k7Q7k 1 2120078 La présente invention se rapporte à un vaccin combiné à bactéries et à virus tués, pour l'immunisation de la volaille contre l'infection des voies respiratoires, qui comprend des quantités efficaces d'Hemophilus Gallinarum tué, de virus tués de la 5 bronchite infectieuse et de virus tués de la maladie de Newcastle. En outre, elle se rapporte également à un procédé de production de ce vaccin. Le coryza infectieux, la bronchite infectieuse et la maladie de Newcastle sont des maladies importantes des voies res-10 piratoires chez les volailles. L'organisme provoquant le coryza infectieux est l'Hemophilus gallinarum ; la bronchite infectieuse et la maladie de Newcastle sont provoquées par des virus. La volaille est sérieusement affectée par des épidémies de ces maladies, ces épidémies se déclarant naturellement affectant fréquemment 15 les poulets, les dindons, les pintades, les canards, les oies, les pigeons, les faisans et les perdrix. La bronchite infectieuse provoque une mortalité élevée chez les jeunes volailles, bien que ses effets soient moins sévères chez les volatiles adultes. Le coryza infectieux provoque peu 20 de mortalité, ses effets principaux étant l'inhibition de la croissance et un abaissement brusque de la production des oeufs, en provoquant de lourdes pertes pour le fermier élevant de la volaille. La maladie de Newcastle est la plus sérieuse de ces maladies ; le taux de mortalité est élevé, indépendamment de l'âge des vo-25 lailles infectées. Bien que des vaccins à base de virus vivants et tués aient déjà été utilisés pour le contrôle de la maladie de Newcastle et de la bronchite infectieuse, ils se présentent tous sous la forme d'un vaccin individuel et non combiné. En outre, le vaccin à 30 base de virus tués pour le contrôle de la bronchite infectieuse, qui est disponible sur le marché, ne présente qu'une faible activité. Bien que les vaccins à base de virus vivants puissent donner une immunité à durée relativement longue, leur utilisation soulève généralement une question de sécurité. De la volaille normale et 35 saine est fréquemment tuée par vaccination avec des vaccins renfermant des virus vivants, le danger étant particulièrement sérieux chez les volatiles jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge de trois semaines. En outre, l'utilisation de vaccins à virus vivants entraîne quelquefois une extension des maladies de la volaille vac-40 cinée à de la volaille sensible ou non immunisée. Pour ces raisons, 71 4707k 2 2120078 on préfère des vaccins à virus tués. Comme cela est bien connu, les infections des voies respiratoires dans la volaille se rencontrent fréquemment sous forme de ce qu'on appelle "un complexe de maladies respiratoires", provo-5 que par plus d'un agent infectieux, par exemple l'Hemophilus gallinarum, le virus de la maladie de Newcastle et le virus de la bronchite infectieuse. Egalement, la perte économique dans l'élevage des volailles provoquée par l'infection multiple est bien plus sévère que celle due à une seule infection. De plus, dans le trai-10 tement d'un grand nombre de volailles, le temps exigé pour des applications répétées de deux (ou davantage) vaccins individuels à un grand nombre de volailles rend très coûteuse la vaccination. Pour ces raisons, l'utilisation d'un vaccin combiné est favorable à l'élevage de la volaille, spécialement à un élevage à grande 15 échelle. Malgré ceci, on n'a pas encore utilisé dans ce domaine de vaccins combinés à virus tués. Alors que l'on pouvait s'attendre à ce qu'une combinaison de plusieurs vaccins entraîne un effet défavorable pour la volaille, on a trouvé que le vaccin combiné selon la présente inven-20 tion pouvait être utilisé de manière très sûre, sans aucun effet contraire. En outre, alors qu'un mélange de différents vaccins est susceptible de perdre les activités des composants individuels par interférence ou inhibition mutuelle (Michael A. Bratt et Harry Rubin, Virology, 598-608 (I967), on a également trouvé que 25 cette incompatibilité n'existait pas dans le vaccin combiné selon la présente invention. D'autre part, les vaccins à bactéries tuées, connus jusqu'à présent pour le contrôle du coryza infectieux, ont été préparés en faisant croître une souche d'Hemophilus gallinarum 30 dans des milieux nutritifs semi-synthétiques, et leurs activités immunologiques sont trop faibles et ne conviennent pas à une utilisation pratique (Clark et Godfrey, Avian Dis., jjj, 37 (1961) î Page et collaborateurs, Avian Dis., 239 (1963)). Cependant, selon des études réalisées par la demanderesse, on a confirmé de manière 35 inespérée qu'un vaccin à bactéries tuées, préparé en faisant croître le microorganisme dans des milieux nutritifs naturels au lieu de milieux nutritifs synthétiques ousemi-synthétiques, présente une activité immunologique bien supérieure à celle des vaccins préalablement connus. En outre, malgré le fait qu'un vaccin indi-40 viduel à virus tués, préparé à partir de virus de la bronchite in 71 4707k 3 2120078 fectieuse, ne présente qu'une légère activité, spécialement dans un premier stade après la vaccination, on a découvert qu'un mélange de ce vaccin avec le vaccin à virus tués, préparé à partir de virus de la maladie de Newcastle, et/ou le vaccin à bactéries 5 tuées préparé à partir de l'Hemophilus gallinarum, fournit une activité immunologique fortement renforcée contre la bronchite infectieuse. Cela revient à dire que les deux derniers vaccins ont un effet synergique sur l'activité immunologique du vaccin à virus tués contre la bronchite infectieuse. 