A. - Méthodes
Les méthodes de contrôle et d'interprétation des résultats bactériologiques à adopter pour la vérification de certains critères - micro-organismes aérobies, coliformes fécaux, salmonella - ont été définies par l'arrêté du 21 juin 1982 modifié.
Pour les autres contrôles, les techniques suivantes sont à utiliser.
1. Recherche des streptocoques bêta hémolytiques
1.1. Définition
Sont visés les streptocoques des groupes A, B, C, G et L de Lancefield qui possèdent une hémolysine de type bêta et ne fermentent pas l'esculine dans les conditions opératoires décrites.
1.2. Principe
Ensemencement d'une quantité déterminée de lait cru à la surface d'un milieu sélectif solide coulé dans des boîtes de Petri.
Incubation des boîtes à 37° C pendant trente-six à quarante-huit heures.
Examen des cultures et repiquages des colonies présumées être celles de streptocoques bêta hémolytiques en raison de leurs caractéristiques.
Confirmation par détermination du sérogroupe des colonies à l'aide de méthodes appropriées.
1.3. Milieu gélosé sélectif
1.3.1 Milieu de base :
Utiliser un milieu complet déshydraté dont la composition est la suivante :
- tryptose 10 g
- extrait de viande de boeuf 3 g
- chlorure de sodium 5 g
- agar-agar 15 g
- eau distillée 1.000 ml
Préparation : faire dissoudre le milieu complet en suivant les instructions du fabricant et ajouter par litre :
- esculine 1 g
- acétate de thallium 0,33 g
- citrate de fer en solution à 1/100 5 ml
- cristal violet en solution à 1/1.000 1,3 ml
Si nécessaire, ajuster le pH pour qu'après stérilisation il soit de 7,4 plus ou moins 0,1 à 25° C.
Répartir le milieu à raison de 100 ml dans des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à 115° C pendant vingt minutes.
1.3.2. Sang de mouton :
Utiliser du sang frais de mouton exempt d'antitoxine bêta ou des préparations commerciales, d'hématies de mouton lavées. Dans ce cas, au moment de l'emploi, rétablir la concentration globulaire initiale du sang.
1.3.3. Toxine staphylococcique bêta :
Au moment de l'emploi, diluer la toxine de manière à obtenir une concentration d'environ 1 unité de toxine par ml.
1.3.4 Milieu complet :
Composition :
- milieu de base (voir 1.3.1) 100 ml
- sang de mouton ou globules lavés
(voir 1.3.2) 5 ml
- toxine staphylococcique bêta (voir 1.3.3) 1 ml
Préparation :
Au moment de l'emploi, faire fondre le milieu de base sélectif et le refroidir dans un bain d'eau à 48-50° C. Ajouter le sang de mouton (ou les globules lavés) et la toxine staphylococcique bêta.
Homogénéiser soigneusement avant de couler en boîte de Petri.
1.4. Préparation des boîtes de Petri
Couler environ 10 ml du milieu complet (voir 1.3.4) dans une boîte de Petri de 90-100 mm de diamètre. Il est préférable de préparer le milieu peu de temps avant l'emploi ; cependant, s'il n'est pas utilisé rapidement, les boîtes de Petri peuvent être conservées pendant plusieurs jours même à une température supérieure à 20° C.
Juste avant l'emploi, faire sécher soigneusement les boîtes retournées et couvercle entrouvert à l'étuce à 45-55° C pendant trente minutes jusqu'à disparition des gouttelettes d'eau à la surface du milieu.
1.5. Mode opératoire
Porter 0,1 ml de lait cru à la surface du milieu et étaler l'inoculum à l'aide d'un étaleur en verre stérile.
Faire incuber dans une étuve à 37 plus ou moins 1° C pendant trente-six heures à quarante-huit heures.
1.6. Lecture et interprétation des résultats
Les streptocoques bêta hémolytiques se présentent sous forme de colonies incolores ou légèrement bleutées, non colorées en noir (absence de fermentation de l'esculine) ....
Lorsqu'au moins cinq colonies caractéristiques sont dénombrées, l'échantillon est considéré comme positif, sous réserve de confirmation.
Repiquer ces colonies et les soumettre aux épreuves de confirmation.
Remarque - Lorsque la charge microbienne d'un lait cru est importante, le caractère sélectif du milieu peut être partiellement ou totalement réduit. Dans ce cas, la vérification des critères concernant les coliformes fécaux, les micro-organismes aérobies à 30° C, supplée à la défaillance de cette épreuve.
1.7. Confirmation
A partir de colonies pures, effectuer le test de Camp et le sérogroupage par la technique de Lancefield ou par celle de Fuller.
Note - Les présentations commerciales pour le groupage rapide sur lame des streptocoques bêta hémolytiques, notamment celles comportant une extraction enzymatique, peuvent être également utilisées. En cas de doute, appliquer les techniques de Lancefield ou de Fuller.
2. Stabilité à l'ébullition
Cette épreuve est décrite en annexe III de l'arrêté du 21 juin 1982 modifié.
3. Mesure de l'acidité titrable
Se référer à l'arrêté du 24 août 1983 (Journal officiel du 27 octobre 1983) relatif aux méthodes officielles d'analyses physiques et chimiques du lait.
Remarque - L'utilisation de cette solution conduit à une expression directe du résultat en acide lactique (en g/l).
B. - Périodicité des contrôles
Les responsables d'exploitations où sont produits ou préparés des laits crus visés au présent arrêté doivent faire effectuer des contrôles réguliers de leur production. Outre la numération cellulaire, ce contrôle comprend à la date de conditionnement (ou de production pour le lait cru non conditionné en emballages individuels) et à la date limite de consommation, si l'épreuve de stabilité est satisfaisante, la vérification des critères microbiologiques suivants : micro-organismes aérobies, coliformes fécaux. La mesure de l'acidité sera, par ailleurs, réalisée. Les recherches relatives aux streptocoques bêta hémolytiques et aux Salmonella seront effectuées chaque trimestre.
En cas d'infection de la mamelle, l'ensemble des interventions thérapeutiques doit être porté par le vétérinaire traitant sur le cahier d'étable prévu à cet effet. La commercialisation du lait provenant d'animaux qui ont été atteints d'une infection de la mamelle ne peut intervenir qu'après que les contrôles ont apporté la preuve du respect des critères fixés à l'annexe I.