# DNA sekuentziazio
## Oinarri teorikoa

Azido nukleikoak izaki bizidun baten informazio genetikoa gordetzen duten biomolekulak dira. Nagusiki, zelula batean aurkitu daitekeen material genetikoa Azido desoxirribonukleikoa (ADN) da, baina Azido erribonukleiko (ARN) ere aurkitu daiteke. ADNak izaki bizidunen garapenerako beharrezkoa den informazio guztia kodetzen du eta belaunaldiz belaunaldi transmititzen da, herentzia moduan ezagututako prozesuaren bidez.
Informazio genetikoa kodetzeko prozesu berezia jarraitzen da. ADN molekula osatzen duten azpiunitateak (Nukleotidoak) base nitrogenatuak (edo Base nukleikoak) dituzte haien konposizioan. Base hauek lau letra erabilita ezagutzen dira: adenina (A), timina (T), zitosina (C) eta guanina (G). ARNan timina ordezkatzen duen uraziloa (U) aurkitzen da. ADNan baseak hirunaka irakurtzen dira (hirukote, kodoi, triplete) eta horietan oinarrituz ARNa sintetizatzen da. ARNan hirukoteak "irakurtzen" dira, itzulpen izeneko prozesu baten bidez, eta horietako talde bakoitzak aminoazido (proteinen azpiunitateak) baterako kodetzen dute, Kode genetikoa erabiliz.
Beraz, sekuentziazio genetikoa, material genetikoa osatzen duten baseen ordena ezagutzeari esten zaio. Hau da, izaki bizidunetan aurkitzen den material genetikoaren sekuentzia ezagutzeari deritzo, teknika biokimiko desberdinak erabiliz. Sekuentzia ezagutzea ezinbestekoa da biologia molekularreko hainbat teknika aurrera atera ahal izateko. Gainera, gaur egun oso ezagunak dira gaixotasun genetikoak, eta hauen atzean sekuentzia genetiko oker bat aurkitzen da. Horregatik, diagnostiko eta tratamendurako beharrezkoa da sekuentzia ezagutzea. Are gehiago, kontseilu genetikorako ere nahitaezkoa da sekuentziazioa egitea.

## Sekuentziazio genetikorako metodoak

Historian zehar asko izan dira sekuentzia genetikoa ezagutzeko garatu diren metodoak. Nahiz eta teknika berritzaile batzuk ARNa sekuentziatzeko helburua duten, orokorrean ADNa da sekuentziatzen den molekula. Hona hemen teknika horietako batzuk.

### Lehenengo belaunaldiko sekuentziazio metodoak
#### Maxam-Gilbert sekuentziazioa

Allan Maxam eta Walter Gilbertek garatu zuten metodoa (1976-1977) ADNaren aldaketa kimikoan eta base espezifikoen bereizketan oinarritzen da. Era zabal batean ADNa sekuentziatzeko lehenengo metodoa izan zen, eta Sanger sekuentziazioarekin batera, lehenengo belaunaldiko metodoa da.
Allan Maxam eta Walter Gilbertek garatu zuten metodoa (1976-1977) ADNaren aldaketa kimikoan eta base espezifikoen bereizketan oinarritzen da. Era zabal batean ADNa sekuentziatzeko lehenengo metodoa izan zen, eta Sanger sekuentziazioarekin batera, lehenengo belaunaldiko metodoa da.
Laburki, ADN molekula lau erreakzio kimiko zehatz desberdinen bidez zatitzen da eta muturrak erradioaktiboki markatzen dira. Ondoren, sekuentziatu nahi diren zatien purifikazioa egiten da. Azkenik, gel elektroforesi baten bidez tamainaren arabera banatzen dira ADN zatiak. Erreakzio bakoitzean lortutako zatiak ikusteko, autorradiografia bidez egiten da. Autoerradiografia horren bidez banda batzuk agertuko dira poliakrilamidazko gelean eta banda horietatik, ADN sekuentzia inferitu daiteke.
Dagoeneko gaur egun metodo zahar bat da eta ez da erabiltzen.

