U 7 *j+J i « x. 2020661 1 La présente invention concerne un procédé perfectionné ds ô'çswgraef Consistait à licy les enzymes à des supports minéraux en présence de leurs substrats, à la suite de quoi les enzymes deviennent ift&olubili.-5 sés, ainsi que le produit obtenu par oe procédé. On considère en général qu'un enzyme est un catalyseur biologique oapable d*amorcer, d'activer et de régler une réaction chimique sawi être consommé dans le procédé ou être incorporé dans le produit obtenu, 1,©$ enzymes aojit des 10 substances synthétisées par des plantes, des animaux, certains virus et micro^rgaj^smee. ïous les enzymes que l'on a réussi à ifQlœç ^upqu'à pjréeesat s® sont révélés être des protéines, c'^st-à^dire dts polymères peptidiques d'amino-ad&es, $n enzyme peut ccnt^nir des groupes p^sthétiques Î5 tel» gu© 1© flav^j^aâénin© dinueléo-ftlde, la porphyrins, le diphoepiiopya^àiRQ'^^léfl^df, etc.. La plupart des enaymee soat d«s ©acsMîBolëoules dont le poids moléculaire est, 9» général, mpÇrZefscç h 6000, 3&#. ^écfe^eeit^ des mz$m& ©t 3.e«Bf apt4%$© h 20 catalyses? 4*9 d© substrat# à d© fa^blef ç^ctntr©*- tioas pré^eatent un intérêt particulier pour les analyses chimiques. On utilise dé-jà depîd-B quelque tes®)? des réaction© catalysées par des enzymes pour effectuer des déterminations qualitative© et qu©n:fei.t.ativ©s de substrat©, d'activants, 25 d'iasj^îteî^s ©$ aussi d^g ©nssym©© «SHwafc8#&. #i%sg.u.,-à usa© époque récente, le^ ijaconv&iients découlant de l'utilisation des enzymes ©at. sérieusement limité leur utilité. L*obstacle à l'utilisation des enzymes a été leur instabilité cas? les enzymes soat ^nsifeles à toutes les conditions qui noxmale-30 ment d&iaturent les protéines, par exemple une température élevée, l'influence de la concentration, les changement du pH, l'attaque p©,r les aiiorobes et 1 'auto-hydrolyse. D© plus, 1© prix d© quantités importantes d'enzymes rend difficile leur utilisation pour des analyses chimiques de routine. 35 pas tentatives ont déjà été faites pour préparer des enzymes sous une ferme immobilisée, sans perte d'activité, de sorte qu'on aurait pu utiliser un échantillon continuellement pendant de nombreuses heures, les enzymes immobilisés effectuent avec une meilleure précision toutes les opérations 69 35112 2020661 des enzymes solubles ordinaires; en d'autres termes, on peut les utiliser pour déterminer la concentration d'un substrat, d'un inhibiteur d1 enzymes ou d'un activant d'enzymes. Pour préparer ces enzymes immobilisés, on emprisonnait par des 5 moyens physiques les enzymes dans un gel d'amidon, un gel de polyacrylamide, de l'agar-agar, etc.. Pour insolubiliser les enzymes, on les diazotait à des dérivés cellulosiques et à des perles de polyaminostyrène. On a également insolubilisé des enzymes sur des polypeptides polytyrosyliques et sur des 10 matrices de oollodion. Les principaux inconvénients découlant de l'utilisation de telles matières organiques sont î (a) ces matières organiques sont sujettes à l'attaque par les micro» hes par suite de la présence d'atomes de carbone dans la chaîne du polymère de sorte que le véhicule est dissocié et 15 que l'enzyme est solubilisé; (b) la diffusion des supports devient fréquemment le facteur qui limite la vitesse de la réaction de sorte que l'activité apparente des enzymes est réduite; et (c) lors d'une utilisation dans des colonnes chromatographiques, le pH et le solvant choisi augmentent ou 20 diminuent le gonflement qui se répercute sur les débits du., substrat à travers la colonne. Dans la demande de brevet français n° 69 02432 du 4 Février- 1969 déposée par la Demanderesse pour "Stabilisation