# Acqua doppiamente marcata

L'acqua doppiamente marcata è acqua dove gli atomi di idrogeno e di ossigeno sono stati entrambi parzialmente sostituiti con isotopi poco comuni di questi elementi, al fine di utilizzarla come tracciante. L'acqua doppiamente marcata è disponibile in commercio. Per motivi di praticità e sicurezza si usano normalmente gli isotopi non radioattivi deuterio (D) e ossigeno-18 ($^{18}$O). La principale applicazione è in campo biologico per misure di metabolismo, con il metodo noto con la sigla DLW.

## Metodo DLW

Il metodo DLW (dall'inglese Doubly Labeled Water = acqua doppiamente marcata), inventato negli anni cinquanta da Nathan Lifson e collaboratori, è usato per misurare il consumo metabolico durante un certo intervallo di tempo. Fino agli anni ottanta l'uso rimase circoscritto ad animali di piccola taglia a causa del costo dell'isotopo $^{18}$O. Negli anni settanta i metodi di spettrometria di massa si perfezionarono e il prezzo di $^{18}$O calò. La prima applicazione su esseri umani fu fatta da Dale Schoeller nel 1982.

### Principio del metodo

Il metodo si basa sul metabolismo del carbonio nel nostro corpo, e valuta la quantità di diossido di carbonio prodotto dal soggetto in un certo intervallo di tempo, determinando la quantità di deuterio e ossigeno-18 presenti in campioni di fluidi corporei (si può prelevare saliva, urina o sangue). Questa procedura ha il vantaggio di non richiedere le apparecchiature ingombranti per misurare scambi gassosi che sarebbero necessarie per misurare direttamente il diossido di carbonio. Il metabolismo del carbonio nel nostro corpo si può schematizzare nel modo seguente.
La respirazione cellulare demolisce molecole contenenti carbonio per ottenere energia, e come prodotto di scarto viene rilasciato diossido di carbonio. Il diossido di carbonio contiene due atomi di ossigeno e un atomo di carbonio (CO$_2$), ma molecole di nutrienti come i carboidrati non contengono abbastanza ossigeno da fornire i due atomi di ossigeno necessari a formare CO$_2$. L'ossigeno mancante viene preso dall'acqua presente nell'organismo. Se al soggetto è stata somministrata acqua doppiamente marcata, l'ossigeno dell'acqua è marcato con $^{18}$O, e anche il CO$_2$ prodotto dalle cellule conterrà $^{18}$O. In seguito il CO$_2$ passa attraverso il citoplasma della cellula, attraverso i fluidi interstiziali, entra nella circolazione del sangue e arriva nei polmoni. Durante questo tragitto il CO$_2$ viene parzialmente convertito in modo reversibile a bicarbonato, e l'$^{18}$O si equilibra distribuendosi nel bicarbonato e nel CO$_2$ disciolti all'interno del corpo (ciò è dovuto all'azione dell'enzima carbonato deidratasi). Quando il CO$_2$ viene espirato, il corpo perde $^{18}$O. Un'altra parte di $^{18}$O viene eliminata dal corpo come acqua (urina, sudore e altri fluidi). Di conseguenza $^{18}$O viene eliminato come CO$_2$ e come H$_2$O. Il deuterio, secondo elemento marcato, viene invece eliminato solo attraverso l'acqua. Così, la misura del calo di deuterio su campioni di fluidi corporei si può usare per compensare matematicamente la perdita di $^{18}$O attraverso l'acqua e valutare quanto CO$_2$ è stato prodotto. Da questo valore si può stimare quale è stato il fabbisogno calorico nell'intervallo di tempo considerato.

### Somministrazione

L'acqua doppiamente marcata può essere somministrata per iniezione o per via orale (come si fa generalmente per l'uomo). Dato che gli isotopi vengono diluiti all'interno dell'acqua presente nell'organismo, non c'è bisogno di somministrarli in forma di particolare purezza isotopica, e neanche di partire da acqua che sia doppiamente marcata. Non è neanche necessario somministrare un atomo di $^{18}$O ogni due atomi di deuterio. In pratica tutto dipende dal costo dell'acqua arricchita con $^{18}$O e dalla sensibilità dello spettrometro di massa che si utilizza. La maniera più semplice per preparare acqua doppiamente marcata per studi di metabolismo è quella di mescolare una certa quantità di acqua pesante contenente il 90-99% di deuterio con una certa quantità di acqua arricchita in $^{18}$O. In questo modo il campione di acqua preparato contiene sia deuterio che $^{18}$O in quantità enormemente maggiore dell'acqua normale, ed è quindi "doppiamente marcata". Il rapidissimo scambio degli idrogeni tra molecole d'acqua tramite i normali processi di autoionizzazione assicura l'uniforme distribuzione degli isotopi in tutto il campione (e anche all'interno del corpo una volta che l'acqua doppiamente marcata è stata somministrata).

### Applicabilità

Il metodo DLW è molto utile per misure di metabolismo che si estendono a periodi relativamente lunghi di tempo (giorni o settimane) su soggetti in cui altri tipi di misure calorimetriche dirette o indirette sarebbero difficili o impossibili. Ad esempio, si può misurare il metabolismo di animali allo stato libero. Nella maggior parte dei casi si cattura l'animale e gli si inietta l'acqua doppiamente marcata, poi lo si tiene in cattività per un certo tempo fino alla raccolta del primo campione di sangue. Questo tempo è necessario per permettere agli isotopi di distribuirsi uniformemente nel sangue, e dipende dalla taglia dell'animale; per animali piccoli bastano 30 minuti mentre per animali molto grandi possono essere necessarie anche 6 ore. L'animale può quindi essere rilasciato e ricatturato dopo intervalli di tempo opportuni per successivi prelievi di sangue.
Gli isotopi deuterio e $^{18}$O usati nell'acqua doppiamente marcata non sono radioattivi, e non sono tossici nelle dosi utilizzate (vedi tossicità dell'acqua pesante). Misure di metabolismo con acqua doppiamente marcata sono state effettuate sia in volontari che su bambini e donne incinte. Questa tecnica è stata usata su oltre 200 specie di animali selvatici (soprattutto uccelli, mammiferi e alcuni rettili).