電解質溶液中DNA断片の電気泳動における塩基対数-泳動距離の関係についての考察

# はじめに

初めまして、東京大学理学部物理学科3年の升永安穂と申します。[^A]
今回は[塩基対数-泳動距離の関係の考察]を
i) 背景知識の導入
ii) 現象を説明できなかったモデル
iii) ある程度現象を説明できるモデル
iv) この試行の意味・次の記事
の順で説明します。
生物・物理ともに背景知識はこの記事でできる限り説明することを試みます。この記事においてモデル化とは事象を数学的・物理的背景を踏まえて表そうとすることを指します。

## 各節でざっくりと何を話すか？
i)では生物学的な背景知識を記述します。
ii) ではi)を踏まえて最も単純なモデル化をした場合、実験と整合しないことを述べます。
iii)ではここ数ヶ月で周囲の助言を踏まえつつ ii)を修正し、結果に大凡合う式を導きます。
v) ここまでの試行で考慮していない部分、この問いを考えるにあったって知った興味深い事象について述べます。
興味や知識に応じて読んでいただければ幸いです。

# i) 背景知識の導入
## 電気泳動とは
今回考えたいのは**電気泳動**という実験法についてです。これは、DNA・RNAやタンパク質のように帯電した物質を物理化学的性質に応じて分離する方法です。分離した物質の **「長さ」** は後に述べる関係性から大凡推定されるので、例えば、PCRで増幅したサンプルが期待されるものだったか検証するのに使われたりします。
今回は特に**アガロースゲル**を用いた**DNA断片**の電気泳動について考えます。
### 電気泳動のやり方
電気泳動での作業は以下のようなものです。(図1)
1. 専用の機械にバッファーを注ぎます
1. バッファーに浸したアガロースゲルのウェルの内、1つに「長さ」がわかっているDNA断片の集合(ラダーと呼ばれます)を注入します
1. 他のウェルに着色したサンプルを注入します
1. 電圧をかけます
1. ある程度の時間(20-30分)経過したあと、印加電圧を切ります

この作業をしたゲルに対して、UVを当ててみると、着色されたDNA断片が移動したことが確認できます。これとラダーを比べることで大凡のDNA断片の「長さ」が分かります。
```plantuml
@startuml
<style>
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  Padding 0
  Margin 0
}
footer {
  FontColor black
  FontSize 60
}
</style>
footer 図１ 電気泳動の作業(画像: https://www.youtube.com/watch?v=jOb6l8rtClc)
title <img:https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/3809012/90cbb01b-56fe-df1f-5ad5-d56db7f94a54.png>
@enduml
```

## タイトルの意味
今まで「DNA断片の『長さ』」と述べてきたものは長さの単位で表すよりも **断片に含まれる単位構造(塩基対)の個数=塩基対数(bp)** で表すことが一般的です。[^B]
そして、タイトルの[DNA断片の電気泳動にける塩基対数-泳動距離の関係]というのは、実験的には(図2)のように分かります。
```plantuml
@startuml
<style>
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  Padding 0
  Margin 0
}
footer {
  FontColor black
  FontSize 60
}
</style>
footer 図2 電気泳動の結果
title <img:https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/3809012/0548e0f4-9743-948f-60b1-9d7afe9d7f61.png>
@enduml
```

(図2)が**縦軸塩基対数、横軸泳動距離**の片対数グラフであることに注意すると、DNA断片が極端に短い/長い領域以外では
大凡、
```math
\text{(泳動距離)}\propto\log\text{(塩基対数)}
```
として知られています。

私はこれを不思議だと思った、というのがこの記事を書いている動機です。
## モデル化に関係しそうな性質
タイトルの意味を説明したところで、早速この現象をモデル化していきたいわけですが、流石に材料が足りていないのでもう少し説明します。
### DNA断片の構造
DNA断片は水溶液中で負に帯電することが知られています。
DNAを構成する単位構造であるヌクレオチドの中のリン酸基が電離するためです。

```plantuml
@startuml
<style>
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  Padding 0
  Margin 0
}
footer {
  FontColor black
  FontSize 30
}
</style>
footer 図3 ヌクレオチドの構造
title <img:https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/3809012/f3455fd0-9013-9bc9-0184-fb49a69150c3.jpeg>
@enduml
```


