Il sistema immunitario 
Con immunità si intende l’esenzione da malattia dopo il primo contatto con un agente patogeno, ma non soltanto, con sostanze estranee in genere. Si pensi ad esempio all’allergia, una risposta immunitaria abnorme a una sostanza come il polline, che naturalmente non sarebbe nemmeno pericolosa. 
Il sistema immunitario è evoluto per difendere l’individuo dall’invasione del mondo esterno: microrganismi, geni estranei (virus), ma anche dalle stesse cellule dell’individuo che, essendo mutate, non possono più essere controllate correttamente, o da cellule umane di altri individui. 
L’insieme dei meccanismi di difesa, numerosi, diversificati e interagenti tra loro, prende appunto il nome di sistema immunitario. Tali meccanismi di basano su molecole, in circolo nei fluidi organici, e su cellule, che possono essere in circolo nel sangue, oppure poste nei tessuti periferici. 
Il riconoscimento delle molecole estranee avviene attraverso specifici recettori di membrana, che riconoscendo ligandi più o meno specifici, permettono la trasduzione di segnali all’interno della cellula. 
Tali segnali attivano le cellule del sistema immune, stimolando la secrezione di molecole solubili (anticorpi, citochine..), l’acquisizione di capacità citotossiche (citolisi, attività killer..) e la loro proliferazione, dando luogo ad un’espansione clonale. 
Il corpo umano è un incubatore perfetto per i microrganismi: l’ambiente è ricco di nutrienti e presenta condizioni di umidità/calore generalmente favorevoli. 
Talvolta, è stato raggiunto un “compromesso” tra i microrganismi e gli individui ospitanti, si pensi alla simbiosi della flora batterica dell’intestino, della cute e della vagina. Da tali microrganismi traiamo vantaggio in vario modo, o perché producono molecole essenziali per il nostro metabolismo, oppure perché antagonizzano l’infezione da parte di microrganismi maggiormente dannosi per l’individuo. 
Altre volte è necessaria l’eliminazione degli agenti esterni, che possono causare danno: i microrganismi secernono esotossine (scarlattina, difterite..), oppure contengono nel loro corpo cellulare endotossine(tifo, polmonite..). Essi possono uccidere le cellule in cui penetrano,oppure attivare una risposta immunitaria abnorme (infiammazione cronica, accumulo di immunocomplessi, autoimmunità, immunodeficienza). 
Si possono distinguere due tipi di immunità, che però sono strettamente interconnessi tra loro: 
­	Immunità innata: media le risposte precoci, in quanto è già predisposta nell’organismo, prima 
ancora dell’invasione da parte dei microrganismi. Essa è caratterizzata da una risposta sempre 
uguale nel tempo al medesimo stimolo. È costituita da: 
o 	Barriere fisiche/chimiche 

o 	Cellule, presenti in circolo e nei tessuti: granulociti, monociti/macrofagi, cellule natural killer. Esse sono naturalmente dotate di attività citotossica o fagocitica nei confronti di cellule che mostrano particolari molecole sulla superficie 

o 	Fattori solubili, quali proteine del sangue, citochine... 


­	Immunità adattativa/acquisita: media le risposte tardive, in quanto non è predisposta prima dell’invasione (in forma attiva), ma necessita di tempo per attivarsi. Tale risposta è caratterizzata da memoria dell’incontro col patogeno e conseguente risposta più intensa ed efficace ad una seconda esposizione. È costituita da: 
o 	Cellule (linfociti T/B), molto diverse dalle cellule dell’immunità innata. Mentre queste ultime presentano recettori tutti uguali, diverse popolazioni di linfociti presentano recettori differenti, in grado di riconoscere molecole differenti in maniera specifica. Tali cellule devono sviluppare l’attività effettrice. All’inizio sono solamente in grado di 

contattare particolari molecole self e non self, esposte da cellule apposite (APC, Antigen Presenting Cell). Se riconoscono la molecola specifica, si attivano, andando incontro a selezione clonale e acquisizione della funzione effettrice. Una porzione, invece, rimane priva di funzione effettrice, andando a costituire il pool di cellule della memoria. Questo aspetto è alla base della risposta più pronta ed efficace che si osserva ad una seconda esposizione allo stesso agente patogeno, in quanto si hanno molte più cellule con recettore specifico per l’invasore. 

o Fattori solubili: anticorpi Si distingue quindi l’immunità umorale, mediata dal compartimento B, indirizzata contro microbi e tossine extracellulari, dall’immunità cellulomediata, che fa capo ai linfociti T ed è diretta contro i microbi che proliferano all’interno delle cellule. 


