i 2053218 La présente invention concerne un procédé pour l'isolement biochimique du 1-menthol. D'après la configuration stéréochimique du menthol, quatre stéréo-isomères peuvent exister, à savoir le menthol, 1'isomenthol, le 5 néomenthol et le néoisomenthol. Chacun desdits stéréo-isomères comporte des isomères optiques (formes dextrogyre (d) et lévogyre (1), de sorte qu'il existe en tout huit isomères optiques. Parmi lesdits isomères, le 1-menthol est l'un des constituants principaux de l'essence de menthe naturelle et il possède l'activité rafraîchissante la plus intense de sorte 10 qu'il est largement utilisé dans les parfums et les médicaments. On peut préparer le 1-menthol à partir d'un certain nombre de méthodes. Par exemple, on peut Isoler les cristaux de 1-menthol à partir de l'essence de menthe naturelle par refroidissement. Par voie synthétique, on peut obtenir le 1-menthol à partirde la 1-menthone, qui est renfermée dans 15 l'essence de menthe naturelle, par réduction avec le sodium métallique. A l'échelle industrielle, on prépare le 1-menthol à partir du d-citroneliai, qui est un composé de l'essence de citronelle, par cyclisa-tion et hydrogénation. Cependant, comme les matières premières naturelles telles que la 1-menthone et le d-citronellal, présentant des activités 20 optiques, ne sont disponibles seulement qu'en quantités très limitées, on cherche à effectuer la synthèse du 1-menthol à partir de produits chimiques industriels peu coûteux. Lorsqu'on effectue la synthèse du 1-menthol à partir de matières premières inactives du point de vue optique, l'un des problèmes importants qui 25 se pose est la séparation, uniquement, du 1-menthol optiquement actif, à partir d'un mélange d'isomères de dl-menthol, car la formation simultanée de tous les isomères dl (dl-menthol, dl-isomenthol, dl-néomenthol et dl-néoisomenthol) est inévitable. On a effectué dans le passé de nombreuses tentatives en vue de séparer le 1-menthol, mais on n'avait pas encore 30 jusqu'alors signalé la réalisation d'un procédé industriel satisfaisant. Pour cette raison, on utilise en fait le dl-menthol dans de nombreux cas, sans qu'il ait été purifié complètement. Le principal procédé industriel pour la synthèse du dl-menthol consiste en l'hydrogénation du thymol et l'équilibrage à la chaleur du 35 mélange résultant formé d'isomères de dl-menthol, en vue d'obtenir la composition suivante : environ 70% de dl-menthol; environ 207. de dl-isomenthol; 70 27840 2 2053218 environ 10% de d1-néomentho1 ; et une trace de dl-néoisomenthol. Le rapport entre lesdits isomères varie selon les conditions de réaction, ce qui s pour conséquence une composition extrêmement variable du produit. Un autre procédé de synthèse du dl-menthol consiste à préparer 5 un mélange d'isomères de dl-menthol, dont les constituants sont principalement le dl-menthol (environ 70'7„), le dl-isomenthol et le dl-néomenthol, par cyclisation et hydrogénation du dl-cicronel lal, et séparation du dl-mer.Lho 1 à partir dudit mélange. Les méthodes connues pour le dédoublement optique du dl-mcnthel 10 ainsi obtenu mettent en jeu l'isolement optique dudit composé à partir de ses semi-esters avec l'acide phtalique, son ester avec l'acide l-menthoxy-acétique et son ester avec l'acide dl-camphorique. Lesdites méthodes sont trop coûteuses et sont fondées sur un mode opératoire qui est trop compliqué pour être utilisé à l'échelle industrielle et, par suite, elles sont seulement uti-15 lisées dans les techniques de laboratoire. Selon un objet de l'invention, on propose un procédé pour l'isolement biochimique du 1-menthol. Selon un autre objet de l'invention, on propose un nouveau procédé pour le dédoublement optique du dl-menthol ou d'un mélange d'isomères 20 de dl-menthol, contenant le dl-menthol, ledit procédé étant acceptable dans le cadre de l'industrie. Selon un objet supplémentaire de l'invention, on propose un procédé pratique et utile pour la préparation du 1-menthol. Enfin, selon un objet encore différent de l'invention, on propose 25 un procédé industriel pour la préparation du 1-mentholoptiquement actif, qui est utile dans la production des parfums et des médicaments, à partir du thymol. La demanderesse a découvert dans le cadre de l'invention que l'on peut isoler par voie biochimique un 1-menthol optiquement actif par 30 un procédé qui comprend le dédoublement optique d'un ester d'acide carboxy-lique