i 2070084 Cette invention concerne un nouveau procédé de récupération et de purification utile dans le domaine des antibiotiques pénicillines. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de récupération à partir d'un mélange d'isomères d'os-car boxy-5 benzylpénicillline de l'isomère qui fournit un sel de calcium pratiquement insoluble. Elle concerne également le nouveau sel de calcium cristallin de l'isomère d'os-car boxybenzylpénic illine ainsi obtenu. 10 formes nouvelles et améliorées d'antibiotiques du type de la pénicilline. Dans de nombreux cas, ces efforts ont fait intervenir la synthèse et l'essai de dérivés tels que benzyl-pénicilline, phênoxyméthylpénicilline, os-phénoxyéthylpénicilline et, plus récemment, k-carboxybenzylpénicilline comme il est 15 décrit dans le Brevet E.U.A. N° 3.142.673. Ce dernier produit a l'avantage de combattre diverses souches de bactéries résistant à la pénicilline, spécialement lorsqu'on l'administre par injection. Malheureusement, cependant, la forme sous laquelle on l'administre habituellement (le sel disodique) telle qu'elle 20 est obtenue par les méthodes de la technique antérieure est amorphe plutôt que cristalline, elle ast quelque peu instable, de nature tout à fait hygroscopique, et elle possède une demie vie biologique relativement courte en raison de grandes vitesses d'absorption et d'excrétion dans le corps. 25 On a désormais trouvé qu'il est possible de résoudre ces problèmes de la technique antérieure et d1 obtenir une stabilité biologique maximale en utilisant le nouveau sel de calcium, pratiquement insoluble, de l'isomère d'cs-carboxyfeenzylpénicilline, qu'il est surprenant d'obtenir sous une forme cristalline pure 30 par réaction de double décomposition avec.les sels hydrosolubles correspondants, ou par une réaction de déplacement avec l'acide libre, ce qui entraîne également un "dédoublement" inattendu mais utile. Le sel de calcium concerné par la présente invention est un diastéréoisomère pur de formule : Par le passé, divers chercheurs ont essayé d'obtenir des 35 H 6 7 H COO 0 40 70 33956 2 2070084 Les avantages offerts par l'emploi du procédé de cette invention sont multiples. On peut améliorer la qualité d'un échantillon de mélange diastéréoisomère d1 oi-carboxybenzylpénicil-line brut sous la forme de sel disodique ou d'acide libre, 5 dans les deux cas un mélange approximativement 50:50 en diastéréoisomères, en le transformant en isomère moins soluble d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium avec des rendements élevés et avec élimination sensiblement totale des impuretés contenues. Le sel de calcium moins soluble est précipité 10 initialement et, au stockage du filtrat, une isomérisation a lieu spontanément avec précipitation ultérieure du même produit. Ceci met en jeu une faible dépense, étant donné que les réactifs utilisés sont relativement bon marché et qu'on peut se les procurer facilement ; aucun équipement très étudié 15 n'est nécessaire. En outre, le nouveau sel de calcium cristallin obtenu comme produit final dans cette invention rend possible la préparation de formes posologiques intramusculaires à action prolongée de l'antibiotique. L'ci-car boxybenzylpénic illine de calcium décrite ici est encore utile comme intermédiaire 20 d'un sel disodique cristallin pur de l'isomère correspondant au sel de calcium insoluble, comme, il est illustré dans les exemples joints. Selon le nouveau procédé de cette invention, on associe un mélange des isomères de l'o-carboxybenzylpénicilline sous la 25 forme des acides libres ou de leurs sels