Perfectionnements relatifs à un agent protéolytique, procédé d'hydrolyse de protéines et produits obtenus. Le domaine des procédés d'hydrolyse de pro- téines peut être subdivisé en procédés d'hydrolyse de protéines dans lesquels la présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé n'a aucune importance, ainsi qu'en procédés d'hydrolyse de protéines dans lesquels la présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est à exclure. Parmi la première des catégories précitées, on peut mentionner, par exemple, l'hydrolyse de pro- téines effectuée au cours d'un procédé de lavage et d'un procédé de dépilage. Aucun effet néfaste n'est exercé si l'activité protéolytique est toujours pré- sente dans la solution de lavage ou de dépilage au terme de l'hydrolyse des protéines. Parmi la deuxième des catégories précitées, on peut mentionner, par exemple, l'hydrolyse de pro- téines effectuée sur des protéines végétales, par exemple, des protéines de soya, afin d'obtenir un hydrolysat de protéines végétales ayant de meilleures propriétés fonctionnelles, par exemple, comme décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique no 4.100.024 et 4.100.151, l'hydrolyse de protéines ef- fectuée sur des protéines animales, par exemple, la fraction hémolysée des globules rouges du sang en vue d'obtenir un hydrolysat de protéines animales ayant de meilleures propriétés fonctionnelles, par exemple, comme décrit dans le brevet belge n0 873.932, de même que l'hydrolyse de protéines que l'on appelle "traitement de protection contre le froid" et que l'on applique à la bière, par exemple, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 3.366.483. Si une activité protéolytique est toujours présente au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envi- sagé dans les procédés d'hydrolyse de protéines dé- crits ci-dessus, le degré d'hydrolyse augmente au- delà de la valeur maximale préférée, si bien que l'on peut obtenir des produits de goût amer ou que l'on peut voir apparaître d'autres inconvénients. C'est la raison pour laquelle l'activité protéolytique doit être inactivée lorsque le degré d'hydrolyse envisagé est atteint. Cette inactivation est habituellement effectuée par un traitement thermique mais, malheureu- sement, ce dernier peut s'accompagner d'une dénatura- tion inopportune de certaines protéines ou de certains hydrolysats de protéines, ce qui, à nouveau, peut altérer sérieusement les propriétés fonctionnelles des protéines ou des hydrolysats de protéines. La présente invention concerne exclusivement la deuxième des catégories précitées de procédés d'hy- drolyse de protéines. Comme on le constate d'après l'exposé ci- dessus, il est nécessaire de trouver un agent protéo- lytique que l'on utilisera dans des procédés dthydro- lyse de protéines dans lesquels la présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est à exclure, la sta- bilité thermique de cet agent étant inférieure à celle des agents protéolytiques connus utilisés à cet effet, tout en étant cependant suffisamment faible pour assu- rer une inactivation complète par un traitement ther- mique modéré ne dénaturant aucune protéine,ni aucun hydrolysat de protéine dans le mélange réactionnel, tandis que toutes les autres caractéristiques de l'agent protéolytique doivent au moins rester inalté- rées. Le premier aspect de l'invention concerne un agent protéolytique destiné à être utilisé dans des procédés d'hydrolyse de protéines dans lesquels la présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est à exclure, cet agent protéolytique étant une sérineprotéase de Bacillus qui est acylée au moyen d'un agent d'acyla- tion,pour obtenir une sérineprotéase de Bacillus désta- bilisée. Certaines combinaisons de sérineprotéase de Bacillus spécifiques et d'agents spécifiques d'acylation ne donnent pas des sérineprotéases de Bacillus déstabi- lisées. GrAce