# Plasma-Sequenzierung

Die Plasma-Sequenzierung (auch Plasma-Seq) bezeichnet Methoden zur Sequenzierung des Genoms aus dem Plasma einer Blutprobe.

## Prinzip

Die Plasma-Seq wird zur Bestimmung von zirkulierender freier DNA, meistens im Rahmen der Diagnostik von Tumoren, eingesetzt. Dabei kommen sogenannte next-generation-Methoden der DNA-Sequenzierung zum Einsatz. Dabei handelt es sich um eine nichtinvasive Methode zur Beurteilung der klonalen Evolution des Tumorgenoms. Durch die Plasma-Sequenzierung können fehlerhafte Therapieentscheidungen gemindert und die Behandlung von Tumoren optimiert werden, sodass eine maximale Wirksamkeit mit geringeren Nebenwirkungen erzielt werden kann. Plasma-Sequenzierung findet in der personalisierten Medizin ihren Einsatz, da sie die Überwachung des Tumorgenoms durch regelmäßige Blutabnahmen ermöglicht.

## Problemstellung und Anwendung

Für die Behandlung von Tumoren, wie zum Beispiel colorektalen Karzinomen und Prostatakarzinomen, ist es im Vorfeld wichtig, Genommutationen des Tumors herauszufinden, da diese die Therapien stark beeinflussen können. Bei colorektalen Entartungen mit einer KRAS-Mutation wirkt zum Beispiel keine Therapie mit monoklonalen Antikörpern, welche auf den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) gerichtet sind. Die Therapien richten sich dabei nach der Ausgangsdiagnose. Es zeigt sich jedoch, dass die Tumore aus noch unerklärlichen Gründen nach einigen Monaten der Behandlung Resistenzen entwickeln können. Da eine Tumorbiopsie eine sehr invasive Methode ist, besteht die Möglichkeit, die zellfreie DNA (cfDNA, cell-free DNA) im Plasma von Krebspatienten zu analysieren. Krebszellen können ihre Tumor-DNA in den Blutkreislauf freisetzen, diese DNA nennt man ctDNA (circulating tumor DNA). Sie ist ein Teil der cfDNA. Mit Hilfe einer Sequenzierung dieser DNA können genetische Mutationen identifiziert werden.

## Diagnostik

Einerseits wird die Methode der Plasma-Sequenzierung verwendet, um therapierelevante Mutationen aufzudecken (dies wird im Plasma jedoch nur dann durchgeführt, wenn kein relevantes Tumorgewebe zur Verfügung steht), andererseits ist die ctDNA nützlich, um tumor-spezifische Mutationen im Blut als Biomarker für Verlaufsbeobachtungen sowie Tumorrezidive frühzeitig zu erkennen. Die Plasma-Sequenzierung ermöglicht somit die Identifizierung von neuen Mutationen (z. B.: KRAS, MET oder ERBB2) eines Tumors bzw. kann bei der Diagnosefindung eine Hilfestellung sein. Dadurch kann für die betroffenen Patienten eine personen- und zielgerichtete Therapie ermöglicht werden. Durch die Instabilität des Tumorgenoms kann sich der Status von Biomarkern, die für die Einstellung einer Therapie wichtig sind, ändern. Durch frühes Reagieren auf neue Mutationen des Tumors kann man Therapien umstellen und dadurch ein Fortschreiten der Krankheit verhindern oder verzögern.
Ein Nachteil der Plasma-Sequenzierung ist, dass keine zielgerichtete Aussage über die Entstehung des Tumors getroffen werden kann. Eine Differenzierung des Entstehungsortes (des primären Tumorgewebes oder der Metastasen) ist bis dato nicht möglich. Dies liegt daran, dass die ctDNA sowohl vom einen wie auch dem anderen Tumor abstammen kann.

## Durchführung

Bei der Plasma-Sequenzierung handelt es sich um eine next-generation-Sequenzierung. Zu Beginn wird die DNA in der Plasmaprobe aufgereinigt und isoliert. Anschließend werden die Proben für eine Sequenzierung mit Brückensynthese vorbereitet. Dabei wird die Template-DNA fragmentiert und Adaptersequenzen werden an die DNA-Fragmente angefügt, sodass sie an einen Glasobjektträger gebunden sind. Auf diesem Objektträger findet die Sequenzierung statt und durch einen PCR-ähnlichen Schritt werden zyklusweise Cluster aus identischen Molekülen gebildet. Je Zyklus wird genau ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid komplementär zur Template-DNA eingebaut. Das Lichtsignal des Fluorophors kann detektiert und verarbeitet werden und im nächsten Zyklus erfolgt der nächste Einbau eines Nukleotids.
Für eine Analyse benötigt man ein Gerät für eine Sequenzierung, im Speziellen für eine Sequenzierung durch Synthese. Es besteht auch die Möglichkeit einer paired-end-Sequenzierung, welche die Genauigkeit der Analyse erhöhen kann. In diesem Fall werden die DNA-Fragmente von beiden Seiten sequenziert.
Mit einem Instrument für eine Gesamtgenomsequenzierung mit einem hohen Durchsatz und einer Sequenzierungstiefe von 0,1–0,2x aus einer Plasmaprobe kann man bereits innerhalb von zwei Tagen mit geringen Kosten ein genomweites Tumorprofil inklusive Kopiezahlvariationen erstellen.

## Methodenvergleich

Es besteht auch die Möglichkeit, das Tumorgenom durch zirkulierende Tumorzellen (CTC) zu überprüfen. Zirkulierende Tumorzellen werden von primären und metastasierenden Tumoren in die Blutbahn abgegeben und können dann isoliert und charakterisiert werden. Die Genotypen der CTCs ermöglichen Abschätzungen von Medikamentensensitivität sowie Resistenzen und können bei der Entscheidung der Therapie behilflich sein. Zusätzlich können CTCs Aufschluss über die Prognose geben.
| | CTC-Analyse | ctDNA-Analyse |
| Ausstattung | spezielle Geräte zur Identifizierung und von CTCs | einfache Blutprobe |
| Isolierung | komplexe Isolierung von CTCs | keine spezielle Isolierung, sondern eine Standard-DNA-Aufreinigung |
| Informationen über Heterogenität und Klonalität | Ja, wenn ausreichend Zellen analysiert sind | Nein, die Ergebnisse spiegeln den Durchschnitt der ctDNA von allen Tumorzellen wider |