【TBtools】シークエンスデータのシンテニープロットやってみた

# はじめに
次世代シーケンサーが登場してはや15年強。少しネットを調べれば、染色体レベルでアセンブリされたシークエンスデータが手軽に手に入る時代になりました。
せっかく公開されているんです。使わなければ損！　あなたのシーケンスデータと公開データを比較してみましょう。
しかし、シーケンスデータの処理はバイオが専攻、特にウェットの生物学が専攻の人には簡単ではないですね。
本記事では、TBtoolsというツールを使って、**簡単にGUIでゲノムシンテニープロットを比較する方法を紹介します**。
Genome assembly データと Gene annotation データがあればすぐできますので、この記事を見たらぜひやってみてください。あなたも染色体進化研究の虜になりますよ！

# 目次
- [TBtoolsとは](#TBtoolsとは)
- [インストール](#インストール)
    - [TBtools](#tbtools)
    - [解析に使うシーケンスデータ](#解析に使うシーケンスデータ)
- [2種間のシンテニーブロック可視化手順](#2種間のシンテニーブロック可視化手順)
- [結果](#結果)
- [こんなときは](#こんなときは)

# TBtoolsとは
"Tools for Biologist"の略で、ハイスループットデータを扱うのに役立つツールキット。
さまざまな生物学的データ処理ツールを統合した生物学者向けのツールセットで、スタンドアロンのソフトウェアにより、GUIで使えることが特徴です。
具体的には、シーケンスの各種操作（ORF予測、変換など）、BLAST、GO・KEGG（アノテーション）、ベン図やヒートマップおよびシンテニープロットなどの図の作成などができます。
今回使用する、ゲノム間のシンテニー領域を調べる機能のアルゴリズムには、MCScanXを採用しています。

GitHub上にソースコードが公開されています。
https://github.com/CJ-Chen/TBtools
ベン図、ヒートマップ、シンテニーブロックの可視化など、分析結果の例がREADMEに載ってますので、参考にしてください。
コマンドラインからも実行できますが、今回は普段CUIに触らない生物学者向けですので、GUIベースでお話を進めます。

# インストール
#### TBtools
[GitHubの最新リリース](https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases) からインストールしてください。
Windowsの場合は、ダウンロードした.exeファイルを実行して設定するだけです。

#### 解析に使うシーケンスデータ
[Ensembl Rapid Release](https://rapid.ensembl.org/index.html)から、適当な種の **Genome assembly データ（FASTA）** と **Gene annotation データ（GFF3）** を取ってきましょう。
（目的の種は[一覧ページ](https://rapid.ensembl.org/info/about/species.html)から探しましょう）
今回は例として、モンシロチョウ（cabbage white）とオオモンシロチョウ（large cabbage white）のデータを使いました。
|Name|Scientific name|Genome assembly|mask|
|---|---|---|---|
|モンシロチョウ|*Pieris rapae*|ilPieRapa1.1 (GCA_905147795.1)|hardmasked|
|オオモンシロチョウ|*Pieris brassicae*|ilPieBrab1.1 (GCA_905147105.1)|hardmasked|

ダウンロードされるのは圧縮ファイル（.gz）ですので、解凍をお忘れなく。

自分のデータを使う場合も、FASTAファイルと、GFF3もしくはGFFファイルを用意してください。

# 2種間のシンテニーブロック可視化手順
**1.TBtools を起動する**
インストール時にデスクトップにショートカットを作成していれば、そこをダブルクリックするだけでOKです。
ホーム画面には、なぜか偉人の名言がランダムで表示されます。今回はキング牧師でした。
![2022-12-07.png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/b0d184cf-29ed-7c4c-93cc-c7c1801ab8f0.png)

**2.Graphics > Comparative Genomics > One Step MC ScanX を選択する**
![2022-12-07 (2).png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/daa62921-bc5d-80d5-d8f4-405258551e5b.png)

**3.FASTAファイルとGFF3ファイルのパスを設定する**
使いたいファイルをドラック&ドロップすればいいです。
テキストボックスの右のボタンから設定することもできます。
![image.png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/d9f1ed2b-8bdc-f87b-04f6-07ddeeb87faf.png)

**4.出力先のパスを設定する**
出力先にしたいディレクトリをドラック&ドロップすればいいです。
テキストボックスの右のボタンから設定することもできます。
![image.png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/ef5425c1-0fd5-81d5-ca57-2bf2d6b8793a.png)

**5.start ボタンを押す**
ボタンを押下後、start の文字がグレーになってから結構長い間待ちます（シーケンスデータのサイズにもよりますが）。
フリーズしたと勘違いして終了などしないように気を付けましょう。
モンシロチョウ vs オオモンシロチョウの場合、約15分待ちました。
E-valueなど、パラメータを設定して実行することもできます。

無事実行が完了すると「MCScanX Running Finished...」というポップアップが表示されます。
出力先ディレクトリに複数のファイルが生成されているはずです。

**6.Graphics > Comparative Genomics > Dual Synteny Plot for MCScanX を選択する**
![2022-12-07 (5).png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/2be65f2f-4e0d-e964-01cd-a7f0bd670cb5.png)

**7.出力されたファイルから、拡張子が「.ctl」「.gff」「.collinearity」のファイルをそれぞれ選んで設定する**
![image.png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/0a54008c-ef56-bdec-df08-b1e4e63c282b.png)
ここも同様に、出力先にしたいディレクトリをドラック&ドロップすればいいです。
テキストボックスの右のボタンから設定することもできます。
ハイライトしたい遺伝子リストがあればここで設定できます（オプション）。

**8.start ボタンを押す**
結果がすぐに画面に表示されます。

# 結果
こんな感じで画面上に結果が表示されます。
![2022-12-07 (7).png](https://qiita-image-store.s3.ap-northeast-1.amazonaws.com/0/652177/b8580874-e7dc-977d-b2d7-bd9bd4361b29.png)
Save Graph から、.png .jpg .svg .pdf で好きなフォーマットで結果を保存できます。
拡大縮小も可能ですので、いい感じに調整して出力しましょう。

# こんなときは
解析時、下記のようなエラー表示が出ることがありました。
`java.io.IOException: Chr IDs is NOT consistent in Species [ファイル名]`
筆者の場合、解析に使用したファイルのフォーマットが不適切な場合に本エラーが発生しました。ファイルの中身や拡張子をご確認ください。

# おわりに
今回はわかりやすさのために、シンテニープロットのみにフォーカスして記事を書きました。
シーケンス技術の発展とともに分析ツールも多数出現してきておりますが、やはり非情報系生物学者には、わかりやすいことが第一ですね。
TBtoolsは他にも便利な機能が多数搭載されていますので、まずは遊んでみてください！

# 参考
[Ensembl Rapid Release](https://rapid.ensembl.org/index.html)
[HTSデータを扱う様々なツールをGUIインターフェースで統合した TBtools](https://kazumaxneo.hatenablog.com/?page=1628508105)
[ゲノム間のシンテニー領域を調べる MCScanX](https://kazumaxneo.hatenablog.com/entry/2020/06/20/144410)
[染色体イデオグラムや染色体間のシンテニープロットを描画する RIdeogram](https://kazumaxneo.hatenablog.com/entry/2021/02/01/073000)
[Genome wide study Part 14 | How to do Synteny analysis between two Species genome using TBTool](https://www.youtube.com/watch?v=8SRPF08OP1s)
[Synteny Analysis in TBTOOLS](https://www.youtube.com/watch?v=v-t0z0UrHqQ)