אתר תצורה גנומית

אתר תצורה גנומית (באנגלית: Topologically associating domain (TAD)) הוא מבנה כרומוזומלי, שבו תבנית הפתיחה והסגירה של הכרומטין משותפת לקבוצת גנים באותו אזור, וגורמת לאותם גנים להיות בעלי דגם ביטוי דומה.<ref>Bonev, B. et al. Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171, 557-572.e24 (2017).</ref> בשנת 2012 התגלו אתרי תצורה גנומית בזבוב התסיסה (דרוזופילה) וביונקים תוך שימוש ב-Hi-C - שיטת אנליזה לאיתור קרבה בין אתרים גנומיים.<ref name=":0">Sexton, T. et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell 148, 458–472 (2012).</ref><ref name=":1">Dixon, J. R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376–380 (2012).</ref> מבחינת מבנה ותפקיד ביולוגי, אתרי תצורה גנומית שמורים ברמה גבוהה לאורך האבולוציה<ref name=":2">Krefting, J., Andrade-Navarro, M. A. & Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biol. 16, 1–12 (2018).</ref>. למרות שאתרי תצורה גנומית תוארו ביצורים רב-תאיים בלבד, גם בשמרים ובבקטריה יש מבנים כרומוזומליים עם תפקיד דומה<ref name=":3">Szabo, Q., Bantignies, F. & Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci. Adv. 5, (2019).</ref>. אף על פי שמנגנון ההיווצרות של אתרי תצורה גנומית אינו מובן באופן מלא, הוא מוסבר על ידיי מודל loop extrusion.<ref name=":4">Sikorska, N. & Sexton, T. Defining Functionally Relevant Spatial Chromatin Domains: It is a TAD Complicated. J. Mol. Biol. 432, 653–664 (2020).</ref> מחקרים מצביעים על כך ששיבושים במיקום של אתרי תצורה גנומית גורמים להפרעות התפתחותיות בעוברי עכברים<ref name=":5">Lupiáñez, D. G., Spielmann, M. & Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends Genet. 32, 225–237 (2016).</ref>. מוטציות באזורים של אתרי תצורה גנומית בבני אדם עלולות לגרום למחלות<ref name=":5" />. בנוסף, דווח על קשר בין מוטציות באתרי תצורה גנומית לבין התפתחות סרטן, מה שתומך בתפקידם של אזורי בקרה גנומיים בפעילות התקינה של התא, הרקמה והאורגניזם.<ref name=":6">Valton, A. L. & Dekker, J. TAD disruption as oncogenic driver. Curr. Opin. Genet. Dev. 36, 34–40 (2016).</ref>

== מבנה ותפקיד ביולוגי ==
אתרי תצורה גנומית הם חלק אחד מתוך מערכת שלמה שאחראית לארגון תלת-ממדי של הגנום<ref name=":7">Gibcus, J. H. & Dekker, J. The Hierarchy of the 3D Genome. Mol. Cell 49, 773–782 (2013).</ref>. כרומוזומים מאורגנים במבנה כרומטין (המורכב מהאינטראקציה בין DNA עם חלבוני היסטון וחלבונים נוספים הקושרים DNA), ומקומם בגרעין מוגדר לשטחים כרומוזומליים (chromosome territory), בגודל הנע בין 1–2 מיקרון<ref name=":7" />. ארגון הכרומוזומים בגרעין קשור לפעילות הגנים המקודדים בהם: כרומוזומים המקודדים למספר רב של גנים פעילים מתרכזים קרוב יותר לאמצע הגרעין, לעומת כרומוזומים עם פחות גנים פעילים אשר נוטים להתמקם סמוך לממברנת הגרעין<ref name=":8">oyle, S. et al. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol. Genet. 10, 211–219 (2001).</ref>. בשטחים או בתחומים הכרומוזומליים שבגרעין (chromosome compartments), אינטראקציות בין אזורים גנומיים שונים משחקות תפקיד בסידור המבנה התלת-ממדי של הגנום בלולאות של 100kb עד מספר מיליוני בסיסים.<ref name=":7" /> התחומים הכרומוזומליים מכילים אתרי תצורה גנומית.<ref>Long, H. S. et al. Making sense of the linear genome, gene function and TADs. Epigenetics and Chromatin 15, 1–19 (2022).</ref><ref name=":7" /> בנוסף, כרומוזומים מחולקים לפי רמת הביטוי של הגנים בתוכם לשתי קבוצות הקרויות מדור A (פעיל) ומדור B (אזור מושתק)<ref name=":7" />. תחומים כרומוזומליים, וכן אתרי תצורה גנומית, מכילים את שתי קבוצות הגנים.