# ii) 現象を説明できなかったモデル
まず、状況を最も単純に考えてみました。仮定と結果をそれぞれ述べます。
## 仮定
:::note info
i.  **DNA断片の2次以上の構造は考えない。**
ii. **電気泳動する際の緩衝液を速度に比例する粘性抵抗がある場として考える。**
iii.  **DNA断片の重さと鎖長[^G]は比例する。**
iv.  **DNA断片全体の電荷と鎖長は比例する。**
v. **DNA断片同士で及ぼし合う力はないとする。**
vi. **(電荷)×(電場)=(静電気力)とする**
:::

###  i. DNA断片の2次以上の構造は考えない。

この仮定は、塩基対数のみで対数関係が現れていることから妥当と思いました。
    
### ii. 電気泳動する際の緩衝液を速度に比例する粘性抵抗がある場として考える。

高分子鎖のゲルの中を泳動していることを考えれば、「何らかの抵抗が生じており、しばらく泳動していくうちに抵抗力と印加電圧に起因する静電気力が釣り合う」ということを考えるのは、最も単純なモデルとしては自然そうです。
###  iii. DNA断片の重さと鎖長は比例する。
DNA断片の重さに影響する要因として「核酸鎖自体の重さ」「着色剤の重さ」が考えられます。
    断片自体の重さを考えるときに1bpの重さは構成する塩基の種類(A,T,G,C)によって多少異なりますが、これらの出現頻度で重み付けした加重平均を分子量に反映すれば 1塩基あたりの重さが定数として考えられそうです。
    「着色剤の重さ」と述べたのは、着色剤が核酸の分子の間に取り込まれることで(インターカレートといいます)、核酸を標識するからです。

着色剤についても何bpに1つ、その分子が取り込まれるというふうにみなすのはまぁまぁ妥当な仮定と思われます。
### iv.  DNA断片全体の電荷と鎖長は比例する。

iii.と同様に、1bpあたりの帯電量というのは考えられそうです。
### v. DNA断片同士で及ぼし合う力はないとする。

それぞれのDNA断片が帯電しているので、本来はDNA断片同士の相互作用がありそうですが、今回は簡単のため、無視します。

### vi.  **(電荷)×(電場)=(静電気力)とする**
これも、これだけ見れば、当然の式です。
## 結果
以上の仮定のもとに、ある長さのDNA断片の泳動距離がどのように表されるか考えてみます。
以下のように文字を置きます。
|$L$|DNA断片の長さ[bp]|
|:----|:----|
|$v$|DNA断片の移動速度|
|$\rho$|1bpあたりの質量|
|$\epsilon'$|1bpあたりの電荷数|
|$E$|電場|
|$\eta$|抵抗に関する係数|

仮定の下、運動方程式は
```math
\begin{align}

(\rho L)\frac{dv}{dt} &=-\eta v+\epsilon' EL\\
\frac{dv}{dt}&=-\frac{\eta v}{\rho L}+\frac{\epsilon'E}{\rho}\\
\text{変数分離法により}&\\
v&=\frac{\epsilon'EL}{\eta}+C\exp(-\frac{\eta t}{\rho L})\\
(Cは定数)\\
\text{泳動距離は}&\int v dt\text{であるため}\\
\int vdt&=\frac{\epsilon'ELt}{\eta}-C\frac{\rho L}{\eta}\exp(-\frac{\eta t}{\rho L})
\end{align}
```
この場合、
```math
(泳動距離)\propto (定数)L-L\exp(\frac{(負の定数)}{L})\cdots ①
```
であり、$L$がある程度大きいと第二項が消えて、
```math
(泳動距離)\propto L\
```
になり、
期待されていた
$(泳動距離)\propto \log L$とは程遠い形になってしまいました。(図4)

```plantuml
@startuml
<style>
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  Padding 0
  Margin 0
}
footer {
  FontColor black
  FontSize 24
}
</style>
footer 図4 ①と仮定したときのグラフの概形。
title <img:https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/3809012/4dc0e70c-0718-8c22-2936-a372898eab27.png>
@enduml
```


