8. Etudes écotoxicologiques.
   Introduction.
   i) Les informations fournies, jointes à celles qui concernent une ou plusieurs préparations contenant la substance active, doivent être suffisantes pour permettre d'évaluer l'impact sur les espèces non cibles (flore et faune) dont l'exposition à la substance active, à ses métabolites et à ses produits de dégradation et de réaction peut être dangereuse, lorsque ces produits ont une importance pour l'environnement. L'impact peut être dû à une exposition unique et prolongée et peut être réversible ou irréversible.
   ii) En particulier, les informations fournies sur la substance active, jointes aux autres informations pertinentes et aux informations relatives à une ou plusieurs préparations contenant cette substance active, doivent être suffisantes pour :
   - décider si la substance active peut ou non être incluse dans la liste des substances actives ;
   - spécifier les conditions ou restrictions appropriées devant accompagner toute inclusion dans la liste des substances actives ;
   - permettre une évaluation des risques à court aussi bien qu'à long terme pour les espèces non cibles (populations, communautés et processus, selon le cas) ;
   - classer la substance active en fonction du danger ;
   - préciser les précautions à prendre pour protéger les espèces non cibles ;
   - définir les symboles des dangers, les indications du danger et les phrases relatives à la nature des risques ainsi qu'aux conseils de prudence pour la protection de l'environnement à faire figurer sur les emballages (conteneurs).
   iii) Il est nécessaire de faire état de tous les effets potentiellement néfastes constatés au cours des investissements écotoxicologiques de routine et de réaliser et rapporter, si les autorités compétentes le demandent, les études supplémentaires qui se révéleraient nécessaires pour déceler les éventuels mécanismes en cause et évaluer la signification de ces effets. Il est indispensable de rapporter toutes les données et les informations biologiques disponibles concourant à l'évaluation du profil écotoxicologique de la substance active.
   iv) Les informations sur le sort et le comportement dans l'environnement, établies et présentées conformément aux points 7.1 à 7.4 et sur les niveaux des résidus dans les végétaux établis et présentés conformément au chapitre 6, sont essentielles pour l'évaluation de l'impact sur les espèces non cibles, car, associées aux renseignements sur la nature de la préparation et son mode d'emploi, elles définissent la nature et l'ampleur de l'exposition potentielle. Les études et les informations toxicocinétiques et toxicologiques présentées conformément aux points 5.1 et 5.8 fournissent des données essentielles sur la toxicité pour les vertébrés et les mécanismes en cause.
   v) S'il y a lieu, des essais devraient être mis au point et les données obtenues devraient être analysées à l'aide de méthodes statistiques appropriées. Tous les détails de l'analyse statistique sont à noter (par exemple, toutes les estimations doivent être délimitées par un intervalle de confiance, il vaut mieux indiquer des valeurs "p" exactes au lieu de préciser qu'une valeur est significative/non significative).
   Substance d'essai.
   vi) Il est indispensable de fournir une description détaillée (spécification) du produit utilisé, conformément aux dispositions du point 1.11. Lorsque les essais sont effectués au moyen de la substance active, le produit utilisé devrait répondre aux spécifications qui seront retenues dans la fabrication des préparations à autoriser, sauf en cas d'utilisation de produit marqué.
   vii) Lorsque les études sont réalisées sur la substance active produite en laboratoire ou dans une unité de production pilote, elles devront être répétées sur la substance active fabriquée, à moins qu'il puisse être prouvé que la substance d'essai utilisée est essentiellement la même aux fins des essais et de l'évaluation du comportement écotoxicologique. En cas de doute, il y a lieu de présenter des études de recoupement appropriées permettant de trancher quant à l'éventuelle nécessité de répéter les études.
   viii) Dans le cas d'études prévoyant une administration prolongée pendant une certaine période, cette administration devrait être effectuée, de préférence, au moyen d'un seul lot de substance active, si la stabilité de celle-ci le permet.
