Les thyrocalcitonines qui sont des hormones du type polypeptide existent dans les glandes thyroïdes des mammifères, y compris les porcs et les humains, et agissent comme agents abaissant la teneur en calcium dû sérum par inhibition de la résorption 5 des os. On a pu isoler des thyrocalcitonines de la glande thyroïde de mammifères, et on a déterminé leur structure: cf• par oscomple "Purification and Structure of Porcine Calcitonon-1" par P.H» Bell, et Crs, Journal of the American Chemical Society, 90:10, S Mai 1960® On notera que la structure exacte de la thyrocalcitonine n'est vrai«» 10 semblableaent pas identique à celle de la thyrocalcitonine existant dans la glande thyroïde d'un mammifère particulier car les procédés utilisés pour isoler ces substances comportent des modes opératoire® qui peuvent provoquer de légères modifications de structurée II est également probable que lorsqu*on administre la thyrocalcitonine 15 possédant la structure indiquée dans la publication de Barg et Bell à des êtres humains en vue d'un traitement thérapeutique, les réactions du corps du patient provoquent de légères modifications de la structure chimique exacte. D'autres chercheurs ont isolé des thyrocalcitonines à partir d'organes de mammifères variés. On citera 20 entre autres les travaux suivants : Tenenhouse, Arnaud et Rasmussen3 Proceedings of the National Academy of Sciences, volume 53, pages 818-822 (1965); Hirsch, P.F. Gauthier, G.Fo et Munson, P.L., Endocrinology. volume 73, pages 244-252 (1963); Foster, G.V. Baghdiantz, A* Kunar, M.A. Slack, E», Soliman, A.A., et Maclntyre, 25 Io, Nature, volume 202, pages 1303-1305 (1964); Maclntyre, I., et Parsons, J.A., Journal of Physiology (London), volume 183, pages 31-33 (1965); Maclntyre, I., Parsons, J.A., et Robinson, 0QJ# Journal of Physiology —(London). volume 191, pages 393-405 (1967)5 Kahnt, F.W., Riniker, B., Maclntyre, I., et Neher, R. Helvetiea 30 Ghimica Acta. volume 51, Fascicule premier, pages 214-217 (1968); et Franz, J., Rosenthaler, J., Zehnder, K., Boepfner, W., Huguenon, R., et St. Guttmann, ibidem, pages 218-220. La présente invention concerne, & titre de produits chimiques nouveaux, des substances actives synthétiques dm type 35 thyrocalcitonine qui présentent une chaîne plus courte que celle des 32 dérivés d'aminoacides décrits dans la publication de Barg et Bell. On a constaté que pour parvenir à une activité analogue à celle de la thyrocalcitonine, la chaîne d'aminoacides la plus courte, 69 14459 =2 2008037 10 en partant du groupe terminal aminé/ devait contenir 16 aminoacides. L'activité observée, est inférieure à celle de la thyrocalcitonine elle-même« L'invention comprend également d*autres thyrocalcitonines synthétiques contenant des chaînes de 17 & 31 aminoacides* Les structures des composés de l'invention peuvent être représentées par la notation ci-après % S 'S' ~ '■ • t i « Gys. Ser. Asx.Leu. Ser. Thr.Cys. Fal.Leu. Ser. Ala. ïyr. Try. 12 3 4 5 6 7 .8 9 10 11 12 13 ArgeAasE»(Lsu. ), (Asx. )■, (Asx. )_(Phee L(His. )_(Arg. )_ 14 15 16 17 1 18 . 19 n 20 ° 21 P (Phe.) (ser.) (Gly.) ( Met. ) «. {Gly a) (Phe 3)v{Gly* 22 q 23 24 25 26 . 27 28 (Pro.) (Gly.)v(Thr.) 29 x 30 7 31 z dans laquelle les symboles k is Inclus soat des nombres égaux & 0 eu 1, les points représentant, selon la manière traditionnelle, des liaisons reliant- les aminoacides satire ©ox ou t das groupes variée* A titre d'exemple, un point placé sur le G terminal ou sur le N terminal indiqua que ces atomes terminaux peuvent être libres (à l'état de groupe carboxyle ou amino) ou substitués. Dans ce dernier ^ cas, il s'agit de toutes les substitutions usuelles. Ainsi donCj, un point placé sur un atome de carbone terminal peut désigner un groupe carboxyle libre, un groupe carboxylamide, un groupe acide carboxyll-que estérifié ou une autre modification usuelle du groupe carboxyle. De même, un point placé sur un N terminal doit être interprété de manière aussi libérale et représente en particulier un groupe amino libre, un groupe amino acylé ou ua groupe amino portant d'autres substituants variés. De manière analogue^ les notations Asx et Glx désignent, selon la tradition,, dés Sûmes alternatives comparables (ainsi par exemple, la forse asparagin© où la forme acide ^ aspartique, substituée ou non, la forme glutamine où acide glutami-que, substituéë-ou nôh^è Les poiïits placés au-désàùs des atomes de soufre dànsi les aminoacide'é "f et 7 peutent êtrè rfeli&a à d'autres groupes ; ailé "ils peuvent* également être reliés "éntrë éux avec 20 69 14459 y 2008037 formation d'un point disulfure. La cystéine ou la méthionine ou d'autres aminoacides susceptibles de se trouver dans des états oxydés ou réduits différents, etc, peuvent se trouver effectivement dans l'un quelconque de ces états. D'autres modifications éven-5 tuelles apparaîtront à la lecture de la description ci-après. Dans un autre de ses aspects, 1*invention concerne des procédés de synthèse pour préparer des substances actives du type thyrocalcitonine comportant dans leur chaîne un nombre quelconque d'aminoacides. On notera que, d'une manière générale, la 10 synthèse ne part pas du premier aminoacide, lTaminoacide n*1, avec synthèse progressive de la molécule par addition d*un acide après l'autre. On a trouvé au contraire qu'il était préférable et plus économique de procéder à la synthèse de fragments peptides de longueur intermédiaire fc partir des aminoacides d'origine et de 15 lier ensuite certains de ces fragments peptides pour former les molécules plus grosses qui, partant d'une molécule contenant dans sa chaîne les aminoacides de 1 k 16, ont manifesté une activité analogue à celle de la thyrocalcitonine. Dans les exemples qui suivent, on trouvera la description de la synthèse de molécules 20 à 16, 22, 25 et 29 aminoacides, à titre d'illustration. On appréciera qu'il s'agit là uniquement de procédés types illustrant le procédé de l'invention sans nullement limiter le nombre exact d'aminoacides contenus dans les fragments peptides dont on réalise la synthèse. Il existe naturellement un nombre énorme de possi-25 bilités de modifications du procédé, et on a dû d'évidence se limiter dans la présente demande à la description de procédés types. Mais il est par suite évident que le cadre de l'invention ne saurait être limité aux procédés particuliers décrits en détail dans les exemples qui suivent. 30 Au cours des synthèses, les divers stades sont en général suivis par des opérations d'analyse qui peuvent comporter l'analyse des aminoacides et la chromatographie en couche mince. Dans ce dernier mode opératoire, il existe un certain nombre de sorbants utilisables pour le revêtement des supports 35 tels que les plaques de verre, utilisés pour la réalisation des chromatogrammes en couche mince. En général, dans les exemples qui suivent, on a utilisé deux plaques de chromatographie en couche existant dans le commerce. Ces plaques sont vendues par la 69 14459 2008037 firme Analtech, Inc., de Wilmington, Delaware, Etats-Unis sous la marque "Uniplate". L'une consiste en un adsorbant à base de gel de silice contenant ce gel et d'autres constituants, vendu par la firme Merck et Go., sous la marque "Silica Gel GFn; l'autre 5 est le produit "Alumine GFn de la même firme. Dans tous les cas, la composition sorbante est fixée à l'aide d'un liant classique et contient une substance fluorescente connue» On appréciera également que l'invention n'est nullement limitée à l'utilisation de ces deux types de plaques de chromatographie en couche existant dans 10 le commerce et qu'il s'agit là uniquement de types représentatifs de plaques de chromatographie en couche mince utilisables. La chromatographie en couche mince exploite un certain nombre de solvants ou mélangea de solvants types dont l'un consiste en 40 parties de.chloroforme, 20 parties de méthanol et 4 parties 15 d'eau» Un autre mélange splvant consiste en 20 parties de chloroforme et 10 parties de méthanol. Dans les exemples où l'on a défini un mélange solvant particulier par des rapports de parties, on comprendra qu'il s'agit de l'un des mélanges à base de chloroforme désignés ci-dessuso Ainsi, le premier mélange, mentionné ci-dessus 20 sera désigné dans les exemples qui suivent par la notation 40î20î4« Mais on utilise également d'autres mélanges de solvants ne contenant pas de chloroforme, par exemple un mélange de 40 parties de n-butanol, 12 parties d'eau et 4 parties d'acide acétique. Ce mélange pourra être désigné par l'abréviation BEA 40î12:4o On a 25 également utilisé occasionnellement un autre mélange solvant constitué de 19 parties d'acétate d'éthyle et 1 partie d'acide acétique. Ici encore, l'invention n'est nullement limitée à l'utilisation de ces mélanges particuliers. La chromatographie en couche mince s'effectue dans 30 certains cas dans une seule dimension et dans d'autres cas dans deux dimensions® Dans les exemples qui suivent, il s'agit de chromato-grammes à une dimension» En d'autres termes, on place à l'origine une petite proportion du mélange à chromatographier, représentant habituellement de 1 à quelques microgrammes, et après développement, 35 les divers constituants apparaissent distribués sous forme de taches le long d'une ligne, les taches étant quelquefois accompagnées de prolongements s'étendant habituellement dans le sens opposé au mouvement du solvanto Les essais réalisés sur les taches des chromato- 69 14459 5 20013037 grammes en couche mince sont souvent examinés sous lumière ultraviolette lorsque lés composés particuliers contiennent des chromo-phores fluorescents qui sont facilement décelables sur la couleur d'arrière-plan du dispositif fluorescent de la plaque à couche 5 mince. Comme dans toutes les synthèses extensives de protéines et de peptides, il est souvent nécessaire de bloquer à plusieurs reprises un groupe fonctionnel ou un autre, et 1®observation s'applique également dans le cas de.l'invention. On n'a pas utilisé 10 de techniques de blocage nouvelles, et l'un des avantagea de l'invention réside précisément en ce qu'elle permet l'utilisation de méthodes classiques. Quelquefois, un groupe bloquant, par exemple le groupe ester p-nitrobenaylique d'un groupe carboxyle d9an carbo»o terminal d'un aminoacide ou d'un peptide donne une fluorescence. 