L’immunità può essere attiva, se è conseguente all’immunizzazione dell’individuo per esposizione al microrganismo, oppure passiva, qualora sia conseguente al trasferimento di immunoglobuline o linfociti T CD8+ provenienti da individui immuni. Quest’ultima non comprende l’instaurarsi di un pool memoria. 
L’immunità innata 
L’immunità innata costituisce la prima linea di difesa dell’organismo, in quanto esiste prima 
dell’invasione e quindi può essere attivata rapidamente. Essa stimola anche la risposta adattativa, 
indirizzandola verso le modalità più efficaci per la rimozione dello specifico patogeno. 
L’invasione può avvenire attraverso le mucose degli apparati respiratorio, gastroenterico e 
genitale, attraverso la cute in seguito a traumi o condizionamenti ambientali, oppure attraverso gli 
occhi e le orecchie. In tali punti si hanno difese molto resistenti. 
Sono barriere biochimiche/biologiche: 

­il lisozima, che scinde la parete dei batteri Gram+ (contenuto nella saliva e nelle lacrime) ­il sebo, che stabilisce un pH acido a livello cutaneo ­le defensine degli epiteli, piccoli amminoacidi cationici (29-34 amminoacidi con 3 ponti 
disolfuro) con diretta funzione antibatterica. Esse sono prodotte da neutrofili, NK e CTL. Esse oltre all’attività citotossica diretta, hanno anche la funzione di attivare le cellule della risposta infiammatoria. 
­la flora batterica di cute/intestino e vagina 
Sono barriere fisico-chimiche: ­il muco ­l’epitelio ciliato delle vie aeree ­la tosse e lo starnuto ­la cute ­l’acido cloridrico HCl, che stabilisce un pH marcatamente acido nello stomaco 
Recettori dell’immunità innata 
La cute, che è un’ottima barriera, permette l’invasione solamente nel caso di un trauma. A livello di essa si hanno risposte immunitarie innate, che riconoscono genericamente l’agente come invasore. Questo è possibile grazie al riconoscimento di molecole comuni e diffuse tra grandi classi di microrganismi, le PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns), non presenti nel nostro organismo. 
Le cellule dell’immunità innata (neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, endotelio…) esprimono recettori che riconoscono tali strutture microbiche conservate, detti pattern recognition receptors (PRR). Essi sono sempre uguali, codificati nel DNA della linea germinale, e riconoscono: 
­Glicoproteine con residui terminali di mannosio 
­Lipopolisaccaridi (LPS) 
­Acidi teicoici 
­RNA a doppia elica (RNA duplex o double strand dsRNA) 
­N-formil-metionil-peptidi (tutte le proteine microbiche hanno tali residui all’N-terminale, 

ma non quelle animali) 
­Zone CpG non metilate del DNA Questi recettori, essendo evoluti appositamente per riconoscere strutture condivise dal mondo microbico ma non da quello animale, sono persino più specifici di quelli dell’immunità adattativa, che invece sono generati in modo casuale (vedi dopo), nel non riconoscere strutture self. I PRR possono anche riconoscere molecole che indicano stress cellulare quali Hsp, molecole MHC-like, fosfolipidi modificati. 
Si ha una predefinizione delle caratteristiche molecolari degli invasori. Tali difese sono dette difese umorali. 
­Lisozima o muramidasi, scoperto nel 1922 da Fleming. È un enzima che scinde i legami ß(1.4) glicosidici fra l’acido N-acetilmuramico e l’N-acetilglucosammina, che costituiscono le catene ramificate della parete dei batteri Gram+. L’azione della muramidasi provoca la morte per lisi dei batteri. È prodotta da granulociti e monociti ed è riscontrabile a livello tissutale e in molti fluidi corporei nei mammiferi, non nel plasma ma nelle lacrime, nel secreto nasale e, soprattutto, nella saliva. 
­Betalisine ­Batteriocidine ­Tufsina, derivante dal clivaggio della porzione terminale delle IgG, con funzione 
opsonizzante ­Sistema lattoperossidasi-tiocianato-H2O2 che uccide i batteri anaerobi ­Interferoni (IFNs) ­Sistema della coagulazione del sangue, che permette la ricostituzione dell’integrità 
tissutale e l’isolamento della ferita dal flusso ematico. 
­Sistema del complemento 
Si hanno anche cellule, costituenti l’immunità cellulare, che percepiscono e antagonizzano l’invasione: ­Mastociti, sentinelle tissutali, in grado di recepire prontamente l’invasione ­Granulociti, popolazione più numerosa dell’immunità innata 
­Macrofagi/monociti 
­Cellule NK 
­Cellule endoteliali: non sono spettatori innocenti, 