   Si une étude comporte l'utilisation de doses différentes, la relation entre dose et effet néfaste doit être notée.
   ix) Dans toutes les études d'alimentation, il y a lieu d'indiquer la dose moyenne administrée, voire, si possible, la dose en mg/kg de poids corporel. Lorsque l'administration s'effectue par les rations alimentaires, le composé d'essai doit y être distribué uniformément.
   x) Des études séparées sur les métabolites, les produits de dégradation ou de réaction peuvent s'imposer lorsque ces composés peuvent présenter un risque non négligeable pour les organismes non cibles et que les résultats des études portant sur la substance active ne permettent pas d'évaluer leurs effets. Avant de procéder à ces études, il convient de tenir compte des informations résultant des chapitres 5, 6 et 7.
   Organismes d'essai.
   xi) Pour faciliter l'évaluation de la signification des résultats obtenus, y compris l'estimation de la toxicité intrinsèque et des facteurs influençant la toxicité, il faudrait utiliser, dans la mesure du possible, des individus appartenant à la même souche ou à la même origine certifiée de l'espèce faisant l'objet des différents essais de toxicité.
   8.1 Effets sur les oiseaux.
   8.1.1. Toxicité orale aiguë.
   Objet de l'essai.
   Dans la mesure du possible, l'essai devrait permettre d'établir les valeurs de la DL 50, la dose seuil létale, les temps de réponse et de récupération et le NSEO et doit faire état des observations pathologiques significatives à l'autopsie.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Il est indispensable de rechercher les effets éventuels de la substance active sur les oiseaux, sauf dans les cas où la substance active est destinée exclusivement à l'incorporation dans des préparations à utiliser uniquement dans des espaces clos (tels que des serres ou des entrepôts de denrées alimentaires).
   Conditions de l'essai.
   La toxicité orale aiguë de la substance active pour une espèce de caille (japonaise) (Coturnix coturnix japonica) ou colin de Virginie (Colinus virginianus) ou pour le canard colvert (Anas platyrhynchos) doit être déterminée. La dose maximale utilisée dans les essais ne dépassera pas 2 000 mg/kg de poids corporel.
   Lignes directrices.
   Setac. Procédures d'évaluation du comportement environnemental et de l'écotoxicité des pesticidesSociety of Environmental Toxicology and Chemistry (Setac), 1995. Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides, ISBN 90-5607-002-9.
   8.1.2. Toxicité alimentaire à court terme.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la toxicité alimentaire à court terme (la CL 50, la plus faible concentration létale, si possible la concentration sans effet observé - CSEO -, les temps de réponse et de récupération) et faire état des observations pathologiques significatives à l'autopsie.
   Circonstances où l'essai est requis.
   La toxicité alimentaire (cinq jours) de la substance active pour les oiseaux doit toujours être testée sur une espèce, sauf lorsqu'il est fait état d'une étude réalisée selon les dispositions du point 8.1.3. Lorsque le NSEO oral aigu est m 500 mg/kg de poids corporel ou lorsque la CSEO à court terme est l 500 mg/kg d'aliment, l'essai doit être répété sur une deuxième espèce.
   Conditions de l'essai.
   La première espèce étudiée doit être la caille ou le canard colvert. Si une deuxième espèce doit être testée, elle ne doit pas être apparentée à la première.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être réalisé en conformité avec la méthode 205 de l'OCDE.
   8.1.3. Toxicité subchronique et reproduction.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la toxicité subchronique de la substance active pour les oiseaux ainsi que la toxicité pour leur reproduction.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Il est obligatoire de déterminer la toxicité subchronique ou de reproduction de la substance active pour les oiseaux, sauf s'il est prouvé que l'exposition continue ou répétée des adultes ou l'exposition des sites de nidification pendant la période de reproduction est improbable.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être réalisé en conformité avec la méthode 206 de l'OCDE.
