«s i 2001142 La présents invention concerne des dérivés de l'insuline, qui possèdent une activité thérapeutique, ainsi qu'un procédé de préparation de ces dérivés, et les compositions pharmaceutiques contenant ces dérivés. 5 l'utilisation de l'insuline d'abaissement du taux de sucre dans le sang et pour traiter le diabète, est connue et a été expérimentée. 'Toutefois, l'insuline par elle-même est instable et les formes de dosage contenant de l'insuline doivent être gardées dans Tin réfrigérateur et stabilisées par addition de matières qui 10 peuvent entraîner de's réactions secondaires contraires chez certains individus prédisposés. L'insuline a en. outre une durée d'action assez courte, de seulement six à huit.heures environ, ce qui nécessite de nombreuses administrations pendant la journée. On modifie l'hormone insuline en formant certains de ses dérivés, tels 15 que des complexes de zinc et des complexes de zinc et de protamine, qui ont bien sûr une durée d'activité plus longue, mais qui.sont difficiles à fabriquer étant donné que la taille des particules régit la durée d'activité, et difficiles à utiliser étant donné qu'il est essentiel de disperser la matière active avant de l'ad-20 minitrer. En outre, il n'est pas facile chez de nombreux sujets diabétiques de leur administrer des doses régulières des formes actuelles d'insuline. Chez certains sujets il semble apparaître * une certaine résistance à l'insuline qui peut être surmontée en administrant des doses inhabituelle ment élevées des types, actuels 25 d'insuline. La résistance semble provenir du développement d'anticorps qui semblent rendre inactifs les types d'insuline disponibles actuellement. Il existe donc un besoin pour des formes d'insuline qui sont très efficaces comme agents hypoglycémiques dans le traitement du diabète, qui ont une longue durée d'activité as-30 sociée à un début rapide d'action, qui sont raisonnablement bien tolérées par le sujet, et qui d© préférence sont des antigènes moins forts que les types actuels d'insuline. La présente invention produit trois nouveaux^.érivés d'insuline, à savoir la 1-aminocyclopentane-carbonyl-insuline, la 1— 35 aminocyclohexane-carbonyl-insuline et la L-try.ptophyl-insuline. Les composés produits par l'invention peuvent être préparés en acylant l'insuline par un agent d'acylation contenant un groupe aminoacyle, en vue d'associer ou de combiner l'insuline à un groupe de formule : 69 02160 2 2001142 m. o I! c ou 10 15 la combinaison se réalise de préférence en faisant réagir l'insuline avec un agent d1aminoacylation contenant un radical aminoacyle ayant la formule générale ci-dessus bous forme 2q d'un ET-carbozyanhydride. La réaction qui se produit est représentée schématiquement ci-après : 25 ! -c- HIT- S 0 •c. + H2N - insuline 30 (II) 1 R a i ■G KH, 0 II 0- -ÏÏH insuline + CO, (I) dans laquelle "HgN-insuline" représente une molécule d'insuline, B. et R1 sont ensemble -CH2(CH2)2CH2- ou •CH2(CH2)30Ho- ou bien B. 35 est l'hydrogène et fi est un radical 3-indolylméthyle de formule 69 02160 3 2001142 Les composés obtenus conf or animent au procédé de 1 ' invention peuvent être des composés ayant la formule (I). Tous les groupes amino libres présents dans l'insuline ont été de préférence pratiquement complètement substitués par réaction avec un réactif ca-5 pable de former le groupe aminoacyle. Les spécialistes du domaine que concerne la présente invention savent bien que quoique l'insuline soit une molécule complexe ayant un poids moléculaire relativement élevé (24 000 environ à un pH de 7,5 environ), chaque molécule d'hormone contient douze groupes amino libres. Ces groupes 10 anino sont ceux qui peuvent réagir -avec 1* agent d' aminoacylation, par exemple, le L~-carboxyanhydride (ITCA) de formule (II) et par conséquent les nouveaux composés contiennent de préférence environ 12 groupes aainoacyle par molécule d'insuline. Toutefois, il est bien entendu que le terme "aminoacylsub-15 stitué" tel qu'utilisé dans la présente invention englobe les iit-sulines mono(aminoacyl)- et poly-(aminoacyl)-substituées, "mono" dans ce sens signifiant un groupe aminoacyle et "poly" comprenant par exemple environ 2 à 9 groupes aminoacyle et même davantage attachés à chaque groupe insuline. 