(図4のスケールは実際のパラメータを使ったわけではないことに注意。)
# iii) ある程度現象を説明できるモデル
先に、前の試行でうまくいかなかった背景を述べます。
## 追加の事前知識
### DNA分子は丸まっている
DNAは溶液中でまっすぐに伸びた形をしているわけではありません。[^J] 
#### 高分子の長さと広がり具合の関係
今回は最も単純に求まる例として$\langle x^2\rangle\propto L$を用います。[^K][^O]導出をします。
簡単のため、一次元で考えます。(3次元でも$\langle x^2\rangle\propto L$になることは比較的簡単に示されます。)**ランダムウォーク**を考えます。
設定は(図5)のとおりです。
```plantuml
@startuml
<style>
root {
  Padding 0
  Margin 0
}
footer {
  FontColor black
  FontSize 45
}
</style>
footer 図5 1次元ランダムウォークの定式化
title <img:https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/3809012/fc4f3814-37d4-5b3e-48b4-edc51f33cf40.png>
@enduml
```

今、n分子からなるポリマーを考えているとします。
一分子の長さが$d$であるとします。分子は+か-の向きをそれぞれ確率$\frac{1}{2}$で取ります。
i番目の分子の位置を$x_i$とします。
そして、最も重要な特徴として、ある分子が取りやすい向きは他の分子の向きに依りません。
以上の設定のもと、計算します。
一分子が加わったときにどれだけx方向に伸びるか、の期待値は
$\langle x_{i+1}-x_{i}\rangle=p(-d)+pd=0$
で、是だけ見ると全く意味がないかのようですが、一分子が加わったときにどれだけ広がりができるか(つまり分散)、の期待値は
$\langle\mathrm{Var} [x_{i+1}-x_{i}] \rangle =\langle (x_{i+1}-x_{i})^2\rangle=p(-d)^2+pd^2=2pd^2$
いま、$p=\frac{1}{2}$であるため、
$\langle \mathrm{Var} [x_{i+1}-x_{i}]\rangle=d^2$です。
では、たくさんの分子が連なっているときの長さや広がりの期待値を求めましょう。
長さの期待値は
```math
\begin{align}
\langle x\rangle&=\langle (x_n-x_{n-1})+(x_{n-1}-x_{n-2})+\cdots+(x_2-x_1)+(x_1-0) \rangle\\
&=\langle x_n-x_{n-1}\rangle+\cdots+\langle x_1-0\rangle\\
&=n\times 0\\
&=0
\end{align}
```
とまたしても0です。
一方で分子鎖の広がりは
```math
\begin{align}
\langle \mathrm{Var} [x]\rangle&=\langle x^2\rangle-\langle x\rangle^2\\
&=\langle \left\{(x_n-x_{n-1})+(x_{n-1}-x_{n-2})+\cdots+(x_2-x_1)+(x_1-0) \right\}^2\rangle-0\\
&=\langle (x_n-x_{n-1})^2\rangle+\cdots+\langle (x_1-0)^2\rangle\\
&+2\left\{\langle (x_n-x_{n-1})(x_{n-1}-x_{n-2})\rangle+\langle (x_n-x_{n-1})(x_{n-2}-x_{n-3})\rangle+\cdots
\langle (x_{n-1}-x_{n-2})(x_{n-2}-x_{n-3})\rangle
+\cdots\langle (x_2-x_1)(x_1-0)\rangle \right\}\\&\text{ある分子が取りやすい向きは他の分子の向きに依らないことから}　\\
&\langle (x_{i+1}-x_i)(x_{j+1}-x_j)\rangle=0
(i\neq j)
\\&=nd^2
\end{align}
```
分子の長さと広がり度合いの関係を見たいときには
$d$は定数であり、$L=nd$であるため、$\langle (\Delta x)^2\rangle\propto L$
です。$\Box$

