1. Définition et domaine d'application.
   La teneur en vitamine C (acides L-ascorbique et déhydroL-ascorbique) dans les produits diététiques et de régime est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.
   2. Principe.
   Oxydation de l'acide L-ascorbique en acide déhydro L-ascorbique par le charbon actif (Norite). Réaction de l'acide déhydroL-ascorbique formé avec l'orthophénylènediamine et formation d'un composé fluorescent ayant un maximum d'excitation à 350 nm et un maximum d'émission à 425 nm. L'intensité d'émission de fluorescence est proportionnelle à la concentration en vitamine C de l'échantillon.
   Elimination de la fluorescence parasite de l'échantillon :

 addition d'acide borique à un échantillon dit témoin (l'acide déhydroL-ascorbique est complexé par l'acide borique et ne réagit plus avec l'orthophénylènediamine). Soustraire l'intensité de fluorescence de l'échantillon témoin, de celle de l'échantillon à analyser.
   3. Réactifs.
   Les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique.
   L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
   3.1. Acide métaphosphorique.
   3.2. Acide acétique cristallisable.
   3.3. Acide sulfurique 0,15 M.
   3.4. Charbon actif.
   Peser 200 g de charbon actif (Norite). Ajouter un litre d'acide chlorhydrique (r20 = 1,19) dilué au dixième. Porter à l'ébullition puis filtrer sur verre fritté (porosité 4) sous pression réduite. Remettre le charbon actif dans un grand bécher, ajouter un litre d'eau, agiter et filtrer à nouveau sur verre fritté. Répéter le lavage et filtrer à nouveau. Sécher le charbon actif à l'étuve durant une nuit à 110-120 °C.
   3.5. Solutions d'extraction.
   3.5.1. Solution acide métaphosphorique - acide acétique.
   Dans un bécher dissoudre en agitant et en chauffant légèrement 30 grammes d'acide métaphosphorique (HPO3)n dans 80 ml d'acide acétique cristallisable et 400 ml d'eau. Laisser refroidir puis transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de un litre et compléter avec de l'eau (cette solution peut se conserver une semaine au réfrigérateur).
   3.5.2. Solution acide métaphosphorique - acide acétique - acide sulfurique.
   Opérer comme en 3.5.1 mais remplacer l'eau par une solution d'acide sulfurique 0,15 M (3.3).
   3.6. Solution d'orthophénylènediamine.
   Peser 20 mg d'orthophénylènediamine, 2HC1. Diluer à 100 ml avec de l'eau (à préparer extemporanément).
   3.7. Solution d'acétate de sodium.
   Dissoudre 500 mg d'acétate de sodium (CH3COONa, 3H20) dans de l'eau et compléter à un litre.
   3.8. Solution complexante d'acide borique et d'acétate de sodium.
   Dissoudre 3 g d'acide borique dans 100 ml de solution d'acétate de sodium (3.7) (à préparer extemporanément).
   3.9. Solution étalon-mère d'acide L-ascorbique (100 mg/100 ml).
   Peser exactement environ 50 mg d'acide L-ascorbique préalablement déshydraté dans un dessiccateur, à l'abri de la lumière. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 50 ml à l'aide de la solution d'extraction (3.5.1) et ajuster à 50 ml (à effectuer immédiatement avant l'utilisation).
   3.10. Solution de bleu de thymol à 0,04 p. 100 (m/m).
   Dissoudre 0,1 g d'indicateur dans 10,75 ml de soude 0,02 M par trituration dans un mortier en agate et diluer avec 250 ml d'eau (zone de virage pH = 1,2 rouge - pH = 2,8 jaune).
   4. Appareillage.
   Matériel courant de laboratoire et notamment :
   4.1. Mixeur - broyeur.
   4.2. Agitateur pour tube à essai.
   4.3. Spectrofluorimètre.
   5. Mode opératoire.
   5.1. Test préliminaire pour apprécier la quantité de substances basiques dans l'échantillon.
   Pour les échantillons liquides, faire une dilution avec un volume double de la solution (3.5.1). Pour les échantillons solides, pulvériser une quantité d'échantillon correspondant à la prise d'essai et ajouter 25 ml de la solution (3.5.1). Faire le test avec l'indicateur coloré (3.10) sur une plaque à godets. Si pH x 1,2, présence appréciable de substances basiques dans l'échantillon et nécessité d'utiliser comme solution d'extraction la solution (3.5.2) et non la solution (3.5.1).
