"3. Phương pháp chẩn đoán
...
3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược)
3.2.1.1. Nguyên tắc
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa trên hoạt động của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại DNA đích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới.
RT-PCR là phương pháp PCR mà axit nucleic đích là RNA. Để có thể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT - reverse transcription) thành cDNA bằng mồi đặc hiệu cho phản ứng này.
Giai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng là Reverse Transcriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA là mạch khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA) có sự tham gia của mồi, dNTP và dung dịch đệm cho phản ứng.
Có hai phương pháp thực hiện RT-PCR, đó là RT-PCR một bước và RT-PCR hai bước. Trong quy trình này, phương pháp RT-PCR hai bước được thực hiện để khuếch đại RNA đích.
3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.
- Trizol;
- Cloroform;
- Isopropanol;
- Etanol 75 % và 95 %;
- Dung dịch TBE 1X
Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X.
- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M
Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch DEPC
Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ - 20 oC
- Dung dịch TE (Tris - EDTA)
Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.
- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.
- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.
- Etidi bromua (EtBr).
CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp xúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay và mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.
- Gel agarose.
3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:
- Tủ lạnh;
- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ - 20 oC;
- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13000 g;
- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC;
- Máy lắc trộn vortex;
- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;
- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 l đến 10 l, từ 2 l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến 1000 l;
- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;
- Máy luân nhiệt (máy PCR);
- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;
- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;
- Buồng đổ gel;
- Bàn đọc gel (UV);
- Giấy parafin.
..."