ma sono sensibili alle citochine, permettendo il 
passaggio nei tessuti di determinate popolazioni 
cellulari, in seguito ad alterazioni delle loro 
proprietà di permeabilità 


Lectine C: sono recettori con teste globulari, in grado di legare carboidrati presenti solo sui microrganismi. La loro azione dipende dalla presenza di ione calcio Ca2+ . Ne sono esempi il recettore per il mannosio e la dectina, in grado di riconoscere i glucani dei funghi. Recettori per gli N-formil-metionil-peptidi, 7 domini transmembrana, associati a proteine G (GPCR 
– G protein coupled receptor). Essi fungono da recettori chemotattici, in grado di controllare e modificare lo scheletro di actina. 
Recettori scavenger, in grado di riconoscere lipoproteine ossidate (LPL) e polimeri anionici. Riconoscono anche strutture self invecchiate, come gli eritrociti, in quanto mancanti di acido sialico. Fan parte di questa famiglia le proteine CD36 e CD68. 
I toll-like receptors (TLRs) sono una famiglia di proteine, simili al recettore Toll della Drosophila, 
fondamentali per lo sviluppo dell’individuo, ma dotati anche di proprietà antibatterica e 
antimicotica. Sono simili anche al recettore per l’interleuchina 1 (IL-1R). 
I TLR sono molto conservati filogeneticamente, essendo riscontrabili in piante, insetti e mammiferi. 
Da questo si può desumere una loro importanza notevole per gli organismi. 
Nell’uomo, ad oggi, sono stati identificati 11 differenti TLR. Essi sono in grado di riconoscere molti 
microbi e parassiti (non i vermi), dando segnali che sono anche stati associati all’infiammazione 
sterile (autoimmune). 
Presentano sequenze ripetute, ricche di leucina. Nei pressi della membrana citoplasmatica sono 
ricchi di cisteine. La coda intracitoplasmatica mostra un dominio per la trasduzione del segnale, 
detto dominio TIR (Toll interleukin-1 receptor). 
È importante sapere che alcuni di essi sono localizzati sulla membrana cellulare, mentre altri a 
livello degli endosomi e del reticolo endoplasmatico (TLR3-7-8-9). Essi sono quindi in grado di 
contattare ligandi nel liquido extracellulare o nel lume degli endosomi (in seguito a 
fagocitosi/endocitosi). 
Sono in grado di riconoscere: lipoproteine, peptidoglicani (Gram+), LPS (Gram -), fosfolipidi tipici dei 
parassiti, Hsp dell’ospite, flagellina… 
I TLR interni riconoscono DNA ed RNA virale double strand e single strand, sequenze CpG non 
metilate. 
Per poter trasdurre il segnale, essi devono poter dimerizzare, in maniera omomerica o eteromerica. 
Il repertorio dei ligandi fisiologici, grazie alla possibilità di eterodimerizzazione, è molto più vasto. 
I domini TIR reclutano presso la membrana adattatori proteici, che a loro volta reclutano e 
attivano chinasi. Alla fine della cascata del segnale, si ha il controllo dell’attività di fattori 
trascrizionali (NF.B, AP-1, IRF-3/7) e quindi dell’espressione di diversi geni: 

­ Citochine infiammatorie: TNF, IL-1, IL-12  
­ Citochine antivirali: IFN  
­ Chemochine: IL-8  

­Modificazione endoteliale (E-selectina) 
­Molecole costimolatorie La specificità dei TLR è inoltre influenzata dal coinvolgimento di altre molecole nel complesso di ricezione/trasduzione del segnale. Una di esse, particolarmente importante, è CD14. Essa è una proteina ancorata alla membrana mediante GPI, che riceve l’LPS dalla LPS-binding protein, circolante nel sangue, trasducendo il segnale. 
Esistono recettori che fungono da sensori delle infezioni batteriche. 
NOD1/NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain), codificati da membri della famiglia 
CARD (caspase-activation and recruitment domain-containing proteins). 