   8.2. Effets sur les organismes aquatiques.
   Les données des essais visés aux points 8.2.1, 8.2.4 et 8.2.6 doivent être soumises pour toutes les substances actives, même s'il n'est pas attendu que les produits phytopharmaceutiques qui la contiennent puissent atteindre les eaux de surface dans les conditions d'emploi proposées. Ces données sont requises en vertu des dispositions de l'annexe VI de la directive 67/548/CEE pour le classement de la substance active.
   Les données rapportées doivent être étayées par des données analytiques sur les concentrations de la substance d'essai dans les milieux d'essai.
   8.2.1. Toxicité aiguë pour les poissons.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la toxicité aiguë (CL 50) et exposer les détails des effets observés.
   Circonstances où l'essai est requis.
   L'essai doit toujours être réalisé.
   Conditions de l'essai.
   La toxicité aiguë de la substance active doit être déterminée pour la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) et pour une espèce de poisson des eaux chaudes. Lorsque des essais doivent être effectués sur les métabolites, les produits de dégradation ou de réaction, l'espèce retenue sera la plus sensible des deux espèces dans l'essai d'exposition à la substance active.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué conformément à l'annexe de la directive 92/69/CEE de la Commission portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives au classement, à l'emballage et à l'étiquetage des substances dangereuses, méthode C 1.
   8.2.2. Toxicité chronique pour les poissons.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Une étude de toxicité chronique doit toujours être effectuée, sauf s'il est prouvé que l'exposition continue ou répétée des poissons est improbable ou que l'on dispose d'une étude adéquate de microcosme ou de mésocosme.
   Un jugement d'expert est nécessaire pour décider des essais à effectuer. En particulier, lorsqu'il s'agit d'une substance active à risques (liés à sa toxicité pour le poisson ou à son exposition potentielle), le demandeur doit soumettre le type d'essai à effectuer à l'agrément des autorités compétentes.
   Un essai de toxicité pour les poissons dans les premières phases de la vie peut être approprié lorsque le FBC est compris entre 100 et 1 000 ou que le CL 50 de la substance active est < 0,1 mg/l.
   Un essai du cycle biologique des poissons peut être approprié :
   - lorsque le facteur de bioconcentration est supérieur à 1 000 et que l'élimination de la substance active au cours d'une phase d'épuration de 14 jours est inférieure à 95 p. 100,
   ou
   - que la substance est stable dans l'eau ou dans le sédiment (DT 90 > 100 jours).
   Les poissons juvéniles ne doivent pas faire l'objet d'un essai de toxicité chronique lorsqu'un essai de toxicité sur les premières phases de la vie ou qu'un essai sur le cycle biologique a été effectué de même, il n'est pas nécessaire de procéder à un essai de toxicité sur les premières phases de la vie lorsqu'un essai sur le cycle biologique a été effectué.
   8.2.2.1. Essai de toxicité chronique pour les poissons juvéniles.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir les effets sur la croissance, le niveau seuil des effets létaux ou des effets observés, la CSEO et les détails des effets observés.
   Conditions de l'essai.
   L'essai doit être pratiqué sur la truite arc-en-ciel juvénile, après une exposition de 28 jours à la substance active. Il doit fournir des informations sur les effets sur la croissance et le comportement.
   8.2.2.2. Essai de toxicité pour les poissons dans les premières phases de la vie.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir les effets sur la croissance, le niveau seuil des effets létaux et des effets observés, la CSEO et les détails des effets observés.
   Directives.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la méthode 210 de l'OCDE.
   8.2.2.3. Essai sur le cycle biologique des poissons.
   Objet de l'essai.
   L'essai permettra d'établir les effets sur la reproduction des générations parentales et sur la viabilité des générations de descendants.
   Conditions de l'essai.
   Le demandeur doit solliciter au préalable l'agrément des autorités compétentes sur la nature et les conditions de l'essai à effectuer.