hydrosolubles, dans un solvant aqueux, à au moins une proportion sensiblement équivalente d'un sel de calcium hydrosoluble, ce qui entraîne la cristallisation de l'isomère d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium pur, sensiblement insoluble, et la possibilité de le séparer par un 30 moyen classique. Comme indiqué, on peut introduire le mélange isomère impur sous la forme d'un sel hydrosoluble, tel qu'un sel d'aminé ou un sel de métal alcalin, par exemple les sels monosodique, disodique, de potassium, ou de lithium. On préfère habituellement 35 le sel disodique. Le choix du solvant aqueux n'est pas important, et les milieux de réaction aqueux particulièrement appropriés, dans le cas des sels hydrosolubles, comprennent l'eau pure et l'eau contenant de l'alcool propylique ou de l'alcool isopropy1iquei On peut utiliser des proportions substantielles de propane!, 40 jusqu'à 15 volumes ou plus par volume d'eau, mais des proportions 70 33956 3 2070084 allant jusqu'à environ 5 volumes sont habituellement tout à fait convenables. Sinon, on peut introduire le mélange d'isomères de pénicilline impure sous la forme de l'acide libre. Divers 5 solvants aqueux conviennent, mais on préfère des alcools aqueux, spécialement un alcool butylique ou amylique saturé d'eau. Ceux-ci sont les plus convenables en raison de leurs excellentes propriétés solvantes pour la forme acide libre de la pénicilline, ainsi que de leur caractère inerte vis-à-vis de la réaction. 10 On préfère particulièrement le n-butanol saturé d'eau. Un extrait butanolique d'a-carboxybenzylpénicilline, préparé comme il est décrit dans le Brevet E.U.A. N° 3.142.673, constitue une solution de départ appropriée. On introduit comme source d'ion calcium le sel de calcium 15 hydrosoluble. On peut utiliser n'importe quel sel de calcium hydrosoluble, parmi lesquels l'acétate de calcium, le chlorure de calcium, le lactate de calcium, 1'isobutyrate de calcium, etc. On préfère en particulier pour leur faible prix et la facilité de se les procurer l'acétate de calcium et le chlorure 20 de calcrum. On doit utiliser une proportion de sel de calcium au moins sensiblement équivalenta à la pénicilline, c'est-à-dire une proportion stoechiométrique, de manière à obtenir le rendement optimal. L'utilisation d'un excès n'est pas nuisible, mais elle n'est pas économique et ne répond à aucun objectif utils. On 25 réalise habituellement le procédé à la température ambiante, c'est-à-dire à environ 20-25°C, avec agitation. On effectue la récupération du nouveau sel de calcium d'a-carboxybenzylpénicilline par des moyens classiques. Le sel de calcium pur cristallise spontanément, et pour améliorer le 30 rendement on peut concentrer la liqueur mère sous pression réduite pour obtenir plus de produit. On peut également refroidir le mélange de réaction, par exemple à 0-10°C, pour augmenter 16 rendement. L'isomère cristallin extrêmement pur d'a-carboxybenzyl-35 pénicilline de calcium, obtenu par le procédé de cette invention, ne présente pas de point de fusion défini mais plutôt se ramollit ou fond avec décomposition dans la gamme de température d'environ 219-233°C. Il possède une solubilité dans l'eau d'environ 7-12 mg par ml de solution et présente une valeur de 40 bioessai allant jusqu'à 1157 mg/g par la méthode de diffusion 70 33956 4 2070084 sur plaque (par rapport au produit classique' a-carboxybenzyl- pénicilline disodique), lorsqu'on fait le calcul en acide libre, en utilisant Pseudomonas aeruginosa comme organisme-test. Lorsqu'il est dissous dans une solution aqueuse de bicarbonate __26° 5 