# Espectrofotômetro

O espectrofotômetro é um instrumento de análise, amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa, capaz de medir e comparar a quantidade de luz (radiação eletromagnética) absorvida, transmitida ou refletida por uma determinada amostra, seja ela solução, sólido transparente ou sólido opaco. Existem duas classes de espectrofotômetros: o de feixe simples e o de duplo feixe e eles são constituídos, essencialmente, por cinco componentes principais: as fontes de radiação, o monocromador, o porta-amostras, os detectores e o indicador de sinal.
O resultado da espectrofotometria é dado por um gráfico que é conhecido como espectro e fornece informações de intensidade por comprimento de onda da fonte de luz. Essa faixa de comprimentos de onda desejados pode ser selecionada antes da realização das medidas, o que torna a medida mais específica e eficaz já que não será necessário um número excessivo de dados para obter o resultado esperado. Os espectrofotômetros mais sofisticados cobrem uma gama de luz entre 200 nm e 2500 nm (ultravioleta a infravermelho). A faixa de comprimentos de onda da radiação eletromagnética mais utilizada está, aproximadamente, entre 350 nm e 750 nm, ou seja, no espectro de luz visível. Para que os resultados obtidos pelas medidas realizadas no espectrofotômetro sejam precisos, é necessário sempre fazer a calibração do instrumento utilizando padrões conhecidos.

## História

O primeiro espectrofotômetro foi inventado em 1940, pelo químico americano Arnold O. Beckman (1900 - 2004) e seus colegas dos Laboratórios de Tecnologias Nacionais, na empresa Beckman Coulter Inc., fundada em 1935. O líder do projeto foi o engenheiro americano Howard Cary (1908 - 1991). O espectrofotômetro foi a maior descoberta da empresa.
Antes de 1940, o processo de análise química era muito longo e trabalhoso levando semanas para ser concluído, com uma precisão de apenas 25%, de acordo com o MIT. Em 1940, quando o Espectrofotômetro DU foi introduzido, o processo ficou bem mais simples e rápido, necessitando de apenas alguns minutos para a análise. De acordo com a mesma fonte, a precisão desse instrumento era de 99,99%. A partir de então, esse espectrofotômetro se tornou o instrumento padrão para análises químicas.
No início, existiam problemas de desempenho do espectrofotômetro. Esses problemas levaram a mudanças no projeto. O espectrofotômetro modelo B usava um prisma de quartzo ao invés de um prisma de vidro, melhorando as capacidades UV do dispositivo. O modelo C, logo em seguida, trouxe mudanças que aumentaram a resolução de comprimentos de onda no UV e dessa forma três espectrofotômetros modelo C foram construídos. Em 1941, o modelo D, também conhecido como modelo DU, foi produzido com uma lâmpada de hidrogênio e outros tipos de melhorias. Esse projeto permaneceu essencialmente inalterado entre 1941 e 1976, quando foi interrompido. Até 1976, mais de 30.000 modelos DU e DU-2 tinham sido vendidos. Esses instrumentos foram utilizados em clínicas, laboratórios industriais e na química e bioquímica.
Em 1981, a empresa Cecil Instruments produziu um espectrofotômetro controlado por um microprocessador, tornando-o um dispositivo automatizado e mais rápido. Entre 1984 e 1985, foram desenvolvidas versões de espectrofotômetros de duplo feixe. Com a década de 1990, veio a adição de softwares externos, controlados pelo computador, que exibiam na tela os espectros resultantes. Hoje, o aperfeiçoamento dos espectrofotômetros continua e suas aplicações vão desde a ciência e a medicina até a investigação de cenas de crime.
Embora novos modelos tenham sido introduzidos ao longo dos anos, ainda existem muitos espectrofotômetros modelo DU em uso ao redor do mundo. As contribuições extraordinárias de Beckman levaram o presidente George H. W. Bush a dar-lhe a Medalha Nacional de Ciência, em 1989, por sua liderança em desenvolvimento de instrumentação analítica e por sua profunda preocupação com a vitalidade das empresas científicas do país.

## Princípios físicos

Alguns princípios físicos são importantes para entender o funcionamento dos espectrofotômetros.

