אנזים הגבלה

EcoRI]]
אנזימי הגבלה (באנגלית: Restriction enzymes) הם אנזימים המסוגלים לחתוך קטעי DNA באזורים מסוימים מאוד.

== אופן פעולה ==
כל אנזים הגבלה מזהה רצף נוקלאוטידים ייחודי ב-DNA, נצמד אליו וחותך את הסליל הכפול במקום ההיצמדות. הרצף או אתר ההגבלה ייחודי לכל אנזים, ומורכב מ-4 עד 12 נוקלאוטידים: לדוגמה, אנזים ההגבלה EcoRI מזהה את הרצף הבא:

* 3' GAATTC 
* 5' CTTAAG
אנזימים רבים מזהים אתר מטרה פלינדרומי, כלומר אתר שבו רצף הדנ"א זהה בשני הגדילים ולכן ניתן לקריאה משני הצדדים.

האנזים ייצמד אל כל מקום ב-DNA שבו קיים רצף זה. החיתוך שהאנזים מבצע יכול להתרחש במרכז הרצף (כך שברצף לעיל יתקבלו שלושה נוקלאוטידים מצד ימין ושלושה משמאל), אך במרבית המקרים הגדיל נחתך בצורה לא סימטרית, בחיתוך מדורג, דבר המביא ליצירת קצוות דביקים:

* 3' G|AATTC
* 5' CTTAA|G

הקו מציין את מקום החיתוך; אופן החיתוך גם הוא ספציפי לכל אנזים הגבלה, ואינו אקראי (כלומר, האנזים EcoRI יחתוך את הרצף תמיד בצורה המוצגת לעיל).

כל אנזימי ההגבלה הם סוגים של אנדונוקלאזות (אנזימים החותכים DNA באמצע הגדיל, זאת בניגוד לאקסונוקלאזות, המפרקים נוקלאוטידים מקצוות הגדיל). אנזימי הגבלה נמצאים באופן טבעי בחיידקים רבים, שם הם משמשים כמנגנון הגנה בפני בקטריופאג'ים (האנזימים חותכים את ה-DNA של הפאג' וגורמים להרס הפאג', בעוד ה-DNA של החיידק ממותל ולא מושפע מאנזים ההגבלה). שמות אנזימי ההגבלה ניתנים להם על שם החיידק שבו נמצאו: EcoRI נמצא ב-E. coli; ה-R מייצג זן ספציפי של החיידק (RY13). קיימים שלושה סוגים של אנזימי הגבלה, המסומנים באותיות II ,I ו-III; כל סוג משתמש בשיטה שונה במקצת לחיתוך ה-DNA.

אנזים ההגבלה HindIII, למשל, נמצא בחיידק Haemophilus influenzae והוא אנזים מסוג III.

לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו.

==סוגים==
את אנזימי ההגבלה מחלקים לשלושה סוגים, המסומנים באותיות II ,I ו-III, על פי מאפיינים כמו הרכב, קופקטורים הדרושים לפעולתם, אופן החיתוך שלהם ומיקום אתר חיתוך ה-DNA שלהם ביחס לרצף המטרה.
* סוג I () – החיתוך מתבצע בריחוק מאתר ההכרה. לפעולתו נדרש ATP ו-S-אדנוזיל-L-מתיונין. פעילותם של אנזימים אלו היא הגבלה ומתילציה ().
* סוג II () – החיתוך מתבצע בתוך או במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעולתם נדרש לרוב מגנזיום; פעילותם של אנזימים אלו מוגבלת כאנזים הגבלה והם לא מבצעים מתילציה.
* סוג III () – החיתוך מתבצע במרחק קצר מאתר ההכרה; לפעילותם נדרש ATP (אך הם לא מפרקים אותו); S-אדנוזיל-L-מתיונין מזרז את התגובה אך אינו נדרש; קיימים כחלק מקומפלקס עם מתיל טראנספראז ().

===סוג I===
אנזימי הגבלה סוג I היו הראשונים שהתגלו וזוהו לראשונה בשני גזעים שונים (K-12 and B) של E. coli. אנזימים אלו חותכים באתר שונה מאתר ההכרה, במרחק של יותר מ-1,000 זוגות בסיסים. החיתוך מתרחש בעקבות תהליך של טרנסלוקציה DNA. אתר ההכרה הוא אסימטרי ומורכב משני חלקים: אחד הכולל 3–4 נוקלאוטידים, ואחר הכולל 4–5 נוקלאוטידים – המופרדים על ידי כ-6–8 נוקלאוטידים. לאנזימים אלו פעילות מגוונת, והם מבצעים הן פעילות של חיתוך והן פעילות של מודיפיקציה של הרצף, כתלות במצב המתילציה של DNA המטרה. הקופקטורים S-אדנוזיל-L-מתיונין (AdoMet), ATP ויוני מגנזיום (Mg<sup>2+</sup>) נדרשים לצורך פעילותם המלאה של אנזימים אלו. אנזימי הגבלה מסוג I מורכבים משלוש תת-יחידות:
*HsdR נדרש לצורך הגבלה (חיתוך)
*HsdM נדרש להוספת קבוצות מתיל ל-DNA (פעילות מתילטרנספראז)
*HsdS חיוני לספציפיות של אתר ההכרה (DNA-binding) בנוסף לפעילויות ההגבלה והמתילציה

