# Biologie cellulaire/Clonage et hybridation

Le but de cette page est de présenter les méthodes d'hybridation et de clonage en biologie moléculaire. Pour faciliter la compréhension des données théoriques, un exemple concret a été choisi et c'est lui qui sert de charpente à tout cet article.

## Caractéristiques du travail

Sujet: « Clonage du fragment homologue à l'orf86a de Marchantia polymorpha chez Solanum tuberosum L. et étude de sa structure et conservation. »

## Présentation

Les végétaux terrestres contiennent trois génomes différents : nucléaire, chloroplastique, mitochondrial. Le génome nucléaire, très grand en terme de longueur d'ADN, est globalement connu à partir d'une approche génétique et non moléculaire. Par contre, les deux autres génomes sont plus petits et leur ADN peut être séquencé relativement facilement. On connait ainsi la séquence intégrale des ADN chloroplastiques d'un certain nombre de plantes (tabac, riz) dont les longueurs sont toujours de l'ordre de 150 kb (1kb = 1000 paires de nucléotides). Une plus grande taille des ADN mitochondriaux (ADN mt) des plantes (variant suivant la plante entre 300 et 600 kb) explique le retard pris dans le séquençage intégral d'ADN mt.
Néanmoins, il existe à l'heure actuelle au moins deux séquences complètes : celle de l'ADN mt d'une Bryophyte, Marchantia polymorpha, et celle de la plante supérieure (Angiosperme) Arabidopsis thaliana. Beaucoup de travaux antérieurs à ces séquençages intégraux ont été consacrés à définir le contenu en gènes du génome mitochondrial des angiospermes; les mêmes gènes mitochondriaux étaient apparemment retrouvés chez toutes les plantes.
Néanmoins, plusieurs études ont montré que certains de ces gènes étaient absents de l'ADN mt de quelques espèces et que chez ces mêmes espèces la séquence correspondante était retrouvée dans le génome nucléaire.
De ces observations on a tiré la conclusion que des gènes mitochondriaux peuvent occasionnellement être transférés puis intégrés dans le génome nucléaire. La mise en évidence du contenu complet en séquences codantes de l'ADN mt du Bryophyte Marchantia polymorpha a permis de réaliser qu'un certain nombre de ces séquences ne correspondaient pas à des séquences déjà identifiées chez les plantes supérieures alors qu'inversement toutes les séquences de gènes mitochondriaux déjà identifiées chez les plantes supérieures avaient leur homologue chez Marchantia polymorpha.
Il est donc tentant d'essayer de compléter notre connaissance du jeu de gènes mt des plantes supérieures en recherchant si ― et si oui lesquelles ― des séquences analogues aux séquences codantes mt de Marchantia polymorpha peuvent y être identifiées.

## Objectif du laboratoire

Le but des recherches est donc d'identifier de nouvelles séquences codantes mitochondriales chez les plantes supérieures (Angiospermes) à l'aide de sondes hétérologues correspondant aux gènes « putatifs » présents dans le génome mitochondrial de Marchantia polymorpha et de caractériser leur structure et leur expression.

## Objectif du travail

Le but de ce travail est le clonage et le séquençage d'un fragment d'ADN mt de pomme de terre (Solanum tuberosum L.) homologue à la séquence de l'orf86a ("orf" : cadre de lecture ouvert) de Marchantia polymorpha, l'étude de sa structure et de son degré de conservation.
Cette recherche sera menée à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire : électrophorèse sur gel, centrifugation en gradient de CsCl, PCR, hybridation ADN/ADN du type Southern, clonage de gènes dans pBluescript, transformation d'E.Coli, séquençage d'ADN.

## Plan de travail
### Extraction de l'ADN mt de pomme de terre

* Extraction des mitochondries de Solanum tuberosum L.
* Extraction de l'ADNmt et restriction enzymatique de ce même ADN.
* Séparation sur gel d'agarose des différents fragments obtenus.
* Empreinte du gel (Southern Blot) sur une membrane de nylon.

### Hybridation de la séquence de l'orf86a de Marchantia polymorpha avec l'ADN mt de pomme de terre digéré par différentes enzymes de restriction

* Augmentation du stock d'orf86a par PCR.
* Purification et quantification de cet orf86a.
* Préparation des sondes radioactives a partir d'orf86a.
* Hybridisation sur la membrane de nylon.
* Lavage, exposition sur un film radiosensible et révélation.

### Sélection d'un fragment de restriction de l'ADN mt de pomme de terre portant la séquence homologue à l'orf86a de Marchantia polymorpha

* Calcul de la taille du fragment homologue.
* Migration de l'ADNmt de Solanum tuberosum L. sur gel d'agarose.
* Récupération du fragment homologue à l'orf86a.
* Purification et quantification de ce même fragment

### Clonage du fragment et transformation d'E.Coli

* Digestion de pBluescript avec la même enzyme qui a servi à digérer S. tuberosum.
* Clonage du fragment homologue dans le plasmide pBluescript.
* Transformation dans E.Coli compétente.
* Criblage des cellules transformées
* Culture de E.Coli transformée et expression du nouveau gène.

## Annexes
### L'ADN mt de Marchantia polymorpha.

Nous recherchons une carte de l'ADN mitochondrial de Marchantia polymorpha libre de droit pour l'insérer ici.
* L'orf86a de Marchantia polymorpha est une séquence codant l'équivalent de 86 acides aminés.

### Qu'est-ce qu'une « orf » ?

* Orf ou Open Reading Frame est en fait une portion d'ADN comprise entre un codon START et un codon STOP de transcription. On peut donc supposer qu'un gène est susceptible de s'exprimer entre ces deux codons.

### Cloner un gène dans pBluescript.

* Pour cloner un gène de Solanum tuberosum L. dans le plasmide pBluescript il suffit d'ouvrir le plasmide avec la même enzyme de restriction qui a servi à fractionner l'ADNmt de la pomme de terre et d'y insérer ledit gène.

## Ailleurs sur le net

* Articles issus du site du CGDC de l'Université Paris-Sud :
** Article très intéressant présentant les "Théories sur l'origine des eucaryotes"
** Autre article présentant "La mitochondrie"
* La publication liée à cette recherche
** Transcription of succinate dehydrogenase subunit 4 (sdh4) gene in potato: detection of extensive RNA editing and co-transcription with cytochrome oxidase subunit III (cox3) gene