# Electroforesis capilar

La electroforesis capilar (EC) (o CE por sus siglas en inglés Capillary electrophoresis), es un grupo de técnicas de separación electrocinética, que se realiza en el interior de tubos capilares, generalmente con diámetros inferiores a las 100 μm y longitudes de 40 a 100 cm. También recibe este nombre la separación electrocinética realizada en canales de micro y nanofluidos. La técnica se basa en la diferente movilidad de los iones a través de una disolución cuando esta se somete a un campo eléctrico. la técnica tiene un gran poder de resolución, habiéndose desarrollado métodos que permiten separar incluso moléculas neutras.
Con cierta frecuencia a esta técnica técnica también se la denomina como electroforesis capilar de zona (ZCE por sus siglas en inglés), por ser esta técnica la más habitual. Sin embargo existen otras modalidades electroforéticas que también permiten la separación electrocinética en el interior de tubos capilares, como la electroforesis capilar en gel (CGE), el enfoque isoeléctrico capilar (CIEF), la isotacoforesis capilar y la cromatografía electrocinética micelar (MEKC), que también pertenecen a esta clase de métodos. En todas estas técnicas, los analitos migran a través de soluciones electrolíticas bajo la influencia de un campo eléctrico. Dependiendo de su movilidad iónico, pueden llegar a separarse. También se pueden concentrar o "focalizar" mediante gradientes de conductividad y pH.

## Fundamentos de la técnica

La técnica de la electroforesis capilar tiene sus orígenes en la técnica desarrollada para muestras muestras macroscópicas por el químico sueco Arne Tiselius en la década de 1930. Originariamente, las separación electroforética se realizaba en medios planos estabilizados, como papel o en geles semiporosos, sistema con los que se conseguían excelentes separaciones de determinadas macromoléculas, pero que era un proceso lento y muy tedioso, que requería una considerable habilidad del operador. Hacia la década de 1980 los científicos comenzaron a explorar la posibilidad de realizar este mismo tipo de separaciones en cantidades microscópicas de muestra, utilizando tubos capilares de sílice fundida, obteniendo resultados muy prometedor en lo que a tiempo de análisis y resolución de los analitos se refiere, iniciándose así, el desarrollo de la electroforesis capilar (CE).
Independientemente de que se trate de electroforesis clásica o capilar, para llevar a cabo la separación de las especies cargadas, es necesario aplicar un campo eléctrico entre los extremos del lecho a través del cual se van a mover dichas especies. Como consecuencia de este campo eléctrico, se produce lo que se denomina movilidad electroforética, que hace las moléculas catiónicas migren hacia el polo negativo y las aniónicas hacia el polo positivo. La velocidad a la que se produce esta migración, expresada en cm/s, depende del campo eléctrico (E), que tiene unidades de V/cm y de un coeficiente denominado movilidad iónica o más correctamente, en el caso de la electroforesis, coeficiente de movilidad electroforética, que se representa como μ$_e$, con unidades cm$^2$/ V.s:
$\upsilon =\mu _{c}.E$
El coeficiente de movilidad electroforética μ$_e$, depende de la carga eléctrica del analito así como de otros factores como el retardo por fricción. Si dos iones difieren en la carga o en las fuerzas de fricción, se desplazan a diferente velocidad a través del lecho electroforético, llegando a separarse entre sí. Esta fuerza de fricción es mayor cuanto mayor es el tamaño del ion, por lo que, a igual carga, los iones grandes se mueven más lentamente que los pequeños.
En la electroforesis capilar, las separaciones electroforéticas en lugar de llevarse a cabo en un medio plano estabilizado como el papel o en un gel semisólido poroso, se utiliza un capilar con un diámetro interno que no excede de 100 μm de diámetro interno y de una longitud, genralmente comprendida entre 40 y 100 cm. Dentro del capilar de separación se encuentra la disolución que contiene los analitos o las moléculas a separar y el tampón o medio electrolítico que es el encargado de conducir la corriente. Los extremos del capilar se colocan en sendos depósitos con la disolución amortiguadora y los electrodos de platino. La introducción de la muestra se realiza en uno de los extremos y la detección de las especies separadas, en el extremo opuesto. El campo eléctrico que se aplica se establece mediante una diferencia de potencial de entre 5 y 30 kV de corriente continua. Dado que el campo eléctrico depende de la diferencia de potencial aplicado y de la distancia, se puede expresar la velocidad de migración de los iones como
$\upsilon =\mu _{c}.{\frac {V}{L}}$
De acuerdo con esta expresión cuanto más alto sea el voltaje y más corto el capilar, mayor será la velocidad de migración iónica, pero un capilar demasiado corto conlleva separaciones incompletas y un voltaje muy bajo, mucho tiempo de análisis, por lo que en la puesta a punto de los métodos de separación por electroforesis capilar es necesario llegar a un compromiso, ya que si bien es deseable que las separaciones sean rápidas, es aún más importante que los analitos queden totalmente separados cuando llegan al detector.
Mientras que en la electroforesis clásica el calentamiento por el efecto Joule limita la magnitud del voltaje aplicado, que generalmente se encuentra en el entorno de los 500 V, en la electroforesis capilar, la gran gran longitud unida a la pequeña área de la sección transversal del capilar hacen que la resistencia de la solución en su interior sea excepcionalmente elevada, disminuyendo el flujo de electrones y por consiguiente, el calentamiento, lo que permite aplicar un mayor voltaje que en el modo ordinario o clásico. Otra ventaja de la aplicación de estos voltajes tan elevados a un capilar de sílice fundida que contiene una solución amortiguadora, es la aparición del fenómeno conocido como flujo electroosmotico, debido al cual la disolución reguladora del interior del capilar migra hacia el cátodo a una velocidad mucho mayor de la de los iones cargados positivamente. La causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice-solución. A valores de pH por encima de 3, la pared interna de un capilar de sílice presenta carga negativa debido a la ionización de los grupos silanol (Si-OH) en su superficie. Los cationes de la solución amortiguadora se agrupan sobre la doble capa eléctrica adyacente a la superficie negativa del capilar de sílice. Los cationes situados en la capa exterior difusa de la doble capa son atraídos hacia el cátodo o electrodo negativo y dado que los cationes están solvatados arrastran entonces al solvente con ellos.
El flujo electroosmótico es el mismo dentro de todo el capilar y mayor que la velocidad de migración de los iones electroforética forzando a todas las especies presentes en el interior del capilar, con independencia de su carga, incluso las neutras, sean arrastradas hacia el cátodo, por lo que si se coloca un detector adecuado en un punto próximo al final del capilar, pueden ser detectadas. El registro que se obtiene de las especies que pasan por el detector recibe el nombre de electroferograma y tiene un aspecto similar a un cromatograma, pero con picos mucho más estrechos y tiempos de resolución menores.