d'enzymes", on a décrit un procédé de préparation 25 d'enzymes stabilisés consistant à mettre en contact une solution aqueuse d'un enzyme contenant des groupes aminés disponibles avec un support minéral ayant une surface spécifique importante et contenant des groupes silanols réactifs, à une température égale ou inférieure à la température ambiante et 30 pendant une durée suffisante pour lier substantiellement l'enzyme, Par ce procédé, l'enzyme est supposé être directement couplé au support, a la fois par liaison hydrogène et par liaison aminé—silicate. Cependant, ce procédé est limité en : ce qu'une perte d'activité peut avoir lieu lorsqu'il se pro-35 duit une liaison sur les sites actifs de la molécule de l'ea-zyme. De façon tout-à-fait surprenante, la Demanderesse a maintenant découvert un procédé de liaison d'enzymes à des supports minéraux permettant d'éliminer ou de réduire nota- 69 35112 3 2020661 / bleaeni* la perte d*activité d© 1*enzyme* Ce p3*oe©Glé consiste à lier 1*enzyme an support en présence de son substrat, ce qui a apparemment pous* effet de bloquer les sites actifs de l'enzyme et d'éviter la réaetton desdits sites aveo le sup« 5 pdrt. Par os procédé perfectionné, on peut préparer des zyaes très stables. Go s enzymes stabilisés trouvent un vaste champ d'application dans les analyses chimiques et on peut également les utiliser pour la préparation de produits ehi« .(. miques, de produits ph&:emaceutiques, de denrées alimentaires jO et de détergents» Dans 1s présent mémoire, - les expressions "stabilisés", "insolubilités" sv 'ttimmobilisés" 9 quand on les applique aux enzymes, ont les significations suivantes s le tena© ' "stabilisé" indique une diminution de la pertô d1activité de 15 l'enzyme en fonction du temps et/ou de la température? le terme "insolubiliaé* indique que 1 ' enzyme est pratiquement insoluble dans!'eau, cette propriété étant du© au eouplaga de l'enzyme par des liaisons chimiques au support minéral f insoluble; et enfin 1© terne "immobilisé" signifi© qu© 20 l'enzyme est emprisonné dans un réseau polymère ©u dans membrane semi-permé able. Selon la présente invention, on a découvert un composite d'enzyme comprenant va support minéral ©ontenanl? â©a groupes oxyde et/ou hydrosyle disponibles^ un enzyme lié à 25 ce support, et un substrat de l:snzym9o De pluss la présente invention a pour ob;jet un procédé de préparation d'un compo* site d'enzyme insolubilisé, selon lequel on combine un support minéral ayant des groupes osqrd© et/ou hydrosyle disponibles avec un substrat de 1'enzyme et on fait réagir l'en*» 30 zyme avec 1? ensemble support-substrat dans un milieu aqueus^ La présence du substrat sert à bloquer le site actif de l'enzyme pendant la liaison pour en empêcher la réaction ave a le support. Les enzymes qui peuvent être stabilisés par le 35 procédé selon l'invention englobent une grande variété d'en» zymes que l'on peut classer dans trois catégories principales! les enzymes hydrolytique s, les enzymes redox et les enzyme a transferases, Les enzymes de la première catégorie, c1^st-à-dire les enzymes hydrolytique s comprennent les enzymes t BAD ORIGINAL 69 35112 ZUZUOUI 4 protéolytiques qui hydrolysent les protéines, par exemple la papaïne, la ficine, la pepsine, la trypsine, la chymo-trypsine, la broméline, la kératinase, les oarbohydrases qui hydrolysent les hydrates de carbone, par exemple la 5 cellulase, l'amylase, la maltase, la pectinase, la chitinasef les esterases qui hydrolysent les esters, par exemple la lipase» la oholinesterase, la lécithinase, les phosphataseg alcalines et acides; les nucléases qui hydrolysent l'acide