aux procédés décrits ci-après dans la présente spécification, on peut aisément découvrir si une sérineprotéase de Bacillus spécifique est déstabili- sée ou non au moyen d'un agent d'acylation spécifique. De façon étonnante, suivant l'invention, on a trouvé que la stabilité thermiques des sérineprotéases de Bacillus était fortement réduite par l'acylation. C'est là une constatation surprenante; en effet, d'après "Agric. Biol. Chem." 41 (11), 2163-2168 (1977), il appa- raît que l'acétylation du blanc d'oeuf provoque une stabilisation thermique. De même, de façon étonnante, on a constaté que les sérineprotéases de Bacillus acylées possédaient une cinétique d'hydrolyse qui est identique à celle des sérineprotéases de Bacillus non modifiées et que le pro- duit d'hydrolyse de protéines, obtenu au moyen des séri- neprotéases de Bacillus acylées, ne pouvait être distin- gué des produits d'hydrolyse de protéines obtenus au moyen des sérineprotéases de Bacillus non modifiées. Certaines sérineprotéases de Bacillus qui sont acylées à un degré spécifique d'acylation, sont décrites telles quelles (voir, par exemple, "Carls- bergRes. Commun.", volume 41, N 5, 1976, pages 242 et suivantes, en particulier, pages 243 et 244 o l'on décrit la succinylation,la glutarylation et la maléylation de la subtilisine Carlsberg et de la subtilisine BPN'; voir également le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3. 886.042). Toutefois, il n'est pas stipulé que dessérineprotéases de Bacillus acylées possèdent une thermolabilité supérieure à celle des sérineprotéases de Bacillus non traitées. Ltactivité protéolytique est mesurée en unités Anson et elle est déterminée suivant la mé- thode modifiée d'Anson décrite dans "NOVO ENZYME INFORMATION IB"t n 058 e-GB (la méthode originale dtAnson est décrite dans "J. Gen. Physiol.", 22, 79-89 (1939)). La sérineprotéase de Bacillus peut être ob- tenue à partir de B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus, ainsi qu'à partir des espèces Bacillus décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique-n 3.723.250. Etant donné que la présente invention con- cerne une déstabilisation thermique réglée dessérine- protéases de Bacillus, on donnera ci-après une certaine élaboration des techniques adoptées pour mesurer la stabilité thermique et quantifier la ré- duction de cette dernière, c'est-à-dire la déstabi- lisation, celle-ci étant exprimée en C. Pour une meilleure compréhension, on se référera à B. Stevens, "Chemical Kinetics", Londres, Chapman & Hall, 1961. La stabilité de l'enzyme est évaluée en la soumettant à un traitement thermique après dilution dans un tampon de phosphate 1/15M à un pH de 7,5. -Si l'on effectue le traitement thermique à deux tempé- ratures différentes T1 et T2, les paramètres thermo- dynamiques A et E peuvent être calculés au moyen des équations d'Arrhenius: E k =A.e RT1 E k2 A. e RT2 oit R est la constante dle -az ( 8,31 J) x C -1 x mole), T inclique la tc:lill)lp'ature: alsetlt ( K), A est le facteur pré-expolientiel ou lte l'.tettrl e té ú-(uenceJ E indilque l ' énergie d' activation pour' Le procédéé cinactivation tiel'rmilltue ((quli)pettt' explrimle en caLoPi. es/mol se'), t andis qule k iiici elia cols(tilte de vitesse pou' 1 il;lactiv;ation ItUl'miqlu(e si i(binl qute, dans lîhypothèse( cltune courbe dlaúfaibtiss emext lu premier ordre p leur k peut 0tre calculée par la formule suivante I a - a o t t, d4ns laquelle a et at indi.quent l1 tactivité de pro- téase en unités Anson rapportécs à -la mi,,mle quantité respectivement avant et après le trxaitement tlhermique au cours dlu laps de temps t (qui peut atre exprimé en minutes). En résolvant les deux équations d'Arrhenitus ci-dessus> on peut calculer les valeurs E et A con- formément aux équations suivantes E =( T - 1)-1 R lin i T2 I2 Ak1 * 1,, - 1 A=!k. e '', -i 1 Si la constante 1de vite(sse k ce 