PRINCIPE 

    La méthode indiquée permet : 

    D'estimer globalement la présence éventuelle de résidus de pesticides organochlorés par le dosage des halogènes organiques extractibles par solvant : 

    De contrôler la présence de résidus de pesticides organophosphorés par la mesure de l'activité anticholinestérasique d'un extrait de l'échantillon ; 

    De rechercher un certain nombre de pesticides par des techniques chromatographiques. 

                          MATERIELS ET REACTIFS 

    Se reporter aux textes précédents traitant la recherche des résidus de pesticides dans le vin et dans la farine. 

                              TECHNIQUE 

                      Préparation de l'échantillon 

    La validité de l'échantillon primitif ayant été assurée par les inspecteurs chargés de cette opération, le laboratoire de chimie reçoit un échantillon de 2 à 3 kg. 

    Echantillon primaire - Après élimination des parties non comestibles, dont le pourcentage en poids par rapport à l'échantillon entier sera noté, divisez au hachoir en petits fragments de 2 à 3 cm la totalité de l'échantillon à analyser (2 à 3 kg). Mélangez. 

    Les fruits ne seront pas pelés à l'exception des agrumes dont l'analyse sera effectuée selon un protocole particulier. 

    Echantillon secondaire - Réduisez au hachoir électrique en morceaux ou en tranches fines, 700 g environ de mélange primaire, de manière à obtenir 600 g environ de mouture. Homogénéisez cette mouture. 

    Echantillon tertiaire - Réduisez en purée ou en parties fines, au mixeur, 350 g environ du mélange secondaire pour obtenir le mélange final qui sera utilisé pour l'extraction. 

    Déterminez l'humidité de l'échantillon tertiaire sur 5 g de celui-ci. 

                     Préparation de l'extrait 

    L'analyse pourra comporter : 

    1. Une détermination des halogènes totaux extractibles par solvant à partir d'une prise d'essai initiale 120 g qui sera utilisée en totalité pour cette détermination. 

    2. La détermination de l'activité anticholinestérasique de l'extrait. 

    3. Une recherche par chromatographique gazeuse d'un certain nombre d'insecticides connus sur 50 g d'échantillon. 

    4. Une recherche particulière par chromatographie en couche mince ou toute autre méthode sur l'équivalent de 50 g d'échantillon. 

    En fonction des opérations de contrôle désirées ou possibles, le poids d'échantillon tertiaire à utiliser pour l'extraction pourra être de : 

    75 g pour l'analyse chromatographique et enzymatique, en conservant une partie de l'extrait pour des recherches complémentaires. 

    120 g pour le dosage des halogènes extractibles par solvant. 

    La technique d'extraction sera la même dans chaque cas, mais elle sera appliquée selon les modalités suivantes : 

      Extraction pour l'analyse chromatographique et enzymatique 

    a) Cas général (raisins et agrumes exceptés). 

    Introduisez l'échantillon tertiaire de 75 g dans un flacon à large col et ajoutez : 

    200 ml d'acétonitrile. 

    Mixez quelques secondes pour homogénéiser. 

    Agitez mécaniquement 30 mn. 

    Décantez le liquide dans le ballon de l'évaporateur rotatif en le filtrant sur un petit tampon de laine de verre résistant à la chaleur. 

    Exprimez fortement. 

    Reprenez la masse de l'échantillon avec 100 ml d'acétonitrile et agitez à nouveau mécaniquement pendant 20 mn. Filtrez sur la même laine de verre le nouvel extrait. Exprimez fortement à nouveau. 

    Evaporez l'acétonitrile au moyen d'un évaporateur rotatif, la température du bain-marie ne dépassant pas 45°. 

    Extrayez le résidu aqueux dans une ampoule à décantation avec 100 ml, puis avec 50 ml d'éther de pétrole purifié, séchez l'extrait avec du sulfate de sodium anhydre. 

    Concentrez au bain-marie sous jet d'air froid jusqu'à 7,5 ml. 

    1 ml d'extrait brut concentré à 7,5 ml correspond à 10 g de fruit ou de légume. 

    b) Cas des agrumes  : (méthode à l'isopropanol - éther de pétrole). 

