# Nitrogenase

A nitrogenase é uma enzima que reduz azoto molecular (N$_2$) a amónia (NH$_3$). Esta conversão é a principal etapa na fixação de azoto atmosférico, levada a cabo por organismos diazotróficos.
A enzima é um complexo composto por duas proteínas: a dinitrogénio redutase, uma proteína de ferro-enxofre contendo centros de ferro-enxofre (FeS) do tipo [4Fe-4S], e a (di)nitrogenase propriamente dita, cujo sítio activo é composto por um centro de ferro-molibdénio (FeMoco).
Existem duas classes de nitrogenases, classificadas de acordo com o seu dador de electrões: nitrogenases dependentes de proteínas de ferro-enxofre (usualmente a ferredoxina ou a rubredoxina; EC 1.18.6.1) e nitrogenases dependentes de flavodoxinas (EC 1.19.6.1). A dinitrogénio redutase, após activação pelo ATP, recebe os electrões destes dadores, transferindo-os de seguida para o centro FeMo via um centro [8Fe-7S] (centro P). O centro FeMo pode então efectuar a catálise. Os centros P e FeMo são encontrados em exclusivo nas nitrogenases.

## Estrutura do complexo enzimático

A nitrogenase é na realidade um complexo de duas proteínas que não se encontram permanentemente ligadas entre si:
* A nitrogenase propriamente dita, também denominada proteína de ferro-molibdénio (FeMo) ou componente I. Catalisa a redução do N$_2$.
* A dinitrogénio redutase, também denominada proteína de ferro ou componente II. Transfere electrões de um dador electrónico para a proteína de ferro-molibdénio.
A enzima é activa somente quando as duas componentes se encontram associadas. É extremamente sensível ao dioxigénio (O$_2$), sendo rapidamente inactivada em condições aeróbias.

### A proteína de ferro-molibdénio

A proteína de ferro-molibdénio (nitrogenase propriamente dita ou componente I; abreviada proteína FeMo ou MoFe) é uma proteína tetramérica do tipo α$_2$β$_2$ (quatro cadeias polipeptídicas com duas sequências diferentes), com uma massa molecular total de cerca de 250 000 Da. Cada dímero αβ liga um centro FeMo, que é o local onde o N$_2$ é reduzido, e um centro de ferro-enxofre do tipo [8Fe-7S], também designado centro P. Ambos os centros metálicos encontram-se apenas em nitrogenases. As subunidades α e β são os produtos dos genes nifD e nifK.
O cofactor FeMo tem uma geometria similar a dois centros [4Fe-4S] fundidos num vértice, com outro vértice mais exterior sendo o átomo de molibdénio. Este liga, por sua vez, uma molécula de R-homocitrato. O átomo central X é, baseado na estrutura cristalográfica de maior resolução existente, carbono, oxigénio ou azoto, tendo sido sugerido o azoto com melhor candidato, embora outros estudos não tenham conseguido confirmar esta hipótese.
A geometria do centro P é também semelhante à de dois centros [4Fe-4S] fundidos num vértice, partilhando neste caso um sulfureto. Aquando da ligação entre as duas proteínas, o centro P situa-se entre o centro de ferro-enxofre da dinitrogénio redutase e o centro FeMo. Esta evidência estrutural, junto com outros estudos, utilizando técnicas de cinética rápida acopladas a espectroscopia EPR e mutagénese dirigida, sugere um papel activo do centro P na transferência electrónica entre as duas componentes. Quando oxidado, o centro P sofre uma alteração conformacional induzida pela dissociação de dois aminoácidos ligandos, mas é desconhecida a importância da existência desta alteração.
| O centro P. A azul: iões de ferro. A amarelo: iões sulfureto. | O centro FeMo. Ligado ao molibdénio encontra-se uma molécula de R-homocitrato. X é desconhecido. |
Teoricamente, o centro P é capaz de sofrer oxirredução multielectrónica, mas desconhece-se se o centro transfere apenas um electrão de cada vez ou se oscila entre maiores estados de oxidação, comportando-se como um condensador eléctrico.
Embora esta proteína possa ser reduzida por outros agentes redutores que não a dinitrogénio redutase, não consegue catalisar o N$_2$ na ausência desta, inferindo a existência de uma alteração conformacional induzida pela ligação das duas proteínas, dependente da hidrólise de ATP.