1 lenzymelie naturelle est calculée pour unlle température (le 600C (température (le référence TR)- et si l'on détermine les valeurs A et E pour l'enzyme modlifiée coni'ormément aux équations in(liquées ci-dlessus, la température TD à laquelle l'enzyllme,,,diit'ide est iàlativt- a I.L même vitesse que cel le:à lacqutelle l enzyvit, zl.tt tl', l i. 4.t t inactivée à la température TRef,l peut tre' calculée par l'équation suivante: T = E D R ( lnA - lnk) La déstabilisation de l'enzyme modifiée est définie par (TRef - TD) oc. Sauf indication contraire, toutes les va- leurs de déstabilisation mentionnées dans la présente spécification sont mesurées à un pH de 7,5, étant donné que les résultats de la mesure de la déstabili- sation dépendent du pH. Le traitement suivant l'invention peut s'ac- compagner d'une perte d'activité suivant l'agent d'acylation utilisé et suivant la quantité dans la- quelle ce dernier est appliqué. On a trouvé que, pour des raisons économiques, la déstabilisation ne devait pas être effectuée au-delà du stade correspon- dant à une perte d'activité d'environ 50%, de préfé- rence, d'environ 30%, mieux encore, une perte d'acti- vité inférieure à 10%. Toutefois, le traitement sui- vant l'invention peut également s'accompagner d'un important accroissement d'activité. On enregistrera une perte ou un accroissement d'activité en fonction de l'agent d'acylation spécifique utilisé et du degré d'acylation. Dès lors, lorsqu'on emploie l'anhydride acé- tique comme agent d'acylation, on observe une perte d'activité, en particulier, au cours des derniers stades dtacylation. Toutefois, lorsqu'on utilise l'anhydride succinique ou l'anhydride maléique comme agent d'acylation, on observe un accroissement d'ac- tivité. Avec l'acide butyrique, on n'observe ni une perte, ni un accroissement d'activité, tandis que l'on peut obtenir une déstabilisation de 50C seulement, cependant qu'avec l'anhydride acétique, on observe une importante perte d'activité, tandis que l'on peut obtenir une haute déstabilisation, par exemple, d'en- viron 150C Dans une application préférée de l'agent protéolytique suivant l'invention, lasérineprotéase de Bacillus est la subtilisine Carlsberg. La subtilisine Carlsberg peut être modifiée en une enzy- me déstabilisée avec une déstabilisation très élevée sans aucune perte d'activité, en particulier, par maléylation. Ce produit modifié est parfaitement ap- proprié pour l'hydrolyse des protéines. Selon une autre application préférée de l'agent protéolytique de l'invention, l'agent dlacy- lation est un dérivé actif de l'acide maléique. Grâ- ce à cet agent dlacylation, pratiquement toutes les sérineprotéases de Bacillus peuvent être modifiées en dérivés fortement déstabilisés. Dans une application préférée de l'agent protéolytique suivant l'invention,- l'agent d'acyla- tion est un dérivé actif d'un acide monocarboxylique contenant 1 à 6 atomes de carbone. Cet agent protéo- lytique est parfaitement approprié pour l'hydrolyse des protéines. Dans une autre application préférée de lla- gent protéolytique suivant l'invention, on effectue l'acylation juste au degré d'acylation auquel il ne se produit aucune déstabilisation complémentaire. On a constaté qu'un degré d'acylation croissant s'accom- pagnait dtune plus forte déstabilisation jusqu'à un certain degré dtacylation à partir duquel on ne peut plus obtenir aucun accroissement complémentaire de déstabilisation. De même, on a trouvé que, pour cer- tains agents d'acylation, un degré d'acylation crois- sant s'accompagnait d'une plus forte perte d'activité. En conséquence, on obtient habituellement le meilleur produit global lorsque l'acylation est effectuée juste au degré auquel il ne se produit aucune déstabilisa- tion complémentaire. f t Le deuxième aspect de l'invention concerne un procédé d'hydrolyse de protéines dans lequel la présence d'une activité