    Pesez l'échantillon d'agrume à analyser, soit un lot de 4 fruits, séparez les zestes et déterminez leur pourcentage en poids dans les fruits entiers. 

    Soit p la fraction décimale correspondante. 

   Réduisez au hachoir électrique les zestes en menus fragments. 

    Après mélange, pesez exactement : 

    (75 p) grammes de zestes (soit par exemple, si p = 0,28) : 

    75 X 0,28 = 21 g de zestes d'oranges en comportant 28 p. 100.    Introduisez cet échantillon tertiaire dans un flacon à large col de 1 litre et ajoutez : 

    4 X (75 p) ml d'alcool isopropylique (soit 4 X 21 = 84 ml dans l'exemple choisi) ; 

    Et 2 X (75 p) ml d'éther de pétrole (soit 2 X 21 = 42 ml dans l'exemple choisi). 

    Actionnez un mixeur quelques secondes pour homogénéiser. 

    Agitez mécaniquement pendant 30 mn. 

    Filtrez le liquide à travers un tampon de laine de verre résistant à la chaleur dans une ampoule de décantation de 500 ml. 

    Reprenez la masse de l'échantillon avec 2 (75 p) ml d'éther de pétrole. 

    Agitez pendant 20 mn supplémentaires. 

    Filtrez le liquide sur le même tampon de laine de verre en recevant le filtrat dans la même ampoule à décantation. 

    Ajoutez : 8 X (75 p) ml d'eau pure. 

    Agitez et après séparation des phases évacuez la phase aqueuse. 

    Ajoutez 25 ml d'eau pure, agitez, rejetez la phase aqueuse après séparation. 

    Séchez la phase éthérée sur sulfate de sodium avant de la concentrer par évaporation à 7,5 ml. 

    1 ml d'extrait brut concentré à 7,5 ml correspondant à 10 g de fruit entier. 

   1° Dosage des halogènes totaux extractibles par solvant. 

    La présence de chlorures naturels dans les extraits d'une part et la sensibilité limite du dosage colorimétrique d'autre part rendent la détermination de la teneur en chlorures extractibles par solvant inadéquate pour la recherche des résidus à des taux inférieurs à 0,4 mg/kg dans la majorité des fruits et des légumes. 

    Indiquée principalement pour contrôler l'absence de dépôts anormaux d'insecticides organochlorés à des teneurs supérieures à 1 mg/kg, cette technique sera appliquée sur un extrait obtenu dans les conditions suivantes : 

       Extraction : 

    Traitez un échantillon tertiaire de 120 g dans les conditions décrites précédemment en utilisant successivement les volumes suivants de solvant : 

    acétonitrile :     200 et 100 ml ; 

    éther de pétrole : 100 et 50 ml. 

    Evaporez presque à sec, au bain-marie et sous jet d'air froid dans un tube conique, l'extrait éthéré ainsi obtenu. Lavez les parois du tube avec de petites fractions d'acétone, évaporez l'acétone à l'aide d'un jet d'air froid jusqu'à 0,4 ml environ. 

    Prélevez l'extrait ainsi concentré au moyen d'une seringue de 1 ml et déposez-le avec précaution sur le papier spécial pour combustion maintenu à l'aide de pinces pour éviter toute souillure. Répétez les opérations de rinçage à l'acétone jusqu'à transfert complet du résidu sur le papier. 

    Continuez les opérations de combustion et de dosage en suivant la technique décrite au sujet de l'analyse des vins. 

    L'analyse colorimétrique est effectuée sur l'équivalent de 80 g d'échantillon. 

    La teneur en chlore est donnée par la relation : 

                            1000   

               (D. O.) 0,24 ---- = 3. (D. O.) mg/kg 

                             80 

    (D. O.) étant la densité optique lue par rapport à un témoin effectué avec l'ensemble des réactifs. 

    En raison des taux variables et mal définis d'halogènes organiques naturels dans les végétaux cette méthode conviendra pour observer l'absence de résidus au-dessus de la teneur donnée par l'analyse. Cette teneur est généralement inférieure à 0,4 mg/kg, exprimée en chlore. 