1° Ainsi, la présente invention a été réalisée sur la base de ces deux découvertes et d'autres encore et peut être clairement caractérisée par ses avantages techniques en vue dé ce qu'on a indiqué précédemment et d'autres indications techniques ultérieures. En conséquence, un des objets fondamentaux de la présen-15 te invention est de prévoir un vaccin combiné à bactéries et à virus tués, comprenant une quantité efficace d'Hemophilus gallinarum tué, de virus tués de la maladie de Newcastle et de virus tués de la bronchite infectieuse, ainsi qu'un procédé pour sa production. Un autre objet de la présente invention est de prévoir un vaccin 20 combiné à bactéries et à virus tués, comprenant une quantité efficace de deux agents choisis dans le groupe se composant d'Hemophilus gallinarum tué, de virus de la maladie de Newcastle tués et de virus tués de la bronchite infectieuse, et un procédé pour sa production. Un autre objet de la présente Invention est de prévoir 25 un nouveau vaccin individuel à bactéries tuées pour le contrôle du coryza infectieux, ainsi qu'un procédé pour sa production. Selon la présente invention, la préparation du vaccin à bactéries tuées pour le contrôle du coryza infectieux utilise des milieux nutritifs naturels qui sont d'ordinaire utilisés pour la 30 culture des bactéries du genre Hemophilus. Tel que mentionné ci-dessus, on a trouvé qu'un vaccin à bactéries tuées, préparé dans un milieu nutritif naturel, avait une puissance supérieure à celui préparé dans des milieux nutritifs synthétiques ou semi-synthétiques. En outre, on a confirmé que la souche 221 d'Hemophilus 35 gallinarum, qu'on a fait croître dans un milieu nutritif naturel, diffère de celle qu'on a fait croître dans un milieu nutritif synthétique ou semi-synthétique au point de vue de ses caractéristiques morphologiques. Comme milieu naturel nutritif à utiliser dans la présente invention, on peut indiquer à titre d'exemple un milieu 40 réglé à un pH de 7,0 à 7,4 et se composant essentiellement de 1000 71 47074 4 2120078 ml de bouillon de viande de volaille, de 5 g de chlorure de sodium, de 10 g de polypeptone et de 0,5 % de sérum de volaille. Bien que la composition du milieu nutritif puisse comprendre une gamme très large de produits nutritifs naturels, il est particu-5 lièrement souhaitable et prévu d'inclure l'utilisation d'extraits de viande de boeuf ou de pomme de terre à la place du bouillon de viande de volaille, l'acide casamino ou un extrait de levure à la place de la polypeptone, et du sérum de mouton ou des nucléotides de diphosphopyridine à la place du sérum de volaille. Un oeuf em-10 bryonnaire peut être également utilisé comme milieu nutritif naturel. Une souche typique d'Hemophilus gallinarum, c'est-à-dire la souche 221, a été déposée au National Institute of Animal Health du Ministère de l'Agriculture et des Forêts au Japon*(dé-3-5 signé ci-après sous le nom de NIAH), faisant partie de la japanese Fédération of Culture Collections of Microorganisms, et on peut en obtenir à tout moment une sous-culture de cette souche. On doit noter que les bactéries à utiliser dans la présente invention ne doivent pas être limitées à la souche spécifique à laquelle à la-20 quelle on s'est référé ci-dessus, et qu'on peut également utiliser pour la production des vaccins recherchés d'autres souches connues d'Hemophilus gallinarum. L'Hemophilus gallinarum peut être inoculé dans un milieu nutritif naturel et puis on peut le faire croître à une températu-25 re ordinaire (par exemple 30-40°C) par une culture permanente à grande échelle. La culture peut être également effectuée dans des conditions aérobies immergées. Après la culture jusqu'à un stade prévu, on ajoute un agent de désactivation au bouillon de culture afin de désactiver le microorganisme. Comme agents de désactiva-30 tion, on peut indiquer à titre d'exemple le thimérosal, la (1- propiolactone, la tylosine, l'acide salicylique, le cristal violet, l'acide benzotque, des agents tensio-actifs tels que le chlorure de benzéthonium, la polymyxine et la gramicidine. Après addition d'une quantité appropriée d'un adjuvant, le bouillon est centrifu-35 gé dans une