# Tinció de Ziehl-Neelsen

La tinció de Ziehl-Neelsen és un tipus de tinció diferencial (composta per dues o més substàncies colorants) que fou creada i perfeccionada per dos doctors alemanys, el bacteriòleg Franz Ziehl (1859–1926) i el patòleg Friedrich Neelsen (1854–1898), durant els anys 1882 i 1883. La tinció es basa en les especials característiques lipídiques que tenen les parets cel·lulars (àcids micòlics amb una cadena beta-hidroxi curta i una cadena lateral d'alfa-alquil més llarga, formant una molècula entre 60 a 90 àtoms de carboni en el cas del bacil de Koch) d'alguns bacteris (bacteris acidoalcoholoresistents o BAAR) i altres classes de microorganismes, que els permeten resistir la decoloració amb àcid-alcohol després d'haver sigut tenyits amb colorants bàsics.
Aquesta tècnica és útil, per exemple, per identificar els bacteris Mycobacterium tuberculosis (el principal micobacteri patògen responsable de la tuberculosi), Mycobacterium marinum (que origina infeccions de tipus granulomatós en humans), diverses formes de Nocardia o el paràsit Cryptosporidium parvum (un protist causant de la criptosporidiosi) que es caracteritzen per les seves propietats àcid-alcohol resistents. També s'utilitza per diagnosticar en esput la paragonimosi (una infecció pulmonar causada pel platihelmint Paragonimus westermani i que té unes manifestacions clíniques semblants a les de la tuberculosi). Afegint el tensioactiu no iònic Tritó X-100, el mètode tenyeix ràpidament els micobacteris a petites quantitats de líquid cefalorraquidi. El diagnòstic de la meningitis tuberculosa és difícil i aquesta millora concreta de la tinció te més sensibilitat -tot i que una menor especificitat- que les proves d'amplificació dels àcids nucleics per detectar el bacil de Koch. Si la mostra de LCR és sotmesa a determinats procediments de citocentrifugació (Cytospin), abans d'aplicar l'esmentada tinció, augmenten les possibilitats d'identificar els M. tuberculosis intra i extracel·lulars. De vegades, la tinció de ZN pot donar un resultat negatiu a causa de la poca quantitat de bacteris presents a la mostra. En aquest cas, cal demostrar la seva presència emprant tècniques de immunofluorescència amb auramina-rodamina. Aquest és el mètode no biomolecular considerat de major sensibilitat per detectar micobacteris i es recomana utilitzar un microscopi de llum LED o amb làmpara de vapor de mercuri. En aspirats de limfadenitis de malalts amb sospita de TB la sensibilitat de la tinció millora si la mostra és prèviament sotmesa a liqüefacció amb NaClO i després centrifugada.
Els elements fonamentals de la tinció són el blau de metilé, l'alcohol àcid i la carbol-fucsina. La coloració clàssica de Ziehl-Neelsen requereix un suau escalfament per travessar la paret bacteriana. Alguns tècnics recomanen escalfar al microones la solució de carbol-fucsina al principi del procediment, uns 90´´ a baixa potència (60W) fins a tenir una temperatura de 46º per aconseguir uns resultats óptims. Aquesta tinció té dos variants destacables: una per tenyir els micobacteris i una altra per tenyir amb major especificitat altres patògens àcid-resistents. És important mantenir les concentracions de carbol-fucsina i fenol en el preparat, ja que canvis percentuals de dites substàncies comporten una menor sensibilitat de la tinció davant dels bacils àcid-alcohol resistents. Fa pocs anys s'emprava una concentració de carbol-fucsina del 0,3% per la detecció de M. tuberculosis; avui dia, molts protocols utilitzen una concentració del 1%. Un problema a l'hora d'identificar bacils de Hansen en mostres tissulars és que si es desparafinen els talls histològics amb xilol pur els bacils no es tenyeixen, ja que perden la propietat d'àcid-resistència. De ser necessari, es recomanable emprar la variant de Fite-Faraco.
Una versió modificada d'aquesta tinció és molt útil per identificar diverses espècies de fongs. Una altra modificació (Stamp, 1950) serveix per tenyir de vermell els bacteris del gènere Brucella, si bé pot donar falsos positius. S'han proposat moltes formes de millorar la visualització del Mycobacterium leprae amb la tinció de ZN. Una d'elles, potser la més econòmica i senzilla, és afegir unes gotes d'una solució d'hidròxid sòdic per augmentar l'alcalinitat (Siqueira et al, 1982). Alguna tinció diferencial similar, d'elaboració en fred i que utilitza el blau de metilé amb àcid sulfúric de Gabbet com substància decolorant, té la mateixa especificitat que la tinció de ZN; si bé una sensibilitat lleugerament menor. La tinció també s'ha emprat per detectar el coccidi Cyclospora cayetanensis en mostres de femta.
Per evitar el risc de toxicitat que comporta l'ús de carbol-fucsina (propi dels compostos fenòlics volàtils) a llocs sense suficients garanties de protecció laboral, es pot utilitzar una tinció semblant, la tinció freda de Kinyoun, una modificació de la ZN, que no origina vapors perillosos i dona bons resultats cercant Mycobacterium en frotis d'esput.
Els resultats cromàtics de la tinció, vistos amb microscòpia òptica són:
| BAAR, incloent el Micobacterium avium intracel·lular | vermell/porpra |
| Eritròcits | rosa |
| Mastòcits | blau |
| Nuclis | blau |
Per diferenciar Nocardia spp. (en especial Nocardia asteroides, patogen causant de greus infeccions pulmonars) d'Actinomyces spp. (les quals en persones sanes sovint formen part de la microbiota de les mucoses), es convenient utilitzar la variant freda de Kinyoun. Això és important a l'hora de detectar les nocardies en la citopatologia de mostres d'esput.
Existeixen algoritmes que faciliten el cribratge automatitzat d'imatges digitals del resultat d'aquesta tinció en anàlisis destinades a identificar micobacteris.

