# Cinética de Michaelis-Menten

La cinética de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas reacciones enzimáticas. Recibe este nombre en honor a Leonor Michaelis y Maude Menten. Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo enzima-sustrato es constante.

## Determinación de constantes

Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la concentración de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formación de producto. Esa es la velocidad máxima (V$_{max}$) de la enzima. En ese caso los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato.
Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten.

## Velocidad de reacción

La velocidad V indica el número de moléculas del sustrato que se convierten en producto por segundo. Con concentraciones crecientes de sustrato[S], la enzima va acercándose asintóticamente a su velocidad máxima V$_{max}$, pero nunca la alcanza. Por esta razón, no hay un valor de [S] determinado para la V$_{max}$. De todas formas, se puede definir un parámetro característico de la enzima empleando la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima (V$_{max}$/2). Podemos resumir el significado de V$_{max}$ con las siguientes afirmaciones:
* Corresponde al límite superior de la velocidad de reacción.
* Equivale al producto kcat*[E]t
* Permite inferir la concentración de enzima inicial
* Se obtiene gráficamente
* Graficando v vs. [S] es difícil encontrar V manualmente, por lo que se necesita usar un método de ajuste no lineal de los puntos experimentales.

## Constante de Michaelis-Menten

Aunque es imposible medir exactamente la concentración de sustrato que da V$_{max}$, las enzimas pueden caracterizarse mediante la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Esta concentración de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (K$_M$). Para enzimas que exhiben una cinética de Michaelis-Menten simple esta constante representa la constante de disociación del complejo enzima-sustrato (ES) (o la inversa de la afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. En estos casos se obtendrá una K$_M$ diferente según el sustrato específico sobre el que actúe la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actúan sobre sustratos análogos) y según las condiciones de reacción en que se realicen las mediciones.
El significado de km se puede resumir en las siguientes afirmaciones:
* Se expresa en unidades de concentración
* Numéricamente corresponde a la concentración a la que se alcanza el 50% de saturación de la enzima
* Está relacionada con la afinidad, es decir, la fuerza de unión entre la enzima y su sustrato. Valores grandes de km significan poca afinidad, mientras que valores pequeños de km (usualmente menores al rango milimolar) corresponden a una afinidad alta de la enzima por el sustrato.
* Es una constante aparente de disociación del complejo enzima - sustrato (E·S).
Nota: K$_M$ solo se puede usar para determinar la afinidad de una enzima por un sustrato, k$_2$ es limitante de la velocidad, por ejemplo, si k$_2$ << k$_{-1}$ y K$_M$ se convierte en k$_{-1}$/k$_1$. Generalmente, k$_2$ >> k$_{-1}$ o bien k$_2$ y k$_{-1}$ son comparables.

## Ecuación

La derivación de Michaelis y Menten está descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de la siguiente manera:
Se supone que la reacción enzimática es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima después de la reacción.
$E+S{\begin{matrix}k_{1}\\\longrightarrow \\\longleftarrow \\k_{-1}\end{matrix}}ES{\begin{matrix}k_{2}\\\longrightarrow \\\ \end{matrix}}E+P$
Siguiendo la aproximación del estado estacionario, que señala que la concentración del complejo enzima-sustrato ($ES$) es pequeña y se mantiene casi constante a lo largo de la reacción enzimática:
${\frac {d[ES]}{dt}}=k_{1}[E][S]-k_{-1}[ES]-k_{2}[ES]=0$
$[ES]={\frac {k_{1}[E][S]}{k_{-1}+k_{2}}}$
Se define:
$K_{m}={\frac {k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}}$
Entonces:
$[ES]={\frac {[E][S]}{K_{m}}}$ (1)
La velocidad de reacción es:
${\frac {d[P]}{dt}}=k_{2}[ES]$ (2)
La concentración total de la enzima:
$[E_{0}]=[E]+[ES]$
Por lo tanto:
$[E]=[E_{0}]-[ES]$ (3)
Sustituyendo (3) en (1) da:
$[ES]={\frac {([E_{0}]-[ES])[S]}{K_{m}}}$
Reordenando:
$K_{m}[ES]+[S][ES]=[E_{0}][S]$
$[ES]={\frac {[E_{0}][S]}{K_{m}+[S]}}$ (4)
Sustituyendo (4) en (2) :
${\frac {d[P]}{dt}}=k_{2}[E_{0}]{\frac {[S]}{K_{m}+[S]}}=V_{max}{\frac {[S]}{K_{m}+[S]}}$
Esta ecuación se puede analizar experimentalmente con un diagrama de Lineweaver-Burke, un diagrama de Eadie-Hofstee o un diagrama de Hanes-Woolf.
* $E_{0}$ es el total de enzima. No es práctico medir la cantidad de complejo enzima-sustrato durante la reacción, por lo que debe escribirse ésta en términos de cantidad total o inicial de enzima, que es una cantidad conocida.
* $d[P]/dt$ o $V_{0}$ es la velocidad de formación del producto.
* $k_{2}[E_{0}]$ o $V_{max}$ es la velocidad máxima. k$_2$ se denomina con frecuencia k$_{cat}$.
Cabe observar que [S] es grande comparada con K$_m$, [S]/(K$_m$ + [S]) tiende a 1. La velocidad de formación de producto es igual a k$_2$[E$_0$] en ese caso.
Cuando [S] es igual a K$_m$, [S]/(K$_m$ + [S]) vale 0.5. En ese caso, la velocidad de formación de producto es la mitad de la máxima (1/2 V$_{max}$). Representando gráficamente V$_0$ frente a [S] se puede fácilmente determinar V$_{max}$ y K$_m$. Esto requiere una serie de experimentos a E$_0$ constante y diferentes concentraciones de sustrato [S].

## Cómo se construye la gráfica

La gráfica de Michaelis - Menten se construye a partir de las velocidades iniciales de reacción de distintas concentraciones de sustrato obtenidas en un ensayo enzimático. El procedimiento a seguir es el siguiente:
* Obtener la velocidad inicial de reacción (V) para cada concentración de sustrato a partir de los datos de un ensayo enzimático.
* Tabular los valores de V para cada concentración de sustrato [S].
* Elaborar una gráfica de dispersión de V vs. [S].
* Trazar una curva hiperbólica desde el origen y extender la curva hacia valores mayores de [S].
* Analizar por inspección la tendencia de la curva. La curva debe mostrar un comportamiento asintótico hacia un límite superior de la velocidad. Este valor límite es V$_{max}$. Teóricamente Vmax es la velocidad inicial de reacción cuando [S] tiende a infinito.
* Sobre el eje de las abscisas, encontrar V$_{max}$ y dividir este valor entre 2.
* Encontrar por interpolación el valor de [S] que corresponde a 1/2 de V$_{max}$. Este valor de concentración es K$_m$.

## Fuentes

* Catalysis chapter from the Biochemistry textbook released under the GFDL