### バッファーの組成が重要である。
電気泳動の際に使うバッファーは電解質溶液です。
タイトルに[電解質溶液中]とつけなければならなかったのは、非電解質溶液中で
電気泳動しても移動距離には鎖長による差が見られないからです。[^D][^E]

電解質中では電荷が遮蔽されていること[^M]が効いて来ているのかもしれません。(しかし、私は、非電解質溶液中と電解質溶液中での挙動の差にそこまで影響してくるのか理解できていません。)
電荷の遮蔽について考慮するには、例えば、ii)の内容を多少修正するなら、$\rho$は**電解質水溶液による遮蔽を考慮した**実効的な電荷に置き換えます。


### 本当に (泳動距離)はlog(塩基対数)に比例するか?
ここまで前提のように$\text{(泳動距離)}\propto\log{(塩基対数)}$としてきました。
しかしながら、[(図3)](#タイトルの意味)で鎖長が10kbps以上になると片対数プロットにおける直線から離れて見えます。勿論、理論を適用できる範囲が限られているとして、$\text{(泳動距離)}\propto\log{(塩基対数)}$を使っても良いと思いますが、
実は(範囲によるでしょうが)、$\text{(泳動距離)}\propto\frac{1}{a+(塩基対数)}$, つまり**反比例の方が**一致度の高い近似であるという話もあります。[^H]
では、なぜ、対数に載っていると言われるかというと、対数関係が否かを確かめるのは片対数グラフを使えば簡単だからだと推測されます。
領域に依って挙動が異なるという話は既知のようです。
## 仮定
:::note info
i.**<変更>** 分子の長さ$L$と広がり具合$x$を区別する。
ii.-1 **<変更>** 速度は定常的な速度を考える。
ii.-2 **<変更>** 抵抗係数$\eta$は鎖の長さ$L$に比例するとする。
iii. DNA断片の重さと鎖長$L$は比例する
iv. DNA断片全体の電荷と鎖長$L$は比例する
v. DNA断片同士で及ぼし合う力はないとする。
vi.**<追加>** 鎖の部分構造の接ベクトル方向にしかその部分構造は動けないとする。
鎖の部分構造の向きと電場の向きが一致しているとは限らないことに注意すると(全電荷)×(電場の大きさ)$\neq$(静電気的な力の大きさ)である。
　実効的に電場がかかるスケールとして、$L$ではなく$\frac{x^2}{L}$を採用する。[^L]
 
:::
i.は[前述](#DNA分子は丸まっている)のとおりです。

ii.について、抵抗についての条件を先ほどと変更しました。確かに、実効的に長くなるほど抵抗を受けやすいというのは直感的にもそんなにおかしくありません。[^I]

iv. について、この説明では納得されないかもしれません。説明の簡単のためにこう書きましたが、注[^L]の文献ではより正確に議論されています。
## 結果
以下のように文字を置きます。
|$L$|DNA断片の長さ[bp]|
|:----|:----|
|$x$|DNA断片の広がり具合|
|$v$|DNA断片の移動速度|
|$\rho$|1bpあたりの質量|
|$\epsilon'$|1bpあたりの電荷数|
|$E$|電場|
|$\eta$|抵抗に関する係数|

仮定の下、
```math
\begin{align}
(\rho L)\frac{dv}{dt} &=-\eta v+\frac{\epsilon' Ex^2}{L}\\
\frac{dv}{dt}&=-\frac{\eta v}{\rho L}+\frac{\epsilon'E x^2}{\rho L^2}\\
\text{定常状態を考えるので} &\frac{dv}{dt}=0\text{として}\\
v&=\frac{\epsilon'Ex^2}{\eta L}\\
\text{期待値を取ると}&
\\
\langle v\rangle&=\frac{\epsilon'E\langle x^2\rangle }{\eta L}
\end{align}
```
$\eta\propto L, \langle x^2\rangle =\langle \mathrm{Var}[x]\rangle\propto L $を思い出すと、
```math
v\propto \frac{1}{L}
```
で逆数関係にあることが分かりました。