organique du dl-menthol, ou par le dédoublement optique d'esters d'un acide carboxylique organique avec un mélange d'isomères de dl-menthol (dl-menthol, dl-isomenthol, dl-néomenthol et dl-néoisomenthol). On peut utiliser dans le procédé de l'invention un ou plusieurs enzymes qui compren-35 nent les hydrolases d'esters d'acides carboxyliques, produits par les microrganismes des genres suivants : Sarcina, Nocardia, Micrococcua, Alcaligenes, Pseudomonas, Brevibacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Lactobacillus , Streptococcus, CLostridium, Flavobacterium, Mycobacterium et Arthrobai ter. 70 27840 3 2053218 On a antérieurement décrit un procédé pour l'isolement biochimique du 1-menthol à partir du dl-menthol ou d'un mélange d'isomères de dl-menthol contenant le dl-menthol. Ledit procédé consiste en ce qu'on traite un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, ou un 5 mélange dudit ester avec les esters d'un acide carboxylique organique avec les isomères de dl-menthol contenant du dl-menthol (dans lesquels l'acide carboxylique organique est l'acide formique ou un acide gras de formule générale : RCOOH, dans laquelle R est un radical alkyle ou alkényle comportant de 1 à 21 atomes de carbone), avec un enzyme, plus particulièrement une 10 hydrolase d'ester d'acide carboxylique, qui peut être produit par l'action de microrganismes appartenant aux genres suivants : Pénicillium, Gliocladium, Trichoderma, Geotrichum, Aspergillus, Pullularia, Fusarium, Absidia, Cunninghamella, Rhizopus, Actinomucor, Chlamydomucor, Mucor Grlbberella, Streptomyces et Bacillus, lesdits enzymes ayant été séparés de leurs corps 15 cellulaires et de leur milieu de culture ou pouvant être, d'une manière différente, utilisés directement sour la forme de leurs corps cellulaires ou de leur milieu de culture contenant ledit enzyme, à savoir 1'hydrolase d'ester d'acide carboxylique. Voir, à ce sujet, la demande de brevet des E.U.A. N° 783.126, déposée au nom de la demanderesse le 11 décembre 1968. 20 On a déjà décrit également une autre méthode pour l'isolement biochimique du 1-menthol à partir du dl-menthol ou d'un mélange d'isomères de dl-menthol contenant le dl-menthol. Ladite méthode comprend le traitement d'un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, ou d'un mélange dudit ester avec des esters d'un acide carboxylique organique avec les 25 isomères de dl-menthol contenant le dl-menthol (dans lequel l'acide carboxylique organique est le même que celui cité ci-dessus), avec un enzyme, plus particulièrement une hydrolase d'ester carboxylique que l'on peut produire par l'action de microrganismes appartenant aux genres suivants : Candica, Sccharomyces, Hanseula, Rhodotorula, Toruropsis, Schizosaccharomyces, 30 Pichia, Sporobolomyces, Debaryomyces, Nadosonia, Trichosporon, Brettanomyces et Cryptococcus; lesdits enzymes ayant été séparés de leurs corps cellulaires et de leur milieu de culture ou pouvant être, d'une manière différente, directement utilisés sous forme de leurscorps cellulaires ou de leurs milieux de culture contenant ledit enzyme, à savoir l'hydrolase d'ester 35 d'acide carboxylique. Voir, à ce sujet, la demande de brevet des E.U.A. N° 878.913 déposée au nom de la demanderesse le 21 novembre 1969. 70 27840 4 2053218 La demanderesse a maintenant trouvé selon l'invention qu'il est possible d'effectuer l'isolement biochimique du 1-menthol par hydrolyse de l'ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol précité avec une estérase, à savoir une hydrolase d'ester d'acide carboxylique, qui est 5 produite par des microrganismes appartenant aux genres suivants : Sarcina, Nocardia, Micrococcus, Alcaligenes, Fseudomonas, Brevibacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium, Flavobacterium, Mycobacterium et Arthrobacter, qui sont tout à fait différents des microrganismes mentionnés ci-dessus et, d'une manière sup-10 plémentaire, la demanderesse a étudié les propriétés de l'estérase produite par les microrganismes précités. Le procédé de l'invention consiste en ce qu'on traite un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, ou un mélange dudit ester avec des esters d'un acide carboxylique organique avec les isomères de dl-menthol 15 renfermant du dl-menthol (dans lesquels l'acide carboxylique organique est l'acide formique ou un acide gras de formule générale : RCOOH, dans laqidle R est un radical