# Laboratorio di biologia/Immunostaining

Laboratorio di biologia
Copertina Tutti i moduli · Sviluppo
* Istologia citologia
** Colorazioni istochimiche
*** Ematossilina eosinaLaboratorio di biologia/Ematossilina eosina
*** PASLaboratorio di biologia/PAS
*** Tricromica di MassonLaboratorio di biologia/Tricromica di Masson
*** Argentica
*** Reticolo
*** Cristal violetto
*** Giemsa
** Colorazioni citochimiche
*** Papanicolau
*** May Grunwald Giemsa
** Metodiche immunologiche
*** ImmunostainingLaboratorio di biologia/Immunostaining
* Colture cellulari
** Sterilità
** Conta cellulare spettrofotometricaLaboratorio di biologia/Conta cellulare spettrofotometrica
* Biologia molecolare
** Elettorforesi
*** SDS-PAGELaboratorio di biologia/SDS-PAGE
** Metodiche immunologiche
*** Western blotLaboratorio di biologia/Western blot
*** ELISALaboratorio di biologia/ELISA
* Biochimica
** Proteine
*** Saggio di BradfordLaboratorio di biologia/Saggio di Bradford
** Cromatografia
*** Cromatografia per affinità
*** FAC
* Appendici
** Appendice 1: unità di misura
** Appendice 2Laboratorio di biologia/Appendice 2
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Questa tecnica si usa per visualizzare in quali zone della sezione di tessuto si trovano determinati antigeni, per far questo si usano gli anticorpi.

## Materiali

* vetrino con una sezione non colorata
* vetrino coprioggetto
* un supporto per vetrini con manico lungo almeno 5-10 cm
* 8 vaschette di vetro la cui dimensione sia compatibile con quella del portavetrini
** 6 di queste andranno a formare la scala di idratazione/deidratazione e colorazione una per l'ematossilina e un'altra (preferibilmente in pirex) sarà usata per i passaggi di lavoro.
* Pipettatrice tipo gilson da 200 microlitri
* xilene, 2 vaschette
* etanolo assoluto, 2 vaschette
* etanolo 90°, 2 vaschette
* Emallume di Mayer (Ematossilina)
* acqua distillata 2 litri
* tampone citrato per IIC
* Soluzione di perossido di idrogeno al 3%
* PBS tampone fosfato in soluzione salina
* Siero di cavallo
* Anticorpo primario
* Anticorpo secondario coniugato con HRP
* Soluzione di diamminobenzidina DAB in tampone di reazione
* Montante per vetrini

## Protocollo
### Idratazione

Mettere il vetrino in stufa 60 °C fino a quando la paraffina non è diventata liquida.
Dopodiché si immerge:
* 20 minuti in xilene 1
* 15 min in xilene 2
* 10 min in etanolo assoluto 1
* 10 min etanolo assoluto 2
* 5 min in etanolo 90° 1
* 5 min in etanolo 90° 2
* 20 min i acqua distillata

### Smascheramento antigenico

Immergere i vetrini in tampone citrato e in tre cicli da 5' in microonde a 700W controllando che il livello dell'acqua copra sempre il vetrino, rabboccando con acqua distillata alla stessa riscaldata in parallelo. Oppure in bagnomaria a 98 °C Una volta finito lasciare raffreddare a temperatura ambiente e lavare 2 volte con acqua distillata.

### Inibizione delle perossidasi del campione

Mettere a bagno i vetrini con la soluzione di H$_2$O$_2$ per 20 min al buio. Sciacquare con acqua distillata

### Anticorpo primario

I successivi 3 passaggi vanno effettuati in camera umida.
Lavare con PBS (tampone fosfato) e depositare, dopo aver cerchiato le sezioni con la PAP pen, siero di cavallo diluito 1:100 v/v con PBS. Togliere il liquido con carta assorbnte e depositare uniformemente la soluzione dell'anticorpo primario da lasciare per 1 ora al buio. Lavare 3 volte in PBS.

### Anticorpo secondario

Cospargere i campioni con una soluzione di anticorpo secondario perossidato e lasciare agire per 20 min al buio. Lavare per tre volte con pbs

### Sviluppo

Aggiungere la soluzione di DAB (manipolare con cautela, è cancerogeno!) a lasciare 7 min al buio, neutralizzare le rimanenze e le gocce cadute al di fuori del vetrino con ipoclorito di sodio concentrato, che non deve toccare assolutamente i vetrini
Dopodiché sciacquare i vetrini in flusso di acqua di corrente, per 5 min.

### Contro colorazione

* Lavare in acqua distillata per 5 min
* Passare, agitando, i vetrini nella soluzione di ematossilina per al massimo 20 sec.
* sciacquare in acqua distillata agitando delicatamente
* virare in acqua di rubinetto per 4 minuti fino a quando il colorante vira da rosso a viola
* sciacquare in acqua distillata per 5 min

### Disidratazione e montaggio

Eseguire al contrario i passaggi di cui al punto primo (idratazione)
Cospargere il vetrino con un poco di montante.
Montare il vetrino coprioggetto e fare asciugare in stufa.

## Risultato

Questa e l'mmagine di un carcinoma mammario colorato per il recettore per gli estrogeni. La diamminobenzidina che ha reagito si colora in marrone e quindi le aree marroni della sezione sono quelle dove è presente l'antigene.