# Oligonukleotido

Oligonukleotidoak DNA edo RNAren sekuentzia laburrak dira, berrogeita hamar base pare edo gutxiagoz osatuak.
Funtzio desberdinak dituzte: anplifikazio erreakzioetan abiarazle gisa erabiltzen dira, hibridazio-zunda gisa eta RNA mezulariaren blokeo espezifikorako.

## Olionukleotidoen sintesia

Oligonukleotidoa hainbat nukleotidoz osatutako molekula konplexua da, eta horietako bakoitza base nitrogenatu batek, karbohidrato batek eta fosfato talde batek osatzen dute.
Oligonukleotidoen sintesia hainbat erreakziotan oinarritzen da, hauetan, molekularen zentro erreaktibo desberdinak ziklikoki babestu eta babesgabetzen dira:
* 2' Hidroxilo babeslea: Tert-butil dimetilsililoa (TBDMS).
* Fosfato askearen babeslea: B-zianoetil.
* Oinarrien heterozikloen babeslea: amida talde desberdinak.

## Terapia genikoan erabilera

Oligonukleotidoak terapia genikoan erabiltzen dira geneak isilarazteko estrategia gisa. Horretarako, isilarazi nahi diren geneen ARN mezulariaren osagarri diren 12 eta 20 base pareko oligonukleotidoak erabiltzen dira.
Zelula barruan, oligonukleotidoa bere xedeko mRNArekin lotzen da eta haren itzulpena blokeatzen du, hau da, erribosomak mRNA itzuliko du oligonukleotidoa aurkitu eta prozesua gelditu arte. Gainera, teknika honen beste abantaila bat, RNasaHk oligo-RNA hibridoa ezagutzen eta degradatzen duela da. Garrantzitsua da oligonukleotidoa itzulpenaren hasieratik hurbil diseinatzea edo sor daitekeen produktuak funtzio biologikorik ez duela ziurtatzea, isiltzea eraginkorra izan dadin.
Terapia genikorako oligonukleotido idealek ezaugarri hauek izan behar dituzte:
* Material genetikoarekin konplexu egonkorrak osatu behar dituzte.
* Helburuarekiko espezifikoak izan behar dute.
* Egonkortasun handia eta ohikoa baino erdi-bizitza luzeagoa izan behar dute nukleasei aurre egiteko.
* Zelularen mintzetatik leunki pasatzeko gai izan behar dute.
* Ez dira organoetan edo zelula organuluetan metatu behar.
* Bere tamaina 18 eta 20 oinarri-pare artekoa izan behar du.
Oligonukleotidoak in vivo erabil daitezke, baina oso erdi-bizitza laburra eta kontzentrazio baxua dute.
Hain zuzen ere, iraupen luzeko efekturik ez dutenez, oligonukleotidoeta oinarritzen den terapia genetikoaren arazo nagusiena ondoz ondoko dosien beharra da. Kimikoki eraldatu egiten dira erdi-bizitza luzeagoa izateko, bai fosfato-zubietako oxigenoan, bai oinarrietan, bai lotura-zubietan aurkitzen ez den fosfatoan. Beraz, droga/sendagaitzat hartzen dira, ez baitute DNA aldatzen eta degradatzen amaitzen baitute.
Oligonukleotidoen erabilera posibleak terapia antibiraletan, bakterioen terapian, terapia antiparasitarioan, minbiziaren aurkako ex vivo terapian, azaleko gaixotasunen tratamenduan, hanturaren inhibizioan, onkogenen kentzean edo gene nagusien kentzean izan daitezke.

