Instructions relatives aux réactifs de groupages sanguins humains 
A. - Dispositions générales applicables à tout réactif
pour groupages sanguins. 
1° Spécificité.
Le réactif doit, dans la technique d'utilisation recommandée par l'établissement producteur, reconnaître exclusivement les échantillons de globules rouges porteurs de l'antigène correspondant et ne doit réagir avec aucun antigène reconnu distinct de ce dernier.
Il ne doit manifester, dans cette technique d'utilisation, ni activité hémolysante, ni formation de pseudo-agglutinats, ni effet de prozone.
2° Puissance.
Elle est appréciée par trois critères : le titre, le score d'agglutination, l'intensité ; en outre, pour les réactifs utilisables sur plaque, l'avidité doit être appréciée :
a) Le titre est mesuré en faisant des dilutions du réactif par progression géométrique de raison 2 dans un milieu approprié en un volume total de 10 gouttes, avec essorage mais sans rinçage de la pipette lors du transfert d'un tube à l'autre. A chaque volume de diluant mis en réaction est ajouté un volume égal de suspension de globules rouges à concentration déterminée et dans un milieu défini. Le titre est l'inverse de la dernière dilution ou l'agglutination est encore visible, étant entendu que le mélange contenant le réactif pur, non préalablement dilué, représente la dilution 1 : 1 et non 1 : 2. Il est recommandé de contrôler le titre obtenu par un essai sur une dilution unique. Pour les réactifs disposant d'étalon international, le titre sera exprimé en unité internationale et pour les autres par la dernière dilution positive. Le centre national de référence pour les groupages sanguins est chargé de constituer les étalons nationaux, d'en déterminer le titre en unités internationales (UI) d'après les étalons internationaux et de les distribuer aux divers établissements producteurs de réactifs en France ;
b) Le score d'agglutination est évalué conjointement au titrage en totalisant les valeurs conventionnelles suivantes attribuées à l'aspect de chaque réaction de la série de titrage : +++ = score 10, ++ = score 8, + = score 5, (+) = score 2, - = score 0 ;
c) L'intensité est définie par l'aspect de l'agglutination obtenue avec le réactif non dilué vis-à-vis de globules rouges lavés ou non selon le mode d'utilisation ;
d) L'avidité est appréciée, pour les sérums-tests utilisables sur plaque, par la mesure au chronomètre du temps d'apparition des premiers agglutinats visibles à l'oeil nu, après mélange rapide d'une goutte de sérum-test non dilué et d'une goutte de suspension globulaire adéquate.
3° Péremption des réactifs.
Il est conseillé de considérer une durée de conservation de douze mois pour les réactifs liquides et de trente-six mois pour les réactifs lyophilisés, dans les conditions de température préconisées par l'établissement producteur.
B. - Dispositions particulières à chaque catégorie de réactifs.
I. - Réactifs de groupage ABO. 
1° Anti-A, anti-B, anti-AB : 
a) Coloration : si les sérums-tests sont artificiellement colorés, leur couleur et celle de l'étiquette des récipients les contenant doivent être verte pour l'anti-A, rouge pour l'anti-B et jaune pour l'anti-AB ; 
b) Puissance : les normes minimales suivantes sont exigibles : 
RÉACTIFS
HÉMATIES
tests
AVIDITÉ
INTENSITÉ
TITRE
(UI)
SCORE
Anti-A
A1
8''
+++
64
50
A3
12''
+++
64
40
Anti-B
B
8''
+++
64
50
Anti-AB
A1 A2 et B
Caractéristiques de l'anti-A et de l'anti-B.
c) Technique de contrôle : 
1. Globules rouges-tests : 
Les globules rouges-tests A1, A2 ou B sont constitués d'un mélange de trois échantillons A1, A2 ou B. 
Ils sont utilisés après lavages. Leur concentration est de 10 % en saline (environ 900 000/mm3) pour l'évaluation, en tube, du titre et du score de l'agglutination. 
2. Mesure de l'avidité : 
Elle s'effectue en déposant côte à côte sur plaque à 20 degrés C environ une goutte, 50 microns de l environ, de réactif et une goutte de suspension globulaire (10 %). Un mélange rapide est effectué en étalant à l'aide d'un agitateur, d'un mouvement spirale centrifuge pour former une surface de réaction circulaire de 3 cm de diamètre. Le chronomètre est alors déclenché et le temps d'apparition des premiers agglutinats visibles à l'oeil nu est mesuré. L'avidité est celle correspondant à la moyenne de deux mesures faites par deux personnes. 
