FR 2492270 A2 19820423 FR 8105535 A 19810319 1 2492270 L'invention concerne un appareil d'élec- trodialyse et un procédé de fractionnement de mélanges de proté- ines. Le brevet principal concerne un procédé de fractionnement de mélanges de protéines liquides contenant des sels dissous, par utilisation d'un appareil d'élèctrodialyse muni d'une ou plusieurs paires de chambres de concentration et de dilution, ces chambres étant définies par des membranes alternées d'échanges d'anions et de cations, situées entre des électrodes terminales d'anode et de cathode, procédé caractérisé en ce qu'il consiste a faire passer le mélange de protéines dans les chambres de dilution, à appliquer un courant continu aux bornes des électrodes pour réduire la teneur en sel de ce mélange de protéines en faisant passer le sel des chambres de dilution aux chambres de concentration; à recueillir le mélange de protéines dessalé dans les chambres de dilution; à séparer et à extraire un ou plusieurs éléments de protéines du mélange de protéines dessalé, et à faire passer ensuite le mélange dessalé obtenu dans les chambres de concentration, grâce à quoi les sels pénétrant dans les chambres de concentration, à partir des chambres de dilution adjacentes, reconstituent exactement la teneur en sel initiale du mélange de protéines dessalé. La présente addition a pour but de perfectionner le brevet principal et concerne à cet effet un procédé de séparation de mélanges de protéines liquides en frac- tions de protéines de compositions intrinsèquement différentes, ce procédé mettant en oeuvre des techniques physiques ou chimi- ques bien connues. Les fluides biologiques tels que le plasma ou le sérum du sang, le petit- lait, l'urine etc... contiennent un mélange de plusieurs protéines. Par exemple le plasma sanguin contient de l'albumine (3,5 à 4,5 g/100 ml), du fibrinogène (0,20 à 0,45 g/100 ml), des '-globulines (0,4 à 1 g/100 ml) des "--globulines (0,8 à 1,8 g/!OOml) de l'immunoglobuline IgM (0,06 à 0,25 g/100 ml) etc... (Frank W. Putnam, The Trace Components of Plasma, An Overview). Les immunoglobulines (Ig) sont très importantes car elles entrent en jeu dans les mecanismes de protection et de défense contre les organismes infectieux. Les troubles cliniques caractérisés 4o 2 2492270 par des désiquilibres de ces systèmes de protéines, soit dans la faculté de reconnaitre des organismes d'invasion, soit dans la faculté de reconnaitre des protéines indigènes ou des acides polynucléiques, ont été à l'origine de la compréhension des aspects cliniques de l'immunologie. On sait, en effet, que des réactions imnâunologiques anormales produisent un large spectre de maladies. Parmi les maladies liées à des réactions immuno- logiques complexes, on peut par exemple citer la maladie du sérum, la glomérulonéphrite et la gravis myasténique. La plasmaphorèse est une technique utilisée pour réduire, freiner ou stopper le processus immunopathologique associé à la circulation d'un anticorps humoral et/ou de composés inimunolo- giques complexes du plasma. (Glassman, Rationale for Plasma- pheresis, "Plasma Thrapy" Volo 1 no 1, Page 13 (1979)). 1 5- É Un procédé connu consiste à effectuer la plasmaphorèse d'environ 4 litres de sang par centrifugation ou par filtrage de débits croisés, sur une période de 2 à 4 heures. Le plasma ponctionné sur le patient de cette manière est généralement jeté et remplacé par de l'albumine et, soit du sérum physi.logique, soit une solution de Ringer, pour obtenir l'équilibre entre les protéines, l'électrolyte et l'eau. Ce precédé cependant, est cher. Dans un autre procédé, le remplacement du plasma éliminé se fait en apportant du plasma frais ou congelé provenant d'une banque de plasma, Ce procédé, bien que moins cher, présente cependant des risques de transmis- sion de virus d'hépatite au patient. Le procédé selon l'invention (appelé immunophorèse) permet de pallier ces inconvénients en éliminant sélectivement les englobulines ou les mélanges complexes d'en- glohulines et d'antigènes produisant la maladie ou résultant de celle-ci, tout en reconstituant en même temps, la majeure partie de l'albumine, de l'électrolyte (sel) et de l'eau pour restituer ainsi au patient son propre plasma (pratiquement débarassé d'Ig ou de mélanges d'Ig et d'antigènes) contenant la bonne proportion de protéines, sans risques d'hépatites car il n'est pas nécessaire d'apporter de l'albumine supplémentaire ou du plasma du donneur. Le facteur antihémophile ou globuline antihémophile (Facteur VIII, AHF ou AEG) est l'un des éléments 1,0 constitutifs mis en oeuvre dans la coagulation du sang. Une 3 2492270 anomalie héréditaire de la coagulation du sang, l'hémophilie, entraîne des saignements très importants aux jointures, dans les muscles ou dans les organes