-1- 2005070 La présente invention concerne un procédé de préparation d1imidazole-glycérol par fermentation, caractérisé en ce qu'on cultive une souche de mutant d'un microorganismë appartenant à 1* espèce Brevibacterium ou Corynebacterium et capable de pro-5 duire de l'imidazole-glycérol dans un milieu approprié. L'imidazole-glycérol est l'un des composants de l'acide imidazole-glycérol-phosphorique qui est un précurseur pour la biosynthèse de l'histidine, amino-acide essentiel. De plus, il est utilisable comme produit brut pour la préparation de l'his-10 tidine et des composés nitroimidazoles. On sait préparer l'imidazole-glycérol dans des cellules microbiennes ou dans un milieu de culture, par culture de l*espèce mutante de microorganisme Neurospora ou Pénicillium /~J. of Am. Chem. Soc. 75, 1015 (1955)_7- Mais dans ce cas, on n'obtient 15 qu'une petite quantité d'imidazole-glycérol parmi diverses autres substances telles que l'imidazole-acétol, l'histidinol, etc, en sorte qu'il est difficile d'appliquer ce procédé antérieur à la production commerciale d*imidazole-glycérol. L'invention a pour but un procédé de préparation d'imidazole-20 glycérol permettant d'obtenir ce produit sélectivement et avec un rendement élevé sans difficulté. Le procédé, suivant l'invention, consiste à cultiver un autant nécessitant de 1'histidine, d'un microorganisme appartenant aux espèces Brevibacterium et Corynebacterium, avantageusement 25 Brevibacterium ammoniagenes ou Corynebacterium g;lutamieu», dans un milieu de culture contenant une source de carbone, une source d'azote, des substances minérales et des traces d'agents nutritifs. Des microorganismes particulièrement avantageux, suivant 30 l'invention, sont Brevibacterium ammoniagenes H-5068 (mutant nécessitant de l'histidine), Corynebacterium glutamicum MI?-134-IT0 47 (mutant nécessitant de l'histidine). Ces micro organismes sont accessibles au public et ils sont déposés à l'"American Type Culture Collection" sous les références : 35 Brevibacterium ammoniagenes A.TCC 21225 Corynebacterium glutamicum ATCC 21224. On obtient ces espèces mutantes à partir de Brevibacterium amaoniagenes ou Corynebacterium glutamicum par irradiation ultra-violette et on les distingue des souches initiales par 40 leur besoin en histidine et leur habilité à produire de l'imi- 69 09274 -2- 2005070 dazole-glycérol. Les propriétés bactériologiques du Brevibacterium ammoniagenes précité sont indiquées dans l'ouvrage de BERGETS intitulé *Détermina tive Bacteriology, 7ème édition". 5 Les propriétés bactériologiques du Corynebacterium glutamicum sont décrites dans le brevet japonais n° 8698/1957* EHTOSHIT1 et autres ont récemment effectué des études bactériologiques et taxologiques sur ces microorganismes et ils ont indiqué dans "The Journal of General and Applied Microbiology"j Vol. 18» 10 279-301 (1967)'que ce microorganisme doit être appelé Corynebacterium glutamicum. Dans le procédé de l'invention, on peut utiliser tpute source de carbone déjà utilisée pour cultiver les souches initiales correspondantes. Des sources de carbone avantageuses comprennent 15 par exemple le glucose, fracfcose, galactose, succrose, maltose, trehalose, cellobiose, arabinose etc. Des sources d'azote avantageuses comprennent, par exemple, l'ammoniaque, l'urée, le sulfate, chlorure, acétate, citrate d'ammonium, et divers autres composés azotés organiques ou minéraux. Des substances miné-20 raies avantageuses peuvent être illustrées par divers sels de sodium, potassium, manganèse, magnésium, calcium, cobalt, nickel, cuivre, chlore, acide sulfurique, acide phosphorique, etc. Afin d'empêcher l'accumulation d'autres composés d'imidaaole, c'est-à-dire pour accumuler sélectivement l'imidazole-glycérol, il est 25 