אתרי תצורה גנומית הם אזורים בעלי תפקיד חיוני לבקרת ביטוי גנים, שכן הם מאפשרים אינטראקציה בין אזורים בקרתיים.<ref name=":4" /> ביטוי גנים ברמת רנ"א תלוי בהפעלת קדם (promoter) על ידי מגבירי ביטוי גנים - מעצמים (enhancers).<ref name=":4" /> הפעלת קדם דורשת אינטראקציה בין הקדם לבין מעצם, שבלעדיה לא יתקיים תעתוק. לפי רצף דנ"א, מעצמים רבים נמצאים במרחק שאינו מאפשר הפעלת קדם על ידי אינטראקציה.<ref name=":4" /> הלולאות של דנ"א שנוצרות באתרי תצורה גנומית מקרבות את המעצם לקדם ובכך מאפשרות את הפעלת התיעתוק של הגן<ref name=":4" />. רוב האינטראקציות מתקיימות בין אלמנטים שנמצאים באותו אתר תצורה גנומית, כיוון שאזורי אתרי התצורה הגנומית מבודדים זה מזה על ידי גבולות<ref name=":5" />.

יחידת TAD בצורה של פיתול. מעצם (צהוב) מתקרב לגן (אדום) ומגביר את הביטוי. חלבוניי cohesin וCTCF מייצבים את המבנה (להרחבה- ראו מנגנוני היוצרות TAD)

== מיפוי של אזורי TAD ==
אתרי תצורה גנומית התגלו ב-2012, ביונקים ובדרוזופילה במקביל.<ref name=":1" /><ref name=":0" /> התקדמות טכנית בשיטת מחקר מסוג Hi-C ,5C, הקרויה Chromatin conformation capture carbon copy, וכן השיטה הוותיקה יותר, 3C, הקרויה chromatin conformation capture, איפשרה ביצוע מחקר זה<ref name=":9">Dostie, J. et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299–1309 (2006).</ref><ref name=":1" />. הרעיון המשותף שעומד בבסיס כל השיטות הללו הut אפיון תדירות אינטראקציות בין אתרים בכרומוזומים, ביחס לרצפי דנ"א אחרים באותו מיקום כרומוזומאלי.<ref name=":1" /> בקצרה, שיטת 3C מתמקדת באיתור אינטראקציות בין אזור מוגדר מראש לאזורים אחרים בכרומוזום שנבחר. לכן, היה צורך בפיתוח שיטות לאפיון כל האינטראקציות האפשריות באזורים שונים ברחבי הגנום<ref name=":1" />. שימוש בשיטות 5C וHi-C, בנוסף לפיתוחים חדשים של שיטות אלה, מאפשר לאפיין מגוון רחב של אינטראקציות ברחבי הגנום הנחקר.<ref name=":8" /><ref name=":1" /> תוצאות של Hi-C או 5C מופיעות כ'מפת חום' (heat map).<ref name=":10">Song, F., Xu, J., Dixon, J., Yue, F. Analysis of Hi-C Data for Discovery of Structural Variations in Cancer. Methods Mol. Biol. 2301, (2022).</ref><ref>לדוגמה, ראו את התרשים בלינק הבא:

<nowiki>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34415534/#&gid=article-figures&pid=fig-3-uid-2</nowiki> .