15 Lorsqu'on examine tin chromatogramme de ce type sous la lumière ultraviolette, il faut distinguer si les valeurs de se rapportent, au peptide formé ou à l'ester de départ. Fréquemment, les taches sont développées.par d'autres agents colorants comme la ninhydrine qui réagit avec les groupes 20 amino libres. Dans un autre cas, on traite par le chlore gazeux qui remplace les atomes d'hydrogène des groupes amide 3 et on fait suivre d'un développement par 1*o-tolidine/iodure de potassium. Il s'agit de la réaction connue dans la technique sous le nom de tolî= dine-chlore. On a également utilisé comme autre agent révélateur 25 le réactif d'Ehrlich, le p-diméthylaminobenzaldéhyde. On utilise quelquefois ce réactif pour déceler de manière spécifique le tryptophane en présence d'autres aminoacides. L'analyse quantitative de grosses molécules telles que des fragments de peptides et molécules similaires, pose quelquefois 30 des problèmes, à la fois en raison de la grande dimension des molécules et en raison du fait que, dans de nombreux cas, la quantité de produit dont on dispose est très faible. Quelquefois, les teneurs trouvées réellement à l'analyse en carbone, hydrogène, azote, soufre, etc, correspondent de très près aux valeurs calculées pour 35 certains de ces éléments mais de moins près avec d'autres» Ainsi par exemple, on peut trouver une bonne corrélation pour l'azote et le soufre et une corrélation moins étroite pour le carbone et l'hydrogène. Dans tin tel cas, la pratique tout à fait courante en 69 14459 6 2008037 iï chimie des protéines consiste & exécuter une analyse de contrôle uniquement pour les éléments au sujet desquels les premiers résultats d'analyse ne sont pas suffisamment satisfaisants. Les composés de l'invention sont utilisables dans le 5 traitement, la guérison, la prévention, lsamélioration, etc, des troubles du métabolisme du calcium, y compris les maladies telles que lfostéoporose. Ils peuvent être administrés par des moyens variés et bien connus. Ainsi par exemple, on peut préparer des compositions injectables. Dans de tels cas, on introduit habituelle liment des véhiculeâ protéinés qui améliorent fréquemment les activités. On a procédé de cette manière dans les essais effectués sur des animaux. In raison du très grand nombre d'exemples nécessités par la nature de ^«invention, on a dû faire appel à un certain nombre ^abréviations a* a joutant aux abréviations utilisées normalement pour les divers aminoacides. Bien que ces abréviations soient bien connues, on indique ci-après la signification de celles qui sont utilisées dans les exettplea? Cils G-méthyle Oit O-êthyle âoMe anhydride mélangé (se rapporte habituellement an mode opératoire utilisé dans-une réaction ds®8-coupleiiient ) HOAc acide acétique BtOAc acétate d'éthyle ETgO éther éthylique NMM N-méthylmorpholine GGM chromatographie en couche mince THF tétrahydrofuranne MF diméthylformamide QBzl O-benzyle SBzl S-benzyle OHB O-p-nitrobenzyle BOC t-butyloxycarbonyle TFA acide trifluoracétiqué ou trifluoracétate selon • " les cas - ' HOSu N-hydroxy suc cinitnida OSu ester de N-hydroxysuc einimide Z benzyloxycârbonyle 20 25 69 14459 7 2008037 Zg dibenzyloxycarbonyle Glx acide glutamique ou glutamine selon les cas Asx acide aspartique ou asparagine selon les cas 0-t-Bu 0-t-butyle 5 DCCD . dicyclohexylcarbodiimide 0SO^H acide benzène suifonique CH^SO-jH acide p-toluène sulfonique DMAC diméthylacétamide ou N,N-diméthylacétamide 1-BuOCCl chloroformiate d'isobutyle n 10 0 i-BuOCOCl voir i-BuOGGl « 0 T.A, température ambiante Tous les aminoacides utilisés (sauf la glycine qui ne 1 *5 y possède pas d'activité optique) sont de la forme L. Les paragraphes 1 à 15 ci-après décrivent les modes opératoires généraux et les conditions observés dans les exemples qui suivent. 1. Réaction d'accouplement par anhydride mixte. Le mode opératoire consiste (a) & former un anhydride mélangé par réaction d'un ct-acylaminoacide ou d'un a-acylaminopeptide avec tin chloroformiate d'alkyle inférieur en présence d'une aminé tertiaire et (b) à faire réagir l'anhydride mélangé obtenu dans ces conditions 25 avec un dérivé d'aminoacide portant un groupe amino libre ou un dérivé de peptide portant un groupe amino libre: il se forme un peptide. Le mode opératoire en question est décrit en détail par Albertson, Noël F., au chapitre 4 de "Synthesis of Peptides vrith Mixed Anhydrides", pages 157-355, Organic Reactions, volume 12, jq John Wiley and Sons, Inc., New York, Londres, 1962. Cette technique générale a été appliquée dans l'exemple 1. 2. L'hydrolyse alcaline ou saponification d'un ester, mode opératoire fondamental de désestérification décrit par Fieser, Louis F. et Fieser, Mary, Organic Chemistry troisième édition, 35 Reinhold Publishing Corporation, New York, 1956, page 173. Cette technique générale est appliquée dans l'exemple 2. 20 69 14459 2008037 8 3o Scission acide d'un groupe t-butyloxycarbonyle bloquant un groupe amino; mode opératoire classique de la chimie des peptides décrit par SchrSder, Eberhard et LSbke, Klaus dans "I. Amino-Protecting Groups" pages 3 à 51 du volume I des "Methods of 5 Peptide Synthesis", de l'ouvrage "The Peptides", Academic Press, New York et Londres, 1965«> Ce mode opératoire général est appliqué dans l'exemple 3 ci-après. 4* Accouplement d'un ester de N-hydroxysuccinimide d'un dérivé d'aminoacide ou d'un dérivé de peptide avec un dérivé d'amino-^ acide ou un dérivé de peptide; ce mode opératoire est décrit par Anderson, G.W. et Crs, Journal of The American Chemical Society, volume 06, pages 1839-1842 (1964)» Ibidem volume 85 page 3039; Kisfaludy, L. et Crs. ACTA Chemica Academiae Scientarium Hungaricae Tome 44, fascicule 1-2, pages 33-35 (1965); et LSw, op. cit. pages ^ 61-66 (1965)* Ce mode opératoire général est appliqué dans l'exemple 4 ci-après. 5« Accouplement par utilisation d'un réactif .de Woodwards; mode opératoire décrit d'une manière générale par Schr5î|er, Eberhard 2q et Ldbke, Klaus dans "III, Formation of the Peptide Bond", pages 113-114 du volume I "Methods of Peptide Synthesis" de l'ouvrage "The Peptides", Academic Press, New York et Londres 1965. Ce mode opératoire est appliqué dans l'exemple 5 ci-après. 6. Scission d'un ester p-nitrobenzylique par hydrogéno-25 lyse catalytique; mode opératoire classique de la chimie organique et de la chimie des peptides, décrit d'une manière générale par Schrôder,, Eberhard et Lîibke, Klaus dans "II. Cârboxyl Protecting Groups", pages 61-62 du volume I "Methods of Peptide Synthesis" de l'ouvrage "The Peptides", Academic Press, New York et Londres 1965. 30 Ce mode opératoire général est appliqué dans l'exemple 6. 7« Scission d'un benzyloxycarbonylaminoacide ou d'un benzyloxycarbonylaminopeptide par hydrogénolyse catalytique; mode opératoire classique de la chimie des peptides décrit par SchrSder, Eberhard et Ltlbke, Klaus dans "I. Amino-Protecting Groups" pages ^ 22 à 30 du volume I, "Methods of Peptide Synthesis", de l'ouvrage "The Peptides", Academic Press, New York et Londres 1965. Ce mode opératoire général est appliqué dans l'exemple 7 ci-après. h* ■ " -"i ' " ; . ; l- •• 69 14459 *• " 2008037 9 Ô» Accouplement à l'aide du dicyclohexylcarbodiiîaide, mode opératoire décrit par SchrSder, Eberhard et Lûbke, Klaus dans "III, Formation of the Peptide Bond", pages 108-111 du volume I "Methods of Peptide Synthesis", de l'ouvrage "The, Peptides™. 5 Academic Press, New York et Londres, 1965, modifié par Zipas^znan et Anderson (utilisation du N-hydroxysuccinimide} Jour. Isa» Soc. 89 7151 (1967Î. Ce mode opératoire est appliqué dans l'exemple 8. 9. Neutralisation d'un sel d'acide, conversion élémentaire de chimie, la neutralisation étant définie à la page 568 • ^ de la troisième édition du Hackh Chemical Dictionary, McGraw-Hill Book Company, New York, Toronto, Londres 1944» Ce mode opératoire est appliqué dans l'exemple 9 ci-après. 10. Formation d'un ester de N-hydroxysuccinimide dsun ^ aminoacide ou d'un peptide. On peut utiliser soit le mode opératoire à l'anhydride mélangé (cf. 1 ci-dessus) soit l'accouplement par utilisation du dicycloh«xylcarbodiimide (cf. 8 ci-dessus)o Ce mode opératoire est appliqué dans l'exemple 10o 11. Conversion d'un ester ou d'un anhydride mélangé en 20 un amide par réaction de l'ester avec l'ammoniac, transformation élémentaire de chimie organique décrite par Fieser, Louis F. et Fieser, Mary, Organic Chemistry, troisième édition, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1956, pages 178-180, 445-446. Ce mode opératoire est appliqué dans l'exemple 13. 