A N N E X E V
    METHODE OFFICIELLE D'EVALUATION DU POTENTIEL IRRITANT PAR DETERMINATION DE LA CYTOTOXICITE APRES DIFFUSION EN GEL D'AGAROSE
    Objectif et principe
    Cette méthode est une alternative à l'expérimentation animale entrant dans une batterie de tests qui concourent à l'évaluation du potentiel irritant oculaire des produits cosmétiques.
    Le principe est basé sur la détermination de la cytotoxicité d'un produit, vingt-quatre heures après son application à la surface d'un gel d'agarose en contact avec une monocouche cellulaire.
    Le paramètre de l'appréciation retenu est le diamètre moyen de la plage de lyse cellulaire révélée par coloration. Celui-ci reflète la cytotoxicité du produit à l'essai et est lié à sa capacité de diffusion dans le gel d'agarose.
    Système réactif
    Fibroblastes de poumon de souris, de lignée NCTC L 929 (ATCC - CCL 1 - American Type Culture Collection - Rockville, Maryland, USA) cultivés en milieu (D)MEM, additionné de 10 % de sérum de veau foetal (décomplémenté à 56 oC pendant trente minutes), d'antibiotiques et de L-glutamine. Les cellules sont maintenues en atmosphère humide contrôlée (37 oC - 5% CO2).
    Matériel
    (liste indicative)
    Balance précise au mg.
    Hotte à flux laminaire vertical.
    Incubateur à CO2 - 37 oC - 5 % CO2 - Hygrométrie  90 %.
    Microscope inversé.
    Système de numération de cellules.
    Bain-marie thermostaté.
    Pipettes stériles (25, 10, 5, 2, 1 ml).
    Tubes stériles gradués de 50 ml et de 15 ml.
    Boîtes de Pétri de 50 mm de diamètre.
    Paire de pinces fines.
    Petite spatule à bout rond.
    Disques de papier filtre en cellulose stériles de 6 mm de diamètre (non imprégnés type antibiogramme).
    Chronomètre.
    Micropipette à piston (25 micro l).
    Règle graduée ou papier millimétré.
    Réactifs
    Agarose à faible température de gélification (inférieure ou égale à 31 C).
    Milieu de culture nutritif - (D) MEM liquide 1X.
    Sérum de veau foetal - SVF.
    Solution de pénicilline 10 000 UI/ml plus streptomycine 10 000 micro g/ml ou équivalent : gentamycine 10 mg/ml.
    (Trypsine - EDTA) 1X.
    L-Glutamine 200 mM dans le milieu de culture.
    PBS (phosphate Buffer Saline Solution) avec ou sans Ca++ et Mg++.
    Solution de MTT, bromure de (3-4,5-diméthylthiazole-2-yl-2,5-diphényltétrazolium) à 0,5 mg par ml dans le milieu de culture.
    Solution de rouge neutre (Colour Index : 50040) à 0,05 mg/ml dans le milieu de culture.
    Solution aqueuse de Bleu de Méthylène/Eosine (Giemsa à 10 %).
    Eau distillée stérile.
    Solution aqueuse de dodécyl sulfate de sodium à 0,01 ; 0,05 et 0,2 % (m/m) (SDS).
    Acide acétique glacial.
    Ethanol 50 .
    Protocole expérimental
    Pour chaque produit à l'essai, deux essais indépendants sont effectués en double (au total quatre boîtes de Pétri).
    Ensemencement des cellules (J-1)
    Les cellules sont trypsinées et comptées conformément aux procédures internes au laboratoire d'essais. Les cellules sont ensuite ensemencées à raison de 2 millions de cellules sous un volume de 4 ml de milieu (D) MEM complet par boîte de Pétri de 50 mm de diamètre. Les boîtes sont placées 24 heures ý 1 heure à l'incubateur (37 C - 5 % CO2 avant le coulage du gel d'agarose.
    Préparation du gel d'agarose (J0)
    Une solution à 1 % d'agarose dans le milieu de culture complet 1 X est préparée selon les techniques propres au laboratoire de culture cellulaire.
    Mise en contact du gel avec les cellules (J0)
    Après élimination par retournement ou aspiration du milieu de culture, 4 ml de la solution d'agarose à 1 % (à une température voisine de 37 oC) sont déposés dans chaque boîte de Pétri. Après une dizaine de minutes d'attente sous la hotte à flux laminaire pour laisser le gel d'agarose se solidifier, les boîtes sont placées à l'incubateur à 37 oC - 5 % CO2 environ trente minutes. Ce délai permet une stabilisation du système réactif.