# iv) この試行の意味・次の記事
この記事で考慮されていないことを述べます。
### 本当に (泳動距離)はlog(塩基対数)に比例するか?(続)
この点については[先](#本当に(泳動距離)はlog(塩基対数)に比例するか?)に述べましたが、より詳細に書きます。
自由溶液中で電気泳動しても、電荷の遮蔽のため、鎖長と泳動距離には関係がありません。したがって、やはりゲルを使っていることも重要です。

分子がゲルの網目の大きさよりも小さい時(1%のアガロースゲルなら300bpほど)、分子は自由に動けるけれども、ゲルにぶつかります。この領域では比較的片対数グラフの直線に載っているように見えますし、A. G. Ogstonという方が、それに合うモデルも提唱したそうです。[^R]

一方で、分子がある程度よりも長いときは分子が網目に引っかかる影響を無視できません。この領域での動き方のモデルをreptation modelと言ってこれはノーベル賞受賞者のde Gennesが命名したそうです。[^P]reptataionする領域では、分子は分子鎖の方向に向かってのみ動きます。

全く異なるよう思えますが、$y=\frac{1}{x}$
のグラフを片対数で見るとわかるように、yが大きい領域では片対数グラフの直線に載っているように見えるので、それほど悪くないような気もします。
### DNA断片の運動での熱ゆらぎの影響
 経験則的にDNAの電荷密度は6 e/nm[[^BNID]](https://bionumbers.hms.harvard.edu/bionumber.aspx?s=n&v=5&id=103784), 1bp 0.3nm, 電気泳動装置の出力電圧が75V[[^モノタロウ]](https://www.monotaro.com/g/02946055/)として、電気ポテンシャルは$\sim 10^{-16} \mathrm{[J]}$で室温での$\mathrm{k_B}T(4.11×10^{−21}\mathrm{[J]})$よりも$10^5$ほど大きい。
 これは、熱ゆらぎに対して十分に大きな外力が加わっていることが示唆されています。もし、一様な電場をかける実験ならば電気泳動での運動自体を**ゆらぐ系**として考える必要性は一見なさそうです。[^C][^F]

しかし、どうやら考える余地もあるようです。今は定電場を考えましたが、定電場で普通のゲルで電気泳動すると鎖長が大きいときに分離できないようです。
それを解消するために周期的な電場をかけるという手法が存在するようです。[^Q]その場合のシミュレーションでランジュバン方程式を使ったものが存在するようなので咀嚼して記事にできたらいいなと思っています。


### この試行に意味はあるのでしょうか?
これが「"What Is Life"に繋がらない問だ」[^N]という点において、生物物理的な内容ではないかもしれません。ただ、かなり、単純に説明されたという嬉しさや、(少なくとも私にとって)高分子・ソフトマターについて積極的に考える機会になったという点では意味があります。
あるいは誰かのレポートの役に立てば幸いです。
### 次に書きたいこと
- A. G. Ogstonのモデル化について
- Deutsch & Madden, 1989による周期的に反転する電場のもとでのDNAの挙動について
- （要望があれば）もっと正確にiii)の議論をする。
- より熱力学的にこの問題に取り組んだ論文[Electrophoretic mobility of semi-flexible double-stranded DNA in defect-controlled polymer networks: Mechanism investigation and role of structural parameters]を咀嚼する。
~~年をまたぎたくないのと~~ 記事を書くうえでの挙動がどんどん遅くなってきたので今回は終わらせていただきます。最後までお読みいただきありがとうございました。