25 12. Elimination de tous les groupes bloquants d'un pepti de (groupes éther S-benzyliques et 0~benzyliqutes de la cystéine et de la sérine, groupes bloquants N-nitro des aminoacides du type arginine, et groupes t-butyloxycarboriyle bloquant les groupes amino terminaux) à l'aide d'acide fluorhydrique. Le mode opératoire en question a été décrit par Sakaribara Sc et Crs, Bulletin of the Chemical Society of Japan. volume 40, pages 2164, etc (196?); ibidem volume 41, pages 438-441 (1968); ibidem volume 41, pages 1477-1479 (1968). Ce mode opératoire est appliqué dans 1'exemple 12o . 13. Scission acide d'un ester t-butylique d'un peptide sur le carbone terminal, mode opératoire classique de. la chimie des peptides, décrit en termes généraux par SchrSder, Eberhard et Lîibke, Klaus dans "II. Carboxyl-Protecting Groups" pages 57-59 du 10 2008037 ffoluis© I "Methods ©f PeptM» By®%faasLa* dQ" "l'ouvrage "The Peptides" Academic Press„ New York et îiondirss, 1965 c C@ mode opératoire général est appliqué dans 13 -is^ce une modifications le aiHeu de scission consiste crs a«id@ acétique saturé d'acide 5 chlorhydrique0 Les exemples suivants illustrât l'invention sans toutefois la limiter| dans ces ©3sempl©ss les indications de parties ot de pour cent s'étendent on poids sauf indication contraire* bxbmplb 1 'tJ Pi-é^aration de » BOC» Val* jùqu* PNB. ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-valyl-âeucine BOC.Val,OH + H.Leu.ONB x ^SO^H BÛGoVal.Leu.GNB On dissout 21,73 ® {0,10 mol©) da- BOCa Val9 OH, 'îg Wbutyloxy carbony l-°valines dans 150.œl d® tétrahydrofuranng sec en agitant à l'aide d'un agitateur laagîiôtiqu'? 3t en refroidissant & «17*C; on ajout© ensuit® 11 s0 si ,{091O sole} de K-iaéthylaoi^pholinQs Au bout de quelques minutas, on ajouts 13,40 rai {0,10 mole) de ehloroformiate d'isobutyle* il y a précipitation immédiate o On 2u -agite pendant,5 minutes durant lesquellos la.température monte.& =°12WC. On ajoute alors une solution d© 42 ; 5 g (0,10 mole) du benzène sulfonate de l'ester p=-nitrobensylique de la. leucine, Hs Leuo 0NB x 0SO^Hs dans 150®! ds diméthyl?_çétamide sec contenant 11,0 ml de N-méthylmorpholinec, la température faonte-à 10°G {la 25 solution ajoutée était à température ambiante,) o On agite au bain réfrigérant pendant 15 minutes durant lesquelles la température tombe à 0°C. On retire le bain réfrigérant® Une heure plus tard environ, on filtre le mélange pour séparer 1© chlorhydrate de N-méthylmorpholine. On concentre le filtrat à volume final d'environ 30 50 ml au bain-mari© à l'aide d8un év&porat.aur sous vi.dea fe dilu.=» tion du résidu par 150 m], d'eau environ provoque la précipitation d'une huile qui se solidifie, par grattage».- la- chromatographie en couche mince sur silice (24 parties de chloroforme: 1 partie de i-iéthanol ) fait apparaître une tache d'un produit, principal à 35 Tig 0g75 (lumière ultraviolette5 réaction au chlore-tolidine). la recristàllisation par addition d'eau dans une solution alcoolique chaude donne 36,3 g de. produit ^rendement 70>) fondant à 90-91 °C puis 104-105°C. bad original 69 14459 11 2008037 10 EXEMPLE 2 Préparation de la BOC, Val. Leu. OH. t-butyloxycarbonyl-valyl-leucine BOCsVal.Leu»ONB Na0H HC1 > BOC.Val.Leu.OH EtOH On dissout 18,61 g (0,040 mole) de 1»ester de dipeptide, ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-valyl-leucine, BOC« Val. Leu. ONB, dans 100 ml d'éthanol absolu et on filtre. On ajoute au filtrat 40 ml d'hydroxyde de sodium aqueux N. Après 1 h de repos à température ambiante, on concentre le mélange de réaction dans un évaporateur sous vide chauffé à l'eau chaude ' pendant 15 minutes. On ajoute de l'acétate dTéthyle au résidu et on concentre à nouveau la solution de la même manière que ci-dessus. On ajoute encore de 1Tacétate d'éthyle au concentré puis environ ^ 40 ml d'acide chlorhydrique N, ce qui provoque l'acidification du mélange. Il se sépare une couche aqueuse. On mélange la couche d'acétate d'éthyle avec environ 20 ml d'eau et on ajoute 20 ml de solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium. On agite le mélange et on le laisse se 20 séparer,, On sépare la couche aqueuse et on extrait l'acétate d'éthyle à deux reprises par des portions fraîches de bicarbonate de sodium aqueux saturé» On met de côté la couche d'acétate d'éthyle. On combine les extraits aqueux bicarbonatés et on aci-difie par l'acide chlorhydrique N; on provoque la séparation d'une couche supérieure d'acétate d'éthyle et d'une couche inférieure aqueuse. On décante et on extrait la couche aqueuse à l'acétate d'éthyle; on combine les extraits à l'acétate d'éthyle et on lave la solution combinée à deux reprises par de l'eau, à pH 3 dans le dernier lavage. On sèche la solution d'acétate d'éthyle lavée et on la clarifie sur sulfate de sodium anhydre; on place la solution d'acétate d'éthyle sèche dans une capsule. Après évaporation, le résidu est cristallin en partie; à l'agitation, la cristallisation se termine et on obtient un ^ rendement de 14,5 g en produit sec (théorie : 13,2 g). Les 14,5 g de produit brut sont purifiés par extraction • et réextraction entre l'acétate d'éthyle et une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, en terminant par une acidifica30 69 14459 12 2008037 tion; on obtient une petite quantité d'une huile de couleur jaune et une matière solide incolore. On met le mélange en suspension dans l'eau et on filtre à nouveau. On sépare la matière solide par filtration, on la lave à l'eau et on la sèche; on obtient 5 S,93 g de t-butyloxycarbonyl-valyl-leucine purifiée fondant à 157-15Ô®C. On recueille à partir des résidus encore 1,2 g de produit fondant à 157-157,5°G. EXEMPLE 3 Préparation du trifluoracétate de valyl-leucine, TFA x Val. Leu. OH 10 BOC.Val.Leu.OH +JTFA ^ tFA x HeVal.Leu.OH On place dans un ballon 6,61 g (20 millimoles) de BOC0 Val. Leu. 0H, t-butyloxycarbonyl-valyl-leucine, et on ajoute 10 ml d'acide trifluoracétique. Le mélange se dissout avec effervescence en quelques minutes. Au bout de 1 h, on concentre la solution sous le vide de la trompe à. eau, au bain-marie; après la trompe à eau, on applique une pompe à vide. On obtient en résidu une huile lourde qu'on dilue par quelques millilitres d'éther éthylique. On filtre le mélange, on lave les matières solides recueillies, d'abord avec 20 une solution d'acide trifluoracétique dans l'éther puis avec de l'éther. On combine-le filtrat et les lavages et on dilue la solution combinée par de l'éther en chauffant jusqu'à ce qu'elle commence à se troubler (à.ce moment, le volume est d'environ 150 ml). On provoque la cristallisation par grattage. On dilue à nouveau 2^ le mélange de cristallisation par l'éther à volume final d'environ 200 ml et on laisse cristalliser jusqu'à cristallisation pratiquement complète; on recueille les matières solides cristallines par filtration, on les lave à l'éther et on les sèche à l'étuve; on obtient le jet A, de 5,33 g, fondant à 99-107°C. On concentre le filtrat à faible volume sous la trompe à eau et on dilue à l'éther; on obtient une matière solide gommeuse. On ajoute encore de l'éther et on laisse reposer le mélange pendant ; une nuit; on obtient alors une matière solide dure qu'on recueille par filtration, qu'on lave à l'éther et qu'on sèche â l'étuve; on ^ obtient le jet B, de 0,06 g, fondant à 99-107°C„ La récolte totale s'élève à 6,19 g soit 90 % de la théorie (6,ÔÔ g). Par chromatographie en couche mince sur silice, des échantillons des jets A et B donnent des taches à la ninhydrine à 69 14459 13 2008037 0,3 dans le système 40 parties de chloroforme: 20 parties de méthanol: 4 parties d'eau. Le filtrat de B donne dès taches à la ninhydrine à des valeurs de Rf 'de 0,48 et 0,8. La réaction tolidins-chlore donne des taches légères à 0,04 pour A et B. 5 • EXEMPLE 4 SBzl » Préparation de BOC. Cys. Val. Leu. OH. t-»butyloxyçarbonyl"S-benzylcystéinyl-valyl-leucine SBzl SBzl . 