7. Isolement du C. m. subsp. sepedonicus.
   Le diagnostic ne peut être confirmé que par l'isolement et l'identification (point 8) du C. m. subsp. sepedonicus. Bien qu'il s'agisse d'un organisme difficile à isoler, il est possible de le faire à partir de tissu présentant des symptômes d'infection. Toutefois, des bactéries saprophytes à croissance rapide peuvent l'étouffer et, dès lors, il n'est pas recommandé de l'isoler directement à partir de l'extrait concentré de tissu tuberculaire (obtenu au point 3.3). Les aubergines représentent un excellent milieu sélectif de multiplication pour la culture de C. m. subsp. sepedonicus et permettent donc de réaliser un excellent test de confirmation sur hôte.
   Les isolements doivent être pratiqués sur tous les tubercules de pommes de terre et toutes les aubergines présentant des symptômes (points 4 et 6). Le cas échéant, les tiges d'aubergines doivent être broyées selon la méthode décrite aux points 3 et 6.9.
   7.1. Purifier par un nouvel ensemencement en stries avec les suspensions un des milieux suivants (les formules figurent à l'appendice 6) :
   - gélose nutritive avec dextrose (uniquement pour les repiquages) ;
   - gélose avec levure, peptone et glucose ;
   - gélose nutritive avec levure et dextrose ;
   - gélose avec extraits de levure et sels minéraux.
   Laisser incuber jusqu'à 20 jours à 21 °C.
   Le C. m. subsp. sepedonicus a une croissance lente et produit généralement en dix jours des colonies de la taille et de la forme d'une tête d'épingle, de couleur crème, et convexes.
   Ensemencer à nouveau en stries pour obtenir des cultures pures.    Les taux de croissance sont meilleurs pour les repiquages. Les colonies typiques sont de couleur blanc crème ou ivoire, arrondies, lisses, dressées, présentant un dôme convexe, de consistance muqueuse à fluide, avec des bords nets ou réguliers et d'un diamètre généralement de 1 à 3 millimètres.
   Identification.
   Beaucoup de bactéries coryneformes Gram positives dont les colonies présentent des caractéristiques similaires à celle de C. m. subsp. sepedonicus peuvent être isolées à partir de pommes de terre ou d'aubergines saines ou malades. Dans ce contexte, il est possible d'identifier C. m. subsp. sepedonicus à l'aide des tests suivants :
   - test d'immunofluorescence (point 5.1) ;
   - test sur aubergines ;
   - tests nutritionnels et physiologiques (appendice 7) :
    - test d'oxydation/fermentation (O/F) ;
    - test de l'oxydase ;
    - croissance à 37 °C ;
    - production d'uréase ;
    - hydrolyse de l'esculine ;
    - hydrolyse de l'amidon ;
    - tolérance d'une solution de chlorure de sodium à 7 p. 100 ;
    - test de l'indole ;
    - test de la catalase ;
    - production de H2S ;
    - utilisation du citrate ;
    - hydrolyse de la gélatine ;
    - production d'acide à partir de glycérol, de lactose, de rhamnose et de salicinoside ;
    - coloration de Gram.
   Il faut inclure dans chaque test une souche connue de C. m. subsp. sepedonicus à titre de témoin. Les tests nutritionnels et physiologiques doivent être effectués sur de l'inoculat provenant de repiquages sur gélose nutritive. Les comparaisons morphologiques doivent se faire à partir de cultures sur gélose nutritive avec dextrose.
   Pour le test d'immunofluorescence, les populations de cellules doivent être ajustées à 106 cellules/millilitre. Le titre d'immunofluorescence doit être similaire à celui de la culture connue de C. m. subsp. sepedonicus.
   Pour le test sur aubergines, les populations de cellules doivent être amenées à environ 107 cellules/millilitre. Ces tests doivent se faire sur dix plantes pour chacun des organismes à tester ; on utilisera également ici une culture connue de C. m. subsp. sepedonicus et de l'eau stérile à titre de témoins. Avec des cultures pures, un flétrissement typique devrait apparaître dans les vingt jours, mais les plantes ne présentant pas de symptômes à l'issue de cette période devraient continuer à incuber pendant un total de trente jours à des températures favorables à la croissance des aubergines mais ne dépassant pas 30 °C (appendice 5). Si des symptômes ne sont pas apparus après trente jours, on ne peut pas confirmer qu'il s'agisse d'une culture d'une forme pathogène de C. m. subsp. sepedonicus.