protéolytique au termnie de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est pro- hibitive, l'hydrolyse des protéines étant effectuée au moyen de l'agent protéolytique constituant le pre- mier aspect de l'invention. Afin d'évaluer la stabilité chimique des dé- rivés, on a soumis un concentrat di"ALCALASE" (marque commerciale déposée) à une maléylation, à une citra- conylation et à une diméthylmaléylation d'une manière analogue à-celle des procédés de déstabilisation dé- crits dans les exemples ci-après. Seuls les dérivés ayant subi la maléylation et la citraconylation ont été déstabilisés avec une déstabilisation denviron C. On a traité ces deux dérivés avec des tampons de phosphate contenant de l'hydroxylamine 2M à un pH de 5, 7 et 9 pendant 24 heures à environ 25 C. On a constaté que seul le dérivé soumis à la citraconylation et traité à un pH de 5 récupérait sa stabilité initiale. Cette découverte concorde avec le fait que les groupes a-amino et E-amino sou- mis à la citraconylation dans les protéines sont plus labiles vis-à-vis des acides que les groupes a-amino et F-amino ayant subi la maléylation. Si la désta- bilisation est due à llestérification des chaînes latérales tyrosyle, séryle et thréonyle, le traitement à lthydroxylamine à un pH de 9 doit rétablir la sta- bilité initiale, ce qui n'est toutefois pas le cas. Llagent protéolytique et le procédé d'hydro- lyse de protéines suivant l'invention seront illus- trés par les exemples ci-après dans lesquels les exem- ples 1-8 illustrent llagent protéolytique suivant l'invention, les exemples 8 et 9 illustrant le procé- dé d'hydrolyse de protéines suivant l'invention. Dans certains de ces exemples, la matière de départ est un concentrat de subtilisine Carlsberg qui est un concentrat d'"ALCALASE" (marque commerciale déposée). On prépare ce concentrat au moyen d'une souche de B. licheniformis. Le procédé général de fabrication est donné dans le manuel "Enzymer hvorfor det ?" de Knud Lundberg, 1972, page 108. La poudre indiquée à la ligne 15 est le concentrat dI"ALCALASE"T (marque commerciale déposée). La prépa- ration d'un concentrat analogue d"'ALCALASE" (marque commerciale déposée) est décrite à l'exemple 1 du bre- vet belge n 877.435 ou dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.723. 250, colonne 12, lignes 9-16 o la poudre indiquée à la ligne 16 correspond au con- centrat d'"ALCALASE" (marque commerciale déposée). Le concentrat d'"ALCALASE" (marque commerciale dépo- sée) est un produit intermédiaire de la protéase ven- due dans le commerce sous le nom de la marque commer- ciale "ALCALASE" (voir, par exemple, le brevet bri- tannique n 1.362.365 ou le brevet des Etats-Unis d'Amérique nQ 4.106.991 o l'on décrit la préparation dI"ALCALASE" avec un concentrat d"'ALCALASE" (marque commerciale déposée) comme matière de départ). Exemple 1 On met 10 g d'un concentrat d"ALCALASE" (marque commerciale déposée) d'une activité protéo- lytique de 10,3 unités Anson/g en suspension dans 250 ml d'un tampon de phosphate O,1M à un pH de 9,5. A la suspension ainsi obtenue, pendant 50 minutes, on ajoute goutte à goutte une solution de 2,5 g d'anhydride maléique dans 12,5 ml de tétrahydrofuran- ne. Au cours de cette addition goutte à goutte, on maintient le pH à une valeur constante de 9,5 au moyen d'un pH-stat avec du NaOH 4N. La consommation de la base est de 11,3 ml. On précipite ensuite la protéase ayant subi la maléylation par addition de g de (NH4)2S04 et, en même temps, on règle le pH à 7,5. Par filtration avec 5 g de terre d'infusoires, on sépare la protéase précipitée ayant subi la maléy- lation, puis on la sèche. Le rendement en produit séché d'une activité de 7,8 unités Anson/g est de 16,4 g. Dès lors, le rendement d'activité est d'en- viron 124%. En vue de déterminer l'activité et la stabi- lité thermique, on prépare des solutions d'une protéa- se non traitée