10 B0C8Cys.0Su + TFA x H.Val.Leu.OH BOC.Cys.Val.Leu..OH On dissout 6,00 g (17,5 millimoles) du trifluoracétate de dipeptide TFA. Val. Leu. OH, trifluoracétate de valyl-leucine, et 1,46 g (17,4 millimoles) de bicarbonate de sodium dans 10 ml d'eang ^ il sé produit une effervescence et on refroidit la solution au bain d'eau glacée sous agitation. On ajoute alors une solution de SBzl 3,55 g (8,7 millimoles) de l'ester BOC. Cys. OSu, ester de M-hydro-xysuccinimide de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéine, dans 25 al de tétrahydrofuranne; on obtient une solution trouble à la tempéra» ture de 12°C. On retire le bain réfrigérant et on poursuit l8agi= tation. Au bout de 10 minutes, la chromatographie en couche mineg sur silice à l'aide du système chloroforme 40 parties? méthanol 20 parties: eau 4 parties, donne une tache prépondérante â R^ 0,8 >0,98 (lumière ultraviolette, positive; réaction tolidine- chlore, jaune, positive), ce qui indique la présence de proportions substantielles de l'ester de succinimide de départ; on observe également une tache mineure à l'ultraviolet à 0,25 ^0,44 et une tache mineure positive à la réaction tolidine-chlore à 0,65. Le dipeptide de départ se manifeste sous la forme dîune bande (réaction tolidine-chlore positive; réaction â la ninhydrine posl= tive) à R^ 0,2—^0,5, avec une tache mineure (réaction tolidine-chlore positive; réaction à la ninhydrine positive) à R^ 0S84® Le mélange de réaction fait apparaître le dipeptide (ÎFA x H. Val* Leu. OH), et une double réaction positive à l'ultraviolet et à tolidine-chlore, jaune, à E^ 0,8 et O, 9. Au bout dé 30 minutes, .un échantillon fait apparaître une tache plus importante, en mouvement- . .. e* * - ._ » "... r ' v ■. lent, à R» 0^85 et une tache moins importante en;mouvement rapide3 69 14459 2008037 à R^ 0,95. A ce moment, le pH de la solution est d'environ 6. On ajoute alors un équivalent (0,73 g) de bicarbonàte de sodium, ce qui provoque là clarification et une effervescence d'environ 10 minutes. Au bout de 55 minutes, on ne retrouve pratiquement plus la tâche 5 ®n mouvement rapide (R^ 0,95) et la tache du produit présumé (jaune) recouvre Rs 0, 0-0,9. Une grande partie de la tache de dipeptide (E|. 0,2-0,5) se manifeste encore» Au bout de 70 minutes, on ajouta ua excès de 10% (0,36 g) de l'aster de succinimide qui se dissout en quelques minutes. La chromatographie en couche mince sur silice 10 h l'aide du système solvant chloroforme 40 parties: méthanol 20 parties: eau 4 parties, d'un échantillon retiré au bout de 00 minutes fait apparaître la bande positive à la ninhydrine à Rf 0,0-0-0,9ô, la tache à R^ 0,9 (positive & l'ultraviolet; positivé à tolidine-chlore, jaune) avec une tache légère au-dessus. A ce moment, le pH 15 est d'environ 6,5, mais la lecture exacte n*est pas sûre. On ajoute environ 0,20 ml (environ 0S4 millimole) de solution aqueuse saturé® d3 bicarbonate de sodium, sans effet apparent® La chromatographie en couche mince au bout de 90 minutes fait apparaître la tache positive à la ninhydrine mais non l'ester de succinimide (un échantillon 2u connu d'ester de succinimide dorme une tache jaune à 0,9$). Au bout de 125 minutes,, on ajoute 0,5 ml de solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (environ 1 millimole), ce qui provoque le déplacement du pH vers une valeur plus définie de 7» On ajoute 0,36 g de l'ester de succinimide, ester de N-hydroxysuc-25 einimide de la S-benzyl—t-butyloxycarbonyl-cystéine, qui se dissout en 5 minutes environ, La chromatographie en couche mince au bout dé 135 minutes montre que la tache positive à la ninhydrine est encore "SBzl" présente. Un échantillon de BOC. Cys. 0H, t-butyloxycarbonyl-S-30 benzyl-cystéine donne par chromatographie en couche mince sur silice, avec le même solvant 40:20:4, une tache positive jaune à.tolidine-chlore,, à 0,9, où. l'on suppose que-;se trouve la tache du produit recherchée Le bas de la tache à 0S9 dans le mélange de réaction ©st plus intense® On décide alors de continuer à traiter le mélange 35 de réaction0 ' On concentre le mélange de réaction à l'évaporateur sous vide. On .élimine;; aJAsi le solvant tétràhydrofuranne, Il se forme un précipité gommeùx'qui se solidifie au malaxage à l'aide d'unespa- 69 14459 2008037 15 tule. On recueille cette matière solide par filtration. Le filtrat présente un pH de 7* On lave la matière solide à l'eau. La chromatographie en couche mince fait apparaître une tache à R^ 0,0 (positive à l'ultraviolet; positive à la réaction tolidine-chlore) 5 et une tache légère positive & la réaction tolidine-chlore à R.£ 0,2. Le filtrat donne & 0,26 une tache positive à l'ultraviolet, à la réaction à la ninhydrine et à la réaction tolidine-chlore, à R^ 0,4, une tache positive & l'ultraviolet et à la réaction tolidine-chlore et à 0,5 une tache positive à l'ultraviolet 10 et à la réaction tolidine-chlore (jaune). On met la matière solide en suspension dans 25 ml d'eau et on acidifie à l'acide chlorhydrique concentré ce qui change l'aspect de la matière. On recueille la matière solide par filtration et on la lave à trois reprises â l'eau; le pH du lavage final 15 est de 3. On place la matière solide à l'étuve où on la sèche. Ce produit constitue le jet A. Le filtrat du jet A donne à l'acidification une petite proportion de gomme, le jet B. Les deux jets A et B donnent une tache unique positive à l'ultraviolet à R^ 0,3 à la chromatographie 20 en couche mince. La réaction tolidine-chlore fait apparaître trois taches jaunes et également une tache bleue à R^ 0,26. Le jet B donne line tache légère à R^ 0,3. La quantité de produit réellement recueillie s'élève à 4,93 g (90% de 5,49 g) fondant à 103-107°C. L'ester de succinimide 25 utilisé comme produit de départ, ester de N-hydroxysuceinimide de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéine, peut être obtenu à la Fox Chemical Company, 1556 Industrial Street, Los Angeles, Californie 90021, Etats-Unis d'Amérique. EXEMPLE 5 30 —————— Préparation de BOC.Asn.Leu.PNB, ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-asparaginyl-leucine 69 14459 2008037 16 A 5ÔO ml d'acétonitrile, on ajoute 11,6 g (0,050 mole) de t-butyloxycarbonyl-asparagine. Lfaminoacide bloqué peut être obtenu dans le commerce à la Fox Chemical Company, 1556 Industrial Street, Los Angeles, Californie, 90021, E.U.A. A cette solution 5 on ajoute 7,0 ml de triéthylamine et 12,65 g du réactif K de Woodward, le 3'-suifonate de N-éthyl-5-phénylisoxaz$lium, provenant de la firme Aldrich Chemical Company, Inc., 2371 North 30 Street, Milwaukee, Wisconsin 53210, E.U.A. On agite le mélange et on le laisse reposer à température ambiante pendant 1 h environ (il 10 s'agit d'une solution claire). On ajoute alors à la solution claire 0,050 moie environ de l'ester p-nitrobenzylique de la leucine et on laisse reposer à température ambiante pendant 1 h. A ce moment, on sépare la matière solide qui s'est formée par filtration, on la lave à l'éther et on 15 la sèche & 50°C. On recristallise le produit dans 475 ml d'isopro-panol. Rendement : 15,5 g, P*F. 195-197,5°C (décomposition). EXEMPLE 6 20 Préparation de la BOC.Asn.Leu.OH. t-butyloxycarbonyl-asparaginyl-leucine B0C.Asn.Leu.0NB > BOC.Asn.Leu.OH On dissout 9,32 g de l'ester de dipeptide, ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-asparaginyl-leucine, BOC.Asn.Leu.ONB, dans un mélange de 250 ml d'à,(3-diméthoxyéthane et 70 ml d'eau. On ajoute 1g environ d'un catalyseur au palladium sur charbon et on fait barboter de l'hydrogène gazeux dans le mélange pendant 2 h. On sépare le catalyseur par filtration. On concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'au moment où l'eau commence à distiller. L'acidification du concentré à l'aide d'acide 2q phosphorique provoque la précipitation du produit qu'on sépare et qu'on sèche pendant 1 nuit. Rendement : 5,4 g (74%), P.F. 175-176°C. La chromatographie en couche mince du produit sur une plaque phosphorescente de silice à l'aide d'un système solvant constitué de n-butanol, d'acide acétique et d'eau (40:4ï12) donne une tache révélée à l'indicateur tolidine-chlore à R^ 0,76. 69 14459 17 2008037 EXEMPLE 7 Préparation de HCI x H.Gly.Phe.Gly.Pro»O-t-Bu. chlorhydrate de l'ester t-butyligue de la glycyl-phénylalanylglycyl-proline Z.Gly.Phe.Gly.Pro.O-t-Bu ==— „ >_ n, __ „ _ 5 HCI x H.tîly.Phe.Gly.ProaQ-t-Bu On dissout 8,07 g (0,014 mole) de l'ester t-butylique de la benzyloxycarbonyl-glycyl-phénylalanylglycyl-proline dans 200 al d'alcool. On ajoute 14 ml d'acide chlorhydrique N puis 2,0 g d'un catalyseur à 10% de palladium sur charbon. On fait barboter dans le mélange de réaction de l'hydrogène gazeux; il se dégage rapidement de l'anhydride carbonique. On suit les progrès de la réaction par chromatographie eh couche mince sur silice à l'aide d'un mélange isopropanol-heptane à parties égales. Le du produit est de 0,58, mis en évidence par la réaction à la ninhydrine ou la réaction ^ tolidine-chlore. Après 1 h environ de"réaction, tout le produit de départ est consommé. On sépare le catalyseur par filtration» on élimine les solvants par évaporation 1 1*évaporation sous vide. EXEMPLE 8 N0„ _____ ( 6 Préparation de Z.His.Arg.Phe.ONB. ester p-nitrobenzylique de la 20 benzyloxycarbonyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine n0g ugcd Z.HiSoArg.OH + H.Phe.ONB x 0S0,H — 3 HOSu .N0, t * Z.His.Arg.Phe.ONB On combine les solutions claires de 6,2 g (0,0122 mole) de benzyloxycarbonyl-histidyl-N-nitroarginine et 1,4- g (Q„Q122 mol©) de N-hydroxysuc einimide dissous dans 65 ml de diméthyla cét ami de, avec 5,60 g (0,0122 mole) de phénylalaninate benzène sulfonate de 30 p-nitrobenzyle dissous dans 15 ml de diméthylac étamide. On ajoute sous agitation à température ambiante 2,52 g (0,0122 mole) de dicy-clohexylcarbodiimide. On ajoute encore au mélange 1,26 g de dicyclo-hexylcarbodiimide et 2,1 g de N-hydroxysuceinimide et on laisse réagir pendant 2h. L'urée qui précipite est séparée par filtration* 35 On concentre le filtrat aux deux.tiers environ de son volume initial et on le coule dans 400 ml d'eau. On décante le liquide sur un entonnoir en verre fritté. Le résidu gommeux restant dans le bêcher et sur l'entonnoir est lavé à plusieurs reprises avec de l'éther afin 69 14459 2008037 d'éliminer les traces de solvant. Là trituration avec une petite proportion de