V.2.2.10. Essai de la fonction Fc
    de l'immunoglobuline
      Sang humain stabilisé. Recueillez du sang humain de groupe O sur une     solution anticoagulante ACD. Conservez le sang stabilisé à 4 oC pendant 3     semaines au maximum.
      Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Dissolvez 1,022 g de     phosphate disodique anhydre, 0,336 g de phosphate monosodique anhydre et     8,766 g de chlorure de sodium R dans 800 ml d'eau et complétez à 1 000 ml     avec le même solvant.
      Solution mère de magnésium et de calcium. Dissolvez 1,103 g de chlorure de     calcium R et 5,083 g de chlorure de magnésium R dans de l'eau et complétez à     25 ml avec le même solvant.
      Solution mère de tampon barbital. Dissolvez 207,5 g de chlorure de sodium R     et 25,48 g de barbital sodique R dans 4 000 ml d'eau et ajustez à pH 7,3 avec     de l'acide chlorhydrique 1 N. Ajoutez 12,5 ml de solution mère de magnésium     et de calcium et complétez à 5 000 ml avec de l'eau. Filtrez sur membrane     (0,22 ,m) et conservez à 4 oC en récipient de verre.
      Solution tampon albumine-barbital. Dissolvez 0,150 g d'albumine bovine R     dans 20 ml de solution mère de tampon barbital et complétez à 100 ml avec de     l'eau.
      Solution d'acide tannique. Dissolvez 10 mg d'acide tannique R dans 100 ml de     solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Préparez immédiatement avant     l'emploi.
      Complément de cobaye. Mélangez les sérums préparés à partir du sang de dix     cobayes au moins. Séparez le sérum du sang coagulé par centrifugation à 4 oC     environ. Conservez le sérum en petites quantités à une température inférieure     à - 70 oC. Le sérum peut également être cryodesséché. Immédiatement avant de     commencer l'hémolyse à l'aide du complément, diluez à 125-200 CH50 par     millilitre avec la solution tampon albumine-barbital et maintenez la solution     diluée dans un bain de glace pendant l'essai.
      Antigène rubéoleux. Antigène approprié pour les titrages de l'inhibition     d'hémagglutination. Titre > 256 unités HA.
      Traitement des érythrocytes à l'acide tannique. Séparez les érythrocytes par     centrifugation d'un volume approprié de sang humain stabilisé. Lavez les     érythrocytes 3 fois au moins avec la solution saline tamponnée au phosphate     pH 7,2 puis mettez-les en suspension à 2 p. 100 V/V dans la solution saline     tamponnée au phosphate pH 7,2. Prélevez 0,1 ml de solution d'acide tannique     et complétez à 7,5 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2     (concentration finale 1,3 x 10-4 p. 100 m/V); mélangez un volume de la     dilution récemment préparée et un volume de la suspension d'érythrocytes et     faites incuber à 37o C pendant dix minutes. Recueillez les cellules traitées     à l'acide tannique par centrifugation (400-800 g pendant dix minutes),
     rejetez le liquide surnageant et lavez les érythrocytes une fois avec la     solution saline tamponnée au phosphate pH 7,2. Remettez les érythrocytes en     suspension à 1 p. 100 V/V dans la solution saline tamponnée au phosphate pH     7,2.
      Addition de l'antigène aux érythrocytes. Prélevez un volume approprié (Vs)     d'érythrocytes traités à l'acide tannique, ajoutez 0,2 ml d'antigène     rubéoleux par 1,0 ml d'érythrocytes et faites incuber à 37o C pendant trente     minutes. Recueillez les cellules par centrifugation (400-800 g pendant dix     minutes) et rejetez le surnageant, en laissant un volume de 200 ,l. Ajoutez     un volume de solution tampon albumine-barbital égal au liquide surnageant     rejeté, remettez les érythrocytes en suspension, recueillez-les comme il est     décrit ci-dessus et répétez le lavage. Complétez les 200 ,l obtenus aux trois     quarts de Vs; on obtient ainsi le volume initial (Vi). Mélangez 900 ,l de     solution tampon albumine-barbital et 100 ,l de Vi, qui est ainsi réduit au     volume résiduel Vr, et déterminez l'absorbance initiale à 541 nm (A). Diluez     Vr par un facteur égal à A à l'aide de solution tampon albumine-barbital. On     obtient ainsi le volume final ajusté Vf = Vr x A d'érythrocytes humains     sensibilisés et une valeur pour A de 1,0   0,1 dans le cas d'une dilution au     1/10.
