# Triosephosphatisomerase

Die Triosephosphatisomerase (TIM, TPI) ist das Enzym, das Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) umwandelt. Dies ist ein Teilschritt der Glycolyse. TPI ist damit unverzichtbar für alle Lebewesen, die Glucose oder Fructose nur mittels Glycolyse verwerten können.
Im Menschen kodiert ein Gen (TPI1) auf Chromosom 12, Locus 12p13 das funktionelle Protein, mindestens drei Pseudogene sind bekannt. Mutationen am Gen können Triosephosphat-Isomerase-Defizienz verursachen.
Ein potenter Inhibitor ist 2-Phosphoglycolat, das in Pflanzen im Zuge der Photorespiration abgebaut wird.

## Struktur

Die Triosephosphatisomerase ist ein Mitglied der all-α- und all-β-Klasse (α/β) von Proteinen und ein Homodimer, das aus zwei sequenzidentischen Untereinheiten (Ketten) mit jeweils 247 Aminosäuren besteht. Jedes TPI-Monomer (Kette) enthält den vollständigen Satz katalytischer Aminosäurereste, jedoch ist das Enzym nur in der oligomeren Form aktiv. Daher ist die Dimerisierung für die volle Funktion des Enzyms wesentlich, obwohl nicht angenommen wird, dass eine Kooperativität zwischen den beiden aktiven Zentren besteht.
Jede Untereinheit enthält 8 äußere α-Helices, die 8 innere β-Stränge umgeben und eine konservierte Strukturdomäne bilden, die als geschlossenes α/β-Barrel (α/β) oder genauer gesagt als TIM-Fass (engl. TIM barrel) bezeichnet wird. Der TIM-Fass wurde ursprünglich nach dem Enzym benannt und ist schätzungsweise in 10 % aller Enzyme enthalten. Charakteristisch für die meisten TIM-Fass-Domänen ist das Vorhandensein des aktiven Zentrums des Enzyms in den Regionen der unteren Schleife, die durch die acht Schleifen erzeugt werden, die die C-Termini der β-Stränge mit den N-Termini der α-Helices verbinden. TIM-Fassproteine teilen auch ein strukturell konserviertes Phosphatbindungsmotiv mit der Phosphatgruppe, die sich im Substrat oder in den Cofaktoren befindet.
In jeder Kette tragen unpolare Aminosäuren, die ausgehend von den β-Strängen nach innen weisen, zum hydrophoben Kern der Struktur bei. Die α-Helices sind amphipathisch: Ihre äußeren (mit Wasser in Kontakt tretenden) Oberflächen sind polar, während ihre inneren Oberflächen weitgehend hydrophob sind. Die Schleifen sind eine Mischung aus polaren und unpolaren Aminosäureresten.

## Katalysiertes Gleichgewicht

$\rightleftharpoons$
TPI stellt ein Gleichgewicht zwischen den Zwischenprodukten Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) her. Die Substrate entstehen aus Fructose-1,6-Bisphosphat in der vorgelagerten Aldolase-Reaktion. Das Gleichgewicht liegt stark auf der Seite des DHAP, für den Fortlauf der Glycolyse wird allerdings GAP benötigt, so dass sich das Gleichgewicht durch Produktentnahme verschiebt (Prinzip von Le Chatelier).
Die Katalyse erfolgt über ein Endiol- bzw. Endiolat-Intermediat. Hierbei tritt ein Glutamat-Rest (Glu$^{165}$) im aktiven Zentrum des Enzyms mit dem ungewöhnlich hohen pK$_s$-Wert von 6,5 als Base auf, ein Histidin-Rest (His$^{95}$) als Säure.
Die Umsetzung von DHAP zu GAP erfordert einen ausgefallenen Reaktionsmechanismus, in dessen Verlauf Glu$^{165}$ ein H$^+$-Ion vom C-Atom 2 abstrahiert, während His$^{95}$ ein H$^+$-Ion ans C1-Atom abgibt. Dieser Mechanismus kann, da die Carboxygruppe des Glu viel azider (saurer) als das C2-Atom ist, unter nicht-enzymatischen Bedingungen keinesfalls ablaufen. Die TIM bildet durch die ideal auf das Substrat angelegte Umgebung des aktiven Zentrums hingegen sog. Low-barrier hydrogen bonds (LBHB) aus, eine spezielle Art von Wasserstoff-Brücken, die mit −40 bis −80 kJ/mol (anstatt etwa −12 bis −30 kJ/mol) deutlich stabiler sind. Diese LBHB werden durch gleichzeitige Protonierung und Deprotonierung an den C-Atomen C1 bzw. C2 erreicht.
Eine 10 Aminosäuren lange Sequenz des Enzyms, ein sogenannter Loop, verdeckt das aktive Zentrum im substratbeladenen Zustand. Einerseits wird damit das Endiol-Zwischenprodukt stabilisiert und die katalytische Aktivität auf diese Weise um den Faktor 10$^5$ erhöht, andererseits wird ein Entweichen dieses Zwischenprodukts verhindert – das Endiolphosphat würde spontan dephosphorylieren und sich zum toxischen Methylglyoxal umlagern.
Die TIM gilt, wie Jeremy Knowles zeigte, als „katalytisch perfektes Enzym“. Dies bedeutet, dass Veränderungen am Enzym, gleich welcher Art, keine Umsatzsteigerung mehr herbeizuführen vermögen: Die Wechselzahl von 4300 Substratmolekülumsätzen pro Sekunde wird nur durch die Diffusionsgeschwindigkeiten von Substrat und Produkt begrenzt.