Lĩnh vực: Phương pháp parafin, Tiêu chuẩn Việt Nam
Câu hỏi: Phương pháp parafin dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá  được tiến hành như thế nào?
Trả lời: Theo tiết 6.2.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về cách tiến hành phương pháp parafin như sau:
"6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin.
...
6.2.4. Cách tiến hành.
6.2.4.1. Đúc khuôn.
- Đặt khuôn nhựa (4.2.1) rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h:
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h:
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;
- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;
CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.
- Đúc khuôn: rót parafin (3.3.5) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4), đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.
8.2.4.2. Cắt tiêu bản.
- Cắt gọt khối parafin (6.2.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5),
- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát;
- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C
Dùng phiến kính (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.
6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản
- Ngâm tiêu bản (6.2 4 2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3 3), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.4), thời gian từ 60 s đến 90 s;
- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1 1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.6). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).
6.2.5. Đọc kết quả.
Mẫu mô được soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10) cho thấy sự hiện diện của các khối u hình tròn màu trắng không bắt màu của H & E;
Giai đoạn sớm quan sát thấy sợi nấm tại vị trí hoại tử thể hiện ở những chấm đen nhỏ trên tiêu bản nhuộm. Dần hình thành những u hạt nấm màu trắng."
Theo đó, các bước tiến hành phương pháp parafin gồm:
- Đúc khuôn;
- Cắt tiêu bản;
- Nhuộm tiêu bản;
- Đọc kết quả.
Chi tiết các bước tiến hành phương pháp parafin được thực hiện theo Tiêu chuẩn vừa nêu trên.