internes, aux moindres blessures. Cette anomalie semble d e à une déficience en protéine AHF spécifique du plasma. Les individus souffrant de cette anomalie doivent être soignés spécialement aux moindres accidents. En cas d'interventions chirurgicales, on corrige l'anomalie de coagulation du sang par des transfusions de plasma frais ou par des injections de Facteur VIII concentré, cetB dernière solution étant préférable car elle évite l'hyperprotéinémie et iles troubles éventuels de fonctionnement des reins résultant de grands volumes de transfusions. Les procédés, selon l'art antérieur, de production d'AHF consistent par exemple à utiliser une banque de plasma, à former un cryoprécipité, à centrifuger le précipité constitué essentiellement d'un mélange d'AHF et de fibrinogène, à éliminer le fibrinogène, et à effectuer ensuite une lyophili- sation pour obtenir de 1'AHF concentré. Ces procédés présentent l'inconvénient d'être longs et fastidieux et risquent également de conduire à des transmissions d'hépatites par suite de l'uti- lisation d'une banque de plasma. De plus la présence de l'impureté constituée par le fibrinogène rend difficile la dissolution de l'AHF concentré. D'autre part, comme plusieurs jours peuvent s'écouler entre le prélèvement du plasma du donneur et l'utilisation de celui-ci, il en résulte une perte considérable d'activité de l'AiF. L'activité d'AiF unitaire se définit comme l'activité régnant dans 1 ml. de plasma humain normal moyen provenant d'une banque de plasma, ce plasma étant vieux de moins d'une heure (100 % d'activité AHF). Ainsi, au bout de six heures, la perte d'activité du plasma liquide extra corpo- rel, peut atteindre 80 È. Un procédé rapide de traitement de I'AHF éviterait cette perte d'activité. L'appareil et les procédés selon l'invention permettent de pallier ces inconvénients en mettant en oeuvre un processus de production en série, en temps réel. La récupération d'AHF peut alors être 4 à 5 fois supérieure à celle obtenue par les procédés actuels beaucoup plus longs. L'invention peut également s'adapter no à une banque de plasm& beaucoup plus petite alimentée par 4 2492270 exemple par deux ou trois donneurs d'une famille d'hémophiles ne présentant pas d'hépatite, lIAHF étant restitué sur le site au bout de très peu de temps, de manière à conserver une très grande activité sans risques d'hépatite. Les procédés de produc- tion en série, selon l'invention, peuvent également s'utiliser pour restituer du Facteur VIII prélevé sur les donneurs pendant la plasmaphorèse. Les techniques de base utilisées dans l'invention, c'est-à-dire la plasmaphorèse, la saturation de sel et la dialyse, se combinent suivant la nouvelle manière décrite ici, pour donner un effet de synergie, c'està-dire une augmentation tout à fait inattendue de l'efficacité de chaque étape et de la combinaison, de ces étapes, pour conduire à un rendement global particulièrement bien adapté à la plasmaphorése, in situ, de patients pour lesquels il faut éliminer les Ig ou leurs composés. Les procédés selon l'invention seront décrits sur des exemples préférés de réalisation, relatifs à l'utilisation des protéines du plasma, mais il est évident que ces procédés peuvent aussi bien s'appliquer à d'autres fluides biologiques ou à d'autres protéines sans sortir du cadre de l'invention. Ces procédés de séparation des protéines peuvent constituer des outils extrêmement efficaces entre les mains des chimistes des protéines. L'invention concerne la séparation de mélanges de protéines en fractions de compositions intrinsè- quement différentes, cette séparation étant obtenue par des procédés physiques et chimiques bien connus. Pour cela l'inven- tion utilise en combinaison la plasmaphorèse, la saturation saline des protéines, puis ensuite une dialyse destinée à extraire et/ou à reconstituer les éléments d'équilibre électro- lytique du plasma. Ce processus est très utile lorsque le traitement thérapeutique nécessite l'élimination des immuno- globulines et de leurs composés, et la restitution au patient de toute son albumine propre (sans apport d'albumine extérieure). Cela permet d'éviter les risques de transmission d'hépatites et rend le traitement beaucoup plus économique car le remplacement de l'albumine est très cher. A cet effet l'invention concerne un procédé de fractionnement de mélanges de protéines liquides 2492270 conforme au brevet principal suivant lequel on sépare un mélange aqueux de protéines en fractions de compositions intrinsèquement différentes, procédé caractérisé en ce qu'il consiste à retirer pratiquement tout le précipité du mâange, à ajouter ensuite une solution d'un agent de saturation saline à un rythme compris entre 2 et 30 % du volume du mélange de protéines, à modifier ainsi suffisamment