### Lei de Bragg

A Lei de Bragg ou Lei de Difração foi explicada pelo físico australiano William Lawrence Bragg, em 1912. Embora simples, a lei confirmou que existem partículas reais na escala atômica e forneceu uma nova ferramenta para o estudo de cristais utilizando difração de raios X.
A difração depende de dois fatores: da estrutura do material e do comprimento de onda utilizado. Então, supõe-se que as ondas incidentes sofrem reflexão especular em planos paralelos de átomos de um cristal, onde cada plano reflete apenas uma porcentagem da radiação. Na reflexão especular, o ângulo de reflexão é igual ao ângulo de incidência (Lei da Reflexão). Embora a reflexão de cada plano seja especular, existem apenas alguns valores para o ângulo de incidência em que as reflexões se somam em fase resultando em um feixe difratado intenso. Nas direções em que as reflexões de planos paralelos de átomos interferem construtivamente, ou seja, nos máximos de intensidade, são observados os feixes difratados. Devemos considerar que o espalhamento é elástico, caso em que a energia inicial é conservada.
Tomando uma família de planos paralelos separados por uma distância $d$, a diferença de caminho entre os raios refletidos por planos vizinhos é $2d\sin \theta$, onde $\theta$ é o ângulo de incidência. Essa diferença é a mesma para qualquer par de planos vizinhos pertencentes àquela família. Assim, para que a intensidade da difração seja máxima, a diferença de percurso deve ser igual a um número inteiro $n$ de comprimentos de onda $\lambda$, ou seja, quando:
$2d\sin \theta =n\lambda$
Esta é a definição da lei de Bragg e é satisfeita apenas quando $\lambda$ $\leq 2d$.

### Lei de Snell

A Lei de Snell ou Segunda Lei da Refração foi formulada pelo matemático holandês Willebrord Snellius, em 1621. Ela fornece o desvio angular sofrido por um raio de luz após passar de um meio para outro que tenha um índice de refração diferente. Nesta mudança de meios, a frequência da onda $f$ não é alterada, embora a velocidade $v$ e o comprimento de onda $\lambda$ sejam. A lei é dada pela seguinte expressão:
$n_{1}\sin \theta _{1}=n_{2}\sin \theta _{2}$
onde o índice de refração é expresso por: $n={\frac {c}{v}}$ .
* $c$ = velocidade da luz no vácuo;
* $v$ = velocidade no meio escolhido;
* $n$ = índice de refração no meio escolhido.
A lei de Snell também pode ser escrita como:
${\frac {\sin \theta _{1}}{\sin \theta _{2}}}={\frac {\lambda _{1}}{\lambda _{2}}}$
já que $v=\lambda f$.

## Funcionamento e partes do espectrofotômetro

O funcionamento dos espectrofotômetros é muito simples. A fonte de radiação emite luz (UV, visível ou IR) e essa luz é fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difração) nos comprimentos de onda que a compõem, ou seja, ela sofre refração. A faixa de comprimentos de onda, inicialmente selecionada, é dirigida para a amostra (soluções, filmes finos, pós). Parte dessa luz é absorvida e parte é transmitida. A luz que é transmitida chega ao detector e lá é transformada em um sinal elétrico. Finalmente, o sinal elétrico é recebido pelo computador que transmite esses dados em forma de espectro (absorção x comprimento de onda).
Como citado anteriormente, os espectrofotômetros são compostos basicamente por cinco partes: a fonte de radiação, o monocromador, o porta-amostras, os detectores e o indicador de sinal. Existem diversos tipos de cada componente de um espectrofotômetro. Abaixo estão listados alguns deles.

### Fontes de radiação

* Lâmpada de filamento de Tungstênio: é uma fonte de radiação que emite no visível e no infravermelho próximo, ou seja, produz uma radiação útil para o funcionamento do espectrofotômetro na faixa de 320 a 2500 nm. A lâmpada opera em uma temperatura de 3000 K.
* Lâmpada de descarga de Deutério: é uma fonte de radiação que emite no ultravioleta (UV), ou seja, produz radiação útil para o espectrofotômetro na faixa de 200 a 400 nm. Nessa lâmpada os elétrons são excitados por uma descarga e quando voltam para seus estados fundamentais, emitem a radiação.
* Lâmpada de vapor de Mercúrio: é uma fonte de radiação que emite no visível e no ultravioleta, ou seja, produz uma radiação útil para o espectrofotômetro na faixa de 300 a 600 nm.

