# Seminar:Molekularbiologische Methoden

Dieses Projekt gehört zum Fachbereich Biologie.
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Willkommen im Seminar Molekularbiologische Methoden!
Hier sollen vor allem Probleme und Hilfestellungen aus der Praxis diskutiert und Lösungsansätze vorgestellt werden: Warum funktioniert meine PCR nicht? An welchen Parametern sollte ich drehen? Was können Probleme bei einer 5'-RACE sein? und und und. Besonders wichtig sollten hierbei gut belegte Auskünfte sein. Hier ist der entsprechende Wikipedia-Artikel: Molekularbiologische Methoden.
Kooperatoren sind herzlich eingeladen! Vorschläge sind ebenfalls sehr willkommen.
Es werden zunächst einige Themen genannt, die aber natürlich noch erweitert werden können:

## DNA-Isolation aus Bakterien

Eine einfache Übersicht über die Methode der Plasmid-Aufreinigung findet man im Institut für Biochemie unter dem Punkt Plasmid-DNA-Isolation aus E. coli.
Hierbei ist es nun wichtig zu wissen, warum welcher Schritt wann gemacht wird.
Im ersten Schritt werden die Bakterienzellen aufgeschlossen. Dies geschieht auf zwei Wegen. Zum einen enthält der Lysispuffer SDS, welches eine Denaturierung der Proteine und der Zellhülle bewirkt. Zum Anderen wird durch das EDTA das Kalzium aus dem Spalt zwischen Zellmembran und äußerer Zellwand entfernt. Dies führt zum Kollabieren der Zellhülle und der gesamte Zellinhalt mitsamt den Plasmiden und Proteinen gehen in Lösung. All das findet in einem basischen pH-Bereich statt, so dass auch die DNA denaturiert. Das Bakterienchromosom, ist an der Zellmambran verankert. Daher ist es bei diesem Schritt nicht ratsam, die Lösung zu vortexen.
Im zweiten Schritt werden die Proteine gefällt. Dazu wird eine hochmolare Salzlösung hinzugegeben (meist NaAc, oder KAc). Zudem kommt es in diesem Schritt zur Renaturierung der DNA. Da das Bakterienchromosom verankert ist, wird es bei der anschließenden Zentrifugation wie auch die anderen ausgefallenen Proteine pelletiert. Das Plasmid ist, da es renaturiert ist, in Lösung und verbleibt im Überstand.
Anschließend findet eine EtOH-Fällung der DNA statt. Dies geschieht nur in Anwesenheit von Salz. Sind keine Salzionen in der Lösung, so ist Plasmid-DNA auch in EtOH löslich. Dieser Schritt dient dazu, das Salz Schritt für Schritt zu entfernen und die DNA umzupuffern. Bitte auf Richtigkeit überprüfen, ergänzen, Links hinzufügen und meine Signatur anschließend entfernen mfG --Gismo78 14:10, 15. Aug. 2008 (CEST)

## (RT)-PCR

* real time PCR
Die Transkriptmenge wird in einem Light Cycler durch Messung von Floureszenzfarbstoffen in Echtzeit bestimmt.
Real time quantitative PCR
* reverse Transkriptase PCR
Aus mRNA (einzelsträngig) wird cDNA (copyDNA → Gen ohne Introns). Je nach Reverser Transkriptase, welche in Retroviren vorkommt, werden einzelsträngige oder doppelsträngige, der mRNA komplementäre, DNA Sequenzen synthetisiert. Es werden unspezifische (meist poly dT) Primer benutzt.
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

## RACE

* RACE-PCR