PRINCIPE 

    La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est exécutée après oxydation préalable à l'eau de brome par la méthode électrométrique de Michel.

    La technique consiste à mesurer l'abaissement de pH produit par la libération d'acide acétique. 

                            MATERIEL 

    Tubes à essai, diamètre extérieur 2 cm, hauteur 11 cm. 

    pH mètre (de préférence à bande étalée). 

    Commutateur multiple à main pour mesures alternées de pH. 

    Quatre électrodes de verre combinées. 

    Bain-marie avec thermostat à 25° C. 

                          REACTIFS NECESSAIRES 

    a) Eau de brome : diluez extemporanément 0,2 ml d'eau de brome saturée dans 50 ml d'eau distillée. 

    b) Tampon de Michel : 

       Barbital sodique ...                  1,237 g. 

       Phosphate monopotassique ...          0,136 g. 

       Chlorure de sodium ...               17,535 g. 

       Eau distillée ...                       900 ml. 

    Ajustez à pH 8 avec 11,6 ml d'HCl 0,1 N et complétez à 1000 ml  avec de l'eau distillée. 

    c) Sérum de poulain filtré sans antibiotique. Ampoule de 10 ml. Institut Pasteur. 

       Sérum de poulain ...                      1 ml. 

       Tampon de Michel ...                      9 ml. 

       Eau distillée ...                        11 ml. 

    e) Solution de chlorhydrate d'acétylcholine : solution extemporanée à 1 p 100 (0,25 g dans 25 ml d'eau distillée). 

    f) Solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100. 

                          MODE OPERATOIRE 

                             Extraction 

    Suivre la technique indiquée dans la méthode colorimétrique (3 A).

                        DOSAGE POTENTIOMETRIQUE 

    Prenez quatre tubes de 25 ml environ pouvant recevoir chacun une électrode combinée (calomel - verre), introduisez dans les numéros 2, 3 et 4 les volumes désirés d'extrait à analyser représentant 1 et (ou) 2 g d'échantillons, ajoutez 0,1 ml de solution f, évaporez presque à sec ces extraits à basse température et introduisez successivement dans tous les tubes les divers réactifs indiqués sur le tableau suivant : 
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 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Eau de brome     :             :
 : diluée ..        :    0,2 ml   :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Eau de brome     :             :
 : diluée ..        :    0,2 ml   :
 :                  :             :
 :================================:
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 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Eau de brome     :             :
 : diluée ..        :    0,2 ml   :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Eau de brome     :             :
 : diluée ..        :    0,2 ml   :
 :                  :             :
 :================================:

                           Repos trois minutes.

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 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Solution         :             :
 : tampon ..        :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Solution         :             :
 : tampon ..        :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Solution         :             :
 : tampon ..        :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
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 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Solution         :             :
 : tampon ..        :    2   ml   :
 :                  :             :
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                               Agitez.

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 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Sérum            :             :
 : tamponné ..      :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
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 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Sérum            :             :
 : tamponné ..      :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
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 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Sérum            :             :
 : tamponné ..      :    2   ml   :
 :                  :             :
 :================================:
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 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Sérum            :             :
 : tamponné ..      :    2   ml   :
 :                  :             :
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    Agitez et disposez au bain-marie à 25° les quatre tubes dans          lesquels sont plongés les électrodes combinées.
              Après trois minutes, vérifiez que le pH                       est voisin de 8. 
                Laissez incuber trente minutes à 25°                   (sans retirer les électrodes). 
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 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :   pHOto     :
 : Ajoutez 1 ml     :             :
 : de solution      :             :
 : d'acétylcholine  :    1 ml     :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :    pH01     :
 : Ajoutez 1 ml     :             :
 : de solution      :             :
 : d'acétylcholine  :     1 ml    :
 :                  :             :
 :================================:
:================================:
 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :    pH02     :
 : Ajoutez 1 ml     :             :
 : de solution      :             :
 : d'acétylcholine  :     1 ml    :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :    pH03     :
 : Ajoutez 1 ml     :             :
 : de solution      :             :
 : d'acétylcholine  :     1 ml    :
 :                  :             :
 :================================:

          Laissez hydrolyser trente minutes à 25° C (sans retirer                          les électrodes).

