Le libellé corrigé de la monographie ci-dessous de la Pharmacopée européenne, huitième édition, est rédigé comme suit :
ANTITHROMBINE III HUMAINE (CONCENTRÉ D')
Antithrombinum III humanum densatum
Définition
Préparation cryodesséchée stérile d'une fraction glycoprotéique plasmatique qui inactive la thrombine en présence d'un excès d'héparine. Le concentré d'antithrombine III humaine est obtenu à partir de plasma humain conforme à la monographie Plasma humain pour fractionnement (0853). La préparation peut contenir des excipients tels que des stabilisants.
L'activité de la préparation, reconstituée selon les indications figurant sur l'étiquette, n'est pas inférieure à 25 UI d'antithrombine III par millilitre.
Production
La méthode de préparation doit préserver l'intégrité fonctionnelle de l'antithrombine III. Elle comprend une ou plusieurs étapes dont la capacité à éliminer ou inactiver les agents infectieux connus a été démontrée. Si des substances sont utilisées à des fins d'inactivation virale en cours de production, l'étape de purification ultérieure doit faire l'objet d'une validation permettant de démontrer que leur concentration est ramenée à un niveau convenable et que leurs résidus éventuels ne sont pas susceptibles de compromettre l'innocuité de la préparation pour les patients.
L'activité spécifique n'est pas inférieure à 3 UI d'antithrombine III par milligramme de protéines totales, albumine exclue.
L'antithrombine III est purifiée et concentrée. Aucun conservateur antimicrobien ni antibiotique n'est ajouté. Le concentré d'antithrombine III est filtré sur une membrane antibactérienne, puis réparti aseptiquement dans les récipients finals et immédiatement congelé. Il est ensuite cryodesséché et les récipients sont fermés sous vide ou sous gaz inerte.
Il doit être démontré, au moyen d'une procédure analytique appropriée établie lors du développement, que le procédé de fabrication donne un produit contenant une proportion constante d'antithrombine III capable de se lier à l'héparine. La procédure utilisée peut par exemple être la procédure suivante :
Proportion d'antithrombine III capable de se lier à l'héparine. Opérez par électrophorèse (2.2.31) sur gel d'agarose. Préparez une solution d'agarose pour électrophorèse R à 10 g/L contenant 15 UI d'héparine R par millilitre dans de la solution tampon barbital pH 8,4 R. Versez 5 mL de cette solution sur une plaque de verre de 5 × 5 cm. Refroidissez le gel à 4 °C pendant 30 min. Creusez 2 cupules d'un diamètre de 2 mm situées à 1 cm et à 4 cm du bord de la plaque et à 1 cm de la cathode. Déposez dans une des cupules 5 µL de la préparation à examiner après l'avoir diluée de façon à obtenir une activité d'environ 1 UI d'antithrombine III par millilitre. Déposez dans l'autre cupule 5 µL d'une solution d'un colorant tel que le bleu de bromophénol R. Procédez à l'électrophorèse à 4 °C en appliquant un champ électrique constant de 7 V/cm jusqu'à ce que le colorant atteigne l'anode.
Découpez le gel d'agarose à 1,5 cm du bord de la plaque près duquel la préparation à examiner a été déposée, et enlevez la plus grande partie du gel en ne laissant qu'une bande de 1,5 cm de largeur contenant la préparation à examiner. Remplacez la partie du gel qui a été enlevée par une couche uniforme formée par 3,5 mL d'une solution d'agarose pour électrophorèse R à 10 g/L dans de la solution tampon barbital pH 8,4 R, contenant un sérum de lapin anti-antithrombine III humaine à une concentration appropriée, déterminée au préalable, afin d'obtenir des hauteurs de pics adéquates, d'au moins 1,5 cm. Placez à la cathode le bord de la plaque le long duquel se trouve le gel initial, de façon qu'une deuxième migration puisse s'effectuer perpendiculairement à la première. Procédez à cette deuxième électrophorèse en appliquant un champ électrique constant de 2 V/cm pendant 16 heures. Couvrez les plaques de papier filtre et de plusieurs couches d'ouate imbibée d'une solution de chlorure de sodium R à 9 g/L et maintenez sous pression pendant deux heures, en renouvelant la solution saline plusieurs fois. Rincez à l'eau R, séchez les plaques et colorez par la solution de bleu acide 92 R.