### A proteína de ferro

A proteína de ferro (dinitrogénio redutase ou componente II) é um homodímero, com uma massa molecular total por volta dos 60 000 Da, que liga covalentemente um centro de ferro-enxofre (do tipo [4Fe-4S]) e possui locais de ligação para o ATP ou ADP. O gene que codifica esta proteína é designado nifH. A redutase interage com a proteína de ferro-molibdénio (uma molécula de redutase por cada dímero αβ de proteína FeMo) na face em que o centro FeS se encontra, sugerindo a participação deste na transferência electrónica entre as duas componentes. A ligação de nucleótidos altera a conformação da proteína, sugerindo um mecanismo alostérico para a sua actividade catalítica; existe também uma alteração nas propriedades magnéticas e electroquímicas do centro FeS após ligação de ATP, possivelmente para facilitação de transferência electrónica para a proteína FeMo.
O centro FeS desta proteína é extremamente sensível à presença de oxigénio e perde dois átomos de ferro em condições aeróbias.

## Mecanismo catalítico

A redução do azoto molecular é a principal reacção do ciclo biogeoquímico do azoto. Na conversão de N$_2$ a NH$_3$, a ligação tripla do azoto tem de ser (pelo menos parcialmente) quebrada, sendo este processo energeticamente custoso. Na ausência de um catalisador biológico, a reacção requer alta pressão e temperatura, no denominado processo de Haber-Bosch; a nitrogenase consegue efectuar a mesma reacção em condições biológicas (pressão atmosférica, temperatura ambiente), requerindo no entanto seis electrões e ATP:
    8 e$^-$ + 8 H$^+$ + N$_2$ + 16 ATP + 16 H$_2$O = 2 NH$_3$ + H$_2$ + 16 ADP + 16 P$_i$
Durante a reacção, a dinitrogénio redutase recebe um electrão do dador electrónico, transferindo-o para o centro FeMo, que por sua vez o adiciona à molécula de azoto; as duas proteínas dissociam-se de modo a possibilitar uma nova transferência electrónica para a redutase, que volta então a associar-se à proteína FeMo e transfere o novo electrão para o centro FeMo. Este sequência repete-se as vezes necessárias para que seja totalmente efectuada a redução do N$_2$ a NH$_3$ e eventualmente a produção de H$_2$.
Os locais específicos de ligação do substrato e dos intermediários reaccionais ao cofactor FeMo não estão totalmente esclarecidos, assim como não é conhecido em pormenor o mecanismo da reacção. Apesar disto, existem estudos em mutantes da proteína FeMo que apontam para a existência da ligação a uma face específica do cofactor e diversos estudos espectroscópicos identificaram alguns dos intermediários reaccionais, nomeadamente o diazeno (N$_2$H$_2$) e a hidrazina (N$_2$H$_4$).
É geralmente aceite o seguinte modelo geral para o mecanismo catalítico:
* o ATP liga-se à proteína de ferro, induzindo uma alteração na sua conformação estrutural;
* a proteína de ferro, mais especificamente o seu centro [4Fe-4S]$^{2+}$, recebe um electrão do dador electrónico (por exemplo, ferredoxina), convertendo-se na forma reduzida [4Fe-4S]$^+$;
* a proteína de ferro associa-se à proteína FeMo, ocorrendo hidrólise simultânea do ATP a ADP e transferência do electrão do centro [4Fe-4S] para o centro P da proteína FeMo;
* ocorre dissociação das duas proteínas e libertação de ADP por parte da proteína de ferro; a proteína FeMo utiliza o electrão recebido num dos passos catalíticos de redução do N$_2$. O centro FeMo tem de receber 3 ou 4 electrões antes de poder ligar o N$_2$.