### Monocromadores

* Prisma: É um elemento óptico transparente com superfícies lisas e polidas capaz de refratar a luz incidente. Os prismas podem ser usados para refletir a luz ou para dividir a luz branca policromática em sete componentes monocromáticas do espectro visível.
* Redes de Difração: É um componente óptico com uma estrutura periódica que divide e difrata a luz em vários feixes que viajam em diferentes direções. As redes de difração possuem uma resolução melhor do que os prismas e podem ser utilizadas em todas as regiões espectrais.

### Compartimentos para amostras

* Cubetas: Para amostras líquidas, o recipiente utilizado é a cubeta retangular de vidro ou de quartzo. A cubeta ideal para medidas, realizadas em espectrofotômetros, é aquela cuja aresta da base tem um tamanho de 1 cm. Esses recipientes devem ser de materiais diferentes dependendo da região de análise. Caso a medida seja feita na região do visível, então a cubeta deve ser de vidro. Porém, se a região de análise for a do ultravioleta, então a cubeta deve ser de quartzo, já que o vidro absorve a radiação ultravioleta.

### Detectores

* Tubo Fotomultiplicador: É um dispositivo elétrico que converte a luz em sinal elétrico. São detectores extremamente sensíveis nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho próximo. Esse detector multiplica a corrente produzida pela incidência de luz em até 100 milhões de vezes.
* CCD (Dispositivo de carga acoplada): São detectores baseados em silício e consistem em uma matriz densa de fotodiodos que convertem a energia dos fótons incidentes em elétrons.

### Indicador de sinal

* Computador: É o dispositivo de processamento de dados utilizado. Nele são instalados softwares apropriados que fornecem o resultado das medidas realizadas no espectrofotômetro.

## Tipos de espectrofotômetros

Existem duas classes de espectrofotômetros: o de feixe simples e o de duplo feixe.

### Espectrofotômetro de feixe simples

O espectrofotômetro de feixe simples foi o primeiro tipo de espectrofotômetro inventado, em 1940. Essa classe do instrumento consiste em que toda a radiação fornecida pela fonte de emissão atravesse a amostra, ou seja, a intensidade relativa de luz é medida antes e depois da amostra de teste ser inserida. Assim, para a realização das medidas basta colocar a amostra no compartimento adequado, previamente determinado pelo fabricante, e fazer com que a radiação passe por essa amostra. Esse tipo de equipamento tem um custo acessível, já que é formado por um sistema não muito complexo.

### Espectrofotômetro de duplo feixe

Mais tarde, por volta de 1985, o espectrofotômetro de duplo feixe foi inventado. Nesse tipo de instrumento, a luz é dividida em dois feixes antes de atingir a amostra. Deve-se ter o cuidado para não confundir um feixe que já sai duplicado da fonte de radiação com um feixe que é duplicado somente após atravessar o monocromador. No caso do espectrofotômetro de duplo feixe, a fonte de luz emite somente um feixe, que chega ao prisma ou rede de difração, como no espectrofotômetro de feixe simples, e somente depois de passar pelo monocromador é que o feixe é dividido em dois. Um dos caminhos do feixe é utilizado para a referência e o outro para a amostra. Isto é bem vantajoso, pois a leitura de referência e a leitura da amostra podem ser feitas ao mesmo tempo, comparando a intensidade de luz entre os dois trajetos. Embora as medições de comparação de instrumentos de feixe duplo sejam mais fáceis e mais estáveis, os instrumentos de feixe único podem ter um alcance dinâmico maior e são opticamente mais simples e mais compactos.

## Medidas no espectrofotômetro

Dois tipos de medidas são possíveis nos espectrofotômetros: medida de transmitância e medida de refletância.
Antes de qualquer tipo de medida é necessário fazer a calibração do instrumento, garantindo a precisão das medições.

### Calibração

A calibração de um espectrofotômetro é um processo utilizado para confirmar que o aparelho está funcionando corretamente. Esse procedimento é importante, pois garante que as medidas realizadas com o instrumento forneçam resultados precisos. A maneira como deve ser feita essa calibração varia um pouco dependendo do modelo do espectrofotômetro, mas os fabricantes fornecem um manual que explica como a calibração deve ser feita.
Geralmente, para medidas de transmitância de amostras em forma de líquido, o procedimento para a calibração é o seguinte:
* Primeiramente deve-se ajustar o 100% T do aparelho com a cubeta contendo somente o solvente utilizado (normalmente água).
* Logo após, deve-se ajustar o 0% T com o feixe de luz totalmente obstruído por um padrão preto.
* Agora, o espectrofotômetro já está apto para realizar as medidas.
Para amostras que não sejam líquidas, o procedimento é o mesmo, porém o padrão utilizado para realizar o 100% T não será um líquido.
As medidas de refletância também devem ser precedidas de calibração. O procedimento deve ser o mesmo realizado para as medidas de transmitância, só que agora utilizando uma esfera integradora.