## Aldaketa kimikoak

Kimikoki egonkorrak diren oligonukleotido laburrak sortzea izan zen oligonuklotido terapiak garatzeko lehen erronka. Naturan dauden oligonukleotidoak erraz degradatzen dituzte nukleasek, nukleotidoak zatitzen dituzten zelula mota guztietan dauden entzimak. Oligonukleotidoen sekuentzia laburrek ere lotura-afinitate ahulak dituzte, eta horrek in vivo degradatzen laguntzen du.
Bizkarrezurreko aldaketak
Nukleotidoen organotiofosfato nukleosidoen (PS) analogoek propietate onuragarri batzuk ematen dizkiete oligonukleotidei. PS bizkarrezurrek nukleotidoei ematen dizkieten propietate onuragarri nagusiak nukleotido bakoitzaren diastereomeroen identifikazioa eta fosforotioato nukleotidoen inguruko erreakzioak erraz jarraitzeko gaitasuna dira, hau da, oligonukleotidoen sintesian erabilgarria. Oligonukleotidoen PS bizkarrezurreko aldaketek entzimek nahi ez duten degradaziotik babesten dituzte. Nukleotidoen bizkarrezurra aldatzea oso erabilia da, nukleotido gehienetan erraztasun eta zehaztasun erlatiboz lor daitekeelako. Oligonukleotidoen 5' eta 3' muturreko aldaketa fluoreszenteak jakinarazi ziren oligonukleotidoen egiturak, dinamikak eta elkarrekintzak ingurunearekiko ebaluatzeko.
Azukre eraztun aldaketak
Oligonukleotidoen aplikazio medikoetarako erabilgarria den beste aldaketa bat 2' azukre aldaketak dira. 2’ posizioko azukrea aldatzeak oligonukleotidoen eraginkortasuna areagotzen du, oligonukleotidoen xede-lotura gaitasunak hobetuz, bereziki zentzuaren aurkako oligonukleotidoen terapietan. Proteinen lotura ez-espezifikoa ere murrizten dute, proteina zehatzak bideratzeko zehaztasuna areagotuz. Gehien erabiltzen diren aldaketetako bi 2'-O-metiloa eta 2'-O-metoxietiloa dira. Nukleobasean aldaketa fluoreszenteak ere jakinarazi ziren.

## Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak

Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak (ASO, -inglesez-) aukeratutako sekuentzia baten osagarri diren DNA edo ARN kate bakarrekoak dira. Zentzuaren aurkako RNAren kasuan, RNA mezulari batzuen kate batzuen proteina-itzulpena ekiditen dute haiekin lotuz, hibridazio izeneko prozesu batean. Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak ARN espezifiko eta osagarri (kodetzailea edo ez-kodetzailea) bideratzeko erabil daitezke. Lotura gertatzen bada hibrido hau RNasa H entzimak degradatu dezake. RNase H RNA hidrolizatzen duen entzima bat da, eta zentzuaren aurkako oligonukleotidoen aplikazio batean erabiltzen denean, mRNAren adierazpenaren % 80-95 beheranzko erregulazioa eragiten du.
Morpholino zentzuaren aurkako oligonukleotidoen erabilera ornodunen gene-eraizketarako, gaur egun garapenaren biologian teknika estandarra dena eta geneen adierazpen aldatua eta geneen funtzioa aztertzeko erabiltzen dena, Janet Heasman-ek garatu zuen Xenopus erabiliz. FDAk onartutako Morpholino sendagaien artean eteplirsen eta golodirsen daude. Zentzuaren aurkako oligonukleotidoak ere erabili izan dira gripearen birusaren erreplikazioa zelula-lerroetan inhibitzeko.
Zentzuaren aurkako oligonukleotidoen terapiak proteina mutante bakar baten ondorio diren gaixotasun neuroendekapenezkoak aproposak dira, terapia hauek selektibitate handiko RNAren sekuentzia oso zehatzak bideratzeko eta aldatzeko duten gaitasunak baitituzte. Gaixotasun genetiko asko, besteak beste, Huntingtonen gaixotasuna, Alzheimer gaixotasuna, Parkinsonen gaixotasuna eta alboko esklerosi amiotrofikoa (ALS) DNAren alterazioekin lotuta daude, RNA sekuentzia okerrak eragiten dituztenak eta efektu fisiologiko toxikoa duten proteina gaizki itzuliak sortzen dituzte.

