# Laboratorio di biologia/Western blot

Laboratorio di biologia
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Il western blot o immunorivelazione è una tecnica immunochimica che permette di identificare la presenza di una determinata proteina in una miscela di proteine separate elettroforeticamente, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici. Esistono poi variazioni quali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni ma ci si affida alla selettivitá antigene/anticorpo per rilevare esclusivamente la presenza o meno dell'antigene. Successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede alla reazione immunomediate ed alla rivelazione enzimatica del complesso antigene/anticorpo.
Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, quindi evitando il trasferimento su membrana, ma sono limitate all'analisi di un numero ristretto di proteine ad espressione elevata.
Qui di seguito indichiamo un protocollo di base, ottimo per un gran numero di proteine con le diluizioni e i tempi generalmente usati. Nella seconda parte della pagina verrà infatti spiegato come progettare un esperimento per la taratura di queste variabili.

#### Generalità sul trasferimento

In generale si utilizzano supporti di nitrocellulosa con porosità 0,45 μm; se le proteine da analizzare sono a basso peso molecolare, è consigliabile usare una porosità inferiore, ad esempio 0,2 μm. Occasionalmente vengono utilizzati supporti di PVDF (specialmente se la membrana servirà anche per il sequenziamento proteico) o nylon.
A seconda dell'apparecchio usato, si parla di trasferimento semi-dry (se il tampone è fornito solo dalla carta assorbente) o wet (se il "sandwich" è immerso in una camera contenente soluzione tampone).
Il trasferimento avviene applicando una corrente elettrica in un ambiente a pH basico (comunemente pH 8.5). In tal modo, le proteine migreranno verso l' anodo, in quanto ad un pH basico buona parte delle proteine è carica negativamente. Per accentuare la carica negativa delle proteine, si utilizza SDS a bassa concentrazione (meno dell' 1%) in quanto esso può inibire il legame delle proteine alla membrana.
In genere si applicano 0.8 V per centimetro quadrato da trasferire, per un tempo minimo di 30 minuti ad un massimo di 16 ore, a seconda delle proteine da separare.

#### Generalità sulla rivelazione

A questo punto, se la proteina è sufficientemente abbondante (per esempio, la porina), si procede alla rivelazione diretta mediante un anti-anticorpo legato ad un enzima (generalmente l'HRP, perossidasi di rafano). Questo enzima permette la conversione di un substrato solubile in uno non solubile, in stretta prossimita della proteina da rivelare. Un substrato chemioluminescente che è comunemente usato è il luminolo; in tale caso, il segnale deve essere catturato da CCD oppure da una pellicola fotografica.
La procedura verrà quindi separata in due parti: il trasferimento delle proteine e la rivelazione. Questa seconda parte è comune con la tecnica del Dot blot (con le dovute variazioni che saranno specificate nel testo)

## Protocollo
### Trasferimento

Il protocollo descritto di seguito prevede l'utilizzo di una cella di trasferimento (wet).
* Si parte da un gel di poliacrilamide su cui hanno corso delle proteine, lo si estrae dal supporto, si taglia via la parte dello stacking gel e lo si immerge nella soluzione di trasferimento per almeno 15 minuti.
* Si immergono nello stesso tampone i due supporti spugnosi, i due rettangoli di carta assorbente e la membrana di trasferimento lasciando anche questi per lo stesso tempo.
* Si predispone poi il sandwich di trasferimento nella cassettina in questo ordine partendo dal lato che sarà rivolto verso l'anodo (polo positivo) " da non confondere con l'anodo delle pile elettriche!:
** Spugna
** Carta
** Membrana
** Gel
** Carta
** Spugna
Prima di porre il secondo strato di carta eliminare le bolle d'aria tra la membrana e il gel con un rullo (o una pipetta) bagnati di tampone.
* Chiudere la cassettina senza disturbare il sandwich.
* Riempire l'apparato con il tampone di trasferimento.
* Introdurre nei binari la cassettina preparata avendo cura di rispettare le polarità; è importante infatti rivolgere la membrana di nitrocellulosa verso il polo positivo (anodo - per convenzione il cavetto è di colore rosso).
* Collegare gli elettrodi all'alimentatore selezionando l'opzione voltaggio costante ed impostando su 50 volt per due ore (nel caso sia necessario trasferire proteine fino a 60 KD) oppure 12 ore per proteine sopra i 100 KD. È bene selezionare un amperaggio massimo, nel caso in cui durante il trasferimento, l'amperaggio dovesse innalzarsi tanto da causare eccessivo calore. Se la cella può alloggiare un cubo di ghiaccio sintetico si possono selezionare 100-130 V ed abbreviare i tempi fino a 3-4 ore a seconda delle necessità. In alternativa, è possibile immergere la cella elettroforetica in una vasca più grande contenente ghiaccio fondente, ed utilizzare un agitatore magnetico per equilibrare la soluzione tampone.
* Terminato il processo, separare la membrana ponendola in un contenitore di dimensioni appena maggiori che non abbia irregolarità sul fondo.