chloroforme puis avec une proportion importante d*éther donne un produit solide, rendement ï 9,5? g. Le produit brut est purifié par lavage avec environ 250 ml d'acétate d'éthyle 5 chaud. On décante et on triture dans l^aeétate d»éthyle froid. On obtient un produit semi-solide. On décante â nouveau le liquide et on triture à l'éther. On obtient un produit bien solidifié. Rendement : 8,13» g. La purification finale est réalisée par ébullition du 10 produit avec 200 ml environ de chloroforme,décantation et lavage avec du chloroforme froid. Le produit est trituré à 1*éther. On obtient un produit qui se manipule facilement. Rendement: 6,82 g. On purifie encore par passage sur une colonne de gel de silice (200 g de gel de silice â dimension de particules comprise 15 entre 74 et 250 microns) et élution â l^aide d'un système solvant constitué de 5% de méthanol dans du chloroforme. EXEMPLE 9 ■1 NU0 | K. Préparation de H0 His.Arg.Phe o ONB, ester p-nitrobenzylique de 1 " ïïïï mh—nT-w—iUBMiimiii i iib nu «mw—dW—m ' i min n —i ni i i n nii "i n i i m .n mmili wi \ï -mu--— 20 lthistldyl-N--nitro-arginyl-phénylalanin£ N02 NO2 2HBr x H.His.Arg.Phe.ONB —H.His.Arg.Phe.ONB A une solution de 1,29 g (0,0014 mole) du dibromhydrato de l'ester p-nitrobenzylique de l'histidyl-N-nitro-arginyl-phényl-25 alanine dans 5 ml d'eau, on ajoute une solution aqueuse d'environ 0,6 g de carbonate de sodium. Il se forme un précipité gommeux qu-on triture avec de l'éther. On recueille 0,58 g (64% de la théorie) d@ produit. L'essai au nitrate d'argent (présence d'halogénures) est négative» La chromatographie en couche mince du produit à l'aide 30 du système solvant chloroforme, méthanol, eau (20;10î12) fait apparaître une tache à 0,50. -EXEMPLE 10 Préparation de BOC.Asn.Asn.Phe.OSu. ester de N-hydroxysuccinimide de la t-butyloxycarbonyl-asparaginyL-asparaglnyl-phénylalanine 35 . - BOC . Asn 6 Asn. Phe. 0H + HOSu B0C.Asn.Asn. Phe. OSu 0?i dissout,4,.93 g,(0,0205 mole) de t-butyloxycàrboriyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanine dans 125 ml de disiéthyiacéta-. 69 14459 19 2008037 mide sous agitation vigoureuse. On ajoute 2,31 g (0,010 mole) de N-hydroxysuccinimide et on refroidit à 0-5°C. On ajoute alors 4,15 g (0,010 mole) de dicyclohexylcarbodiimide et on place le mélange pendant une nuit au réfrigérateur à 0°C environ. L'urée 5 qui précipite est séparée par filtration et le filtrat est concentré sous pression réduite au tiers environ de son volume initial. On sépare à nouveau l?urée par filtration et on concentre le filtrat» On obtient un résidu huileux semi-solide qu'on traite ,à l'éther. On obtient alors un produit cristallin brut qu'on purifie par 10 ébullition avec 80 ml environ de têtrahydrofuranne et filtration; on obtient le produit avec un rendement de 00 à 90%, P.F» 199-200°C (effervescence). La chromatographie en couche mince de ce produit sur silice à l'aide du système solvant chloroforme, méthanol, eau 15 (20:10:2) fait apparaître une tache à 0,00. EXEMPLE 11 OBzl Préparation de BOC.Ser.Gly.Met.NH,,. amide de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-serylglycyl-méthionine 20 OBzl BOC. Ser. Gly. Met. H NMM + i-BuOCCl OBzl g B0CoSer.Gly.Met.0C0i-Bu LfLi ^ 8 OBzl t BOC.Ser.Gly. Met.NH2 On dissout 1,?6 g (0,003 mole) du tripeptide BOC dans 2Q 25 ml de têtrahydrofuranne et on ajoute 0,33 ml (0,003 mole) de N-méthylmorpholine. On refroidit à -10°C et on ajoute 0,40 ml (0,003 mole) de chloroformiate d'isobutyle. On maintient le mélange à -10°C pendant 4 minutes pour provoquer l'activation, après quoi on fait barboter du gaz ammoniac dans le mélange. On laisse revenir le mélange à température ambiante : il se forme un précipité cristallin. On élimine le têtrahydrofuranne sous le vide de la trompe à eau» On obtient en résidu le produit brut solide qu'on lave successivement avec de l'eau, une solution aqueuse de bicarbonate de sodium puis à nouveau avec de l'eau. 69 14459 • 2008037 20 On sèche sous vide sur anhydride phosphorique; on obtient 1,20 g de produit cristallin solide. La chromatographie en couche mince du produit sur silice à l'aide du système solvant n-butanol-acide acétique glacial-eau 5 (40:4:12) fait apparaître une tache unique à Rf 0,S6, très légèrement positive à l'ultraviolet, très fortement positive à la méthioni-ne et positive (forte, jaune) à la réaction tolidine-chlore. A partir des filtrats aqueux, un second jet de produit cristallise en une nuit sous forme d'aiguilles longues fondant à 10 152-153°C. A l'analyse chimique, ce produit donne des résultats corrects» Nota : L'essai sur tache pour déceler le soufre bivalent (méthionine) est une modification de celui décrit par Stephan R. et Erdman J. Nature. N° 4948, 15 Août 1964, page 749. 15 FtMPTfi 12 rtTi , SBzlOBzl OBzl SBzl t t » » Préparation de BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu. NO- N09 t t A Ser«Ala.Tvr«Try.Arg0Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.NH2 amide de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucyl-O-benzyl-sôryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl- N-ni tro-arginyl-ph énylalanine SBzlOBzl OBzl SBzl * i t t BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try. NO- N0o t f ~ NHq Arg.Asn.Leu.Asn„Asn„Phe.His.Arg.Phe.ONB > BOC. SBzlOBzl OBzl SBzl N0o t * t » t ^ Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg. NO. 30 t Asn» Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.NH2 On dissout 30mg (0,04 micromole) de l'ester nitroben-zylique du peptide à 22 aminoacides t-butyloxycarbonylé dans 13 ml de diméthylformamide• On sature la solution claire de gaz ammoniac 35 à température ambiante et on laisse reposer à température ambiante pendant 15 h» La chromatographie en couche mince sur silice à l'aide du système chloroforme-méthanol-eau (20:10:2) ne fait apparaître que le produit de départ à R^ 0,60 (bande). On laisse le* 20 25 69 14459 21 2008037 mélange de réaction reposer pendant encore 9 h à température ambiante. La chromatographie en couche mince sur silice dans le système chloroforme-méthanol-eau (20:10:2) et dans le système n-butanol-acide acétique-eau (20:2:6) ne fait apparaître aucune modification 5 à R^ 0,68. On ajoute au mélange de réaction 1 ml d'éthylèneglycol saturé d,ammoniac et on laisse reposer la solution pendant 15 h. La chromatographie en couche mince sur silice à l'aide du système n-butanol-acide acétique-eau (20:2:6) fait apparaître une tache mineure à R^ 0,68 et une tache prépondérante à R^ 0,22. Après repos 10 pendant encore 23 h, on ne note pas de modifications dans le R^ (même système); on ajoute alors encore 1 ml d'éthylèneglycol saturé d'ammoniac et on laisse reposer la solution à température ambiante pendant 42 h. La chromatographie en couche mince sur silice à l'aida du système chloroforme-méthanol-eau (20:10:2) donne une tache pré-15 pondérante à R^ 0,25, une tache très légère à R^ 0,44 et une tache très légère à R^ 0,85. On filtre la solution claire de couleur brune et on concentre le filtrat sous vide. On dilue le résidu huileux par un mélange de n-butanol et d'eau à parties égales et on concentre.. On répète cette dilution et cette concentration. On concentre 20 1® résidu sous vide. On dilue le résidu huileux par 25 ml d'eau distillée, on refroidit à 5°C et on place au réfrigérateur à 5°C pendant 48 h. On recueille la matière solide par filtration; on obtient 11,6 mg d'une matière solide de couleur beige. EXEMPLE 13 25 Préparation de HCI x H.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro»0H. chlorhydrate de la glycyl-méthionylglycyl-phénylalanylglycyl-proline BOC o Gly. Met .Gly «Phe • Gly «Pro • 0—t—Bu CH^"(îOOH HCI x HoGly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro.0H On dissout 5,04 g (0,007 mole) de l'ester t-butylique de la t-butyloxycarbonyl-glycyl-méthionylglycyl-phénylalanylglyeyl-proline à chaud dans 25 ml d'acide acétique et on ajoute 25 ml d'acide acétique saturé d'acide chlorhydrique. La réaction est effectuée 35 sous atmosphère d'azote. Il se dégage de l'anhydride carbonique. Au bout de 1 h 30, on précipite le produit par addition d'éther. On filtre le mélange sous atmosphère d'azote et on conserve le produit pendant une nuit sous atmosphère d'azote. La chromatographie 69 14459 22 2008037 10 15 20 en couche mince sur silice à l9aide d'un système solvant constitué de n-butanol, diacide acétique et dfeau {%0s4: 1v2 ) donne une tache à 0,37, donnant des réactions positives â la ninhydrine et à tolidine-chlore. Dans les exemples qui suivent, on a observé les modes opératoires décrits dans les exemples 1 à 13. On sfest donc contenté de donner le nom des réactifs ©t des produits de réaction. BXEMPLE 14 Préparation du trifluoracétate de S-benzyl-cystéinyl-valyl-leuclna •■j.. .VJMWI, .j, ■■i>ijwiawwBBe3B«BBEMe3î3»MK=airawwaawMEMBEr_givt!o.': si»» :.»w ■ ■ Mt, ■■■.crrr^fca'i imiwnw-f iiW»nJa'jnjctK^,nuii«»i'1. i'.TI—csarna SBal SBzl BOC « Cy s « Val. Leu .OH T*A» > TFA x H. Cy a -, Val « Leu . OH +TFA R* 0,5 X 5 EXEMPLE 15 Préparation de la t-butvloxycarbonyl-thréonvl-S-benzyl- ■ ■klW.wAra II «—É—ff.H. a'V.J ■ ■ ^ y.'IJIit » ■■ I» mfcr » cystéinyl-valyl-leucine B0CoThro0Su + TFA 32 H.Cys.Vfil.LaUoOH — . SBzl BOC «Thr oCys.Val.Leu.OH Rf 0,8 EXEMPLE 16 25 Préparation du trifluoracétate de thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucine SBzl SBzl BOCoThr0Cys.ValoLeu.0H —TFA x H«Thr.Cys.Val.Leu0OH Rf 0,5 BXEMPLE 17 Préparation de la t-butyloxygarbonyl-O-benayl-séryl-thréonyl- OBzl SBzl BOC.SeroOSu + TFA x H.Thr.Cys.Val.Leu.OH ^ 35 OBzl SBzl BOCoSeroThroCys.Val.Leu.OH PoFo 175-178°C. 30 69 14459 23 2008037 10 15 EXEMPLE 1g Préparation du trichloracétate de O-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucine OBzl SBzl BOC.SeroThr.Cys.ValoLeu.OH TTFS ^ OBzl SBzl TFA x H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OH 0,6 EXEMPLE 19 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucyl-Q-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucine SBzlOBzl OBzl SBzl BOC®Cys»Ser.Asn.Leu.OH + TFA x H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OH -15°C à T.A. ^ BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OH M0A. 20 Rf EXEMPLE 20 Préparation du trifluoracétate dTasparaginy1-leucine BOC o Asn.Leu. OH +TFÀ—^ ^FA x H. Asn. Leu. OH 25 EXEMPLE 21 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucine OBzl 3Q B0CeSero0Su + TFA x H.Asn.Leu.OH 70°C à T.A. > OBzl BOCoSeroAsn.LeuoOH R.