### Transmitância

Transmitância é a fração da luz incidente, com comprimento de onda específico, que passa por uma amostra seja nanopartículas em solução, filmes finos, pós, entre outras. As medidas de transmitância podem ser, facilmente, realizadas em qualquer tipo de espectrofotômetro. A amostra é colocada no suporte e a fonte emite luz que passa pela fenda chegando ao monocromador e, então, chega na amostra. A amostra absorve uma determinada quantidade de luz e transmite o restante. Essa luz transmitida chega ao detector e é direcionada ao computador que fornece os dados.
As medidas de transmitância podem fornecer diferentes informações como: a concentração de soluto presente na solução (via lei de Beer-Lambert) e elementos presentes na amostra (via pico de absorção).

#### Lei de Beer-Lambert

A lei de Beer-Lambert ou lei de Beer-Lambert-Bouguer foi descoberta pelo matemático, geofísico e astrônomo Pierre Bouguer (1698 - 1758). Em 1729, Bourguer publicou "Essai d'optique sur la gradation de la lumière" (Ensaio de óptica sobre a gradação da luz), cujo assunto era a determinação da quantidade de luz perdida quando ela atravessava uma dada distância na atmosfera terrestre.
A Lei de Beer-Lambert é frequentemente atribuída a Johann Heinrich Lambert (1728 - 1777) que publicou um livro de fotometria em 1760.
Mais tarde, em 1852, August Beer (1825 - 1863) expandiu a lei exponencial de absorção, incluindo a concentração das soluções no coeficiente de absorção.
A lei indica que existe uma dependência logarítmica entre a transmitância, $T$, de luz por meio de uma substância e o produto do coeficiente de absorção da substância, $\alpha$, e a distância que a luz viaja através do material (ou seja, o comprimento do caminho), $l$. O coeficiente de absorção pode, por sua vez, ser escrito como o produto de qualquer absortividade molar do absorvedor, $\varepsilon$, e a concentração molar $c$ da amostra. Estas relações são geralmente escritas como:
$T={\frac {I}{I_{0}}}=e^{-\alpha l}=e^{-\varepsilon lc}$
onde
* $I$ = intensidade de luz transmitida
* $I_{0}$ = intensidade de luz incidente
A transmitância é expressa em termos de uma absorbância que, para os líquidos, é definida como:
$A=\varepsilon lc=\alpha l$
Assim, se o comprimento do caminho e a absortividade molar são conhecidos e a absorbância é medida, a concentração da substância pode ser encontrada através da lei de Beer-Lambert.

#### Curva de absorção

Absorção é toda radiação que incide na amostra e não é nem transmitida e nem refletida. Cada elemento possui um pico de absorção específico, isto é, dado um determinado elemento a intensidade de luz é maior para um determinado comprimento de onda. Esse pico saliente no espectro é chamado de pico de absorção, ou seja, é naquele comprimento de onda que o material absorve radiação.

### Refletância

Refletância é a fração do fluxo de radiação eletromagnética que é refletida por uma interface.
$R={\frac {F_{R}}{F_{I}}}$
onde
* $F_{R}$ = fluxo de radiação eletromagnética refletido
* $F_{I}$ = fluxo de radiação eletromagnética incidente
Então, a relação entre a luz absorvida, a luz refletida e a luz transmitida é:
${\frac {luz_{A}}{luz_{T}}}+{\frac {luz_{R}}{luz_{T}}}+{\frac {luz_{TR}}{luz_{T}}}=1$