ציר X מייצג מיקום בגנום, והריבועים מייצגים את התדירות היחסית של האינטראקציה הכרומוזומלית בין 2 נקודות ביחס למיקום בדנ"א. כדי לקרוא מפת Hi-C, ניתן לתאר 2 קווים שנפגשים באמצע של 2 נקודות בציר X, ויוצרים צורה של משולש. בכל נקודה, עוצמת הצבע של הריבוע עולה עם חוזק האינטראקציה: אדום כהה מייצג תדירות גבוהה של אינטראקציות, לעומת שטח לבן שמייצג מיעוט/חוסר באינטראקציות </ref><ref name=":1" />

בעזרת שיטות אלה נתגלו אזורים גנומיים בהם קיימת נטייה משמעותית ליצור אינטראקציות מקומיות; אזורים אלה זכו לכינוי: TAD (topologically associated domains)<ref>Belton, J. M. et al. Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods 58, 268–276 (2012).</ref><ref name=":9" />.

=== שימור אבולוציוני ===
השימור האבולוציוני של TAD במינים רב-תאיים, וקיום מבנים כרומוזומליים דומים בשמרים ובחיידקים, מדגישים את החשיבות של תפקידם הביולוגי.<ref name=":11"></ref> מיעוט מוטציות, ואף העדרן, במיוחד בגבולות ה-TAD, מעיד על לחץ סלקציה שלילי המתבטא בשימור אבולוציוני<ref name=":11" />. במהלך הזמן, ועם פיצול מינים, השוני העיקרי שהתרחש מבחינת TAD הוא שינוי במיקומי TADs באותו הכרומוזום.<ref>McArthur, E. & Capra, J. A. Topologically associating domain boundaries that are stable across diverse cell types are evolutionarily constrained and enriched for heritability. Am. J. Hum. Genet. 108, 269–283 (2021).</ref><ref name=":4" />

עיבוד נתוני Hi-C של מינים שונים הראה, שבזמן היוצרות מינים חדשים, קיים שימור של גבולות TAD אפילו בין יצורים רחוקים אבולוציונית<ref name=":2" /><ref name=":4" /><ref>Sikorska, N. & Sexton, T. Defining Functionally Relevant Spatial Chromatin Domains: It is a TAD Complicated. J. Mol. Biol. 432, 653–664 (2020).

ראו את הנתונים בחלק B בלינק הבא:

<nowiki>https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-018-0556-x/figures/2</nowiki>

בציר X המיקום בגנום ביחס לגבול TAD-TAD. בציר Y השימור אבולוציוני ביחס למיקום הגנומי המיוצג בציר X . Breakpoint הוא שבירה בDNA שהתרחשה במהלך האבולוציה. כלומר, breakpoint הוא מקום עם מעט אירועי DNA shuffling, או מקום שמור.</ref> השוואת Hi-C בין שימפנזה, יונקי כיס (אופוסום), בקר, ודג זברה, הראתה שאזור הגבולות של TAD שמור ביותר<ref name=":2" />. פיצול מינים אלה במהלך 450 מיליון שנים מדגיש את השימור ארוך השנים של TADs באבולוציה של חולייתנים.<ref name=":2" />

מיפוי כרומוזומאלי הראה שכרומוזומים של דרוזופילה מחולקים על ידי גבולות ברורים, ומותאמים לפי אזורים של ביטוי גנים פעילים, בדומה ל-TAD של יונקים.<ref name=":3" /> במינים רבים של צמחים גם כן נמצאו TAD. לדוגמה, בכרומוזומים של אורז וכותנה אזורי TAD מועשרים בביטוי גנים פעיל<ref name=":3" />.

מבנים דומים ל-TAD בצורתם ובתפקידם נמצאו ביצורים חד תאיים.<ref>Fudenberg, G. et al. Formation of Chromosomal Domains by Loop Extrusion. Cell Rep. 15, 2038–2049 (2016).</ref> בשמרים מסוג S. pombe קיימות יחידות מבניות בגודל של כ-100 kb עם קשירה של החלבון cohesin בגבולות בין היחידות השונות, שבתוכן נמצאים גנים המבוקרים יחד.<ref name=":12">Mizuguchi, T. et al. Cohesin-dependent globules and heterochromatin shape 3D genome architecture in S. pombe. Nature 516, 432–435 (2014).</ref> בבקטריה, כגון Bacillus subtilis ו-Caulobacter crescentus, קיימים גנים המבקרים יצירת אינטראקציה בין אזורים שונים בגנום החיידק.<ref name=":3" />

