# Aula 7 - Processos Fermentativos Eucarioticos
## Aula 7 - Processos "Fermentativos" Eucarioticos
### Objetivo Geral:

Apresentar os diferentes tipos de bioprocessos envolvendo organismo eucarióticos e suas características.

### Objetivos específicos:

* explicar os tipos de bioprocessos e suas características
* apresentar algumas característica exclusiva dos bioprocessos abordados
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### 1.    Introdução

Apesar de a maioria dos processos utilizando células eucarióticas serem aeróbicos, o nome fermentativo foi mantido por ser um sinônimo de bioprocesso. Sendo assim, o termo fermentativo localiza-se em aspas já que a maioria dos processos não são de fato uma fermentação, mas sim um bioprocesso.
Diferentemente dos processos procarióticos, as células eucarióticas possuem características próprias de cada organela que podem ser utilizadas nos bioprocessos. Proteínas são amplamente produzidas através de células procarióticas já que existe uma diferenciação onde algumas proteínas são sintetizadas apenas no citoplasma e outras apenas no núcleo, o que facilitaria o processo de purificação e isolamento pós síntese. Outra característica da célula eucariótica é a existência de glicosilação inexistente em células procarióticas, o que gera proteínas com ação específica já que a adição de carboidratos a proteína confere o destino a que ela irá atuar, resultando assim em maior seletividade.
Com o desenvolvimento de DNA recombinante foi possível desenvolver diversos produtos utilizando células eucarióticas. Dentre os produtos destacam-se: hormônios, vacinas, alimentos (queijo, cerveja, vinho), enzimas, ácidos orgânicos, solventes (etanol), biofarmacos (anticorpos monoclonais), células para produção de alimentos, vitaminas, antibióticos (penicilina) e novas moléculas por biotransformação.
FIGURA 1

### 2.    Breve histórico

Desde tempos remotos microrganismos são utilizados em processos de biotransformação da matéria. Através da observação do ambiente ao seu redor, o ser humano passou a perceber que certos processos se desenvolviam devido à presença de microrganismos no meio. A partir dessas observações, foi possível estudar mais a fundo e utilizar esses microrganismos de forma a atender da melhor forma as nossas necessidades.
➔ Os babilônios e os sumérios usavam leveduras na produção de álcool antes de 6000
➔ Os egípcios, em 2000 AC, utilizavam leveduras para a produção de pães.
➔ Na Ásia, antes do nascimento de Cristo, utilizava-­se Penicillium rouquefortii na produção de queijos
➔ Na China, a 2500 anos atrás, o fungo Aspergillus oryzae era usado no processo de fabricação de koji, que foi levado também para o Japão no século VII
➔ Na metade do século XIX, Luis Pasteur estudou a função de microrganismos na produção de vários produtos como alimentos fermentados, vinho, cervejas, queijo, leite, iogurte, combustíveis e química fina
➔ Pasteur desenvolveu em 1864 o processo de pasteurização, que consiste em aquecer um determinado meio a uma temperatura de 60oC por 30 minutos
➔ Durante a Primeira Guerra Mundial começou-­se a utilizar microrganismos, inclusive eucarióticos para a produção de substâncias como etanol, acetona e ácido cítrico.
➔ Nos dias atuais os produtos biotecnológicos estão presentes em muitos setores da economia, como na área química, farmacêutica, energética, alimentícia e na agricultura. Os tipos de serviços que uma indústria de bioprocessos pode oferecer podem ser classificados em produções como as de: biomassa, metabólitos celulares, proteínas recombinantes, e também enzimas.
Os bioprocessos vêm substituindo uma série de processos que antigamente só podiam ser feitos quimicamente. Eles apresentam algumas vantagens como a possibilidade de utilizar matéria-prima barata e disponível no mercado (como por exemplo, o bagaço de cana), o processo pode ser desenvolvido sob pressões e temperaturas normais e não há a produção em quantidade de resíduos tóxicos.