nucléique, par exemple la ribonucléase et la désosyribonu™ 10 cléase; et les amidases qui hydrolysent les aminés, par exemple l'arginase, 1 *asparsginase, la glutaminase et lsu-réase. Les enzymes de la seconde catégorie sont les essyaes redox qui catalysent les réactions d*oxydation ou de rédne-tion* Cette ostégorie comprend l'oaydase du glyeose, la 15 catalase, la peroxydase» la lipoxydase et la réductaee chromique. Enfin la troisième catégorie, celle des enzyme g transferase englobe les enzymes qui transfèrent des groupes d'une molécule à une autre. On citera dans cette catégorie, la transaminase glutamique-pyriwique» la transamissase gluta* 20 mique-oxalacétique» la transméthylase et la transphosphory-lase phosphopyruvique. Il convient de remarquer que l'on peut utiliser l'enzyme isolément ou en combinaison avec d'autres enzymes. Les supports sont des substances minérales conte-25 riant des groupes oxyde et/ou hydroxyje disponibles* Ces substances doivent être senaiblement insolubles dans l'eau et peuvent être des aoides faibles ou bien des bases faibles. On peut également les considérer, de par leur composition chimique, comme étant des oxydes métalliques sili-30 ceux ou non-siliceux. Parmi les matières siliceuses, 1© support préféré est un verre poreux qui peut être sous une forme particulaire ou sous forme d'une pièce unitaire, par exemple d'un disque de verre. Le verre offre l'avantage d'être dimensionnellement stable et de pouvoir subir un 35 nettoyage parfait pour le débarrasser des substances de contamination, par exemple par stérilisation. Un verre poreux qui constitue un support efficace, et qui est facilement disponible, est vendu par Corning G-lass Works sous 1© numéro de catalogue 7930 des verres poreux. On peut préparer 69 35112 7020661 un tel verre, poreux avec des dimensions de pore variées, selon notamment les enseignements du brevet des E.U.A. n° 2 106 764# du "brevet français n° 1 534 990, ou de la demande de brevet des E.U»A. n° 507 092 déposée au nom de 5 W. Haller. D'autres supports minéraux siliceux que l'on peut également utiliser, sont la silice colloïdale (produit vendu sous la marque déposée CAL-Q-SIL), la wollastonite (silicate de calcium naturel), le gel de silice séché et la bentonite» Parmi les oxydes métalliques non-siliceuxg on citera 11alu-10 mine et 11 hydroxyapatite. Ces supports minéraux représentatifs peuvent être classés de la façon indiquée dans le ta» bleau ci-dessous. 15 20 Siliceux Oxydes métalliques non*- . , siliceux Amorphes Cristallins MeO acide MeO basique Verre Bentonite Al^O^ Hydroxy Gel de Wollastonite Apatite silice r Silice colloïdale Pour former un enzyme hautement insolubilisé et pour empêcher la perte de l'activité enzymatique, un substrat de l'enzyme en question doit être présent pendant le 25 stade de liaison. l'importance de ce facteur peut être mis© en lumière à propos de la liaison de la trypsine dans la*» quelle en formant un complexe enzyme-substrat avant la liaison avec le support, les groupes amino dans les sites actifs, c'est-à-dire l'azote dans le résidu d'histidine, 30 sont occupés par le substrat. Le masquage de ces groupes empêche la réaction entre les sites actifs de l'enzyme et le support et les sites demeurent disponibles pour des réactions enzymatiques ultérieures. D'autre part, le substrat se comporte comme un amortisseur pour empêcher la déforma*. 