# Reacções de fase II

Reacções de fase II ou também chamadas reacções de conjugação são de natureza sintética e mais rápidas que as reacções de fase I. Estas reacções envolvem a conjugação ou adição de compostos endógenos (glutationa, aminoácidos, sulfato). Com excepção da acetilação e da metilação, a conjugação torna a molécula inicial mais polar e hidrofilica facilitando a excreção e desta forma tornando-a menos susceptível de exercer o seu efeio tóxico. A maioria das enzimas de conjugação estão localizadas no citosol, excepto a UDP-glucuronosiltransferase, que é uma enzima microssomal.

## Glucuronidação

É a mais importante reacção de conjugação do tipo 1, e ocorre na maioria das espécies com uma ampla variedade de substratos, incluindo substâncias endógenas. É também a mais importante via de biotransformação dos xenobióticos nos Mamíferos, excepto na família dos felinos (leões, linces, e gatos domésticos entre outros).
O ácido glucurónico é um hidrato de carbono polar e solúvel em água, que pode ser adicionado a grupos hidroxilo, ácido carboxílico, amino e tióis.
A glucuronidação envolve a transferência de ácido glucurónico na forma activada - o ácido uridina difosfato glucurónico (UDPGA) - a grupos hidroxilo e carboxiilo e por vezes a átomos de carbono.O UDPGA é formado no citosol a partir de glicose-1-fosfato através de uma reacção em dois passos.
A enzima catalisadora da reacção de conjugação é a UDP-glucuronosiltransferase (UGT), que está predominantemente localizada no reticulo endoplasmático do fígado e de outros tecidos (como por exemplo do rim, tracto gastrointestinal, pulmões, prostata, glândulas mamárias, pele, cérebro, baço, e mucosa nasal).
Há pelo menos 50 isoformas funcionais diferentes nos mamíferos, em que pelo menos 16 estão presentes nos Humanos, sendo as duas principais famílias a UGT1 e a UGT2. Existem variadas formas desta enzima, cada uma com diferentes especificidades para um determinado substrato preferido. Por exemplo: os fenóis podem ser substratos para UGT1A8 mas também para as UGT1A1 e UGT1A6; ácidos carboxílicos são substratos para UGT1A8 e UGT1A3; aminas primárias são substratos para UGT1A6, UGT1A8 e UGT1A4.

