# Lactoferrina

Lactoferrina (LF) ou Lactotransferrina (LTF) é uma proteína globular multifuncional isolada inicialmente de leite bovino. Ela pode exercer funções sob forma de holo-lactoferrina, ligada a íons de ferro, com peso molecular de ~80 kDa, ou sob forma apo-lactoferrina, com peso molecular de ~76 kDa.

## Histórico

A lactoferrina foi isolada pela primeira vez por Soerensen de leite bovino em 1939$^1$, e somente em 1960$^{2-4}$ três pesquisadores diferentes a isolaram simultaneamente de leite humano. A principal característica da proteína é a coloração vermelha intensa quando incubada na presença de íons de ferro Fe$^{3+}$. Portanto, a proteína foi reconhecida como proteína análoga a transferrina, proteína carreadora de ferro presente no soro sanguíneo. O nome lactoferrina é derivado da sua classificação na família das Transferrinas, sendo a principal proteína carreadora de íons de ferro no leite. Desde então diversos estudos demonstraram a expressão de lactoferrina, em menores concentrações do que no leite, em diferentes secreções mucosas como lágrimas, saliva, fluído seminal, secreções vaginais, bile, suco pancreático, secreções intestinais, em grânulos de neutrófilos e no plasma sanguíneo. $^{6-9}$
A principal característica físico-química da lactoferrina é a alta afinidade por íons Fe$^{3+}$ (K ~ 1022 M),$^{10-11}$ levando a supor que sua função biológica era absorção de ferro na nutrição infantil, ou como proteína com propriedade bactericida por privar bactérias do ferro essencial para seu crescimento.$^{12}$ Atualmente, diversas funções são reconhecidas e podem ser dependentes ou independentes da ligação da proteína com íons de ferro.

## Estrutura e Funções

A sequência de aminoácidos da lactoferrina foi determinada em 1984, e verificou-se que tinha ~60% de identidade com a transferrina do soro humano e compartilha a mesma duplicação interna, sendo assim a porção N-terminal da proteína tem ~40% de identidade com a porção C-terminal.$^{13}$ A estrutura tridimensional revela uma organização bilobada, lobo N-terminal e lobo C-terminal, com enovelamentos similares e sítios de ligação ao ferro idênticos.$^{14}$
As funções dependentes da ligação ao ferro da lactoferrina, inicialmente eram limitadas à capacidade de captação de ferro e privação do íon para bactérias que necessitam de ferro para seu crescimento. $^{15}$ Mais tarde, foram identificados outros mecanismos pelos quais a lactoferrina exerce função antibacteriana e antiviral. Portanto, a principal função da lactoferrina que depende de ferro é o transporte de ferro para o neonato e as vantagens nutricionais decorrentes da sua ingestão: alguns dados sugerem que no epitélio intestinal humano existem receptores para lactoferrina complexada ao ferro, assim como propriedades antioxidantes já foram relatadas à proteína ligada ao ferro. Desde 1985 a lactoferrina tem sido estudada e produzida como suplemento alimentar. $^{16}$ Assim, as propriedades da lactoferrina como um regulador do íon ferro livre no sangue e secreções, como um protetor lipídico antioxidante e como um concorrente (com receptores bacterianos membranares) para o ferro, estão diretamente ligadas à sua capacidade de ligação ao ferro. No entanto, algumas propriedades únicas da lactoferrina são independentes de ferro.
A lactoferrina pode se ligar à receptores de membrana específicos e tem efeitos citotóxicos em células procarióticas. Portanto, outro aspecto da sua atividade bactericida é a afinidade da lactoferrina por receptores e sua internalização, resultando em morte celular. $^{17}$ Células eucarióticas também possuem receptores específicos para lactoferrina, mas não necessariamente a interação levará a morte celular. A lactoferrina possui afinidade por receptores celulares como glicosaminoglicanas, e ao se ligar a tais receptores, os ocupam e impedem a ligação de partículas virais e sua internalização. Esse efeito antiviral já foi descrito para herpes simplex vírus$^{18}$, citomegalovírus$^{19}$, vírus da imunodeficiência$^{20-21}$, Mayaro vírus$^{22}$, zika vírus e chikunguya $^{23}$. Além de se ligar a polissacarídeos, a lactoferrina pode se ligar a receptores de natureza nucleotídica$^{24-27}$ e pode ser internalizada, penetrando no núcleo e tem a capacidade de ativar transcrição de genes específicos influenciando na proliferação e diferenciação celular.$^{28-32}$ Ainda foi descrito um papel imunológico da lactoferrina por ligação à receptores bacterianos, por influencia no metabolismo de células NK e pela contribuição na produção de citocinas e elementos do sistema complemento.$^{33-37}$
Finalmente, existe mais uma função que independe da ligação de ferro descrita que consiste na hidrólise de ácidos nucleicos. Em menores proporções, a lactoferrina tem atividade de ribonuclease clivando especificamente cadeias de pirimidinas e com atividade similar a RNase A (EC: 3.1.26.2).$^{38-39}$ A atividade enzimática mais significativa da lactoferrina é a de desoxirribonuclease e é similar a atividade da DNase I (EC: 3.1.21.1).$^{40}$

