i 2052959 La présente invention concerne de nouvelles tétracyclines. On connaît depuis un certain nombre d'années un groupe d'antibiotiques importants qui présente la structure de base suivante: ît(ch3)2 (1) OH 0 OH 0 0 Lé composé de "base (1),désoxy-6-déméthyl-6-tétracycline, est le 3 plus simple des composés tétracyclines qui conserve une activité biologique complète vis-à-vis des bactéries Gram-négatives et Gram-positives. L'étude de ce composé et des composés apparentés a conduit les chercheurs à penser que la relation stérique des divers grou-10 pes substituants sur le cycle de la tétracycline jouait tin rôle important pour assurer l'activité biologique. Les relations stéri-ques, telles quelles sont indiquées sur la formule structurale ci-dessus,placent le groupe hydro^cyle 12a,le groupe diméthylamino-4,1'hydrogène 4a et l'hydrogène 5a, tous du même côté du système 15 cyclique. (Il est bien entendu que la formule structurale précitée, ainsi que celles qui seront décrites plus loin, n'impliquent aucune connaissance de la configuration absolue de la forme biologi-quement active des tétracyclines mais qu'elle' indique. seulement la relation stérique relative des groupes substituants importants). 20 On a découvert, ce qui est tout à fait surprenant étant don né ce qui précède,-un nouveau groupe de tétracyclines biologique-ment actives,dans lesquelles l'hydrogène 5a, est en position anti-par rapport à l'hydrogène 4a, contrairement à la position syn considérée jusqu'ici comme essentielle dans les composés de la tétra-25 cycline biologiquement actifs. En fait, un certain nombre des nouvelles tétracyclines ainsi découvertes maintenant se sont révélées présenter un spectre d'activité biologique sensiblement différent de celui de leurs isomères stériques "naturels"« Les composés selon la présente invention peuvent être représentés par la formule : H .'S3 R" El (?.) BAD ^GINAL 21532 205295 dans laquelle R^ est de l'hydrogène ou -un groupe hydroxyle,?^ est de l'hydrogène ou un halogène,R^ est de l'hydrogène ou un groupe méthyle,R^ est un groupe diméthylamino ou benzamido et R^ est de l'hydrogène ou un groupe alcoyle de 1 à 4- atomes de carbone. Les 5 composés préférés sont ceux dans lesquels R^ est de l'hydrogène, R^ est Tin groupe diméthylamino et R^ est de -l'hydrogène.De préférence aussi , Rg est de l'hydrogène ou du chlore* Les composés selon la présente invention sont accessibles par condensation d'une azolactone ou d'une thiazolone de structure s 10 ' 15 20 (3) W 25avec un oxo-3—glutarasiate de méthyle approprié. Lo produit de condensation résultant est un composé tétracyclique qui peut être avantageusement traité pour éliminer les groupes protecteurs et donner ainsi les produits finaux désirés. La préparation de ces composés est donnée en détail dans les exemples ci-après, en réfé-3 Or o ne e aux schémas 5 à 18 annexés. ËSELIPLS 1 Préparation de l'azdactone. l.(a) estérification de (5)^ On a dissous 25 6 de (5) dans 300 ml de méthanol contenant 5% 35 en volume d'acide sulfurique concentré.On a porté la solution à refluât pendant 2 heures puis on l'a versée dans 800 ml d'eau glacée. On a filtré le précipité blanc,on l'a lavé à l'eau et cristallisé du méthanol. On a obtenu 23,5 S (rendement 89%)d'ester BAD ORIGINAL 70 21532 2052959 3 de méthyle cristallisé.L'identité du produit a été confirmée par une analyse élémentaire. 