 5 0,05 % de sucres fermentescibles, à l'exception des cas où l'on a ajouté du glucose stérile aux bières totalement fermentées pour accroître la quantité d'hydrates de carbone fermentescibles, comme dans les bières additionnées de sirops de sucre ou dans les bières incomplètement fermentées. les organismes utilisés pour inoculer 10 les bières pasteurisées sont ceux qui constituent les bactéries ou les levures contaminantes rencontrées le plus souvent dans les boissons à base de malt souillées telles que la levure sauvage N° 21 du genre Saccharomyces, Saccharomyces disstaticus, levure sauvage N° 1, Pediococcus cerevisiae. et Lactobacillus 15 pastorianus. Sur les tableaux, la densité finale de l'inoculum se rapporte à la densité des cellules dans la bière lorsque l'inoculation est terminée. Les densités approximatives des inoculum ont été estimées par des lectures néphélométriques concernant 20 des suspensions plus concentrées, comme délimité sur une courbe étalon calibrée, ou en utilisant des chambres de numération. Des numérations sur plaque ont été effectuées pour établir de façon plus précise la densité initiale réelle de cellules viables, à l'instant de l'inoculation. 25 Sur la base des valeurs concrètes données dans les exem ples et d'autres observations de l'efficacité de la combinaison de deux ou plusieurs des composés de conservation selon l'invention, on peut conclure que des concentrations étonnamment faibles de ces composés peuvent être utilisées en toute sécurité pour 30 la conservation de boissons et en particulier pour la conservation de boissons à base de malt, telles que la bière. Donc, une composition contenant deux ou plusieurs des agents de conservation préférables, tels que le gallate d'octyle et le p-hydroxybenzoate d'heptyle, dans les proportions relatives souhaitées pour la 35 bière, peut 'être vendue comme produit industriel nouveau. Une composition efficace de cette catégorie contient : 69 34227 6 2020074 1 partie en poids de gallate d'octyle 1 partie en poids de p-hydroxybenzoate d'heptyle 5 parties en poids de p-hydroxybenzoate de prcpyle 5 parties en poids d'acide sorbique ou d'un de ses 5 sels. Ce produit doit être ajouté à la bière ou une autre boisson dans un rapport en poids de l'ordre de 30 à 100 parties par million de l^bière ou de la boisson. D'autres combinaisons de ces constituants peuvent être utilisées selon la nature de la boisson qu'il faut 10 conserver. Dans les exemples suivants, toutes les concentrations des agents de conservation sont exprimées en parties par million de la boisson à laquelle les agents de conservation sont ajoutés. Exemple 1 15 - Saccharomyces diastaticus est une levure sauvage rencon trée au voisinage des brasseries,qui est particulièrement nuisible aux boissons à base de malt mises en récipients qui ont été complètement fermentées avec une levure d® brasserie et auxquelles aucun sirop n'a été ajouté au départ. Cette levuer est capable 20d'hydrolyser la dextrine de faible poids moléculaire, en libérant ainsi suffisamment de sucre supplémentaire dans la bière pour qu'elle puisse alors se développer et causer une souillure dans des conditions qui ne conviendraient pas au. développement d'autres levures sauvages ou des levures de brasserie. 25 Des échantillons de bière pasteurisée ont été inoculés avec des cellules de ce micro-organisme, avec ou sans addition de glucose et/ou d'un seul ou plusieurs.agents de conservation utilisés dans la mise en oeuvre de l'invention, et ont été mis à incuber et examinés. Le tableau I suivant montre l'action de conser-30vation obtenue Dans la plupart des cas, les résultats sont la moyenne de plusieurs essais» * tel a m SD H- cf-(d 4 B (Dx 01 O h M % CD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Essai N° 0,05 0,5 0,05 0,05 0,5 0,1 0,05 0,1 0,5 0,05 0,3 0,3 i pucre fermentescible, % 25 20 25 100 100' 30 55 30 30 25 60 60 i JDensité finale de l'inoculum, en cellules/ml 10 10 10 8 5 5 6 4 4 teallate d'octyle -£>• -Ê- O t Heptyl paraben O ^Propyl paraben 4^ O Hydroxytoluène butylé (HTB) vj1 O !