### 3.    Contextualização com a atualidade

Um dos exemplos amplamente utilizados nos dias atuais são as leveduras como Saccharomyces cerevisiae. Estas são utilizadas em vários processos, como: produção de fermento de pão, extrato de levedura, cerveja, aditivos alimentícios, proteínas heterólogas (vacinas e outros componentes terapêuticos), e produtos de interesse farmacêutico. O genoma de leveduras já foi inteiramente sequenciado, o que permite manipulação de novas vias metabólicas e do aumento da produção com a engenharia genética.
Para o cultivo de leveduras há necessidade de uma fonte de carbono como fonte energética para seu crescimento, podendo também ser necessária a adição de vitaminas (tiamina e ácido pantotênico), de nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, cálcio, zinco, manganês, cobre, ferro, cobalto, iodo, dentre outros elementos.
Caso sejam utilizadas células animais há parâmetros diferentes para o crescimento celular, sendo este mais lento. Estas células são mais frágeis e não resistem a muita agitação. Além do mais precisam de diversos nutrientes para seu crescimento, o que pode tornar o processo mais caro.
Dentre outros exemplos comumente utilizados atualmente podemos citar:
a) ENZIMAS
Antes do século XIX produzia-se primeiramente as células para que elas produzissem as enzimas de seu metabolismo que eram por fim isoladas e purificadas para serem utilizadas. Hoje em dia com o desenvolvimento do DNA recombinante é possível produzir a enzima diretamente.
O conhecimento de que enzimas são proteínas foi verificado em 1946 com o isolamento da enzima urease do feijão testando-a em um substrato e produzindo uréia. Porém em antes dessa descoberta, em 1914, as enzimas já eram utilizadas, como por exemplo detergentes contendo enzimas de degradação.
O amplo uso de enzimas na indústria ocorreu a partir de 1960, principalmente na indústria alimentícia como a quimosina usada na produção de queijos.
Uma das utilizações mais recentes de enzimas é a produção de etanol de segunda geração através da quebra da celulose por enzimas como xilanase e celulase em produtos que são utilizados como biocombustíveis. Porém esse processo necessita de muita enzima, sendo assim um processo caro para produção de combustível, não sendo assim economicamente competitivo com os derivados do petróleo.
b) ÁCIDOS ORGÂNICOS
Impressoras 3D utilizam um plástico constituído de monômeros de ácido itacômico produzido por fungos Aspergillus modificados.
c) VITAMINAS
Microalgas são utilizadas para a produção de betacaroteno que é convertido a vitamina A com a utilização de enzimas.
d) ANTIBIÓTICOS
Em 500 a.C utilizava-se o bolor da coalhada de soja (fungos) em feridas. Apenas em 1929 foi identificado e comprovado que a presença de fungos diminuíam o crescimento bacteriano e foi isolado a Penicilina do Penicillium sp.
e) BIOTRANSFORMAÇÃO
A Biotransformação consiste na conversão de moléculas em outras moléculas com a utilização de células e/ou enzimas. Como por exemplo a conversão de hortelã em outras fragrâncias.
f) CÉLULAS
Células ricas em proteínas podem ser utilizadas como fonte de alimento.
g) BIOFARMACOS
Uma das principais utilizações de células eucarióticas e da vantagem da glicosilação está na produção de Biofármacos já que a glicosilação é muito parecida com a humana.
FIGURA 2

### 4. Definição

Tortora et al, definem fermentação como qualquer tipo de processo de cultivo microbiológico que pode acontecer na presença de ar ou não. Bioquimicamente, define-se fermentação como um processo metabólico que acontece em condições anaeróbicas (sem oxigênio), porém sem ativação da cadeia respiratória, sendo o substrato orgânico o doador e o receptor final de elétrons. (TORTORA et al., 2006)
Dependente de fatores específicos, a figura abaixo ilustra fermentações dependentes de microorganismos. . Por realizações de análises bioquímicas, o produto final de uma fermentação pode servir como uma maneira de identificação de microorganismos.