centrifugeuse continue. Comme adjuvant, on peut utiliser du gel d'hydroxyde d'aluminium, du gel de phosphate d'aluminium, du gel de phosphate de calcium ou de l'alun. Le précipité rassemblé par centrifugation est remis en suspension dans une solution saline-tampon phosphaté stérile afin que la concentration fi A 40 des cellules soit de 10 -10 cellules/ml, et puis on ajoute un t , V kix^. -J J/t- agent antiseptique à la suspension pour l'emmagasinage. Comme agent antiseptique» on peut utiliser le thimérosal, la tylosine, la (3-propiolaetone, l'acide benzoîque, la formaline,1'acide salicylique, le cristal violet, des agents tensio-actifs tels que le chlorure 5 de benzéthonium, la polymyxine ou la gramicidine. Le vaccin contre le coryza infectieux renfermant des bactéries tuées ainsi préparé est ci-après désigné sous le nom de vaccin Hg. La production du vaccin contre la maladie de Newcastle, à base de virus tués,et du vaccin contre la bronchite infectieuse, 10 à base de virus tués, peut être réalisée par des procédés classiques, par exemple en faisant se propager le virus désiré dans un oeuf d'embryon de poulet, en rassemblant les virus qui se sont propagés, en désactivant les virus, en mettant en suspension les virus dans une solution de tampon convenable et finalement en ajou-15 tant un adjuvant convenable à la suspension. Un virus typique de la maladie de Newcastle employé pour la préparation du vaccin contre la maladie de Newcastle, à virus tués, est le virus de la maladie de Newcastle souche Sato. Le virus de la maladie de Newcastle souche Sato a été déposé au NIAH. 20 Si on le désire, on peut également utiliser le virus de la maladie de Newcastle souche Miyadera à la place de la souche Sato, bien que le virus de la maladie de Newcastle à utiliser dans la présente invention ne soit pas limité à ees deux souches. Le vaccin contre la maladie de Newcastle, à base de virus tués, ainsi préparé 25 est ci-après désigné sous le nom de vaccin ND. Un virus typique de la bronchite infectieuse, employé pour la préparation du vaccin à base de virus tués contre la bronchite infectieuse, est le virus de la bronchite infectieuse souche Beaudette 42, qui a été également déposé au NIAH, mais le virus 30 à utiliser dans la présente invention n'est pas limité à cette souche. Par exemple, on peut utiliser, à la place de la souche Beaudette 42, la souche du type Massachusetts ou Connecticut des virus de la bronchite infectieuse. La souche Beaudette 42 est très semblable à la souche de type Massachusetts du virus de la bronchi-35 te infectieuse, si bien que le vaccin à virus tués, produit par la souche Beaudette 42, est également efficace au point de vue immunologique contre les souches des types Massachusetts et Connecticut de la bronchite infectieuse. Le vaccin contre la bronchite infectieuse, à base de virus tués, ainsi préparé est ci-après désigné 40 sous le nom de vaccin IB. 71 47C: * 2120C~6 Pour la préparation des vaccins combinés, deux ou trois agents choisis parmi l'Hemophilus gallinarum tué, le virus tué de la maladie de Newcastle et le virus tué de la bronchite infectieuse sont mélangés dans des proportions telles que chaque agent soit 5 contenu à une concentration efficace dans le produit final. Par exemple, une préparation préférée peut être de 5 à 30 volumes de la suspension de souche 221 d'Hemophilus gallinarum tué à une concentration de 3,3 x 10^-3,3 x 10^ cellules/ml, 5 à 30 volumes de la suspension de virus tués de la bronchite infectieuse souche 10 Beaudette 42, à une concentration de 10^-10^ DEI^/ml et 5 à 30 DU volumes de la suspension de virus tués de la maladie de Newcastle souche Sato, à une concentration de 10^*-*-10^*5 DEI^/ml pour 100 volumes du vaccin mélangé produit, bien que ce qu'on ait indiqué ci-dessus né soit pas essentiel. 15 Bien que les vaccins à virus et à bactéries tués ainsi préparés présentent, dans la plupart des cas, une activité immunologique suffisante sans aucun adjuvant, on préfère ajouter un adjuvant aux préparations de vaccins pour renforcer leur puissance. Un rapport préféré de l'adjuvant peut être de 1 à 50 volumes pour 20 100 volumes du vaccin combiné à bactéries et à virus tués, bien que ceci ne soit pas essentiel. En ce qui concerne l'adjuvant dans ce but, on peut utiliser du gel d'hydroxyde d'aluminium, du gel de phosphate d'aluminium, du gel de phosphate de calcium ou de l'alun. Si cela est nécessaire, on peut aussi fournir un agent antisepti-25 que tel que du thimérosal, de la (3-propiolactone, de la tylosine, de l'acide salicylique, du cristal violet, de l'acide benzonique, et des agents tensio-actifs tels que le chlorure de benzéthonium, la polymyxine ou la gramicidine. Les vaccins à bactéries et à virus tués de la présente 30 invention peuvent être administrés à de la volaille par injection intramusculaire, sous-cutanée ou intracutanée. Le