#### Difusa

A reflexão difusa é a reflexão da luz a partir de uma superfície de tal modo que um raio incidente é refletido em vários ângulos, ao invés de ser refletido em apenas um ângulo, como no caso da reflexão especular. Uma superfície refletora difusa ideal, quando iluminada, terá igual luminância em todas as direções. A refletância difusa é, então, o fluxo de radiação eletromagnética que sofre reflexão difusa em relação ao fluxo de radiação eletromagnética incidente.
Uma superfície constituída de um pó não absorvente, tal como gesso, ou de fibras, tal como o papel, ou de um material policristalino, como mármore branco, reflete a luz, difusamente, com uma grande eficiência. Geralmente, o instrumento utilizado em espectrofotômetros para a medida de refletância total e difusa é a esfera integradora.
A visibilidade de objetos, excluindo aqueles emissores de luz, é causada principalmente pela reflexão difusa da luz, ou seja, são os vários feixes resultantes de reflexão difusa que formam a imagem do objeto no olho do observador.
Este mecanismo é muito comum, pois quase todos os materiais apresentam interfaces irregulares entre as suas pequenas partículas em uma escala comparável ao comprimento de onda da luz. Como há essa irregularidade na estrutura do material, a luz é refletida de forma difusa, ao invés de a luz ser refletida em um único raio, isto é, cada interface está orientada de uma maneira diferente, gerando uma orientação diferente para cada feixe refletido (lei da reflexão).

##### Modelo de Kubelka Munk

A técnica de medição de refletância difusa é muito utilizada para obter a estrutura das bandas (níveis de energia) nos materiais, o band gap. O Modelo de Kubelka Munk é o mais utilizado para a interpretação dos dados obtidos no espectro de refletância difusa. A partir desse modelo, é possível obter a função de remissão de Kubelka Munk, dada pela expressão abaixo.
$F={\frac {(1-R)^{2}}{2R}}={\frac {k}{s}}$
onde
* $F$ = absorção
* $R$ = refletância
* $k$ = constante de absorção
* $s$ = coeficiente de espalhamento
O valor de band gap pode ser estimado, então, fazendo um gráfico da raiz quadrada da função remissão pela energia. Ao traçar uma reta no gráfico $(F\times E)$, o valor que intercepta o eixo das ordenadas é o valor estimado de band gap.

#### Especular

A reflexão especular é a reflexão da luz a partir de uma superfície de tal modo que um raio incidente é refletido em uma única direção (um só ângulo). Tal comportamento é descrito pela lei da reflexão, que afirma que a direção da luz de entrada (o raio incidente) e a direção da luz de saída (o raio refletido) fazem o mesmo ângulo em relação à superfície normal. A refletância especular é, então, o fluxo de radiação eletromagnética que sofre reflexão especular em relação ao fluxo de radiação eletromagnética incidente.
Praticamente todos os materiais podem refletir, especularmente, desde que a superfície seja polida para eliminar as irregularidades comparáveis com o comprimento de onda da luz. Alguns materiais, como líquidos e vidros, não possuem as subdivisões internas que dão o mecanismo de espalhamento do feixe refletido, portanto eles podem ser analisados pelo método de reflexão especular. Os espelhos, por exemplo, são superfícies lisas, mesmo nos níveis microscópicos, logo, eles geram feixes na mesma direção.

#### Total

A refletância total é a soma das outras duas refletâncias: especular e difusa.
$R_{T}=R_{E}+R_{D}$
Um feixe de luz pode ser pensado como um feixe de raios de luz individuais que viajam paralelas umas às outras. Cada raio de luz individual do pacote segue a lei da reflexão. Se o feixe de raios de luz é incidente sobre uma superfície lisa, então os raios de luz refletem e permanecem concentrados em um único feixe ao sair da superfície. Por outro lado, se a superfície é microscopicamente áspera, os raios de luz vão refletir e difundir em muitas direções diferentes. Alguns materiais possuem pouca rugosidade, fazendo com que a luz refletida seja difusa e especular ao mesmo tempo. Nesses casos, é necessário medir a refletância total, pois nela estão contidas a reflexão especular e a reflexão difusa.

## Aplicações

A espectrofotometria é amplamente utilizada para análise quantitativa em várias áreas como química, física, biologia, bioquímica, engenharia de materiais e produtos químicos, aplicações clínicas, aplicações industriais, ente outras. Qualquer aplicação que envolva substâncias químicas ou materiais pode usar esta técnica e, consequentemente, o espectrofotômetro.
* Em bioquímica: é usado para determinar reações catalisadas por enzimas.
* Em aplicações clínicas: é utilizado para examinar o sangue ou tecidos para diagnóstico clínico.
* Em biologia: é usado na realização do teste MTT. E em biologia molecular é utilizado para quantificar o DNA e determinar sua pureza depois de extraído.
* Em medicina: é utilizado na análise cinética de diferentes enzimas sanguíneas e na dosagem da fosfatagem alcalina.