   2° Contrôle de l'activité anticholinestérasique de l'extrait. 

    La présence des résidus d'insecticides organophosphorés inhibiteurs de la cholinestérase peut être contrôlée par la mesure directe de l'activité anticholinestérasique de l'extrait non purifié. 

    Après prélèvement de 5 ml (sur les 7,5 ml disponibles) pour l'analyse chromatographique, diluez à 10 ml les 2,5 ml restants avec de l'éther de pétrole. 

    0,4 ml de cet extrait étendu représente 1 g d'échantillon. 

    Les mesures de l'activité anticholinestérasique pourront être exécutées, soit par la méthode colorimétrique, soit par la méthode potentiométrique en suivant les protocoles indiqués au sujet de l'analyse des vins (méthodes I-3 A - I-3 B). 

    Les déterminations seront exécutées en double sur une partie aliquote de l'extrait équivalente à 2 g d'échantillon avec la méthode colorimétrique ou 1 g d'échantillon avec la méthode potentiométrique. La prise d'essai sera réduite à l'équivalent de 0,5 g dans le cas des agrumes. 

    L'évaporation de l'extrait éthéré dans le tube à réaction, avant addition de l'eau de brome, sera effectuée en présence de 0,1 ml de solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100. 

    Dans chacune des deux méthodes, la teneur réelle en insecticide organophosphoré ne peut être déterminée qu'après identification du résidu, report à la courbe d'étalonnage particulière au pesticide mis en évidence et étude du rendement dans chaque cas particulier. 

    Lorsque l'identité du produit anticholinestérasique décelé ne sera pas connue, sa teneur sera exprimée en concentration apparente en parathion, telle qu'elle est indiquée par la comparaison des inhibitions constatées et de la droite d'étalonnage obtenue avec le parathion. 

   3° Recherche des insecticides par chromatographie gazeuse. 

       Principe : 

    Une élution sélective sur colonne de florisil permet de séparer de l'extrait brut une série de pesticides dont la présence est ensuite recherchée dans les différents éluats successifs par chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électron. 

    La sensibilité de ce type de détecteur aux principaux insecticides organochlorés usuels permet de contrôler leur absence dans l'échantillon analysé au-dessus de teneurs variables avec l'insecticide et la concentration choisie. 

    Lorsque cette analyse mettra en évidence des résidus apparents d'insecticides à des taux supérieurs aux tolérances, un contrôle plus complet sera mis en oeuvre : étude sur plusieurs colonnes, mesure d'un coefficient d'extraction, chromatographie en couche mince, colorimétrie ou microcoulométrie pour obtenir confirmation du résultat de la première analyse. 

    La sensibilité plus faible du détecteur à capture d'électron aux insecticides organophosphorés sera compensée par une concentration des éluats ; cependant, la polarité plus élevée de ces insecticides limite le nombre de ceux qui peuvent être élués dans les conditions choisies. 

    L'identification pourra être confirmée par analyse au moyen du détecteur thermoionique, par l'analyse enzymatique ou par chromatographie sur couche mince. 

       Purification de l'extrait : 

    5 ml de l'extrait de 75 g d'échantillon concentré à 7,5 ml, soit l'équivalent de 50 g de produit à analyser, sont chromatographiés sur colonne de florisil dans les conditions décrites dans la méthode de contrôle du vin (méthode I-6) ou de la farine (méthode II). 

    Après lavage de la colonne avec 50 ml de mélange éluant i et 50 ml d'éther de pétrole, introduisez les 5 ml d'extrait éthéré concentré et éluez successivement avec : 

    100 ml d'éther de pétrole pour obtenir l'éluat E1 ; 

     50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E2 ; 

     50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E3. 

    Une liste (non limitative) des pesticides qui peuvent être obtenus dans les différents éluats est donnée au tableau 1.