35 tion de la molécule d1 enzyme et, également, comme un agent complexant renforçant les liaisons internes de l'enzyme. Il est essentiel que le substrat soit spécialement étudié en fonction de l'enzyme spécifique. La proportion de substrat présent, pendant la liaison doit être suffisante pour protéger l'enzyme pendant la liaison. En général, et de façon 69 35112 ZUZUOOI 10 très approximative, la quantité pondérale de l'enzyme doit être égale à celle du substrat. Les substrat peuvent être utilisés isolément ou en combinaison, pour autant qu'ils sont compatibles» Cependant, si l'on doit lier deux ou plusieurs types différents d'enzymes, on obtient les meilleurs résultats en présence d'un substrat pour ohaque type d1 en>-zyme. Des substrats pour des enzymes particuliers sont énu« mères dans le tableau ci-dessous» TABLEAU D*ENZYMES ET SUBSTRATS DE PROTECTION B3C01MMDBS ENZYME SUBSTRAT 1. Enzyme protéolytique î 15 20 as urypsine, cnymo'crxpsme, broméline, protéase alcaline 2, Garbohydrases : (a) cellulase (b) amylase (c) maltase (d) pectinase (e) chitinase Estérases : (a) lipases jbj cholinesterase 30 lécithinase 4» Nucléases ï (a) ribonucléase (b) désoxyribonucléase 5* Amidases s 35 fa) arginase (b) asparaginase (c) uréase 6. Enzymes redox : (a) glucose oxydase '("&) peroxydase 7. Transférases s (a) transaminase gluta-mique—pyruviqu© (b) transphosphorylase pho sphopyruvique giODine, aioumine, e>;c, cellulose, carboxymétîiyl- cellulose amidon maltose pectine chitosane • chitine, nitrar» te de chitine graisses, huiles, triglycérides acétylcholine lécithine acide ribonucléiquo acide désoxyribonucléiqu© arginine asparagine urée glucose, dextrose peroxyde acide glutamique acide phosphopyruvique 69 35112 ZUZVÙÙI La figure unique du dessin annexé est ujI schéma général du nouveau procédé, qui ne constitue pas une définition mais une illustration de l'invention, Ci-après, on étudiera ce procédé en détail» 5 On va d'abord étudier le mode de réalisation qui est appelé "procédé I" sur le dessin, dans lequel le support peut être constitué de corps conformés ou d'une matière Particulaire. On combina d'abord le support avec le substrat., habituellement en suspension ou en solution aqueuse0 la tem-10 pérature n'est pas critique, mais il est préférable d'utiliser la température ambiante ou une température légèrement plus élevée. La durée dépend de la nature du substrat et de la température. D'une façon générales, l'utilisation de substrats ayant un faible poids moléculaire et de températures 15 plus élevées permet de rscluiro la durée du stade de combinaison, tandis que celle de substrats présentant un poids moléculaire plus élevé et de températures plus basses conduit à des durées de combinaison plus longues, LJexpression "combinaison" englobe d'une façon générale la saturation^ 20 le revêtement, la réaction, la formation d'un complexe, le mélange et la formation d'une dispersion. Après avoir combiné le support et le substrat9 on peut éliminer l'excès de substrat. Au stade suivant, on fait réagir 1!enzyme en pré» 25 sence de son substrat avec le support* La réaction peut être considérée en réalité comme comportant deux stades : initialement l'enzyme réagit avec 1© substrat et ensuit© on laisse réagir avec le support les résidus disponibles d© l'enzyme qui n'ont pas réagi avec le substrat. Le plus sou-30 vent on introduit l'enzyme en solution aqueuse dans la combinaison support-substrat0 La température de la réaction doit être très basse, de préférence d'environ 5°C ou au-dessous, Le pH auquel on exécute la réaction est également un facteur important et il est recommandé que le pH soit 35 p3-us élevé ou au contraire plus faible que le pE optimal de la réaction entre l'enzyme et le substrat» On doit permettre à la réaction de se poursuivre pendant une durée suffisante (habituellement au moins 20 minutes) pour lier l'enzyme au support. On peut conserver