V - Détermination de l'activité phosphatasique.
   A - Méthode de référence.
   1. Définition.
   L'activité phosphatasique d'une crème est la propriété que possède la phosphatase alcaline contenue dans cette crème d'hydrolyser les esters phosphoriques en milieu nettement alcalin.
   2. Principe.
   Toute crème correctement pasteurisée ne doit pas posséder d'activité phosphatasique. Cette dernière est évaluée grâce à la détermination colorimétrique du phénol libéré par l'hydrolyse enzymatique du phénylphosphate disodique.
   3. Réactifs.
   Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
   Il convient d'éviter particulièrement l'introduction de traces de salive lors de la préparation des réactifs et de la poursuite du mode opératoire.
   3.1. Solution-tampon.
   Dissoudre 25 grammes d'hydroxyde de baryum, Ba(OH)2, 8H20, dans l'eau et compléter à 500 ml.
   Dissoudre 11 grammes d'acide borique, H3B03, dans l'eau et compléter à 500 ml.
   Amener chaque solution à environ 50° C puis les mélanger.
   Agiter et refroidir rapidement jusqu'à température ambiante.
   Le pH de cette solution doit être de 10,6 + ou - 0,1. Filtrer.
   Conserver le filtrat dans un récipient bouché hermétiquement.
   3.2. Solution pour le développement de la couleur.
   Dissoudre 6 grammes de métaborate de sodium, NaB02, ou 12,6 grammes de NaB02, 4H20 et 20 grammes de chlorure de sodium, Nacl, dans de l'eau et compléter à 1000 ml.
   3.3. Substrats tamponnés.
   3.3.1. Substrat à 50 p. 100.
   Dissoudre 0,1 gramme de phénylphosphate disodique, Na2C6H5P04, 2H20, dépourvu de phénol libre dans 50 ml de tampon (3.1) et 50 ml d'eau.
   3.3.2. Substrat à 80 p. 100.
   Dissoudre 0,1 gramme de phénylphosphate disodique, Na2C6H5P04, 2H20, dépourvu de phénol libre dans 80 ml de tampon (3.1) et 20 ml d'eau.
   3.4. Défécants :
   3.4.1. Défécant pour crème peu acide.
   Dissoudre dans l'eau 3 grammes de sulfate de zinc, ZnS04, 7H20, et 0,6 gramme de sulfate de cuivre, CUS04, 5H20, compléter à 100 ml.
   3.4.2. Défécant pour crème acide ou maturée.
   Dissoudre dans l'eau 4,5 grammes de sulfate de zinc, ZnS04, 7H20, compléter à 100 ml.
   3.5. Réactifs de Gibbs.
   Dissoudre 40 mg de dibromoquinone chloro-imine 0C6H2Br2NCl dans 10 ml d'éthanol à 96 p. 100. Conserver au réfrigérateur dans un facon de verre coloré bien bouché. Cette solution n'est plus utilisable dès qu'elle commence à brunir.
   3.6. Solutions-étalon de phénol.
   Peser 200 mg de phénol, les dissoudre dans de l'eau et transférer quantitativement dans un ballon jaugé de 100 ml. Compléter avec de l'eau. Mélanger. Cette solution reste stable plusieurs mois au réfrigérateur. Préparer une solution au 1/100 (1 ml de cette solution renferme 20 micron de gramme de phénol). A partir de cette dernière solution, préparer des solutions-étalon contenant respectivement 2, 5, 10 et 20 micron de gramme de phénol par millilitre.
   3.7. Solution cuivrique.
   Dissoudre 0,05 gramme de sulfate de cuivre, CUS04, 5H20 dans l'eau.
   Compléter à 100 ml.
   3.8. Solution 3.2. diluée.
   Amener 10 ml de la solution (3.2) à 100 ml avec de l'eau.
   4. Appareillage.
   Toute la verrerie, les bouchons et le matériel d'échantillonnage doivent être soigneusement nettoyés et rincés.
