# Engenharia genética/Desenho dos primers
## Objetivo

* Desenhar os primers necessários para amplificar o gene GFP do vetor pUG35.

## Conhecer o Vetor pUG35
#### Encontrar a sequência nucleotídica do vetor pUG35

* Entrar em Entrez, The Life Sciences Search Engine e seleccionar CoreNucleotide.
* Pesquisar "pUG35" e clicar no link “AF298787”.
* O ficheiro então apresentado assenta na seguinte estrutura:
LOCUS: AF298787 6231 bp DNA circular SYN 26-NOV-2000 (Nome curto para esta sequência).
DEFINITION: C-terminal GFP fusion vector pUG35, complete sequence (Definição da sequência).
ACCESSION: AF298787 (Número de acesso de entrada).
VERSION: AF298787.1 GI:11344888 (Versão de entrada).
KEYWORDS: (Palavras-chave da entrada).
SOURCE: C-terminal GFP fusion vector pUG35.
ORGANISM: C-terminal GFP fusion vector pUG35 (O organismo a partir do qual a sequência derivou).
REFERENCE: 1 (bases 1 a 6231)
AUTHORS: Gueldener,U. and Hegemann,J.H. (Autores do trabalho).
TITLE: A second generation of GFP-vectors for subcelluar localization studies in budding yeast (Título da publicação).
JOURNAL: Unpublished (Jornal de referência para a entrada).
FEATURES: Location/Qualifiers (Características da sequência).
| 1..6231 | |
| organism | C-terminal GFP fusion vector pUG35 |
| mol_type | other DNA |
| db_xref | taxon:142955 |
| note | derived from Saccharomyces cerevisiae |
| gene | 417..1220 |
| | gene | URA3 |
| CDS: | 417..1220 | (Sequência codificante, a parte do gene que codifica para uma proteína) |
| | gene | URA3 |
| | codon_start | 1 |
| | transl_table | 11 |
| | product | orotidine-5'-phosphate decarboxylase |
| | protein_id | AAG34528.1 |
| | db_xref | GI:11344889 |
| | translation | MSKATYKERAATHPSPVAAKLFNIMHEKQTNLCASLDVRTTKELLELVEALGPKICLLKTHVDILTDFSMEGTVKPLKALSAKYNFLLFEDRKFADIGNTVK LQYSAGVYRIAEWADITNAHGVVGPGIVSGLKQAAEEVTKEPRGLLMLAELSCKGSLSTGEYTKGTVDIAKSDKDFVIGFIAQRDM GGRDEGYDWLIMTPGVGLDDKGDALGQQYRTVDDVVSTGSDIIIVGRGLFAKGRDAKVEGERYRKAGWEAYLRRCGQQN |
| terminator | 2004..2262 |
| | note | from CYC1 |
| gene | complement(2271..2987) |
| | gene | EGFP3 |
| CDS: | complement(2271..2987) |
| | gene | EGFP3 |
| | codon_start | 1 |
| | transl_table | 11 |
| | product | enhanced green fluorescent protein 3 |
| | protein_id | AAG34529.1 |
| | db_xref | GI:11344890 |
| | translation | MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDF FKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRH NIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK |
| promoter | 3051..3443 |
| | note | from MET25 |
| rep_origin | 3882..3954 | (Início da sequência) |
* De seguida, encontra-se a sequência completa do vector pUG35.

#### Encontrar a sequência nucleotídica da CDS do gene GFP

* Para analisar apenas a sequência que codifica o gene GFP, clique em “CDS” para “EGFP3”.
* Ao fundo, encontra a seguinte sequência:
* As duas cadeias do DNA, denominam-se Watson e Crick:
O DNA é sempre exibido na forma 5'-3' por isso, normalmente, a cadeia Crick é invisível.
No entanto, na sequência obtida para o gene GFP, só vemos a cadeia Crick.
* Nota: A sequência codificante (CDS) deve começar com “atg” (codão start) e acabar com ”taa” (codão stop).
Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão start está na base (cat ⇒ atg) e o codão stop está no topo (tta ⇒ taa).

## Construir os primers para amplificar o gene GFP

* Vamos amplificar o gene GFP inteiro, incluindo os codões start e stop (mas nada fora do gene).
* Precisamos de dois primers para o PCR, um primer forward e um primer reverse.
O primer forward liga-se à cadeia Crick e o primer reverse liga-se à cadeia Watson.
* De seguida, apresenta-se a cadeia reverse complement correspondente à sequência Crick obtida anteriormente para o gene EFGP3:
* Temos, então, toda a informação necessária para desenhar os primers:
Primer Forward: 5' - ATG TCT AAA GGT GAA GAA TTA TTC A - 3'
Primer Reverse: 5' - TTA TTT GTA CAA TTC ATC CAT ACC A - 3'
Explicação:
cadeia molde - 5' - ATG TCT AAA GGT GAA GAA TTA TTC ACT ... CAT GGT ATG GAT GAA TTG TAC AAA TAA - 3'
Primer Reverse ------------------------------------------------------------------ 3' - A CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5'
Primer Forward ---------------- 5' - ATG TCT AAA GGT GAA GAA TTA TTC A - 3'
cadeia molde complementar - 3' - TAC AGA TTT CCA CTT CTT AAT AAG TGA ... GTA CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5'

## Propriedades dos primers construídos para amplificar o gene GFP

* Pretende-se que os primers tenham uma T$_m$ (melting temperature) de 49-51 °C.
Utilizando o programa Oligonucleotide properties calulator pode calcular a T$_m$ automaticamente.

#### Propriedades correspondentes aos primers Forward e Reverse, quanto à temperatura média de desnaturação (T$_m$), ao tamanho da sequência (quantidade de nucleótidos) e à percentagem de guaninas e citosinas (% GC).

| Primer | Forward | Reverse |
| T$_m$ (Basic) | 49 °C | 49 °C |
| Tamanho | 25 nucleótidos | 25 nucleótidos |
| Conteúdo GC | 28% | 28% |