## Sulfatação

A formação de ésteres de sulfato é a principal via de conjugação para vários tipos de grupos hidroxilo, e também pode ocorrer com grupos amina.
Assim, os seus substratos incluem álcoois alifáticos, fenóis, aminas aromáticas, e compostos endógenos (tais como esteróides e carbohidratos).
O dador de sulfato para esta reacção do tipo 1 (o co-factor) está na sua forma activada e é denominado PAPS (3´fosfoadenosil-5’-fosfosulfato), o qual é formado a partir de um sulfato inorgânico SO4-2 e ATP, numa reacção em dois passos.
Primeiro passo: a reacção é catalisada pela ATP sulfurilase, a qual converte o ATP e SO4-2 em pirofosfato e APS (adenosina-5-fosfosulfato). Segundo passo: é catalisado pela ATP quinase, a qual transfere um grupo fosfato do ATP para a posição 3 do APS.
A conjugação é catalisada pelas enzimas sulfotransferases (SULTs), as quais estão localizadas no citosol e é particularmente encontrada no fígado, mucosa gastrointestinal, rins, pulmões, plaquetas e cérebro.
Existem pelo menos 5 famílias de sulfotransferases, que por sua vez são divididas em subfamilias, e que resulta em pelo menos 50 isoformas desta enzima.
Nos mamíferos há duas principais classes de SULTs: 1) SULTs ligados à membrana, no complexo de Golgi (responsáveis, por exemplo, pela sulfonação de glicosaminoglicanos, proteínas e péptidos como a colecistoquinina e os factores V e VIII) 2) SULTs solúveis no citoplasma
Estas diferentes isoformas catalisam a sulfonação de diferentes substractos, como por exemplo fenóis (SULT1As), álcoois (SULT2As/SULT2Bs), arilaminas (SULT3A1), e ainda existem outras isoformas para a sulfonação de sais biliares e esteróides.
Sulfonação de álcoois alifáticos e fenóis, R-OH.
A sulfonação envolve a transferência de sulfonato SO-2 (e não de sulfato SO− 4 ) do PAPS para o xenobiótico.
Fonte de sulfato - Através da dieta - Gerada pelo metabolismo oxidativo da cisteina.
Neste último há uma complexa sequência de oxidação e, uma vez que a concentração de cisteína livre é limitada, as concentrações celulares de PAPS (4–80 μM) são consideravelmente inferiores às de UDP-ácido glucurónico (200–350 μM) e glutationa (5–10 mM).
Esta baixa concentração relativa PAPS limita a capacidade de sulfonação dos xenobióticos. No geral, a sulfonação é um caminho de grande afinidade mas baixa capacidade para a conjugação de xenobióticos, enquanto que a glucuronidação é um caminho de baixa afinidade mas elevada capacidade.
Acetaminofeno
É um dos diversos xenobióticos que são substractos tanto para as sulfotransferases como para as UDP-glucuronosiltransferases.
A quantidade relativa de conjugados da sulfonação e da glucuronidação do acetaminofeno é dependente da dose: - Baixas doses: o acetaminofeno sulfatado é o principal composto formado devido à alta afinidade das sulfotransferases.
- Altas doses: à medida que a dose aumenta, a proporção de acetaminofeno conjugado com sulfonato decresce, considerando que a proporção conjugada com ácido glucurónico aumenta. Em alguns casos, a quantidade absoluta de xenobiótico conjugado com sulfonato possa decrescer a elevadas doses aparentemente devido à inibição do substracto da sulfotransferase.
A sulfonação não está limitada a álcoois fenólicos e alifáticos (os quais são frequentemente os produtos de biotransformação oxidativa e hidrolitica), embora estas representem os maiores grupos de substratos para as sulfotransferases, e algumas aminas aromáticas, como a anilina e o 2-aminonaftaleno, podem sofrer sulfonação originando sulfamatos Em todos os casos, a reacção de conjugação envolve o ataque nucleofílico do oxigénio ou do azoto no átomo de enxofre electrofilico do PAPS, com a quebra da ligação fosfosulfato.
Em determinados casos, a conjugação do sulfato pode aumentar a toxicidade dos químicos, como acontece com o acetilaminofluoreno e o fármaco tamoxifeno. Isto é devido ao grupo sulfato ser descrito, em termos químicos, como um bom grupo abandonador.
Assim, com alguns conjugados, a clivagem do éster de sulfato gera um ião nitrénio ou em carbocatião reactivo, o qual é electrofilico e pode reagir com macromoléculas biológicas (como por exemplo o DNA).

## Acetilação

É uma das mais importantes vias de metabolismo para aminas aromáticas, sulfonamidas, hidrazinas e hidrazidas, existindo também uma ampla variedade de substractos para este tipo de reacção do tipo 1.
Esta reacção metabólica é um dos dois tipos de reacção de acilação, e envolve um agente conjugante activado – a acetil CoA.
Acetilação origina produtos que podem ser menos solúveis em água do que o composto inicial, e isto originou problemas com as sulfonamidas quando estas são administradas em doses elevadas.
Os metabolitos acetilados, sendo menos solúveis na urina, cristalizam fora dos túbulos renais, causando necrose tubular.
Porém, a acetilação reduz a reactividade das aminas e hidrazinas e também reduz a possibilidade de oxidação pelo citocromo P-450 (o que pode conduzir a intermediários reactivos).
Enzimas:
As enzimas que catalisam as reacções de acetilação são as N-acetiltransferases, existindo duas formas distintas: NAT1 e NAT2. Estas enzimas citosólicas, com 87% homologia entre elas, têm diferentes substratos preferidos e distribuição.
NAT1: distribuído amplamente em vários órgãos e tecidos, incluindo glóbulos vermelhos NAT2: principalmente presente nas células de Kupffer no fígado, e também há alguma actividade nas células reticuloendoteliais do baço, intestino e pulmão.
Mecanismo de acção da N-acetiltransferase
Em primeiro lugar decorre a acetilação da enzima através da acetil CoA, seguido de adição do substrato. Em seguida há transferência do grupo acetil para o substrato, e com perda do produto de acetilação a enzima é regenerada.
Embora as duas formas da enzima possuam substratos preferidos, há sobreposição entre elas de tal modo que nenhum substrato parece ser exclusivamente acetilato por um ou por outro.
Substratos preferidos:
NAT1: ácido de p-aminobenzóico, ácido de p-aminosalicilico, e sulfanilamidas NAT2: isoniazidas, hidralazinas, procainamidas e dapsona
Algumas substâncias químicas, como 2-aminofluoreno, são acetiladas na mesma extensão por ambas.
Sulfanilamidas
A sua acetilação pode ser no N4 ou no N1, ou em ambos Figure 4.68
A NAT2 pode ter um polimorfismo genético, e apresentar uma distribuição bimodal com dois fenótipos, conhecidos como acetiladores lentos e rápidos., e este polimorfismo acarreta inúmeras consequências toxicológicas
O acetilador lento possui uma mutação, a qual origina uma forma menos activa da enzima.
A acetilação pode levar à formação de metabolitos tóxicos, os quais podem reagir com o DNA ou serem cancerinogénicos.