#### Sanger sekuentziazioa

1977. urtean Frederick Sangerek ADNa sekuentziatzeko metodo berri bat garatu zuen: Sanger metodoa. Metodo honen berrikuntzarik nagusia dideoxinukleotidoen (ddNTP) erabilera da. Hauen berezitasuna da 3' muturrean -OH taldea falta zaiela (desoxinukleotidoekin (dNTP) konparatuz). Hori dela eta, sekuentziazio prozesuan zehar molekula sintetizatzen doan heinean, ddNTP bat sartzen denean, sintesia eteten da.
Era labur batean, hau izango litzateke Sanger metodoaren funtzionamendua:
* Lehenik eta behin, sekuentziatu nahi den ADNa isolatu behar da eta Polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) bidez kopiak egiten dira (anplifikazio moduan ezagututa).
* ADNa desnaturalizatu behar da, sekuentziazio erreakziorako harizpi bakarreko molekula erabiltzen delako.
* Sekuentziazio erreakziorako primer edo hasle moduan ezagututako ADN zati txikiak (oligonukleotidoak) behar dira. Gainera, lau erreakzio desberdin prestatzen dira. Erreakzio bakoitzean erradiaktiboki markatutako ddNTP bat gehitzen da. Sintesi prozesuan zehar, dNTPak gehitzen joango dira eta noizean behin, zoriz, ddNTP bat gehituko da. Behin ddNTPa gehituta, sintesia geldituko da eta beraz luzera desberdineko zatiak lortuko dira.
* Behin erreakzioak amaituta, akrilamidazko gel batean kargatzen dira, bakoitza kale batean. Elektroforesia burutzen da eta zatiak tamainaren arabera banatzen dira, base bateko erresoluzioarekin.
* Autoerradiografia erabiliz gela errebelatzen da eta ADN zati bakoitzari dagokion banda ikusgarri egiten da. Era honetan, sekuentzia "irakurri daiteke".

#### Sekuentziazio automatikoa

Oinarri moduan Sanger metodoa erabiltzen du. Kimikoki, aurreko atalean azaldutakoa jarraitzen du, baina kasu honetan ez da erreadioaktibitatea erabiltzen. Aldiz, ddNTP bakoitzak fluoroforo desberdin bat du lotututa. Prozesua erraztu eta azkartzearren, automatizatu egin zen. Kasu honetan, elektroforesi gelak erabili beharrean, sekuentziadore moduan ezagututako aparatuak erabiltzen dira. Sekuentziadorean elektroforesi kapilar bat egiten da eta laser batekin didesoxinukleotidoen fluoroforoak kitzikatzen dira. Kitzikatutakoan, fluoroforoek fluoreszentzia igortzen dute eta sekuentziadoreak seinale hori irakurtzen du. Seinalea irakurri ahala, sekuentzia ebazten doa. Emaitza moduan, sekuentzia elektroferograma eran ematen da (beheko irudia).
Gaur egun sekuentziazio metodoen hartean urrezko estandarra da. Hau da, sekuentzia bat analizatzerako orduan, ontzat ematen diren emaitzak teknika honetatik lortutakoak dira.

### Bigarren belaunaldiko sekuentziazio metodoak

Lehenengo belaunaldiko sekuentziazio metodoekin sekuentzia gutxi batzuk azertu daitezke aldi berean eta gainera denbora aldetik asko eskatzen dute. Hori dela eta, bigarren belaunaldiko metodoak garatu dira.
Next Generation Sequencing (NGS) moduan ezagutzen diren metodoen ezaugarriak honako hauek dira:
* Milioika irakurketa sortzen dituzte paraleloan.
* Lehenengo belaunaldiko metodoak baino azkarragoak dira.
* Koste ekonomikoa baxuagoa da.
* Erabiltzen den makinariak analisiaren parte handia egiten du, ez dira beharrezkoak elektroforesi gelak.
Plataforma eta metodo ugari daude, baina erabilienetakoak hauek dira:

##### Pirosekuentziazioa

Luminiszentzian oinarrituz ebazten da ADNaren sekuentzia. Entseguan entzima desberdinak erabiltzen dira: luziferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa eta apirasa. Gainera, bi sustrato ere beharrezkoak dira: luziferina eta adenosin-5-fosfosulfatoa (APS). Sekuentziazio prozesuan zehar, banan-banan gehitzen dira nukleotidoak. Nukleotidoa gehitzerakoan, pirofosfato bat askatzen da eta erreakzio desberdinen bidez luziferina oxiluziferinan bihurtzen da eta honek luminiszentzia ematen du.
Gaur egun ez da asko erabiltzen, bestelako NGS metodoek abantaila gehiago erakusten dituztelako. Hala ere, aplikazio batzuetarako (adibidez metilazio maila ezagutzeko) oso erabilgarria da.