3. Mesure de l'intensité : 
Elle est appréciée trois minutes après la fin de l'étalement en agitant la plaque pour homogénéiser le mélange. Au terme de ces trois minutes, l'agglutination doit être totale (+++), sans globule rouge libre, laissant apparaître le fond de la plaque. 
4. Mesure du titre et du score de l'agglutination : 
La dilution du sérum se fait en saline, la réaction proprement dite effectuée à 20 degrés C environ en tube à fond hémisphérique de 12 mm de diamètre intérieur, contenant deux gouttes du sérum ou de ses dilutions et deux gouttes d'une suspension saline à 1 % de globules rouges-tests. Ces tubes sont alors centrifugés à environ 500 g durant une minute. Après une légère agitation, pour décoller le culot, les réactions sont lues à l'oeil nu sur fond blanc et évaluées selon la convention suivante : 
+++ = Score 10 : agglutinat non dissocié par le décollement du culot et fragmenté en trois amas au maximum. 
++ = Score 8 : culot fragmenté en quatre à dix amas lors du décollement. 
+ = Score 5 : réaction formée de plus de dix petits agglutinats dissociés par le décollement. 
(+) = Score 2 : agglutination très fine mais encore visible. 
- = Score 0 : absence d'agglutination. 
La valeur du titre est exprimée en unité internationale (UI) par comparaison, dans les mêmes conditions techniques, avec le sérum de référence local préparé et conservé par le producteur du sérum-test lui-même et titré d'après le sérum étalon national qui est préparé par le centre national de référence des groupages sanguins et qui est à son tour titré d'après l'étalon international préparé par les laboratoires de l'OMS. 
Exemple de mesure d'un titre : 
L'étalon national anti-B contenant 256 UI d'anticorps fourni par le centre national de référence est testé parallèlement avec un sérum anti-B inconnu dans deux laboratoires différents. Bien que le titre effectif de ce sérum soit de 256 pour l'un et de 64 pour l'autre, le titre relatif affiché par comparaison avec celui de l'étalon sera 128 pour les deux laboratoires. 
TITRE EFFECTIVEMENT
observé
TITRE DÉFINI (UI)
Etalon
national
Sérum
inconnu
Etalon
national
Sérum
inconnu
Laboratoire (X)
512
256
256
128
Laboratoire
128
64
128
d) Exigences particulières : 
Le réactif anti-A doit agglutiner de façon visible les globules rouges A3 de référence. Le sérum test anti-A + B doit agglutiner de façon visible les globules rouges Ax et si possible Bx de référence. Le sérum test anti-B doit agglutiner de façon visible les globules rouges B3 de référence. Le contrôle de réactivité de ces globules rouges se fait sur plaque, vis-à-vis d'une suspension saline de globules rouges à 5 %. La réaction doit être positive en moins de six minutes. Les échantillons de globules rouges A3, Ax et B3 et si possible Bx sont distribués par le centre national de référence pour les groupes sanguins aux centres de transfusion sanguine producteurs de sérums-tests ; 
2° Les réactifs anti-A1 et anti-H : 
Ils doivent être utilisables dans les mêmes techniques que les réactifs anti-A, anti-B et anti-A + B et leur contrôle s'effectue selon les mêmes procédés : 
Le réactif anti-A1, testé sur plaque à 20 degrés C environ vis-à-vis d'un pool de trois échantillons de globules rouges A1, à 10 % en suspension saline ou en sérum AB, doit, après trois minutes d'étalement, avoir une intensité de ++. Son titre et son score d'agglutination, appréciés par la technique de centrifugation en tube vis-à-vis du même mélange de globules rouges mais à 1 % doivent être respectivement, au minimum, de 8 et 25 ; 
Le réactif anti-H, testé sur plaque à 20 degrés C environ vis-à-vis d'un mélange de trois échantillons de globules rouges A2 et d'un mélange de trois échantillons de globules rouges 0 à 10 % en suspension saline ou en sérum AB doit, après trois minutes d'étalement, avoir une intensité minimum de ++. Après le même délai, l'intensité de l'agglutination d'un mélange de trois échantillons de globules rouges A1, à 10 % en suspension saline, doit être nulle ou nettement inférieure à celle de globules rouges A2, et les globules rouges de type Bombay classique doivent rester inagglutinables quel que soit le temps de contact entre le sérum et les globules rouges ; 
Son titre et son score d'agglutination, appréciés par la technique de centrifugation en tube, vis-à-vis des globules rouges à 1 %, en suspension saline ou en sérum AB, doivent être respectivement au minimum de huit et trente contre les globules rouges 0, au maximum de deux et dix contre les globules rouges A1, et nuls conte les globules rouges Bombay. 