## Referències

* ↑ Bishop PJ, Neumann G «The history of the Ziehl-Neelsen stain» (en anglès). Tubercle, 1970 Jun; 51 (2), pp: 196-206. PMID: 4099679 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Takayama K, Wang C, Besra GS «Pathway to Synthesis and Processing of Mycolic Acids in Mycobacterium tuberculosis» (en anglès). Clin Microbiol Rev, 2005 Gen; 18 (1), pp: 81–101. DOI: 10.1128/CMR.18.1.81-101.2005. PMC: 544180. PMID: 15653820 [Consulta: 8 juny 2017].
* ↑ Singhal R, Myneedu VP «Microscopy as a diagnostic tool in pulmonary tuberculosis» (en anglès). Int J Mycobacteriol, 2015 Mar; 4 (1), pp: 1-6. DOI: 10.1016/j.ijmyco.2014.12.006. PMID: 26655191 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Cribier B, Aubry A, Caumes E, Cambau E, Jarlier V, Chosidow O «Aspects histopathologiques de l'infection à Mycobacterium marinum» (en francès). Ann Dermatol Venereol, 2011 Gen; 138 (1), pp: 17-22. DOI: 10.1016/j.annder.2010.10.025. PMID: 21276456 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Olson ES, Simpson AJ, Norton AJ, Das SS «Not everything acid fast is Mycobacterium tuberculosis--a case report» (en anglès). J Clin Pathol, 1998 Jul; 51 (7), pp: 535-536. PMC: 500808. PMID: 9797732 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Webster JP, Macdonald DW «Cryptosporidiosis reservoir in wild brown rats (Rattus norvegicus) in the UK» (en anglès). Epidemiol Infect, 1995 Ag; 115 (1), pp: 207-209. PMC: 2271563. PMID: 7641834C [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Slesak G, Inthalad S, Basy P, Keomanivong D, et al «Ziehl-Neelsen Staining Technique Can Diagnose Paragonimiasis» (en anglès). PLoS Negl Trop Dis, 2011 Maig; 5 (5), pp: e1048. PMC: 3096611. PMID: 21610861 [Consulta: 19 agost 2017].
* ↑ Chen P, Shi M, Feng GD, Liu JY, et al «A Highly Efficient Ziehl-Neelsen Stain: Identifying De Novo Intracellular Mycobacterium tuberculosis and Improving Detection of Extracellular M. tuberculosis in Cerebrospinal Fluid» (en anglès). J Clin Microbiol, 2012 Abr; 50 (4), pp: 1166-1170. DOI: 10.1128/JCM.05756-11. PMC: 3318527. PMID: 22238448 [Consulta: 3 juny 2017].
* ↑ Wang T, Feng GD, Pang Y, Yang YN, et al «Sub-optimal Specificity of Modified Ziehl-Neelsen Staining for Quick Identification of Tuberculous Meningitis» (en anglès). Front Microbiol, 2016 Des 27; 7, pp: 2096. DOI: 10.3389/fmicb.2016.02096. PMC: 5186791. PMID: 28082963 [Consulta: 3 juny 2017].
* ↑ CDC «Availability of an Assay for Detecting Mycobacterium tuberculosis, Including Rifampin-Resistant Strains, and Considerations for Its Use — United States, 2013» (en anglès). MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2013 Oct 18; 62 (41), pp: 821-827. PMID: 24141407 [Consulta: 3 juny 2017].
* ↑ Thermo Fisher Scientific «Shandon Cytospin®4 Cytocentrifuge» (en anglès). Catalogue M312118 R3/08, 2008, pàgs: 12. Arxivat de l'original el 17 de maig 2018 [Consulta: 18 maig 2018]. Arxivat 17 de maig 2018 a Wayback Machine.
* ↑ Philip N1, William T, John DV «Diagnosis of tuberculous meningitis: challenges and promises» (en anglès). Malays J Pathol, 2015 Abr; 37 (1), pp: 1-9. ISSN: 0126-8635. PMID: 25890607 [Consulta: 18 maig 2018].
