TABLEAU 1
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                        Vous pouvez consulter le tableau                        dans le JO no 0146 du 25/06/94                        Page 9191   a 9199    
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      Ajoutez 1,0 ml de la suspension à 5 p. 100 d'érythrocytes de mouton à chaque     tube de la série de dilutions d'hémolysine à partir de la dilution 1: 75 et     mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 30 minutes.
      Transférez 0,2 ml de chaque mélange de dilution d'hémolysine à de nouveaux     tubes et ajoutez 1,10 ml de solution tampon gélatine-barbital et 0,2 ml d'une     dilution de complément de cobaye (par exemple 1: 150). Effectuez ces     opérations en double.
      Préparez 3 tubes témoins de cellules sans hémolyse avec 1,4 ml de solution     tampon gélatine-barbital et 0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton     à 5 p. 100.
      Préparez 3 tubes témoins de cellules à hémolyse totale avec 1,4 ml d'eau et     0,1 ml de la suspension d'érythrocytes de mouton à 5 p. 100.
      Faites incuber tous les tubes à 37 oC pendant 60 minutes et centrifugez à 1     000 g pendant 5 minutes.
      Mesurez l'absorbance (V.6.19) de chaque liquide surnageant à 541 nm et     calculez le degré d'hémolyse de chaque tube à l'aide de l'expression:
    Aa - A1  x 100
    Aa - A1
    Ab - A1
      Ab = la moyenne de l'absorbance des trois tubes avec hémolyse totale.
      Al = la moyenne de l'absorbance des trois tubes sans hémolyse.
      Construisez une courbe sur papier graphique linéaire en portant le degré     d'hémolyse (p. 100) en ordonnée et l'inverse de la dilution d'hémolysine en     abscisse. La dilution optimale de l'hémolysine est déterminée à partir du     graphique, en choisissant une dilution telle qu'une augmentation de la     quantité d'hémolysine ne produit pas de variation sensible du degré     d'hémolyse. Cette dilution est considérée comme contenant 1 unité d'hémolyse     minimale (1 UHM) dans 1,0 ml. Pour la préparation des érythrocytes de mouton     sensibilisés, la dilution d'hémolysine à hémolyse optimale contient 2 UHM par     millilitre.
      Le titrage de l'hémolysine n'est valable que si l'hémolyse maximale se situe     entre 50 p. 100 et 70 p. 100. Sinon, répétez le titrage en utilisant une     solution de complément plus ou moins diluée.
      Préparation des érythrocytes de mouton sensibilisés de façon optimale     (système hémolytique).
      Préparez une quantité appropriée d'hémolysine diluée contenant 2 UHM/ml.
     Préparez un volume égal de suspension standardisée d'érythrocytes de mouton à     5 p. 100. Ajoutez la dilution d'hémolysine à la suspension standardisée de     cellules et mélangez. Faites incuber à 37 oC pendant 15 minutes; conservez au     réfrigérateur à 2-8 oC et utilisez dans les 6 heures.
      Titrage du complément.
      Préparez une dilution appropriée de complément (par exemple 1: 250) avec la     solution tampon gélatine-barbital et effectuez le titrage en double selon le     tableau 2.
      Ajoutez 0,2 ml d'érythrocytes de mouton sensibilisés à chaque tube, mélangez     et faites incuber à 37 oC pendant 60 minutes. Refroidissez les tubes dans un     bain de glace et centrifugez à 1 000 g pendant 5 minutes. Mesurez     l'absorbance du surnageant à 541 nm et calculez le degré d'hémolyse (Y) à     l'aide de l'expression:
    Ac - A1
    Ab - A1
      Ab = moyenne de l'absorbance des tubes à 100 p. 100 d'hémolyse.
      Al = moyenne de l'absorbance des tubes à 0 p. 100 d'hémolyse.