de sodium à 1 %, il présente un pouvoir rotatoire optique /aZ d'environ + 177° à 184°, et dans une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 2 % la valeur est d'environ + 173° à 184°. Lorsqu'il est dissous dans de l'eau deutérée à 200 mg par ml avec un poids égal de bicarbonate de sodium, ce sel de calcium pur présente un 10 spectre de résonance magnétique nucléaire caractéristique avec absorption pour cinq protons sous forme d'un singlet à ^7,94 (phényle). , deux protons sous forme d'un singlet à 6,09 (protons en 5 et 6), un proton sous forme d'un singlet à 5,13 (proton en 3'), un proton sous forme d'un singlet à 4,80 (proton en 3) et 15 six protons sous forme d'un singlet à 2,00 p.p.m. (CÎI3) • Ce spectre diffère de celui de l'a-carboxybenzylpénicilline disodique de la technique antérieure en ce que les protons en 3' et 3 ne sont pas des doublets, et que le pic méthyle est un singlet, indiquant ainsi que l'os-çarboxybehzylpénicilline de calcium de 20 la présente invention est un isomère simple plutôt qu'un mélange épimère. La présence c'e deux isoiaères dans le sel disodique de la technique antérieure jdu'^ au carbone 3' est indiquée par les doublets pour les protons en 3' et 3, respectivement, et un pic asymétrique pour les protons du groupement méthyle. 25 Lorsqu'on laisse l'isomère sel de calcium pur de la présente invention dans l'eau deutérée (D20) pendant environ 48 heures, il s'isomérise (c'est-à-dire qu'il s'épimérise) en un mélange environ 50:50 d'épimères, qui est le rapport des isomères trouvés dans l'oi-carboxybenzylpénicilline disodique commerciale de la 30 technique antérieure. L'invention est illustrée par les exemples suivants, que l'on ne doit pas considérer comme fixant une limitation à son champ d'application. Divers autres modes de réalisation et équivalents se révéleront facilement d'eux-mêmes à l'homme de l'art. 35 EXEMPLE 1 On dissout 221,6 g (0,5 mole) du sel disodique brut de 1'a-carboxybenzylpénicilline dans 400 ml d'eau distillée, en agitant. Lorsque la solution résultante est limpide, on ajoute lentement 400 ml d'isopropanol, puis ensuite 80,0 g (0,5 mole) 40 d'acétate de calcium monohydraté dissous dans 250 ml d'eau 70 33956 5 2070084 additionnée de 250.ml d'isopropanol. Puis ensuite on ajoute lentement 1000 ml d*isopropanol de manière à ce que le rapport final de 1'isopropanol de manière à ce que le rapport final de 1'isopropanol à l'eau dans le mélange soit approximativement 5 2,5:1,0. ©n agite vigoureusement le mélange pendant 60 minutes et ensuite on le filtre pour séparer le produit cristallin qui a précipité. Après avoir lavé avec 200 ml de mélange isopropanol-eau (3:2 en volume) on repulpe le gâteau de filtration dans 300 ml d'eau, on le filtre et on le lave avec le mélange 10 isopropanol-eau et finalement avec 11isopropanol. En séchant sous vide, on obtient 151 g d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium cristalline pure (isomère pur à 100 %) ayant les propriétés caractéristiques suivantes : p.f„ 220-233°C (déc) y /â£26°+ 177° (c = 0,4804, NaHCO^ aq. à 1 %) ; /J^A' + 180° 15 (c = 0,9796, NaHC03 aq. à 1 %) ; /§g2ô° + 173° (c = 1,9959 NaHC03 aq. à 2 %). Le spectre rmn présente une absorption pour cinq protons sous forme d'un singlet à $7,94 (phényle),deux protons sous forme d'un singlet à 6,09 (protons en 5 et 6), un proton sous forme d'un singlet à 5,13 (proton ea 3'), un 20 proton sous forme d'un singlet à 4,80 (proton en 3) et six protons sous forme d'un singlet à 2,00 p.p.m. (CH^). Analyse. Calculé pour C-j^H^g^OgSCa^H^O : C, 45,12 ; H, 4,46 ; N, 6,19 ; S, 