A 2023860 La présente invention a pour objet une méthode permettant d'isoler biochimiquement le 1-menthol. De par sa configuration stéréochiraique, le menthol peut avoir quatre stéréoisomères, à savoir: le menthol, l'iso-5 menthol, le néomenthol et le néoisomenthol. Corroie chacun d'eux a une forme dextrogyre (d) et une forme lévosyre (1), cela fait en tout huit isomères optiques. Dans ce nombre, le 1-menthol est l'un des principaux constituants de l'essence naturelle de menthe, et c'est lui qui présente les meilleures propriétés "rafraichis-10 santés", de sorte qu'on l'utilise largement en parfumerie et en pharmacie. On peut le préparer de diverses façons. Or. peut, par exemple, le séparer sous forme de cristaux par refroidissement de l'essence de menthe naturelle. Par synthèse, on peut l'obtenir 15 à partir de la 1-menthone que contient ladite essence naturelle, par réduction à l'aide de sodium métallique. A l'échelle industrielle, on le fabrique à partir du d-citronellal que contient l'essence de citronelle, par cyclisa-tion et hydrogénation. Mais comme ces matières premières natu-20 relies (1-méthone et d-citronellal), qui sont optiquement actives, ne peuvent être fournies qu'en très petites quantités, le besoin se fait sentir, pour la synthèse du 1-menthol, de produits chimiques industriels à bas prix. Lorsqu'on part, pour cette synthèse, de matières 25 premières optiquement inactives, le problème important à résoudre est de 3eparer, du mélange des isomères racéaiques, le seul menthol gauche, parce qu'il est impossible d'empêcher la formation simultanée de tous les isomères-dl (dl-menthol, dl-iso-menthol et dl-néoisomenthol). Jusqu'à présent, les nombreuses 30 tentatives pour séparer le 1-menthol n'ont jamais abouti sur le pian industriel, et c'est pourquoi dans de nombreux cas le corps qu'on utilise n'est pas tout à fait pur. Le principal procédé de synthèse industrielle du l-ner.thcl consiste dans l'hydrogénation du thymol, et à mainte-35 nir par la chaleur le mélange d'isomères racémiques qui en résulte, : la composition suivante: dl-menthol, environ 70£> ; dl-isomenthol, environ 20%; dl-nécmenthol, environ ÎO^, et dl-n.îoiscmenthol : traces. Toutefoisles proportions de ces isomères peuvent varier suivant les conditions de la réaction, 40 ce v.; r.onne un produit de composition très i"- nstante , 6939148 2 2023860 une autre méthode de synthèse du dl-menthol consiste à faire, par cyclisation et hydrogénation du dl-citronelial, un mélange composé essentiellement de dl-menthol (environ ?0j«) , de di-iôoneatiiol et de dl-néomenthol, cuis d'en extraira le ai- / i men thol. Po*;r Le dédoublement optique de ;e d irni«r. les mé-j ko^.,vji i- jusqu'ici cornoortaient sa ôooaratien v')^^ à pcrTsi;- .>es ses:!-est ers phthaliques, le iir;oxy ••no•:or de l'aeia^ acfitiqus , et le dl-ester de l'acide caniphorxque. Ces proc i-13.- -jC-.t t rcp :o2teux et trop complexe •; l'ec.;.eil? industriel!* , ru- 3 'emploient qu'au laboratoire. ",a présente invention a pour objets : -- ,;>j procurer une méthode bioohimicu-.» le a ipayatiou du 1-xenthol ; - ,io procurer une méthode nouvelle de dédûucùoment optique la ai-menthol ou des mélanges d'is OïHô!r*ficj x a. C rjiO -,- ijs s - de procurer une méthode pratique et oatisfa-sante pour la production du 1-menthol; - de permettre d'obtenir indus triellemo.iit un 1-menthol optiquement actif pouvant servir à la fabrication â^s parfums et des médicaments à partir du thymol. On a découvert qu'un 1-menthol optiquement actif peut ?tre isolé biochimiquement par un procédé comportant le dédoublement optique d'un ester organique carooxyiique de menthol ra-cémique, ou par dédoublement optique d'esters orgsniques carboxyiique s d'un mélange d'isomères de menthol racsmique (dl-menthol, dl-isomenthol, dl-nécaenthol, et dl-néoisomentholi. On peut utiliser peur cela une ou plusieurs enzymes comme les hydrolases d'ester carboxyiique que produisent certains microorganisaes du type: Candidi, Saccharomyces, Pichia, Sporoboloiayces, Debaryo-myces, Nadsonia, Trichosporon, Brettanomyces ou Cryptococcus. 