4. Milieux de culture, diluants et réactifs. 
4. 1. Composants de base. 
Pour améliorer la reproductibilité des résultats il est recommandé d'utiliser pour la préparation des milieux de culture des composants de base déshydratés ou des milieux complets déshydratés. 
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déminéralisée exempte de substances pouvant inhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de l'essai. 
La mesure de pH doit être effectuée au pH-mètre à 25 degrés C ou après correction de la température. 
Si les milieux et le diluant ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent être conservés à l'obscurité entre 0 et + 5 degrés C dans des conditions évitant toute modification de leur composition pendant un mois au maximum ou en respectant les prescriptions indiquées. 
4. 2. Méthode d'acidification. 
4. 2. 1. Lait écrémé reconstitué. 
Composition : 
Lait en poudre écrémé séché par atomisation (" spray ") exempt d'antibiotiques ou autres substances inhibitrices : 100 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre la poudre de lait dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Répartir à raison de 12 ml dans des tubes de 18 x 180 mm (5. 13) avec bouchon à vis. 
Stériliser à l'autoclave à 115 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 2. Solution d'extrait de levure. 
Composition : 
Extrait de levure déshydraté : 10 g
 Eau : 100 ml
 Préparation : 
Dissoudre l'extrait de levure dans l'eau. 
Répartir à raison de 50 ml dans des flacons (5. 8.). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 3. Solution de pourpre de bromocrésol. 
Composition : 
Pourpre de bromocrésol : 250 mg
 Eau : 100 ml
 Préparation : 
Dissoudre le pourpre de bromocrésol dans l'eau. 
Répartir à raison de 50 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 4. Solution de triméthoprime. 
Composition : 
Triméthoprime : 100 mg
 Acide acétique, solution à 5  % v / v : 10 ml
 Eau q. s. p. : 1000 ml
 Préparation : 
Introduire le triméthoprime dans une fiole jaugée de 1000 ml (5. 12), faire dissoudre dans l'acide acétique, compléter avec de l'eau. 
Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le triméthoprime est disponible au Laboratoire central d'hygiène alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris. 
4. 3. Méthodes de confirmation. 
4. 3. 1. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus stearothermophilus. 
4. 3. 1. 1. Bouillon nutritif. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 20 g
 Extrait de levure déshydraté : 10 g
 Glucose : 0, 5 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 15 ml dans des tubes de 18 x 180 mm (5. 13). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, répartir aseptiquement le bouillon à raison de 10 ml par fiole (5. 11) stérile. 
4. 3. 1. 2. Milieu pour les cultures de réserve. 
Composition : 
Preptone pepsique de viande : 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 2 g
 Extrait de viande déshydraté : 1 g
 Chlorure de sodium : 5 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 4 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 10 ml dans des tubes de 16 x 160 mm (5. 13). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir en position inclinée de façon à obtenir une pente d'environ 10 cm. 
4. 3. 1. 3. Milieu pour l'épreuve de diffusion. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 2, 5 g
 Glucose : 1 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1 000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
4. 3. 2. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus subtilis. 
4. 3. 2. 1. Gélose n° 11 de Grove et Randall. 
Composition : 
Peptone pepsique de viande : 6 g
 Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 4 g
 Extrait de levure déshydraté : 3 g
 Extrait de viande déshydraté : 1, 5 g
 Glucose : 1 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH, de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 9 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
4. 3. 3. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus megaterium. 
4. 3. 3. 1. Solution tampon. 
Composition : 
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2 PO4) : 34 g
 Eau : 500 ml
 Préparation : 
Introduire le dihydrogénophosphate de potassium dans une fiole jaugée de 1000 ml (5. 12) et faire dissoudre dans l'eau. 
Ajuster le pH à 7, 2 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 1 Mol / litre compléter à 1 litre avec de l'eau. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, introduire 1, 25 ml de ce tampon dans un flacon (5. 9) stérile et diluer avec de l'eau stérile afin d'obtenir 1 litre de solution tampon diluée. 
4. 3. 3. 2. Diluant, solution tryptone-sel. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 1 g
 Chlorure de sodium : 8, 5 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans les flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, distribuer aseptiquement le diluant à raison de 9 ml dans des tubes de 20 x 200 mm (5. 13) stériles. 
4. 3. 3. 3. Milieu de Mueller-Hinton. 
Utiliser le milieu déshydraté Difco 0252 ou tout autre milieu donnant des résultats identiques. 
Composition : 
Hydrolysat de caséine : 17, 5 g
 Macération de viande de boeuf : 300 g
 Amidon : 1, 5 g
 Agar-agar en poudre : 17 g
 Eau q. s. p. : 1000 g
 Préparation : 
Dissoudre le milieu complet déshydraté dans l'eau en suivant les prescriptions du fabricant. 
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 4 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Réparti à raison de 10 ml dans des tubes de 16 x 160 mm (5. 13) et de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir les tubes en position inclinée de façon à obtenir une pente d'environ 10 cm. 
4. 3. 3. 4. Milieu à 0, 01 micron de ml de triméthoprime, pour l'épreuve de diffusion. 
Avant de répartir le milieu 4. 3. 3. 3 ajouter par litre : 
1 ml de la solution de triméthoprime (4. 2. 4) diluée au 1 / 10 au moment de l'emploi. 
Mélanger soigneusement. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Conserver au réfrigérateur 0 à + 5 degrés C pendant un mois au maximum. 
4. 3. 3. 5. Milieu de sporulation. 
Composition : 
Peptone pepsique de viande : 3 g
 Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 2, 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 4 g
 Extrait de viande déshydraté : 2, 5 g
 Monohydrogenophosphate de potassium (K2HPO4) : 2 g
 Sulfate de manganèse (MnSO4H2O) : 10 mg
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 8, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 250 ml dans des fioles de Roux (5. 10). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir les fioles (5. 10) en position horizontale.