alkyle ou alkényle comportant de 1 à 21 atomes de carbone) avec un enzyme, plus particulièrement une hydrolase d'ester d'acide carboxylique qui peut être produit par l'action de microrganismes apparte-20 nant aux genres suivants : Sarcina, Norcadian Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas, Brevibacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium, Flavobacterium, Mycobacterium, et Arthrobacter, lesdits enzymes ayant été séparés de leurs corps cellulaires et de leurs milieux de culture ou pouvant être d'une manière différente, 25 directement utilisés sous la forme de leurs corps cellulaires ou de leurs milieux de culture contenant l'enzyme formé par l'hydrolase.d'ester.d'acide carboxylique. Un essai d'hydrolyse sélective des esters de 1-menthyle par les microrganismes mentionnés ci-dessus, qui peuvent être employés de préférence 30 selon l'invention, est effectué comme suit. Dans un tube à essai ayant un diamètre interne de 18 mm et une longueur de 180 mm, on introduit 10 ml d'un milieu constitué par 10 g de peptone, 4 g d'extrait de viande, 4 g d'extrait de levure et 1 g de glucose dans 1 litre d'eau. On inocule le milieu par un microrganisme soumis à l'essai, après 35 stérilisation,et on secoue le tube à essai pendant 48 heures à 30°C. Ensuite, on ajoute au milieu un mélange émulsifié-d'acétate de menthyle constitué de 80% d'un mélange d'acétate de menthyle (composé des Isomères : acétate de dl-menthyle 55,2%, acétate de dl-néomenthyle 34,3%, acétate de dl-isomenthyle 15,5% et une trace d'acétate de dl-néoisomenthyle), en quantité décrite au 70 27840 2053218 5 tableau I, ci-après, et on agite l'ensemble pendant 48 heures. On extrait le milieu de culture arec de l'éther éthylique que l'on élimine à partir de l'extrait. On analyse le résidu résultant par chromatographie gazeuse. On calcule le taux d'hydrolyse: 5 1-menthol (+ 1-isomenthol) 1-menthol (+ 1-isomenthol) + Esters d'acide acétique non décomposés d'après l'aire du pic, dans les courbes de chromatographie gazeuse. Ces 10 résultats sont indiqués au tableau I. La classification de tous les microrganismes, à l'exception de ceux qui proviennent de la Fédération Japonaise des Collections de Cultures de microrganismes, est fondée sur les indications de "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7ème édition 1957". TABLEAU I 15 Microrganisme Quantité de mélange d'ester d'acide acétique d'isomères de dl-menthol, à ajouter, 7. Taux d'hydrolyse 7. Quantité d'isomenthol produite 7. 20 Sarcina aurantiaca IAM 1059 4 6,8 0,0 Nocardia gardineri IAM 0105 4 3,9 0,0 Micrococcus lysodeikticus IAM 1056 4 1,2 0,0 Micrococcus varians IAM 1314 4 6,2 0,0 Alcaligenes faecalis IAM 1061 4 8,9 1,3 25 Alcaligenes viscolactis IAM 1517 4 11,5 1,3 Pseudomonas crudiviae IAM 1048 4 10,2 0,3 Pseudomonas fluorescens IAM 1057 4 12,5 1,8 Pseudomonas fragi IAM 1650 4 7,8 2,1 Pseudomonas sp. No. 001 8 21,8 9,7 30 Pseudomonas sp. No. 002 8 26,9 5,9 Pseudomonas sp. No. 003 8 24,6 7,2 Brevibacteri um helvorum IAM 1637 4 6,3 0,0 Brevibacteri um sp. No. 004 8 19,4 5,2 Aerobacter aerogenes IAM 1338 2 0,9 0,0 35 Aerobacter cloacae IAM 1134 2 1,5 0,0 Aerobactef aerogenes IAM 1539 2 4,8 1,8 Agrobacterium tumefaciens IAM1625 2 7,3 0,5 Adiromobact«;r s(>. No. 005 ■'i 13,1 2,7 Lactobacl l lus casei AHll 1055 2 2,8 0,0 70 27840 6 2053218 13 20 30 35 TABLEAU I (suite) Microrganisme Quantité de mé- Taux Quantité lange d'ester d'hydrolyse d'isomenthol d'acide acétique "L produite 7» d'isomères de dl-menthol, à ajouter, % LactobaciLlus casei IF0 3425 2 14,5 4,3 Lactobacillus helveticus IFO 3219 2 11,2 2,8 Streptococcus lactis AHU 108?" 2 1,6 0,0 Streptococcus faecalis AHU 1086 2 4,7 0,0 Clostridium acetobutyricum IF0 3346 4 7,9 1,2 Clostridium caproicum IAM 19228 4 19,4 2,8 Flavobacterium esteroaromaticum IF0 3751 4 9,9 1,2 Flavobacterium fiavescens IF0 3085 4 6,4 0,0 Mycobacterium phlei IFO 3158 2 3,6 0,0 Arthrobacter simplex IAM 1660 4 7,1 0,5 Arthrobacter ureafaciens IAM 1658 2 7,8 0,5 Note : IAM : Université de Tokyo, Laboratoires des Microrganismes appliqués. IFO : "Incorporated Foundation Fermentation Laboratory"ou Institut de Fermentation, Osaka, Japon. AHU : Université Hokkaido, Département d'Agriculture, Chaire de Mycologie appliquée. En ce qui concerne l'acide carboxylique organique utilisé pour pcoduire l'ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, on emploie 2^ l'acide formique