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 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :   pHfto     :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :   pHf1      :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :   pHf2      :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :                  :-------------:
 : Prenez le pH     :             :
 : après ces trente :             :
 : minutes ..       :   pHf3      :
 :================================:
 :================================:
 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :             :------------------:
 : Abaissement :       DTo =      :
 : du pH ..    : (pH0to - pHfto)  :
 :             :                  :
 :================================:

 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :             :------------------:
 : Abaissement :       D1 =       :
 : du pH ..    :  (pH01 - pHf1)   :
 :             :                  :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :             :------------------:
 : Abaissement :       D2 =       :
 : du pH ..    :  (pH02 - pHf2)   :
 :             :                  :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :             :------------------:
 : Abaissement :       D3 =       :
 : du pH ..    :  (pH03 - pHf3)   :
 :             :                  :
 :================================:
 :================================:
 :                  :     To      :
 :                  : Témoin zéro :
 :                  :-------------:
 : Pourcentage      :             :
 : d'inhibition ..  :    0 p. 100 :
 :                  :             :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      1      :
 :                  :   Extrait   :
 :              :-----------------:
 : Pourcentage  :    DT0 - D1     :
 : d'inhibition :    --------     :
 :              :    0,01xDT0     :
 :              :                 :
 :================================:

 :================================:
 :                  :      2      :
 :                  :   Extrait   :
 :              :-----------------:
 : Pourcentage  :    DT0 - D2     :
 : d'inhibition :    --------     :
 :              :    0,01xDT0     :
 :              :                 :
 :================================:
 :================================:
 :                  :      3      :
 :                  :   Extrait   :
 :              :-----------------:
 : Pourcentage  :    DT0 - D3     :
 : d'inhibition :    --------     :
 :              :    0,01xDT0     :
 :              :                 :
 :================================:

     NOTA - En raison de l'activité variable et inconnue des échantillons de sérum utilisés, il est conseillé de vérifier cette activité avant l'analyse des extraits. A cet effet, une mesure témoin sera effectuée au préalable, le sérum ne devant être considéré comme valable que si la valeur de l'abaissement du pH est supérieure à 0,8 unité de pH.                           RESULTATS 

    La sensibilité de cette technique est supérieure à celle de la méthode colorimétrique. En raison des variations d'activité des produits techniques étalons, les doses inhibitrices suivantes pour le malathion et le parathion sont données à titre indicatif seulement.

    1° Inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100. 

    Les résultats obtenus indiquent que les prises d'essai renferment généralement moins de 0,05 micron de gramme d'insecticide organo-phosphoré. 

    Nous avons noté par exemple qu'une inhibition de 5 p. 100 était obtenue avec : 0,03 micron de gramme de malathion. 

    0,01 micron de gramme de parathion produisent une inhibition de 10 p. 100. 

    2° Inhibition de 50 p. 100. 

    L'inhibition de 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,16 micron de gramme de malathion et 0,08 micron de gramme de parathion. 

    3° Inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100. 

    Cette inhibition est constatée respectivement pour : 0,59 micron de gramme de malathion et 0,60 micron de gramme de parathion. 

    La définition de la dose réelle demande toujours une identification parallèle du produit actif. 

    NOTA - Technique sans oxydation préalable à l'eau de brome. 

    La suppression de l'étape d'oxydation à l'eau de brome rend la technique beaucoup moins sensible. A titre d'exemple, pour le parathion et le malathion, les sensibilités sont réduites aux valeurs suivantes : 

    1° L'inhibition voisine de 5 p. 100 est donnée par : 80 microns de grammes de malathion ou 0,85 micron de gramme de parathion. 

    2° L'inhibition de 50 p. 100 est donnée par : 400 microns de grammes de malathion ou 8 microns de grammes de parathion. 

    3° L'inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100 est donnée par :

 1,400 microns de grammes de malathion ou 45 microns de grammes de parathion.