^ 0,4 =-0,6 EXEMPLE 22 Préparation du trifluoracétate de O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucine OBzl OBzl BOCoSeroAsn.Leu.OH —x H»Ser.Asn.Leu.OH Rf 0,2 69 14459 24 2008037 EXEMPLE 23 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucine SBzl OBzl 5 BOC.Cys.OSu + TFA x H.Ser.Asn.Leu.OH 5°C à T. A. | > SBzlOBzl » » BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.OH P.F. 172 - 174°C 10 EXEMPLE 24 Préparation de 1*ester de N-hydroxysuceinimide de la t-butyloxy-carbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-bengyl-séryl-asparaginyl-leucine SBzlOBzl BOC.CySoSer. Asn.Leu.OH "17°A.M.^70C—** SBzlOBzl ï » BOC«Cys.Ser«Asn.Leu.OSu Rj 0,9 EXEMPLE 25 20 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-benzyl- séryl-asparaginyl-leucyl-O-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl- valyl-leucine SBzlOBzl OBzl SBzl t t « t BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.OSu + TFA x H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OH 25 SBzlOBzl OBzl SBzl |T|°AjjaHC0^ °BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val Leu.OH P.F0 218 « 228°C 30 EXEMPLE 26 Préparation de l1ester méthylique de la dibenzyloxycarbonyl-histidyl-N-nitro-arginine no2 no2 35 Z2.HiscOH + H.Arg.OMe "1^A* Zg.His.Arg.OMe 69 14459 2008037 25 EXEMPLE 27 Préparation de la benzyloxycarbonyl-histidyl-N-nitro-arginine no2 no2 Z2.His.Arg• OMe > Z.His.Arg.OH 5 P.P. 161 - 173«C EXEMPLE 2g Préparation du dibromhydrate de l'estefr p-iiitrobenzyliqua de lThistidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine 10 no2 no2 Z.His.Arg.Phe.ONB > HBr x H.His.Arg.Phe.ONB HBr + HOAc * Rf 0,50 EXEMPLE 29 ^ Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-à sparaginyl-phényl-alanine BOC„Asn.OH + CH30SO3H x H .Phe. ONB + Ëéâctif 20 BOC.Asn.Phe.ONB P.F. 191 - 192®C EXEMPLE 30 Préparation du chlorhydrate de l'ester p-nitrobenzylique de 25 1'asparaginyl-phénylalanine BOC.Asn.Phe.ONB > HCI x H.Asn.Phe.ONB P.Fo 184 - 187°C 3Q EXEMPLE 31 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonylé asparaginyl-asparaginyl-phénylalanine HCI x H.Asn.Phe.ONB + BOC.Asn.OH —+*R4actif K' '^ ^ BOC.Asn.Asn.Phe.ONB P.F. 209 - 213°C (effervescence) 69 14459 26 2008037 EXEMPLE 32 Préparation de la t^butyloaeycarbonyl-aspar&ginyl-asparaginyl'» phénylalanine 5 BGOoAsïio Asn® Phe e 40°G à 5QaC içTFr , Asn o Asn.Ph© « OH 10 PoF. 204 - 206°C EXEMPLE 33 Préparation de l8ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl- asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phényl» alanine HOg B0G.Asn 0 Asn.Phe.OSu + H.His»Arg.Phe.ONB — N°2 ^ BOC.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Ph©®ONB 0,26, 0,36, 0,80 et 0,95 EXEMPLE 34 Préparation de l'ester p-nitgobengylique de j.Tasparagim 20 phénylalanyl-histidyl-N-nitro^aa'ginyl-phénylalanine N0o ToA. l7TEÏÏSL3 G.Asn o Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB N°2 H®Asn»Asn.Phe«His.Arg.Phe.ONB 25 EXEMPLE 35 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-but asparaginyl-leuc ine -p, OSO^H x B0G o Asn. 0H + H. Leu e0NB H^fliâct-tf K BOC.Asn.Leu « ONB PoF. 192 - 195°C EXEMPLE 36 35 Préparation du trifluoracétate de lg ester p-nitrobenzylique de l'asparaginyl-leucine BOC.Asn.Leu.ONB PoF, 128 - 130°C 'IfFÂ 1 ^ x H.Asn.Leu.ONB 69 14459 2008037 27 10 EXEMPLE 37 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucine NO, » *■ BOC « Arg.Asn.Leu.ONB EXEMPLE 38 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucine N02 N02 BOCoArg.Asn.Leu.ONB H*Pd ^ BOC.Arg.Asn.Leu.OH Rf 0,65 EXEMPLE-39 Préparation de 1*ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl- N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl- phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine NO, NO, ? ' » ^ BOC.Arg.Asn.Leu.0H + H.Asn.Asn.Phè.His.Arg.Phe.ONB EXEMPLE 40 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la N-nitro-arginyl- asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl- N-nitro-arginyl-phénylalanine N0, -20°C à 0°C I)CflD*+°H05u *> ^ ° ^rS • ^sn • Leu .Asn. Asn. Phe. Hi s. Arg. Phe . ONB N0, N0, Ç « f 6 H»Arg.Asn. Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB 35 Rf 0,2, 0,32 -f 69 14459 28 2008037 EXEMPLE 41 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl- tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl- phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine 5 no2 no2 BOC.Try.OSu + H.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB n°2 no2 —»i BOG o Try. Arg • Asn. Leu .Asn.Asn.Phe.His.Arg. 1Q Phe.ONB rf 0,56 EXEMPLE 42 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-^ histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine no, no- t * t 2 BOC.Try.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB NO, NO, TA ' ' 2Q He^ry.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB Rj* 0,4 EXEMPLE 43 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-alanyl-tyrosine BOC.Ala.OH + CH^jZfeO^ x H.Tyr.ONB ~12°C à 20°C > BOC0Ala.Tyr.ONB rf 0,47 30 1 EXEMPLE 44 Préparation du chlorhydrate de l'ester p-nitrobenzylique de 1* alanyl-tyrosine 35 BOC • Ala « Tyr. ONB > HG1 x H. Ala.Tyr.ONB rf 0,60 69 14459 29 2008037 EXEMPLE 45 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-séryl-alanyl-tyro sine 5 HG1 x H.AlaoTyr.ONB + BOC.Ser.OH "13°CAj^,Ao > BOC.Ser.Ala.Tyr.ONB Rf 0,73 - 0,92 EXEMPLE 46 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-séryl-alanyl-tyrosine BOC.Ser.Ala.Tyr.ONB > BOC.Ser.Ala.Tyr.OH 2 R- 0,80 15 EXEMPLE 47 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N--nltrQ~ 20 arginyl-phénylalanine NO, BOC » Ser. Ala. Tyr. OH + H.Try0Arg0Asn.Leu.Asn.Asn8Phe0His. nog n02 Arg «, Phe. ONB BOC.Ser. Ala a Tyr. Try. Arg „ Asn . 25 *" Ç02 Leu.Asn e Asn.Phe.His.Arg.Phe.ONB Rj. 0,60 EXEMPLE 48 30 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine NO- N0, i ^ BOC.Ser0Ala«Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.Asn«AsnoPhe«His«Arg.Phe. o* N0, Js TA - f ONB ——TT° BOC o Ser. Ala oTyr ,, Try . Arg. Asnc Leu„ Asn NGt>23 9 C HisoArg.Phe.0H Rf 0,22, 0,3, 0,80 69 14459 30 2008037 15 EXEMPLE 49 Préparation du t-»butyloxycarbonyl"3éryl-'alanyl-»tyrosyl-tryptophanyl-N"nitro-arginyl«asparaginyl~le.ucyl~asparûfiinyl-a3paraginyl-phényl~ alaayl'°histidyI«'I^aitrQ-argiaTl^phénylalanyl«"0°'benzyl"sérylglycyl-mé thioninami de N0o NO, t à t * BOC.Ser. Al,a» Tyr. Try « Arg.Asn £ Leu.Asn.Asn 0 Phe.Ki s.Arg. OBzl Phe.OH + TFA x H.Ser.Gly.Met.NH2 HQgu> B0C*Ser# N0o NO, OBzl r y f AlaeTyr«TryoArg»AsnaLeu.Asn.Asn•Phe0HisoArgoPhe„Ser.Gly« Mefc.NH^ Rf 0,60 EXEMPLE 50 ' VTtT.I J»np' | Préparation du trifluoracétate de séryl'-alanyl-tyrosyl-tryptophanjl^-N"-nitro-arginyL-asparaginyl-lsucyL»-a.spara.g;inyl"a.sparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl'-phénylalanyl--0~benzyl-séryl~ glycyl-méthioninamide N0, » & BOC « Ser.Ala.Tyr a Try.Arg•Asn » Leu.Asn o Asn N0, ï >His0Arg.Phe, 25 35 OBzl N02 Ser .Gly „ Met. NH2 TFA x H Ser. Ala -, Tyr. Try. Arg. Asn « N0, OBzl t *• . t Leu.Asn s Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly. Met.NH2 Rf 0,1 EXEMPLE 51 t---butyloxycarbonyl~S^benzyl"cystéiny3.°°0^bengyl°='sérYl^asparaginyl°» lsttcyl-0-bengyl-3éryl-thréonyl«^S-benayl«»cy-3».éinyl-»valyl-leucyl-aéryl° alanyl-tyrosyl-tryptophanyl^N^nltro-arglnyi^asparaginyl-leucyl- asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl- phénylalanyl-O-benzyl-sérylglyoyl-méthioninaraide SBzlOBzl OBzl SBzl BOC.Cys.Ser.Asn«Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Lèu.OSu + H.Ser.Ala. NO, NO, OBzl ' » * t » Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.Asn•Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly.Met• 69 14459 31 2008037 SBzlOBzl OBzl SBzl NHg BOC. Cys. Ser. Asn. Leu. Ser. Thr. Cys. Val. Leu. N09 N0o t Ser o Ala.Tyr.Try.Arg 0 Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe. 5 OBzl Ser.Gly.Met.NHg. Rf 0,5 . exemple 52 10 Préparation de l>ester méthyligue de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérylglycine OBzl BQCoSèr„OIU+ HCI x H. Gly. OMe ~15 °A.jLT'>A*—^ OBzl ^ BOC.Ser.Gly.OMe Rf 0,84 EXEMPLE 53 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérylglycine 20 OBzl OBzl BOC.Ser.Gly.OMe > BOC.Ser.Gly.OH R^, 0,80 EXEMPLE 54 25 Préparation de l'ester méthylique de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérylglycylrméthionine OBzl BOC.Ser.Gly.OH + HCI x H.Met.OMe TfA* > OBzl 30 BOC.Ser.Gly. Met.OMe Rf 0,74 EXEMPLE 55 OBzl OBzl 35 BOC.Ser.Gly.Met.OMe > BOC.Ser.Gly.Met.OH 0,82 69 14459 32 2008037 EXEMPLE 56 Préparation du trifluoracétate de l*Q-benzyl-sérylglycyl-méthloniriamide OBzl OBzl BOC o Ser. Gly. Met .NHg —> TFA x H.Ser.Gly.MeteNH2 5 EXEMPLE 57 Préparation du cystéinyl-séryl-asparagirryl-leueyl-séryl-thréonyl"-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrcsyl-tryptophanyl-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyi-phénylalanyl-histidyl-10 arginyl-phénylalaninamide SBzlOBzl OBzl SBzl t î t t BOC.Cys.Ser„Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val®Leu„Ser.Ala«Tyr.Try. ÎÎO, KO, * t -60°C â. T À ^ Argo Asn o Leu s Asn® Asn. Phe. Pli s e Arg ©Phe sNH2 œ=======^||r--!