le produit, c'est-à-dire 69 35112 2020661 8 1*enzyme lié en milieu aqueux» et l'utiliser comme désiré. Cependant, pour la plupart des applications, on élimine l'excès d'enzyme par filtration ou centrifugation et par lavage dans de l'eau distillée. Finalement, on sèche 5 l'enzyme lié par des techniques usuelles* par exemple à l'air ou sous -vide. On peut également conserver 1*enzyme lié et séché en vue d'une utilisation ultérieure. Dans la variante dénommée ''procédé II" sur le dessin, le support est sous forme d'une matière particulaire 10 fine, dont la granulométrie maximum ne dépasse pasj de préférence j 150 microns. On commence par combiner le support et on le mélange avec le substrat en suspension aqueuse dp sorte que le support (portant une charge superficielle) est dispersé dans la suspension; les conditions de température 15 et de durée sont, les mêmes que dans le procédé I. On fait ensuite réagir 1* enzyme avec la combinaison support-substrat pendant une très brève durée, habituellement inférieur» - à 5 minutes, et à basse température. Pans ce cas encore, il se produit un© réaction initiale entre 1* enzyme et son subs-20 trat* cette réaction étant s&ivie d'une réaction entre l'enzyme et le support. C'est à ce moment que 1 'enzyme et le support sont co-»précipités. par l'incorporation dîun a*• gent' d© précipitation* Cette co-précipitation peut être réalisée par déshydratation ou par une neutralisation de la 25 charge. Si l'on opte pour la déshydratation, le rôlç de l'agent de précipitation est rempli par un solvant oiganiquo tel que l'acétone ou un alcool. La neutralisation de la charge est obtenue par l'incorporation d'un sel en solution, par exemple de sulfate d'ammonium ou de sulfate de sodium, 30 pour neutraliser la charge sur les molécules de protéine et sur les particules du support. Pendant la co-»précipitation, la température doit-être généralement inférieure à la température ambiante» Finalement, on élimine 1 ' agent de précipitation par des techniques usuelles telles que la filtra-55 tionj la centrifugation, le lavage et le séchage à l*air. On obtient, à titre de produit un composite .enzymatique stabilisé et séché qui est initialement insoluble dans l'eau. Les exemples suivantsi dans lesquels les parties et les pourcentages sont en poids sauf stipulation contraire, 69 35112 2020661 ' • " 9 - servent à illustrer 1* invention sans aucunement eri limiter la portée. Exemple 1 Une certaine quantité de verre pulvérulent poreux 5 contenant 96# de silice (dimension des pores 595 1» granulométrie 177 à 105 microns) est lavée dans du 0,2 N aux ultra-sons# de façon continue, pendant au moins 30 minutes„ On lave le verre à plusieurs reprises avec de l'eau.distillée et on le chauffe à 625°C pendant 30 minutes sous un cou-10 rant de 0^. On refroidit ensuite le verre dens «ne atmosphère de 0g. On prépare une solution de substrat à 0f2$ de gélatine par addition de 100 ml d'eau distillée à 200 mg ûw éélaiiae (produis gi'anuJLaire confoxme aux spécifications do la pharmacopée américaine, Bloora 270) et par dissolution 15 avec chauffage et traitement aux ultras-sons. A 500 mg de verre poreux, on ajoute 5 rai do la solution gélatineuse et on agite à 37°C pendant 90 minutes; On sépare la solution gélatineuse résiduelle (3,6 ml) du verre par décantation. 