## Modalidades y aplicaciones

Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo operando de diferentes maneras, según los fines buscados en cada caso o los analitos que se van a separar. Existen varias modalidades electroforéticas que permiten la separación electrocinética en el interior de tubos capilares, cada una de ellas con su nombre y siglas características. A continuación se describen brevemente las más frecuentes.

### Electroforesis capilar de zona.

En esta modalidad, conocida por sus siglas en inglés como CZE, la composición de la solución amortiguadora es constante en toda la zona de separación. El campo aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que pueden estar perfectamente definidas y separadas entre sí. La modalidad en muy adecuada para la separación de iones pequeños y moléculas de naturaleza iónica y de no muy elevada masa molecular (herbicidas sintéticos, plaguicidas, fármacos, aminoácidos e hidratos de carbono).

### Electroforesis capilar en gel

También conocida por las siglas GEC (por su nombre en inglés), esta modalidad utiliza una matriz polimérica con disoluciones reguladoras que rellenan los poros. Este tipo de medio proporcionaba una acción de tamiz molecular que retrasaba la migración de las especies por analizar en función del tamaño de poro del polímero y del tamaño de los iones del analito, lo que hace que esta modalidad sea muy útil en las separaciones de macromoléculas, como proteínas, fragmentos de ADN y oligonucleótidos que tienen en esencia la misma carga pero distinto tamaño. Entre los geles más utilizados se encuentra la poliacrilamida, que se forma al polimerizar la acrilamida con un agente de entrecruzamiento. Los tamaños medios de poro depende de las proporciones entre el monómero y el agente entrecruzante. Al incrementar la cantidad de este último se obtiene una disminución del tamaño de poro.

### Isotacoforesis capilar

En esta modalidad, la muestra se inyecta entre dos disoluciones reguladoras, una de vanguardia, formada por iones de mayor movilidad que los iones analito, y otra de retaguardia o rezagada, con iones de menor movilidad que los que se pretende separar en la muestra. Cuando se aplica el campo eléctrico, los iones del analito migran como en la electroforesis de zona, cada ion a su propia velocidad, permitiendo que los analitos se separen en bandas; la especie más rápida se sitúa en la banda más próxima a la de la solución amortiguadora de vanguardia y la más lenta después de la solución amortiguadora a la zaga. Una vez que se han formado las bandas, todas se mueven a la misma velocidad, de ahí el nombre de la modalidad; iso significa igual y taco, velocidad.

### Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF)

En esta modalidad la separación se basa en la diferencia entre puntos isoeléctricos, por lo que es muy adecuada para separar especies anfóteras, como aminoácidos y proteínas, que contienen en su estructura un grupo del ácido carboxílico que es débil y un grupo amino que es una base también débil. Las separaciones isoeléctricas se llevan a cabo en una mezcla de soluciones amortiguadoras cuyo pH varía de manera continua. Este gradiente de pH se consigue utilizando una mezcla de diferentes anfolitos en disolución acuosa escogidos de forma que puedan abarcar diferentes intervalos de pH.