### Mecanismo proposto

Embora o mecanismo da redução do gás nitrogênio pelo cofator FeMoco ainda não seja totalmente esclarecido, há estudos e evidências que apontam para um mecanismo provável. Nesse mecanismo proposto, o FeMoco existe em nove estados possíveis:
* E0 - o estado original, como mostrado na imagem acima.
* E1 - o cofator recebe um íon H$^+$ e 1 elétron; um dos íons Fe$^{3+}$ é reduzido para Fe$^{2+}$. O hidrogênio recebido fica ligado a um dos enxofres equatoriais da estrutura (aqueles na altura do carbono central), que fica na forma de um grupo sulfidrila (-SH) entre dois átomos de ferro.
* E2 - o cofator recebe mais um próton e mais um elétron. Esse H$^+$ combina com o elétron e depois oxida o Fe$^{2+}$ de volta a Fe$^{3+}$, ficando na forma de um equivalente de hidreto (H$^–$) ligado entre dois ferros (formando, assim, uma ligação tricentrada Fe--H--Fe).
* E3 - o cofator recebe mais um elétron e íon hidrogênio. Outro ferro +3 é reduzido a +2 e o hidrogênio se liga a outro enxofre equatorial do cluster (semelhante ao estado E1).
* E4 - Semelhante ao estado E2, outro par H$^+$/e- é recebido. O hidrogênio se liga novamente entre dois ferros como um equivalente de hidreto, com o ferro reduzido na reação anterior sendo novamente oxidado, formando uma ponte [Fe$^{III}$--H--Fe$^{II}$--H--Fe$^{III}$] (com o ferro central divalente localizado próximo ao molibdênio). É nesta etapa que o gás nitrogênio se liga ao cofator, deslocando os dois hidretos ligados aos ferros como gás H 2 e deixando o átomo de ferro central reduzido ao estado de oxidação zero. É nesse suposto ferro zerovalente, localizado próximo ao átomo de molibdênio, que o N 2 permanece ligado, sob a forma de um complexo backbonding de dinitrogênio. O complexo [Fe$^0$$\leftarrow$N≡N], então, altera-se para [Fe$^{2+}$$\leftarrow$N$^-$=N$^-$] (com a mudança da ligação tripla do dinitrogênio para uma ligação dupla e consequente enfraquecimento dessa ligação) e abstrai os hidrogênios dos grupos -SH vizinhos para formar um equivalente de diazeno [Fe$\leftarrow$NH=NH].
* E5 - mais um par H$^+$/e- é recebido pelo cofator, ligando-se como hidreto aos ferros, mas rapidamente reduzindo o equivalente diazeno [Fe$^{2+}$$\leftarrow$NH=NH] para um equivalente hidrazinil, [Fe$^{3+}$–NH–NH 2]
* E6 - mais um par próton-elétron é recebido, com formação transitória de hidreto, que reduz o equivalente de hidrazinil [Fe$^{3+}$–NH–NH 2] a um equivalente de hidrazina, [Fe$^{2+}$$\leftarrow$NH 2–NH 2].
* E7 - mais um par próton-elétron é recebido, com formação transitória de hidreto, que reduz o equivalente de hidrazina [Fe$^{2+}$$\leftarrow$NH 2–NH 2] para um derivado amideto [Fe$^{3+}$–NH 2] com liberação de uma molécula de amônia (NH 3).
* E8 - o último par elétron-próton é recebido, reduzindo o equivalentede amideto [Fe$^{3+}$–NH 2] para um equivalente amino [Fe$^{2+}$$\leftarrow$NH 3], que rapidamente se decompõe liberando uma segunda molécula de amônia, retornando o cofator de volta ao estado E0 reiniciando o ciclo. O gás nitrogênio é, assim, completamente reduzido para amônia.

### Outros substratos e inibidores

A nitrogenase tem também a capacidade de reduzir acetileno a etileno, actividade esta aproveitada para a detecção da actividade enzimática; nalguns casos, o etileno pode ser reduzido a etano.
O óxido nítrico (NO) é um inibidor desta enzima, ligando-se ao centro FeS da proteína de ferro e possivelmente ao cofactor FeMo. Outros compostos azotados capazes de se ligarem ao centro FeMo incluem o óxido nitroso (N$_2$O) e o nitrito (NO$_2$$^-$), agindo ora como substratos ora como inibidores competitivos.
Outros compostos agem simultaneamente como substratos e inibidores reversíveis. Por exemplo, o ácido cianídrico (HCN) é reduzido pela nitrogenase a metano (CH$_4$), amoníaco (NH$_3$), metilamina (CH$_3$NH$_2$) e di-hidrogénio (H$_2$), dependendo das condições utilizadas no ensaio enzimático; por outro lado, a sua base conjugada cianeto (CN$^-$) é capaz de inibir a enzima ao desacoplar a desfosforilação do ATP e o fluxo de electrões. O monóxido de carbono (CO) e a azida (N$_3$$^-$) competem com o CN$^-$ pelo local de ligação à enzima.

## Síntese in vivo

Diversas proteínas participam no enovelamento das proteínas componentes da nitrogenase, na síntese dos centros metálicos e na sua inserção nas respectivas apoproteínas. A proteína NifB recebe ferro e sulfureto, mobilizados pelas proteínas NifU e NifS, e inicia a construção do cofactor FeMo, que sofre posterior maturação e inserção na nitrogenase catalisadas pelo complexo NifEN. Outras proteínas necessárias para a síntese do cofactor FeMo são a homocitrato sintase (NifV) e a NifQ, que mobiliza molibdénio. Também a dinitrogénio redutase participa na maturação da proteína FeMo, em particular na inserção do centro P, acção esta possivelmente coordenada com ainda outra proteína, NifZ.