=î==&==s3' H0Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.ValcLeu aSeraAla0Tyr eTry o Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.NH2 20 EXEMPLE 50 Préparation du fluorhydrate de cystéinyl-séryl SBzlOBzl OBzl SBzl ï t « t BOC.Cys«Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser»Ala«Tyr.Try. 30 NO, N0o OBzl * ^ » * » t Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly.Met0GlysPhe. Gly.Pro.NH2 ""10°§pà T*A* HP x H.Cys.Ser.Asn.Leu. Ser.Thr 0 Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg„Asn.Leu.Asn.Asn. 35 Phe,His«Arg.Phe.Ser.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NH2 69 14459 33 2008037 EXEMPLE 59 Préparation du trifluorhydrate de cystéinyl-séryl-asparaginyl-leucyL-séryl-thréonyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-5 phénylalanyl-histidyl-arginyl-phénylarginyl-sérylglycyl-méthioni-namide SBzlOBzl OBzl ' SBzl BOC•Cys.Ser,Asn,Leu,Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try. 10 ?°2 ï°2 ?Bzl Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly. Met.NH^ -6°°C à T'A* > -HF x H.Cys.Ser.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys. +HF , 3 ■ 15 Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg. Phe. Ser. Gly. Met. NHg EXEMPLE 60 Préparation de l'ester t-butylique de la benzyloxycarbonylglycyl-20 phénylalanyl-glycine Z.Gly.Phe.Gly.OH + H.Pro.O-t-Bu M.°°G > Z.Gly.Phe.Gly.Pro.O-t-Bu 25 P.Fo 77 - 78 °C EXEMPLE 61 Préparation de l'ester t-butylique de la t-butyloxycarbonylglycyl-méthionylglycyl-phénylalanylglycyl-proline 30 BOC.Gly.Met.0H + HCI x H.Gly.Phe.Gly.Pro.O-t-Bu —T'A" ^ BOC. Gly. Met. Gly. Phe. Gly. P ro . O-t-Bu DCCD + HOSu 35 hj 0,85 69 14459 34 2008037 EXEMPLE 62 Préparation de la t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérylglycyl-méthionylglycyl-phénylalanylglycyl-proline OBzl BOC « Ser o OSu + H.Gly. Me t.Gly.Phe„Gly.Pro.OH "fJaHCÔ OBzl BOC. Ser ..Gly. Met. Gly.Phe.Gly.Pro.OH EXEMPLE 63 10 Préparation du t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérylglycyl-méthionylglycyl-phénylalanylglycyl-prolinamide OBzl BOC.Ser.Gly.Met « Gly. Phe. Gly c Pro o OH 15 OBzl •ï 20 BOC.Sér.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro.KH^ Rf 0,57 EXEMPLE 64 Préparation du chlorhydrate de lfQ-benayl OBzl BOC. Ser.Gly.Met. Gly. Phe .Gly « Pro. ÎÏH2 HffiT^HOAc^ ■ Oflsl 25 HCI x H.Ser.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NHg EXEMPLE 65 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-Q° benzyl-séryl-thréonyl-S~benzyl-cystéinyl~valyl~leucyl-séryl-alanyl~ tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl" 30 iyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanlne OBsl SBzl N02 BOC t, Ser. Thr. Cys. Val. Leu. OH + H.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn. NO, 35 Asn. Leu .Phe.His. Arg. Phe. ONB OBzl SBzl NO- » » t * BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try. Arg.Asn.Leu. 69 14459 35 2008037 N0o t Asn.Asn.Phe.His 0Arg ePhe «ONB R^ 0}80 exemple 66 P Préparation de 1*ester p-nitrobenzylique de lfO-benzyl-séryl— thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophahyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine 10 OBzl SBzl N0o î t t *~ BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try®Arg.Asn0Leu.Asn. N02 OBzl SBzl Asn«Phe.His.Arg.Phe.ONB —+TFl> x H.Ser.Thr.Cys. . - NO*5 15 t 2 Val. Leu.Ser. Ala. Tyr. Try. Arg 0 Asn. Leu. Asn. Asn. Phe «, His. N°2 Arg«Phe.ONB R- 0,8 20 exemple 67 Préparation de l'ester p-nitrobenzylique de la t-butyloxycarbonyl-S-bengyl-cystéinyl-O-benzyl-séryl-asparaginyl-leucyl-O-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-25 tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanine SBzlOBzl OBzl SBzl BOC.Cys.Ser.Asn.Leu.OH + H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala. N0? N09 ■5 9 1 ^ J Tyr.Try » Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.Hi s.Arg„Phe„ONB SBzlOBzl OBzl SBzl TA » » î î DÔCf) +'HÔSu—^ B0G "Cy s •Ser.Asn.Leu.Ser. Thr. Cy s. Val. Leu. no, no~ "î c ï î Ser. Ala. Tyr. Try. Arg. Asn. Leu. Asn. Asn. Phe. Hi s. Arg. Phe. ONB R^> 0,6 - 0,8 69 14459 36 2008037 EXEMPLE 6g Préparation c'u t-butyloxycarbonyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leueyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylala-nyl-histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanyl-O-benzyl-sérylglycyl-5 méthionylglycyl-pKénylalanylglycyl-»prolinamide N0o N0o t g. ,4. BOC.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe. OBzl *q OH + HCI x H.Ser.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.ProoNHg ^ N0o N0o t ^ t ^ BOC 9 S ©r o Ala»Tyr.Try.Ârg•Asn « Leu.Asn«Asn.rhe.His.Arg « Phe. OBzl Ser.Gly. Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NHQ 15 Rf 0,5 EXEMPLE 69 Préparation du séryl-alanyl~fcyrosyi~tï"yp'oophanyl~N-nitro-arsinyl-" 4 asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-' 20 N-nitro-arginyl-phénylalanyl-O-benzyl-sérylglycyl-méthionylglycyl^ phénylalanylglycyl-prolinamide NO, N0o ? *, t ^ t a BOC.S er.Ala.Tyr.Try.Arg•Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe. 25 * OBzl Ser.Gly.Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NH2 Hfl^+^HOAc " NQ0 t HCI x H. Ser. Ala. Tyr. Try. Arg. Asn. L&u. Asn o Asn. Phe. His. N0„ OBzl 30 * 4 t Arg» Phe.Ser.Gly. Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NH? Rf 0,3 EXEMPLE 70 Préparation du t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-séryl-thréonyl-S-bensyl-35 cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nltro»» arginyl-asparaginyl-leucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-" histidyl-N-nitro-arginyl-phénylalanyl-0-benisyl~^érylglycyl-îaéthj.cn; glycyl-phénylalanylglycyl-prolinamide 69 14459 37 2008037 OBzl SBzl » * BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OSu + HCI x H.Ser.Ala.Tyr.Try. N0o N0o OBzl ' » * i ^ » Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.Hxs.Arg.Phe.Ser.Gly«Met.Gly.Phe. 5 OBzl SBzl Gly.Pr0.NH2 —>■ BOC.Ser.ThreCys9¥al.L©UoSer«Ala. NO„ NO, OBzl Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg » Phe.Ser.Gly. 10 Met•Gly.Phe.Gly.Pro.NH2 Rf 0,75 EXEMPLE 71 15 Préparation du trifluoracétate de 1*Q^benzyl"séryl-thréonyl^S° benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-fcryptopMriyl-N'" nitro-arginyl-a3paraginyl-leucyl-asparaginyl-asparag;inyl-»phénirl°» alanyl-histidyl-N-nitrô-ârginyl-phénylalanyl-Q-bQnzyl-séFFlglyeyl"-méthionylglycyl-phénylalanylglycyl-prolinamide 20 OBzl SBzl NQ2 BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn.Leu. NO- OBzl t ^ t Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly. Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NH-, 25 OBzl SBzl ——TFA x H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try. H0„ N0o OBzl f 9^9 Arg.Asn.Leu.Asn.Asn.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly.Met.Gly.Phe. 30 Gly0Pro.NH2 BXEMPLE 72 Préparation du t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-benzyl-séry.1" asparaglnyl-leucyl-Q-benzyl~séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl«°?alyI leucyl-séryl-alanyl-trysol-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginjl= ieucyl-asparaginyl-asparaginyl-phénylalanyl-histidyl-N-nitro-arginyl^ phénylalanyl-O-benzyl-sérylglycyl-méthionylglycyl-phénylalanyl- glycyl-prolinamide 69 14459 2008037 SBzlOBzl OBzl SBzl S S « î BOCoCysoSer.Asn.Leu.OSu. + TFA x H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu. NCU N0o t t 2 Ser o Ala 0 Tyr a Try oArg c isn . Leu0 As» »Âsn . Phe 0 Hi s o Arg 0 Phe ® '"i OBzl Sor.Glyo Mec.Gly.Phe.Gly.Pro.NH, — TaAa > SBzlOBzl OBzl SBal f ï s s BOC « Cys. Ser. Asn. Leu. Ser. Thr. Cys. Val. Leu «, Ser® Ala. Tyr. 10 NO„ H0o OBsl f Ty-y 0 Arg « Asn 0 L©u e Asn 0 Asn « Phe ? Hi s Q Arg . Phe c Ser e Gly « Met 9 Gly o Phe„Gly «Pro eNHg j; Rf O, 30 BXEMPLE 73 Préparation du t-butyloxycarbonyl-tyrosyl-»t,ryptophane 300 o Tyr, OSu + H « Try. OH — 20 BOG »Tyr 0 Try « OH R.? 0S4 - 05Ô EXEMPLE 74 25 Préparation du tyrosyl-tryptophan® BOC.Tyr.Try.OH H.Tyr.Try.OH ^ A* fl^ P.? Os5j Os4 et 0382 EZgMPLE 75 Préparation du t-butyloxyearbonyl^-alanyl^tyg'osyl^tryptophane BOC.Ala„OSu + H.Tyr.Try.OH —TaiU > BOC.Ala.Tyr.Try.OH 35 SIMPLE 76 Préparation du chlorhydrate d♦alanyl-tyrosinyl-tryptophane BOC.Ala.Tyr.Try.OH McîC+&H0Àe* > HC1 x H*Ala.Tyr.Try.OH Rf 0,2 69 14459 39 2008037 EXEMPLE 77 Préparation du t-butyloxycarbonyl-Q-benzyl-séryl-alanyl-tyrosinyl-tryptophane OBzl 5 BOG « Ser 0 OSu + HCI x H. Ala. Tyr. Try. OH OBzl BOC«SeroAla.Tyr.Try.OH EXEMPI3 78 10 Préparation de l1ester de N-hydroxysuceinimide de la c^butyloxy-carbonyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucine NOp BOG. Arg. Asn. Leu. OH À^HOSu5 °C 15 N02 BOC.Arg.Asn.Leu.OSu 0,02 EXEMPLE 79 20 Préparation du t-butyloxycarbonyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamide N02 BOC.Arg.AsnoLeu.OSu + NH^ °°C & 1Q°G > 25 î°2 BOC.Arg o Asn.Leu.NH2 rf o j 7 EXEMPLE 80 30 Préparation du trifluoraccfta.te da N-nitro°arfiinyl^asparaginyl-leucinamide N°2 NO2 BOC „ Arg o Asn. Leu. NH2 > x H. Arg. Asn. Leu. NH2 35 rf 0,25 69 14459 2008037 w EXEMPLE 81 Préparation du t-butyloxycarbonyl-O-'benzyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamlde OBzl N02 BOC.Ser.Ala.Tyr.Try.OH + TFA x H.Arg.Asn.Leu.NH2 OBzl N02 °"^ ^ BOC.