7,09 ; Ca, 8,86. Trouvé : C, 44,35 ; H, 4,56 ; N, 5,85 y S, 6,65 ; 25 Ca, 9,11. Ce produit a une activité in vitro de 1060 mg/g par la méthode de bioessai par diffusion sur plaque par rapport au produit normal «-carboxybenzylpénicilline disodique, avec Pseudomonas aeruginosa comme organisme-test. 30 EXEMPLE 2 On dissout 21,1 g (0,05 mole) d 'c:-carboxybenzylpénicilline disodique dans 30 ml d'eau distillée en agitant. On dilue la solution à 50 ml avec de l'eau et on ajoute 8,8 g (0,05 mole) d'acétate de calcium inonohydrate dans 30 ml d'eau. Ensuite on 35 agite le mélange rêactionnel pendant 1,5 heure au fur et à ffiesurl/ fait la cristallisation. Après filtration, lavage du gâteau de filtration avec 10 ml de mélange isopropanol-eau à 50 % et séchage sous vide, on obtient 14,9 g d!Qi-carboxyfcenzylpéniciilir-e de calcium cristalline, pure, identique au produit de l'Exemple 1. PAO ORIGINAL 70 33956 6 2070084 EXEMPLE 3 On traite une solution agitée de 11,0 g (0,025 mole) d'a-carboxybenzylpénicilline disodique dans 20 ml d'eau distillée par 2,8 g (0,025 mole) de chlorure de calcium anhydre dissous 5 dans 5 ml d5eau distillée. On agite le mélange résultant pendant ancore 3-4 minutes et on le dilue avec 25 ml d1isopropanol. Après avoir gratté la paroi du bêcher et avoir ensemencé avec quelques cristaux du sel. de calcium pur obtenu dans 1!Exemple 1, puis avoir ensuite dilué à un volume total de 10 200 ml en ajoutant de 1'isopropanol, on agite le mélange pendant encore 20 minutes et on le filtre. On lave le gâteau de filtration avec le mélange isopropanol-eau et ensuite avec de 15isopropanol sec, et on le sèche sous vide pour obtenir 6,9 g d'a-carboxybenzyipénicilline de calcium cristalline, pure, 15 identique au produit de l'Exemple 1. EyWMPT.R 4 On répète le mode opératoire décrit dans l'Exemple 3 si ce n'est que l8on ajoute 5,6 g (0,05 mole) de chlorure de calcium anhydre dans 10 ml d'eau, à la solution aqueuse d'a-carboxy-20 benzylpénicilline disodique, plutôt qu'une quantité, équimolaire telle qu'il a été utilisé auparavant. On agite le.mélange aqueux pendant 20 minutes et on le dilue à 1!isopropanol jusqu'à un volume total de 400 ml. Après avoir encore agité pendant 1,5 heure, puis après avoir filtré, on obtient 10,4 g d1a-carboxybenzy1-25 pénicilline de calcium. Par repulpage dans 25 ml.d'eau distillée, en agitant pendant 30 mn, et filtration subséquente et séchage on obtient de 1'a-carboxybenzyIpénicilline de calcium cristalline, pure, identique au produit de 13Exemple 1. Le rendement est 4,9 g. EXEMPLE 5 30 On dissout, en agitant, 110 g (0,25 mole) du sel disodique de 1'a-carboxybenzylpénicilline dans 200 ml d'eau distillée. A lâ solution résultante on ajoute 28 g (0,25 mole) de chlorure de calcium anhydre dans 50 mi d8eau distillée. Après ensemencement avec quelques cristaux d1a-carboxybenzyipénicilline de calcium 35 pur et agitation pendant encore 15-20 minutes, on dilue la solution à 4 litres avec de 1®isopropanol. On agite ensuite le mélange pendant 1,5 heure et on le filtre. Par lavage du gâteau de filtration avec de 1 * isopropanol et séchage à l'air jusqu'à .poids constant, on obtient 126,8 g de produit. On repulpe celui-ci 40 pendant 30 minutes dans 200 ml d'eau distillée, on le filtre, BAD ORIGINAL 70 33956 7 2070084 on le lave à l'eau et on le sèche, pour obtenir 71,3 g d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium cristalline, pure, identique au produit de l'Exemple 1. EXEMPLE 6 5 On traite une solution de 480 g (1,0 mole) d'a-carboxybenzyl pénicilline disodique dans 960 ml d'eau distillée par 184,8 