11 existait déjà un procédé qui permettait d'isoler bi ochimiquement le 1-menthol à partir du menthol racémique ou de 3on mélange avec ses isomères racémiques: on traitait un ester organique carboxyiique de dl-menthol, ou un mélange audit e ster avec les esters organiques carboxyiiques d'isomères de menthol racémique contenant ce dernier (l'acide carboxyiique utilisé étant l'acide formique ou un acide gras de formule générale RCCCH, où R ej;t un groupe alkyle ou alkényl; ayan;; de 1 à 21 6939148 3 2023860 atomes de carbone), avec une enzyme particulière, hydrolase de l'acide carboxyiique, que produisent certains microorganismes tels que: Pénicillium, Gliocladium, Trichoderma, Geotrieum, Aspergillus, Pullularia, Fusarium, Absida, Cunninghamella, 5 Rhizopus, Actinomucor, Chlamydomucor, Mucor, Gribberella, Strep- tomyces et Bacillus; ladite enzyme ayant été soit séparée de ses corps cellulaires et de leur milieu de culture, soit utilisée directement en restant incorporée aux cellules ou au milieu. L'association isomère-enzyme est soumise à une hydrolyse asymé-10 trique qui, à partir du mélange d'esters organiques carboxyliques d'isomères de dl-menthol contenant ce dernier, libère un 1-menthol et un 1-isomenthol optiquement actifs, mais qu'il faut ensuite séparer. Pour éviter cette dernière opération, il faudrait soit utiliser un mélange brut ne contenant pas d'ester de 15 dl-isomenthol, soit retirer dudit mélange le dl-isomenthol avant de procéder.à l'hydrolyse biochimique. Pour pallier ces inconvénients de la première méthode et mettre au point un procédé permettant de s éparer directement le 1-menthol du mélange de menthol racémique et de ses isomères, 20 on a recherché un microorganisme produisant une hydrolase d'ester carboxyiique capable d'hydrolyser seulement un ester organique carboxyiique de 1-menthol, sans hydrolyser les esters des isomères racémiques. Il a été découvert un certain microorganisme produisant une hydrolase d'ester carboxyiique, capable d'opérer cette 25 hydrolyse sélective du seul ester de 1-menthol, avec libération exclusive de 1-menthol, tandis que les esters des isomères racémiques restent non hydrolyaés. C'est sur cette observation qu'est basée la présente invention. Celle-ci consiste à traiter un ester organique carbo-30 xylique de dl-menthol, ou le mélange dudit ester avec des esters organiques carboxyliques d'isomères de dl-menthol associés au dl-menthol lui-même, (l'acide carboxyiique correspondant étant l'acide formique ou un acide gras de formule générale: RC00H où R est un groupe alkyle ou un groupe alkényle ayant de 1 à 21 35 atomes de carbone), avec line enzyme particulière: une hydrolase d'ester carboxyiique, que savent produire certains microorganismes du type: Candida, Saccharomyces, Hansenula, Rhodotorula, Torulopsis, Schizosaccharomyces, Pichia, Sporobolomyces, Debaryomyces, Nadsonia, Trichosporon, Brettanomyces et Crypto-40 cossus; ladite enzyme ayant été séparée des corps cellulaires 6939148 i» 2023860 correspondants et de leur milieu de culture, ou bien étant utilisée directement sous forme desdits corps cellulaires ou des milieux de culture