   8.2.3. Bioconcentration chez le poisson.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir les facteurs de la bioconcentration à l'équilibre (FBC), les constantes des taux d'accumulation et des taux d'élimination, calculés pour chaque substance d'essai, ainsi que les limites de confiance correspondantes.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Le potentiel de bioconcentration des substances actives, des métabolites et des produits de dégradation ou de réaction, susceptibles de se déposer dans les tissus adipeux (tel que le log POE 3 - voir chapitre 2, point 2.8, ou d'autres indications relatives à la bioconcentration), doit être déterminé et rapporté, à moins qu'il ne soit prouvé qu'une exposition entraînant une bioconcentration est improbable.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la méthode 305 E de l'OCDE.
   8.2.4. Toxicité aiguë pour les invertébrés aquatiques.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la toxicité aiguë à 24 et 48 heures de la substance active, exprimée sous forme de concentration médiane effective (CE 50) provoquant l'immobilisation et, si possible, la concentration la plus élevée ne provoquant pas d'immobilisation.
   Circonstances où l'essai est requis.
   La toxicité aiguë doit toujours être déterminée pour Daphnia (de préférence, Daphnia magna). Lorsque des produits phytopharmaceutiques contenant la substance active doivent être utilisés directement dans ou sur des eaux de surface, des données additionnelles doivent être communiquées au sujet d'au moins une espèce représentative de chacun des groupes suivants : insectes aquatiques, crustacés aquatiques (d'une espèce non apparentée à Daphnia) et mollusques aquatiques.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la directive 92/69/CEE, méthode C 2.
   8.2.5. Toxicité chronique pour les invertébrés aquatiques.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir, si possible, les valeurs de la CE 50 concernant des effets tels que l'immobilisation et la reproduction ainsi que la concentration la plus élevée n'ayant aucun effet sur la mortalité ou la reproduction (CSEO) et des détails des effets observés.
   Circonstances où l'essai est requis.
   L'essai sur Daphnia et sur au moins une espèce représentative d'insecte aquatique et une espèce de mollusque gastéropode aquatique est obligatoire à moins qu'il ne soit prouvé qu'une exposition continue ou répétée est improbable.
   Conditions de l'essai.
   L'essai sur Daphnia doit avoir une durée de 21 jours.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la méthode 202 partie II de l'OCDE.
   8.2.6. Effets sur la croissance des algues.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir les valeurs des CE 50 relatives à la croissance et au taux de croissance, les valeurs de la CSEO et les détails des effets observés.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Les effets éventuels de la substance active sur la croissance des algues doivent toujours être consignés.
   Pour les herbicides, l'essai doit être pratiqué sur une seconde espèce d'un autre groupe taxonomique.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la directive 92/69/CEE, méthode C 3.
   8.2.7. Effets sur les organismes vivant dans les sédiments.
   Objet de l'essai.
   L'essai permettra de mesurer les effets sur la survie et le développement (y compris les effets sur la sortie des adultes de l'espèce Chironomus), les valeurs des CE 50 correspondantes et les valeurs des CSEO.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Lorsque les données sur le sort et le comportement dans l'environnement prescrites au chapitre 7 indiquent qu'une substance active risque de se répartir et de persister dans les sédiments aquatiques, un jugement d'expert est nécessaire pour décider s'il faut réaliser un essai de toxicité aiguë ou chronique pour les sédiments. L'avis susmentionné devra établir la probabilité des effets sur les invertébrés vivant dans les sédiments par une comparaison des valeurs des CE 50 relatives à la toxicité pour les invertébrés aquatiques visées aux points 8.2.4 et 8.2.5 avec les niveaux prédits de la substance active dans les sédiments tirés des données visées au chapitre 9 de l'annexe II.
   Conditions de l'essai.
   Le demandeur doit solliciter au préalable l'agrément des autorités compétentes sur la nature et les conditions de l'essai à effectuer.