et d'une protéase ayant subi une maléy- lation de telle sorte que ces solutions contiennent environ 0,2 unité Anson/l dans un tampon de phosphate 1/15M à un pH de 7,5. On soumet les échantillons ainsi dilués de la protéase ayant subi la maléylation à un traitement thermique à 45 et 50 C respectivement pendant 30 minutes, tandis que l'on soumet liéchan- tillon de la protéase non traitée à un traitement thermique à 600C et que l'on détermine l'activité résiduelle des solutions ayant subi le traitement thermique (voir tableau ci-dessous). Protéase Température Activité Déstabi- du traite- résiduel- lisatior ment thermi- le après OC que (OC) 30 minu- (tempé- tes ( %) rature de référen- ce:600C) Concentrat d"'ALCALASE" (marque 45 49,6 commerciale dépo- 18 sée) ayant subi la 50 4,2 maléylation j Concentrat d "ALCALASE" (mar- que commerciale dé- 60 74,8 o posée) non traité l Exemple 2 On utilise un concentrat d"'ALCALASE" (mar- que commerciale déposée) d'une activité de 9,4 unités Anson/g pour préparer une suspension à 4% dans un tampon de phosphate 1M à un pH de 9. Le pH de la sus- pension est d'environ 7,5. A trois portions de.50 ml de cette suspen- sion, on ajoute respectivement 0,25 g, 0,5 g et 1 g d'anhydride d'acide maléique en solution dans 1 ml de tétrahydrofuranne. On effectue cette addition pendant une heure sous le contrôle d'un pH-stat (pH: 8.5) avec du NaOH 4N. - De la même manière, à trois autres portions de 50 ml de cette suspension, on ajoute respective- ment 0,25 g, 0,5 g et 1 g d'anhydride d'acide succi- nique solide. On dilue les dérivés ainsi préparés de pro- téases, ainsi qu'une portion de référence non traitée avec un tampon de phosphate 1/15M à un pH de 7,5. Ensuite, on soumet les dérivés dilués de protéases à un traitement thermique à 50 et 55 C, tandis que l'on soumet la portion de référence diluée à un trai- tement thermique à 600C. Après les déterminations dlactivité, on calcule-le rendement dlactivité, l'ac- tivité résiduelle après le traitement thermique et la déstabilisation en C. Protéase Dosage de Rende- Traitement Activité Déstabili- l'agent ment résiduel- sation, C d'acyla- d'acti- Tem- Durée le (%) (températu- tion vité pé- (minu- re de réfé- g/g d'"AL- (%) ratu- tes) rence: 600C) CALASE" re ( c) Concentrat 0,125 134 50 30 23,8 14 dl "ALCALAS E" (marque conmmerciale déposée) 55 10 2,5 ayant subi la maléy- lation 0,25 137 50 30 6,8 10 0,9 30 15,6 0,50 114 55 10 0,6 15 Concentrat 0,125 107 50 30 85,4 4 d "ALCALASE" (marque commerciale déposée) 55 30 68,1 ayant subi la succi- nylation 0,250 109 50 30 78,9 30 54,6 30 47,8 0,500 122 13 30 15,2 Concentrat d"'ALCA- -100 60 30 64,2 0 LASEI" non traité J.' bN oo Co gN w u1 Exemple 3 On met 1 g d'un concentrat dl'ALCALASE"l (marque commerciale déposée) dlune activité de 10,1 unités Anson/g en suspension dans 10 ml d'eau ayant subi un échange d'ions, puis on filtre. On rince le filtre avec une solution saturée d'acétate de sodium et on règle le volume du filtrat à 25 ml avec une solution saturée d'acétate de sodium. Pendant environ 1 heure, à 20 ml de cette solution et à une température d'environ 50 C, on ajou- te 4 x 50 1l d'anhydride acétique. Au cours de la réaction, on règle le pH à 8-9 au moyen de carbonate de potassium solide. Ensuite, on transfère le mélan- ge réactionnel dans un flacon de mesure de 50 ml et on règle le volume à 50 ml au moyen d'eau ayant subi *un échange d'ions. On dilue des échantillons de protéase acéty- lée et de la solution de référence avec un tampon de phosphate 1/15M (pH: 7,5). On détermine l'activité avant et après le traitement thermique comme spéci- fié dans le tableau ci-après qui reprend également le rendement d'activité et la déstabilisation. Protéase Rende- ment dlacti- vité (%) Traitement thermique Tem- Du- péra- rée ture (mi- ( C) nu- tes) Activité résidu- elle après traite- ment ther- mique (%) Concentrat 71,2 