contenant ladite hydrolase. L'ensemble: isomère/enzyme est alors soumis à une hydrolyse asymétrique qui 5 aboutit à la séparation de 1-menthol optiquement actif. Un type d'essai à utiliser de préférence pour l'hydrolyse des esters de dl-menthol à l'aide des microorganismes susmentionnés, selon la présente inyention, s'effectue comme suit: Dans un tube à essai ayant lômm de diamètre intérieur 10 et 250mm de longueur, on met 10 ml d'un milieu composé de 10g de glucose, 5g de phosphate dipotassique, 7g de peptone et 5g d'extrait de levure dans 1 litre d'eau. Après stérilisation, on ensemence ce milieu à l'aide du microorganisme à tester, puis l'on agite le tube durant 4# heures à 27°C. On ajoute alors au 15 milieu, dans les proportions indiquées au tableau 1, une énul-sion à base d'acétate de menthyle composée pour 30% d'une phase aqueuse à 2% d'alcool polyvinylique, et pour 20% d'un mélange composé des acétates isomères racémiques suivants: dl-acétates de menthyle (55,2%), de néomenthyle (34»3%), d'isomenthyle 20 (15,5%) et de néoisomenthyle (traces), après quoi, le tout est secoué durant kê heures» Le milieu de culture est extrait à l'éther éthylique, puis on chasse l'éther de l'extrait. Le résidu obtenu est analysé par chromatographie gazeuse. Le taux d'hydrolyse - (1-menthol x 100/dl-acétate de menthyle 25 + 1-menthol) est calculé À partir du sommet du chromatogramme. Eésultats au tableau 1. La classification des microorganismes est basée sur l'ouvrage de Lodder & Kregger Van Eij "The Teasts, a taxonomic study" ( 1952.) • ! 6939148 5 2023860 - Tableau 1 - Microorganisme s 1 quant.ajoutée du mélange: ester acétique de dl-menthol + isomères y Taucc d'hydro- -lyse (en quant.libéré d'isomenthol (en }c) candida peliculosa 2 17,1 0 robusta 2 18,3 0 lipolytica 2 27,4 0 tenuis 2 2,3 0 utilis 2 3 0 saccharomyces cerevisiae var elipsoideus 2 14 0 saccharomyces rouxii 2 n c y S 0 saccharomyces rouxii var polymorphu3 2 11,3 G pichia fermentans 2 «• j» c pichia membranaefaciens 2 -r J : n schizosaccharomyces pombe 2 . s G schizosaccharomyces octosporus 2 2^ G schizosaccharomyces sp. 2 -/ j't 0 torulopsis dattila 2 16. i 0 aeria 4 21,4 o candida 2 5,è c etchellsii 2 6 0 hansenula anomala 2 19; 4 0 3aturnu3 2 "1 ( \ c , o 0 minuta 2 17,3 0 rhodotorula glutinus 3 20,1 0 5 22,3 0 — glutinus var rubescens 3 15 0 rhodotorula rubra 3 10 ^ 0 minuta 2 2b ,2 c fl ava 2 19,7 0 mueilaginosa 3 24 O' rhodotorula mucilaginosa 5 27,6 0 10 14,7 0 sporobolomyces roseus 2 2,6 0 pararoseus 1 6 0 debaryomyces hansenii 1 2,7 Q kloeckeri 2 2,4 0 nadsonia flavescens 2 5,8 0 trichosporon pullurans 2 "! 7 i Q behrendii 2 14 0 brettanomyces klausenii 1 9,3 o bruccellensis 1 3,4 û cryptococcus alhidus 4,7 c cryptococcus laurentii var flave.r.ceins 2 3 ,o n Pour obtenir l'ester carboxyiique de dl-menthol, on utilise l'acide formique et les acides de formule générale RCOOH où R est un groupe alkyle ou alkényle ayant de 1 à 21 atomes de carbone, par exemple les acides suivants: acétique, propionique, butyrique, eaprolque, caprylique, caprique, laurique, myristique, 6939148 6 2023860 pal/aitique, stéariaua, acrylique, oléique, crucique, Dana la inJ-Stî en oeuvre ùâ la présence invention, ceux qui c * 5 élevé a'hydrolyse asymétrique. Le caractère le plus importan„ l*-i la .:.nvc.;~ .ioû est _e :;;ùriî2ent e nzymatiqus d'un cô'^r ;:\;ar.i \...• irbo;:/- ^ue . -i.:é.-.tncl ou d'un mélange d'oscsra carberryli -uec iso- ^re.» au.ï. .« icnne e ■ ^ i.. eeru ix l'hydrolyse uCijct»vo e, : i .■•. i-:. •:;."3 ^ ■? dune la présente invention . 1 '.r.•.