« HÉPARINE SODIQUE
Heparinum natricum
Définition
 Préparation contenant le sel sodique d'un glycosaminoglycane sulfaté présent dans les tissus de mammifères. L'héparine sodique peut être préparée soit à partir de poumon de bœuf, soit à partir de muqueuse intestinale soit de porc, soit de bœuf, soit de mouton. Par hydrolyse complète, l'héparine sodique libère de la d-glucosamine, de l'acide d-glucuronique, de l'acide l-iduronique, de l'acide acétique et de l'acide sulfurique. Elle possède la propriété de retarder la coagulation du sang.
 Activité : au minimum 180 UI/mg (substance desséchée).
Production
 Les animaux à partir desquels l'héparine sodique est obtenue répondent aux exigences de santé pour les animaux destinés à la consommation humaine. Toutes les étapes de la production et de l'approvisionnement sont soumises à l'application d'un système de management de la qualité approprié. L'identité de l'espèce source et l'absence de matériel provenant des autres espèces sont vérifiées lors de la production, au moyen d'essais appropriés.
 L'héparine sodique est produite par des méthodes permettant de réduire ou d'éliminer les substances hypotensives.
Caractères
 Aspect : poudre blanche ou sensiblement blanche, hygroscopique.
 Solubilité : facilement soluble dans l'eau.
Identification
 A. ― L'héparine sodique retarde la coagulation du plasma de mouton citraté et recalcifié (voir Titrage).
 B. ― Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (2.2.33).
 Solution A. Solution dans de l'oxyde de deutérium R contenant 20 µg/ml de triméthylsilylpropionate de sodium deutérié R et, si le signal à 5,22 ppm est inférieur à 80 % du signal à 5,44 ppm, 12 µg/ml d'édétate de sodium R.
 Préparation : dissolvez 20 mg d'héparine sodique dans 0,7 ml de solution A.
 Comparaison : dissolvez 20 mg d'héparine sodique pour identification RMN SCR dans 0,7 ml de solution A.
 Si elles sont stockées, les solutions d'édétate de sodium et de triméthylsilylpropionate de sodium deutérié doivent être conservées dans des bouteilles de polyéthylène naturel de haute densité.
 Appareillage : spectromètre opérant au minimum à 300 MHz.
 Acquisition des spectres RMN ¹H :
 ― nombre d'impulsions : au minimum 16 ; ajustez ce nombre de façon à obtenir un rapport signal/bruit d'au moins 1 000 : 1 pour le signal méthyle de l'héparine à 2,04 ppm ;
 ― température : environ 25 °C ; les spectres de l'échantillon à examiner et de la substance de référence sont enregistrés à la même température ;
 ― temps d'acquisition : au minimum 2 s ;
 ― temps de répétition (acquisition plus relaxation) : au minimum 4 s ;
 ― largeur spectrale : 10-12 ppm, centrée sur environ 4,5 ppm ;
 ― largeur d'impulsion : donnant un angle de basculement compris entre 30° et 90°.
 Traitement :
 ― fenêtre exponentielle décroissante : 0,3 Hz ; 
 ― transformée de Fourier ; 
 ― réglage du 0,00 ppm : avec le signal de référence du triméthylsilylpropionate.
 Résultats :
 ― les principaux signaux caractéristiques de l'héparine sodique sont présents ; ils sont respectivement situés à 2,04 ppm, 3,27 ppm (doublet), 4,34 ppm, 5,22 ppm et 5,42 ppm, à ± 0,03 ppm près ;
 ― le spectre RMN ¹H obtenu avec l'échantillon à examiner et celui obtenu avec l'héparine sodique pour identification RMN SCR sont comparés qualitativement après que les 2 spectres ont été normalisés de façon à avoir une intensité semblable. Du sulfate de dermatan, avec un signal méthyle à 2,08 ± 0,02 ppm, peut être présent. Aucun signal non identifié de hauteur supérieure à 4 % de la hauteur du signal de l'héparine situé à 5,42 ppm n'est observé dans les plages 0,10-2,00 ppm, 2, 10-3,10 ppm et 5,70-8,00 ppm. Des signaux dus au solvant ou à des impuretés liées au processus peuvent être présents, et doivent être identifiés pour être acceptables. Le signal peut être d'intensité variable dans certaines régions du spectre. Ces régions, où l'allure du spectre est sensiblement conservée mais avec des variations d'intensité, se situent entre 3,35 ppm et 4,55 ppm.
 C. ― Chromatographie liquide (2.2.29) selon les indications de l'essai des substances apparentées, avec les modifications suivantes.
 Injection : solution à examiner (a) et solution témoin (c).