## Metilação

Grupos amino, hidroxil e tiol e também azoto heterocíclicoem xenobióticos podem levar a reacções de metilação in vivo.
O dador de metilo é o S-adenosilmetionina, formado através da metionina e de ATP, sendo mais uma vez uma reacção do tipo 1 com um dador activado. As reacções são catalizadas por várias enzimas metiltransferases, as quais são maioritariamente citosólicas apesar de algumas estarem localizadas no retículo endoplasmático.
Algumas destas enzimas são altamente específicas para compostos endógenos, como a N-metiltransferase (a qual metila a histamina). No entanto, existem N-metiltransferases não especificas, presentes nos pulmões e outros tecidos, que metilam quer compostos endógenos quer xenobióticos.
Catecol-O-metiltransferase É uma enzima citosólica, que existe de múltiplas formas e catalisa a metilação quer de catecol endógeno quer exógeno, e também de fenóis trihidricos. Acredita-se que a metilação da 4-hidroxiestradiol pela catecol-O-metiltransferase é uma reacção de desintoxicação
Tiol-S-metiltransferase é uma enzima microssomal presente no fígado, pulmões e rins, a qual pode catalisar a metilação de uma grande variedade de xenobióticos
A metilação da tiopurina, um fármaco anticancerígeno, pela tiopurina metiltransferase é uma reacção de desintoxicação, a qual reduz a mielotoxicidade deste fármaco.
H$_2$S é desintoxicado, primeiro pela metilação a CH$_3$SH (o qual é altamente tóxico) seguido da metilação a CH$_3$-S-SH$_3$
Mercúrio Os metais, como o mercúrio, também podem sofrer reacções de metilação Na metilação do mercúrio, as propriedades físico-químicas, a toxicidade e o comportamento ambiental são alterados, e os produtos formados – metilmercúrio e dimetilmercúrio- são mais lipófilos, neurotóxicos, e persistem no ambiente.
Outros metais como o estanho, chumbo e tálio também podem ser metilados, e esta reacção tende a reduzir a solubilidade em água dos xenobióticos, invés de aumentá-la (tal como acontece nas reacções de acetilação).