   8.2.8. Plantes aquatiques.
   Un essai sur les plantes aquatiques doit être effectué pour les herbicides.
   Le demandeur doit solliciter au préalable l'agrément des autorités compétentes sur la nature et les conditions de l'essai à effectuer.
   8.3. Effets sur les arthropodes.
   8.3.1. Abeilles.
   8.3.1.1. Toxicité aiguë.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir les valeurs DL 50 concernant la toxicité aiguë orale ou de contact de la substance active.
   Circonstances où l'essai est requis.
   La détermination de l'impact potentiel sur les abeilles est obligatoire, sauf lorsque les préparations contenant la substance active sont exclusivement destinées à être utilisées dans des situations où l'exposition des abeilles est improbable, à savoir.
   - l'entreposage des denrées alimentaires en espace clos ;
   - le traitement non systémique des semences ;
   - les préparations non systémiques pour l'épandage sur le sol ;
   - les traitements non systémiques par trempage des plants et bulbes repiqués ;
   - les traitements des plaies et des blessures ;
   - les appâts rodenticides ;
   - l'emploi en serre sans pollinisateur.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la directive 170 de l'OEPP.
   8.3.1.2. Essai d'alimentation du couvain d'abeilles.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'obtenir des informations suffisantes pour évaluer les risques éventuels que présente le produit phytopharmaceutique pour les larves d'abeilles.
   Circonstances où l'essai est requis.
   L'essai doit être réalisé lorsque la substance active peut agir comme régulateur de la croissance des insectes, sauf s'il est établi que l'exposition du couvain d'abeilles est improbable.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être réalisé en conformité avec la méthode ICPBR (par exemple : P.A. Comen, A. de Ruijter et J. van der Steen. Method for honeybee brood feeding tests with insect growth-regulating insecticides. Bulletin OEPP, volume 22, 613-616, 1992).
   8.3.2. Autres arthropodes.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'obtenir des informations suffisantes pour évaluer la toxicité (mortalité et effets sublétaux) de la substance active pour certaines espèces d'arthropodes.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Il est obligatoire de déterminer les effets sur les arthropodes terrestres non cibles (par exemple, les prédateurs ou les parasitoïdes des organismes nuisibles). Les renseignements obtenus pour ces espèces peuvent également être utilisés pour indiquer la toxicité potentielle à l'égard d'autres espèces non cibles vivant dans le même environnement. Ces informations sont exigées pour toutes les substances actives, sauf lorsque les préparations contenant la substance active sont destinées exclusivement à être utilisées dans des situations où les arthropodes non cibles ne sont pas exposés, à savoir :
   - l'entreposage de denrées alimentaires en espace clos ;
   - les traitements des plaies et blessures ;
   - les appâts rodenticides.
   Conditions de l'essai.
   L'essai doit d'abord être réalisé en laboratoire sur substrat artificiel (par exemple, plaque de verre ou sable de quartz, selon le cas), sauf si d'autres études révèlent la probabilité d'effets néfastes. Dans ce cas, des substrats plus adaptés peuvent être utilisés.
   Deux espèces types sensibles, un parasitoïde et un acarien prédateur (par exemple, Aphidius rhopalosiphi et Typhlodromus pyri), sont à tester. A celles-là s'ajouteront deux espèces supplémentaires, qui doivent être appropriées à l'utilisation prévue de la substance.
   Dans la mesure du possible et s'il y a lieu, elles représenteront les deux autres grands groupes en cause, les prédateurs vivant dans le sol et les prédateurs vivant dans le feuillage. Si des effets sont observés sur les espèces appropriées à l'utilisation envisagée pour le produit, d'autres essais peuvent être effectués en condition semi-naturelle. La sélection des espèces à soumettre à l'essai sera conforme aux propositions formulées dans le Guidance Document on Regulatory Testing Procedures for Pesticides with Non-Target ArthropodsWorkshop European Standard Characteristics of beneficials Regulatory Testing (ESCORT), 28-30 mars 1994. ISBN 0 9522535 2 6.