#### Produtos Biotecnológicos

Produtos biotecnológicos fazem parte de muitos setores da economia hoje em dia, por exemplo: área química, farmacêutica, energética, alimentícia e agricultural. Os tipos de serviços que uma indústria de bioprocessos pode oferecer podem ser classificados em produções como as de:
➔ Biomassa: Usada no processo de panificação com o objetivo de produção em larga escala de biomassa de bactérias, leveduras ou fungos.
Exemplo : Saccharomyces cerevisiae​, que é adicionado à massa pois quando se multiplicam realizando seu processo metabólico, produzem gás que expande a massa e a torna mais aerada e leve. A levedura, por sua vez usa do seu sistema enzimático, consumindo os açúcares da massa, transformando-­os em dióxido de carbono (CO2) e álcool (etanol).
➔ metabólitos celulares: tem como objetivo produzir em grande quantidade produtos de metabolismo celular, podendo estes serem intra ou extracelulares;
➔ proteínas recombinantes: Manipula-se genes e de forma que, ao introduzir nestes microrganismos com objetivo de obtenção de produtos que antes eram produzidos em outras células ou ainda melhorar a especificidade de uma enzima.
➔ enzimas:. Extraídas de animais ou plantas, mas a produção por microrganismos pode fornecer uma maior rendimento. É a forma mais usada.

##### Produção de cerveja

Para produção de cerveja, deve- se seguir alguma etapas:
separação do malte -> em seguida, moagem para que desta forma o amido se torne mais disponível para as próximas etapas.
Enzimas são utilizadas com o objetivo de lisar este amido em açúcares, sendo submetido à temperaturas ótimas (35 ­ 78ºC de acordo com a fonte utilizada) até obtenção da água cervejeira, após isso é submetido à temperaturas de 76º a 78ºC para passar seguir para outra etapa:
* clarificação, nesta etapa há a separação entre o líquido e o bagaço do malte (mosto). O mosto é fervido e é acrescentado o lúpulo, que fornece o sabor amargo à cerveja.
* Em seguida, o processo de whirlpool acontece. Nesta etapa ocorre a decantação natural por ação da força centrípeta, que retirará as partículas em suspensão que estão no mosto.
O mosto é resfriado na temperatura considerada ótima para fermentação, em seguida há a adição de levedura para que a fermentação de fato aconteça, processo este que demora cerca de 7 dias para ocorrer, transformando o açúcar em álcool e gás carbônico.
As leveduras podem ser tipo Ale de alta fermentação, que trabalham em temperaturas maiores ou Lager que são de baixa fermentação e trabalham em temperaturas menores.
Depois de ocorrida a fermentação, ocorre a maturação onde a cerveja descansa em baixas temperaturas no mesmo biorreator que o processo de fermentação ocorreu, e pode levar até 21 dias.
A cerveja é filtrada para que fique um líquido cristalino, em seguida é envasada e comercializada.

##### Produção de anticorpo monoclonal

Para desenvolver uma vacina, é necessário identificar e empregar o antígeno certo para que ocorra a resposta imunológica específica e protetora contra o patógeno.
Desta forma, a resposta imunológica à um antígeno tem como produto a formação de anticorpos, que possuem alta afinidade e especificidade. Para a produção de anticorpos primeiro é necessário selecionar o antígeno contra o qual desejamos obter o anticorpo. A dose e via de inoculação é verificada, de acordo com o modelo animal, normalmente é usado o camundongo para a produção de anticorpos monoclonais. Injeta-se o antígeno no animal, e este procedimento deve ser repetido de 2 à 3 vezes, com intervalo de 14 dias entre cada inoculação.
Após 30 à 45 dias após a primeira inoculação se faz a sangria do animal e no soro está presente os anticorpos que reconhecerão os antígenos inoculados. Com esta técnica, o produto obtido é uma mistura heterogênea de imunoglobulinas específicas para diferentes epítopos do mesmo antígenos e de epítopos de diferentes antígenos, ou seja, policlonais.
Para fazer a purificação, em uma mistura de células esplênicas, um linfócito secretor do anticorpo específico a uma determinada região do antígenos permite a obtenção do anticorpo monoclonal. Hibridomas são células híbridas que secretam anticorpos específicos, originados de mieloma com células esplênicas imunes.
O híbrido isolado é clonado e ampliado, formando um banco de células secretoras de anticorpos com alta especificidade para o antígeno alvo da imunização que se precedeu.

## Exercícios Bônus

Link para documento do exercício (É preciso fazer uma cópia no Drive, para resolução).