## Conjugação com a glutationa

Glutationa é um tripéptido, composto por ácido glutâmico, cisteina e glicina (glu-cys-gly). É uma das moléculas mais importantes na defesa celular contra compostos tóxicos. Em parte, esta função protectora é devida ao seu envolvimento em reacções de conjugação Ex: na hepatoxicidade do bromobenzeno e do paracetamol
A molécula de glutationa é importante por várias razões:
* Tem um grupo SH reactivo
* É protegido da digestão da protease devido à natureza da ligação entre a cisteina e o glutamato
* Está presente em concentrações relativamente altas
Há três locais de reservas da glutationa: no citosol, na mitocôndria, e também no núcleo. É encontrada na maioria das células, sendo especialmente abundante no fígado (onde alcança uma concentração de 5 mM) e nos mamíferos.
A presença de cisteina fornece um grupo sulfidrilo, o qual é nucleofílico e desta forma a glutationa irá reagir com electrofílicos.
Estes electrofílicos podem ser
* quimicamente reactivos
* produtos metabólicos de uma reacção de fase 1
* ou xenobióticos mais estáveis
Assim, a glutationa protege as células removendo metabolitos reativos.
A glutationa não está activada numa conformação de elevada energia, e o substrato está habitualmente numa forma activada. A conjugação da glutationa pode ser uma reacção catalisada por enzimas ou simplesmente uma reacção química.
O conjugado da glutationa produzido pela reacção pode então ser:
* excretado (normalmente na bílis invés da urina)
* metabolizado
Isto envolve vários passos:
* remoção dos grupos glutamil e glicinil
* acetilação do grupo amino cisteina para formar um ácido mercapturico ou um conjugado nacetilcisteina
Naftaleno
Metabolizado pelo citocromo P-450 a um intermediário epóxido reactivo, o qual é conjugado com a glutationa e, eventualmente, excretado como um conjugado N-acetilcisteina. Esta sequência de passos catabólicos adicionais é denominada metabolismo de fase 3. O Naftaleno é tóxico para os pulmões, e estes percursos metabólicos são importantes para essa toxicidade.
Existem vários tipos de substratos para a conjugação da glutationa:
* époxidos aromáticos, alifáticos, heterocíclicos e aliciclicos
* alifáticos halogenados e compostos aromáticos,
* compostos nitro aromáticos
* hidrocarbonetos benzo[a]pirenos insaturados
* compostos alifáticos
Em cada caso, a glutationa reage com um átomo de carbono electrofílico numa reacção de adição ou de substituição.
Dietilmaleato
Reage rapidamente com a glutationa in vivo, e foi utilizado para baixar os níveis tecidulares deste tripéptido. A reacção pode ser catalisada com uma das GSTs (glutationa-S-transferases), as quais são enzimas citosólicas apesar de existirem também diferentes isoformas no reticulo endoplasmático e em vários tecidos (especialmente fígado, rim, intestino, testículos e glândulas adrenais).
Existem 8 familias de GSTs: α (A), µ (M), π (P), σ (S), θ (T), ω (O), ς, κ (K)
A enzima existe como hetero - ou homodímero de subunidades organizadas para dar resposta às várias isoformas com certas preferências para determinados substractos.
Os substratos possuem determinadas características:
* hidrofóbicos
* contêm um átomo de carbono electrofilico
* reagem não enzimaticamente com a glutationa
Transferases:
* catalisam reacções de conjugação
* têm função de ligação, transporte ou armazenamento
GSTA1 e GSTA2:
Também conhecidas como ligandin. A sua facilidade de ligação está relacionada com uma subunidade em particular mas não está directamente relacionada com a actividade catalítica.
Há polimorfismos nas GSTs, incluindo a completa ausência de algumas isoformas (o que varia de acordo com a etnia), e as GSTs também podem ser induzidas por uma variedade de condições químicas e fisiológicas.
Após a reacção de conjugação, o primeiro passo catabólico – remoção de um resíduo glutamil- é catalisada pela enzima γ-glutamiltranspeptidase (glutamiltransferase)
γ -glutamiltranspeptidase Enzima de ligação à membrana presente no rim em elevadas concentrações.
No segundo passo, parte da glicina é removida pela peptidase cisteinil glicinase.
O passo final é acetilação do grupo amino da cisteina pela acção de uma N-acetil transferase, a qual utiliza acetil CoA e é uma enzima de microssomal presente no fígado e rim.
O conjugado N-acetilcisteina resultante, também conhecido como ácido mercaptúrico, é então excretado.

## Conjugação com aminoácidos

Este é um segundo tipo de reações de acilação, no entanto neste caso é o próprio xenobiótico a ser activado, seguindo-se uma reacção do tipo 2.
Substractos: Ácidos orgânicos, quer aromáticos quer alifáticos
Esta reacção envolve a conjugação com um aminoácido endógeno, sendo a glicina o mais vulgarmente utilizado, mas a taurina, glutamina, arginina e ornitina também o podem ser. O aminoácido utilizado depende da espécie de animal exposto, contudo espécies do mesmo grupo evolutivo tendem a usar o mesmo.
Mecanismo:
Primeiro, envolve a activação do grupo ácido carboxílico do xenobiótico com a acetil-CoA. Esta reacção requer ATP e é catalizada por uma ligase ou uma acetil-CoA sintetase (a qual é uma enzima mitocondrial)
O derivado S-CoA acila o grupo amino do aminoácido utilizado, de uma maneira análoga à da acetilação dos grupos amino, fornecendo um conjugado péptido. Esta reacção é catalisada por um aminoácido N-aciltransferase (o qual está localizado na mitocôndria).
Ácidos biliares também são conjugados com aminoácidos de um modo similar, mas as enzimas intervenientes são diferentes.
Apesar dos ácidos biliares conjugados com aminoácidos serem normalmente excretados na bílis, os aminoácidos conjugados com xenobióticos são usualmente excretados na urina. A conjugação com aminoácidos endógenos facilita a excreção urinária, uma vez que os sistemas de transporte de aniões orgânicos estão localizados nos túbulos renais.
Geralmente a conjugação com aminoácidos é uma reacção desintoxicante, contudo a conjugação com grupos hidroxilamino (N-hidroxi) podem levar à formação de iões nitrénio reactivos, como nas reacções de sulfatação e acetilação.