# Proteases da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2

Desde fevereiro de 2020 a Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou a síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) como uma pandemia e em pouco mais de dois anos e meio, foram registrados globalmente mais de 594 milhões de casos confirmados e 6,44 milhões de mortes. Visto que ainda não há um tratamento eficaz totalmente disponível e o surgimento das variantes de preocupação do SARS-CoV-2 podem escapar a resposta imune humoral à infecção natural ou vacinação, ainda há necessidade de identificar potenciais antivirais tanto por estudos de reposicionamento de fármacos quanto por design/avaliação de novos compostos químicos.
No processo de infecção e replicação do SARS-CoV-2, primeiramente a glicoproteína presente na superfície viral (do inglês spike protein) interage com duas enzimas localizadas na superfície celular: primeiro com a enzima conversora da angiotensina humana 2 (do inglês angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) e posteriormente com a serina-protease transmembranar (do inglês transmembrane serine protease, TMPRSS2) para entrar nas células. O ácido ribonucleico viral (vRNA) de sentido positivo é traduzido em poliproteínas que são autoclivadas por duas proteases virais: protease principal (do inglês main protease, M$^{pro}$) e semelhante à papaína (do inglês papain-like protease, PL$^{pro}$). Essas proteases virais desempenham papel crucial na clivagem da cadeia polipeptídica para gerar fragmentos funcionais denominados como proteínas não estruturais (do inglês non-structural proteins, nsp), mais especificamente a M$^{pro}$ tem como alvo pelo menos 11 sítios de clivagem, enquanto PL$^{pro}$ é responsável por produzir as nsp1, nsp2 e nsp3. Dessa forma, as proteases do SARS-CoV-2 se tornaram alvos cruciais na avaliação tanto de reposicionamento de fármacos quanto no design e desenvolvimento de novos inibidores ao assumir principalmente o conceito de leads-to-hit.

## Estrutura tridimensional e sítio catalítico da M$^{pro}$ e PL$^{pro}$ do SARS-CoV-2

A estrutura tridimensional da M$^{pro}$ do SARS-CoV-2 é organizada na forma homodimérica cujo monômero é constituído por três domínios diferentes: domínios I (8-100 resíduos), II (101-183 resíduos) e III (200-303 resíduos), sendo que o sítio catalítico não está próximo à interface do dímero, e é constituído pelos resíduos chaves His-41 e Cys-145 (díade catalítica) nos domínios I e II, respectivamente. O sítio de ligação ao substrato está posicionado dentro de uma fenda proteica denominada como bolsas S1, S1’, S2 e S4 entre os domínios I e II. Tem sido relatado que o imidazol do resíduo His-41 faz uma forte ligação de hidrogênio com uma molécula de água, denominada como água catalítica (H$_2$O$_{cat}$) por desempenhar um papel crucial como um pseudo terceiro resíduo catalítico (tríade catalítica não canônica). Diferentemente da enzima M$^{pro}$, a PL$^{pro}$ é um homotrímero composto por cadeias A, B e C unidas por um núcleo constituído por íon de Zn(II) e sua atividade catalítica está relacionada à tríade composta pelos resíduos de aminoácidos Cys-112, His-273 e Asp-287, sem a contribuição direta de moléculas de água na reação química que possa ser considerada como H$_2$O$_{cat}$.

## Inibidor sintético de M$^{pro}$ aprovado para uso emergencial pelo FDA e Anvisa

Em 2021, a empresa farmacêutica Pfizer desenvolveu o medicamento PAXLOVID$^{TM}$ - combinação entre PF-07321332 (atualmente denominado como nirmatrelvir) e ritonavir - tendo eficácia clínica na redução da hospitalização de pacientes com COVID-19 em 80%, reconfirmando a M$^{pro}$ como um alvo farmacológico muito importante. Assim, outros medicamentos que têm como alvo essa enzima merecem uma caracterização mais detalhada, para fornecer informações sobre as regiões farmacofóricas para a próxima geração de antivirais como anti-COVID-19. Vale ressaltar que o ritonavir não age diretamente na M$^{pro}$ do SARS-CoV-2 mas permite que o nirmatrelvir permaneça mais tempo na corrente sanguínea ao diminuir sua metabolização. No final de 2021, o U.S. Food and Drug Administration (FDA) autorizou o uso emergencial do PAXLOVID$^{TM}$ como um medicamento oral para adulto e com venda somente sob prescrição médica.
Em março de 2022 após avaliação pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), o Ministério da Saúde no Brasil anunciou a aprovação do PAXLOVID$^{TM}$ para uso emergencial pelo Sistema Único de Saúde (SUS) contra a COVID-19 nas formas leve e moderada da doença para quem tenha alto risco de complicações. A Anvisa verificou que o perfil das reações adversas do PAXLOVID$^{TM}$ é compatível com o que consta em bula de outros antivirais ou estão associados à doença de base, contudo o órgão público vetou que pacientes hospitalizados iniciem o tratamento com o remédio, assim como não recomenda o uso em grávidas e pacientes com insuficiência renal grave ou com falha renal.

## Reposicionamento do fármaco atazanavir como inibidor de M$^{pro}$ do SARS-CoV-2

O atazanavir (ATV), fármaco clinicamente aprovado e usado na inibição competitiva da protease do vírus da imunodeficiência humana (VIH), foi inicialmente descrito com atividade anti-SARS-CoV-2. Embora ensaios preliminares in silico e baseados em células (nas linhagens celulares Vero-E6 e A549), no início do surto pandêmico, tenham mostrado a viabilidade de reposicionamento do ATV, relatos controversos sobre seu mecanismo de ação na M$^{pro}$ e eficácia como anti-SARS-CoV-2 foram descritos posteriormente. No entanto, no ano de 2022 Chaves e colaboradores através de ensaios pré-clínicos (enzimáticos, moleculares, baseados em células e in vivo) demonstraram que tanto a linhagem SARS-CoV-2 B.1 quanto a variante B.1.1.28 (gama) são suscetíveis ao ATV. A M$^{pro}$ do SARS-CoV-2 é inibida pelo ATV via mecanismo competitivo dependente do conteúdo de água catalítica (H$_2$O$_{cat}$), sendo que a processividade da M$^{pro}$ foi inibida com constante inibitória de Morrison (K$_i$) 1,5 vezes maior que o controle GC376, aumentando o valor da constante de Michaelis-Menten (K$_m$) da enzima em mais de seis vezes. É improvável que a outra protease do SARS-CoV-2, tenha sido alvo do ATV nesses ensaios enzimáticos, uma vez que o valor de K$_i$ para PL$^{pro}$ estava acima do limiar de inibição in vitro. Ensaios baseados em células indicaram que diferentes linhagens de SARS-CoV-2 são suscetíveis ao ATV e os ensaios com camundongos transgênicos expressando o receptor ACE-2 humano (camundongos-K18-hACE2) confirmaram a proteção antiviral e anti-inflamatória do ATV contra a linhagem B.1.1.28