vaccin combiné à bactéries et à virus tués de la présente invention a une excellente activité immunologique, et une immunisation contre les trois maladies, c'est-à-dire le coriza in-35 fectieux, la bronchite infectieuse et la maladie de Newcastle, peut être effectuée par une seule administration. En outre, il n'y a aucun effet secondaire important dans la volaille qui reçoit un vaccin selon la présente invention. Ainsi, les vaccins de la présente invention sont avantageusement utilisés pour l'immunisa-40 tion de la volaille contre les infections des voies respiratoires, 71 47074 r 2120078 et les avantages fournis par la présente invention peuvent être très appréciés dans le domaine de l'élevage des volailles, spécialement dans l'élevage à grande échelle. Des exemples de réalisation pratiques et actuellement 5 préférés de la présente invention sont présentés à titre d'illustration dans les exemples suivants.et les données expérimentales qui figurent serviront à faire apparaître clairement que les produits de la présente invention ont d'excellentes activités. EXEMPLE 1 10 Le milieu décrit ci-dessous est utilisé pour la produc tion d'un vaccin Hg à bactéries tuées. Milieu : Bouillon de viande de poulet^ 1.000 ml Chlorure de sodium 5g Polypeptone 10 g 15 Sérum de poulet 0,5 % PH 7,0 - 7,4 - : / Dans un kilo de viande de poulet émincée, on ajoute 2 litres d'eau en agitant. On laisse reposer le mélange à 0°C pendant environ 24 heures, on traite à la vapeur d'eau pendant 30-60 mi-20 nutes et on filtre. Le filtrat est utilisé comme bouillon de viande de poulet. Un milieu de viande de poulet, se composant du bouillon de viande de poulet, de chlorure de sodium et de polypeptone, est stérilisé à 121 °C pendant 20 minutes dans un autoclave.. Du sérum 25 de poulet est stérilisé séparément avec un filtre dit Seitz. Le sérum de poulet stérilisé est ajouté au milieu de viande de poulet stérile. De la souche 221 d'Hemophilus gallinarum, obtenue à partir d'un échantillon de matière séchée par congélation, est ino-30 culée dans la membrane vitelline d'un oeuf d'embryon de poulet, vieux de 4 jours, suivant une quantité d'inoculat d'approximativement 10^ cellules viables/ml. Après incubation pendant environ 24 heures, la mort de l'embryon est confirmée, le jaune de l'oeuf est enduit sur un milieu d'agar-agar de Blood et on fait croître la 35 souche 221 d'Hemophilus gallinarum à 37°C pendant 24 heures dans une atmosphère contenant 5 à 10 % de COg. Les cellules, obtenues à partir d'une colonie sur le milieu d'agar-agar de Blood, sont inoculées dans un litre de milieu de poulet stérilisé mentionné ci-dessus placé dans un ballon de 2 litres, suivant une quantité d'ino-40 eulat de 10^-10^ cellules viables/ml, et on les fait croître à 37°C 71 47074 8 2120078 par une culture statique jusqu'à ce qu'on atteigne une phase sta- 6 8 tionnaire avec une concentration de 10-10 cellules/ml» La culture est alors désactivée en ajoutant 0,1 % du thimérosal et on laisse le bouillon reposer à 4°C pendant environ 24 heures. Du gel 5 d'hydroxyde d'aluminium préparé par le procédé décrit ci-dessous est ajouté au bouillon de culture désactivé, suivant un rapport d'environ 1 volume pour 50 volumes du bouillon de culture. On laisse le mélange reposer pendant environ 5 minutes à la température ambiante, puis on soumet à une centrifugation continue à 10 6.000-12.000 tours/minute avec un taux de débordement de 100 ral/mn. Dans le précipité rassemblé par centrifugation, on ajoute une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour donner une suspension ayant environ 33 fois la concentration du bouillon de culture d'origine. De la tylosine est ajoutée comme antisepti-15 que à la suspension pour amener la concentration finale à 5 %. Préparation de gel d'hydroxyde d'aluminium : Un léger extrait de solution aqueuse à 1 % de. sulfate d'ammonium et d'aluminium est mis à réagir avec de l'ammoniaque à 1 % et le fluide surnageant est retiré par décantation. Le préci-20 pité est lavé à maintes reprises avec de l'eau jusqu'à ce que l'ion ammonium disparaisse du lavage. Le précipité est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes dans un autoclave pour obtenir un gel d'hydroxyde d'aluminium à utiliser comme adjuvant. Préparation du vaccin Hg à 15 # : . 25 Une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2- 7,5) et du gel d'hydroxyde d'aluminium sont mélangés avec 15 volumes de la suspension concentrée 33 fois, mentionnée précédemment, pour faire 100 volumes du produit final contenant 50 volumes du gel d'hydroxyde d'aluminium. 