particulièrement avantageux d'ajouter au milieu un phosphate approprié à une concentration supérieure à 0,05 mole {calculé sous forme d'ions de l'acide phosphorique) par litre de milieu. Des exemples de tels phosphates sont le phosphate acide de potassium, le phosphate diacide de potassium, le phosphate diacide JO de sodium, le phosphate diacide d'ammonium, etc. Il est nécessaire d'ajouter.au milieu de l'histidine ou un agent nutritif contenant de l'histidine, pour la croissante de la souche suivant l'invention. Il «st. également possible d'util»— liser comme composé contenant de l'histidine diverses substances 35 organiques telles que, par exemple, de la liqueur de macération .. de blé, peptone, extrait de viande, h^rdrolysat de farine de soja, hydrolysat de caséine, hydrolysat de cellules microbiennes, extrait de levure. Une'concentration avantageuse et de 50 à 3000 Y/ml, calculé sous forme d'histidine. Il est également 40 avantageux d'ajouter au milieu des traces d'au moins un composé 69 09274 -3- 2005070 suivant : biotine, thiaminé, P-alanine, acide nicotinique, dérivés de l'acide nicotinique, hypoxanthine, adénine, guanine, xanthine et autres bases dérivées a1acides nucléiques. On cultive la souche dans des conditions aérobies sous agita-5 tion ou aération à un pH généralement neutre et avantageusement d'environ 6,0 à 8,5* La température de culture est de 23 à 40°C, avantageusement de 26 à 35°C. On peut ajouter au milieu un agent neutralisant approprié tel que l'ammoniaque, l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium. Il est 10 possible de contrôler le pH du milieu et de fournir de l'ammoniac à ce milieu par l'addition d'urée, la durée de culture doit être suffisante pour que l'imidazole-glycérol s'accumule dans le milieu. Elle est avantageusement de 3 à 7 jours. A la fin de la culture, il arrive que le milieu contienne 15 l'un des trois sous-produits imidazole. Mais la concentration de ces sous-produits ne dépasse généralement pas 1/10 de la quantité d'imidazole-glycérol accumulée et il est possible d'accumuler sélectivement et en quantité suffisante l'imidazole-glycérol, par exemple en augmentant la concentration de l'acide phospho-20 rique contenu dans le milieu. On peut utiliser divers procédés connus pour concentrer l'imidazole-glycérol. Par exemple, on peut séparer 1 *imidazole-glycérol sous forme d'un sel insoluble (sel mercurique) ou utiliser des techniques connues d'extraction, de purification par exemple 25 avec une résine échangeuse d'ions. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre de quelques exemples non limitatifs de modes de réalisation suivant l'invention. Exemple 1 30 On inocule une souche de Brevibacterium ammoniagenes H-5068 (ATCC 21225) dans un milieu ayant la composition ci-dessous (pH 7,2) et on la cultive pendant 24 heures pour obtenir une culture d'ensemencement. On divise le milieu de culture ayant la composition ci-après 35 en fractions de 20 ml qu'on verse dans des flacons dits "saka-guchi" (capacité 500 ml) et qu'on stérilise. On inocule ensuite chaque milieu de culture avec 1 ml de la culture d'ensemencement et on effectue la fermentation pendant 5 jours à 28°C pour obtenir 6,8 mg/ml (en moyenne) d*imidazole-glycérol. 