##### Illumina

Illumina, Inc. enpresak garatutako metodoan, sintesian oinarritutako sekuentziazioa egiten da.
Lehenik eta behin ADNa zatitzen da eta adaptadore batzuk gehitzen zaizkio. Ondoren, "libreria" izeneko ADN multzoak lortzeko, "zubi PCR" bat egiten da. Era honetan, sekuentziatu nahi diren ADN zatien kopia asko lortuko dira. Azkenik, sekuentziazio erreakzioan fluoreszenteki markatutako nukleotidoak erabiltzen dira. Molekulara gehitzen direnean, fluoreszentzia igortzen dute, argazki bat ateratzen da eta era honetan jakin daiteke ze base sartu den. Ondoren, beste nukleotido bat gehitzen da, gero beste bat, ... eta horrela ADN zatiaren sekuentzia osoa irakurri arte.

##### Roche 454

Roche taldeak garatutako metodoa, komertzializatu zen lehenengo NGS plataforma izan zen. ADNa zatitzeko spray metodoa erabiltzen du eta adaptadoreak jartzen ditu ADNaren bi muturretan. Material genetikoaren kopiak egiteko, "emultsio PCR" izaneko erreakzioa erabiltzen da. Amaitzeko, pirosekuentziazioan oinarritutako sekuentziazioa egiten da.

##### Ion torrent

Metodologia honen berezitasuna honako hau da: sekuentziazioaren prozesuan zehar, sintetizatzen ari den molekulan gehitzen diren nukleotidoek askatzen dituzten protoiei esker inferitzen da sekuentzia.

### Hirugarren belaunaldiko sekuentziazio metodoak

Sekuentziazio metodologia berrienak dira eta oraindik garapen fasean daude horietako asko. Multzo honen barruan sartzen diren teknologiak long-read sequencing moduan ere ezagutzen dira. Aurreko sekuentziazio metodoekin alderatuz, hiru abantaila nagusi dituzte:
* Sekuentzia luzeagoak irakur daitezke, 5.000 eta 15.000 bp artean.
* Epigenetika mailan gertatzen diren aldaketak ikusi daitezke.
* Askoz azkarragoak dira eta aparatuak errazago mugitu daitezke.
Haien aurrerapenei esker, aplikazio ugari dituzte arlo askotan: epigenetika, trasnkriptomika, metagenomika, ...
Hirugarren mailako sekuentziazioan hiru plataforma komertzial aritzen dira: Pacific Biosciences molekula bakarreko denbora errealeko (SMRT, Single Molecule Real Time) sekuentziazioa, Illumina Tru-seq Synthetic Long-Read teknologia eta Oxford Nanopore. Hauen berezitasuna honako hau da: molekula bakar batetik abiatuta anplifikazioa egin dezakete.