                      TABLEAU N° 1 

    Séparation des pesticides donnée par la chromatographie 

             sur la colonne de florisil indiquée 
 :================================:
 :  Eluat E1   :     Eluat E2     :
 : 100 ml/E.P. :      50 ml/4     :
 :-------------:------------------:
 : Soufre      :    Diallate      :
 : HCB         :    Triallate     :
 :             :    (+++)         :
 : HCH         :    Diazinon      :
 :             :    (+++)         :
 : Gamma HCH   :    Fénitrothion  :
 :             :    (++)          :
 : Quintozène  :    Ronnel        :
 : Triallate   :                  :
 : (+)         :    Fenthion      :
 : HHDN        :    Parathion     :
 :             :    Dicofol       :
 : Heptachlore :    Bromophos     :
 : Heptaclhore :                  :
 : - époxyde   :    Phenthoate    :
 : DDE         :    2,4-D-Butyl   :
 :             :    glycol ester  :
 : DDD         :    Endosulfan    :
 : Chlordane   :    Chlorofénizon :
 :             :                  :
 : Zeidane     :    HEOD          :
 : Toxaphène   :    Endrine       :
 :             : Chlorobenzilate  :
 :             : 2,4-D-alkyl      :
 :             : cyclohexanol     :
 :             : ester            :
 :             : (85 p. 100)      :
 :             : 2,4,5-T-butyl    :
 :             : glycol ester     :
 :             : (85 p. 100)      :
 :             : Diéthion         :
 :             : Carbophénothion  :
 :             : Méthoxychlore    :
 :             : Dinocap          :
 :             : Tétradifon       :
 :             :                  :
 :================================:

 :================================:
 :  Eluat E1   :     Eluat E3     :
 : 100 ml/E.P. :      50 ml/4     :
 :-------------:------------------:
 : Soufre      : Parathion-méthyl :
 : HCB         : Dichlofluanide   :
 : HCH         :    Malathion     :
 : Gamma HCH   :   Diazinon (+)   :
 : Quintozène  :   Fénitrothion   :
 :             :      (++)        :
 : Triallate   :     Phaltane     :
 : (+)         :                  :
 : HHDN        :    2,4-D-alkyl   :
 :             :   cyclohexanol   :
 :             :   ester          :
 :             :   (15 p. 100)    :
 : Heptachlore :                  :
 : Heptaclhore-:                  :
 : époxyde     :                  :
 : DDE         :    Endosulfan    :
 :             :    (2e pic)      :
 :             :    +++ ... E4    :
 : DDD         :                  :
 : Chlordane   : 2,4,5-T butyl    :
 :             : glycol ester     :
 :             :   (15 p. 100)    :
 : Zeidane     :                  :
 : Toxaphène   :                  :
 :             :                  :
 :================================:

   Les pesticides du groupe 4 signalés au tableau 3 (méthode I-6) ne sont pas élués dans ces conditions. 

       Analyse par chromatographie gazeuse : 

    L'éluat E4, après addition de 0,5 ml de solution k, est préalablement concentré à 50 ml par évaporation au bain-marie et sous jet d'air froid. Les éluats E2 et E3 sont réduits à 10 ml dans les mêmes conditions. 

    Après injection de 4 microlitres de chacun des éluats ainsi concentrés, les limites de sensibilité de la méthode, calculées sur la base de valeurs moyennes des quantités minimales détectables, correspondent au double des valeurs données dans la troisième colonne du tableau 2 (Méthode I-6) puisque la prise d'essai est réduite ici à 50 g au lieu de 100 ml de vin. 

    Ces limites peuvent être abaissées, si jugé utile, en réduisant l'éluat E1 à 10 ml et les éluats E2 ou E3 à 5 ml. 

    NOTA - Analyse des carottes 

    Dans l'analyse des carottes, des produits naturels non halogénés produisent irrégulièrement des interférences gênantes pour l'interprétation des chromatogrammes de l'éluat E2 concentré, avec le détecteur à capture d'électrons. Pour éviter cet inconvénient et permetre la recherche sans difficulté de l'HEOD à des teneurs inférieures à 0,01 mg/kg, le mélange éluant i pourra être remplacé par un mélange chlorure de méthylène-éther de pétrole (25 p + 75 P). 