=== סוג II ===
EcoRI (גדילי תכלת וירוק) הקשור ל-DNA דו גדילי (גדילים חומים). שני יוני מנגן בעלי תפקיד קטליטי (אחד בכל מונומר) מוצגים ככדורים סגולים והם סמוכים לאתרי החיתוך בDNA]]

קיימים מספר הבדלים בין אנזימי הגבלה סוג II לאנזימי הגבלה סוג I. אנזימי סוג II טיפוסיים הם הומודימרים, אתרי ההכרה שלהם הם פלינדרומים ואינם מופרדים, ואורכם 4–8 נוקלאוטידים, החיתוך נעשה באתר ההכרה, והם לא צריכים ATP או AdoMet לפעילותם – לרוב הם צריכים רק Mg<sup>2+</sup> כקופקטור. אנזימים מסוג זה הם אנזימי ההגבלה הזמינים והנפוצים ביותר.

בשנות התשעים של המאה ה-20 ובתחילת שנות ה-2000, התגלו אנזימים חדשים מסוג זה שאינם עונים לקריטריונים הקלאסיים המגדירים אנזימים אלו, ובעקבות זאת הוגדרו תת-סוגים לחלוקת אנזימים מסוג זה לתת קטגוריות בהתבסס על מאפיינים טיפוסיים. תת-קבוצות אלו מיוצגות על ידי אות סיומת: 

{| class="wikitable" border="1"
! סוג !! תיאור !! דוגמה
|-
| IIB || הם מולטימרים, המכילים יותר מתת יחידה אחת. הם חותכים את DNA באתר ההכרה משני צידיו. לפעולתם נדרשים הקופקטורים AdoMet ו-Mg<sup>2+</sup>. || BcgI ו-BplI
|-
| IIE || חותכים DNA בעקבות אינטראקציה עם שני העתקים של רצף ההכרה שלהם. אתר הכרה אחד משמש כמטרת החיתוך, ואילו השני משמש כגורם אלוסטרי המאיץ או משפר את יעילות החיתוך. || NaeI
|-
| IIF || דומים לאנזימי IIE, והם פועלים על שני העתקים של רצף ההכרה שלהם, אולם הם חותכים את שני הרצפים במקביל. || NgoMIV
|-
| IIG ||הם בעלי תת-יחידה אחת, בדומה לאנזימי סוג II קלאסיים, אולם לפעולתם נדרש הקופקטור AdoMet. || Eco57I
|-
| IIM || מסוגלים לזהות ולחתוך DNA שעבר מתילציה. || DpnI
|-
| IIS || חותכים DNA במרחק מוגדר מאתרי ההכרה הלא פלינדרומים האסימטריים שלהם. אנזימים אלו עשויים לתפקד כדימרים. || FokI
|-
|IIT || מורכבים משתי תת-יחידות שונות. חלק מהם מזהים רצפים פלינדרומים ואילו לאחרים יש אתרי הכרה אסימטריים. || Bpu10I ו-BslI
|}

=== סוג III ===
אנזימי הגבלה סוג III (כדוגמת EcoP15) מזהים שני רצפים לא פלינדרומים נפרדים הפוכים. החיתוך נעשה לאחר כ-20–30 זוגות בסיסים אחרי אתר ההכרה. אנזימים אלו מכילים יותר מתת-יחידה אחת ודורשים AdoMet ו-ATP לצורך מתילציה וחיתוך, בהתאמה. הם חלק ממכניזם ההגבלה-מודיפיקציה של DNA של פרוקריוטיים אשר מגן על האורגניזם מפני פלישת DNA זר. אנזימי סוג III הם חלבונים הטרו-אוליגומטרים המורכבים משתי תת-יחידות:
*Mod מזהה את רצף הDNA הספציפי למערכת והיא מתילטרנספראז; ככזו היא דומה מבחינה פונקציונלית לתת יחידות M ו-S של אנזימי הגבלה סוג I.
*Res נדרש לצורך הגבלה, אף על פי שאין לו פעילות אנזימטית בפני עצמו. 
אנזימי סוג III מזהים רצף DNA קצר באורך של 5–6 זוגות בסיסים וחותכים במורד (downstream; מכיוון 5' לכיוון 3') 25-27 זוגות בסיסים. על מנת שההגבלה תתבצע נדרשים שני אתרי הכרה הפוכים. אנזימים אלו מוסיפים קבוצת מתיל רק לגדיל אחד של ה-DNA, ודי בכך כדי להגן מפני הגבלה.