30 EXEMPLE 2 Environ 10^ cellules du virus de la maladie de Newcastle souche Sato sont inoculées dans la cavité allantoique d'un oeuf d'embryon de poulet, vieux de 9 à 11 jours, et on les amène à se propager pendant 26-36 heures à 37°C dans un incubateur. Le fluide 35 allantoîque est pris dans l'oeuf embryonnaire et on lui ajoute de la p-propiolactone comme agent de désactivation pour donner une concentration finale de 0,05 %. On laisse alors le fluide reposer à 4°C pendant 3O-6O minutes. Le fluide est centrifugé à 3.000 tours/minute pendant environ 30 minutes pour retirer tout 40 précipité résiduel. 71 47074 9 2120078 Préparation de vaccin ND à 15 % : Dans 15 volumes du fluide surnageant- ainsi obtenu qui contient 10^*^-10^*^ DEI^0/ml de virus de la maladie de Newcastle souche Sato, on ajoute 50 volumes du gel d'hydroxyde d^aluminium 5 décrit dans l'exemple 1. On dilue alors le mélange jusqu'à 100 volumes avec une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2 - 7,5). EXEMPLE 3 Un vaccin IB à virus tués est préparé à la manière déeri- 10 te dans l'exemple 2, sauf que le virus de la bronchite infectieuse, souche Beaudette 42, est employé à la place du virus de la maladie de Newcastle, souche Sato. Préparation du vaccin IB à 15 % : Dans 15 volumes du fluide surnageant obtenu, qui con- ii ■7 15 tient 10 -10' DEI,_0/ml de souche Beaudette 42, on ajoute 50 volumes d'hydroxyde d'aluminium décrit dans l'exemple 1. Le mélange est alors dilué jusqu'à 100 volumes avec une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5). EXEMPLE 4 20 Préparation de vaccins combinés à virus tués comprenant du vaccin ND à 15 % et du vaccin IB à 15 % ï Dans un mélange de 15 volumes du fluide surnageant contenant 10^*5_io9»5dei /ml de virus de la maladie de Newcastle sou- 5U che Sato, décrit dans l'exemple 2, et 15 volumes du fluide surna- 25 géant contenant 10^-10^ DEI^/ml de souche Beaudette 42, décrit dans l'exemple 3, on ajoute 50 volumes du gel d'hydroxyde d'aluminium décrit dans l'exemple 1. Le mélange est alors dilué jusqu'à 100 volumes avec une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5). 30 EXEMPLE 5 Préparation d'un vaccin combiné à bactéries et à virus tués comprenant du vaccin IB à 15 % et du vaccin Hg à 15 % î Dans un mélange de 15 volumes du fluide surnageant con- Jl rj tenant 10 -10' DEI^/ml de souche Beaudette 42, décrit dans l'exem- 35 pie 3, et 15 volumes de la suspension concentrée 33 fois décrite dans l'exemple 1, on ajoute le gel d'hydroxyde d'aluminium décrit dans l'exemple 1 et la solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour constituer 100 volumes du produit final contenant 50 volumes du gel d'hydroxyde d'aluminium. 40 71 47074 10 2120078 EXEMPLE 6 Préparation d'un vaccin combiné à bactéries et à virus tués comprenant du vaccin ND à 15 % et du vaccin Hg à 15 % : Dans un mélange de 15 volumes du fluide surnageant con-5 tenant 10^*5_iq9*5 DEI^/ml de virus de la maladie de Newcastle souche Sato, décrit dans l'exemple 2, et 15 volumes de la suspension concentrée 33 fois décrite dans l'exemple 1, on ajoute le gel d'hydroxyde d'aluminium décrit dans l'exemple 1 et la solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour constituer 100 vo-10 lûmes du produit final contenant 50 volumes du gel d'hydroxyde dfelu minium. EXEMPLE 7 Préparation d'un vaccin combiné à bactéries et à virus tués comprenant du vaccin ND à 15 %, du vaccin IB à 15 % et du 15 vaccin Hg à 15 % î Dans un mélange de 15 volumes du fluide surnageant contenant 106'5_iO9>5 DEI,_n/ml de virus de la maladie de Newcastle ^>u souche Sato, décrit dans l'exemple 2, 15 volumes du fluide surna- if y géant contenant 10 -10' DEI^/ml de souche Beaudette 42 décrit 5U 20 dans l'exemple 3 et 15 volumes de la suspension concentrée 33 fois décrite dans l'exemple 1, on ajoute le gel d'hydroxyde d'aluminium décrit dans l'exemple 1 et la solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour constituer 100 volumes du produit final contenant 50 volumes de gel d'hydroxyde d'aluminium. 25 EXEMPLE 8 Préparation d'un vaccin combiné à bactéries et à virus tués comprenant du vaccin ND à 15 %, du vaccin IB à 15 % et du vaccin Hg à 15 %i Dans un mélange de 15 volumes du fluide surnageant con- 30 tenant 10^*^-10^'^ DEIco/ml de virus de la maladie de Newcastle 50 souche Sato, décrit dans l'exemple 2, 15 volumes du fluide surna- 1l y géant contenant 10 -10' DEI^g/ml de souche Beaudette 42, décrit dans l'exemple 3, et 15 volumes d'une suspension concentrée 33 fois de souche 221 d'Hemophilus gallinarum, préparée de la même 35 manière que celle décrite dans l'exemple 1, sauf que le gel de phosphate de calcium décrit ci-dessous est utilisé à la place de gel d'hydroxyde d'aluminium, on ajoute du phosphate de calcium et une solution saline-tampon phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour constituer 100 volumes de produit contenant 50 volumes de gel de 40 phosphate de calcium. 