20 En général, les conditions nécessaires pour transformer les i'TGA de formule (II) en insulines aminoacyl-substituées de formule (I) ne sont pas critiques. Par exemple, il est avantageux d'utiliser 1/12 à 1/2 partie en poids de iICA pour 1 partie en poids d'insuline (ceci produit un excès stoéchiométrique d'agent d'amino-25 acylation, étent donné que 1'insuline a un poids moléculaire de 24 000 au pn de la réaction et que chaque molécule de cette ts.illi contient 12 groupes amino). La réaction se produit régulièrement et complètement à un pH compris entre 7,5 et 8,5 dans un agent tau: pon, tel que du phosphate de potassium 0,1 M et même à 0°C, û-, pré 30 férence dans une at-osphère d'azote. Bien que l'agent d'aminoacylation puisse être ajouté en une seule fois (initialement), il est préférable de l'a.jouter par petites portions, à des intervalles de quinze minutes environ, jusqu'à ce que la totalité soit ajoutée. Le produit peut âtne isole, de préférence après- avoir ajusté lo 35 pH à 8,6-9,2, en séchant par congélation (en lyophilisant) le mélange réactiomiel, en reconstituant le résidu dans l'eau, en le soumettant à une dialyse en présence d'eau et en séchant par congélation le produit retenu afin de laisser le produit sous for^e de résidu. BAD ORIGINAL 69 02160 2001142 On peut préparer les IT-carboxyanhydridei das acides a.:oin~s de formule (II) par des te clinique s tien connues des spécialistes dans ce domine. Far exemple, la phosgenation de l'acide 1-amino-eyclohexaiie-carboxylique, de l'acide 1 -aninocyclopc-ntanecarhosyli-5 que et du L-tr yp tophane a et- d-crite en détails dans le brevet des Etats Unis d'Amérique nc 3 258 5135 et dans la section écrite par G-reer.stein et Winitz, dans "Chemistry of Amino Acids" 1961, Joîji Wiley et fils,- i;ew-York, ïsev-York State, volume 11, concernant les anhydrides des acides ïT-carboxyaminés. 10 les nouveaux composes qui peuvent être préparés conformé ment au procédé de l'invention présentent une activité pour abaisser le taux da sucre dans le sang et peuvent être administrés en diverses formes dosées injectables. Gomme pour l'insuline, la voie d'administration détermine la durée et la rapidité de l'action, 15 l'invention fournit donc également une composition pharma ceutique injectable comprenant un composé produit par l'invention et un support liquide acceptable en pharmacie. les injections- peuvent être faites de façon aseptique par voie sous-cutanée, bien que pour assurer une action rapide on puisse procéder par injec-20 tion intraveineuse ou intramusculaire. la cuisse est un endroit approprié pour réaliser l'injection sous-cutanée. les besoins journaliers varient suivant la composition particulière utilisée, la gravité des symptômes présentés, et le patient, que l'on traite (qui peut être un animal tel qu'un ani-25 mal domestique de valeur, ou un ani/jal do _laboratoire tel qu'une souris, un rat, ou un singe). la dose varie également d'après la taille du malade. La dose à administrer est calculée en imités de la même façon que pour l'insuline de zinc cristalline. Pour un mammifère pesant environ 70 kg, la dose normalement efficace est 30 comprise entre 1 et 200'unités par jour. les "unités" utilisées sont les unités d'insuline du codox. Comme dans le cas de l'insuline, chaque sujet nécessite bien entendu une étude particulière pour déterminer la durée, le nombre et la quantité de doses individuelles journalières, les plus efficaces. Comme pour l'insuline, 35 des estimations du taux de sucre dans le sang et du sucre présent dans les urines fournissent un guide pour' le traitement à l'aide des compositions de l'invention, le but thérapeutique étant d'abaisser le taux de sucre dans le sang à un taux normal, puis de le maintenir. d BAD OFMGJN^ & 02160 5 2001142 Les composés de l'invention peiivent être formulés en une variété de formes de dosage "essentiellement aqueuses contenant divers électrolytes, agents tampons et stabilisants. Ainsi, par exemple, une suspension aqueuse des nouveaux composés peut con-5 tenir du chlorure de sodium, de l'acétate de sodium, du para- hydroxybenzoate de méthyle, de la glycérine, du phosphate de sodium dibasique, et des faibles quantités stabilisantes de phénol ou de méta-crésol. Une dose unitaire particulièrement utile comprend 20, 40 ou 80 unités/ml dans une solution saline physiologi-10 que stérile. Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention. Exemple 1. 1-Aminocvclopentane carb onyl-insuline 15 On prépare une solution d'insulxne en dissolvant 500 mg d'in suline dans 250 ml de tampon phosphate 0,05 M (pH 8,0) à 22°G environ, On ajoute 40 mg d'anhydride de l'acide IT-carboxy-1-aiûino-cyclopentane-carboxj/lique (1ÏCA). Après dissolution complète, on refroidit le mélange réactionne1 à 5°C et on ajoute encore 40 mg 20 de NCA. On agite le mélange pendant encore deux heures, on le so-che par congélation, et on remet en suspension le résidu dans 50 ml d'eau que l'on soumet à une dialyse avec^trois volumes de 4 litres d'eau Chacun. On sèche par congélation (lyophilise) le produit retenti, en vue de produire comme résidu 520 mg de produit. 25 Exemple 2. 1-Aminocyclohexane carb onyl-insuline On prépare une solution d'insuline en mélangeant 1,0 g d'insuline avec 500 ml d'agent tampon EgHPO^ 0,05 M, en ajustant le pE à 9,5 jusqu'à ce que la dissolution soit complète, et fina-30 lement en ramenant le pH à 8,0. On ajoute à la température ambiante 40 mg d'anhydride d'acide N-carboxy-1-aJinocyclohéxane-carboxylique (MCA) à 250 ml de la-solution. Après que le HCA se soit dissous, on ajoute encore 40 mg de lîCA. On agite ensuite le mélangé pendant deux heures à 5°G et on le lyopholise. On le re-35 constitue dans 50 ml d'eau,-on le soumet à une dialyse avec trois fois 4 litres d'eau, et on sèche par congélation le produit retenu, laissant le produit sous forme de résidu-. Exemple 5. L-tryptophyl-insuline bad obiq,nM- 69 02160 é 2C01142 On prépare une solution d'insuline en dissolvant 100 ;ag d'insuline dans 50 ml de ïïaHCO^ 1/16 M, en ajustant le pH à 9,5 puis en rauenant le pK entre 7*0 et 7,5. On refroidit le mélange à 0°C et on ajoute 6 mg de l'anhydride de l'acide îi-cvirboxy-l-trypt o-5 "oiiane (ïTCA) dissous dans 0,5 ml de dioxane. Au bout de quinze minutes, on ajoute encore 6 mg de ÏÏCA dans 0,5 ml de dioxane. On soumet le mélange à une dialyse soignée en utilisant de l'eau, puis on le lyophilise. On sèche par congélation le produit retenu ; et le produit (le résidu) pèse 98 mg. 10 Pour une évaluation préliminaire des composés hypoglycémi- ques de l'invention, et pour démontrer leur activité intéressante, on détermine l'effet in vivo et in vitro des composés de l'invention en procédant de la façon suivante. L'activité des insulines aminoacylées sur le gonflement 15 des mitochondries qui dépend de la concentration, sert d'indice de leur activité. On met des mitochondries de foie de rat dans une solution de saccharose 0,25 M contenant de l'acide éthylène-diamine-tétracétique (AEDT) 0,001 M, conformément à une technique de centrifuga-20 tion différentielle standardisée. On mesure l'action des nouvel-» les insulines sur le gonflement des mitochondries de foie de rat venant d'être isolées, en suspension dans une solution à 0,1 c/o de gélatine partiellement hydrolysée, de KCl 0,125 M et de tris(hy-droxymé t hylainino)méthane 0,02 M à un pH de 7,3, en suivant les 25 changements d'absorption de lumière à 520 mp. au moyen d'un spec-trophotomètre Beckman modèle B. voir par exemple l'article de R.L. Penichel, W.H. Bechmann et H.E. Album Biochemistry, j5, 461 (1966). Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau. 30 BfijO ORIGINAL 69 02160 7 2001142 TABLEAU ' ACTION DES II78ULIE2S AMUJOACYLEE 3 SUR LE G-OITZLEKEUT DES MITOCHONDRIES. _5 A. Concentration. 1 x 10 M AD.E. à 520 gp 10' 20; 50' Total 10 1 -aminocyclopentane-car'b onyl- insuline 75 150 168 393 1 -aminocycl olisxane -carb onyl- insuline 83 150 148 381 L-tryptophyl-insuline 115 170 164 449 15 — fi 3. Concentration. 5 x 10~ M 10' 20| Total 20 1-aminocyclopentane-carb onyl- insuline 57 117 144 320 1-aminocyclohexane-carbonyl- insuline 53 99 140 292 25 L-tryptophyl-insuline 80 162 155 397 — fi C. Concentration. 2.5 x 10 M ^sD.E. à 520 cy. 30 20_| 30J, Total 1-aminocyclopentane-carbonyl- insuline 35 24 5 64 1-aminocyclohexane-carbonyl-35 insuline .20 59 107 156 L-trypt ophyl-insuline 15 69 85 159 BAD ORIGINAL 69 02160 8 2001142 D. Concentration. 