=== אנזימי הגבלה מלאכותיים ===
אנזימי הגבלה מלאכותיים נוצרים על ידי איחוד של מתחם קושר DNA טבעי או מהונדס למתחם נוקלאזי (מתחם נוקלאזי לדוגמה הוא זה של אנזים ההגבלה FokI). את אנזימי ההגבלה המלאכותיים ניתן להנדס כך שיקשרו לאתרי DNA ארוכים (עד 36 זוגות בסיסים) ולהיקשר לרצפי DNA רצויים. נוקלאזות אצבעות אבץ הם אנזימי ההגבלה המלאכותיים הנפוצים ביותר ולהם שימושים בתחום ההנדסה הגנטית, אך גם שימושים בשיבוט גנטי סטנדרטי. דוגמה אחרת לאנזימי הגבלה מלאכותיים היא כאלו המתבססים על מתחם קושר DNA של חלבוני TAL שמקורם מהחיידק Xanthomonas.

==שימושים==

לאנזימי ההגבלה חשיבות עליונה בביולוגיה מולקולרית, בהנדסה גנטית ובביוטכנולוגיה; גילוים חולל מהפכה של ממש בתחומים אלו. החשיבות נעוצה בקצוות הדביקים הנוצרים לאחר חיתוך ה-DNA. בקטע שהוצג לעיל, שבו האנזים חותך את הקטע בקצה, קיימים לאחר החיתוך חמישה נוקלאוטידים חופשיים, אשר אינם מזווגים לנוקלאוטידים אחרים; אם ייפגשו נוקלאוטידים אלו עם נוקלאוטידים מקבילים בקטע DNA אחר (כלומר, A ייפגש עם T ו-C ייפגש עם G), הרי ששני הקטעים יתחברו ליצירת סליל DNA חדש. 

זוהי השיטה העיקרית שבה משתמשים הביולוגים לחיבור גדילי DNA. השיטה מאפשרת השתלה של גנים בתוך הגנום הקיים של יצור מסוים, ומכאן חשיבותה הרבה. ניתן, למשל, להשתיל את הגן המייצר את ההורמון אינסולין, החיוני לחולי סוכרת, בתוך תאו של חיידק; הגן ישתלב בחומר התורשתי של החיידק, והחיידק יתחיל לייצר אינסולין. לאחר שהחיידק יתחלק (באמצעות מיטוזה), שני הצאצאים יישאו אף הם את גן האינסולין וייצרו אף הם את ההורמון. אם הגן הושתל לתוך פלסמיד, הרי שהחיידק מסוגל עתה להעביר את הגן לחיידקים אחרים באמצעות קוניוגציה. לאחר זמן קצר מתקבלת מושבת חיידקים ענקית המייצרת כמויות נכבדות של אינסולין.

באמצעות אנזימי הגבלה ניתן גם לזהות קטעי DNA שהרצף שלהם ידוע. ניתן לחפש ברצף ה-DNA שאותו מעוניינים לבדוק אתרי הגבלה לאנזימים ידועים, ולבצע חיתוך בעזרת אנזימים אלו. בנוסף, חיתוך באנזימי הגבלה מאפשר שרטוט מפות הגבלה של מקטע מסוים ב-DNA, המספקות מידע חיוני ביותר למהנדסי ביוטכנולוגיה בעת הנדסה הגנטית. לאחר החיתוך מתקבלים כמה מקטעים בגדלים שונים, שניתן לנתח אותם באמצעות אלקטרופורזה.

==דוגמאות==
מבנה קריסטלוגרפי של אנזים ההגבלה HindIII שהוא דימר (מופיע בירוק ותכלת) מצומד ל-DNA דו-גדילי (חום) 
קיימים למעלה מ-3,500 אנזימי הגבלה שנחקרו, ויותר מ-600 מהם נמכרים באופן מסחרי. 