et les acides carboxyllques organiques de formule générale "RCOOH", dans laquelle R est un radical alkyle ou un radical alkényle comportant de 1 à 21 atomes de carbone. Des exemples desdits acides sont l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide caprotque, l'acide caprylique, l'acide caprique, l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide acrylique, l'acide oléique, l'acide érucique et analogues. Cependant, en général, on utilise de préférence un acide organique inférieur tel que l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique et analoguest car l'activité hydrolytique de l'acide carboxylique organique tend à être abaissée à la fois en ce qui concerne la vitesse et la sélectivité lorsque la longueur de sa chaîne carbonée augmente. L'acide acétique est l'acide dont l'utilisation est la plus avantageuse comme matière première industrielle, et il est particulièrement préféré. Dans le procédé de l'invention, on effectue l'hydrolyse de l'ester de 1-menthol non seulement en le soumettant à des secousses en contact avec 70 27840 7 2053218 les microrganismes en cours de croissance ou avec les cellules intactes desdits microrganismes, mais également en mélangeant l'ester avec un milieu de culture exempt de cellules vivantes et avec l'extrait exempt de cellules des microrganismes précités. Par exemple, on peut faire incuber les microrga-5 nismes précités dans un milieu de culture liquide afin d'accumuler les estérases dans les corps cellulaires ou dans les milieux de culture et ensuite, on peut ajouter un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol ou un mélange d'esters d'acide carboxylique organique d'isomères de dl-menthol contenant le dl-menthol, au milieu de culture liquide. D'une 10 manière différente, après la séparation des corps cellulaires à partir du milieu de culture liquide, on peut mettre en suspension les corps cellulaires dans un liquide tamponné d'une manière convenable et ajouter ladite suspension à l'ester précité. En outre, on peut utiliser toutes les substances telles qu'un extrait contenant l'estérase, le liquide de conden-15 sation obtenu à partir dudit extrait, l'estérase brute et l'estérase purifiée, isolées à partir des corps cellulaires des microrganismes précités ou leurs milieux de culture, selon les méthodes courantes pour l'isolement et la purification de l'estérase. En outre, on peut utiliser des estérases brutes ou des estérases purifiées insolubilisées par combinaison avec un composé 20 à poids moléculaire élevé quelconque. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, la température de réaction préférée est de 25-45°C, de préférence 30-40°C, afin de réaliser une opération économique. La durée de réaction est d'environ 5-96 heures à 30-40°C. Cependant, on peut raccourcir ou prolonger cette 25 durée par réglage de la concentration de l'ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol. Latjuantité dudit ester ou du mélange d'ester dïso-mères contenant le dl-menthol est de préférence dans l'intervalle d'environ 2-207. en poids de milieu de culture du microrganisme précité. Lorsqu'on utilise les corps cellulaires ou les estérases, on peut déterminer la quan-30 tité de l'estérase précitée que l'on doit utiliser d'après la quantité calculée du microrganisme dans le milieu de culture. On peut ajouter un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol ou un mélange d'esters d'acide carboxylique organique d'isomères de dl-menthol contenant le dl-menthol, tel quel, ou sous forme émulsifiée avec l'alcool polyvinylique ou d'autres éraul-35 sifiants. On peut effectuer la réaction d'hydrolyse assez rapidement lorsqu'on réalise l'addition sous la forme émulsifiée. Dans le procédé de l'invention, lorsqu'on utilise l'estérase produite par les microrganismes mentionnés ci-dessus en contact avec un 70 27840 8 2053218 mélange d'esters d'acide carboxylique organique d'isomères de dl-menthol contenant un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, dans certains cas seul l'ester d'acide carboxylique organique de 1-menthol est sujet à l'hydrolyse en produisant ainsi seulement du 1-menthol. Dans d'autres cas, 5 les esters d'acide carboxylique organique de 1-menthol et de 1-isomenthol sont sujets à l'hydrolyse en produisant à la fois le 1-menthol et le 1-isomenthol. Cependant, les esters différents des esters d'acide carboxylique organique de 1-menthol