l'environnement ionique du mélange pour déstabiliser, au moins partiellement, une ou plusieurs protéines de celui-ci, à laisser les protéines déstabilisées former un précipité, à retirer ensuite du mélange tout le précipité obtenu en maintenant la température de ce mélange, pendant la séparation, dans une plage comprise entre 0 et 400 C environ, et à éliminer enfin l'agent de saturation saline par un traitement de dialyse. Après avoir retiré-du sang les éléments formés (FE), on ajoute l'agent de saturation saline au plasma obtenu pour former ainsi une solution à très forte concentration saline qu'on agite en permanence. L'adjonction de sel a pour résultat que les différentes protéines précipi- tent une par une lorsque la concentration ionique (saline) augmente. Les agents de saturation saline agissent apparemment comme s'ils diminuaient l'activité de l'eau dans le mélange de solvant en déshydratant ainsi les groupes hydrophiles des molécules de protéines pour provoquer ainsi la précipitation des protéines. La quantité de sel à ajouter dépend de la protéine ou des protéines particulières à éliminer. Ainsi, pour extraire une fraction de l'ordre de 50 à 60 % de globulines, on ajoute un agent de saturation saline tel que du Na2 SO4 pour amener le sulfate de sodium à titrer entre 1 et 1,3 dans le plasma. Le précipité résultant de la saturation saline est ensuite extrait, par exemple par filtrage. Le liquide restant qui surnage est alors dialysé en présence d'un élément tampon convenable pour retirer le sel Na2 SO4 ajouté, puis restitué au patient après adjonction des cellules de sang ou éléments formés, qu'on avait précédemment xtirés. Ainsi ce procédé combinant une plasmaphorèse et une saturation saline suivies d'une reconstitution de la concentration normale en électrolyte, est parfaitement bien adapté à un échange théra- i4 peutique de plasma, s;ns qu'il soit nécessaire d'utiliser de 6 2492270 l'albumine ou du plasma frais ou congelé provenant d'une banque de plasma. L'extraction des immunoglobulines par satu- ration saline est appelée ici immunophorèse. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et qui se réfère aux dessins ci-joints dans lesquels: - la figure 1 représente un schéma du processus d'immunophorèse selon l'invention, - la figure 2 représente les pourcen- tages d'extraction de protéines (c'est-à-dire de l'albumine et des Ig) en fonction du titre en sel du plasma surnageant, - la figure 3 représente les valeurs des protéines fractionnées en fonction du titre en sel du plasma surnageant. La dialyse est un procédé largement utilisé, dans le domaine de la biologie, pour le dessalage ou le salage des électrolytes. La dialyse est un procédé de séparation par membrane dans lequel la force d'entraînement est due à un gradient de potentiel chimique, c'est-à-dire à un gradient de concentration ou d'activité des solutés de part et d'autre d'une membrane séparant les deux solutions. La membrane est perméable à l'eau et aux solutés à faible poids moléculaire. Ces solutés diffusent à travers la membrane jusqu'à ce que le gradient de concentration soit négligeable à travers la membrane. La dialyse peut ainsi être un procédé tout à fait efficace dans les cas o l'on doit mettre en jeu des gradients de- concentration élevés. La principale application de la dialyse est celle des reins o l'on doit retirer des solutés a faible poids moléculaire tels que l'urée et certains sels. Ces systèmes de dialyse bien connus sont complètement décrits dans les brevets USA no 4.192.748; 4.191.646; 4.213.859; 3.960. 730 et autres. Cependant l'utilisation de la dialyse avec la saturation saline des immunoglobulines et la plasmaphorèse, est totalement nouvelle et inconnue de l'art antérieur. L'effet de synergie résultant de la combinaison de ces procédés augmente l'efficacité de cette combinaison, en particulier lorsqu'on l'applique à un usage thérapeutique de l'immunophorése. 7 2492270 Sur la figure 1 représentant le processus d'immunophorèse selon l'invention, le mélange de protéines illustré est du sang mais le procédé peut également s'appliquer à d'autres mélanges de protéines. On ajoute tout d'abord un anticoagulant au sang 1 du patient et les éléments formés (FE) à partir du sang anticoagulé, constitués essentiel- lement par des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes, sont éliminés en 3 par une membrane de filtrage ou par une centrifugation 2, pour donner un débit de plasma clair 15. Une solution concentrée d'un agent de saturation saline 18 tel que du sulfate de sodium, est ajoutée directement pour se mélanger au plasma. Quand on désire retirer environ 50 % d'Ig G on ajoute d sel jusqu'à ce que le plasma titre environ 1, 1 à 1,2 de Na2 S4* Si le but est d'obtenir un plus grand pour- centage