    Contact avec le produit à l'étude (J0)
    Un disque de papier filtre de 6 mm de diamètre est déposé au centre de la boîte, à la surface du gel d'agarose. Dix microlitres de produit à l'étude prélevés à la micropipette (produit liquide) ou 10 mg (produit solide ou semi-liquide) sont déposés délicatement à la surface du disque.
    Révélation de la cytotoxicité (J + 1)
    Après 24 heures ý 1 heure de contact à l'incubateur à 37 C - 5 % CO2, le gel d'agarose et le disque imprégné de produit sont retirés délicatement à l'aide d'une pince fine ou d'une spatule, en prenant soin de ne pas endommager le tapis cellulaire.
    Un rinçage est ensuite réalisé, en prenant soin de ne pas endommager les cellules, avec 2 ml de PBS (préalablement chauffé à 37 C) à l'aide d'une pipette, puis 2 ml de solution d'un des colorants sont ajoutés.
    A titre indicatif, l'une des solutions suivantes peut être utilisée :
    - solution à 0,5 mg/ml de MTT, bromure de (3-4,5 diméthylthiazole-2-yl-2,5-diphényltétrazolium) dans le milieu de culture. Contact : 1 heure ý 30 minutes ;
    - solution de rouge neutre à 0,05 mg/ml dans le milieu de culture. Contact : 3 heures ý 30 minutes ;
    - solution aqueuse de Bleu de Méthylène-Eosine (Giemsa à 10 %). Contact : 15 minutes ý 5 minutes.
    Les boîtes sont remises à l'incubateur à 37 C - 5 % CO2 sauf pour la coloration au Giemsa qui se fait à température ambiante.
    Après contact, le colorant est éliminé par retournement ou aspiration (et éventuellement lavage avec deux fois deux millilitres de PBS) et la boîte est mise à sécher à l'air libre après retournement.
    La coloration de Giemsa présente l'avantage de permettre la conservation des boîtes après une étape de fixation pendant 15 minutes ý 5 minutes avec une solution à 1 % (v/v) d'acide acétique glacial dans l'éthanol à 50 , suivie d'un rinçage à l'eau courante.
    Expression et interprétation des résultats
    Après coloration des cellules, une plage non colorée (zone de lyse) peut apparaître au centre de la boîte. Le plus grand et le plus petit diamètre de cette zone, estimés à l'oeil, sont mesurés et le diamètre moyen (DM) est calculé. En cas de lyse irrégulière l'expérimentateur doit valider l'observation.
    Pour le produit à l'étude, la réponse est la moyenne arithmétique des diamètres moyens mesurés sur les quatre boîtes. Cette valeur est exprimée en centimètres avec une décimale. La cytotoxicité du produit est donnée par l'échelle suivante :
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    Vous pouvez consulter le tableau dans le JO
    n° 302 du 30/12/1999 page 19817 à 19820
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    L'expérimentateur appréciera le potentiel irritant du produit à l'essai par comparaison aux données acquises pour des produits de même catégorie et de même forme galénique.
    Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonnes pratiques de laboratoire (BPL).
    Remarques importantes
    De façon à vérifier la validité de l'essai, il est conseillé de procéder systématiquement à des contrôles à l'aide des témoins suivants :
    - témoin négatif : milieu de culture complet ;
    - témoin positif : solution de SDS à 3 %.
    Les témoins doivent être classés correctement, cytotoxicité faible pour le témoin négatif et cytotoxicité modérée pour le témoin positif.
    Limites du système
    Cette méthode permet de tester des produits tels quels, hydrodispersibles et hydrophiles.
    Cette méthode n'est pas adaptée aux produits volatils ou contenant des substances volatiles ou présentant des pH extrêmes.
    A N N E X E V I
    METHODE OFFICIELLE D'EVALUATION DU POTENTIEL IRRITANT PAR APPLICATION DIRECTE SUR MONOCOUCHE DE FIBROBLASTES DE CORNEE DE LAPIN PAR LA METHODE DE RELARGAGE DU ROUGE NEUTRE
    Objectif et principe
    Cette méthode est une alternative à l'expérimentation animale entrant dans une batterie de tests qui concourent à l'évaluation du potentiel irritant oculaire des produits cosmétiques.
    Le principe est basé sur l'évaluation de la cytotoxicité du produit testé, par détermination de la concentration entraînant 50 % de mortalité (CI 50), à l'aide de la technique de relargage du rouge neutre.