et de 1-isomenthol demeurent intacts sans être sujets à l'hydrolyse. Lorsque le taux d'hydrolyse de l'ester d'acide carboxylique 10 organique de 1-menthol, dans un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol ou un mélange d'esters d'acide carboxylique organique d'isomères de dl-menthol contenant un ester d'acide carboxylique organique de dl-menthol, devient égal (à 80-100%, la réaction s'arrête et l'on isole le produit réactionnel contenant le 1-menthol (éventuellement le 1-menthol et 15 le 1-isomenthol) à partir du liquide réactionnel. Lorsque cet isolement est difficile en raison de l'utilisation d'un'émulsifiant on extrait le produit de réaction avec un solvant organique ou on l'isole par distillation à la vapeur d'eau et analogues. On peut séparer le l-menthol(éventuellement le 1-menthol et le 20 1-isomenthol) et les esters d'acide carboxylique organique des isomères de menthol non convertis dans le produit réactionnel isolé, en utilisant la différence des propriétés physiques et chimiques desdites substances, par exemple, des méthodes d'absorption (notamment la chromatographie par absorption, en utilisant de l'alumine et analogues), l'extraction par 25 solvants ou la distillation fractionnée et analogues. Lorsque le 1-menthol ainsi obtenu doit contenir du 1-isomenthol, on peut aisément séparer les deux menthols en effectuant les opérations d'isolement-purification telles qu'une rectification, une formation de dérivés (par exemple,un ester d'acide cyanacétique, un ester d'acide monochloracétique, un monOester 30 d'acide phtalique et analogues), une recristallisation, uie chromatographie et analogues. Les microrganismes de l'invention permettent de produire l'estérase désirée d'une manière peu coûteuse et aisée car ils possèdent un taux de croissance élevé et peuvent être cultivés dans un milieu de culture 35 peu coûteux. L'estérase obtenue présente une activité et une stabilité élevée avantageuses. Les exemples suivants illustrent l'invention selon des modes de mise en oeuvre préférés, sans nullement limiter ladite invention dans son cadre et son esprit. 70 27840 9 2053218 Dans lesdits exemples tous les pourcentages sont exprimés en poids. En outre, dans les exemples, on emploie les abréviations suivantes : IAM : Institut de Microbiologie Appliquée, Université de Tokyo, Tokyo, Japon. 5 IFO : Institut de Fermentation, Osaka, Japon. AHU : Département d'Agriculture, Université Hokkaido, Sapporo, Japon. EXEMPLE 1 Dans un flacon, on introduit et on stérilise 100 ml d'un milieu de culture constitué de 0,5% de glucose, 0,5% de phosphate dipotassique, 0,7% 10 de peptone 0,5% d'extrait de levure. On inocule le contenu du flacon avec Sarcina aurantiaca IAM 1059, et après l'incubation en secouant (amplitude des vibrations = 6 cm, rotation = 15 tours par minute) à 30°C pendant 24 heures, on ajoute une émulsion de 2 g d'un mélange d'esters d'acide formique d'isomères de dl-menthol (55,2% de formiate de dl-menthyle, 15,3% de formiate 15 de dl-isomenthyle, 29,37. de formiate de dl-néomenthyle et une trace de formiate de dl-néoisomenthyle) dans 8 ml d'une solution aqueuse à 2% d'alcool poly-vinylique et on secoue le mélange pendant 96 heures supplémentaires. On extrait ensuite le mélange réactionnel avec dé l'hexane. On obtient le produit réactionnel avec un rendement de 1,73g, et il contient, selon l'analyse par 20 chromatographie gazeuse, 14,8 % de 1-menthol et 0,4% de 1-isomenthol. On dissout 1,5g du produit de réaction dans 30 ml de 1-hexane et on le répartit en menthol (0,21 g) et en esters non convertis, par chromatographie sur colonne d'alumine. On recristallise le menthol à partir de nitrométhane en obtenant 0,13 g de 1-menthol; — — 20 25 Point de fusion 41°C, £ ot-J * =-49,7° (C= 1,5; éthanol). EXEMPLE 2 A 100 ml du milieu décrit à l'exemple 1, on inocule l'organisme Micrococcus varians IAM 1314 et, après incubation en secouant à 30°C pendant 24 heures, on y ajoute 2 g d'un mélange d'esters d'acide acétique d'isomères 30 de dl-menthol (acétate de dl-menthyle 55,2%, acétate de dl-isomenthyle 15,3%; acétate de dl-néomenthyle 29,3%, et acétate de dl-néoisomenthyle à l'état de traces). Après avoir secoué à la même température pendant 72 heures, on sépare le produit de réaction du milieu de culture par centrifugation, le rendement en produit de réaction est de 1,81 g et l'analyse chromatographique 35 révèle la présence de 13,4% de 1-menthol et 0,097. de 1-isomenthol. On traite le produit de réaction de la même manière qu'à l'exemple 1 en obtenant 0,2 g de 1-menthol. 