 Rétention relative par rapport à l'héparine (temps de rétention = environ 26 min) : sulfate de dermatan et sulfate de chondroïtine = environ 0,9 ; chondroïtine persulfatée = environ 1,3.
 Conformité du système : solution témoin (c) :
 ― rapport pic/vallée : au minimum 1,3, avec Hp = hauteur au-dessus de la ligne de base du pic dû au sulfate de dermatan + sulfate de chondroïtine et Hv = hauteur au-dessus de la ligne de base du point le plus bas du tracé entre ce pic et celui dû à l'héparine.
 Résultats : le pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner (a) est semblable quant à son temps de rétention et sa forme au pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (c).
 D. ― Sodium (voir Essai).
Essai
 Aspect de la solution. La solution est limpide (2.2.1) et n'est pas plus fortement colorée que la solution de degré 5 de la gamme des solutions témoins présentant la coloration la plus appropriée (2.2.2, procédé II).
 Dissolvez une quantité d'héparine sodique correspondant à 50 000 UI dans de l'eau R et complétez à 10 ml avec le même solvant.
 pH (2.2.3) : 5,5 à 8,0.
 Dissolvez 0,1 g d'héparine sodique dans de l'eau exempte de dioxyde de carbone R et complétez à 10 ml avec le même solvant.
 Impuretés nucléotidiques. Dissolvez 40 mg d'héparine sodique dans 10 ml d'eau R.
 L'absorbance (2.2.25) mesurée à 260 nm n'est pas supérieure à 0,15.
 Protéines : au maximum 0,5 % (substance desséchée).
 Solution A. Mélangez 2 volumes d'une solution d'hydroxyde de sodium R à 10 g/l et 2 volumes d'une solution de carbonate de sodium R à 50 g/l et complétez à 5 volumes avec de l'eau R.
 Solution B. Mélangez 2 volumes d'une solution de sulfate de cuivre R à 12,5 g/l et 2 volumes d'une solution de tartrate de sodium R à 29,8 g/l et complétez à 5 volumes avec de l'eau R.
 Solution C. Mélangez 1 volume de solution B et 50 volumes de solution A.
 Solution D. Préparez une dilution au 1/2-1/4 d'un réactif phosphomolybdotungstique dans de l'eau R. Des dilutions appropriées permettent d'obtenir des solutions à pH 10,25 ± 0,25 après addition des solutions C et D aux solutions témoins et à examiner.
 Solution à examiner. Dissolvez la substance à examiner dans de l'eau R pour obtenir une concentration de 5 mg/ml.
 Solutions témoins. Dissolvez de l'albumine bovine R dans de l'eau R pour obtenir une concentration de 100 mg/ml. Préparez différentes dilutions de cette solution dans de l'eau R selon les indications données dans le chapitre général 2.5.33, méthode 2.
 Solution à blanc : eau R.
 Procédure. A1 ml de chaque solution témoin, de la solution à examiner et de la solution à blanc, ajoutez 5 ml de solution C. Laissez reposer pendant 10 min. Ajoutez 0,5 ml de solution D, mélangez et laissez reposer à température ambiante pendant 30 min. Déterminez les absorbances (2.2.25) des solutions à 750 nm, en utilisant la solution préparée à partir de la solution à blanc comme liquide de compensation.
 Calculs. Selon les indications données dans le chapitre général 2.5.33, méthode 2.
 Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). Les solutions témoins sont stables pendant 24 h à température ambiante.
 Solution à examiner (a). Dissolvez environ 50 mg d'héparine sodique, exactement pesés, dans 5,0 ml d'eau pour chromatographie R. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète.
 Solution à examiner (b). Dissolvez environ 0,1 g d'héparine sodique, exactement pesé, dans 1,0 ml d'eau pour chromatographie R. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète. Mélangez 500 µl de solution avec 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis ajoutez 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
 Solution témoin (a). Dissolvez 250 mg d'héparine pour analyse physicochimique SCR dans de l'eau pour chromatographie R et complétez à 2,0 ml avec le même solvant. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète.
 Solution témoin (b). Ajoutez 1 200 µl de solution témoin (a) à 300 µl de sulfate de dermatan et chondroïtine persulfatée SCR. Homogénéisez à l'aide d'un mélangeur de type vortex.
 Solution témoin (c). Ajoutez 100 µl de solution témoin (b) à 900 µl d'eau pour chromatographie R. Homogénéisez à l'aide d'un mélangeur de type vortex.
 Solution témoin (d). Ajoutez 400 µl de solution témoin (a) à 100 µl d'eau pour chromatographie R et mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex. Ajoutez 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
 Solution témoin (e). A 500 µl de solution témoin (b), ajoutez 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
 Précolonne :
 ― dimensions : l = 0,05 m, Ø = 2 mm ; 
 ― phase stationnaire : résine échangeuse d'anions R (13 m).