    Système réactif
    Fibroblastes de cornée de lapin, de lignée SIRC cat no 2-552 (ATCC - CCL 60 - American Type Culture Collection - Rockville, Maryland, USA) cultivés en milieu (D) MEM, additionné de 10 % de sérum de veau foetal (décomplémenté à 56 oC pendant 30 minutes), d'antibiotiques et de L-glutamine. Les cellules sont maintenues en atmosphère humide contrôlée (37 oC - 5 % CO2).
    Matériel
    (liste indicative)
    Balance précise en mg.
    Hotte à flux laminaire vertical.
    Microscope inversé.
    Incubateur à CO2 - 37 o C - 5 % CO2 - Hygrométrie  90 %.
    Système de numération de cellules.
    Lecteur de microplaques automatique.
    Micropipettes de 5 ml, 1 000 micro l, 200 micro l.
    Embouts pour micropipettes 5 ml, 1 000 micro l, 200 micro l.
    Microplaques 24 puits pour culture cellulaire.
    Microplaques 96 puits non stériles.
    Chronomètre.
    Agitateur pour microplaques.
    Réactifs
    Solution de rouge neutre (Colour Index : 50040) à 0,05 mg/ml dans le milieu de culture.
    Milieu de culture nutritif - (D) MEM liquide 1X.
    Sérum de veau foetal - SVF.
    Tampon phosphate : PBS (Phosphate Buffer Saline Solution) avec ou sans Ca++ et Mg++.
    Acide acétique glacial.
    Ethanol 50 o.
    Solution de pénicilline 10 000 UI/ml, plus streptomycine 10 000 micro g/ml ou équivalent : gentamycine 10 mg/ml.
    L-Glutamine 200 mM dans le milieu de culture.
    Eau distillée stérile.
    Diluant hydrophile : chlorure de sodium à 0,9 %.
    Diluant lipophile (huile minérale).
    Solution aqueuse de dodécyl sulfate de sodium à 0,01 ; 0,05 et 0,2 % (m/m) (SDS).
    Protocole expérimental
    Préparation des dilutions du produit à tester
    Les dilutions du produit à l'essai sont faites extemporanément en poids/poids et réalisées avec du chlorure de sodium à 0,9 % pour les produits hydrophiles et dans un diluant lipophile pour les produits hydrophobes.
    Deux étapes sont nécessaires à la classification du produit. La première permet d'estimer la valeur de la CI 50 et la seconde de la préciser.
    Première étape (estimation de la CI 50) :
    Le produit est dilué à : 5, 15, 25, 35 et 50 %. Les dilutions 5, 15, 25 et 35 % sont testées une fois et la dilution 50 % deux fois.
    Deuxième étape (détermination de la CI 50) :
    Le choix des dilutions à tester deux fois dans cette étape dépend de l'estimation faite à l'étape précédente. Le tableau ci-dessous présente la démarche à suivre.
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    Vous pouvez consulter le tableau dans le JO
    n° 302 du 30/12/1999 page 19817 à 19820
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    Cas particulier
    Si les dilutions imposées de la deuxième étape ne permettent pas la détermination de la CI 50, une dilution supplémentaire sera utilisée deux fois sur la même microplaque. Cette dilution sera égale à + ou - 5 % des bornes minimales ou maximales imposées.
    Exemple :
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    Vous pouvez consulter le tableau dans le JO
    n° 302 du 30/12/1999 page 19817 à 19820
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    Chronologie expérimentale (quelle que soit l'étape)
    La veille de l'essai
    Ensemencement des cellules
    Les cellules sont trypsinées et comptées conformément aux procédures internes au laboratoire d'essais. Les cellules sont ensuite ensemencées en microplaque de 24 puits, à raison de 200 000 cellules par puits sous un volume de 1 ml de milieu (D) MEM complet, sans agitation. la plaque est placée au moins 24 heures à l'incubateur (37 oC - 5 % CO2).
    Préparation de la solution colorante
    Une solution mère de rouge neutre à 0,4 % dans de l'eau distillée stérile est préparée et diluée au 1/80 dans du milieu de culture complet puis mise à l'incubateur dix-huit à vingt-quatre heures (37 oC - 5 % CO2).
    Préparation de la solution de révélation
    Une solution à 1 % d'acide acétique glacial dans l'éthanol à 50 o est préparée. Cette solution se conserve plusieurs semaines.
    Le jour de l'essai
    Coloration cellulaire
    Vingt-quatre heures après l'ensemencement, le milieu de culture de chaque puits est éliminé. La solution colorante de rouge neutre, après centrifugation à 3 000 g pendant dix minutes, est déposée à raison de 1 ml par puits. La plaque est placée trois heures à l'incubateur (37 oC - 5 % CO2).