    L'analyse sera limitée à l'étude de l'éluat E1 habituel et à celle du nouvel éluat E'2 obtenu avec 50 ml du nouveau mélange éluant. 

    L'éluant E'2 devra être évaporé à sec - en présence de 0,5 ml de solution k - pour éliminer toute trace de solvant chloré. Le résidu sec sera repris par 5 ml d'éther de pétrole pour l'analyse chromatographique. 

    L'élution ainsi réalisée permet d'isoler l'HEOD, l'endrine et le méthoxychlore ; le dicofol et le tétradifon ne sont que partiellement élués tandis que le parathion et le fénitrothion ne le sont pas. 

    Les interférences naturelles sont reportées à l'éluation suivante.

                              Calcul 

    Lorsqu'une réponse positive est enregistrée après chromatographie sur l'une des deux colonnes DC 200 ou QF 1, l'analyse sera répétée avec le même extrait sur la deuxième colonne. 

    La présomption de la présence d'un insecticide déterminé sera donnée en première analyse par les critères suivants : 

    Possibilité de la présence de ce produit dans l'éluat E1-E2 ou       E3 ; 

    Conformité des temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN       dans les deux conditions opératoires différentes ; 

    Conformité des résultats quantitatifs donnés par les deux       chromatographies effectuées. 

    Les teneurs apparentes seront calculées par comparaison entre les surfaces des pics observés et celles - voisines - des pics donnés par les solutions étalons dans les mêmes conditions opératoires, immédiatement avant ou après l'analyse de l'inconnu. 

    La surface d'un pic sera déterminée soit en utilisant les données de l'intégrateur disponible, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par la largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet. 

    Après avoir assuré par l'une au moins des méthodes indiquées ici (1 - 2 - 3 (a-b-c-d) - 4) l'identification définitive du résidu, la teneur trouvée sera corrigée après détermination du rendement de la technique par une analyse de l'échantillon additionné avant extraction d'une dose connue - égale ou voisine de celle trouvée - du pesticide incriminé. 

    La méthode d'extraction utilisée est un compromis entre le désir d'une extraction polyvalente efficace et la nécessité d'un contrôle relativement rapide et peu onéreux. Il est donc parfois nécessaire de préciser le rendement de l'extraction. 

    Cette détermination ne sera utile que si la teneur trouvée initialement est à la fois inférieure et du même ordre de grandeur qu'une tolérance en vigueur puisque le rendement est normalement supérieur à 80 p. 100 pour les produits stables (organohalogénés en général) et supérieur à 60 p. 100 pour les substances à dégradation plus rapide (organophosphorés en particulier). 

    Elle ne sera pas indispensable lorsque la teneur trouvée sera supérieure à une tolérance en vigueur, notamment pour les tolérances nulles. 

    Dans ce dernier cas il convient de considérer que le rendement affecte le seuil de sensibilité de l'analyse. 

            Identification par chromatographie gazeuse 

    a) Temps de rétention relatifs : 

    Le temps de rétention relatif trr du composé à identifier sera déterminé par chromatographie sur colonnes DC 200 et QF 1 en présence d'HHDN, élément de référence. 

    Les valeurs de trr seront précisées au moment de l'analyse ; les tableaux donnés dans la méthode 6 de l'analyse des vins peuvent être consultés à titre indicatif. 

    b) Coefficient d'extraction éther de pétrole - acétonitrile "p" :

    Ce coefficient "p" peut contribuer à confirmer la présomption de l'identité d'un produit avec un insecticide connu. La technique a été décrite et les valeurs de "p" des principaux insecticides organochlorés indiquées dans l'analyse du vin et de la farine. 

    c) Analyse par microcoulométrie : 

    Les éluats E1 et E2 dans lesquels auront été décelés des résidus d'insecticides organochlorés pourront être analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur microcoulométrique après concentration suffisante de manière à injecter 20 à 50 microlitres d'une solution titrant au moins 1 mg/l de l'insecticide présumé. 

    d) Analyse par le détecteur thermoionique 

    Les éluats E2 et E3 dans lesquels auront été mis en évidence au moyen du détecteur à capture d'électron des résidus apparents d'insecticides organophosphorés pourront être soumis à l'analyse chromatographique avec détecteur thermoionique pour confirmer l'identité de ces composés. 