71 47074 ii 2120078 Préparation d'un gel de phosphate de calcium s Dans 10 litres d'une solution aqueuse contenant 1/10 M de chlorure de calcium, on ajoute 10 litres d'une solution aqueuse contenant 1/10 M de phosphate acide de sodium et le fluide est 5 retiré par décantation. Le précipité est lavé à maintes reprises avec de l'eau jusqu'à ce que l'ion ammonium disparaisse du lavage aqueux. Le précipité est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes dans un autoclave et utilisé comme gel de phosphate de calcium. EXEMPLE 9 10 Préparation d'un vaccin combiné à bactéries et à virus tués comprenant du vaccin ND à 15 %, du vaccin IB à 15 % et du vaccin Hg à 15 % : Dans une solution de 15 volumes du fluide surnageant, contenant 10^'5_iq9j5 dei^/uji de virus de la maladie de Newcastle 15 souche Sato, décrit dans l'exemple 2, 15 volumes du fluide surnageant Il 7 contenant 10 -10' DEI^Q/ml de souche Beaudette 42, décrit dans l'exemple 3, et 15 volumes d'une suspension concentrée 33 fois de souche 221 d'Hemophilus gallinarum préparée de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, sauf que le gel de phosphate d'alu-20 minium décrit ci-dessous est employé à la place de gei d'hydroxyde d'aluminium, on ajoute le gel de phosphate d'aluminium et une solution saline-tampon'phosphaté stérile (pH 7,2-7,5) pour constituer 100 volumes du produit final contenant 50 volumes de gel de phosphate d'aluminium, 25 Préparation de gel de phosphate d'aluminium : Dans une solution aqueuse à 1 % de phosphate acide de sodium, on ajoute une solution aqueuse à 1 % de chlorure d'aluminium à la température ambiante, tout en agitant, et le fluide surnageant est retiré par décantation. Le précipité est lavé avec de 30 l'eau à maintes reprises jusqu'à ce que l'ion disparaisse du lavage aqueux. Le précipité est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes dans un autoclave et utilisé comme gel de phosphate d'aluminium. Test 1 Des poulets mâles dits Forsgate, âgés de 4 semaines, ont 35 reçu une injection intramusculaire de 0,5 ml d'un vaccin individuel ou combiné, à bactéries et à virus tués, produit par le mode opératoire décrit dans l'exemple 1, 2, 3, 6 ou 7. Les groupes des poulets soumis à l'immunisation et des poulets non immunisés ont été testés avec des bactéries deux semaines plus tard en laissant 40 tomber la souche 221 d'Hemophilus gallinarum dans la cavité nasale. 71 47074 i2 '2120078 Des symptômes de jetage, de gonflement facial et d'éternuement ont été observés quotidiennement pendant 7 jours consécutifs après le test avec des bactéries, et le gain de poids corporel a été mesuré pendant 6 jours. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. 5 Les poulets immunisés avec du vaccin Hg à. ou avec du vaccin combiné comprenant du vaccin Hg à 15 %, du vaccin ND à 15 % et du vaccin IB à 15 % ne présentaient pas de symptômes de coryza infectieux. Les poulets non immunisés et ceux immunisés avec du vaccin ND à 15 % ou du vaccin IB à 15 % présentaient des symptômes de 10 coryza infectieux et une diminution de gain de poids corporel. TABLEAU 1 Groupe Vaccin Nombre de Symptômes du ooryza Infectieux après le test avec les bactéries (%) Gain de poids corporel en 6 jours (g/poulet) poulets 1 2 3 4 5 6 7 (jour) Testé aveo les bactéries Aucun 6 100 100 100 100 100 100 100 31,6 it Hç à 15 % 5 0 0 0 0 0 0 0 67,0 H ND à 15 % 5 100 100 100 100 100 100 100 4,0 " IB à 15 % 5 100 100 100 100 100 100 100 33,0 If Hg à 15 % + ND à 15 % 5 0 0 0 0 0 0 0 89,0 It Hg à 15 % ND à 15 % 5 0 0 0 0 0 0 0 123,0 IB à 15 % Non testé avec les bactéries (contrôle) Aucun 6 0 0 0 0 0 0 0 90,0 VI h-* 4?* VJ O VI 4> N> M l\> O O Vj 00 71 47074 14 2120078 Test 2 Des poulets mâles dits Forsgate, vieux de 4 semaines, ont reçu une Injection intramusculaire de 0,5 ml du vaccin combiné produit par le mode opératoire décrit dans l'exemple 9. La puis-5 sance du vaccin combiné a été déterminée par les procédés décrits ci-dessous : (1) Test avec une souche de bactéries ou de virus : deux semaines après la vaccination, des poulets immunisés et non immunisés ont été testés avec une souche de bactéries, en laissant 10 tomber une souche 221 d'Hemophilus gallinarum à une concentration de 5 x 10' cellules/ml dans la cavité nasale, ou en injectant le virus de la maladie de Newcastle souche Sato à une concentration d'une dose minima léthale de 1000 dans le muscle. Les symptômes de jetage et de gonflement facial ont été observés quotidiennement 15 pendant 10 jours consécutifs après le test. Le nombre de poulets survivants, dix jours après le test, a été noté. (2) Test d'inhibition d'hémagglutination : du sérum a été retiré des poulets deux semaines après la vaccination et du sérum dilué en série (0,2 ml) a été ajouté à 0,2 ml d'un antigène conte- 20 nant 4 unités HA de virus de la maladie de Newcastle souche Ishii. On a laissé reposer le mélange pendant 10 minutes à la température ambiante et puis on a ajouté 0,4 ml de globules rouges du sang de poulet à 0,5 %. Le taux de dilution maximum du sérum pour lequel une agglutination est complètement inhibée a été déterminé. 