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.NH2 10 Rf 0,8 bxemple 82 Préparation du trifluoracétate d'O-benayl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophahyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamlde 15 OBzl N02 BOC.Ser.Ala.Tyr.Try-.Arg.Aan.Lau.NH2 + TFATtA* > OBsl N02 TFA x H.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.Asn.Leu.NH2 20 Rf 0,7 EXEMPLE 83 Préparation du t-butyloxycarbonyl-O-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-O-benzyl-séryl-alanyl-tyrosyl-25 tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamide OBzl SBzl OBzl BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.OH + TFA x H.Ser.Ala.Tyr.Try. NOg -jq Arg.Asn0Leu.NH2 ' ^ M OBzl N02 OBzl N02 BOC.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser•Ala.Tyr.Try•Arg.Asn.Leu.NH2 Rf 0,8 69 14459 2008037 41 EXEMPLE 64 Fréparati on de 1*O-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-O-benzyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamide OBzl • SBzl OBzl N0o t t » t ^ BOC„Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr„Try.Argo Asn.Leu.NHg OBzl SBzl OBzl ToAo h.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser»Ala.Tyr.Try. 1Q TFA H** NaHC03 N0o t ^ Arg.Asn.Leu.NHg R|. 0,8 15 EXEMPLE 85 Préparation du t-butyloxycarbonyl-S-benzyl-cystéinyl-O-bengyl-séryl asparaginyl-leucyl-Q-benzyl-séryl-thréonyl-S-benzyl-cystéinyl-valyl-leucyl-O-benzyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptophanyl-N-nitro-arginyl-asparaginyl-leucinamide 20 SBzlOBzl OBzl SBzl OBzl » t t » s BOC„Cys.Ser.Asn.Leu.OSu + H.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala. 25 N09 SBzlOBzl * TA * * Tyr.TryoArg.Asn.Leu.NHg * * > BOG,Gys.SeroAsn»Lsu. OBzl SBzl OBzl N02 S er o Thr.Cys.Val. Leu•Ser.Ala•Tyr.Try.Arg„ Asn.Leu.NH2 30 Rf 0,85 EXEMPLE 86 Préparation du fluorhydrate de cystéinyl-séryl-asparaginyl-leucyl-séryl-thréonyl-cystéinyl-valyl-leucyl-séryl-alanyl-tyrosyl-tryptQ" phanyl-arginyl-asparaginyl-leucinamide SBzlOBzl OBzl SBzl OBzl * * » » » 35 B0C.CysoSer.Asn.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr•Try. 69 14459 42 2008037 NO, t —an°n s t a Arg<>Asn.Leu• NH2 — 4HF * *—^ ^ x H. Cys.Ser.Asn.Leu. Ser.Thr.Cys.Val.Leu»Ser.Ala.Tyr.Try « Arg•Asn•Leu.NHg EXEMPLE 57 Détermination de l'activité thyroealeitoniaique du produit de 1*exemple 66 On dissout un échantillon du produit de l'exemple 86 ,4îq dans l'acide chlorhydrique 0,01 N; on dilue la solution à l'eau à concentration finale d'environ 0S4 mg de produit par ml de solution CpH 3 environ). Dans cette solutiona on recherche qualitativement la présence des groupes sulfhydryle par un® modification de la méthode de Boyer, P.D. décrite daas nSrm ctro pho tome tri c Study of the Reaction of Protein Sulfhydryl Groups with Organic Mercuriale^ Journal of the American Chemical Society» volume 76, pages 4331-4337 (1954). Cette recherche donne un résultat positif. On règle le pH de la solution â 7,5 environ â l'aide d'ammoniaque aqueuse et on agite vigoureusement de manière à pro-voquer une aération jusqu'à ce que la solution donne un résultat négatif à la recherche des groupes sulfhydryle. On congèle alors la solution et on la lyophilise sous forme de poudre sèche. On étudie l'activité thyrocalcitoninique de cette poudre de la manière usuelle par essai sur des rats. 22 Cette activité est au moins égale en puissance à celle du produit de l'exemple 86. On soumet cette poudre à une distribution à contre-courant à l'aide du système solvant n-butanol-eau-acide acétique glacial (5î4î1). On décèle de cette manière au moins trois produits différents. 69 14459 w •20080 37 revendications 1. A titre de médicament nouveau utile notamment en cas de troubles de métabolisme du calcium présentant une activité analogue & celle de la thyrocalcitonine, un polypeptide répondant à la formule de constitution suivante : « c * • 5 S S • r f .Cys.Ser.Asx*Leu.Ser.Thr•Gys*Val.Leu.Ser.Ala. 1 23 45 67 8 9 10 11 Tyr.Try.Arg.Asx. (Leu. ), (Asx. ).. (Asx. ) (Phe.) (His. ) ' 12 13 14 15 16 k 17 1 18 m 19 n 20 0 10 (Arg.) (Phe.) (ser.) (Gly.) (Met.)t(Gly.) (Phe.) • 21 P 22 ^ 23 24 25 26 27 (Gly.) (Pro.) (Glx.) (Thr.) 28 w 29 30 7 31 z dans laquelle les symboles k à z représentent des nombres égaux à "15 0 à 1 et les points représentent, conformément à l'usage, des liaisons reliant les aminoacides entre eux ou à des groupes fixés sur ces aminoacides. 2. Un polypeptide selon la revendication 1, dans lequel l'atome de carbone terminal est un carbone d'amide et l'atome d'azote 20 terminal est un atome d'azote aminé. 3. lin polypeptide selon les revendications 1 et 2, répondant à la formule de constitution ci-après : • o S s t » __ HoCysoSer.Asx.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala. 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tyr.Try.Arg.Asx.Leu.NH 12 13 14 15 16 ^ 30 4. Un polypeptide selon les revendications 1 et 2, répon dant à la formule de constitution : e • S S t t H.Cys.Ser.Asx.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 _ Tyr .Try. Arg. Asx. Leu. Asx « Asx. Phe. His. Arg.Phe CNH„ 35 12 13 14 15 16 .17 18 19 20 21 22 V 69 14459 44 2008037 5* Un polypeptide selon les revendications 1 et 2, répon dant «-à la formule de constitution, suivante : $ O S S - i « " H.Cys.Ser.Asx.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala.Tyr.Try. 5 1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10 11 12 ,13 ,; Arg.Asx.Leu.Asx.Asx.Phe.His.Arg.Phe.Ser.Gly. Me t.NH, 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 6. Un polypeptide selon les revendications 1 et 2, répon- 10 dant & la formule de constitution suivante : • • S S H.Cys.Ser.Asx.Leu.Ser•Thr•Cys.Val,Leu*Ser.Ala. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 . Tyr.Try.Arg.Asx.Leu.Asx.Asx.Phe.His.Arg.Phe. 15 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 S er.Gly. Met.Gly.Phe.Gly.Pro.NHL 23 24 25 26 27 20 29 7* Un polypeptide selon les revendications 1 et 2, répon dant à la formule de constitution suivante : • • ' S S H.Cys.Ser.Asx.Leu.Ser.Thr.Cys.Val.Leu.Ser.Ala. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 5 Tyr. Try • Arg. Asx. Leu. Asx. Asx. Phe. His. Arg. Phe. 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ser.GlyeMet»Gly.Phe«Gly•Pro•Glx.ThreNH„ 23 24 25 26 27 28 29 30 31 * 30 g. Les compositions thérapeutiques contenant comme ingrédient actif tin polypeptide selon les revendications 1 à 7, aësocié à un support pharmaceutiquement acceptable. 9. Les formes d'administration des compositions selon la revendication 8. 10. Les formulations injectables contenant un polypeptide selon les revendications 1 à 7 et un support protéiné* 20 69 14459 45 2008037 11. Un procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 1, présentant une activité analogue à celle de la thyrocalcitonine, procédé caractérisé en ce que l'on effectue la synthèse de plusieurs fragments peptides dont certains au moins 5 contiennent plusieurs aminoacides disposés selon la séquence représentée par la formule de la revendication 1, on bloque un groupe amino terminal d'un des fragments et le groupe carboxy terminal correspondant d'un autre fragment, on les condense de manière à former un peptide plus gros contenant les deux fragments 10 en séquence, et on condense d'autres fragments peptides contenant chacun au moins un aminoacide, selon la séquence représentés par la formule, par déblocage du groupe carboxyle terminal du polypeptide formé dans le premier stade et condensation de ce polypeptide avec un fragment peptide portant un groupe carboxyle ter-15 minai bloqué et un groupe amino terminal non bloqué, en répétant l'opération jusqu'à ce qu'on obtienne un polypeptide contenant au moins les 29 premiers aminoacides selon la séquence représentée dans la formule de la revendication 1, qu'on recueille. 12. Un procédé selon la revendication 3, dans lequel le 20 premier fragment consiste en la séquence des aminoacides 1 à 9 de la formule de la revendication 1 et le second fragment qu'on condense sur le premier est un polypeptide présentant la séquence des aminoacides 10 à 22 de la formule de la revendication 1. 13. Un procédé selon la revendication 8, dans lequel le 25 premier fragment présente la séquence des aminoacides 1 â 4 de la formule de la revendication 1 et le second fragment, qi'on condense sur ce premier fragment, est un polypeptide présentant la séquence des aminoacides 5 à 16 de la formule de la revendication 1.