   Matériel courant de laboratoire, et notamment :
   4.1. Tubes à essai 18 x 180 mm.
   4.2. Baguettes de verre d'environ 8 x 200 mm.
   4.3. Papier-filtre, diamètre 9 cm, Whatman n° 42 ou équivalent.
   4.4. Bain d'eau à 37 + ou - 1° C.
   4.5. Bain d'eau bouillante.
   4.6. Spectromètre permettant la lecture à une longueur d'onde de 610 mm.
   5. Mode opératoire.
   Eviter l'action directe de la lumière au cours des opérations suivantes :
   5.1. Prise d'essai.
   Peser dans un tube (4.1), à 10 mg près, environ 1 g d'échantillon pour essai. De la même façon, préparer un autre tube à usage de témoin.
   5.2. Inactivation de l'essai témoin.
   Placer le tube à usage de témoin pendant deux minutes dans le bain d'eau bouillante (4.5) de façon que le tube soit immergé sur le maximum de hauteur. Refroidir rapidement le tube jusqu'à température ambiante.
   5.3. Hydrolyse.
   Ajouter à chacun des deux tubes 10 ml de solution (3.3.1.) dans le cas d'une crème peu acide, ou 10 ml de solution (3.3.2) dans le cas d'une crème acide ou maturée.
   Mélanger à l'aide de la baguette (4.2).
   Porter immédiatement les deux tubes dans le bain d'eau (4.4). Les laisser pendant une heure en agitant de temps à autre.
   Porter ensuite les deux tubes dans le bain d'eau bouillante (4.5) pendant deux minutes, puis refroidir rapidement jusqu'à température ambiante.
   5.4. Développement de la couleur.
   Ajouter 1 ml de défécant (3.4.1) dans le cas d'une crème peu acide, ou 1 ml de défécant (3.4.2.) dans le cas d'une crème acide ou maturée.
   Mélanger soigneusement à l'aide d'une baguette (4.2.).
   Filtrer sur papier filtre sec (4.3), plusieurs fois si nécessaire, jusqu'à ce que le filtrat soit limpide, en recueillant 5 ml dans un tube (4.1.).
   Ajouter 5 ml de la solution (3.2).
   Ajouter 0,1 ml de réactif de Gibbs (3.5), mélanger et laisser la coloration se développer pendant trente minutes à la température ambiante.
   Mesurer à 610 nm l'absorbance de la solution par rapport à l'essai témoin. Si l'absorbance est supérieure à celle correspondant à 20 micron de gramme de phénol, recommencer l'essai avec une dilution appropriée du filtrat.
   5.5. Etablissement de la courbe d'étalonnage.
   Préparer un tube avec 1 ml d'eau et quatre tubes avec 1 ml de chacune des solutions-étalon (3.6) de manière à obtenir une gamme correspondant à 0, 2, 5, 10 et 20 micron de gramme de phénol par tube.
   Ajouter dans chaque tube 1 ml de solution cuivrique (3.7), 5 ml de solution diluée (3.8), 3 ml d'eau et 0,1 ml de réactif de Gibbs (3.5).
   Agiter.
   Laisser la coloration se développer pendant trente minutes à température ambiante.
   Mesurer à 610 nm l'absorbance des solutions-étalon par rapport au tube (0 micron de gramme de phénol) et tracer la courbe d'étalonnage.
   6. Expression des résultats
   6.1. Mode de calcul et formule.
   Convertir l'absorbance obtenue en (5.4) en micron de gramme de phénol en se référant à la courbe d'étalonnage (5.5.).
   Calculer l'activité phosphatasique, exprimée en micron de gramme de phénol par gramme, à l'aide de la formule suivante :
   Activité phosphatasique = 2,4.A.D/C.
   où :
   A est la quantité de phénol en micron de gramme lue sur la courbe (5.5) ;
   D est le facteur de dilution éventuel (5.4) ;
   C est la masse en grammes de la prise d'essai (5.1),
   6.2. Répétabilité.
   La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou successivement par le même analyste ne doit pas excéder 2.