&cide Sorbique ou sorbate de sodium 1 G-allate de propyle ro ro -»• 'ro m o v» ro ro —« m m w u tri m ro i Stabilité, en semaines 4=» O en \ Temps de ^pollution, en semaines cr- UJ ■t* hO NJ hO O K> O O 69 34227 8 2020074 Exemple 2 La levure sauvage N° 1 est semblable à Saccharomyces diastaticus mais a un mode d'action différent sur les divers types de bière qu'elle peut souiller, et a aussi une sensibilité 5 différente aux agents chimiques de conservation en général, et en particulier aux nouvelles combinaisons d'agents de la présente invention. Par exemple, elle est assez résistante à l'heptyl-paraben utilisé seul. Les échantillons de la bière non pasteurisée de l'exemple 10 1 ont été inoculés avec cette levure et ont été mis à incuber et examinés de la même façon, en donnant les résultats suivants : * tel CD 01 » h' C+" (D 4 B t (IX m % ta 00 o & H H 5 (D Essai N° v 0,05 0,05 0,5 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,5 0,5 0,3 0,3 Sucre fermentescible, # 10 100 10 10 100 55 10 100 10 100 60 55 Densité finale de l'inoculum en cellules/ml -f* ■£>. VJI O O G-allate d'octyle 10 10 4 4 Heptyl paraben 20 . 20 40 Propyl paraben un VJI HTB 50 50 Acide sorbique ou sorbate de sodium VJI U1 G-allate de propyle M M ^ ^ ro -*■ ->■ CT\ OOro-]V>l|\jVJl Stabilité, en semaines -*■ ro -- -*■ Temps de pollution, en semaine 5 6 I h O >o eu ■fc* K> K) "^1 vo K) O K) O O ^4 69 34227 2020074 Exemple 5 La levure sauvage du genre Saccharoayces est une levure sauvage typique rencontrée au voisinage deB brasseries et dans la bière souillée, capable de fermenter les mono-, di-, tri- et 5 tétrasaccharides, mais non les dextrines de masse moléculaire supérieure. Pediococcus et Lactobacillus sont des bactéries typiques de pollution de la bière. Lorsqu'on a ajouté les mélanges conservateurs de l'invention à des échantillons de bière inoculés avec ces micro-organismes, les essais ont donné les résultats 10 suivants : S o o VJI VJI VJI O sa VJI o o o VJI VJI VJI O VJI à> o o VJI VJI VJI o vji hd fcH P P m c+ 0 4 H- 1 en V>1 Vjj o v>j o o o O o o o ro ro o o VJI VJI O O VJI VJI -P* -P=» ro o o Ch v^ * * o o ct- o a" P o H-H H P CQ O cd 4 (d cq H-P cd CD P-H-O O O o o c cq CQ Pi M P P O O. 0*5 CD ïï 4 O o cd en cd e cd cq P I otj cd ro rv> vu o ro o o o o o o o o o ro v>i o o ro o o o o o ro o ro ro o o & * o VJI VJI O O VJI VJI E> o VJI VJI VJI VJI VjO O -p» ro o o o~> IM -P* -P>- cri o o ^ v» o * * o VJI O * * ro ro Sucre fermentescible, # p p £ S ° £ •• (D\ Densité finale de l'inoculum, en cellules/ml Gallate d'octyle Heptyl paraben Propyl paraben Acide sorbique ou sorbate de sodium G-allate de propyle Stabilité, en semaines Temps de pollution, en semaines h h O sO LU NO hO ^4 NO O K) O O 69 34227 12 2020074 Exemple 4 Une culture contenant des quantités approximativement égales des micro-organismes suivants a été préparée et ajoutée à des échantillons de bière non pasteurisée contenant 0,3 de sucre 5 fermentescible, aux densités finales indiquées. Les micro-organismes étaient : Saccharomyces diastaticus Levure sauvage N° 1 S. Carlsbergensis 10 Lactobacillus pasterianus Pediococcus cerevisiae Les échantillons ont été ensuite mis à incuber et périodiquement examinés. L'essai a été arrêté après vingt-trois semaines, au bout desquelles il était évident que tous les échantillons 15 étaient restés en bonne condition. Dans le tableau suivant, chacun des résultats représente la moyenne de plusieurs essais. TABLEAU IV —1 o H h a H \ CQ (D CD s a h CD o 3 d !—1 •H Ci ci H H "P 0) CD S O o! œ O & ,a CT* CQ ci o o 03 cû •H CQ •H — ?H k & CD •> CD nd es oJ T* V(D Cj d) O •P -H VD CD 1 03 CD •H 03 += -p H H -P H a •h a cfl >5 CD Ctf •H (D ra 3 H P X) ,J2 ' & CD 3 H rH O •H M 05 CD 3 05 U O O 4° S O o K pm «S CQ m (D 6 6 6 30 30 23 60 6 6 30 30 23 60 5 5 40 • 23 6934227 „ 2020074 Exemple 5 Des échantillons de jus de pomme inoculés à des densités de 6 cellules/ml avec les trois levures et 2 bactéries de l'exemple 4» ont été mis à incuber et périodiquement examinés pendant 5 87 jours, comme le montre le tableau V. TABLEAU V JUS DE POMME 1 o •5 H - ^ H \ m m h © d a •d H © o 3 3 d H •rf o © H ci ci , © "3 i-i h i—) -p (s © d o CS (D O ,n Û a1 m a S o O rf co •H © •H Ci » h U ,£> (D a as h «d vd © a pi o -p xd (d i l £q © •ri -p -p h h p rH •h s cd !