להלן טבלה של כמה אנזימי הגבלה מוכרים:

{| class="wikitable sortable" border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:1px solid #aaa; border-collapse:collapse"
! אנזים !! אורגניזם מקור !! רצף הכרה !! חיתוך
|- style="direction:ltr;"
|EcoRI||Escherichia coli
|
 5'GAATTC
 3'CTTAAG
|
 5'---G AATTC---3'
 3'---CTTAA G---5'
|- style="direction:ltr;"
|EcoRII||Escherichia coli
|
 5'CCWGG
 3'GGWCC
|
 5'--- CCWGG---3'
 3'---GGWCC ---5'
|- style="direction:ltr;"
|BamHI||Bacillus amyloliquefaciens
|
 5'GGATCC
 3'CCTAGG
|
 5'---G GATCC---3'
 3'---CCTAG G---5'
|- style="direction:ltr;"
|HindIII||Haemophilus influenzae
|
 5'AAGCTT
 3'TTCGAA
|
 5'---A AGCTT---3'
 3'---TTCGA A---5'
|- style="direction:ltr;"
|TaqI||Thermus aquaticus
|
 5'TCGA
 3'AGCT
|
 5'---T CGA---3'
 3'---AGC T---5'
|- style="direction:ltr;"
|NotI||Nocardia otitidis
|
 5'GCGGCCGC
 3'CGCCGGCG
|
 5'---GC GGCCGC---3'
 3'---CGCCGG CG---5'
|- style="direction:ltr;"
|HinfI||Haemophilus influenzae
|
 5'GANTCA
 3'CTNAGT
|
 5'---G ANTC---3'
 3'---CTNA G---5'
|- style="direction:ltr;"
|Sau3A||Staphylococcus aureus
|
 5'GATC
 3'CTAG
|
 5'--- GATC---3'
 3'---CTAG ---5'
|- style="direction:ltr;"
|PovII*||Proteus vulgaris
|
 5'CAGCTG
 3'GTCGAC
|
 5'---CAG CTG---3'
 3'---GTC GAC---5'
|- style="direction:ltr;"
|SmaI*||Serratia marcescens
|
 5'CCCGGG
 3'GGGCCC
|
 5'---CCC GGG---3'
 3'---GGG CCC---5'
|- style="direction:ltr;"
|HaeIII*||Haemophilus aegyptius
|
 5'GGCC
 3'CCGG
|
 5'---GG CC---3'
 3'---CC GG---5'
|- style="direction:ltr;"
|HgaI||Haemophilus gallinarum
|
 5'GACGC
 3'CTGCG
|
 5'---NN NN---3'
 3'---NN NN---5'
|- style="direction:ltr;"
|AluI*||Arthrobacter luteus
|
 5'AGCT
 3'TCGA
|
 5'---AG CT---3'
 3'---TC GA---5'
|- style="direction:ltr;"
|EcoRV*||Escherichia coli
|
 5'GATATC
 3'CTATAG
|
 5'---GAT ATC---3'
 3'---CTA TAG---5'
|- style="direction:ltr;"
|EcoP15I||Escherichia coli
|
 5'CAGCAGN<sub>25</sub>NN
 3'GTCGTCN<sub>25</sub>NN
|
 5'---CAGCAGN<sub>25</sub>NN ---3'
 3'---GTCGTCN<sub>25</sub> NN---5'
|- style="direction:ltr;"
|KpnI||Klebsiella pneumoniae
|
 5'GGTACC
 3'CCATGG
|
 5'---GGTAC C---3'
 3'---C CATGG---5'
|- style="direction:ltr;"
|PstI||Providencia stuartii
|
 5'CTGCAG
 3'GACGTC
|
 5'---CTGCA G---3'
 3'---G ACGTC---5'
|- style="direction:ltr;"
|SacI||Streptomyces achromogenes
|
 5'GAGCTC
 3'CTCGAG
|
 5'---GAGCT C---3'
 3'---C TCGAG---5'
|- style="direction:ltr;"
|SalI||Streptomyces albus
|
 5'GTCGAC
 3'CAGCTG
|
 5'---G TCGAC---3'
 3'---CAGCT G---5'
|- style="direction:ltr;"
|ScaI||Streptomyces caespitosus
|
 5'AGTACT
 3'TCATGA
|
 5'---AGT ACT---3'
 3'---TCA TGA---5'
|- style="direction:ltr;"
|SpeI||Sphaerotilus natans
|
 5'ACTAGT
 3'TGATCA
|
 5'---A CTAGT---3'
 3'---TGATC A---5'
|- style="direction:ltr;"
|SphI||Streptomyces phaeochromogenes
|
 5'GCATGC
 3'CGTACG
|
 5'---GCATG C---3'
 3'---C GTACG---5'
|- style="direction:ltr;"
|StuI||Streptomyces tubercidicus
|
 5'AGGCCT
 3'TCCGGA
|
 5'---AGG CCT---3'
 3'---TCC GGA---5'
|- style="direction:ltr;"
|XbaI||Xanthomonas badrii
|
 5'TCTAGA
 3'AGATCT
|
 5'---T CTAGA---3'
 3'---AGATC T---5'
|-
| colspan="4"| * = קצוות חלקים (blunt ends). N = C או G או T או A. W = A או T
|}

==קישורים חיצוניים==

* 

==הערות שוליים==

קטגוריה:גנטיקה מולקולרית
קטגוריה:ביולוגיה: שיטות ומכשור
קטגוריה:אנזימים