>ro._;'3 -• •' •_ in croissance ou de leurs cellules inv-û-jce:, u-uis : i-core en 1 = célan^eant à un milieu de cul-are exeap- de cellule3 vivantes et avec les extraits sans cellules deseLLt j nier;-rga-msir.ec„ Lans la ai s a en oeuvre de c c ;rccêué. li teneentur-. 2C optimale d ^ réaction e st coaprise entre 25 2» 45°C ; îi .-; -.-.st de préférence de 25 à 37°C, de façon que le 3 en3Tr.ec coi ont ir.ri-î-tivee3 le mnne possible par J.3. cjfi ri [ ai j # r ér-3. c u 1. u n ci Q h- ifS heures environ, à 25-37°C. La quantité d' enzyme utilisée y "sa ferme brute 1 ar exemple Sx.Ô) est d'environ C,1 à G, 5% eu poids s 1 il iiioj. an^s' de réacti -i-r- ^ • 1 « Dans le mêla nga J :i3.::nl ;rer d-- dl-meu- cncu, la pi 0portion • esters 0rgani que.; carbc: :/l.lque; iepré- snr.i'î -3 r • - 'p r"' 3 n. C 0 2 à 10% environ e n poidr du aelar^-e dn réac tiorw Aux plu.3 i07o 63 concent raticas * - - - -•••-• i' ny-lrolpse peut ouio se r.. demandant, m5cie aux concentrât! Jus élevéos, la réaction, peu , è-,re accélérée par l'emploi d-'une plus grande quantité d •'sa-syres, es:;r organique carboxyiique le àl-iri£-:itnoi ;.u un rnte i;mge i •;i isotûeres auxquels le iix~me.ut.ioi e st a3se jié ^eut être ajouté sel quel ou sous forme d 'ému-sion. L:hydrolyse peur étr-3 ass 33 rapico lorsque l'additioa esc faite à !'•' état 1 ?émué -ion. 35 suivant 1a présente invention, un ester carboxyiique 1 - /ùv l -'U un mélange d'esters ._-jC..n;rés a._e 3 j' a3 jé -e d L-r.isn thoj. peut •*0 reecar.t en d ir.-eri .le la réaction. ?a.:- c oéeueu; , 31 ^ .^te,' ■.\n bouylique 6939148 7 2023860 de dl-menthol sert de substance de départ, seule la forme gauche est hydrolysée, tandis que la forme droite reste inchangée. Le menthol gauche se sépare facilement du mélange de réaction, de par ses propriétés physiques et chimiques différentes(notamment 5 par adsorption chromatographique sur alumine), par extraction à l'aide d'un solvant, par distillation fractionnée, etc. Les exemples ci-après expliciteront les réalisations préférentielles de la présente invention. EXEMPLE 1 On met dans un ballon, 100ml d'un milieu formé de 1Q glucose (2%), de phosphate dipotassique (0,5%), de peptone (0,7%) et d'extrait de levure (0,5%). On stérilise, puis on ensemence le milieu avec deux pleines anses de platine de Saccharomyces cerevisiae var.elipsoideus prélevées sur une culture oblique. Le tout est secoué (amplitude de vibration 6cm, rotation 150 t/min) 15 durant 40 heures à 27°C; ensuite on ajoute 2g d'un mélange d'ester acétique de dl-menthol avec ses isomères racémiques (dl-acétates de menthyle 55,2%, d'isomenthyle 15»3%; de néomenthyle 29,3% ; de néoisomenthyle: traces) émulsionnés dans 8ml d'une solution aqueuse à 2% d'alcool polyvinylique, et l'on secoue le tout durant 20 encore 48 heures. Le mélange de réaction est alors extrait à l'hexane et chromatographié sur colonne d'alumine de façon à séparer le menthol gauche des esters non touchés par la réaction. On obtient ainsi 0,24g de 1-menthol. 25 l'exemple 1, on stérilise et lfon ensemence avec Candida pelicu-losa. On secoue le tout durant 40 heures, puis l'on ajoute 3g d'un mélange d'ester formique de dl-menthol et de ses isomères racémiques (dl-formiates de menthyle 55,2% ; d'isomenthyle 15,37° ; de néomenthyle 29,3% j de néoisomenthyle: traces), après quoi l'on 30 secoue le tout pendant encore 20 heures. Le mélange de réaction est alors extrait à l'hexane et chromatographié sur colonne d 'alumine pour séparer le menthol gauche des esters non touchés par la réaction. On obtient ainsi 0,53g de 1-menthol. 20 Rendement 1; 2%( «-46,6® (c=5;éthanol). D mHtfiE 2 On met dans un flacon 100 ml du milieu décrit à Rendement 17,7% D éthanol). 