1.2e) x 10~^ M D.E.* à 520 iap ' 10' 20J ]50J Total 5 1 -a&inocyclopentane-c insuline 17 0 -14 3 1 - ariiino c y c 1 o he xane - c ar b ony 1 - insuline 35 15 48 98 10 L-tryptophyl-insuline■ 4 14 6 24 *ADE : variation du diamètre extérieur. Les données du tableau montrent que tous les composés de 15 l'invention présentent une bonne activité dépendant de la concentration, la 1-aminocyclohexanecarbonyl-insuline étant supérieure aux deux autres dérivés de l'insuline à la concentration la plus basse, 1,25 x 10~^ M. l'essai in vivo des nouvelles insulines aminoacylées est 20 réalisé de la façon suivante (voii^krticle de H.Ë. Alburn et R.L. Eenichel, Nature 211» 515 (1967). . Après avoir prélevé pour en analyser le taux de sucre un échantillon de sang initial de" 0,1 ml dans le coeur de rats Sprague Lawley mâles légèrement traités à l'^ther et qui ont jeu-25 në pendant dix-huit heures, on injecte aux animaux par voie in-trapéritonéale des concentrations différentes en unités/kg de poids du corps, des nouvelles insulines aminoacylées. On prélève encore des échantillons de sang de 0,1 ml dans le coeur de ces animaux à des intervalles de temps réguliers pour analyser le taux 30 de sucre dans le sang. Les valeurs moyennes du taux de glucose dans le sang (en mg fo) sont portées en ordonnée par rapport au temps porté en abscisse sur les graphiques représentés au dessin annexé,' où la figure 1 donne les résultats obtenus avec la L-tryptophyl-insuline, la figure 2 les résultats obtenus avec la 35 1-aminocyclopentaAie,carbonyl-insuline, et la figure 3 les résultats obtenus avec la 1-aminocyclohexanecârbonyl-insuline. Ces trois composés abaissent considérablement le taux de sucre dans le sang, quand on se base sur la réponse à une dose. BAD ORIGINAL 69 02160 9 2001142 On teste ensuite- la I-tryptopliyl-insuline, la 1-aminocyclo-pentanecarbonyl-insuline et la 1 -aminocycl oiiexane carb onyl-insuline dans un essai de formation d'anticorps, et dans des essais sur le diaphragme des rats et sur les boules graisseuses de Bichat. On 5 a constaté que ces insulines sont des antigènes moins forts que l'insuline pure de porc dans l'essai de formation d'anticorps, et sont très actives dans les essais sur le diaphragme des rats et sur les boules graisseuses de Bichat. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite et 10 représentée qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et qu'elle est susceptible de diverses variantes sans sortir de son cadre. g AD ORIG1^ 69 02160 10 2001142 BEVEUDIOA'IIOSS x 1. Procédé de préparation de nouvelles insulines aminoacyl- oubstituéc.G, caractérisé ea ce qu'on acyle l'insuline avec un a-g-jnt d'acylation contenant un groupe ...iinoacylu approprie en vue 5 de combiner 11 insuline à un groupe de foraule : 10 \ \ A .0 H ■c ira.. V o 11 0- EBL ou 15 H 2. Procédé selon la revendication 1, careictérisé en ce que l'a-20 cylation de l'insuline est réalisé avec un K-carboxyanhydride ayant la foriule générale : 25 30 R1 R i I -C .0 HET" 1 dans'laquelle R et R sont ensemble -0IÎ2 (OE^) 2CI"I2~ ou -GH2^GH2^3CH2~ ou bien R est l'hydrogène et R1 est un radical 3-indolylméth.yle. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réaction est réalisée à un pH compris entre 7,5 et 8,5 dans un tampon. 4. Procédé selon la revendication 3? caractérisé en ce qu'on 35 utilise 1/12 à 1/2 partie en poids de ïï-carboxyanii:/dride pour 1 partie en -poids d ' insuline. 5. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 précédentes, caractérisé en ce nue le produit est isolé par deo Doyens comprenant le séchage par congélation ou lyophilisation. \ 69 02160 11 2001142 6. Insulines aminoacylées, caractérisées en ce que le groupe aminoacyle est un groupe ay.ant la formule toile que décrite dans la revendication 1, et préparées par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 précédentes. 8. La l-aaiinocyclohexaneearbonyl-insuline. 9. la L-tryptophyl-insuline. 10. Composition pharmaceutique injectable, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé tel que revendiqué dans l'une auel-10 conque des revendications 6 à 9 et un excipient liquide acceptable en pharmacie. 5 7. La 1-aainocyclopentanecarbonyl-inculine. j.COPY