# Gélose ADN-bleu de toluidine

La gélose à ADN au bleu de toluidine est utilisée pour déterminer la présence d'une activité nucléase chez un micro-organisme.
En routine, on l'utilise pour identifier l'expression d'une DNAse thermorésistante (ou thermonucléase TNase) caractéristique de l'espèce Staphylococcus aureus.

## Usage

Recherche de la DNAse thermorésistante de Staphylococcus (Microbiologie alimentaire et médicale)

## Principe

* Dans un premier temps élimination des nucléases thermolabiles par chauffage (notamment de Staphylococcus epidermidis et Micrococcus sp.)
* Métachromasie du bleu de toluidine vers le rouge/rose du fait de l'action de la TNase sur l'ADN du milieu (en présence de Ca$^{++}$)
* Le bleu de toluidine colore les nucléotides en rose.

## Composition

Composition basé sur Les Milieux de culture de N. Marchal, J.L. Bourdon et Cl. Richard
(pH final = 8.6)

## Préparation

Milieu prêt à l'emploi. Il est possible de la fabriquer à partir des constituants de base.

## Recherche de la DNAse thermostable ou Thermonucléase

La DNAse thermostable est une enzyme qui résiste à la chaleur (100 °C pendant 15 minutes) et qui dégrade l'ADN selon la réaction :
    $ADN\longrightarrow Nucl{\acute {e}}tides\ ou\ polynulc{\acute {e}}otides.$

### Technique

Ensemencer un bouillon cœur-cervelle pendant 24 heures à 37 °C, ou 3 à 4 heures sous agitations, avec la souche à étudier.
En placer, une partie 15 min au bain-marie (100 °C) et conserver le reste.
Percer la gélose de 3 trous. Inoculer quelques gouttes :
* De bouillon stérile dans le premier puits. (contrôle négatif)
* De bouillon chauffé, et refroidi, dans le second puits.
* De bouillon non chauffé dans le troisième. (facultatif - contrôle positif)
Incuber 4 heures à 37 °C.
Remarques : bien noter le contenu de chaque puits au dos de la boîte de Petri. Limiter à quelques gouttes de bouillon sans faire déborder les puits. Incuber la gélose sans retourner la boîte.

### Lecture

L'observation d'un éventuel halo rose de métachromasie signe la présence d'une DNAse autour des trous percés sur le fond bleu de la gélose.
* Puits témoin : contenant du bouillon cœur cervelle stérile
* Puits contenant du milieu cœur cervelle avec la souche à étudier
* Puits contenant du milieu cœur cervelle ensemencé puis chauffé a 100 °C pendant 10 minutes
* Si le puits 1 devient rose, le test est à recommencer.
* Si le puits 2 devient rose et que le puits 3 reste bleu, la souche possède une DNase non thermostable.
* Si les puits 2 et 3 sont roses, la souche possède une DNase thermostable (donc S. aureus si Coque Gram positif)

## Limites

* Présence de TNase chez S. hyicus, S. intermedius, S.lugdunensis et S. schleiferi

## Alternative simplifiée

Une autre méthode proposée par Diagnostics Pasteur peut également être utilisée. Voici en quoi elle consiste :
* Sur Baird-Paker, après 24 h de culture (habituellement 48 h)
* Observer les boîtes à la recherche de colonies suspectes (colonies noires avec halo clair)
* Placer ces boîtes à 60 °C durant 2 heures et laisser refroidir
* Recouvrir le milieu Baird-Paker de milieu ADN-Toluidine en surfusion (~45 °C) et laisser prendre en masse.
* Incuber à 37 °C durant 3 à 4 heures
* Observer le résultat
Les zones de halos roses sont, ici également, caractéristiques d'une thermonucléase présente chez les bactéries des colonies suspectes.