1. (b) cétalisation de l'ester méthylique en (6).s On a dissout 123g de l'ester préparé selon l'exemple la 5 dans 1500 ml de benzène par agitation et chauffage. Après addition de 0,5 g d'acide p-toluène suifonique et de 10ml d'éthylène glycol,on a porté la solution à reflux en Maintenant une agitation vigoureuse et on a séparé l'eau azéotropique. On a ajouté des portions aliquotes de 10 ml de glycol après 1, 3, 6 et 8 heures, lOjusqu'à addition d'un total de 50 ml. Après 20 heures de reflux, on a; refroidi la solution, on l'a diluée au chloroforme et lavée 4 fois à l'eau. On a séché la couche organique sur sulfate de sodium et on l'a évaporée. On a cristallisé l'huile résiduelle d'un petit volume d'éther et on a obtenu 123 g (rendement de 81 °/o) 15 h Cette préparation ainsi que les suivantes sont exposées dans la thèse de doctorat de Jeffrey Michael présentée à l'Université de Wisconsin. 20 1.(c)Réduction de (6) en alcool (7) On a préparé une solution d'hydrure d'aluminium et de lithium en portant à reflux pendant 10 heures 100g d'hydrure d'aluminium et de lithium dans 1500 ml d'éther anhydre.Après avoir laissé reposer pendant la nuit,on a siphoné le liquide surnageant 25clair et on l'a conservé dans une bouteille de verre à parois é-pàisses. On a ajouté goutte à goutte 250 ml--de cette solution (1,1 molaire environ) à une solution agitée de 114g de (6) dans 300 ml d'éther et 300 ni de benzène (distillés tous deux sur* hy-drure (LiAlH^) d'aluminium et de lithium). Après avoir agité pen-30dant 4 heures à la température anbiante ordinaire,on a détruit l'hydrure en excès à l'acétate d'éthyle, on a dilué la solution au chloroforme et on l'a agitée avec du chlorure d'ammonium aqueux. On a lavé la couche organique 3 fois à l'eau,on l'a sé-chée sur sulfate de sodium et évaporée à sec. On a recristallisé 351e résidu du méthanol de manière à obtenir 96 g (rendement de 93%) de (7). L'identité du produit était confirmée par infrarouge et analyse élémentaire. l.(d) méthanesuifonate de (7)« On a dissous 95g de l'alcool (7) dans 500 ml de pyridine 40et on a refroidi la solution à 0°C dans un bain de glace. On a BAD ORIGINAL 70 21532 , 2052959 ajouté 40 ml de chlorure de méthane sulfonyle à la solution agitée puis on l'a laissée revenir à la tenpérature ambiante ordinaire. Après 2 heures,on a versé le produit réactionnel dans l'eau glacée,on a filtré le produit,on l'a dissous dans l'acétate 5 d'éthyle et séché sur sulfate de sodium.On a cristallisé l'huile restant après évaporation de l'acétate d'éthyle,dans un grand volume d'éther et on a obtenu 113 g (rendement de 94%) de produit. L'identité du produit a été vérifié par analyse élémentaire. l.(e) Nitrile (S). 10 - • On a dissous 112 g du méthane sulfonate préparé selon l'exemple ld,dans 1500 ml de diméthyl suifoxyde contenant 75 g de cyanure de potassium. On a agité cette solution à 60°C pendant 3 heures,puis on l'a refroidie et versée dans 4 litres d'eau glacée. On a filtré le précipité,on l'a lavé à l'eau, dissous dans 15 le chloroforme et séché sur sulfate de sodium.O11 a cristallisé l'huile restant après évaporation du solvant,du méthanol et obtenu 89g (rendement de 97%) de nitrile cristallisé (8). L'identité du produit a été confirmée par les spectres et l'analyse élémentaire. l.(f) réduction au nickel do Raney, de (8) en aldéhyde (9)« 20 On a dissous 50g du nitrile (8) dans 400 ml de pyridine et d'une solution tampon composée de 200g de phosphate trisodique, 100 ml d'acide acétique glacial et 400 ml d'eau.On a chauffé le mélange clair à 55°0 et on y a ajouté 30 ml environ de niclcel de Raney . On a agité vigoureusement le mélange réactionnel pendant 25 3 heures puis on l'a refroidi,filtré et acidifié jusqu'à un pli égal à 1 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. On l'a ensuite extrait au chloroforme. On 'a lavé l'extrait trois fois à l'eau on l'a séché sur sulfate de sodium et évaporé. On a cristallisé le résidu de l'alcool méthylique et obtenu _>lg (rendement de 72%) 30d'aldéhyde (9). L'identité du produit a été confirmée par analyse spectrale. 1.