* ↑ Annam V, Kulkarni MH, Puranik RB «Comparison of the modified fluorescent method and conventional Ziehl-Neelsen method in the detection of acidfast bacilli in lymphnode aspirates» (en anglès). Cytojournal, 2009 Jul 18; 6, pp: 13. DOI: 10.4103/1742-6413.53887. PMC: 2716690. PMID: 19680441 [Consulta: 3 juny 2017].
* ↑ Pernick, N «Acid fast/Auramine-rhodamine» (en anglès). Stains. Pathology Outlines, 2015; Nov 3, pàgs: 3 [Consulta: 23 octubre 2017].
* ↑ Krishna M, Gole SG «Comparison of Conventional Ziehl-Neelsen Method of Acid Fast Bacilli with Modified Bleach Method in Tuberculous Lymphadenitis» (en anglès). J Cytol, 2017 Oct-Des; 34 (4), pp: 188-192. DOI: 10.4103/JOC.JOC_84_16. PMC: 5655654. PMID: 29118472 [Consulta: 6 maig 2018].
* ↑ Llewellyn, BD «Ziehl-Neelsen for Acid Alcohol Fast Bacteria» (en anglès). Stainsfile, 2010, Feb, pàgs: 2. Arxivat de l'original el 4 d’abril 2016 [Consulta: 15 maig 2017]. Arxivat 4 April 2016$^{[Datemismatch]}$ a Wayback Machine.
* ↑ Churukian, C «Microwave Ziehl-Neelsen Method for Acid-Fast Bacteria» (en anglès). Method of the Histochemical Stains & Diagnostic Application. University of Rochester, 2009, 2n edition, pàgs: 1 [Consulta: 25 octubre 2017].
* ↑ Wall, Susan L. «Histology Procedure Manuals. Staining Procedures: Acid Fast Stain (for mycobacteria)» (en anglès). WebPath-Eccles Health Sciences Library. University of Utah, 2017, pàgs: 3 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Winn, Greg «Histology Procedure Manuals. Staining Procedures: Acid Fast Stain (Ziehl-Neelsen, for M. leprae and Nocardia)» (en anglès). WebPath-Eccles Health Sciences Library. University of Utah, 2017, pàgs: 2 [Consulta: 15 maig 2017].
* ↑ Selvakumar N, Rahman F, Rajasekaran S, Narayanan PR, Frieden TR «Inefficiency of 0.3% Carbol Fuchsin in Ziehl-Neelsen Staining for Detecting Acid-Fast Bacilli» (en anglès). J Clin Microbiol, 2002 Ag; 40 (8), pp: 3041–3043. DOI: 10.1128/JCM.40.8.3041-3043.2002. PMC: 120628. PMID: 12149374 [Consulta: 12 juliol 2017].
* ↑ Angra P, Ridderhof J, Smithwick R «Comparison of Two Different Strengths of Carbol Fuchsin in Ziehl-Neelsen Staining for Detecting Acid-Fast Bacilli» (en anglès). J Clin Microbiol, 2003 Jul; 41 (7), pp: 3459. DOI: 10.1128/JCM.41.7.3459.2003. PMC: 165351. PMID: 12843125 [Consulta: 12 juliol 2017].
* ↑ Singhal R, Myneedu VP «Microscopy as a diagnostic tool in pulmonary tuberculosis» (en anglès). Int J Mycobacteriol, 2015 Mar; 4 (1), pp: 1-6. DOI: 10.1016/j.ijmyco.2014.12.006. ISSN: 2212-554X. PMID: 26655191 [Consulta: 6 maig 2018].
* ↑ De Naranjo PJ, Rodríguez G, Rodríguez J, Calda ML «La coloración de Ziehl-Neelsen en histopatología» (en castellà). Revista Biomédica, 1988; 8 (3-4), pp: 84-93. ISSN: 2007-8447 [Consulta: 27 octubre 2017].
* ↑ Ellis, R «Fite-Faraco Staining Protocol for Leprosy Bacilli» (en anglès). IHCWorld, 2004, pàgs: 3. Arxivat de l'original el 9 de novembre 2016 [Consulta: 27 octubre 2017].