g (1,05 mole) d'acétate de calcium monohydraté dissous dans 500 ml d'eau distillée. On ensemence la solution résultante avec quelques cristaux du produit pur obtenu antérieurement et on 10 l'agite à la température ambiante pendant six heures. On sépare par filtration 1'a-carboxybenzylpénicilline de calcium précipitée et on la lave avec deux portions de 100 ml d'eau, et on met le filtrat aqueux de côté. On repulpe le gâteau de filtration dans 500 ml d'eau en agitant pendant 30 minutes, puis on ajoute encore 15 100 ml d'eau. Par filtration et séchage sous vide on obtient 247,5 g (rendement de 60 %) d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium cristalline, pure, identique au produit de l'Exemple 1. Cette récolte particulière de cristaux présente une valeur d1?. bioessai de 990 mg/g (calculé en tant qu'acide) par la méthode de diffusion 20 sur plaque, utilisant P.. aeruginosa comme organisme-test. On concentre le filtrat aqueux (2500 ml) ou la liqueur mère obtenue dans la première cristallisation, sous une pression de 10-15 mm de Hg et à une température d'environ 30°CX jusqu'à environ 800 cc et on refroidit pour obtenir une seconde récolte 25 de cristaux. On repulpe ce produit dans 300 ml d'eau pendant 30 minutes* on le sépare et on le sèche sous vide pour obtenir 118,0 g (25 %) d'une seconde récolte. Cette récolte est identique au produit de l'Exemple 1 et présente une valeur du bioessai de 980 mg/g (calculé en tant cru'acide) , par la méthode de 30 diffusion sur plaque par rapport à P.. aerucrinosa. Le rendement total en a-carboxybenzylpénicilline de calcium cristalline, pure, s'élève à 85 %. EXEMPLE 7 On répète le mode opératoire décrit dans l'Exemple 1 si ce 35 n'est que l'on utilise d'autres sels d'a-carboxybenzylpénicilline hydrosolubles comme matières de départ au lieu des sels disodiques. Lorsqu'on utilise de 1'a-carboxybenzylpénicilline bipotassique impure sur la même base molaire que le sel de sodium, le produit est la même a-carboxybenzylpénicilline de calcium 40 cristalline, pure, que celle de l'Exemple 1 (c'est-à-dire isomère 70 33956 8 2070084 pur à 100 %) . De la même manière, 1'a-carboxybenzylpénicilline dilithique brute fournit également la même a-carboxybenzy1-pênicilline de calcium cristalline, pure. EXEMPLE 3 5 On répète le mode opératoire décrit dans ltExemple 1 si ce n'est que l'on utilise le n-propanol au lieu de 1'isopropanol. Le produit obtenu est le même produit a-carbo^cybenzylpénicilline de calcium cristalline, pure, que celui de l'Exemple 1. EXEMPLE 9 10 On traite par 300 ml de n-butanol une solution constituée de 100 g d'a-carboxybenzylpénicilline disodique pure à 90 % (0,212 mole) dissous dans 300 ml d'eau glacée. Ensuite on ajuste le pH à 2,6 avec 424 ml diacide chlorhydrique 2N. On élimine du mélange la couche organique qui s'est séparée et on extrait 15 encore la couche aqueuse restante avec deux portions de 50 ml de n-butanol neuf avant de la jeter. On refroidit dans un bain glacé à 5-10°C les extraits butanoliques associés (environ 400 ml) , contenant 1 ' os-rarboxy- ! benzylpenicilline sous la forme acide libre, et on traite par 20 40,5 g (0,23 mole) d'acétate de calcium monohydraté dissous dans 100 ml d'eau. On continue à agiter pendant 15 minutes et ensuite on laisse le mélange se mettre à la température ambiante pendant une durée de quatre heures. On récupère par filtration le matériau cristallin précipité et on le repulpe successivement 25 dans 400 ml d'eau, 500 ml d'acétone et 400 ml d'eau. Après séchage à la température ambiante, on obtient un rendement de 75 g d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium cristalline, pure (isomère pur à 100 %) ayant les propriétés suivantes : p.f. 219-230°C (déc.) ; /§g26° +183,7° (c = 0,4804, NaHCO aq. à 30 X %) ; /«726°+ 180,1° (c = 0,8216, NaHC03 &qa à 1 %) ; /§£ -î-183,7° (c = 2,0056, NaHCO^ aq. à 2 %) . Le spectre rmn présente une absorption pour un seul pic de groupement méthyle à 2,00 ppm. Analyse : Calculé pour C^7H^6N206SCa.2H20 ï C, 45,12 ; H, 4,46 ; N, 6,19 ; S, 7,09 ; Ca, 8,86. 