25 Ce taux de dilution représente le titre d'inhibition d'hémagglutination pour le virus de la maladie de Newcastle (Kawashima et collaborateurs ; Report of Gov. Exp. Sta. Anim. Hyg., 22 19 (1959)). (3) Neutralisation du virus : deux semaines après la vaccination, on a pris dans un poulet 0,2 ml de sérum et on l'a 30 agité avec 0,2 ml d'une dilution convenable de virus de la bronchite infectieuse, souche Beaudette 42. Le mélange a été soumis à l'incubation à 0-4°C dans un réfrigérateur toute la nuit. Ensuite, 0,1 ml du mélange a été inoculé dans la cavité allantoîque d'oeufs embryonnaires vieux de 11 jours. Après incubation pendant une se- 35 maine, les oeufs embryonnaires de poulet ont été examinés, 1 es résultats étant donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Groupe ! Nombre de poulets Symptômes du coryza infectieux après infection par l'Hemophilus gallinarum Gain de poids en 10 jours (g) Titre d'inhibition d'hémagglu-tination pour le virus de la maladie de Newoastle Test^utilisant le virus de la maladie de Newcastle Titre de neutralisation pour le virus de la bronchite infectieuse 123456789 10 (jour) i ! i Contrôle 1 P S 2 P S 3 F S 4 P S 5 F S ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ — ■ — ~ — *- ~ 4* — — —, 4-4-4- 4-4-4- 4-4-4- 4-4-4- 4-+4- 4-4-4- 4-+4- 4-4-4- 4-4-4- +4- +++ ++4* 4-4-4' ++-H ++■+■ 4-444* 4-4-4- 4-+4- ++4* 4-4-4-+++ 4*+ 4-4-4- 4-4-4* ++4* 4-4- 4*4- 4-4* 4*4-4* 4-4-4- 115,0 90,0 85,0 35,0 65,0 , "C 5 D D D D D Moyenne 78,0 0/5^ -0,10 Vaoc iné 6 F S ■ 7 P s 8 P S 9 P S 10 P s ^ ' - - ' ■ 80,0 145,0 120,0 115,0 140,0 40 80 : 10 40 40 S S S S S ■„ ■ Moyenne 120,0 3H 5/5// 2,20 71 I*707k 16 2120078 Indications des symptômes du coryza infectieux : F gonflement facial, S jetage. La sévérité des symptômes est indiquée en général par le nombre de signes + comme suit : 5 : Pas d'apparence de symptômes ++ : Modérément sévère +++ : Très sévère / D : mort, S : survivant ++ survivants/nombre de poulets testés. 10 Test 3 Les effets des vaccins individuels et combinés, à bactéries et à virus tués, sur la bronchite infectieuse et la maladie de Newcastle ont été examinés selon les procédés décrits dans le test 2. Les résultats sont présentés dans les tableaux 3 15 et 4. On a observé que les poulets immunisés par injection de vaccin IB à 15 % seul produisaient à peine d'anti-corps vis-à-vis du virus de la bronchite infectieuse, deux semaines après la vaccination, mais les poulets immunisés par les vaccins combinés à bactéries et à virus tués, se composant de vaccin IB à 15 % et de vac-20 cin ND à 15 % ou de vaccin IB à 15 %, de vaccin ND à 15 % et de vaccin Hg à 15 produisaient totalement un anti-corps vis-à-vis du virus de la bronchite infectieuse. En conséquence, il apparaît d'après les tableaux 3 et 4 que l'activité du vaccin IB est fortement renforcée par administration concomittante avec le vaccin 25 ND. TABLEAU 3 30 35 40 Vaccin Nombre de poulets Poids corporel (g) Titre d'inhibition d'hémagglu-tination pour le virus de la maladie de Newcastle Test utilisant le virus de la maladie de / Newcastle7^ Titre de neutralisation pour le virus de la bronchite infectieuse 1 234 2 172 3 219 Contrôle 4 220 0/6 -0,80 5 190 6 204 71 47074 17 2120078 TABLEAU ? (suite) *7 178 3 160 0 -'5 0,20 Hg à 15 q lob 1 10 lq"> 1 [ - , —* il loO i 184 10 , ■ 13 132 ND à 15 i 14 186 10 5/5 0,000 15 202 20 16 213 ; j 5 rr 183 i 18 1--54 i IB à 15 *€ 19 1"2 0/5 0,00 20 173 ^ 5 ' 21 200 -■ 22 r"8 20 Hg à 15 % 23 216 10 J + 24 240 40 5/5 0,20 ; ND à 15 % 25 210 5 1 1 26 200 5 2*7 186 Hg à 15 * 28 218 + 2Q 150 0/5 0,00 ■ IB à 15 % 30 196 31 192 32 220 40 ; IB à 15 ^ 5? 234 10 1 + 34 190 5 5/5 2,20 ND à 15 % 35 180 10 36 200 20 i Hg à 15 « 3"T l^B 40 - + 3S 216 10 j J IB à 15 % 39 188 5 j 5/5 ■2,50 \ \ ! + 40 194 i ND à 15 36 41 132 10 10 ; 15 25 30 35 71 47074 18 2120078 4 Survivants/nombre de poulets expérimentaux. Les vaccins à bactéries et à virus tués employés dans le test étaient préparés par les modes opératoires décrits dans les exemples 1, ?, 4, 5, 6 et J. S TABLEAU 4 10 Vaccin Nombre de poulets Titre d'inhibition d'hémagglu-tination pour le virus de la maladie de Newcastle Test utilisant le virus de la maladie de / Newoastle7^ Titre de neutralisation pour le virus de la bronchite infectieuse 1 0/5 2 Contrôle 3 0/5 0,00 . 