## Erreferentziak

* ↑ Travers, Andrew; Muskhelishvili, Georgi. (2015-06). «DNA structure and function» FEBS Journal 282 (12): 2279–2295. doi:10.1111/febs.13307. ISSN 1742-464X. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ (Ingelesez) Watson, J. D.; Crick, F. H. C.. (1953-04-25). «Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid» Nature 171 (4356): 737–738. doi:10.1038/171737a0. ISSN 0028-0836. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ (Gaztelaniaz) Md., Sonia Santillán-Garzón; Diego-Álvarez, Dan; Buades, Celia; Romera-López, Alejandro; Pérez-Cabornero, Lucía; Valero-Hervás, Diana; Cantalapiedra, Diego; Bioinformatics et al.. (2015-07-01). «DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES GENÉTICAS: DEL DIAGNÓSTICO GENÉTICO AL DIAGNÓSTICO GENÓMICO CON LA SECUENCIACIÓN MASIVA» Revista Médica Clínica Las Condes 26 (4): 458–469. doi:10.1016/j.rmclc.2015.07.004. ISSN 0716-8640. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* 1 2 Maxam, A. M.; Gilbert, W.. (1977-02). «A new method for sequencing DNA» Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 (2): 560–564. doi:10.1073/pnas.74.2.560. ISSN 0027-8424. PMID 265521. PMC PMC392330. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ (Ingelesez) Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A. R.. (1977-12-01). «DNA sequencing with chain-terminating inhibitors» Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (12): 5463–5467. doi:10.1073/pnas.74.12.5463. ISSN 0027-8424. PMID 271968. PMC PMC431765. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ Parker, L. T.; Deng, Q.; Zakeri, H.; Carlson, C.; Nickerson, D. A.; Kwok, P. Y.. (1995-07). «Peak height variations in automated sequencing of PCR products using Taq dye-terminator chemistry» BioTechniques 19 (1): 116–121. ISSN 0736-6205. PMID 7669285. (Noiz kontsultatua: 2022-03-09).
* ↑ Kchouk, Mehdi; Gibrat, Jean Francois; Elloumi, Mourad. (2017). «Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation» Biology and Medicine 09 (03) doi:10.4172/0974-8369.1000395. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ Kanzi, Aquillah M.; San, James Emmanuel; Chimukangara, Benjamin; Wilkinson, Eduan; Fish, Maryam; Ramsuran, Veron; de Oliveira, Tulio. (2020). «Next Generation Sequencing and Bioinformatics Analysis of Family Genetic Inheritance» Frontiers in Genetics 11: 544162. doi:10.3389/fgene.2020.544162. ISSN 1664-8021. PMID 33193618. PMC 7649788. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ (Ingelesez) Langaee, Taimour; Ronaghi, Mostafa. (2005-06-03). «Genetic variation analyses by Pyrosequencing» Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 573 (1): 96–102. doi:10.1016/j.mrfmmm.2004.07.023. ISSN 0027-5107. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ Bentley, David R.; Balasubramanian, Shankar; Swerdlow, Harold P.; Smith, Geoffrey P.; Milton, John; Brown, Clive G.; Hall, Kevin P.; Evers, Dirk J. et al.. (2008-11-06). «Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry» Nature 456 (7218): 53–59. doi:10.1038/nature07517. ISSN 1476-4687. PMID 18987734. PMC 2581791. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ Zhao, Jianhua; Grant, Struan F. A.. (2011-02-01). «Advances in whole genome sequencing technology» Current Pharmaceutical Biotechnology 12 (2): 293–305. doi:10.2174/138920111794295729. ISSN 1873-4316. PMID 21050163. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ Harrington, Colleen T.; Lin, Elaine I.; Olson, Matthew T.; Eshleman, James R.. (2013-09). «Fundamentals of pyrosequencing» Archives of Pathology & Laboratory Medicine 137 (9): 1296–1303. doi:10.5858/arpa.2012-0463-RA. ISSN 1543-2165. PMID 23991743. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ (Ingelesez) Perkel, Jeffrey. (2011-02). «Making Contact with Sequencing's Fourth Generation» BioTechniques 50 (2): 93–95. doi:10.2144/000113608. ISSN 0736-6205. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ (Ingelesez) Lee, Hayan; Gurtowski, James; Yoo, Shinjae; Nattestad, Maria; Marcus, Shoshana; Goodwin, Sara; McCombie, W. Richard; Schatz, Michael C.. (2016-04-13). Third-generation sequencing and the future of genomics. , 048603 or. doi:10.1101/048603. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ (Ingelesez) Levene, M. J.; Korlach, J.; Turner, S. W.; Foquet, M.; Craighead, H. G.; Webb, W. W.. (2003-01-31). «Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations» Science 299 (5607): 682–686. doi:10.1126/science.1079700. ISSN 0036-8075. (Noiz kontsultatua: 2022-03-05).
* ↑ McCoy, Rajiv C.; Taylor, Ryan W.; Blauwkamp, Timothy A.; Kelley, Joanna L.; Kertesz, Michael; Pushkarev, Dmitry; Petrov, Dmitri A.; Fiston-Lavier, Anna-Sophie. (2014). «Illumina TruSeq synthetic long-reads empower de novo assembly and resolve complex, highly-repetitive transposable elements» PloS One 9 (9): e106689. doi:10.1371/journal.pone.0106689. ISSN 1932-6203. PMID 25188499. PMC 4154752. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).
* ↑ (Ingelesez) Lu, Hengyun; Giordano, Francesca; Ning, Zemin. (2016-10-01). «Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly» Genomics, Proteomics & Bioinformatics 14 (5): 265–279. doi:10.1016/j.gpb.2016.05.004. ISSN 1672-0229. PMID 27646134. PMC PMC5093776. (Noiz kontsultatua: 2022-03-08).

## Kanpo estekak

* Maxam-Gilbert sekuentziazio bideoa: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0
* Sanger metodoaren bideoa: https://www.youtube.com/watch?v=KTstRrDTmWI
* Illumina plataformaren NGS sekuentziazioa: https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing.html
* NGS sekuentziazio desberdinen konparaketa: https://www.youtube.com/watch?v=JNqXgLKOzKU&ab_channel=ImGenTechWPI
* Datuak: Q380546
* Multimedia: DNA sequencing / Q380546