35 Trouvé C, 44,52 ; H, 4,32 ; N, 5,87 ; S, 7,21 ; Ca, 8,60. Cette récolte particulière présente une valeur du bioessai de 1157 mg/g par la méthode de diffusion sur plaque (par rapport au produit classique a-carboxybenzylpénicilline disodique), à l'aide de Pseudomonas aeruginosa comme organisme-test. 40 On obtient pratiquement les mêmes résultats en répétant .70 33956 9 2070084 l'expérience en remplaçant le n-butanol par l'alcool n-amyligue primaire, l'alcool isoamylique ou l'alcool isobutylique. A un mélange bien agité de 75 g (0,158 mole) d'œ-carboxy— 5 benzylpénicilline de calcium dihydratéa,cristalline, pure à 95 % (isomère pur à 100 %) en suspension dans 250 ml d'eau froide, on ajoute goutte-à-goutte une solution de 16,7 g (0,158 mole) de carbonate de sodium anhydre dans 1500 ml d'eau, refroidi à 5°C. Ensuite on agite le mélange rêactionnel pendant 10 minutes 10 et on le filtre sur un entonnoir de verre fritte pour éliminer le carbonate de calcium précipité. Le filtrat a un pH de 7,8. On le verse dans des fioles de Wheaton N° 10, en utilisant 9,5 ml de filtrat par fiole, et on le lyophilise à 50-100 microns pour obtenir de 1'a-carboxybenzylpénicilline disodique pure _ 2 Ç\ ° 15 (1.. g/fiole) ayant un pouvoir rotatoire optique de /a7 + 185,5° et une valeur du bioessai de 1133 If/wg par la méthode de diffusion sur plaque par rapport à P. aeruginosa. Analyse. Calculé pour C^H^.N20gSNa2 : Na, 10,89. EXEMPLE 10 Trouvé Na, 11,06 \ \ \ \ \ ../.. 70 33956 10 2070084 REVENDICATIONS 1. Un procédé pour récupérer l'isomère sensiblement insoluble de l1 os-carboxybenzylpénicilline de calcium à partir d'un mélange des isomères de lsoî-carboxybenzvlpénicilline sous la forme des 5 acides libres ou de leurs sels hydrosolubles, caractérisé en ce que l'en combiné ledit mélange dans un solvant aqueux avec au moins une proportion sensiblement équivalente d'un sel de calcium hydrosoluble, et que l'on isole l'isomère d'a-carboxybenzylpénicilline de calcium qui cristallise. 10 2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit mélange d'isomères est sous la forme d'un sel hydrosoluble et que ledit solvant aqueux est de l'eau contenant jusqu'à 15 volumes d'alcool propylique ou d'alcool isopropylique. 3. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le 15 fait que ledit mélange d'isomères est sous la forme d'un sel hydrosoluble et que ledit solvant aqueux est l'eau. 4. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit mélange d'isomères est sous la forme du sel disodique de 15a-carboxybenzylpénicilline. 20 5. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit mélange d* isomères est sous la forme de l'acide libre et que ledit solvant aqueux est un alcool butylique ou amylique saturé d'eau* 6. Le procédé selon la revendication 5, caractérisé par le 25 fait que ledit solvant aqueux est le n-butanol saturé d'eau. 7. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit sel de calcium hydrosoluble est l'acétate de calcium. 8. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé par le 30 fait que ledit sel de calcium hydrosoluble est le chlorure de calcium.