### Cromatografía micelar de zona (MEKC)

El capilar contiene un tensioactivo a un nivel de concentración en el cual se forman micelas. Las micelas se forman en disoluciones acuosas cuando la concentración de una especie iónica que tiene una cadena larga hidrocarbonada se aumenta por encima de un cierto nivel llamado concentración micelar crítica (cmc). Las micelas constituyen una segunda fase estable que puede unirse a compuestos no polares y por consiguiente, poco solubles en el medio acuoso tamponado. Esta circunstancia permite que mediante esta modalidad se puedan separar sustancias con poca polaridad. En la práctica habitual de esta modalidad, los tensoactivos se añaden a la solución amortiguadora en cantidades que superan la concentración micelar crítica y entre los tensioactivos, el de uso más frecuente es el dodecilsulfato sódico.

## Ventajas

La inducción del alto potencial eléctrico permite: 1) que la separación sea más sensible entre las diferentes moléculas (aumento de la resolución) y 2) que el tiempo de análisis sea más corto.
La eficacia y la velocidad de la separación se pueden mejorar mediante la optimización de diferentes factores como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de separación, el disolvente en el que se encuentra disuelta la muestra, etc.
Generalmente se obtienen tiempos de análisis bastante bajos si se compara con otras técnicas separativas como la cromatografía de gases o la de líquidos. Además el consumo de muestra y reactivos es muchísimo menor por lo que se la puede considerar una técnica más limpia.
Es muy versátil ya que se puede emplear para separar cualquier tipo de compuesto eligiendo bien el detector; se puede acoplar a un detector UV, de fluorescencia, un espectrómetro de masas, etc.
Todas estas características convierten a la EC en un método eficiente y económico, capaz de separar cientos de componentes de forma simultánea, empleando cantidades mínimas de muestras y reactivos.

## Separación de ácidos nucleicos (ADN/ARN)

Para el caso del ADN, los fragmentos a analizar se encuentran unidos a marcas fluorescentes, siendo detectadas por un láser de argón, que las excita a distintas longitudes de onda, lográndose así el análisis de múltiples fragmentos al mismo tiempo, que se van a mover hacia el polo positivo y se separarán de acuerdo a la longitud del campo eléctrico: los de menor peso molecular viajarán más rápido a través del capilar, los de mayor peso molecular lo harán más lentamente.
En los últimos años, la EC ha contribuido al fortalecimiento de la ciencia y la medicina moderna. Gracias a las ventajas que provee la EC, la secuenciación del ADN ha podido automatizarse, permitiendo, hoy día, poder conocer las secuencias genómicas de los humanos y otras especies con mayor velocidad y especificidad (15 mil millones de nucleótidos de secuencia en menos de un año).
Además, la información acumulada por la EC comienza a vislumbrar las causas genéticas de muchas enfermedades, fortaleciendo el diagnóstico en contraposición de las metodologías clásicas usadas para el estudio de la medicina genómica. Las pruebas de diagnóstico genético emplean normalmente un gran número de marcadores polimórficos (variaciones específicas en la secuencia del genoma), como los "microsatélites o STR" (Short Tandem Repeat), los "minisatélites o VNTR" (Variable Number of Tandem Repeat) y los SNP (Single Nucleotide Polymorphism), además de la determinación de mutaciones asociadas a muchas enfermedades.
Así, el uso de marcadores polimórficos y mutacionales para el diagnóstico requiere de una tecnología automatizada, como la EC, que contribuye, principalmente, en dos áreas del diagnóstico genético: secuenciación y análisis de fragmentos en los cuales se puede determinar la dosis génica de forma cuantitativa (como para pruebas prenatales: trisomías, monosomías, duplicaciones, deleciones e inserciones). Técnicas como la electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida consumen más tiempo y recursos, son menos específicas y reproducibles, y suelen requerir mayor cantidad de muestra (actualmente se encuentran casi en desuso).

### Anomalías en aplicaciones de diagnóstico

Los resultados obtenidos en electroforesis capilar con fines diagnósticos pueden presentar ciertas anomalías que dificultan su interpretación.

#### Allele drop-out (ADO)

Este fenómeno ocurre, tal y como indica su nombre (pérdida de alelo) cuando sólo una copia de ADN del par correspondiente ha sido amplificada. Como consecuencia, se puede observar un diminuto pico que se identifica con dicha copia.

#### Pico n-A

En ocasiones, la ADN polimerasa sintetiza el producto de PCR con un nucleótido menos del que debería (normalmente cuando la hebra molde acaba en adenina). Esto resulta en la aparición de un pico ligeramente más pequeño pegado a otro mayor.

#### Pull-ups

Tiene lugar cuando muestras de ADN con un fluróforo determinado aparece en forma de pico en los resultados del análisis de otro fluoróforo (es decir, el láser de argón no emite la longitud de onda óptima para su detección, pero aun así reacciona ante éste). Esto es debido a la gran cantidad de ADN con dicho fluróforo determinado.

## Electroforesis capilar sensible a la conformación (CSCE)

La CSCE se utiliza para detectar la presencia de heterodúplex mediante la tecnología de fluorescencia. Es más rápida y consigue mejores resultados que la DHPLC, ya que los productos de la PCR pueden multiplexarse utilizando colorantes fluorescentes múltiples. Una alteración en la secuencia del DNA puede producir una conformación distinta, con diferente movilidad electroforética, y puede emplearse un polímero adecuado para la identificación.