   Test et C. m. subsp. sepedonicus :
   Test d'oxydation/fermentation (O/F) : inerte ou faiblement oxydant.
   Test de l'oxydase : - 
   Test de la catalase : + 
   Réduction des nitrates : - 
   Activité uréasique : - 
   Production de H2S : - 
   Production d'indole : - 
   Utilisation du citrate : - 
   Hydrolyse de l'amidon : - ou faible 
   Croissance à 37 °C : - 
   Croissance dans du NaCl à 7 p. 100 : - 
   Hydrolyse de la gélatine : - 
   Hydrolyse de l'esculine : + 
   Acide à partir de :
   - glycérol : - 
   - lactose : - ou faible 
   - rhamnose : - 
   - salicinoside : - 
   Appendice 1 : Formule du liquide d'homogénéisation recommandé par Lelliott et Sellar, 1976.
   Composé DC silicone antimousse MS A (Hopkins et Williams Ltd, Cat n° 9964-25, Chadwell Heath, Essex, Angleterre) : 10 ml.
   Flocons de Lubrol W (ICI Ltd) : 0,5 g.
   Pyrophosphate tétrasodique : 1 g.
   Tampon au phosphate 0,05 M de pH 7,0 (appendice 2) : 1 l.
   Appendice 2 : Tampons.
   Tampon au phosphate 0,05 M à pH 7,0 :
   Ce tampon peut être utilisé pour l'homogénéisation de tissu tuberculaire (point 2.1).
   Na2HPO4 : 4,26 g.
   KH2PO4 : 2,72 g.
   NaCl : 8,0 g.
   Eau distillée jusqu'à 1 l.
   Tampon au phosphate 0,01 M à pH 7,2 :
   Ce tampon est utilisé pour diluer les antisérums et laver les lames des tests d'immunofluorescence.
   Na2HPO4 12 H2O : 2,7 g.
   NaH2PO4 2 H2O : 0,4 g.
   NaCl : 8,0 g.
   Eau distillée jusqu'à 1 l.
   Solution de glycérine tamponnée au phosphate 0,1 M à pH 7,6 :
   Ce tampon est utilisé comme support pour renforcer la fluorescence dans le test d'immunofluorescence.
   Na2HPO4 12 H2O : 3,2 g.
   NaH2PO4 2 H2O : 0,15 g.
   Glycérol : 50 ml.
   Eau distillée : 100 ml.
   Appendice 3 : Procédure pour la réaction de Gram (modification de Hucker) (Doetsch, 1981).
   Solution de violet cristallisé :
   Dissoudre 2 g de violet cristallisé dans 20 ml d'éthanol à 95 %.    Dissoudre 0,8 g d'oxalate d'ammonium dans 80 ml d'eau distillée.    Mélanger les deux solutions.
   Soluté iodo-ioduré de Lugol :
   Iode : 1 g.
   Iodure de potassium : 2 g.
   Eau distillée : 300 ml.
   Broyer les solides ensemble à l'aide d'un pilon et d'un mortier. Ajouter à l'eau et mélanger dans un récipient fermé pour dissoudre.    Solution colorante de safranine :
   Solution mère.
   Safranine 0 : 2,5 g.
   Ethanol 95 % : 100 ml.
   Mélanger et stocker.
   Diluer à 1:10 pour obtenir une solution de travail.
   Procédure de coloration :
   1. Préparer les frottis, les sécher à l'air et les fixer à la chaleur.
   2. Plonger la lame dans la solution de cristal violet pendant 1 minute.
   3. Laver rapidement à l'eau courante.
   4. Plonger dans le soluté iodo-ioduré de Lugol pendant 1 minute.    5. Laver à l'eau courante et sécher au buvard.
   6. Décolorer en ajoutant goutte à goutte de l'éthanol à 95 % jusqu'à ce qu'il ne modifie plus la couleur ou en plongeant dans l'éthanol pendant 30 secondes tout en agitant légèrement.
   7. Laver à l'eau courante et sécher au buvard.
   8. Plonger dans la solution de safranine pendant 10 secondes.
   9. Laver à l'eau courante et sécher au buvard.
   Les bactéries Gram positives ont une couleur violet-bleu ; les bactéries Gram négatives ont une couleur rose-rouge.
   Appendice 4 : Détermination de la population de cellules positives au test d'immunofluorescence.
   Superficie (S) d'un puits d'une lame multipuits :
   = pi D2 / 4
   où D = diamètre du puits.