# 参考文献
基本的には注釈にかいています。
加えて、wikipedia,Electrophoresis <https://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoresis>
も
この問題を考えるうえで非常に重要でした。
あんまり網羅的に知らない領域は、英語でwikiから調べると望む文献に出会いやすい のかもしれないという教訓を得ました。
[^A]:今回は名乗ります。
[^B]:ナノメートルのような長さの次元を持つ量で表しても、塩基対数と長さは大凡比例関係にあるので同じような関係性は成り立つはずですが、実験する際には塩基対数で考えているため、このような書き方をしています。
[^G]:もしかしたら、鎖長という言い方は私が勝手に用いているだけかもしれません。
私が使っている意味としてはcontour length of the chainであり、この記事で「長さ」といっていたものを「『DNA断片の輪郭に沿った』長さ」を意図しています。

[^C]:今夏頃からずっと、DNA断片のサイズ間自体は$<1\mathrm{\mu m}$程度でありブラウン運動が無視できないはずと考えていました。しかし、考えてみれば自明なように、ブラウン運動に特有の部分はホワイトノイズの仮定であり、その効果は期待値としてみれば0です。
移流の効果を加えて考えればなにか出てくるかもしれないと思いましたが、移流拡散方程式から求まる移動距離の期待値は$v$を移流の速度として、$vt$であります。この$v$と塩基対の長さの関係は、この観点からは明らかにならないような気もしてきます。
[^F]:改めて、物事を考えるうえで見積もりをすることが重要なのだと気づきました。
[^D]:[参考] 島尾和男, 電気泳動法の基礎知識 <https://www.jstage.jst.go.jp/article/sbk1951/41/1/41_1_1/_pdf>
[^H]:Elder, J. K., & Southern, E. M. (1983). Measurement of DNA length by gel electrophoresis II: Comparison of methods for relating mobility to fragment length. Analytical Biochemistry, 128(1), 227-231.
[^J]:統計物理学的にどのように扱われるかについて、最も簡単な例としては、物理学演習IV 中間試験の第二問を参照するといいと思います。
[^K]:実は、以前[他の記事](https://qiita.com/capybara_appin/items/a534a44f5a81b1c2d774)でも紹介した、2022年[五月祭のポスター](https://event.phys.s.u-tokyo.ac.jp/physlab2022/poster/bp-poster02.pdf)でも取り上げられている結果です。
[^I]:ゲルを使った電気泳動の実験で、純粋に$\eta$の影響だけを求めるのは難しそうです。
[^L]:今回は説明の簡単のため、このような書き方になっていますが、
[Zimm, B. H., & Levene, S. D. (1992). Problems and prospects in the theory of gel electrophoresis of DNA. Quarterly reviews of biophysics, 25(2), 171-204.]
 のp6,7付近では、これと同等の議論を、各モノマーの速度から重心速度をもとめるという議論を[あと](#本当に(泳動距離)はlog(塩基対数)に比例するか?(続))に説明する"reptation "の「軸方向にしか動かない」という仮定をつかうことにより、より正当に議論しています。
[^E]:ここには、「電気泳動でなぜ、長さによって分別できるの?」という問いに対して、教科書や先生方は、「ゲルの網目より分子が大きいほど引っかかって流れにくいから」とよく説明するが、その説明は非常にわかりやすいけれど不十分なのではないか、という気付きがあります。
[^M]:この遮蔽電荷に対する見積もりについても文献があります。(参考:北原文雄, ゼータ電位: 微粒子界面の物理化学)
[^N]:以前、人に話した際にそのように評価されました。
[^O]:[鳥谷部祥一，物理学アドバンストシリーズ生物物理学]の議論と同じです。また、この本は高分子差の取り扱いについてもかいて
あります。
[^P]:「de Gennesという人が『ヘビが杭の間を這うような』ことを考えた」ということをこの前の生物物理の自主ゼミの際に教えてもらったときは、気づきませんでしたが、まさに文献を探していくうちに "reptation"のことを指していたのだと気づきました。
[^Q]:FIGEというようです。
[^R]:どうやら、
ゲルとの衝突による減速の頻度がポアソン分布にしたがう、ということを考えているようで、これが本当ならば、以前[@Cosmic_Censor](https://qiita.com/Cosmic_Censor)にこの話題をしたときに帰ってきた回答と近くて、@Cosmic_Censorすごい、と思いました。