Calculez la proportion d'antithrombine III liée à l'héparine (représentée par le pic le plus proche de l'anode) par rapport à la quantité totale d'antithrombine III, en mesurant la surface définie par les deux pics de précipitation.
La proportion d'antithrombine III capable de se lier à l'héparine n'est pas inférieure à 60 %.
Caractères
Aspect : poudre ou masse solide friable blanche ou sensiblement blanche, hygroscopique.
Reconstituez la préparation à examiner selon les indications de l'étiquette immédiatement avant d'effectuer l'identification, les essais (sauf ceux de solubilité, des protéines totales et de teneur en eau) et le dosage.
Identification
Le concentré d'antithrombine III humaine satisfait aux limites du dosage.
Essai
Solubilité : au contenu d'un récipient de la préparation à examiner, ajoutez le volume de liquide indiqué sur l'étiquette, à la température recommandée. Agitez doucement. La préparation se dissout complètement dans les 10 min en donnant une solution limpide ou légèrement opalescente, incolore ou pratiquement incolore.
pH : (2.2.3) : 6,0 à 7,5.
Osmolalité : (2.2.35) : au minimum 240 mosmol/kg.
Protéines totales : diluez si nécessaire un volume exactement mesuré de la préparation reconstituée de façon à obtenir une solution contenant environ 15 mg de protéines dans 2 mL. Dans un tube à centrifuger à fond rond, introduisez 2,0 mL de cette solution, puis ajoutez 2 mL d'une solution de molybdate de sodium R à 75 g/L et 2 mL d'un mélange de 1 volume d'acide sulfurique exempt d'azote R et de 30 volumes d'eau R. Agitez, centrifugez pendant 5 min, éliminez le surnageant et laissez égoutter le tube renversé sur du papier filtre. Déterminez la teneur en azote du culot de centrifugation par la méthode de minéralisation par l'acide sulfurique (2.5.9). Calculez la teneur en protéines en multipliant le résultat par 6,25.
Héparine : au maximum 0,1 UI d'héparine par Unité Internationale d'antithrombine III.
L'activité anticoagulante de l'héparine est évaluée in vitro par comparaison de sa capacité à retarder la coagulation du plasma de mouton, citraté et recalcifié, à celle d'une préparation de référence, étalonnée en Unités Internationales, dans des conditions données.
L'Unité Internationale d'héparine correspond à l'activité d'une quantité donnée de l'étalon international ; celui-ci est constitué par de l'héparine sodique cryodesséchée provenant de muqueuse intestinale de porc. La correspondance entre l'Unité Internationale et l'étalon international est indiquée par l'Organisation mondiale de la santé.
L'héparine sodique PBR est étalonnée en Unités Internationales à partir de l'étalon international, à l'aide du titrage décrit ci-après.
Effectuez le titrage à l'aide d'un des procédés suivants permettant de déterminer le début de la coagulation et de choisir les tubes et autres appareils appropriés à la méthode utilisée :
a) Examen visuel direct, effectué de préférence à l'aide d'un éclairage indirect sur fond noir et mat ;
b) Enregistrement spectrophotométrique du changement de densité optique à une longueur d'onde de 600 nm environ ;
c) Examen visuel du changement de fluidité en inclinant les tubes manuellement ;
d) Enregistrement mécanique du changement de fluidité en procédant au mélange tout en ayant soin d'éviter au maximum toute perturbation au sein de la solution pendant la phase initiale de coagulation.
Il est nécessaire de valider le titrage de l'héparine pour chaque préparation afin de tenir compte de l'interférence de l'antithrombine III.
Mode opératoire :
Les volumes sont donnés à titre indicatif et peuvent être adaptés à l'appareillage utilisé, à condition toutefois que les rapports entre les différents volumes soient respectés.
Diluez l'héparine sodique PBR dans une solution de chlorure de sodium R à 9 g/L de façon à obtenir par millilitre un nombre connu avec précision d'Unités Internationales. Préparez dans les mêmes conditions une solution de la préparation à examiner de même activité présumée. A partir de chacune de ces solutions, préparez une série de dilutions dans une solution de chlorure de sodium R à 9 g/L en progression géométrique, de façon que le temps de coagulation obtenu avec la concentration la plus faible ne soit pas inférieur à 1,5 fois le temps de recalcification à blanc et que le temps de coagulation obtenu avec la plus forte concentration soit tel qu'il donne une courbe log dose/réponse satisfaisante, telle que déterminée dans un essai préliminaire.