   Superficie(s) du champ de l'objectif :
   = pi d2 / 4
   où d = diamètre du champ.
   Calculer le diamètre du champ (d) par mesure directe ou en appliquant les formules suivantes :
   s = pi i2 / G2 K2 x 4
   où i = coefficient du champ (dépend du type d'oculaire et varie de 8 à 24),
   où K = coefficient du tube (1 ou 1,25),
   où G = grossissement (100 fois, 40 fois, etc.) de l'objectif.
   De (2), on tire : d = racine de 4s / pi
   De (3), on tire : d = racine de 4 x pi i2 / G2 K2 x 4 / pi = i / G K
   Compter le nombre de cellules fluorescentes typiques par champ (c).
   Calculer le nombre de cellules fluorescentes typiques par puits (C).
   C = cS / s
   Calculer le nombre de cellules fluorescentes typiques par millilitre d'extrait concentré (N) :
   N = C x 1 000 / y x F
   où y = volume d'extrait concentré sur le puits,
   où F = facteur de dilution de l'extrait concentré.
   Appendice 5 : Culture des aubergines.
   Semer des graines d'aubergines (Solanum melongena cv. Black Beauty) dans une terre de semis pasteurisée. Repiquer les plantules dans de la terre de rempotage pasteurisée lorsque les cotylédons sont entièrement développés (10 à 14 jours).
   Utiliser des aubergines au stade 3 feuilles lorsque au moins 2, mais pas plus de 3 feuilles sont entièrement ouvertes (étalées).
   Les aubergines doivent être cultivées en serre dans les conditions suivantes :
   - longueur du jour : 14 heures ou durée naturelle de la journée si elle est supérieure ;
   - température diurne : 21 à 24 °C ;
   - température nocturne : 15 °C.
   Nota - Le C. m. subsp. sepedonicus ne se développera pas à des températures supérieures à 30 °C. Si la température nocturne ne descend pas à 15 °C, des nécroses argentées peuvent survenir.
   L'application d'un insecticide approprié permet de prévenir les dégâts aux racines causés par les larves de sciarides.
   Les aubergines de la variété Black Beauty peuvent être commandées auprès de :
   1. AB Hammenhögs Frö, 270 50 Hammenhög (Suède).
   2. Hurst Seeds Ltd, Avenue Road, Witham, Essex CM8 2DX (Angleterre).
   3. Asgro Italia SpA, Corso Lodi 23, Milan.
   4. Küpper, Mitteldeutsche Samen GmbH, Hessenring 22, D-37269 Eschwege.
   Appendice 6 : Milieux à utiliser pour la croissance et l'isolement de clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
   Gélose nutritive :
   La gélose nutritive de Difco Bacto dans de l'eau distillée à la concentration indiquée par le fabricant. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
   Gélose nutritive avec dextrose :
   La gélose nutritive de Difco Bacto contenant 1 % d-glucose (monohydraté). Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 20 minutes.    Gélose avec levure, peptone et glucose :
   Extrait de levure de Difco Bacto (n° 0127) : 5 g.
   Peptone de Difco Bacto (n° 0118) : 5 g.
   D-glucose (monohydraté) : 10 g.
   Gélose purifiée de Difco Bacto (n° 0560) : 15 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Stériliser par demi-litre à l'autoclave à 115 °C pendant 20 minutes.
   Milieu de culture avec extrait de levure et sels minéraux :
   Extrait de levure de Difco Bacto : 2,0 g.
   D-glucose (monohydraté) : 2,5 g.
   K2HPO4 : 0,25 g.
   KH2PO4 : 0,25 g.
   MgSO4. 7H2O : 0,1 g.
   MnSO4. H2O : 0,015 g.
   NaCI ; 0,05 g.
   FeSO4. 7H2O : 0,005 g.
   Gélose purifiée de Difco Bacto : 18 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Stériliser par demi-litre à l'autoclave à 115 °C pendant 20 minutes.
   Appendice 7 : Tests nutritionnels et physiologiques d'identification de clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
   Tous les milieux doivent incuber à 21 °C et être examinés après 6 jours. Si on ne décèle aucune croissance, laisser incuber jusqu'à 20 jours.
   Test d'oxydation et de fermentation (O/F) (Hugh et Leifson, 1953).    Milieu de culture :
   KC1 : 0,2 g.
   MgSO4. 7H2O : 0,2 g.
   NH4H2PO4 : 1,0 g.