      Liaison de l'anticorps sur les érythrocytes traités à l'acide tannique et     couverts d'antigène. Préparez les solutions suivantes successivement et en     double. Utilisez une cuve semi-micro (par exemple, des cuves à usage unique)     ou un tube à essai pour chaque solution.
      1. Solutions à examiner. Prélevez des volumes de la préparation à examiner     contenant 30 mg et 40 mg d'immunoglobuline respectivement et complétez à 900     ,l avec la solution tampon albumine-barbital.
      2. Solutions de référence. Préparez la solution comme il est décrit pour la     solution à examiner à partir de l'immunoglobuline humaine PBR.
      3. Témoin complément. 900 ,l de solution tampon albumine-barbital. A chaque     cuve/tube à essai, ajoutez 100 ,l d'érythrocytes humains sensibilisés et     mélangez soigneusement.
      Laissez reposer pendant quinze minutes, ajoutez 1 000 ,l de solution tampon     albumine-barbital, recueillez les érythrocytes par centrifugation (1 000 g     pendant dix minutes) de la cuve/tube à essai et enlevez 1 900 ,l du liquide     surnageant. Ajoutez 1 900 ,l de solution tampon albumine-barbital et répétez     le lavage en laissant un volume final de 200 ,l. Les échantillons peuvent     être conservés à 4 oC pendant 24 heures.
      Hémolyse provoquée par le complément. Pour la détermination de l'hémolyse,
     ajoutez 600 ,l de solution tampon albumine-barbital chauffée à 37 oC à     l'échantillon à examiner, remettez les érythrocytes en suspension avec     précaution en les pipettant plusieurs fois (cinq fois au moins) et placez la     cuve dans le porte-échantillon d'un spectrophotomètre muni d'un thermostat.
     Après deux minutes, ajoutez 200 ,l de complément de cobaye dilué à 125-200     CH50/ml, mélangez soigneusement en pipettant le mélange 2 fois puis commencez     immédiatement l'enregistrement de l'absorbance à 541 nm en fonction du temps,     en utilisant la solution tampon albumine-barbital comme liquide de     compensation. Arrêtez l'enregistrement si la courbe de l'absorbance en     fonction du temps a nettement dépassé le point d'inflexion.
      Evaluation. Déterminez la pente (S) de la courbe d'hémolyse au point     d'inflexion approximatif: délimitez sur la courbe dans la partie à plus forte     pente des sections par intervalle de temps approprié (par exemple,  t = 1     min.) et calculez S, exprimé en  A par minute, entre les points     d'intersections adjacents. Trouvez la valeur maximale de la pente (Sexp).
     Déterminez l'absorbance de départ (As) par extrapolation de la courbe, qui     est presque linéaire et parallèle à l'axe du temps dans les premières minutes     de l'enregistrement.
      Corrigez Sexp selon l'expression:
    S'   Sexp
    Sexp
    S' =
    AS
    I Fc   100 x (S' - S'c)
    100 x (S' - S'c)
    I Fc =
    S's - S'c
      S's =  moyenne arithmétique de la pente corrigée pour la préparation de     référence.
      S'c =  moyenne arithmétique de la pente corrigée pour le témoin complément.      Calculez l'indice de la fonction Fc de la préparation à examiner. La valeur     n'est pas inférieure à celle indiquée dans le feuillet qui accompagne la     préparation de référence.
    VII.1.1. REACTIFS
      Phosphate disodique anhydre. Na2HPO4 (Mr 142,0).
      Phosphate monosodique anhydre. NaH2PO4 (Mr 120,0).