Placez douze tubes dans un bain d'eau glacée en les étiquetant en double T1, T2 et T3 pour les dilutions de la préparation à examiner et S1, S2 et S3 pour les dilutions de la préparation de référence. Dans chaque tube, introduisez 1,0 mL de substrat de plasma R1 décongelé, 1,0 mL de la dilution appropriée de la préparation à examiner ou de la préparation de référence. Après chaque addition, mélangez en évitant la formation de bulles. En prenant les tubes dans l'ordre suivant S1, S2, S3, T1, T2, T3, transférez chacun d'eux dans un bain-marie à 37 °C. Laissez s'équilibrer la température du milieu à 37 °C pendant 15 min environ, puis ajoutez dans chacun des tubes 1 mL d'un réactif APTT (1) (temps de thromboplastine partielle activée) approprié contenant des phospholipides et un activateur de contact, à une dilution telle qu'un temps de recalcification à blanc convenable ne dépassant pas 60 s est obtenu. Après exactement 2 min, ajoutez 1 mL d'une solution de chlorure de calcium R à 3,7 g/L chauffée au préalable à 37 °C. Enregistrez, comme temps de coagulation, l'intervalle exprimé en secondes entre cette dernière addition et le début de la coagulation déterminé selon le procédé choisi. Déterminez le temps de calcification à blanc au début et à la fin de l'opération dans les mêmes conditions en utilisant 1 mL d'une solution de chlorure de sodium R à 9 g/L au lieu d'une des dilutions d'héparine ; les deux valeurs à blanc obtenues ne doivent pas différer de façon significative. Transformez les temps de coagulation en logarithmes, en utilisant la valeur moyenne des tubes traités en double. Répétez le procédé en utilisant de nouvelles dilutions et effectuez l'incubation dans l'ordre T1, T2, T3, S1, S2, S3. Calculez les résultats par les méthodes statistiques habituelles (5.3).
Effectuez au moins trois titrages indépendants. Pour chacun d'eux, préparez respectivement de nouvelles solutions de la préparation à examiner et de la préparation de référence et utilisez un nouveau prélèvement de substrat de plasma décongelé immédiatement avant l'emploi.
Calculez l'activité de la préparation à examiner par les méthodes statistiques habituelles (5.3) en combinant les résultats des différents titrages. Lorsque la variance issue des différences entre les titrages est significative au niveau P = 0,01, une estimation combinée de l'activité peut être obtenue en calculant la moyenne non pondérée des estimations de l'activité.
Eau : Déterminée par une méthode appropriée telle que le semi-microdosage de l'eau (2.5.12), la perte à la dessiccation (2.2.32) ou la spectroscopie dans le proche infrarouge (2.2.40), la teneur en eau est comprise dans les limites approuvées par l'Autorité compétente.
Stérilité : (2.6.1) La préparation à examiner satisfait à l'essai.
Pyrogènes (2.6.8) ou Endotoxines bactériennes : (2.6.14). La préparation à examiner satisfait à l'essai des pyrogènes ou, de préférence et sous réserve de justification et d'autorisation, à un essai in vitro validé, tel que l'essai des endotoxines bactériennes.
Pour l'essai des pyrogènes, injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle, un volume de préparation correspondant à 50 UI d'antithrombine III.
Si l'essai utilisé est celui des endotoxines bactériennes, la préparation à examiner contient moins de 0,1 UI d'endotoxines par Unité Internationale d'antithrombine III.
Dosage
Antithrombine III humaine : (2.7.17). L'activité estimée n'est pas inférieure à 80 pour cent ni supérieure à 120 pour cent de l'activité déclarée. Les limites de confiance (P = 0,95) ne sont pas inférieures à 90 % ni supérieures à 110 % de l'activité estimée.
Conservation
A l'abri de la lumière, en récipient étanche.
Etiquetage
L'étiquette indique :
- le nombre d'Unités Internationales d'antithrombine III par récipient ;
- le nom et le volume du liquide à utiliser pour reconstituer la préparation ;
- dans les cas appropriés, la quantité d'albumine ajoutée comme stabilisant.

        (1) Les kits CK Prest conviennent.