>> © 0} •H m d h -p o. *CJ fi ci h i—l a o •h 14 CS © d d u o o -p n o ci? - w a-1 «î m 03 6 1 6 4 4 20 20 87* 6 6 6 50 30 87* 6 5 5 40 54 60 4 4 20 20 16 60 6 6 50 30 87* 60 5 5 40 8 200 5-1/2 5-1/2 27 27 g 2** 200 5 5 24 24 92#*» 200 4 4 20 20 4** | *Dans les 7 premiers cas, l'expérience a duré 87 jours. **Les 3 derniers exemples-'correspondent à des essais faits à une autre période ; ils ont été arrêtés à 92 jours. 69 34227 14 2020074 Exemple 6 Des échantillons de jus de raisin inoculés avec les 3 levures et 2 bactéries de l'exemple 5» à. une densité d'inoculum de 6 cellules/ml, ont été mis à incuber et examinés périodiquement pendant 87 jours» comme le montre le tableau VI. TABLEAU VI JUS ' DE*' '"RAISIN 1 o 5 H ? 'É r-1 * m © d a tS i—1 © o 3 3 S H •H o © H ri ri © ti 1-5 H H -P © © S O cG © O ,£> & 0 ri O O cfl CO •H • © "H — h !H fO © •d n) 03 fn XD © P o +3 vi) © l 1, 03 © •H -P -P i—l H +3 H 4=1 S "'al -S* t» « 0] «H cq 3 H -P Pi ,Q .o s d H P O •h m © s CS h o o -p P) O CÎJ K 6 1 6 4 4 20 20 87* 6 6 6 30 30 87* 6 5 5 40 72 60 4 4 20 20 46 60 6 6 30 '30 87* 60 5 5 40 50 — ♦Terminé au bout de 87 jours. 69 34227 15 2020074 - revendications - 1. Procédé d'inhibition de la pollution de boissons susceptibles d'attaque microbienne, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter à ces boissons, en quantités convenables 5 pour la conservation, un mélange d'au moins 2 composés dont chacun est choisi dans un des différents groupes que constituent (1) des esters alkyliques de l'acide gallique dans lesquels le groupement alkyle contient de 3 à 12 atomes de carbone, (2) des esters alkyliques d'acide para-hydroxybenzoïque dans lesquels le groupe- 10 ment alkyle contient de 1 à 8 atomes de carbone, et (3) l'acide sorbique et ses sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux, les quantités nécessaires à la conservation étant choisies dans les gammes suivantes : 1-a de 1 à 30 parties par million quand le groupement alkyle du gallate d'alkyle contient 3 à 6 atomes de carbone, 1-b de 2 à 6 parties par million quand le groupement alkyle du gallate d'alkyle contient de 7 à 12 atomes de carbone, 2-a de 10 à 50 parties par million quand le groupement alkyle de l'hydroxybenzoate d'alkyle contient de 1 à 6 atomes de carbone, 2-b de 2 à 6 parties par million quand le groupement alkyle du p-hydroxybenzoate d'alkyle contient de 7 à 8 atomes de carbone, 3. de 10 à 150 parties par million d'acide sorbique ou de l'un de ses sels. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on ajoute moins de 30 ppm de gallate de propyle ou 6 ou 30 moins de 6 ppm de gallate d'octyle ou un mélange de ceux-ci, et on ajoute également moins de 50 ppm de p-hydroxybenzoate de propyle ou 6 ou moins de 6 ppm de p-hydroxybenzoate d'heptyle ou un mélange de ceux-ci. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait 3C5 qu'on ajoute aussi moins de 150 ppm d'acide sorbique ou de l'un de ses sels. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, carac15 20 25 69 34227 16 2020074 térisé en ce que la boisson est une boisson à base de malt et/ou de céréales. 5. Composition destinée à la conservation de la bière, caractérisée par le fait qu'elle consiste en un mélange de gallate 5 d'octyle et de p-hydroxybenzoate d'heptyle. 6. Composition destinée à la conservation des boissons, caractériséqfesr le fait qu'elle consiste en un mélange de 1 partie en poids de gallate d'octyle, 1 partie de p-hydroxybenzoate d'heptyle, 5 parties de p-hydroxybenzoate de propyle, et 5 parties 10 d'acide sorbique ou d'un de ses sels. 7. Boissons protégées contre la pollution au moyen du procédé selon l'une des revendications 1, 2 et 3.