=== מנגנוני ההיווצרות של TAD ===
כיום, המודל העיקרי העומד בבסיס האינטראקציות המבניות ב-TADs הוא loop extrusion model, שנחקר בעיקר ביונקים.<ref name=":4" /> TADs מקבלים צורת לולאה עקב פעילות משותפת של קבוצת חלבונים, שהבולטים שבהם הם CTCF ו-cohesin.<ref name=":1" /><ref name=":13">Vian, L. et al. The Energetics and Physiological Impact of Cohesin Extrusion. Cell 173, 1165-1178.e20 (2018).</ref> כפי שניתן לראות באיור 5, שתי יחידות של cohesin קושרות אזור כרומטיני בשני קצותיו, ומושכות את הדנ"א לצורת לולאה. בזמן שcohesin מושך את הדנ"א, שתי יחידות של CTCF מתקרבות ללולאה משני הצדדים. ברגע שcohesin מתקרב לחלבון בCTCF, נוצר מבנה יציב של TAD.<ref name=":13" /> לולאות אלה, בגודל של כ-1.5 מיליוני בסיסים, נצפו מבעד לעדשת המיקרוסקופ.<ref name=":7" />

המנגנון של loop extrusion מתרחש באופן אקטיבי, תלוי-ATP.<ref name=":13" /> עיקוב של יצירת ATP בתאים של בני אדם מנע את היווצרות הלולאות של TAD.<ref name=":13" /> היווצרות TAD מתרחשת בשלב האינטרפאזה במחזור החיים של התא, בשל הצורך הרב בבקרת ביטוי גנים.<ref name=":13" />

לאחר טעינת cohesin (עיגולים סגולים), Cohesin מוטח את הדנ"א ומקרב את CTCF (משולשים שחורים) מ-2 הצדדים. כתוצאה, מתבצעת יוצרות פיתולים והיתייצבות של ה-TAD

היווצרות TAD, בדומה למסלולים רבים בביולוגיה של התא, הנה דינמית. בכרומוזומים, TADs נבנים ומתפרקים באופן תדיר. יציבותו של TAD נשמרת לפרק זמן שמותאם לתפקוד התאים.<ref name=":4" /> בנוסף לcohesin ול- CTCF ישנם חלבונים שתפקידם להוליך, לקשור את חלבון ה-cohesin לכרומטין או לשחרר אותו משם.<ref name=":4" /> לדוגמה, עיקוב של החלבון WAPL, אשר משחרר את cohesion מהכרומטין, גורם לשינויים במרחק האינטראקציות שמתרחשות בין גנים ומעצמים (אינהנסרים).<ref>Uusküla-Reimand, L. et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biol. 17, 1–22 (2016).</ref><ref name=":14">Haarhuis, J. H. I. et al. The Cohesin Release Factor WAPL Restricts Chromatin Loop Extension. Cell 169, 693-707.e14 (2017)</ref> נתגלה, כי מרחק האינטראקציות ב-TAD, וכמובן גודל הלולאות, גדלים על ידי עיקוב פעילות של החלבון WAPL.<ref name=":12" /> בנוסף, גבולות TAD מועשרים בחלבון topoisomerase II, שתפקידו לשחרר לולאות בדנ"א באמצעות חיתוכים.<ref name=":14" /> ממצא זה מחזק את מודל loop extrusion כי מתח פיזי בדנ"א הוא תופעה צפויה באזור בלולאות תקינות של ה-TAD.<ref name=":14" /> עם זאת, רבים מאתרי הקישור של חלבון ה-CTCF תוארו במקומות שאינם בקצוות של TAD, מה שמרמז על קיומם של פקטורים נוספים המבקרים את גבולות ה-TADs.