6939148 3 2023860 ETEMPTÏE 3 100 ml du milieu décrit à l'exemple 1 sont ensemencés avec Schizosaccharomyces pombe et cultivés durant 48 heures à 27°C. A ce milieu on ajoute 2g d'un mélange d'ester myristique de dl-menthol st de ses isomères (dl-myristates de menthyle ôl>); 5 d 'isomenthyle 22%; de néomenthyle 17%) et l'on secoua le tout durant Le heures. Le liquide de réaction est entraîné à la vapeur et le 1-menthol récupéré sous forme de distillât, On obtient ainsi C,35g de menthol gauche. f N*0 Rendement 17,5% / = -42e {c=5, éthanol) D JÎLX fJ4PLE 4 10 Dans une cuve à fermentation d'une capacité de 30 litres on met 20 litres du milieu .décrit à l'exemple 1, on stérilise, et l'on ajoute au milieu environ 10% d'une culture d'Hansenula anomala. Le tout est alors cultivé pendant 24 heures à 27°C sous agitation (200 tours/minute) et aération (7,5 litres/minute); puis 15 l'on ajoute 500g d'un mélange d'e3ter caprolque et de ses isomères (dl-caproates de menthyle 61%; d'isomenthyle 22%; de néomenthyle 17%, le tout étant cultivé pendant 72 heures sous agitation et aération. Ensuite on cesse d'agiter et d'aérer, et l'huile qui surnage sur le mélange de réaction est prélevée, ai 3-20 soute dans 1,5 litre de n-hexane et mélangée sous agitation à 1,5 litre d'une solution aqueuse de méthanol à 65%; on laisse alors reposer le mélange et l'on décante la couche aqueuse . Àu méthanol aqueux on ajoute 200 ml d'hexane, on mélange, on laissa le tout reposer, et l'on sépare la couche de méthanol aqueux, on 25 en chasse le méthanol par distillation et les cristaux bruts de 1-menthol que l'on obtient sont recristallisés dans le nitro-méthane pour donner 50g de menthol gauche. f Y20 rendement : 10) = -45°. D EXEMPLE 5 Dans un bac à fermentation d'une capacité de 30 litres, 30 on met 20 litres de moût et 1kg de glucose, on stérilise, on ensemence avec environ 5% d'une culture de 24 heures de Rhodotorula mucilaginosa, et l'on cultive le tout pendant 30 heures.On ajoute alors 1,2 kg du mélange d'ester acétique de dl-menthol et de ses 6939148 9 ? 2023860 isomères décrit à l'exemple 1, et l'on poursuit la culture pendant encore 40 heures. Le produit de réaction qui surnage sur le mélange de réaction est repris et traité comme à l'exemple 4 pour donner 270g de 1-menthol. 20 5 Rendement: 22,5ù/o[c^J = -49,5° D EXEMPLE 6 Dans un grand ballon, on met 1 Litre du milieu de l'exemple 5, on stérilise et l'on ensemence avec 5% d'une culture de Rhodotorula minuta, puis le tout est cultivé durant 48 heures à 27°C. On ajoute alors au milieu 100g d'-ir. mélange d'ester acé-10 tique de dl-menthol et de ses isomères (dl-acotates de menthyle 25%; d'isomenthyle 23%; de néomenthyle 14fS ; at de néoisomenthyle 38/fe) et l'on passe le tout à l'agitateur à secousses pendant 67 h. Le produit de la réaction est alors repris et chromatographié sur colonne d'alumine, afin d'isoler le 1-menthol. On obtient ainsi 15 9,7g de menthol gauche. 20 Rendement: 9 »7% = -50° ( c=5, éthanol ) D EXEMPLE 7 20 De la façon décrite à l'exemple 5, on procède à une culture de Rhodotorula nrucilaginosa pendant 30 heures, puis on en centrifuge 100 ml. Les cellules obtenues sont dispersées dans 20 ail d'une solution tamponnée à 0,1 Mde phosphate (pH 7),broyées aux ultrasons sous refroidissement, puis centrifugées à grande 25 vitesse. X 10ml du liquide surnageant on ajoute 10 ml d'une émulsicn du mélange d'ester acétique de dl-menthol et de ses isomères décrit, à l'exemple 1, puis l'on secoue le tout pendant 3 heures à 30°C, et l'on extrait à l'éther, L'analyse par chromatographié gaseu22 donne: 14% de menthol gauche et 0c/a de 1-iso-30 menthol., !