"3.2.2.4. Cách tiến hành
3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
Cố định trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm Postlarvae có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.
Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng thuốc Davidson tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lượng thuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.
3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định
Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.
3.2.2.4.3. Làm trong mẫu
Ngâm sang lọ xylen 1, để trong 30 min đến 60 min.
Ngâm sang lọ xylen 2, để trong 30 min đến 60 min.
Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 °C đến 58 °C trong 1 h.
Đúc khuôn: đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
3.2.2.4.4. Cắt mẫu
Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.
Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước 30 °C đến 35 °C; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.
3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E
Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.
Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.
Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90 % và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.
3.2.2.4.6. Đọc kết quả
Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1 000 X).
Mô học gan tụy của tôm bị bệnh hoại tử gan tụy thể hiện đặc điểm bệnh lý sau: Các vùng mô gan tụy bị hoại tử, bắt màu đồng đều của thuốc nhuộm, hoàn toàn không còn nhìn thấy cấu trúc tế bào và mô gan tụy đồng thời xuất hiện dày đặc những tế bào máu bao vây xung quanh những vùng bị hoại tử. Trên lát cắt mô học gan tụy với thuốc nhuộm haematoxylin và eosin cho thấy dấu hiệu của sự viêm teo từ trung bình tới rất nặng của ống gan tụy. Các tế bào biểu mô gan tụy khi bị viêm teo hoại tử chuyển từ hình trụ tròn sang hình khối, hoặc có thể bị phình to và chứa một số lớn vi khuẩn tự do giống với rickettsia, gram âm nằm trong nguyên sinh chất của các tế bào.
Ở tôm P, vannamei giai đoạn ấu niên bị nhiễm bệnh NHP nặng, mãn tính biểu mô tuyến gan tụy bị teo rõ rệt, dẫn đến phù thũng nặng (dịch tràn hoặc các khu vực có nước trong gan tụy).
Độ phóng đại 10000X tôm bị bệnh trong tế bào chất có nhiều vi khuẩn bệnh NHP dạng hình que và hình xoắn."