* ↑ Huss, Martin J. «Application of a Modified Ziehl-Neelsen's Carbol-Fuchsin Stain for Observing Nuclei in Vegetative Hyphae of the Puffball Species Lycoperdon pyriforme» (en anglès). Proceedings Arkansas Academy of Science, 1996; 50, pp: 70-74 [Consulta: 2 juny 2017].
* ↑ Tilak K, Eshwara VK, Tellapragada C, Mukhopadhyay C «Stamp's modified Ziehl-Neelsen staining for Brucella: Beware of the first impressions» (en anglès). Indian J Med Microbiol, 2016 Oct-Des; 34 (4), pp: 561-562. Arxivat de l'original el 5 de novembre 2018. DOI: 10.4103/0255-0857.195363. PMID: 27934847 [Consulta: 2 juny 2017].
* ↑ Siqueira LF, de Almeida RG, Belda W «Modificação da coloração de fundo da técnica de Ziehl-Neelsen na identificação do Mycobacterium leprae» (en portuguès). Hansenol Int, 1982 Des; 7 (2), pp: 88-94. Arxivat de l'original el 30 d’abril 2018. ISSN: 1982-5161. PMID: 6198275 [Consulta: 4 juny 2017].
* ↑ Weldu Y, Asrat D, Woldeamanuel Y, Hailesilasie A «Comparative evaluation of a two-reagent cold stain method with Ziehl-Nelseen method for pulmonary tuberculosis diagnosis» (en anglès). BMC Res Notes, 2013 Ag 13; 6, pp: 323. DOI: 10.1186/1756-0500-6-323. PMC: 3847439. PMID: 23941444 [Consulta: 8 juny 2017].
* ↑ Clarke SC, McIntyre M «Modified detergent Ziehl-Neelsen technique for the staining of Cyclospora cayetanensis» (en anglès). J Clin Pathol, 1996 Jun; 49 (6), pp: 511–512. PMC: 500546. PMID: 8763270 [Consulta: 23 juliol 2017].
* ↑ Merck KGaA «Fucsina fenicada en solución según Ziehl-Neelsen» (en castellà). Ficha de datos de seguridad de acuerdo al Reglamento (CE) No. 1907/2006, 2017, Maig 25; V13.14, pàgs: 25 [Consulta: 11 juny 2017].
* ↑ HiMediaLabs «HiCold Stain TB Kit-Kit for Mycobacteria (Kinyoun method)» (en anglès). K062. Technical Data, 2015, 1, pàgs: 2. Arxivat de l'original el 10 de setembre 2016 [Consulta: 11 juny 2017].
* ↑ Kurup R, Chester K «Comparative Evaluation of Ziehl Neelsen Staining and Knowledge, Attitudes and Practices of Laboratory Personnel in Relation to Ziehl Nielsen» (en anglès). West Indian Med, 2014 Gen; 63 (1), pp: 34-39. DOI: 10.7727/wimj.2012.247. PMC: 4655639. PMID: 25303192 [Consulta: 11 juny 2017].
* ↑ McHugh KE, Sturgis CD, Procop GW, Rhoads DD «The cytopathology of Actinomyces, Nocardia, and their mimickers» (en anglès). Diagn Cytopathol, 2017 Des; 45 (12), pp: 1105-1115. DOI: 10.1002/dc.23816. ISSN: 8755-1039. PMID: 28888064 [Consulta: 6 maig 2018].
* ↑ Kenzaka T, Kumabe A «Nocardia sputum staining» (en anglès). QJM, 2014 Mar; 107 (3), pp: 229. DOI: 10.1093/qjmed/hct086. ISSN: 1460-2393. PMID: 23564634 [Consulta: 6 maig 2018].
* ↑ Tadrous, PJ «Computer-assisted screening of Ziehl-Neelsen-stained tissue for mycobacteria. Algorithm design and preliminary studies on 2,000 images» (en anglès). Am J Clin Pathol, 2010 Jun; 133 (6), pp: 849-858. DOI: 10.1309/AJCPMR3BLVBH8THV. ISSN: 0002-9173. PMID: 20472842 [Consulta: 4 juny 2018].

## Bibliografia

* García del Moral, Raimundo. Laboratorio de Anatomía Patológica (en castellà). Ed. McGraw-Hill/Interamericana, 1993. 1ª ed. pp: 284. ISBN 8448102290 [Consulta: 15 maig 2017].

## Enllaços externs

* Tinción de Ziehl-Neelsen. Universidad Miguel Hernández de Elche. 6 de juliol 2012 (en castellà)