II. - Réactifs de groupage Rhésus. 
1° Anti-D (anti-Rh standard) pour groupage sur plaque : 
a) Aucune coloration artificielle du réactif n'est recommandée. Les normes minimales exigibles sont les suivantes : 
RÉACTIF
GLOBULES ROUGES
tests
AVIDITE
INTENSITÉ
TITRE
(VI)
SCORE
Anti-D plaque
D+ C+ c+ E- e+
30''
+++
32
40
b) Technique de contrôle : 
L'avidité et l'intensité sont appréciées sur plaque chauffée à 40 °C environ contre une suspension à 40 % en sérum AB humain d'un pool de trois échantillons de globules rouges D+ C+ c+ E- e+ préalablement lavés. Les détails de la manipulation sont identiques à ceux décrits pour les sérums-tests de groupage ABO ; cependant la surface circulaire d'étalement est ici de 2 centimètres de diamètre. L'intensité sera également déterminée vis-à-vis d'hématies non lavées ; 
Le titre et le score sont évalués en microtube (6 mm de diamètre intérieur) par lecture microscopique, après une incubation de une heure trente à deux heures à 37 degrés C d'une goutte de sérum-test ou de ses dilutions en sérum AB humain et d'une goutte du même pool de globules rouges D+ C+ c+ E- e+ à concentration de 2 % en sérum AB humain ; 
c) Exigences particulières : 
Le réactif anti-D plaque doit agglutiner dans sa technique d'utilisation des échantillons D faible de référence distribués par le centre national de référence pour les groupages sanguins. 
Le centre de transfusion sanguine producteur de sérums-tests anti-D doit également préparer un réactif "témoin négatif" dont la composition est la même que la dilution de l'anti-D, et qui, utilisé parallèlement au réactif anti-D contre les mêmes globules rouges, ne doit pas les agglutiner. 
2° Autres réactifs anti-rhésus utilisables sur plaque : 
a) Aucune coloration artificielle du réactif n'est recommandée. 
Les normes minimales exigibles sont les suivantes : 
RÉACTIFS
GLOBULES ROUGES
tests
INTENSITÉ
TITRES
SCORES
Anti-C
D- C + c+ E- e+
+++
8
30
Anti-E
D- C- c+ E+ e+
+++
8
30
Anti-c
D- C+ c+ E- e+
+++
8
30
Anti-e+
D- C- c+ E+ e+
+++
8
30
b) Techniques de contrôle : 
Elles sont identiques à celles décrites pour l'anti-D plaque. La concentration des globules rouges peut cependant s'écarter, si le centre producteur le souhaite, de celle préconisée pour l'anti-D. Dans ce cas les concentrations retenues doivent être clairement indiquées dans la notice d'utilisation ; 
c) Exigences particulières : 
L'anti-C doit agglutiner dans sa technique d'utilisation les globules rouges ayant l'antigène C et dépourvus de l'antigène Ce ainsi que les globules rouges Cw + communs ; 
L'anti-E doit reconnaître dans sa technique d'utilisation les globules rouges ayant l'antigène E et dépourvus de l'antigène cE ; 
d) Les réactifs plurispécifiques (anti-D + C + E, anti-D + C, etc.). 
Les exigences qualitatives et quantitatives pour chaque spécificité du mélange d'anticorps sont analogues à celles des mêmes réactifs. 
Il est nécessaire que les diverses spécificités contenues dans ces réactifs puissent se manifester dans la même technique. Toute amélioration visant à simplifier les techniques devra être prise en compte, en conservant néanmoins les mêmes normes de sécurité. 
III. - Autres réactifs de groupage
a) Les caractéristiques suivantes sont mentionnées à titre indicatif : 
RÉACTIFS (*)
GLOBULES ROUGES - TESTS
TITRES
SCORES
TECHNIQUES D'EMPLOIS
recommandées
Anti-L salin
D+ C+ c+ E- e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-C salin
D- C+ c+ E- e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-c salin
D- C+ c+ E- e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-E salin
D- C- c+ E+ e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-e salin
D- C- c+ E+ e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-Cw salin
D+ Cw+ c+ E- e+
8
30
Saline 37 degrés C.
Anti-Cw incomplet
D+ Cw+ c+ E- e+
8
30
AB 37 degrés C.
Anti-K
K + k+
16
35
Test à l'antiglobuline.
Anti-k
K + k+
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-Kpa
kp (a+ b+)
4
20
Test à l'antiglobuline.
Anti-Kpb
kp (a+ b+)
4
20
Test à l'antiglobuline.