## Zeluletan barneratzea

Zeluletan hartzea/barneratzea oligonukleotido terapeutiko arrakastatsurako oztoporik handiena da oraindik. Molekula txikiko sendagai gehienen antzera aprobetxamendu zuzena, bizkarrezur polianionikoak eta ONen tamaina molekularrak oztopatzen du. Ekintza-lekurantz iristeko eta zelula barneko trafikoan bidaiatzeko mekanismo zehatzak oraindik ez daude argi. Gainera, ON egitura/aldaketaren desberdintasun txikiek eta zelula-motaren desberdintasunak aprobetxamenduan desberdintasun handiak eragiten dituzte. Uste da zelulen harrapaketa bide ezberdinetan gertatzen dela ONak zelulen gainazalean xurgatu ondoren. Nabarmentzeko, ikerketek erakusten dute ehun-hazkuntzako zelula gehienek erraz hartzen dituztela ASOak modu ez-produktiboan, hau da, ez da zentzuaren aurkako efekturik ikusten. ASO-ren komunztadurak G-akoplatutako errezeptoreek ezagutzen dituzten ligandoekin konjugatzeak ekoizpen produktiboa areagotzen du. Sailkapen horren ondoan (ez produktiboa vs. produktiboa), zelulen barneratzea gehienetan energiaren menpeko era batean egiten da (hartzaileen bidezko endozitosia), baina baliteke energiatik independentea den difusio pasiboa (=gimnosia) ez baztertzea. Zelula-mintza igaro ondoren, ON terapeutikoak endosoma goiztiarretan kapsulatzen dira, eta azken finean pH baxuan entzima degradatzaileak dituzten lisosomekin fusionatzen diren endosoma berantiarretara garraiatzen dira. Bere funtzio terapeutikoa gauzatzeko, ONak endosomatik ihes egin behar du degradatu aurretik. Orain arte, ez dago metodo unibertsala emate, zelulen harrapaketa eta ihes endosomikoaren arazoak gainditzeko, baina badira zelula zehatzetara (haien errezeptoreak barne) egokitutako hainbat planteamendu. Oligonuckleotidoa eta zelulen ezagutze/hartzeaz arduratzen den entitate batekin konjugatzeak hartzailea areagotzeaz gain (ikus supra), zelulen aprobetxamenduaren konplexutasuna murrizten duela uste da. Hau molekula-ON konjugatu txikiekin lortu da, adibidez, hepatozitoen errezeptoreak zuzentzen dituen N-acetil galaktosamina bat dutenak. Konjokatu hauek adibide bikaina dira zelulen aprobetxamendu handitzea lortzeko bideratuarekin batera, dagozkien errezeptoreak xede-zeluletan gehiegi adierazita baitaude, xede-zeluletan zuzendutako terapeutiko bat lortzeko (konparatu minbizi-zeluletan gehiegi adierazitako errezeptoreak ustiatzen dituzten antigorputz-droga konjokatuak). Oligonukleotidoen zelulen bidalketa eta zelulen aprobetxamendu handitzeko oso erabilia eta asko ikertutako beste entitate bat antigorputzak dira.

## Teknika analitikoak
### Kromatografia

Alkilamidak fase geldi kromatografiko gisa erabil daitezke. Fase horiek oligonukleotidoak bereizteko ikertu dira. Ioi-bikote alderantzizko faseko errendimendu handiko kromatografia likidoa, sintesi automatizatuaren ondoren oligonukleotidoak bereizteko eta aztertzeko erabiltzen da.

### Masa-espektrometria

Azido 5-metoxisalizilikoaren eta esperminaren nahasketa bat, oligonukleotidoen analisirako matrize gisa erabil daiteke MALDI masa-espektrometrian. ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) oligonukleotidoen masa ikertzeko tresna indartsua da ere.

### DNA mikroarray-ak

DNA mikroarray-ak oligonukleotidoen aplikazio analitiko erabilgarria dira. cDNA mkroarray-ak estandarrekin alderatuta, espezifikotasun kontrolatuagoa dute hibridazioan baino gehiago, eta splicing alternatiboa duten sekuentzien ​​edo poliadenilatutako sekuentzien presentzia eta prebalentzia neurtzeko gaitasuna dute. DNA mikroarry azpimota bat dentsitate handian oligonukleotidoa lotu zaizkien substratu gisa deskriba daiteke (nylona, ​​beira, etab.). Bizitza zientzien barruan DNA mikroarrayen aplikazio ugari daude.