45 30 49,2 17 d"'ALCALASE" 50 30 14,4 (marque com- merciale dé- posée) acéty- lé Concentrat d' "ALCALASE" (marque com- 100 60 30 60,3 O merciale dé- posée) non traité Exemple 4 On met 3 g de protéase de Bacillus pumilus d'une activité de 1,3 unité Anson/g ("NOVOZYM 226" vendu par "Novo Industri A/S", Novo Allé, 2880, Bagsvaerd, Danemark) en suspension dans 75 ml d'un tampon de phosphate O, 1M à un pH de 9. De la sortes le pH tombe à 5,9. En contrôlant le pH à 8, 5 au moyen d'un pH-stat et en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 4N, on ajoute 0,98 g d'anhydride d'acide maléique en solution dans 2 ml de tétrahydrofuranne. On effec- tue l'addition pendant 45 minutes. On abandonne le mélange pendant 15 minutes, puis on règle le pH à 7,5. Ensuite, on transfère le mélange réactionnel Désta- bili- satica, OC (tempé- rature de ré- féren- ce: 600C) - i dans un flacon de mesure de 100 ml que l'on remplit jusqu'au repère avec un tampon de phosphate 1/15M à un pH de 7,5. Ensuite, on dilue cet échantillon et un échantillon de référence correspondant non traité à l'anhydride d'acide maléique, à environ 0,2 unité Anson/l, puis on les soumet à un traitement thermi- que. - On se référera au tableau ci-dessous. Exemple 5 De la même manière qu'à l'exemple 4, on sou- met, à une maléylation, 3 g d'un concentrat d'enzyme d'une activité de 8 unités Anson/g et préparé au moy- en du micro-organisme NCIB 10309 conformément au bre- vet des Etats-Unis d'Amérique n 3.723.250. On prépare le concentrat d'enzyme de la ma- nière décrite ci-après. On amorce la fermentation à Enzyme Ren- Traitement Acti- Désta- dement thermique vité bilisa- d'acti- Tem- Du- rési- tion, vité péra- rée duelle- OC (%) ture (mi- (%) - (oC) nu- tes) Protéase de.. . Bacillus pumilus ayant 41,9 45 10 34,411 subi la ma- 50 10 4,0 léylation i '. Protéase de Bacillus pumilus non - 60 10 8,1 traitée !___L. un pH de 10,1 et, après la phase de croissance initia- le, on maintient le pH à une valeur comprise entre 8,1 et 8,35, tandis que lion maintient la température à environ 34 C. On effectue la fermentation pendant 99 heures. On soumet le bouillon de fermentation à une centrifugation, on filtre le produit surnageant dans des conditions stériles et on précipite les en- zymes par addition de Na2SO4. On soumet le gâteau de filtre à un séchage par pulvérisation pour obtenir ainsi le concentrat d'enzyme indiqué cidessus et ayant une activité de 8 unités Anson/g. On se référera au tableau ci-dessous. Enzyme Rende- Traitement Activité Déstabi- ment thermique résidu- lisation d'acti- Tem- Du- elle (OC) vité péra- rée (%) (%) ture (Mi- (OC) nu- tes) Enzyme ayant 50 30 70,8 subi la ma- 31,3 5,2 léylation 60 0,O Enzyme non traitée - 60 30 21,3 - Exemple 6 De la même manière qu'à l'exemple 4, -on sou- met 3 g d'un concentrat d"ALCALASE" (marque commer- ciale déposée) d'une activité de 10,6 unités Anson/g à une citraconylation avec 1,12 g d'anhydride citra- conique en solution dans 2 ml de tétrahydrofuranne. On se référera au tableau ci-dessous. 3o Enzyme Rende- Traitement Activité Désta- ment thermique rési- bilisa- d'ac- Tem- Du- duelle tion tivité péra- rée (%) (O C) (%) ture (mi- (oc) nu- tes) Concentrat dt"ALCALAS E"t' 45 30 20,5 (marque com- 79,2 20 merciale dé- 50 10 23,6 posée) ayant subi la ci- traconyla- tion ., Concentrat d ' ALCALAS E" (marque com- merciale dé- - 60 30 56,5 - posée) non traité Exemple 7 On dissout 1 g de subtilisine Carlsberg dans ml d'un tampon de phosphate glacé 0,1M à un pH de 9. On prépare une solution de 1,25 g d'anhydride maléique dans 10 ml de tétrahydrofuranne. Pendant 35 minutes, on ajoute 2 ml de cette solution à la solu- tion ci-dessus de subtilisine Carlsberg. On maintient le pH à une valeur constante de 9 au moyen d'un pH- stat avec du NaOH 1N (on ajoute une quantité totale de 6 ml de NaOH 11. La température réactionnelle est d'environ 