69 09274 -4- 2005070 Composition du milieu d'ensemencement Glucose 5 g/dl, KHgPO^ 0,1 g/dl, K^EPO^ 0,1 g/dl, MgS04,7H20 0,05 g/dl, ZnS04,7H20 0,001 g/dl, FeS04,7H20 0,001 g/dl, MnS04_,4E20 0,0004 g/dl, biotine 30 Y/1» p-alanine 5 0,0005 g/dl, Thiamine,HCl 0,0005 g/dl, peptone 2 g/dl, extrait de viande 1 g/dl, urée 0,3 g/dl, histidine-HCl 0,0001 g/dl, succinate de sodium,ôHgO 0,3 g/dl. Composition du milieu de culture Glucose 12 g/dl, (NH^SO^ 2 g/dl, urée 0,3 g/dl, EELjPO^ 10 2 g/dl, Ha2HP04,12H20 2 g/dl, MgS0^,7^0 2 g/dl, p-alanine 0,0005 g/dl, L-cystine 0,002 g/dl, amide de l'acide nicotinique 0,0005 g/dl, ïeSO^HgO 0,001 g/dl, ZnSO^HgO 0,001 g/dl, MnS0^,4H20 0,0004 g/dl, biotine 30 t /1, thiamine,HCl, 0,0005 g/dl, L-histidine,HCl 0,1 g/dl, extrait de viande 15 0,2 g/dl, CaGOj 2 g/dl. A la fin de la culture, on recueille la liqueur de fermentation. On centrifuge la liqueur pour éliminer les cellules microbiennes puis on l'ajoute à une solution saturée d'hydroxyde de baryum pour ajuster le pi à 8,5 et 011 laisse reposer la li-20 queur pendant une nuit. On filtre le précipité. On ajoute au filtrat une solution à 25 % de chlorure mercurique et d'éthanol pour donner un précipité du sel mercurique d'imidazole-glycérol qu'on sépare par filtration et qu'on sèche sous vide à la température ambiante. On ajoute de l'acide chlorhydrique 0,5 M" au 25 produit séché pour dissoudre l'imidazole-glycérol qu'on filtré. On concentre sous vide le filtrat ainsi obtenu jusqu'à un volume d'environ 50 ml et on fait passer la liqueur concentrée dans une colonne contenant une résine échangeuse de cations fortement acide, vendue sous la dénomination commerciale de 30 "Dowex-50" par "DOW CHEMICAL COMPAHY, USA", sous forme libre, pour adsorber l'imidazole-glycérol. On lave la résine avec de l'eau et on l'élue avec de l'acide chlorhydrique 1,5 N. On recueille les fractions contenant l'imidazole-glycérol, on les combine et on les concentre. Après séparation par cristallisa-35 tion, on obtient 5*8 d'imidazole-glycérol. Exemple 2 On prépare une culture d'ensemencement en procédant ainsi que décrit dans l'exemple 1 si ce n'est qu'on utilise une souche de Corynebacterium Klutamieum MF-134-ïï° 47 (ATCC 21224). 40 La composition du milieu de culture est la suivante : glu* 69 09274 -5- 2005070 cose 12 g/dl, urée 0,9 g/dl, extrait de viande 2,5 g/ On divise ce bouillon de culture en fractions de 2 ml qu'on verse dans des flacons "Sakaguchi" (capacité 500 ml) et qu'on stérilise (on stérilise séparément de l'urée et on l'ajoute 10 à ce milieu). Après stérilisation, on inocule chaque flacon avec 1 ml de culture d'ensemencement. On effectue la culture en agitant à 28°C pendant 6 jours. La liqueur fermentée contient 8,3 mg/ml d'imidazole-glycérol. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exem-15 pies décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans qu'on s'écarte pour cela du cadre de l'invention. BAD ORIGINAL 69 09274 -6- 2005070 - REVENDICATIONS - 1 - Procédé de production d*imidazole-glycérol par fermentation, qui consiste à cultiver dans un milieu de culture approprié, une souche nécessitant de l'histidine, capable de produire 5 de l'imidazole-glycérol, ladite souche étant choisie dans le groupe constitué par Brevibacterium et Corynebacterium, puis à recueillir l'imidazole-glycérol accumulé dans la liqueur de fermentation. 2 - Procédé suivant 1 dans lequel la souche appartient au 10 groupe du Brevibacterium ammoniagenes ou du Corynebacterium glutamicum. 3 - Procédé suivant 1 dans lequel 0,05 mole d'un composé phosphaté par litre de milieu de culture est présent pour accroître la production en imidazole-glycérol. 15 4 - Procédé suivant 1 dans lequel le milieu de culture renferme un agent nutritif contenant de l'histidine. 5 - Procédé suivant l'une des revendications précédentes dans lequel on effectue la culture dans des conditions aérobies à un pH généralement neutre. 20 5 - Procédé suivant 5 dans lequel on effectue la culture à une température de 23 à 4-0°G, à un pH de 6,0 à 8,5? pendant une durée suffisante pour qu'une notable'quantité d'imidazole-glycérol s'accumule. 7 - Procédé suivant 6 dans lequel on recueille l'imidazole-25 glycérol par des précipitations sélectives. 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