    Après ce temps de contact, la solution colorante est éliminée et remplacée par 1 ml de milieu de culture complet, par puits. La microplaque est maintenue à température ambiante pendant 30 mn avant de mettre en contact avec le produit à l'essai.
    Contact avec le produit à l'essai
    Chaque puits est préalablement rincé avec 2 ml de PBS maintenu à température ambiante, avant d'être traité à raison de 500 micro l par dilution du produit à l'essai.
    Le temps de contact est de 60 secondes ou de 30 secondes pour les tensioactifs et les formulations contenant plus de 10 % de tensioactifs en matière active (ex. : gels douche, shampooings, crèmes à raser, gels démaquillants visage, mousses à raser, etc.)
    Le chronomètre est déclenché au moment du dépôt et la microplaque est agitée manuellement pendant toute la durée du traitement.
    Compte tenu du temps de contact très court, il est conseillé d'effectuer cette opération puits après puits.
    Rinçage
    Après 55 ou 25 secondes (*) de contact, la dilution testée est aspirée. A 60 secondes ou 30 secondes (*) précises, 5 rinçages successifs sont effectués (5 x 2 ml de PBS maintenus à température ambiante).
    Les rinçages sont pratiqués verticalement, de la hauteur du puits, en employant une micropipette et un embout dont l'orifice d'ouverture est de 3 mm de diamètre.
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    Vous pouvez consulter le cliché dans le JO
    n° 302 du 30/12/1999 page 19817 à 19820
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    Le surnageant est aspiré après chaque rinçage. Après le dernier rinçage, les puits restent dépourvus de milieu en attendant la phase de révélation. Il est possible d'effectuer plus de 5 rinçages pour éliminer totalement les traces de produit, à condition de pratiquer la même manipulation sur les puits témoins.
    Révélation de la cytotoxicité
    Après traitement complet de la microplaque, 1 ml par puits de la solution de révélation (acide acétique à 1 % dans l'éthanol à 50o) est déposé. La microplaque est agitée modérément pendant 15 minutes.
    Lecture
    Les solutions révélées sont réparties dans une microplaque de 96 puits à raison de 200 micro l/puits. La lecture de la densité optique est réalisée à 540 nm contre le blanc (solution de révélation), sur un lecteur de microplaques.
    Expression et interprétation des résultats
    On obtient une valeur de densité optique (DO) par puits. Le pourcentage de mortalité cellulaire est calculé pour chaque dilution de produit à l'essai selon la formule :
    DO moyenne des puits traités
    % mortalité = 100 - 
    x 100
    DO moyenne des puits témoins
    La courbe du pourcentage de mortalité cellulaire en fonction de la concentration en produit à l'essai est tracée. La CI 50 du produit à l'essai est alors calculée par analyse de régression linéaire. La cytotoxicité du produit est donnée par l'échelle suivante :
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    Vous pouvez consulter le tableau dans le JO
    n° 302 du 30/12/1999 page 19817 à 19820
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    L'expérimentateur appréciera le potentiel irritant du produit à l'essai par comparaison aux données acquises sur des produits de même catégorie et de même forme galénique.
    Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonnes pratiques de laboratoire (BPL).
    Remarques importantes
    De façon à vérifier la validité de l'essai, il est conseillé de procéder systématiquement à des contrôles à l'aide des témoins suivants :
    - témoin négatif : diluant hydrophile ou éventuellement lipophile (temps de contact 60 secondes) ;
    - témoin positif : solution de SDS à 0,01 % ; 0,05 % et 0,2 % (temps de contact 30 secondes).
    Trois conditions doivent impérativement être réunies pour classer définitivement le produit à l'essai :
    La CI 50 estimée lors de la première étape doit obligatoirement s'intercaler dans les trois dilutions imposées de la deuxième étape (sauf cas particulier) ;
    Une réponse de type effet/dose doit être observée pour les produits présentant une cytotoxicité modérée ou importante. Les produits de cytotoxicité négligeable ou peu importante peuvent présenter des réponses en plateau ;
    Les témoins doivent être classés correctement :
    - cytotoxicité négligeable pour le témoin négatif ;
    - cytotoxicité importante pour le témoin positif SDS CI 50 entre 0,01 et 0,2 %.
    Limites du système
    Cette méthode est utilisable pour tous types de formulations, sauf les formulations ayant des propriétés fixantes en raison d'interactions avec le relargage du rouge neutre.
    Cette méthode peut provoquer une surestimation du potentiel irritant des formulations contenant plus de 10 % de tensioactifs en matière active.
    (*) Cas des tensioactifs.