(g)azolactone (10) A une solution de 15g de (9) cristallisé,dans 400 ml de tétrahydrofurane (distillé sur hydrure d'aluminium et de lithium), 35on a ajouté 10,5 g d'acide hippurique, 18,5 elL d'anhydride acétique et 11,5 g d'acétr.te de plomb (poudre anhydre).Après 2,5 heures de reflux avec agitation,on a refroidi la solution,on l'a diluée au chloroforme et lavée 5 fois à l'eau BAD ORIGINAL 70 21532 2052959 (53%) en azolactone (10), de point de fusion 154-160°C.L'identité du produit a été vérifiée par analyse sioectrale. EmgLS 2- Condensation de l'azclactone (10) avec le B-t-butyl-oxo-3-glutaramate de méthyle (11). 5 On a dissout? 5 g de (10) et 3 g de (il) dans 75 de tétra- hydrofurane et 25 El d'éther (tous deux distillés sur hydrure d1 aluminium et de lithium sous azote). Le récipient réactionnel a été au préalable séché et balayé à l'azote et était muni d'une entrée de gaz pour, réaliser dans le récipient une atmosphère cons-lOtante d'azote pendant toute la durée de la réaction. A la solution agitée à température ambiante, on a lentenent ajouté 1,20 g d'hydrure de sodium en dispersion dans l'huile minérale, -à-près 1 heure d'agitation,on a porté la solution à reflux à 70°C au bain d'huile et on l'a maintenue à cette température pendant 30 heures.Après ce 15temps, on a refroidi la solution,on l'a acidifiée à l'acide acétique,diluée au chloroforme,lavée 4 fois à lreau,séchée sur sulfate de sodium et évaporée jusqu'à obtenir une mousse marron. Ce résidu a été repris dans un petit volume de chloroforme et placé au sommet d'une colonne de chromatograpliie remplie d'en-20vi.ron 800 g de gel de silice lavé préalablement équilibré dans un récipient fermé avec 120 ml d'éluant. On a développé la colonne par addition au sommet,d'une petite quantité d'éluant,chloroforme-acétone (95:5)5de manière à maintenir une tête de 2 cm environ. Le robinet d'arrêt a été laissé OLivert pour permettre l'échappement 25de l'air déplacé du gel de silice. Dès que le solvant a commencé à couler de la colonne,on a recueilli des fractions,on a analysé leur teneur par chromatographie sur plaques en couches minces (gel de siliceîbenzène-acétate d'éthyle 4:1 plus 1% d'acide formi-que). On a obtenu un total de 4 g environ (rendement de 56%)de 30produit tétracyclique cristallisé,à partir de ces fractions par cristallisation de l'acétone. Les fractions 1 à 4 ont fourni 0;66g environ de l'isomère 12;les fractions 5 et S ont fourni 0,68 g environ de l'isomère 14 et les fractions 7 à 12 ont donné 2,7 g environ d'un mélange égal des isomères 13 et 15.Ces deux derniers 35isomères ont été ultérieurement séparés par cristallisation^ractionnée de 1'acétone.Les produits ont tous été caractérisés par leur point de fusion,comme indiqué ci-dessous : isomère 12 : point de fusion de 228-232°C; isomère 13 : point de fusion de 240-244°C; 40 isomère 14:point de fusion de 214-222°C; BAD ORIGINAL 21532 20529;.. 6 isomère 15 : point de fusion de 230-237°C. L'identité de chaque isomère a été en outre confirmée par analyse spectrale. EXEMPLE 3- 5 On a dissous 1?0 g de (14) dans 40 ml de diméthylforma- mide ot 100 ml de tétrahydrofurano. On a ajouté 280 mg de phos-phite de triéthyle,puis 200 mg d'hydrure de sodium en dispersion dans l'huile minérale. On a fait barbotter de l'oxygène dans cette solution pendant 10 minutes et la coloration est passée de 10rrorange fluorescent au vert profond. Une goutte de cette solution placée dans du borate de soditun méthanolique, a montré que l'absorption dans la région visible du spectre avait disparu et avait été remplacée par un nouveau maximum à 350 millimicrons environ. (On a noté à maintes reprises,que la réaction avec l'oxygène ne I5se produisait pas immédiatement- pas de changement de coloration. Dans ces cas,il était nécessaire