Lĩnh vực: Bệnh Gumboro ở gà
Câu hỏi: Phương pháp ELISA được tiến hành theo trình tự như thế nào?
Trả lời: Theo tiết 6.3.4 tiểu mục 6.3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về cách tiến hành phương pháp ELISA như sau:
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro
...
6.3.4. Cách tiến hành
VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (Infectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX3)
6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu
- Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);
- Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 ml huyết thanh pha với 500 ml dung dịch pha loãng mẫu);
- Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;
- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 ml/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;
- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).
6.3.4.2. Tiến hành phản ứng
Bước 1: Nhỏ huyết thanh
- Nhỏ 100 ml dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);
- Nhỏ 100 ml kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;
- Nhỏ 100 ml kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;
- Nhỏ 100 ml huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;
- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.
Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)
- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể vào các giếng;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;
- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;
- Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.
Bước 3: Nhỏ cơ chất
- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;
- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 15 min.
Bước 4: Dừng phản ứng
- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;
Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.
6.3.5. Đọc kết quả
Điều kiện phản ứng được công nhận khi:
- Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;
- Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.
Tính kết quả:
- Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb
- Trung bình của đối chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb
- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PCx tb - NC x tb)
- Hiệu giá của mẫu: log10 Titer = 1,09 (log10 S/P) + 3,36
CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.
Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:
- Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;
- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.
Theo đó, phương pháp ELISA được thực hiện theo trình tự nêu trên để phát hiện kháng thể bệnh Gumboro ở gà.