## Erreferentziak

* ↑ (Ingelesez) Frazier, Kendall S.. (2015-01). «Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist’s Perspective» Toxicologic Pathology 43 (1): 78–89. doi:10.1177/0192623314551840. ISSN 0192-6233. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* 1 2 (Ingelesez) DeVos, Sarah L.; Miller, Timothy M.. (2013-07-01). «Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA» Neurotherapeutics 10 (3): 486–497. doi:10.1007/s13311-013-0194-5. ISSN 1878-7479. PMID 23686823. PMC PMC3701770. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* 1 2 Eckstein, Fritz. (2000-04-01). «Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides: What Is Their Origin and What Is Unique About Them?» Antisense and Nucleic Acid Drug Development 10 (2): 117–121. doi:10.1089/oli.1.2000.10.117. ISSN 1087-2906. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ academic.oup.com (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* 1 2 Michel, Benoît Y.; Dziuba, Dmytro; Benhida, Rachid; Demchenko, Alexander P.; Burger, Alain. (2020). «Probing of Nucleic Acid Structures, Dynamics, and Interactions With Environment-Sensitive Fluorescent Labels» Frontiers in Chemistry 8 doi:10.3389/fchem.2020.00112/full. ISSN 2296-2646. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* 1 2 aacrjournals.org (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ Crooke, Stanley T.. (2017-04-01). «Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides» Nucleic Acid Therapeutics 27 (2): 70–77. doi:10.1089/nat.2016.0656. ISSN 2159-3337. PMID 28080221. PMC PMC5372764. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Heasman, Janet; Kofron, Matt; Wylie, Chris. (2000-06-01). «βCatenin Signaling Activity Dissected in the Early Xenopus Embryo: A Novel Antisense Approach» Developmental Biology 222 (1): 124–134. doi:10.1006/dbio.2000.9720. ISSN 0012-1606. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Kumar, Prashant; Kumar, Binod; Rajput, Roopali; Saxena, Latika; Banerjea, Akhil C.; Khanna, Madhu. (2013-11-01). «Cross-Protective Effect of Antisense Oligonucleotide Developed Against the Common 3′ NCR of Influenza A Virus Genome» Molecular Biotechnology 55 (3): 203–211. doi:10.1007/s12033-013-9670-8. ISSN 1559-0305. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Kumar, B.; Khanna, Madhu; Kumar, P.; Sood, V.; Vyas, R.; Banerjea, A. C.. (2012-05-01). «Nucleic Acid-Mediated Cleavage of M1 Gene of Influenza A Virus Is Significantly Augmented by Antisense Molecules Targeted to Hybridize Close to the Cleavage Site» Molecular Biotechnology 51 (1): 27–36. doi:10.1007/s12033-011-9437-z. ISSN 1559-0305. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ academic.oup.com (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Smith, Richard A.; Miller, Timothy M.; Yamanaka, Koji; Monia, Brett P.; Condon, Thomas P.; Hung, Gene; Lobsiger, Christian S.; Ward, Chris M. et al.. (2006-08-01). «Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease» The Journal of Clinical Investigation 116 (8): 2290–2296. doi:10.1172/JCI25424. ISSN 0021-9738. PMID 16878173. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ academic.oup.com (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Hawner, Manuel; Ducho, Christian. (2020-01). «Cellular Targeting of Oligonucleotides by Conjugation with Small Molecules» Molecules 25 (24): 5963. doi:10.3390/molecules25245963. ISSN 1420-3049. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ Crooke, Stanley T.; Wang, Shiyu; Vickers, Timothy A.; Shen, Wen; Liang, Xue-Hai. (2017-03). «Cellular uptake and trafficking of antisense oligonucleotides» Nature Biotechnology 35 (3): 230–237. doi:10.1038/nbt.3779. ISSN 1546-1696. PMID 28244996. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ academic.oup.com (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Buszewski, B.; Kasturi, P.; Gilpin, R. K.; Gangoda, M. E.; Jaroniec, M.. (1994-08-01). «Chromatographic and related studies of alkylamide phases» Chromatographia 39 (3): 155–161. doi:10.1007/BF02274494. ISSN 1612-1112. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Buszewski, Bogusław; Safaei, Zahra; Studzińska, Sylwia. (2015-01-01). «Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography with alkylamide stationary phase» Open Chemistry 13 (1) doi:10.1515/chem-2015-0141. ISSN 2391-5420. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Gilar, Martin; Fountain, Kenneth J.; Budman, Yeva; Neue, Uwe D.; Yardley, Kurt R.; Rainville, Paul D.; Russell II, Reb J.; Gebler, John C.. (2002-06-07). «Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides:: Retention prediction» Journal of Chromatography A 958 (1): 167–182. doi:10.1016/S0021-9673(02)00306-0. ISSN 0021-9673. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Distler, Anne M.; Allison, John. (2001-04-01). «5-Methoxysalicylic acid and spermine: A new matrix for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides» Journal of the American Society for Mass Spectrometry 12 (4): 456–462. doi:10.1016/S1044-0305(01)00212-4. ISSN 1044-0305. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Shah, Samit; Friedman, Simon H.. (2008-03). «An ESI-MS method for characterization of native and modified oligonucleotides used for RNA interference and other biological applications» Nature Protocols 3 (3): 351–356. doi:10.1038/nprot.2007.535. ISSN 1750-2799. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ academic.oup.com (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).
* ↑ (Ingelesez) Gong, Ping; Harbers, Gregory M.; Grainger, David W.. (2006-04-01). «Multi-technique Comparison of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides» Analytical Chemistry 78 (7): 2342–2351. doi:10.1021/ac051812m. ISSN 0003-2700. (Noiz kontsultatua: 2023-03-07).

## Kanpo estekak

* Datuak: Q133686