d'extraction d'Ig G et/ou d'Ig M et d'Ig A, il faut ajouter une plus grande quantité de sel. EXEMPLE 1 - Une solution de Na2 SO4 est progressi- vement ajottée, avec agitation permanente, à 300 ml de plasma, cette adjonction se faisant à un rythme compris entre 10 et ml/min. De petits échantillons de plasma sont retirés, à divers intervalles de temps, pour permettre l'analyse de la concentra- tion du plasma en protéines et en sel. Les résultats représen- tant le pourcentage d'extraction des protéines (c'est-à-dire de l'albumine et des Ig) en fonction de la teneur en sel du plasma qui surnage, sont portés sur la figure 2. On remarquera que pour une teneur en sel représentant 2 fois la concentration normale, pratiquement toute l'Ig G est extraite du plasma, avec une extraction ou perte simulténée de 25 % d'albumine. Le précipité (d'Ig) résultant de l'adjonction de sel, est extrait en 17 par centrifugation ou filtrage 7. Cette étape d'extraction peut se combiner à un refroidissement (non représenté) destiné à faciliter une extrac- tion plus rapide du précipité. L'adjonction de l'agent de saturation saline se fait de préférence à la température physiologique de 370 C, mais elle peut également se faire à la température ambiante ou plus bas, avec un choix convenable de l'agent de saturation saline util'sé. 8 2492270 Le liquide surnageant 8 qui reste après extraction du précipité d'Ig et de leurs composés, est riche en albumine mais contient une forte concentration en agent de saturation saline qu'on élimine au moyen d'un appareil de dialyse 21. La solution d'albumine est dialysée en présence d'un corps tampon convenable 23 tel que par exemple du PBS (titre 0,1 de NaCl, titre 091 de K2HPO4), L'étape dedLalyse peut consister en une dialyse initiale 21 (destinée à réduire le Na SQ4 à un niveau faible) et une dialyse finale 24 destinée à rétablir l'équilibre de l'électrolyte pour l'injection. Comme le but de la dialyse initiale est de retirer l'excès de sel en retenant l'albumine, on peut choisir pour cela une membrane de dialyse en cellulose par exemple, pour obtEir une bonne extraction de l'agent de saturation saline. Cet agent de saturation saline peut être constitué par un mélange de sels tels que par exemple Na2 S04 et NaCl, comme-illustré par l'exemple ci-après. EXEMPLE 2 - Un agent de saturation saline constitué par un mélange de 6N de Na2 SQ4 et 6N de NaCl, est ajouté à 300 ml de plasma, de la même manière que dans l'exemple précé- dent. Les résultats de ce.fractionnement des protéines, sont représentés sur les courbes de la figure 3. On remarquera qu'une concentration saline d'environ 2,4 fois la normale dans le li- quide qui surnage, conduit à une extraction d'environ 90 % de l'Ig G avec une extraction (perte) d'environ 15 % d'albumine. Si l'on compare ces résultats à ceux de l'Exemple 1, on pourra remarquer qu'il faut utiliser une plus grande concentration saline pour extraire les Ig lorsqu'on utilise le mélange de sels, la perte d'albumine semblant alors moins importante. Le choix de l'agent de saturation saline dépend de la protéine ou de l'ensemble de protéines qu'on veut retenir ou éliminer. On peut citer comme autres exemple d'agents de saturation saline utilisables dansl'invention, le (NH4)2 S4, le K2 S04 le citrate de sodium, l'acétate de potassium, le Mg SQ4, le Na Cl etc... ou des mélanges de ces sels. Après avoir extrait les agents de saturation saline par dialyse 21 pour les ramener à un niveau acceptable, la solution de protéines dessalée 8 (essentiellement de l'albumine) est reconstituée avec l'électrolyte convenable par adjonction directe de sel ou par dialyse 24, puis mélangée à l'élément formé 3 pour être ensuite restituée au patient sous forme de sang reconstitué (12). Ainsi, un système tel que celui décrit ci-dessus présente les mêmes possibilités potentielles qu'un procédé de série dans lequel on utilise une zone de dialyse suffisamment grande avec une membrane de séparation saline. Il serait également possible, dam une variante de réalisation, d'utiliser aussi un procédé,non de série-très bon marché. Ainsi, pendant le premier traitement de plasmaphorèse, on peut remplacer de façon classique environ 3 litres de plasma du patient par 1,5 litres d'albumine à 5 % et 1,5 litres d'eau salée. Pendant le second traitement de plasmaphorèse on récupère suffisamment d'albumine à partir des 3 litres de plasma obtenus par la première plasmaphorese selon le procédé deLl!invention. Cette albumine issue du premier traitement est utilisée pour remplacer le second volume de plasma, de sorte que chaque traitement ultérieur utilise l'albumine précédemment régénérée plut8t que de l'albumine supplémentaire apportée de l'extérieur. Comme le traitement utilise la propre albumine du patient on évite ainsi tout risque d'hépatite. De nombreuses variantes des formes de réalisation ci-dessus sont possibles sans sortir du cadre de l'invention,comme cela apparaîtra à l'évidence aux spécialistes de la question. 