20 On refroidit l'échantillon de verre protégé par la gélatine jusqu'à 5°0 dans un bain d'eajx et ensuite on ajoute 5 al d'une solution aqueuse contenant 1,39 mg/ml de protéase alcaline provenant de B. Subtilis (vendue sous la dénommi-nation "Alcalase1'). On laisse l'enzyme réagir avec le verre 25 à 5°0 pendant 17,5 heures, On élimine la solution enzymati-que par filtration et on lave minutieusement les particules de verre avec de l'eau, après quoi on sèche à l'air, Qa prépare également un éçhantillon-»témoin en ajoutant 500 mg du verre poreux à 1,4 ml d'eau distillée 30 00 qui est approximativement le volume liquide restant dans l'échantillon protégé par la gélatine après décantation. Par la suite* le processus de liaison est semblable à celui de l'échantillon dans lequel l'enzyme est lié en présence du substrat. 35 On analyse les solutions des enzymes et les li queurs de lavage pour chaque échantillon pour déterminer la proportion des protéines noh-liées à une longueur d'onde de 280 millimicrons. Les poids du verre qui a réagi et les quantités d'enzyme lié (par différence à 280 millimicrons) 69 35112 10 2020661 10 15 sont les solvants : Echantillon Echantillon séché protégé par le substrat Enzyme protéi-nlque lié 1,023 g 3,36 mg témoin 1,020 g 2,78 mg On titre ensuite l'enzyme lié comme suit : À. Hémoglobine foson (pH Echantillon ' mg activité enzymatique/ . g échantillon protégé par le substrat témoin 1,32 0,92 Enzyme ,.Wft ■ 2,31 2,73 Enzyme actif 7 2# 30# Enzyme JWffi. 20 25 30 Bi fraoco^l (pH-10*, 15 minutes* 57° C) protégé par le substrat 1,32 5756 témoin 0,.92 34# Ces résultats montrent clairement que le système protégé par le substrat possède une activité notablement plus élevée que le témoin et que, par conséquent, le système protégé par le substrat permet de réduire la perte d'ao-» tivité enzymatique pendant la liaison, de 1*enzyme an support minéral. Exemple 2 On procède comme dans 1» exemple 1 pour lier 200 mg de protéase alcaline (enzyme) à 600 mg de particules de silice colloïdale amorphe ("GAS-O-Slli'1) en présence et en l'absence de 200 mg d'un substrat gélatineux de protection. On titre les échantillons liés avec un substrat d'hémoglobine à pH 9,7 et avec des incubations de 10 minutes et de 45 minutes à 55°G. Les résultats sont les suivants s 55 Echantillon protégé par le substrat témoin Durée d1incubation 10 minutes 45 minutes 10 minutes 45 minutes mg activité enzy- Enzyme matique/g échantil» aotif Ion ' - - . B 38,8 34,0# 73,3 €4,3# 4,8 1,1# 9,2 2,2# 69 35112. 1i 2020661 La récupération plus importante de l'enzyme lié par rapport à "l'enzyme libre, avec la plus longue durée d*incubation (45 minutes), est due à une libération progressive de l'enzyme dans la solution aveo le temps tandis que çj l'enzyme en solution libre est détruit par dénaturation. Exemple 5 En suivant le procédé de l'exemple f, on ajoute 0,6 g de bentonite qui a été chauffée à 500°G dans Og pendant 90 minutes, à 10 ml d'une solution de gélatine à 2S$r"~ ^0 Après un mélange intime du support et du substrat, on ajoute à température ambiente 10 ml d'une solution de protéase alcaline à 2fo (200 mg). On refroidit le mélange du support* du substrat et de l'enzyme à 5°C et on laisse réagir pendant 16 heures. On filtre le produit sur un entonnoir Bttchnér, 15 on le lave avec de l'eau distillée et on le sèche à l'air. On détermine la protéine enzyme liée à la bentonite à partir de la. protéine résiduelle (par voie spectrophotométrique à 280 mil 1.irriterons) dans la 2Lqueur de lavage et dans le fjUU-trat. Pour préparer un échantillon-témoin, Le poids de la bentonite qui a réagi et la quan-25 tité d'enzyme lié sont les suivants : Echantillon Poids mg d'enzyme mg enzyme/ protéinique g échantillon lié 30 ■protégé par le substrat 0,6870 g 86 125 témoin 1*1244 g 146 130 On titre ensuite l'enzyme lié par l'hémoglobine Anson (pH 9,75, 10 minutes, 37°C), Echantillon mg activité enzymatique/ Enzyme actif 35 i i g échantillon J _ protégé par le substrat 40,0 32fo témoin 1,2 0,9$ 69 35112 12 2020661 Exemple 4 En procédant comme à l'exemple 3, on ajoute 0,6 g d'alumine activée broyée à 10 ml d'une solution de gélatine à 2Après mélange intime du ©apport et du substrat, on 5 ajoute 10 ml d'une solution à 2$ de protéase alcaline à température ambiante. On refroidit le mélange à 5°C et on laisse réagir pendant 16 heures. On prépare un échantillon- témoin en ajoutant 10 ml d'une solution à 2$ de protéase alcaline à 1,0 g d'alumine, 10 Les poids d'alumine ayant réagi et la quantité d*©azyme lié sont les suivants ï Echantillon Poids mg d'enzyme mg enzyme/g é» protéinique chantillon - - Uâ - «c protégé par le substrat 0,6026 g 54 90 témoin 1,0435 g 88 84 On titre ensuite l'enzyme lié par l'hémoglobine Anson (pH 9,75, 10 minutes, 37°0) 20 Echantillon mg aotivité enzymatique/ enzyme actif - g échantillon ^ protégé par le substrat 7,0 7,9^ 25 témoin 1*2 1,4# Par le même procédé et avec les mêmes proportions de réactifs que dans l'exemple 3, on prépare un échantillon protégé par un substrat et un échantillon-témoin en utilisant à titre de support, de l'hydroxyapatite ^a^COH^PO^)^ 50 qualité Réactif de BakerT» Le poids de l'hydroxyapatite qui a réagi et la quantité d'enzyme lié sont les suivants ? Echantillon Poids mg d'enzyme mg ©azyme/ , protéinique l^ié, g é.chantiHoi} 35 protégé par le substrat 0,6455 58 90 témoin 1,008 99 98 On titre ensuite 1? enzyme lié par 1? hémoglobine Anson (pH 9*75, 10 minutes, 37°G)t bV 351 ! 2 ZU4U00 i 13 Echantillon Eg activité enzymatique/ Enzyme actif - g échantillon _ protégé par le snb strat 24 , 0 26,7# témoin 4,2 4,3# Exemple 6 En suivant le procédé de l'exemple 1s on nettoie et on prépare pour la liaison line certaine quantité de verre pulvérulent poreux contenant 96# de silice (dimension des 10 pores 79Q+50A, granulométrie 149 microns). On prépare une solution de 3# de dextrose en dissolvant 3 g de dextrose monohydraté dans 100 roi d'eau. A 4,0 g de verre poreux dans un tube à essais, on ajoute 8,0 ml de la solution de dextrose et on place le tube dans un bain d'eau à 5°C, Après avoir 15. refroidi l'échantillon, on ajoute 8,0 ml d1oxydase du glucose préalablement refroidie (45,5 unités/mg, 5 mg/ml) et on laisse réagir le mélange pendant 21,5 heures à5°C. On sépare le verre par filtration et on le lave avec de l'eau» On analyse à 280 milllmicrons la solution d1 enzyme et les 20 liqueurs de lavage pour déterminer la protéine non-liée. Par différence, on détermine que la quantité d'enzyme lié au verre est de 5,5 mg d'enzyme par gramme d8échantillon. On prépare un échantillon témoin de la même façon que l'échantillon à substrat protecteur sauf qu8on remplace 25 la solution de dextrose par 8,C ml d'eau distillée» la quantité d'enzyme lié au verre est de 4,6 mg par gramme de l'échantillon. On titre les échantillon de verre lié par incubation à température ambiante dans un tampon phosphaté 30 0,01 M, pH 7,0, en utilisant 22,4 ^-g do fi-D-glucose par ml de tampon. Pour déterminer le Hg0^ produit, on prélève une aliquote de 2,5 ml du mélange de réaction et on ajoute 0,025 ml de o-dianisidine à 1# dans du méthanol, puis on ajoute 0,5 ml d'une solution de perexydase (0,04 mg/ml). 