ה-loop extrusion model לא רק מתאר כיצד נבנים ה-TADs, אלה גם נותן הסבר מנגנוני לפעילות של ריכוזי מעצמים ומעצמי-על (super enhancers).<ref name=":15">Grosveld, F., Van Staalduinen, J. & Stadhouders, R. Transcriptional Regulation by (Super)Enhancers: From Discovery to Mechanisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 22, 127–146 (2021)</ref> מעצמי-על, כגון ה-Locus control region (LCS) המבקר את פעילות הגנים ממשפחת הבתא-גלובין באדם (מעצם-העל הראשון שנתגלה), מורכבים מקבוצות מעצמי גנים, שפועלים באופן מתואם.<ref name=":15" /> אכן, אזורים בתוך מעצם העל של משפחת גני הגלובין נמצא בגבול של TAD.<ref>Kim, J., Kang, J., Kim, Y. W. & Kim, A. R. The human β-globin enhancer LCR HS2 plays a role in forming a TAD by activating chromatin structure at neighboring CTCF sites. FASEB J. 35, 1–12 (2021).</ref>

מנגנונים העומדים בבסיס הקשר בין היווצרות TADs לבקרת תהליכי שכפול DNA, תעתוק, ושינויים בקשירת חלבוני היסטון ועריכתם על ה-DNA עדיין אינם מובנים לעומק<ref>Pope, B. D. et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature 515, 402–405 (2014).</ref><ref name=":1" /><ref name=":0" />. כמו כן, הבנת הקשר בין שינויים ב-TAD להשפעה על תפקוד התאים, הפנוטיפ, ומחלות תורשתיות באדם עדיין בחיתוליה<ref name=":4" />. עם זאת, בעוברי עכברים, עיקוב של שכפול מבטל היווצרות TAD, ועיקוב תיעתוק לא משפיע על היווצרות TADs.<ref>Ke, Y. et al. 3D Chromatin Structures of Mature Gametes and Structural Reprogramming during Mammalian Embryogenesis. Cell 170, 367-381.e20 (2017).</ref> ממצא זה משמש רמז לתפקיד החשוב של TADs בבקרת פעילות התא והאורגניזם.

=== TAD ומחלות בבני אדם ===
עקב החיוניות של תפקידם הביולוגיים של ה-TAD, ירידה בתפקוד ה-TADs עלולה לעמוד בבסיס מחלות תורשתיות או להוליך להתפתחות סרטן.<ref>Gröschel, S. et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in Leukemia. Cell 157, 369–381 (2014).</ref><ref name=":5" />. מחקר שנעשה בעכברים מעיד על החשיבות של היווצרות ותפקוד באזורים של TAD למחלות<ref name=":5" />. לדוגמה, מחקר בעכברים הראה, כי מוטציה בגבול של -TAD המכיל גנים המעורבים בהתפתחות הגפיים, גורמת להתפתחות לא תקינה במבנה מפרק הרגל של העכבר; לעומת זאת, חסר שהתרחש בתוך TAD זה לא השפיע על הפנוטיפ<ref name=":5" />.

בבני אדם, גילו מתאם בין מוטציות באזור גנומי של TAD לבין מחלות.<ref name=":4" /> קיים קשר בין מחלות ניורולוגיות, כמו autosomal dominant leukodystrophy(ADLD), ומחלות תורשתיות שמובילות להפרעות אנטומיות, כמו F-syndrome וmesomelic dysplasia<ref name=":5" />.

מוטציות ב-TAD שנצברות במהלך החיים יכולות להשפיע על מסלולי התפתחות סרטן, כמו לוקמיה מיאלואידית חריפה ו-medulloblastoma.<ref>Northcott, P. A. et al. Enhancer hijacking activates GFI1 family oncogenes in medulloblastoma. Nature 511, 428–434 (2014).</ref> שיבוש בגבולות של TAD עשוי להוליך לפגם בבקרת ביטוי של גנים, תהליך שעלול לתרום להתפתחות סרטן.<ref name=":6" />

== קישורים חיצוניים ==

* [https://www.youtube.com/watch?v=wMkbr55S35k&t=775s Jian Ma | Comparing 3D Genome Organization | CGSI 2019] (הרצאה)
* [https://www.youtube.com/watch?v=Szmq4KMrG78 Prof. Daniel Panne: Structural insights into genome folding by CTCF and cohesin] (הרצאה)

== הערות שוליים ==

קטגוריה:גנטיקה