    Les éluats E2 et E3 seront analysés directement ou après concentration de manière à soumettre à la chromatographie une solution titrant environ 5 mg/l. Injectez 2 à 4 microlitres. 

       4° Recherche des insecticides par chromatographie 

                       en couche mince 

    Les techniques décrites pour la recherche par chromatographie en couche mince des insecticides organochlorés et organothiophosphorés dans le vin peuvent être suivies sans modification (en ce qui concerne la préparation des plaques et la chromatographie) pour rechercher d'éventuels insecticides dans les éluats E1, E2 et E3. 

    L'éluat E1 ne renferme - dans la limite des produits phytosanitaires essayés jusqu'ici - que des insecticides organochlorés et le soufre. 

    Les éluats E2 et E3 peuvent contenir des insecticides organohalogénés et organophosphorés. 

           Recherche des insecticides organohalogénés 

    L'extraction et la purification des extraits ayant été exécutés comme il vient d'être indiqué ci-dessus, la totalité ou une partie aliquote de l'éluat E1 et la moitié des éluats E2 et E3 pourront être utilisées pour la recherche des insecticides organochlorés par chromatographie en couche mince. 

    Après avoir évaporé, avec précaution, les fractions choisies - soit E1, E2 et E3, déposez le résidu d'évaporation sur une plaque comme il est indiqué pour l'analyse des vins et continuez en suivant ce même protocole. 

    Pour l'étude de l'éluat E1, utilisez le mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol. 

    Pour l'étude des éluats E2 et E3, utilisez le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol. 

    La présomption de l'identité des taches éventuellement observées sera déduite de la comparaison de leurs Rf avec ceux des insecticides organohalogénés chromatographiés dans les mêmes conditions opératoires. 

    L'étude des éluats E2 et E3 pourra être exécutée en déposant, d'une part, sur la moitié d'une plaque, des résidus d'éluats concentrés équivalents à 25 g d'échantillon et, d'autre part, sur la deuxième moitié de la même plaque, des résidus de ces mêmes éluats équivalents à 10 g d'échantillon. 

    Les pesticides organohalogénés (y compris les organophosphorés halogénés) seront recherchés par pulvérisation du réactif de Mitchell sur la première moitié de la plaque tandis que les organothiophosphorés seront révélés par pulvérisation du réactif spécifique indiqué plus loin. 

    Sensibilité - Une limite de détection aussi élevée que 2 microgrammes (limite qui peut être abaissée) assure le contrôle de l'absence de résidus de pesticides organohalogénés à des teneurs supérieures à 0,08 mg/kg, lors que la recherche est effectuée, comme indiqué, sur l'équivalent de 25 g d'échantillon. 

             Recherche des insecticides organophosphorés 

    La recherche des insecticides organothiophosphorés séparés dans les éluats E1 et E2 sera effectuée sur l'équivalent de 10 g d'échantillon (le 1/5 des éluats) comme il vient d'être indiqué ci-dessus). 

    Révélez les produits organothiophosphorés selon la technique décrite au sujet de l'analyse des vins. 

    NOTA - La révélation des pesticides organophosphorés possédant un groupement nitré, comme le parathion, peut être assurée très simplement par la pulvérisation d'une solution de potasse alcoolique 2 N. 

    Les spots jaunes sont accentués après un séjour de 5 mn à l'étuve à 110° et permettent de détecter 0,1 microgramme de parathion. 

    La présomption de l'identité des taches observées sera déduite par comparaison de leurs Rf avec ceux des pesticides chromatographiés dans les mêmes conditions opératoires. 

    Sensibilité - Une limite de détection de 0,5 microgramme (limite qui peut être abaissée) assure le contrôle de l'absence de résidus des insecticides indiqués à des teneurs supérieures à 0,05 mg/kg lorsque la recherche est effectuée, comme indiqué, sur l'équivalent de 10 g d'échantillon.