*i A rcMPLE Ô Par la méthode décrite à l'exemple ;!, on fait une culture de Rhodotorula mucilaginosa durant 30 heures, puis on centrifuge un litre de cette culture. Les cellules obtenues sont dispersées dans 500 ml d'une solution tamponnée à 0,1 M de phos-35 phate ipH 7i, broyées aux ultrasons sous refroidissement, et centrifugée.-; X. grande vitesse. Au liquide surn.;.--'.ant on a ioute 6939148 1Q 2023860 du nvlfn.te d 'araoniua, nuis le précipité estera 3ique f orsi>$ à 40-Û0% cie saturation est recueilli et séché sous nr°$>ion réduits (rendement: 4,7g). Dans 100 ml d'une solution tamponnée à 0.2 M de phosphate on dissout 0,5 de la préparation estérasique obtenue, on l-i av; Intient A 30° puis on y ajoute 50 ml d'un >3 -Semi s ion du mé~ Lan:- " i-?r -cétique de dl-menthol et de s es isonères décrit à 1 ' 1, -it l'or, agita lentement le tout pendant 10 heures. La .Tiôl'Ku: > le réaction est alors extrait à 1 'éther et chr^oato--y.-L > ■■■ •• n'.o'in" -J '.alumine de fa7on à do^nr- ig d-; :-..ntho.T 2° "■ >.rd-?.uîS!'T.t *. 10% f®v / 5=1 — 4Q ,?0 [ D EXEMPLE 9 r„::r•* .m bocal à fermentation d'un? capacité d? 5 lieras. ■'ri mat ? Vitrer d'un milieu contenant 5% de farine de 3 o j*, 2^ da glasos?,. l'\ i'? sulfata d'ammonium, 1% de phosphate mor.opotassicma et 1';, -, ulfata de magnésium, on stérilise, puis on ensoaence &?* \2° H t : è.fyvlchj « -49 5 2° (c=5« éthanol) D CTiarPT.^ 10 Dan3 un ballon d'une capacité de SGCaii, on ast 100ml du : ilieu décrit à l'exemple 9> on stérilise et l'on eisecience -à l'aide d 'uns cul-cure de TQrulopcis datilla déjà faite sur 30 a., at Von dacc-ua ^out pendant 43 haure3 à 278C. Cn ajoute alors à : i Ti'.lii^i 10g d'acétate de dl-menthyle, et l'on secoue la tout encore pendant 96 heures. Le mélange de réaction est extrait à l'étner après addition de 10g de sulfate :1a 30ude, on évapore 1 ' extrait e:: l'on analysa le résidu obtenu par chromatographié gas 70 ■yC'J : 16% (cÀ ) ' C 1= ' ■ .->1 ] 6939148 ii 2023860 REVENDICATIONS 1. Méthode biochimique pour isoler le 1-menthol, consistant à hydrolyser sélectivement le seul ester organique carboxyiique de dl-menthol ainsi que les esters isomères qui en contiennent, l'acide servant à former ledit ester étant l'acide 5 formique eu un acide gras de formule générale RGOCH, dans lequel R est un groupe alkyle ou alkényle ayant 1 à 21 atomes de carbone, cette hydrolyse étant réalisée par une enzyme: 1'hydrolase d'ester carboxyiique déjà formée par l'action de microorganismes du type: Candida Saccharomyces, Hansenula, Rhodotorula, Turolopcis, Schizo- 10 saccharomyces, Pichia, Sporobolomyces, Debaryomyces, Nadsonia, Trichosponcn, Brettanomyces, ou Cryptococcus ; et à séparer le 1-menthol optiquement actif du mélange de réaction enzymatique. 2. Procédé selon 1, dans lequel ledit acide organique carboxyiique e st un acide actif. 15 3• Procédé selon 1, dans lequel ladite hydrolyse est conduite à une température' comprise entre 25 et 45°C environ. 4. Procédé selon 1, dans lequel la quantité d'enzyme mise en oeuvre varie de 0,1 à 0,5/& environ, en poids, du mélange de réaction enzymatique. 20 5. Procédé selon 1, dans lequel la quantité d'ester organique carboxyiique est comprise entre 2 et lOyi environ, en poids, du mélange de réaction. 6. Procédé selon 1, dans lequel ladite enzyme est utilisée sous forme de cellules de microorganismesen croissance 25 active des espèces définies ci-dessus. 7. Procédé selon 1, dans lequel ladite enzyme est utilisée sous forme d'un extrait sans cellules, obtenu à partir desdits microorganismes.