   5.2. Préparation des échantillons pour essai.
   5.2.1. Cas des échantillons solides.
   Broyer l'échantillon et en peser une quantité M grammes contenant de 1 à 8 mg de vitamine C. Ajouter 30 ml de la solution d'extraction (3.5.1) ou (3.5.2) suivant le résultat du test 5.1 et triturer pendant deux à trois minutes. Centrifuger. Récupérer le surnageant et le mettre dans une fiole jaugée de 100 ml. Refaire deux fois cette opération d'extraction. Compléter à 100 ml. Refaire deux fois cette opération d'extraction. Compléter à 100 ml avec la solution (3.5.1). Transférer la solution obtenue dans une fiole conique de 250 ml. Ajouter 2 g de charbon (3.4), agiter vigoureusement. Filtrer. Eliminer les cinq premiers millilitres, puis recueillir le filtrat.
   5.2.2. Cas des échantillons liquides.
   Prélever un échantillon M grammes ou V ml contenant entre 1 et 8 mg de vitamine C. Si l'échantillon contient des quantités appréciables de substances alcalines, ajuster à pH 1,2 avec la solution d'extraction (3.5.2). Compléter à 100 ml avec la solution d'extraction (3.5.1). Transférer la solution obtenue dans une fiole conique de 250 ml. Ajouter 2 g de charbon (3.4), agiter vigoureusement. Filtrer. Eliminer les cinq premiers millilitres, puis recueillir le filtrat.
   5.3. Préparation des étalons.
   Prélever exactement 2, 4, 6 et 8 ml de la solution étalon-mére (3.9), les introduire dans des fioles jaugées de 100 ml. Ajuster avec la solution d'extraction (3.5.1). Transférer les solutions étalons dans des fioles coniques de 250 ml. Ajouter 2 g de charbon (3.4) dans chaque fiole conique, agiter vigoureusement. Filtrer. Eliminer les cinq premiers millilitres puis recueillir les différents filtrats.
   5.4. Détermination fluorométrique.
   5.4.1. Echantillon
   Dans une fiole jaugée de 100 ml contenant 5 ml de la solution d'acétate de sodium (3.7), introduire 5 ml du filtrat obtenu en 5.2.1 ou 5.2.2 et ajuster au trait de jauge avec de l'eau.
   5.4.2. Echantillon témoin.
   Dans une fiole jaugée de 100 ml contenant 5 ml de la solution complexante acide borique-acétate de sodium (3.8), introduire 5 ml du filtrat obtenu en 5.2.1 ou 5.2.2. Laisser en contact pendant quinze minutes puis ajuster au trait de jauge avec de l'eau.
   5.4.3. Etalons.
   Opérer comme en 5.4.1 en utilisant 5 ml des différents filtrats (5.3).
   5.4.4. Etalons témoins.
   Opérer comme en 5.4.2 en utilisant 5 ml des différents filtrats (5.3).
   5.4.5. Dosage.
   Dans une série de tubes à essai, introduire 2 ml des diverses solutions obtenues en 5.4.1, 5.4.2, 5.4.3 et 5.4.4 (faire trois mesures par solution). En se plaçant à l'abri de la lumière, ajouter dans chaque tube 5 ml de la solution d'orthophénylènediamine (3.6). Bien mélanger à l'aide d'un agitateur pour tube à essai. Laisser la réaction se développer trente-cinq minutes à l'obscurité. Puis faire les mesures au spectrofluorimètre (les longueurs d'onde d'excitation et d'émission optimales peuvent dépendre de l'appareil utilisé et doivent être déterminées préalablement).
   5.4.6. Courbe d'étalonnage.
   Placer en abscisse les concentrations en vitamine C (exprimées en mg/100 ml) des solutions étalons et en ordonnée les valeurs moyennes correspondantes de l'intensité de fluorescence (chaque valeur est obtenue en soustrayant de l'intensité de fluorescence de la solution étalon, celle de la solution étalon témoin de même concentration).
   Obtention d'une droite d'étalonnage tant que la concentration en vitamine C ne dépasse pas 8 mg/100 ml.
   6. Expression des résultats.
   6.1. Mode de calcul et formules.
   Porter en ordonnée la valeur moyenne corrigée de l'intensité de fluorescence de solution échantillon. La valeur lue en abscisse (x) représente la quantité de vitamine C dans 100 ml du filtrat obtenu en 5.2.1 ou 5.2.2.
   La teneur en vitamine C de l'échantillon est donnée par les relations suivantes :
   échantillon liquide ou solide (mg/100 g) : (x/M) 100
   échantillon liquide (mg/100 ml) : (x/V) 100
   6.2. Répétabilité.
   La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou successivement par le même analyste ne doit pas excéder 1 mg/100 g (ou 100 ml) lorsque la teneur en vitamine C de l'échantillon analysé est comprise entre 10 et 100 mg/100 g (ou 100 ml).