 Colonne :
 ― dimensions : l = 0,25 m, Ø = 2 mm ; 
 ― phase stationnaire : résine échangeuse d'anions R (9 m) ;
 ― température : 40 °C.
 Phase mobile :
 ― phase mobile A : dissolvez 0,40 g de phosphate monosodique R dans 1 l d'eau pour chromatographie R et ajustez à pH 3,0 avec de l'acide phosphorique dilué R ;
 ― phase mobile B : dissolvez 0,40 g de phosphate monosodique R dans 1 l d'eau pour chromatographie R ; ajoutez 140 g de perchlorate de sodium R, puis ajustez à pH 3,0 avec de l'acide phosphorique dilué R ; filtrez et dégazez ;
INTERVALLE
(min)
PHASE MOBILE A
(pour cent V/V)
PHASE MOBILE B
(pour cent V/V)
0 ― 10
75
25
10 ― 35
75  0
25  100
35 ― 40
0
100
 Débit : 0,22 ml/min.
 Détection : spectrophotomètre à 202 nm.
 Equilibrage : au moins 15 min.
 Injection : 20 µl de solution à examiner (b) et des solutions témoins (d) et (e).
 Rétention relative par rapport à l'héparine (temps de rétention = environ 26 min) : sulfate de dermatan et sulfate de chondroïtine = environ 0,9 ; chondroïtine persulfatée = environ 1,3.
 Conformité du système :
 ― le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (d) ne présente pas de pic au temps de rétention de l'héparine ; 
 ― résolution : au minimum 3,0 entre les pics dus au sulfate de dermatan + sulfate de chondroïtine et à la chondroïtine persulfatée dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (e).
 Limites :
 ― somme du sulfate de dermatan et du sulfate de chondroïtine : au maximum la surface du pic correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (e) (2,0 %) ; 
 ― toute autre impureté : aucun autre pic que celui dû au sulfate de dermatan + sulfate de chondroïtine n'est détecté.
 Azote (2.5.9) : 1,5 % à 2,5 % (substance desséchée), déterminé sur 0,100 g d'héparine sodique.
 Sodium : 9,5 % à 12,5 % (substance desséchée).
 Spectrométrie d'absorption atomique (2.2.23, procédé I).
 Solution à examiner. Dissolvez 50 mg d'héparine sodique dans une solution de chlorure de césium R à 1,27 mg/ml dans de l'acide chlorhydrique 0,1 M et complétez à 100,0 ml avec le même solvant.
 Solutions de référence. Préparez des solutions de référence (25 ppm, 50 ppm et 75 ppm) à partir de la solution à 200 ppm de sodium (Na) R, diluée avec une solution de chlorure de césium R à 1,27 mg/ml dans de l'acide chlorhydrique 0,1 M.
 Source : lampe à cathode creuse au sodium.
 Longueur d'onde : 330,3 nm.
 Dispositif d'atomisation : flamme de composition appropriée (par exemple 11 l d'air pour 2 l d'acétylène par minute).
 Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 30 ppm.
 1,0 g d'héparine sodique satisfait à l'essai F. Préparez la solution témoin avec 3,0 ml de solution à 10 ppm de plomb (Pb) R.
 Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 8,0 %, déterminé à 60 °C sur du pentoxyde de diphosphore R sous une pression ne dépassant pas 670 Pa pendant 3 h sur 1,000 g d'héparine sodique.
 Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 0,01 UI par unité internationale d'héparine, si l'héparine sodique est destinée à la fabrication de préparations parentérales sans autre procédé approprié d'élimination des endotoxines bactériennes.
Titrage
 Effectuez le titrage de l'héparine (2.7.5). L'activité mesurée n'est pas inférieure à 90 %, ni supérieure à 111 % de l'activité indiquée. Les limites de confiance (P = 0,95) de l'activité mesurée ne sont pas inférieures à 80 %, ni supérieures à 125 % de l'activité indiquée.
Conservation
 En récipient étanche. Si la substance est stérile, elle est conservée en récipient stérile, étanche, à fermeture inviolable.
Etiquetage
 L'étiquette indique :
 ― le nombre d'unités internationales d'héparine par milligramme ; 
 ― l'espèce animale d'origine ; 
 ― dans les cas appropriés, que la substance convient à la fabrication de préparations parentérales.
Réactifs
 Sodium (triméthylsilylpropionate de) deutérié. C6H9²NaO2Si. (Mr 172,3). [24493-21-8].
 3-(Triméthylsilyl)(2,2,3,3-2H4)propionate de sodium. TSP-d4.
 Degré de deutériation : au minimum 98 %.
 Poudre blanche ou sensiblement blanche. »