35 Une unité d'activité équivaut à une vitesse de production de 1 micromole de HgOg à l'heure à température ambiante. On détermine le HgOg produit par sa décomposition en présence de peroxydase et de o-dianisidine, qui augmente, lors de l'oxydation, la densité optique à 460 millimicrons. les résultats du titrage sont les suivants î 69 35112 A; Activité initiale Echantillon mg activité enzymatique/ Enzyme actif ' g échantillon protégé par le substrat 0,230 4,2/à "* témoin 0,190 2,4# B» Après 24 heures de llxiviatîoii à la températare saMsar'jc Echantillon mg activité enz^iatique/ Enzyme actif . g échantillon _____ ^ Tlîliwii |»|IT»IIIÎ Tl 1 »» ^ Il m Jf m*. Je—i» ii"a.i»ll Un vt»m»ni*i» i« n Un r.JCsa»=3 protégé par le 10 substrat 0,094 1,7# témoin 0P026 0, 57fî A 200 g de bentonitef on ajoute avec agitation ■J5 2,0 litres de solution de gélatine (70 g de gélatine ûisseï^ te dans 2 litres HgO à 80°C. On poursuit l'agitation tout en laissant la température descendre à 39°C» On introduit ensuite avec agitation 1,0 litre de solution de protêass alcaline à 5®0 (60 g de protéase alcaline dans 1,0 litee fie 20 HgO) et aussitôt après, on introduit 9»0 litres d1acetous. La température tombe à 19°C. Après avoir agité le mélange et l'avoir laissé se déposer, on filtre et on lave à l'acétone. On obtient 297,5 g de filtrat séché. On titre le produit par les procédés suivants ï 25 A. Hémoglobine Anson (pH 9.75. 37°Q« 10 minutes) Echantillon mg enzyme/g échantillon Enzyme, actif protégé par le substrat 182 91# B, Azocoll dans solution détergente f55°0. 10 ml. ,5Q m 30 Azocoll) Echanti 1i on mg enzyme/g échantillon Enzyme actif protégé par le substrat 250 125# 0. Azocoll dans solution détergente (37°0. 25 mg Azocoll, 10 minutes) ^ Echantillon mg enzyme/g échantillon Enzyme actif protégé par le substrat 283 • 142# On remarquera que la technique de co-préoipitation actif est spécialement efficace. Le fait que l'enzymeyfeemble don-40 ner des valeurs d'activité de plus (te 100# peut s'expliquer 69 35112 15 2020661 par le fait que les échantillons liés avec un substrat de protection possèdent une stabilité thermique aoorUe à des températures plus élevées en comparaison de l'enzyme libre non-lié. 5 II va de soi que l'on peut apporter des modifica tions aux modes de misa en oeuvre qui ont été décrits,, sans sortir poux cela du cadre de cette invention. r 35112 zuzuoo i 16 iïËVEKDICAïIONS 1* Composite d'enzyme insolubllisé, caractérisé en oe qu'il comprend au moins un support minéral contenant des groupes hydroxyle ou oxyde disponibles, au moins un enzyme lié à oe support, et au moins un substrat lié à l'enzyme. 2» Composite selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est du verre poreux, du gel de silice, de la silice colloïdale, de la bentonite, de la wollastonite* de l'alumine ou de 1'hydroxyapatite. 3. Composite selon la revendication t ou 2, caractérisé en ce que 1'oneyme est une protéase telle qu'une protéase alcaline p. Subtilia; ou une enzyme redox telle qu'une oxydase de glucose. 4. Procédé de préparation d'un composite d'enzyme insolubilisé selon l'une quelconque dés revendications 1 à 3» caractérisé en ce qu'on fait réagir un support minéral contenant des groupes oxyde et/ou hydroxyle disponibles avec un enzyme en présence d'un substrat de celui-ci. 5. Procédé selon la revendication 4* caractérisé en ce qu'on fait réagir 1*enzyme aveo la combinaison du support et du substrat dans un milieu aqueux. 6« Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, en outre* on élimine ultérieurement l'excès d*enzyme et on sèche le produit résultant. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en oe que, ensuite, on coprécipite l'enzyme et le support par l'incorporation d'un agent de précipitation, et on élimine cet agent de précipitation. 8. Procédé selon la revendication 1ft caractérisé en ce que l'agent de précipitation est un liquide organique déshydratant, comme l'acétone, un alcool, ou un sel de neutralisation de la charge tel que le sulfate d * ammonium ou le sulfate de sodium.