15 4 5 PO Vaccin ND à virus tués disponible sur le marché H 6 7 8 9 10 80 80 40 40 5/5 0,30 " 11 80 12 80 25 ND à 15 % ' 13 14 15 20 10 5 5/5 0,70 16 30 IB à 15 % 17 18 19 20 ^ 5 "C 5 ^ 5 ^ 5 0/5 0,00 35 21 22 IB à 30 % 23 24 25 0/5 -0,30 j 40 71 47074 19 2120078 TABLEAU 4 (suite) 26 5 ND à 15 % 27 160 + 28 40 5/5 1,50 5 IB à 3,75 % 29 10 30 20 31 40 ND à 15 % 32 20 10 + 33 20 5/5 1,80 IB à 7,5 % 34 80 35 40 36 40 15 ND à 15 % 37 20 + 38 40 5/5 • o o •i ai IB à 15 % 39 40 40 80 41 5 ] 20 ND à 15 % 42 10 + 43 10 5/5 o o * OJ IB à 30 % 44 80 î i i 45 80 ( 5 t 1 25 46 40 ND à 15 % 47 80 + 48 80 5/5 2,20 IB à 45 % 49 80 50 80 30 51 80 ND à 10 % 52 5 + 53 5 5/5 2,80 IB à 40 % 54 20 55 40 35 40 / Survivants/nombre de poulets testés. // Produit de la société dite Ghemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Kumamoto, Japan. Les vaccins à virus et à bactéries tués, employés dans 71 47074 20 2120078 le test, ont été préparés par les modes opératoires décrits dans les exemples 2, 3 et 4, sauf que le gel de phosphate d'aluminium a été utilisé à la place du gel d'hydroxyde d'aluminium. X % de vaccinssignifie que X volumes du fluide surnageant contenant 5 io6'5_i09,5 DEI^o/ml de virus de la maladie de Newcastle, souche Sato , ou 10^-10 DEI^0/ml de virus de la bronchite infectieuse, souche Beaudette 42, étaient contenus dans 100 volumes de la solution de vaccin. TABLEAU 5 10 _ 15 20 Vaccin Titre de neutralisation pour le virus de la maladie de Newcastle Titre d'inhibition d'hé-magglutination pour l'Hemophilus gallinarum Semaines après la vaccination • 0 3 5 9 0 3 5 9 Aucun 0 0 0 0 C 5 IB à 15 % 0 1,2 1,0 1,7 Hg à 15 % 0 0 0 0 80 80 20 IB à 15 % + 0 1,2 2,0 2,2 80 80 30 Hg à 15 % Les vaccins tués employés dans le test ont été préparés par les modes opératoires décrits dans les exemples 1, 3 et 5, sauf que du gel de phosphate d'aluminium a été utilisé à la place de gel d'hydroxyde d'aluminium. Bien que l'on ait illustré la présente invention pour les poulets, il apparaîtra aux personnes expérimentées dans les techniques vétérinaires que les vaccins combinés et individuels, 30 à bactéries et à virus tués, selon la présente invention sont applicables d'une manière semblable à d'autres espèces de volaille domestique. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire 35 susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. 71 47074 21 2120078 REVEMPICATIONS 1 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'Hemophilus gallinarum tué, de virus tués delà bron- 5 chite infectieuse et de virus tués de la maladie de Newcastle. 2 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace de (1) la souche 221 d'Hemophilus gallinarum tué, (2) un virus tué choisi dans le groupe se composant du virus de la 10 bronchite infectieuse souche Beaudette 42 tué, du virus de la bronchite infectieuse souche du type Massachusetts tué et du virus de la bronchite infectieuse souche du type Connecticut tué, et (3) un virus tué choisi dans le groupe se composant du virus de la maladie de Newcastle souche Sato tué et du virus de la maladie de 15 Newcastle souche Miyadera tué. 3 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'Hemophilus gallinarum tué et de virus tué de la bronchite infectieuse. 20 4 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utili ser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace de la souche 221 d'Hemophilus gallinarum tué et d'un virus tué, choisi dans le groupe se composant de virus de la 'bronchite infectieuse souche Beaudette 42 tué, de virus de la bronchi- 25 te infectieuse souche du type Massachusetts tué et de virus de la bronchite infectieuse souche du type Connecticut tué. 5 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'Hemophilus gallinarum tué et de virus de la mala- 30 die de Newcastle tué. 6 - Vaccin combiné à bactéries et à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace de souche 221 d'Hemophilus gallinarum tué et d'un virus tué, choisi dans le groupe se composant du virus de la mala- 35 die de Newcastle souche Sato tué et du virus de la maladie de Newcastle souche Miyadera tué. 7 - Vaccin combiné à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il contient une quantité efficace de virus de la bronchite infectieuse tués et de virus de la maladie 40 de Newcastle tués. 71 47074 22 2120078 8 - Vaccin combiné à virus tués, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace de (1) un virus tué, choisi dans le groupe se composant de virus de la bronchite infectieuse souche Beaudette 42 tué, de virus de la 5 bronchite infectieuse souche du type Massachusetts tué et de virus de la bronchite infectieuse souche de type Connecticut tué, et de (2) un virus tué choisi dans le groupe se composant de virus de la maladie de Newcastle souche Sato tué et de virus de la maladie de Newcastle souche Miyadera tué. 10 9 - Vaccin contre le cozyza infectieux, à bactéries tuées, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il est préparé en cultivant une souche d'Hemophilus gallinarum dans un milieu nutritif naturel, en désactivant les bactéries et en récoltant les bactéries désactivées. 15 10 - Vaccin contre le coryza infectieux, à bactéries tuées, à utiliser pour la volaille, caractérisé en ce qu'il est préparé en cultivant la souche 221 d'Hemophilus gallinarum dans un milieu nutritif naturel, en désactivant les bactéries et en récoltant les bactéries désactivées. 20