d'amorcer la réaction en ajoutant jusqu'à 10 gouttes d'eau).La solution oxygénée a ensuite été acidifiés à l'acide acétique,diluée au chloroforme et lavée 4 fois à l!eau» On l'a séchée sur sulfate de sodium et évaporée. Le jro-20duit (15) pouvait être cristallisé directement du néthanol. On a obtenu 0,740 g de (15) cristallisé pur.L'identité du produit a été confirmée par les analyses spectrales et élémentaires,, > 4— Transformation du benzamide (15) 25 en le composé diméthylamine (17) On a injecté 10 ml d'éther (distillé sur hydrure d'aluminium et de lithium) dans un récipient à trois cols de 50 ml contenant une atmosphère d'azote et muni d'un bouchon à seringue. On a ensuite ajouté 0,820 ml d'éthérate de trifluorure de bore 30et 0,400 ml d1 épich-lorhydriF.'- . ,.puis on a agité vigoureusement la solution pendant la nuit. On a lavé le solide blanc (tétra-fluoborate de triéthyloxonium)avec de l'éther frais,à l'aide d'une seringue de 10 ml munie d'une longue aiguille. On a dissous le sel dans un petit volume de dichloronéthane sec et on l'a repré-35cipité par 10 ml d*éther.Après avoir lavé -une fois encore à l'éther,on a dissouiï le sel dans 10 ml dé dichlorométhane et ôn a ajouté 430 mg de (15) en suspension dans 20 ml de dichlorométhane .Après 48 heures à la tenpératui-e ambiante ordinaire,on a ajouté un excès d'une solution à 5% de carbonate de potassium dans 401'eau et on a agité vigoureuaement pendant une demi-heure . On a BAD ORIGNAL 70 21532 2052959 7 séparé la couche organique,on l'a séchée et évaporée. On a ensuite dissous le résidu dans 16 ml de tétrahydroftira-ne,on a ajouté 8 ml d'1 acide chlorhydrique 0,1 1" et on a laissé reposer la solution à température ordinaire ambiante pendant 5 1 heure . Après dilution au chloroforme,on a lavé la solution réactionnelle à l'eau,on l'a séchée sur sulfate de sodium et évaporée jusqu'à obtenir une huile noire qu'on a triturée avec de l^éther chaud jusqu'à obtention de 265 mg du chlorhydrate d'aminé (16) sous forme d'une poudre amorphe légère. Cette poudre s'est lOrévélée être pure à plus de 90%,par chromatographie en couche mince .L'identité du produit a été confirmée par son spectre ultra-violet, son poids moléculaire et son spectre de masse. On a dissous 0,100 g de 1'aminé (16) dans 10 ml de chloroforme contenant 0,38 ial de diisopropyl éthylamine. On a ajouté 150,17 ml de sulfate de diméthyle et on a agité le mélange réactionnel à la température ordinaire,tout en suivant l'avancement de la réaction par chromatographie en couche mince. Après disparition (12 heures environ) tout le produit de départ et du produit de monoalcoylation,la solution chloroformique a été agitée 3 fois 20avec de l'acide chlorhydrique dilué ( pïï 1) et une fois avec de l'eau neutre, séchée sur sulfate de sodium et évaporée. On a cristallisé le résidu du mélange chloroformo-méthanol et obtenu 59 mg (rendement de 56%) du composé diméthylamino (17). Il a été caractérisé par son point de fusion de 247-251 (décomposition). 25L?identité dii produit a été confirmée par analyse spectrale élémentaire. EXEi.CPLE 5- Eliminati on des groupes protecteurs mét'ioxy et K-t-butyle. On a placé 0,040 g de diméthylamino (17) dans un petit tube 30à essai avec 3 ml d'acide bromhydrique à 48% et on a fait barbotter de l'azote dans l'acide pendant 5 minutes à température ordinaire* On a ensuite immergé le tube à essai dans un bain d'huile,qui avait été préalablement chauffé à 100°C et on a continué à faire barbotter de l'azote pendant le chauffage de la solution acide. 