### Preparazione della membrana e deposizione anticorpi

* Versare circa 20 ml di soluzione di Rosso Ponceau (soluzione allo 0,1%, in acido acetico 1%) nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min; drenare il colorante e decolorare con acqua distillata fino a quando non siano visibili le bande. Il colorante può essere riusato per un centinaio di volte.
** Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro e le lanes corse. Queste informazioni sono utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie lanes o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.
** È utile in questo passaggio incidere con un bisturi o taglierino nuovo dei minuscoli triangolini sul bordo della membrana per orientarsi quando la membrana sarà totalmente bianca: sul bordo alto in corrispondenza dei bordi delle singole lanes; Sul bordo prossimo ai pesi molecolari, in corrispondenza delle bande. Conviene inoltre tagliare una porzione dell'angolo in basso a sinistra (le due facce della membrana non sono uguali). Se non interferisce con il particolare anticorpo utilizzato, è anche possibile usare una penna con inchiostro blu.
** È consigliabile disegnare sul foglio provvisorio dell'esperimento la forma della membrana, la posizione dei triangolini con i numeri delle lanes e dei pesi molecolari e dell'angolo tagliato, le bande più evidenti alla colorazione con il rosso, eventuali bolle e, se si è tagliata la membrana, una mappa della stessa. In alternativa, è possibile inserire la membrana colorata con il rosso ponceau fra due fogli lucidi e fare una fotocopia della membrana.
* Opzionalmente si può colorare anche il gel di poliacrilamide residuo in coomassie blu per verificare l'efficienza di trasferimento.
* Per eliminare il rosso ponceau, utilizzare un piccolo volume (circa 10 ml) della soluzione tampone in cui verrà incubato l'anticorpo.
* Una volta decolorata aggiungere in sequenza i seguenti tamponi in modo tale che il loro livello sia meno di 1 mm superiore della superficie della membrana (prendere nota di tale volume), continuando ad agitare:
** NET-Gelatina 0,2% per 1 ora (opzionale, è preferibile nel caso si debbano visualizzare proteine poco espresse perché abbassa notevolmente il disturbo di fondo)
** Tre cambi di NET di 10 min ciascuno
** NET-Carnation 2-5% per 1 ora
** Tre cambi di NET di 10 min ciascuno
* Preparare una soluzione di anticorpo primario nel volume di NET annotato nel passaggio precedente.
** La concentrazione dell'anticorpo viene spesso indicata dalla casa produttrice solitamente 10 μg/ml per i monoclonali 10 volte di meno per i policlonali, tuttavia conviene effettuare dei western di prova per calibrare la quantità come indicato nel paragrafo apposito.
* Incubare per almeno 1 ora poi recuperare e conservare aggiungendo lo 0,02% di Azoturo di sodio in modo da poter essere riutilizzato per 5-10 volte. Anche la durata dell'incubazione va determinata come spiegato infra.
* Tre cambi di NET di 20 min ciascuno.
* Preparare una soluzione di anticorpo secondario perossidato (solitamente diluito 1:10000)nel volume di NET-Carnation (o gelatina)annotato nel passaggio 5. QUesta soluzione puoò essere usata per 4-5 volte, a patto di non superare i 5 giorni di conservazione.
* Tre cambi di NET di 20 min ciascuno.

### Rivelazione

Viene descritto il procedimento effettuato con substrato chemioluminescente (ECL o Luminolo) più complesso ma più preciso rispetto ad un sistema basato su un substrato precipitante come Diamminobenzidina.
* Preparare in camera oscura, un volume pari alla metà di quello annotato al punto 5 del precedente sottoparagrafo, di una soluzione composta di un ugual volume dal reagente A e dal reagente B del kit ECL.
* Versarlo nella vaschetta con la membrana e lasciare incubare 2 minuti
* Disporre in una cassetta di sviluppo con interposta un foglio di cellophane la mabrana sgocciolata e una lastra fotografica su cui si è riprodotto il taglio di un angolo che dovrà coincidere perfettamente con quello della membrana
* Sviluppare la lastra secondo le istruzioni fornite dal fornitore