5 C (bain de glace). Après un temps de réaction supplémentaire de 22 minutes à un pH de 9, on règle le pH à 7,5 avec de l'acide chlorhydrique iN, Ensuite, on ajoute 32, 5 g de sulfate dlammonium et, par filtration avec 0,58 g de kieselguhr comme adjuvant de filtration, on sé- pare l'enzyme précipitée. Après séchage dans un des- siccateur sous vide, le poids de l'enzyme est de 3,2 g. On analyse ensuite l'enzyme pour en détermi- ner l'activité et la stabilité. Les résultats obtenus sont repris dans le tableau ci-après. Enzyme Activité Traitement Activi- Désta- Uni- Ren- thermique té rési-bili- tés de- Tem- Du- duelle sation Anson/ ment péra- rée () g (%) ture (mi- ( C) nu- tes) Subtilisine Carlsberg 40 30 37 ayant subi 10,0 101 18 la maléyla12 27 tion Subtilisine Carlsberg 31,3 - 60 40 15 - non traitée Exemple 8 Cet exemple illustre la maléylation lisation de tétrahydrofuranne. sans uti- On met 100 g de concentrat d"'ALCALASE" (marque commerciale déposée) en suspension dans 2.500 ml d'un tampon de phosphate O,1M à un pH de 9,5. Ensuite, pendant environ 70 minutes, on ajoute une quantité totale de 25 g de cristaux d'anhydride maléique, Au cours de la réaction, on maintient le pH à une valeur constante de 9,5 par addition de 117,8 ml de NaOH 4N. Au terme de la réaction, on règle le pH à 7,5 au moyen de HC1 1N et on précipite l'enzyme avec 1.500 g de sulfate d'ammonium. On sépare l'enzyme par filtration avec 50 g de kieselguhr comme adju- vant de filtration, puis on la sèche dans un dessic- cateur sous vide. Après séchage, le poids de l'enzyme est de 168,3 g. On analyse ensuite l'enzyme pour en déter- miner l'activité et la stabilité. Les résultats obtenus sont repris dans le tableau ci-après. On utilise cette protéase déstabilisée pour l'hydrolyse des protéines et l'on obtient d'excellents résultats. Exemple 9 A. On prépare, en laboratoire, un hydrolysat de protéine de soya soluble isoélectrique conformé- ment aux principes décrits dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4.100.024, exemples 1 'et 2; les détails expérimentaux sont les suivants: En adoptant la technique au pH-stat, on hydrolyse 800 ml d'une suspension contenant 8% (N x 6,25) d'un produit d'isolation de protéine de soya ("Purina 500 E"t) avec une préparation de sub- tilisine Carlsberg vendue sous la marque commerciale "ALCALASE 0,6 L" (marque commerciale déposée) à un Enzyme Activité Traitement Activité Déstabi- Uni- Ren- thermique résidu- lisation tés de- Tem- Du- elle ( C) An- ment péra- rée (%) son/ (%) ture (mi- g (oC) nu- tes) Concentrat dI'ALCALASE' - (marque com- 40 20 32 merciale dé- 5,7 89 23 posée) ayant 45 12 20 subi la ma- léylation Concentrat d'"ALCALASE' 10,7 60 60 15 non traité { pH de 8. Le dosage de l'enzyme est de 20 unités Anson/kg de substrat et la température est de 40 C. On-enregistre la consommation de la base au cours de l'hydrolyse et on utilise la valeur obtenue pour tracer la courbe d'hydrolyse comme décrit par Adler- Nissen et Sejr Olsen, "ACS Symposium Series", n 92, pages 125146, "Functionality and Protein Structure" 1979 (que l'on désignera plus brièvement ci-après par "référence Il'). Lorsqu'on atteint un degré d'hydro- lyse de 10%, on ajoute de l'acide malique à un pH de 4. Après 30 minutes à 50 C et à un pH de 4 (pour assurer ltinactivation complète de l'enzyme), on sou- met la suspension à une centrifugation à 3.000 x g pendant 15 minutes, puis on filtre le produit surna- geant et on le traite au carbone à un pH de 5 (régla- ge du pH avec NaOH) comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4.100.024. Lthydrolysat définitif fait l'objet d'une évaluation organolepti- que par des personnes expérimentées dans deux groupes différents de conditions: a) 4% (N x 6,25) et pH de 6,5 b) 3% (N x 6,25), pH de 4,5 et 8% de sucrose. On constate que le premier groupe de condi- tions est optimum pour l'évaluation de