35Après 5 minutes de chauffage, tout le composé (17) s'était dissout. On a continué le chauffage pendant 15 minutes supplémentaires. La solution claire a été refroidie, diluée avec 10 ml d'eauneutralisée à un pH de 7 avec de la soude aqueuse à 20% et extraite deux fois avec des portions do 10 ml de n-butanol. On a rassemblé les 40extraits de butanol,on les a lavés à l'eau,et évaporés pour obtenir bad Original -'s /'J z 2052959 8 un solide sec marron,qu'on a dissouc dans m petit volume d'éthanol acide et chromatographié sur une courte colonne remplie d'une po^^-dre de polyamide sec non traité, en utilisant de l'éthanol absolu comme éluant. Les premières quelques fractions ont été cristal-5 lisées et on a obtenu 23 ng (rendement de 64 %) du composé (18). Le composé obtenu était caractérisé par un point de fusion de 248-250°C (décomposition) (dimorphe, £"=213-215 °C décomposition). L'identité du produit a été on outre confirmée par son analyse spectrale élémentaire. IQSXEiJPLE 6— Un échantillon du composé de formule î m N(ch3) OH HO 0 a été soumis à un test biologique pour déterminer son activité vis-à-vis de divers microorganismes. Les résultats ont été les suivants : microgrammes /ml 15staph. aureus 0,78 staph.aureus, souche résistant à la tétracycline 0,04 strept.pyogenes 0,78 20 S.. coli 12,5 P.multocida 0,19 Sal.typhosa 25 L'activité précitée a été considérée comme exceptionnellement favorable. Il est d'une signification particulière que la tétracy-25cline non naturelle présente une activité marquée vis-à-vis d'une souche de staph.aureus normalement résistant aux antibiotiques du type tétracycline. On a testé de la même manière l'activité biologique des autres tétracyclines épi C-5a.Par exemple le composé : BAD ORIGINAL 21532 2052959 NHCOCgHc It HO 0 OH 0 0 s'est montré aussi actif que le benzanide du composé biologi-quement actif dés 02£y-6-déméthyl-6~tétracyc line et a aussi présenté une activité vis-à-vis des souches bactériennes normalemot résistantes. Les tétracyclines épi 5a selon la présente invention représentent aussi des intermédiaires pour la préparation des autres composés tétracycliques. EXELPLE 7- On a dissout 1 g de : F(CH5)2 "H :-C(ch3^ OH C 0 OH 0 0 O lOdans 75 ml d'acide brorihydrique à 48%,On a chauffé la solution au bain de vapeur pondant 5 minutes,puis on a évaporé le solvant et.recristallisé le résidu cristallin de l'éthanol contenant quelques gouttes d'acide broiahydrique. Le rendement en produit: H(CH3)2.HBr OH | H *>» H ^ -OH | OH 0 OH o ci était de 95% « Point de fusion avec décomposition supérieur a 15240°C.L1identité a été confirmée par les analyses spectrales élémentaires. ÔAD ORIGINAL 70 21532 10 -EEVEHDICASIOITS- 2052959 l.Ig composé de formule : .NH-Rc dans laquelle: & R^ est l'hydrogène ou un groupe hydroxylo Rg est l'hydrogène ou un halogène, R^. est l'hydrogène ou un groupe méthyle E^ est un groupe diméthylamino ou benzamido et est l'hydrogène ou un groupe alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone. 2.Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que 10 R^ est de l'hydrogène. 3.Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R^ est do l'hydrogène et R^ est l'hydrogène ou le chlore. 4. Composé conforme à la revendication 1 caractérisé en ce que R^ est de l'hydrogène et R^ est le groupe diméthylamino. 15 5« Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R^ est de l'hydrogène et R^ est .l'hydrogène. 6. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R-^ est de l'hydrogène, R2 est l'hydrogène ou le chlore, R^ est un dinéthylardno et R^ est de l'hydrogène. 20 7, Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que E^ est de l'hydrogène, E2 est le chlore, R^ est de l'hydrogène, Rq_ est le groupe diméthylamino et R^ est do l'hydrogène. 8.Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R-j est de l'hydrogène, E2 est du chlor* est le groupe benzanido ot E^ est ds R^ est le groupe méthyle, 1'hydrogène. BAD ORIGINAL