70 27840 10 2053218 lotJ p° =-49,8° (C = 5; éthanol). EXEMPLE 3 Dans un flacon, on Introduit 1 litre d'un milieu de culture contenant 1,5% de poudre de graines de soja, 0,17. de glucose et 0,27„ d'extrait 5 de levure. On inocule ensuite le contenu du flacon avec Alcaligenes viscalactis IAM 1061 et on fait incuber à 37°C pendant 24 heures. Après avoir éliminé la matière soluble à partir de ladite substance cultivée, en utilisant une toile filtrante, on recueille les corps cellilaires par centrifugation et on les met en suspension dans 500 ml d'une solution tampon à base de 0,1 mole 10 d'acide phosphorique (pH 7,5). On ajoute ensuite 50g d'un mélange d'esters d'acide acétique d'isomères de dl-menthol ayant la même composition qu'à l'exemple 2, et après avoir secoué le mélange à 37°C pendant 72 heures, on recueille le produit de réaction par centrifugation. Le rendement en produit de réaction est de 44,3 g et l'analyse 15 par chromatographie gazeuse révèle la présence de 23,47. de 1-menthol et 6,87. de 1-isomenthol. On répartit ensuite le produit réactionnel en 1- menthol, 1-isomenthol (13,2 g) et en esters non convertis par chromatographie sur colonne d'alumine. On estérifie le menthol avec de l'acide monochloracétique et on le recristallise à partir de méthanol en obtenant 11,5 g de cristaux 20 d'esters monochloracétique du 1-menthol que l'on hydrolyse ensuite en obtenant 8,1 g de cristaux de 1-menthol. — — 20 / ot / p =- 49,9° (C = 5; éthanol). EXEMPLE 4 Dans un flacon fermenteur, on introduit et on stérilise 5 litres 2 5 d'un milieu de culture contenant 307, d'extrait de son (obtenu en extrayant 1 partie de son avec 5 parties d'eau chaude), 0,5% de peptone, et 0,17. de glucose. On inocule le contenu du flacon avec 250 ml d'un milieu liquide de préculture de Pseudomonas fluorescens IAM 1057 et on fait incuber à 37°C (enagitant à 250 tours par minute, l'aération étant de l'ordre de 2,5 litres/ 30 minute). Après une incubation pendant 24 heures, on y ajoute 500 ml de l'ester d'acide propionique de dl-menthol et on poursuit l'incubation avec une aération de 0,5 litre/minute pendant 96 heures supplémentaires. Ensuite on arrête l'agitation et on sépare le produit surnageant. Le rendement en produit de réaction est de 418 g et le 1-menthol y est présent à raison 35 de 37,6 7.. On répartit le produit de réaction en 1-menthol et en esters non convertis par chromatographie sur colonne d'alumine. Le rendement en 1-menthol est de 161 g. — — 20 _/«._/ =-49,1" (C = 5, éthanol). 70 27840 h 2053218 EXEMPLE 5 Dans un flacon, on introduit et on stérilise 500 ml du milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 1. On inocule le contenu du flacon avec Brevibacterium helvorum IAM 1637 et après l'incubation en le secouant à 37°C pendant 24 heures, on recueille les corps cellulaires par 5 centrifugation et on les met en suspension dans 100 ml d'une solution tampon à base de 0,1 mole d'acide phosphorique et on effectue ensuite la mise en suspension par traitement au moyen d'ultrasons (22 kilocycles, 200 watts,30 minutes) en refroidissant avec un bain de glace et d'eau. On soumet le liquide à une centrifugation Intense pour éliminer les ingrédients insolubles et on y ajoute 10 une émulsion de 5 g d'un mélange d'esters d'acide formique d'isomères de dl-menthol ayant la même composition qu'à l'exemple 1 émulsifié par 25 ml d'une solution aqueuse d'alcool polyvinylique à 21.. Après avoir effectué la réaction à 30°C pendant 48 heures, on extrait le produit réactionnel avec de l'éther. Le rendement en produit de réaction est de 4,8 g et l'analyse parchromatographie 15 gazeuse montre la présence de 13,4% de 1-menthol et 3,47. de 1-isomenthol. Après une chromatographie sur colonne d'alumine pour séparer le 1-menthpl et le 1-isomenthol à partir des esters non convertis, on obtient 0,5 g d'un mélange de 1-menthol et de 1-isomenthol. On convertit ledit mélange en ester d'acide monochloracétique que l'on refroidit ensuite à -20°C en obtenant 0,41 g de 20 l'ester d'acide monochloracétique de 1-menthol que l'on soumet ensuite à l'hydrolyse en obtenant 0,23 g de 1-menthol. — — 90 Point de fusion = 42,7°C, ]_ ot_/ «-50,2° (C» 1,5, éthanol). EXEMPLE 6 On laisse écouler 50 ml du liquide traité aux ultrasons selon 25 