Anti-P1
P1
8
30
Trypsine saline.
Anti-M 
MN
8
30
Saline 22 degrés C.
Anti-N
MN
8
30
Saline 22 degrés C.
Anti-S
Ss
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-s
Ss
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-Lea
Le (a+ b-)
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-LebH - anti-Leb1
Le (a- b+)
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-Fya
Fy (a+ b+)
16
35
Test à l'antiglobuline.
Anti-Fyb
Fy (a+ b+)
8
30
Test à l'antiglobuline.
Anti-Jka
Jk (a+ b+)
16
35
Test à l'antiglobuline.
Anti-Jkb
Jk (a+ b+)
8
30
Test à l'antiglobuline.
(*) Pour chaque réactif l'intensité est de +++
b) Techniques de contrôle. 
Les techniques recommandées dans ce tableau ne sont pas exclusives. Les réactifs de même spécificité peuvent être mis en circulation, même lorsque leur technique optimale d'utilisation est différente de celles-ci, à condition toutefois qu'ils répondent, dans ces techniques, aux normes minimales exigibles. 
Les globules rouges-tests sont faits d'un mélange de deux ou trois échantillons préalablement lavés et mis en suspension dans le milieu adéquat. Ce milieu est la solution saline physiologique pour les tests en saline 22 degrés C, en fait à la température du laboratoire (22 degrés C plus ou moins 3 degrés C), saline 37 degrés C et test indirect à l'antiglobuline. Ils sont préalablement trypsinés pour les tests en trypsine saline 22 degrés C et test indirect trypsiné à l'antiglobuline. La concentration des globules rouges est de 2 % pour les tests en saline. Elle est de 3 à 5 % pour les tests à l'antiglobuline. 
Détails des techniques recommandées : 
1. Les tests "en saline" se font en microtube par incubation à 22 degrés C ou à 37 degrés C d'une goutte de sérum ou de ses dilutions en saline et d'une goutte de suspension saline des globules rouges pendant 90 minutes, la lecture étant microscopique. 
2. Les tests en "AB 37 degrés C" sont exécutés de façon analogue, mais les globules rouges sont en milieu AB et les dilutions du sérum se font en sérum AB. 
3. Les tests indirects à l'antiglobuline se font par incubation de quarante-cinq minutes à 37 degrés C de volumes égaux de sérum ou de ses dilutions en saline et de globules rouges en suspension saline à 3 %. Après trois lavages, la réaction à l'antiglobuline proprement dite se fait entre une goutte d'antiglobuline conforme et une goutte de suspension saline de globules rouges lavés. La concentration de celle-ci est de 5 % pour les tests sur plaque, la lecture se faisant au terme de trois minutes, et de 2 % pour les tests en tube utilisant une centrifugation à 130 x g. environ pendant trente secondes suivie d'une lecture microscopique. 
Pour les anticorps, dont l'activité n'est décelable dans cette technique que grâce à leur capacité de fixation du complément, il est nécessaire, au terme du temps de sensibilisation, de retirer après centrifugation le surnageant sérique et de le remplacer par un volume égal de sérum AB frais, source de complément. Les lavages et le test à l'antiglobuline proprement dit n'interviendront qu'après vingt minutes d'incubation supplémentaire à 37 degrés C de ce nouveau mélange. 
c) Exigences particulières : 
1. Le réactif ne doit certes contenir aucun autre anticorps que celui indiqué sur l'étiquette, capable de réagir dans sa technique d'utilisation. Il est cependant indispensable de tester le réactif par toutes les techniques courantes et d'indiquer dans la notice d'utilisation la présence d'éventuels anticorps associés et les techniques par lesquelles ils seraient décelables. Un tel renseignement est indispensable pour éviter les erreurs d'interprétation lorsque l'utilisateur s'écarte des conditions techniques recommandées et surtout lorsqu'il utilise le réactif dans les expériences de fixation-élution tout en respectant ces conditions. 
2. Pour chaque réactif, les globules rouges porteurs d'antigènes faibles doivent être testés et leur réaction notifiée à l'utilisateur. La liste de ces globules rouges n'est pas limitative et sera fonction de la richesse et des disponibilités du laboratoire national de contrôle. L'absence de réaction positive, vis-à-vis de certains de ces échantillons, ne peut à elle seule rendre le réactif non conforme, mais il est nécessaire que la notice d'utilisation mentionne la réactivité du produit vis-à-vis de ces antigènes particuliers. 
3. Les réactifs anti-Rhésus (anti-C, c, E, e) doivent en outre répondre aux exigences mentionnées ci-dessus (II-2 °c).