   Peptone de Difco Bacto : 1,0 g.
   Gélose purifiée de Difco Bacto : 3,0 g.
   D-glucose (monohydraté) : 10,0 g.
   Bleu de bromothymol : 0,03 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Mélanger et ajuster le pH à 7,0-7,2 avec du 1N KOH.
   Répartir dans les tubes à culture en pyrex de 16 mm x 100 mm (d'une capacité de 12 ml), à raison de 5 et 10 ml par tube.
   Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes.
   Inoculer chaque culture par piqûre profonde dans des tubes de 5 et 10 ml. Ajouter aseptiquement 1 à 2 ml de paraffine liquide stérile aux tubes de 10 ml. Laisser incuber.
   Réaction positive (interprétation) :.
   tube ouvert ou fermé : jaune = fermentation.
   tube ouvert ou fermé : jaune ou bleu-vert = oxydation.
   tube ouvert ou fermé : verdâtre ou bleu-vert = oxydation ou inerte.
   Test de l'oxydase (Kovacs, 1956).
   Réactif de Kovacs pour tester de l'oxydase :
   Solution aqueuse à 1 % de dihydrochlorure de tétraméthyle paraphénylènediamine (BDH n° 30386) dans de l'eau distillée.
   Le réactif doit être fraîchement préparé en volumes de 1 ml ou peut être stocké dans une bouteille en verre brun à 5 °C pendant 1 à 4 semaines.
   Dans une boîte de Petri propre, mettre une goutte de réactif sur un papier filtre. A l'aide d'une anse en platine, frotter immédiatement sur celui-ci un peu de culture du test provenant de la gélose nutritive.
   Réaction positive : apparition d'une coloration pourpre dans les 10 secondes. Les cultures pour lesquelles la coloration apparaît dans un délai de 10 à 30 secondes sont considérées comme faiblement positives.
   Nota - Il est essentiel d'utiliser une anse en platine et des cultures faites sur gélose nutritive, car des traces de fer ou des teneurs élevées en sucre dans le milieu de culture peuvent donner des résultats faussement positifs.
   Production d'acide à partir de lactose, de rhamnose, de salicinoside et de glycérol :
   Préparer du milieu de culture pour test d'oxydation et de fermentation de Hugh et Leifson sans glucose. Répartir dans des tubes à raison de 5 ml par tube. Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes. A la base fondue portée à 45 °C, ajouter aseptiquement 0,5 ml de solution aqueuse à 10 % de glycérol, de lactose, de rhamnose ou de salicinoside, stérilisée par filtration. Mélanger soigneusement.
   Réaction positive : la coloration virant du bleu-vert au jaune indique la production d'acide.
   Test de la catalase :
   Placer une goutte de peroxyde d'hydrogène (30 volumes) sur une lame propre et ajouter le contenu d'une anse de platine de la culture, en émulsionnant.
   Réaction positive : la production de bulles d'oxygène dans la goutte témoigne de la présence de catalase.
   Activité de réduction des nitrates et dénitrification (Bradbury, 1970).
   Milieu de culture :
   KNO3 (exempt de nitrites) : 1 g.
   Extrait de levure de Difco Bacto : 1 g.
   K2HPO4 : 5 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Répartir dans des bouteilles d'une capacité de 20 ml, à raison de 10 ml par bouteille. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
   Réactif A :
   H2SO4 : 8 g.
   Acide acétique 5N : 1 l.
   Réactif B :
   Naphtylamine : 5 g.
   Acide acétique 5N : 1 l.
   Inoculer le milieu nitrate en double. Tester après 10 et 20 jours, en ajoutant une goutte de soluté iodo-ioduré de Lugol, 0,5 ml de réactif A et 0,5 ml de réactif B. Si le milieu ne devient pas rougeâtre, ajouter environ 50 mg de poudre de zinc. Observer la couleur.
   Réaction positive (interprétation) :.
   Pas de réaction du nitrate.
   Stade 1 : incolore
   Stade 2 : rouge
   Réduction du nitrate en nitrite (uniquement réductase des nitrates).
   Stade 1 : rouge
   Réduction du nitrate au-delà du stade du nitrite (dénitrification - réductase des nitrates et nitrites).
   Stades 1 et 2 : incolore
   Production d'uréase (Lelliott, 1966).
   Milieu de culture :
   Base de gélose avec urée d'Oxoid (CM53) : 2,4 g.
   Eau distillée : 95 ml.
   Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 20 minutes. Refroidir jusqu'à 50 °C la base fondue et ajouter aseptiquement 5 ml de solution aqueuse d'urée à 40 p. 100 (Oxoid SR20) stérilisée par filtration. Bien mélanger.
   Répartir dans des tubes stériles (16 x 100 mm) à raison de 6 ml par tube et laisser prendre dans les tubes inclinés.
   Réaction positive : le milieu, de couleur jaune orangé, vire au rouge cerise ou au rouge magenta s'il y a eu activité uréasique.
   Utilisation du citrate (Christensen) (Skerman, 1967).
   Base de gélose avec citrate (Merck 2503) : 23 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Mélanger et dissoudre en chauffant. Répartir à raison de 6 ml par tube, comme pour le milieu du test de production d'uréase. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes et laisser prendre les tubes inclinés.
   Réaction positive : l'utilisation du citrate est indiquée par un changement de la couleur du milieu qui de l'orange vire au rouge.
   Production d'hydrogène sulfuré (Pamamurthi, 1959).
   Milieu :
   Tryptone de Difco Bacto (n° 0123) : 10 g.
   K2HPO4 : 1 g.
   NaCl : 5 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Dissoudre et répartir dans des tubes de 16 x 100 mm à raison de 6 ml par tube. Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes.    Inoculer et suspendre aseptiquement un papier à l'acétate de plomb (Merck 9511) au rebord du tube. Le maintenir avec le couvercle. Laisser incuber jusqu'à 20 jours.
   Réaction positive : la production de H2S à partir de tryptone est indiquée par l'apparition sur le papier de test d'une coloration noir-brun.
   Production d'indole (Ramamurthi, 1959).
   Milieu : identique à celui du test de H2S.
   Enlever le papier à l'acétate de plomb, ajouter 1 à 2 ml d'éther éthylique et secouer légèrement. Laisser décanter (5 minutes). Ajouter doucement 0,5 ml de réactif de Kovacs (Merck 9293) à l'intérieur du tube incliné.
   Réaction positive : la présence d'indole est indiquée par l'apparition d'une coloration rouge dans la couche jaune entre la phase éther et la phase aqueuse.
   Croissance à 37 °C (Ramamurthi, 1959).
   Milieu :
   Bouillon de culture de Difco Bacto (n° 0003) : 8 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Mélanger, dissoudre et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube.
   Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
   Inoculer et laisser incuber à 37 °C.
   Réaction positive : croissance.
   Croissance dans du chlorure de sodium à 7 p. 100 (Ramamurthi, 1959).
   Milieu :
   Bouillon de culture de Difco Bacto : 8 g.
   NaCl : 70 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Mélanger, dissoudre et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube.
   Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
   Réaction positive : croissance.
   Hydrolyse de la gélatine (Lelliott, Billing et Hayward, 1966).
   Milieu :
   Gélatine de Difco Bacto (n° 0143) : 120 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Mélanger, dissoudre en chauffant et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube.
   Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
   Réaction positive : liquéfaction de la gélatine même en maintenant la température à 5 °C pendant 30 minutes.
   Hydrolyse de l'amidon.
   Milieu :
   Gélose nutritive de Difco Bacto (fondue) : 1 l.
   Amidon soluble de Difco Bacto (n° 0178) : 2 g.
   Mélanger et stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes.    Verser dans les boîtes. Inoculer les boîtes par tâches.
   Après une croissance suffisante (10 à 20 jours), prélever une partie du produit et le plonger dans du soluté iodo-ioduré de Lugol.    Réaction positive : des zones claires sous ou autour de la croissance bactérienne indiquent qu'il y a eu hydrolyse de l'amidon. Le reste du milieu reste pourpre.
   Hydrolyse de l'esculine (Sneath et Collins, 1974).
   Milieu :
   Peptone de Difco Bacto : 10 g.
   Esculine : 1 g.
   Citrate de fer (Merck 3862) : 0,05 g.
   Citrate de sodium : 1 g.
   Eau distillée : 1 l.
   Dissoudre en mélangeant et répartir dans des tubes à raison de 6 ml par tube.
   Stériliser à l'autoclave à 115 °C pendant 10 minutes.
   Le milieu est clair, avec une fluorescence bleuâtre.
   Réaction positive : l'hydrolyse de l'esculine est révélée par le virage au brun et la disparition de la fluorescence. Pour la contrôler, utiliser une lampe à rayonnement ultraviolet.