l'amertume (référence I), tandis que les conditions du deuxième groupe imitent une boisson non alcoolisée enrichie de protéines et constituent des conditions optimales pour évaluer la qualité générale de l'hydrolysat. B. On effectue une hydrolyse comme décrit dans la partie A du présent exemple, avec cette ex- ception qu'au lieu de 1"ALCALASE 0,6 L", on utilise la subtilisine Carlsberg déstabilisée de l'exemple 3 en une dose de 15 unités Anson/kg de substrat. En pratiquant les évaluations organolepti- ques décrites dans la partie A du présent exemple, on constate que lthydrolysat obtenu dans cette partie B du présent exemple ne peut être distingué de l'hy- drolysat obtenu dans la partie A. On constate que les deux hydrolysats sont ceux souhaités, ctest-à- dire qu'ils sont doux, dépourvus d'amertume et clairs. De même, on doit considérer que les deux hydrolysats sont identiques en ce qui concerne le rendement en protéine (68% de protéine solubilisée dans la partie A et 67% de protéine solubilisée dans la partie B du présent exemple) et également en ce qui concerne la consommation d'acide malique (18,6 g contre 18,8 g). C. On effectue une hydrolyse comme décrit dans la partie B du présent exemple, avec cette ex- ception que le dosage de l'enzyme est de 45 unités Anson/kg de substrat. On peut comparer la courbe d'hydrolyse avec celle de l'exemple 7 A (voir figure). Pour n'im- porte quelle valeur de l'ordonnée h (Adler-Nissen et Sejr Olsen, "Enzymatic hydrolysis of soy protein for nutritional fortification of low pH food", "Ann. Nutr. Alim." 1978, 32, 205-216, que l'on appellera ci-après plus brièvement "référence II") (degré d'hydrolyse h x 100% o htot = 7,75 milliéquivalents/g), on htott pleut calculer le rapport des temps d'hydrolyse (t) pour les deux courbes et l'on constate que ce rapport est constant (c'est-à-dire que la variation est sta- tistiquement non significative comparativement aux répétitions d'hydrolyses dans des conditions identi- ques), ce qui signifie que la vitesse réactionnelle pour n'importe quelle valeur h par rapport à la vi- tesse réactionnelle initiale est la même pour les deux expériences, impliquant ainsiune identité vis- à-vis de la cinétique d'hydrolyse (voir les exposés donnés dans la référence II). Par comparaison, deux protéases différentes donnent souvent des courbes d'hydrolyse d'une différence significative comme le montre la figure de la référence I. REVENDICATIONS -- 1. Agent protéolytique utilisé dans des procédés d'hydrolyse de protéines dans lesquels la - présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est a exclure, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une sérine- protéase de Bacillus que l'on soumet à une acy- lation au moyen d'un agent d'acylation, Dour obtenir une 'sérineprotéase de Bacillus déstabilisée. 2. Agent protéolytique suivant la revendi- cation 1, caractérisé en ce que la sérineprotéase de Bacillus est la subtilisine Carlsberg. 3. Agent protéolytique suivant ltune quel- conque des revendications l et 2, caractérisé en ce que l'agent dtacylation est un dérivé actif d'acide maléique. 4. Agent protéolytique suivant l'une quel- conque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'agent d'acylation est un dérivé actif d'un acide monocarboxylique contenant 1 à 6 atomes de car- bone. 5. Agent protéolytique suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on effectue liacylation juste au degré d'acyla- tion auquel il n'y a plus de déstabilisation complé- mentaire. t. 6. Procédé d'hydrolyse de protéines dans lequel la présence d'une activité protéolytique au terme de l'hydrolyse des protéines au degré envisagé est prohibitive, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse des protéines au moyen de l'agent protéo- lytique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5.- 7. Produits obtenus par le procédé de la revendication 6.