l'exemple 5, sur une colonne de résine Séphadex G-75, nom d'une résine mise dans le commerce par la firme Pharmacia, Uppsala, Suède, (diamètre 3,5 cm, longueur 75 cm) pour recueillir l'estérase que l'on concentre ensuite par la méthode de la membrane semi-perméable et que l'on insolubilise par combinaison avec 5 g de DEAE-cellulose, à savoir la diéthylaminoéthylcellulose. On met 30 en suspension 2 g du produit insolubilisé dans 50 ml d'une solution tampon à 0,1 mole d'acide phosphorique et on y ajoute une émulsion d'esters, puis on fait réagir de la même manière pendant 24 heures. On répète 8 fois la même opération, en analysant dans chaque cas le mélange réactionnel par chromatographie gazeuse en obtenant les résultats suivants: 35 Essai N° Rendement (g) Teneur en 1-menthol (7.) 1 0,87 17,6 2 0,88 17,8 3 0,87 17,4 4 0,90 17,4 70 27340 12 2053218 10 30 (suite) Essai N° Rendement (g) Teneur en 1-menthol (%) 5 0,92 16,8 6 0,90 16,3 7 0,92 16,3 8 0,88 16,3 9 0,93 15,1 10 0,94 15,0 On traite 2 g du produit réactionnel obtenu dans cet exemple par chromatographie sur colonne d'alumine comme décrit à l'exemple 1 en 15 20 obtenant 0,3 g de 1-menthol. /~a_7 p0=-49,9° (C= 1,5, éthanol). EXEMPLE 7 Dans un flacon, on introduit et on stérilise 100 ml du milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 1. On inocule le contenu du flacon avec Lactobacillus casei IFO 3425 et, après avoir fait incuber en secouant à 37°C pendant 48 heures, on y ajoute 2 g d'un mélange d'esters d'acide acétique d'isomères de dl-menthol décrit à l'exemple 2. Après avoir poursuivi les secousses pendant 72 heures à la même température, on extrait le produit avec de l'éther. Le rendement en produit de réaction est de 1,74 g et il contient, comme on le détermine par analyse par chromatographie gazeuse, 17,4% de 1-menthol et 4,9% de 1-isomenthol. On traite le produit réactionnel de la même manière qu'à l'exemple 3 en obtenant 0,12 g de 1-menthol. 2 S — — 70 /.«._/ =-49,7°, (C = 5, éthanol) point de fusion 41,9°C. EXEMPLE 8 En suivant le mode opératoire de l'exemple 7, mais en utilisant Streptococcus faecalis AHU 1086 au lieu de Lactobacillus casei IFO 3425, le rendement en produit réactionnel est de 1,83 g et l'analyse par chromatographie gazeuse révèle 6,7 % de 1-menthol et 0,0% de 1-isomenthol. On traite le produit réactionnel de la même manière qu'à l'exemple 3 en obtenant 0,09 g de 1-menthol. — — 20 /_ oc / p =-48,9° (C = 1, éthanol) point de fusion 41,5°C. EXEMPLE 9 35 On inocule Clostridbm caproicum IAM 19228 dans 500 ml d'un milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 1 et on fait incuber le mélange en le secouant à 30°C pendant 48 heures. On y ajoute 20 g 70 27840 13 2053218 d'un mélange d'esters d'acide caprotque d'isomères de dl-menthol (caproate de dl-menthyle 61%, caproate de dl-isomerithyle 22 % et caproate de di■néomenthyle 17%) et, après avoir poursuivi les secousses pendant 96 heures, on laisse reposer pour recueillir le produit réactionnel qui surnage. Le rende»,ent en 5 produit réactionnel est de 19,7 g et par l'analyse par chromatographie gazeuse, révèle 17,6 % de 1-menthol et 4,9% de 1-isomenthol. On soumer le produit réactionnel à la distillation à la vapeur d'eau en obtenant 3.9 g d'un mélange de 1-menthol et de 1-isomenthol (1-menthol 797°, l-isome"thol 21%). On purifie ledit mélange de la même manière que décrit à l'exemple 5 en obtenant 10 2,3 g de 1-menthol. — — 20 i ot.J D =-49,9° (C = 5, éthanol). EXEMPLE 10 Dans un flacon, on introduit et on stérilise 100 ml d'uti milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 1. On inocule le contenu 15 du flacon avec Flavobacterium esteroaromaticum IFO 3751 et après 1'avoir fait incuber en le secouant à 37°C pendant 36 heures, on y ajoute 2 g d'ester d'acide palmitique de dl-menthol et on secoue l'ensemble pendant 72 heures supplémentaires. Ensuite on extrait le mélange réactionnel avec de 1'éther et on obtient 1,91 g d'extrait. L'analyse par chromatographie gazeuse révèle 20 que l'extrait contient 13,2% de 1-menthol. On soumet ledit extrait à la distillation à la vapeur d'eau et on recueille le 1-menthol en tant que distillât. On recristallise le 1-menthol brut résultant à partir de nitrométhane en obtenant 0,14 g de 1-menthol. — — 20 / a. / =-49,7'"' (C= 1, éthanol) Point de fusion = 41,2 C. EXEMPLE 11 Dans un flacon, on introduit et on stérilise 100 ml d' n milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 3 et on inocule !e contenu du flacon avec Mycobacterium phlei IFO 3158, et, après incubation en le secouant à 37°C pendant 36 heures, on y ajoute 2 g d'un mélange d'esters d'acide laurique d'isomères de dl-menthol décrit à l'exemple 1 et on secoue l'ensemble pendant 96 heures supplémentaires. Ensuite, on extrait le mélange réactionnel avec de l'éther et l'on obtient 1,92 g d'extrait. L'annlsse par chromatographie gazeuse montre que l'extrait contient 7.1 X de 1-menthol et 0,0% de 1-isomenthol. On traite ledit extrait de la même manière que décrit à l'exemple 10 en obtenant 0,23 g de 1-menthol. — — 20 j_ ot / =-49,0e (C = 1, éthanol) : point de fusion = 41,4"C. 70 27840 2053218 14 EXEMPLE 12 On inocule Arthrobacter simplex IAM 1660 à un milieu de culture ayant la même composition qu'à l'exemple 1 et on le fait incuber en le secouant à 37°C pendant 48 heures. On y ajoute 4 g de myristate de dl-menthyle et après 5 avoir poursuivi les secousses pendant 96 heures, on laissa reposer et on recueille le produit réactionnel surnageant. Rendement 3,4 g. On soumet le produit de réaction ainsi obtenu à la distillation à la vapeur d'eau en obtenant 0,14 g de cristaux de 1-menthol. — — 20 £olJ =-50,0 (C = 5, éthanol). îO EXEMPLE 13 En suivant le mode opératoire de l'exemple 7, mais en utilisant Nocardia gardineri IAM 0105 au lieu de Lactobacillus casei IFO 3425, le rendement du produit réactionnel est de 1,80 g et l'analyse par chromatographie gazeuse révèle la présence de 6,57. de 1-menthol et de 0,07. de 1-isomenthol. 15 On traite le produit réactionnel de la même manière qu'à l'exemple 3 en obtenant 0,08 g de 1-menthol. -r— — 20 i_ a ./ p =-48,8° (C = 1, éthanol) Point de fusion = 41,5°C. EXEMPLE 14 En suivant le mode opératoire de 1 'exemple 2 mais en utLlisant 20 Aerobacter cloacac IAM 1134 au lieu de Micrococcus varians IAM 1314, le rendement en produit réactionnel est de 1,76 g et l'analyse par chromatographie gazeuse montre la présence de 13,8 7. de 1-menthol et 0,07. de 1-isomenthol. On traite le produit réactionnel de la même manière qu'à l'exemple l en obtenant 0,3 g de 1-menthol. 20 25 iaJ D =-49,9° (C = 5, éthanol). EXEMPLE 15 En suivant le mode opératoire de l'exemple 12, mais en utilisant Agrobacterium tumefaciens IAM 1525, au lieu de Arthrobacter simplex IAM 1660, on obtient 3,2g de produit réactionnel. On soumet ledit produit réactionnel 30 à la distillation à la vapeur d'eau en obtenant 0,87 g de cristaux de 1-menthol. - - 20 !_ ot / p =-48,8° (C = 5 éthanol). 70 27840 15 2053218 REVENDICATIONS 1 - Procédé pour l'isolement biochimique du 1-menthol, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants : on hydrolyse sélectivement une substance choisie parmi un ester d'acide carboxy- 5 lique organique de dl-menthol et un mélange d'esters d'acide carboxylique organique d'isomères de dl-menthol contenant du dl-menthol, l'acide carboxylique organique utilisé pour former l'ester étant choisi parmi l'acide formique et les acides gras de formule générale RCOOH, dans laquelle R est choisi parmi un radical alkyle et un radical alkényle ayant chacun de 1 à 21 10 atomes de carbone, en effectuant l'hydrolyse sélective par une hydrolase d'ester carboxylique produite sous l'action d'un microrganisme appartenant aux genres des microrganismes suivants : Sarcina, Nocardia, Micrococcus, Alcaligènes, Pseudomonas, Brevibacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium, Flavobacterium, 15 Mycobacterium et Arthrobacter, et on sépare le 1-menthol optiquement actif à partir du mélange réactionnel enzymatique. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide carboxylique est l'acide acétique. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé m ce qu'on 20 conduit l'hydrolyse à une température comprise entre 25 et environ 45°C. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'estersd'acide carboxylique organique est comprise dans l'intervalle d'environ 2 à environ 207. en poids, par rapport au milieu de culture. 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 25 l'on utilise l'enzyme sous la forme de cdlules de microrganismes en cours de croissance active, provenant des microrganismes des genres définis à ladite revendication 1. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise l'enzyme sous la forme d'un extrait exempt de cellules, produit à partir 30 desdits microrganismes.