2492270 REVENDICATIONS 1.- Procédé de fractionnement de mélanges de protéines liquides conforme au brevet principal suivant lequel on sépare un mélange aqueux de protéines (1) en fractions de compositions intrinsèquement différentes, procédé caractérisé en ce qu'il consiste à retirer pratiquement tout le précipité du mélange (15), à ajouter ensuite une solution d'un agent de saturation saline (18) à un rythme compris entre 2 et 30 % du volume du mélange de protéines, à modifier ainsi suffisamment l'environnement ionique du mélange pour déstabiliser, au moins partiellement, une ou plusieurs protéines de celui-ci, à laisser les protéines déstabilisées former un précipité (17), à retirer ensuite du mélange tout le précipité obtenu en maintenant la température de ce mélange, pendant la séparation, dans une plage comprise entre O et 400 C environ, et à éliminer enfin l'agent de saturation saline par un - traitement de dialyse (23). 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en augmentant sa concentration ionique d'au moins 10 6 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en amenant son pH au point isoélectrique de l'une au moins des protéines. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à-3, caractéuisé en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en augmentant la concentration en ions monovalents. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en augmentant la concentration des ions non monovalents. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en augmentant à la fois la concentration en ions monovalents et en ions non monovalents. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 paractérisé en ce que l précipité retiré (17) est redissous. 11 2492270 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le mélange de protéines (15) est constitué par des protéines du plasma, et en ce que le précipité extrait (17) est constitué par du fibrinogène et du facteur antihémophile. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le mélange de protéines aqueux (15) est constitué essentiellement de protéine de plasma non dénaturées, et en ce que le précipité retiré (17) est constitué essentiellement d'immunoglobulines. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le mélange de protéines aqueux (15) comprend essentiellement des protéines de plasma, en ce que le précipité retiré (17) comprendd. fibrinogène et du facteur antihémophile, et en ce que le préci- pité est redissous et séparé en fractions riches en fibrinogène et riches en facteur antihémophile, par mise en contact avec un matériau choisi dans un groupe de matériaux comprenant des granulés de résine d'échange d'ions, des granulés de gel perméables, et des mélanges de ces granulés. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le mélange de protéines (15) comprend des protéines de plasma, et en ce que le précipité retiré (17) comprendde l'albumine. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le précipité retiré (17) est redissous pour servir à étendre le plasma. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le mélange de protéines aqueux (15) comprend des protéines de plasma, en ce que l'environnement ionique du mélange se modifie en ajoutant des sels solubles (18) choisis dans un groupe comprenant les sulfates, les citrates, les phosphates, les chlorures, les acétates et des mélanges solubles de ces sels, et en ce que le précipité (17) qu'on en retire comprend essentiellement des protéines sans albumine. 14.- Procédé de séparation d'un mélange de protéines aqueux en fractions de compositions intrinsèquement différentes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, 4o procédé caractérisé er ce qu'il consiste à retirer tout le précipité (17) du mélange (15), à faire passer ensuite ce mélange dans un appareil de dialyse (21) comprenant au moins une paire de membranes de dialyse contigties définissant entre elles une chambre de passage de liquide, de manière à modifier ainsi suffisamment l'environnement ionique du mélange pour déstabiliser, au moins partiellement, une ou plusieurs protéines du mélange, à laisser précipiter les protéines déstabilisées, à retirer ensuite tout le précipité obtenu (17) en maintenant la température du mélange entre O et 400 C environ pendant toute la eiaration, et en retirant ensuite l'agent de saturation saline par un traitement de dialyse (21, 24). 15.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le mélange de protéines aqueux (15) comprend des protéines de plasma et en ce que le précipité retiré (17) comprend du facteur antihémophile.