1. Définition et domaine d'application.
   La teneur en vitamine B 2 (riboflavine) dans les produits diététiques et de régime est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.
   2. Principe.
   Extraction de la riboflavine par hydrolyses acide et enzymatique et dosage de ce composé par fluorométrie après isolement par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
   3. Réactifs.
   Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
   3.1. Solution environ 0,1 M d'acide chlorhydrique.
   3.2. Solution 2,5 M d'acétate de sodium.
   3.3. b-amylase.
   3.4. Takadiastase.
   3.5. Méthanol (qualité pour chromatographie).
   3.6. Solution 0,05 M d'acétate de sodium.
   3.7. Phase mobile : mélange 30/70 (v/v) de méthanol (3.5) et d'acétate de sodium (3.6) (ces proportions peuvent être éventuellement modifiées si nécessaire).
   3.8. Vitamine B 2 (riboflavine).
   3.9. Solution 0,02 M d'acide acétique.
   3.10. Solution étalon mère de vitamine B2 (0,1 mg/ml). Peser exactement environ 50 mg de riboflavine dans un erlenmeyer de 500 ml. Ajouter 400 ml d'acide acétique 0,02 M (3.9). Agiter à l'aide d'un agitateur magnétique chauffant jusqu'à dissolution de la vitamine B 2 (environ 1 heure). Refroidir la solution et amener le pH à 4,5 avec la solution d'acétate de sodium (3.2). Transvaser dans une fiole jaugée de 500 ml et ajuster avec de l'eau.
   4. Appareillage.
   Matériel courant de laboratoire et notamment :
   4.1. Mixeur-broyeur.
   4.2. Bain d'eau.
   4.3. pH-mètre.
   4.4. Etuve à 37 7 1 °C.
   4.5. Agitateur magnétique chauffant.
   4.6. Membrane d'acétate de cellulose 0,2 mm.
   4.7. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorométrie.
   4.8. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane (longueur 30 cm et diamètre intérieur 4 mm).
   5. Mode opératoire.
   5.1. Préparation de l'échantillon pour essai :
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement et rapidement (si nécessaire). Peser exactement environ M grammes d'échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5 grammes pour un échantillon contenant approximativement 0,8 mg de vitamine B 2 pour 100 grammes). Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique (3.1) et mettre au bain d'eau à 100 °C pendant trente minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition d'acétate de sodium (3.2). Ajouter ensuite 50 mg de b-amylase et 500 mg de takadiastase avec un peu d'eau. Agiter. Mettre à l'étuve à 37 °C pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de l'eau. Filtrer le surnageant (solution à injecter dans le chromatographe).
   5.2. Préparation des étalons :
   Faire des dilutions au 1/100, au 1/200 et au 1/500 avec de l'eau de la solution étalon-mère (3.10) et filtrer les solutions obtenues sur membrane d'acétate de cellulose (4.6) (solutions étalons à injecter dans le chromatographe et contenant respectivement 1,00, 0,50 et 0,20 mg de vitamine B 2 par ml).
   5.3. Conditions chromatographiques :
   Débit de la phase mobile : 1 ml/minute.
   Détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation 422 nm ; longueur d'onde d'émission 540 nm.
   Volume injecté : 20 ml.
   5.4. Remarque : toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.
   6. Expression des résultats.
   6.1. Mode de calcul et formule :
   Soit x la quantité de vitamine B 2 (exprimée en mg) contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage).
   La teneur en vitamine B 2 de l'échantillon à analyser (exprimée en mg/100 g) est donnée par la relation : 12,5 X M.
   6.2. Répétabilité :
   La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou successivement par le même analyste ne doit pas excéder 0,03 mg/100 grammes lorsque la teneur en vitamine B 2 de l'échantillon à analyser est voisine de 0,60 mg pour 100 grammes. Cette différence peut atteindre 0,15 mg/100 grammes pour des aliments riches en vitamines B 2 (teneur de l'ordre de 4 mg pour 100 grammes).