 du Setac. Les essais utiliseront des doses équivalentes à la dose la plus élevée des applications recommandées sur le terrain.
   Lignes directrices.
   L'essai devrait être effectué en conformité avec les directives correspondantes qui répondent au moins aux exigences d'essai du Guidance Document on Regulatory Testing Procedures for Pesticides with Non-Target Arthropods du Setac.
   8.4. Effets sur les vers de terre.
   8.4.1. Toxicité aiguë.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la valeur de la CL 50 de la substance active à l'égard des vers de terre et, dans la mesure du possible, la concentration la plus élevée ne provoquant pas de mortalité et la concentration la plus faible provoquant 100 p. 100 de mortalité ; il mentionnera les effets observés sur la morphologie et le comportement.
   Circonstances où l'essai est requis.
   La détermination des effets sur les vers de terre est obligatoire lorsque les préparations contenant la substance active sont appliquées sur le sol ou sont susceptibles de contaminer le sol.
   Lignes directrices.
   L'essai doit être effectué en conformité avec la partie C :

 Toxicité pour les vers de terre. Essai sur sol artificiel de la directive 88/302/CEE de la Commission, portant neuvième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses.
   8.4.2. Effets sublétaux.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'établir la CSEO et les effets sur la croissance, la reproduction et le comportement.
   Circonstances où l'essai est requis.
   Lorsque l'exposition continue ou répétée des vers de terre à la substance active ou à des quantités significatives de métabolites, de produits de dégradation ou de réaction est prévisible, sur la base du mode d'emploi proposé pour les préparations contenant la substance active ou sur la base du comportement et du sort de celle-ci dans le sol (TF 90 > 100 jours), un jugement d'expert est nécessaire pour décider si la détermination des effets sublétaux est utile.
   Conditions de l'essai.
   L'essai doit être réalisé sur Eiusenia foetida.
   8.5. Effets sur les micro-organismes non cibles du sol.
   Objet de l'essai.
   L'essai devrait permettre d'obtenir des données suffisantes pour évaluer l'impact de la substance active sur l'activité microbienne du sol, traduite par la transformation de l'azote et la minéralisation du carbone.
   Circonstances où l'essai est requis.
   L'essai est obligatoire lorsque les préparations contenant la substance active sont appliquées sur le sol ou sont susceptibles de contaminer le sol dans les conditions d'utilisation courante. Dans le cas des substances actives destinées à être utilisées dans des préparations servant à la stérilisation des sols, les études doivent avoir pour objet la détermination des taux de récupération après traitement.
   Conditions de l'essai.
   Les sols utilisés doivent être des sols agricoles fraîchement échantillonnés. Les sites dont ils proviennent ne doivent pas avoir été traités au cours des deux années précédentes par des substances pouvant modifier considérablement la diversité et le niveau des populations microbiennes présentes à un titre autre que de manière transitoire.
   Lignes directrices.
   Setac. Procédures d'évaluation du comportement environnemental et de l'écotoxicité des pesticides.
   8.6. Effets sur d'autres organismes non cibles (flore et faune) supposés être exposés à un risque.
   Il est obligatoire de fournir un résumé des données résultant des essais préliminaires effectués pour évaluer l'activité biologique et les doses exploratrices, qu'elles soient positives ou négatives, de nature à fournir des renseignements sur l'impact éventuel d'autres espèces non cibles (flore et faune) et de les accompagner d'un avis critique sur la pertinence d'un impact potentiel sur les espèces non cibles.
   8.7. Effets sur les méthodes biologiques de traitement des eaux usées.
   Il est obligatoire de déterminer et consigner les effets sur les méthodes biologiques de traitement des eaux usées lorsque l'utilisation de produits phytopharmaceutiques contenant la substance active peut avoir des effets néfastes sur les installations de traitement des eaux usées.