## Atividade Enzimática
### Substrato e Produtos

O sítio de ligação a ácidos nucleicos da lactoferrina tem afinidade por três sequências de DNA específicas: GGCACTT0 (G/A)C (ON1), TAGA(A/G)GATCAAA (ON2), e ACTACAGTCTACA (ON3). A lactoferrina tem dois centros de ligação à ácidos nucleicos e possuem afinidades diferentes ao substrato.$^{41}$ Para o substrato específico ON2, a razão entre as afinidades dos centros é de ~1200 enquanto que para oligonucleotídeos inespecíficos, esta razão aumentou para 30056. Ambos os centros estão localizados na porção N-terminal da proteína e coincidem significantemente com sítios de ligação de ânions. $^{41}$ Os substratos para a reação são fragmentos de DNA, com preferência para pirimidinas, e moléculas de água H$_2$O. Os produtos são 5’ fosfodinucleotídeos e 5’ fosfooligonucleotídeos.

### Purificação enzimática

A purificação de lactoferrina ocorre em cinco etapas: primeiramente, a amostra é centrifugada para separar a fração lipídica do leite materno. Em seguida, é realizada uma sequência de cromatografias: DEAE-celulose, heparina-sefarose e anticorpos anti-lactoferrina. A coluna de DEAE-celulose é uma cromatografia de troca iônica com resina carregada positivamente e que separa proteínas de ácidos nucleicos e proteínas carregadas negativamente. O filtrado passa pela resina de heparina-sefarose retendo na coluna, proteínas que tem afinidade à heparina, como a lactoferrina, que será recuperada ao final do experimento. Finalmente, a etapa que promove a obtenção de uma amostra homogênea de lactoferrina é a resina onde estão retidos anticorpos específicos anti-lactoferrina. As duas últimas cromatografias são definidas como cromatografias de afinidade. A ultima etapa é uma purificação suplementar por coluna Blue Sepharose onde há separação de frações da proteína com afinidade por ácidos nucleicos para subsequentes estudos dos parâmetros cinéticos da atividade enzimática. $^{38}$

### Parâmetros cinéticos

O valor de K$_m$ para a atividade de hidrólise de DNA da lactoferrina independe da composição e do tamanho da sequência de DNA atuante como substrato e está na faixa de 5 ± 2 mM. Enquanto que os valores de K$_{cat}$ variam mais dependendo da purificação da fração com maior atividade pela cromatografia com Blue Sepharose, uma vez que a enzima ligada à DNA pode ser retida pela resina e estar inativa durante o experimento de medida de velocidade catalítica. Portanto, ainda não existem medidas confiáveis de K$_{cat}$ nem da relação entre K$_{cat}$ e K$_m$. As medidas da razão K$_{cat}$/K$_m$ publicadas variam de 1,5x10$^{-3}$ a 8,0 x10$^{-3}$ M$^{-1}$min$^{-1}$.$^{40}$

### Moduladores da atividade enzimática

Inibidores específicos para lactoferrina ainda não foram relatados, entretanto, inibidor para DNase I humana conhecido é 2-(4-amidinofenil)-6-indolecarbamidina.$^{42}$ Um modificador químico que inativa a lactoferrina é um oligonucleotídeo derivado, T$_9$U$_{ox}$: análogo de 2’, 3’-dialdeído de d(pT)$_9$(pU). A atividade DNase da lactoferrina é ativada por ligação de ATP e pode ser acentuada na presença de NAD. O sítio de ligação de ATP é espacialmente separado do sítio de ligação ao DNA, sugerindo uma ativação alostérica. A atividade também aumenta quando em presença de alguns íons metálicos: Mg$^{2+}$, Mn$^{2+}$, Ca$^{2+}$, Cu$^{2+}$ e Zn$^{2+}$.$^{40}$

### Condições ótimas para reação

A reação de hidrólise de fita dupla de olligonucleotídeos acontece em pH ótimo neutro de 7,0 a 7,5. Ao hidrolisar oligonucleotídeos de fita simples, o pH ótimo desloca em direção a alcalinidade, 8,0 a 8,5.$^{40}$
Lactoferrina e células epiteliais intestinais
Foi verificada que ingestão e a infusão subcutânea de apoLactoferrina aumentou a atividade angiogênica mediada pelo Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-A), um importante regulador do desenvolvimento vascular (43), isso significou estímulo no crescimento em células do epitélio intestinal de ratos, aumentando a proliferação destas (44).
Em bezerros, a ingestão de leite enriquecido com lactoferrina associado à vitamina A, apontou proliferação celular no epitélio intestinal, destacando o crescimento de células na porção do jejuno e do íleo (45).
Devido à sua degradação no intestino, a quantificação da concentração fecal de lactoferrina foi utilizada como método não invasivo para avaliação da atividade inflamatória intestinal, mostrando valores diferentes entre indivíduos saudáveis e doentes e distinguindo a fase ativa e inativa do doença. Supondo que futuramente possa se detectar inflamação intestinal pelo teste rápido de determinação qualitativa de Lactoferrina (46, 47).