Lĩnh vực: Tôm thẻ chân trắng
Câu hỏi: Quy trình thực hiện chẩn đoán bệnh Taura ở tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp mô bệnh học được thực hiện như thế nào?
Trả lời: Theo tiết 4.2.2.4 tiểu mục 4.2 Mục 4 TCVN 8710-5:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 5: bệnh Taura ở tôm he quy định về cách tiến hành khi thực hiện phương pháp mô bệnh học để chẩn đoán bệnh Taura ở tôm như sau:
"4. Phương pháp chẩn đoán
...
4.2.2 Phương pháp mô bệnh học
...
4.2.2.4 Cách tiến hành
4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu
Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.
Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu ấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.
Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô dưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.
4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định
Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.
4.2.2.4.3 Làm trong mẫu
Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.
Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.
Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.
Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
4.2.2.4.4 Cắt mẫu
Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.
Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.
4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E
Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3 min đến 5 min.
Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.
Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính.
4.2.2.4.6 Đọc kết quả
Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao.
Khi tôm bị bệnh TSV, trên các lát cắt mô bệnh học của tầng biểu bì mang, dạ dày, mô liên kết thể hiện các vùng bị hoại tử. Trong tế bào bị cảm nhiễm, nhân kết đặc hay phân tán, trong tế bào chất xuất hiện các thể vùi hình cầu kích thước từ 1 µm đến 20 µm, bắt màu trung gian giữa màu tím của haematoxylin và màu hồng của eosin. Ngoài ra một dấu hiệu khác của bệnh taura ở thời kì cấp tính là các ống tuyến an ten bị phá hủy, xuất hiện nhiều các tế bào bạch cầu có nhân, sự vắng mặt của các tế bào máu trong phần mô bị hoại tử, xuất hiện sắc tố đen trên vỏ ki tin, là sản phẩm cuối cùng của hoạt động miễn dịch của tôm khi bị bệnh."
Như vây, nếu bạn muốn thực hiện chẩn đoán bệnh bằng phương pháp mô bệnh học ở tôm để xác định tôm có mắc bệnh Taura hay không thì tiến hành theo các bước nêu trên.
Khị thực hiện chẩn đoán phải đảm bảo các vấn đề về thuốc thử, vật liệu thử và các thiết bị dụng cụ phù hợp cho quá trình thực hiện chẩn đoán.