In questo caso, le proteine non sono strutture di membrana, ma sono citoplasmatiche. 
Condividono con i TLR la capacità di legare frammenti microbici Gram+ e Gram -. Innescano la via di 
NF.B. Sono espressi da cellule epiteliali, macrofagi e cellule dendritiche. 
I TLR si legano anche a frammenti delle nostre cellule, al fibrinogeno. Questi sensori sono anche 
responsabili dell’attivazione di alcune popolazioni cellulari quando si ha l’attivazione del sistema di 
coagulazione del sangue. Talvolta possono avere un ruolo di facilitazione di rottura della tolleranza. 
Trasducono dei segnali che portano, a seconda della via attivata, ad una risposta pro-
infiammatoria. 
La cellula si modifica, in particolare matura la cellula dendritica che, inviando segnali, amplia ed 
attiva una risposta immunitaria nei confronti dell’invasore. 
I microrganismi infettanti mandano segnali che vengono percepiti da tutta una serie di recettori 
sui macrofagi, che secernono citochine proinfiammatorie, quali il TNFa, l’IFNa, ad azione autocrina 
e paracrina (su T, NK…) 
Il dialogo (crosstalk) tra immunità innata e adattativa non è monodirezionale, ma i bersagli delle 
citochine macrofagiche sono indotti a secernere altre citochine (ad es. IFN.), che attivano di nuovo 
i macrofagi (burst respiratorio). 

L’importanza di tutto questo set recettoriale, in particolare dei toll-like receptors, si può notare nel 
funzionamento patologico di tali molecole: un loro ipofunzionamento porta a quadri di 
immunodeficienze più o meno gravi, un iperfunzionamento correla con un maggior rischio di 
sviluppare patologie autoimmuni (quali ad esempio il morbo di Crohn). Si tenga conto che almeno 
una parte del mondo microbico, alcuni virus, sono in grado di sopprimere i segnali tradotti dai TLR. 
CpG tipiche del mondo microbico, riconosciute da TLR9, sono sfruttate terapeuticamente come 
fattori immunostimolanti (inducendo la secrezione di interferoni). Nel caso di malattie 
autoimmuni, invece, si blocca il TLR9, rallentando il processo. 

Cellule dell’immunità innata 
Tra le cellule dell’immunità innata, quelle presenti in maggior numero sono i neutrofili, che 
presentano granuli specifici con lisozima, collagenasi, elastasi e granuli azzurrofili (comuni 
lisosomi). Ne vengono prodotti 1011 al giorno ed hanno una emivita breve, di 6 ore appena. 
Vengono rimossi dai macrofagi epatici (cellule di Kuppfer). 
Si hanno poi i monociti circolanti, che quando si spostano nei tessuti si differenziano a macrofagi. 
Assumono una forma particolare dopo la loro attivazione e sono dotati di attività fagocitica. 
Possono andare incontro a divisione cellulare. 
Le cellule dendritiche sono le principali responsabili del collegamento tra immunità innata ed 
adattativa. Secernono citochine e forniscono segnali costimolatori, oltre a presentare l’antigene. 
Dell’immunità innata fan parte anche le cellule natural killer (vedi dopo). 

Il reclutamento leucocitario ai siti di infezione inizia con il rolling delle cellule sull’endotelio, 
mediato da legami transienti con le selectine (upregolate sull’endotelio in seguito alla presenza di 
citochine proinfiammatorie). Le P-selectine vengono espresse rapidamente perché sono 
conservate in vescicole endocellulari che si fondono con il plasmalemma a seconda della necessità, 
le E-selectine, invece, hanno una risposta lenta perché devono essere sintetizzate (almeno 1-2 ore). 
Le L-selectine (CD62L) sono espresse dai leucociti e mediano l’homing dei T naïve. Il legame 
all’inizio è transiente per la forza di trascinamento del flusso ematico. 
In seguito le chemochine vengono trasportate nel lume e si legano agli eparan solfati. Legano i 
recettori sui leucociti ed aumentano l’affinità delle integrine e la loro clusterizzazione sulle 
membrane. Si ha una upregolazione dei ligandi integrinici (VCAM-1, che lega VLA-4 e ICAM-1, che 

lega LFA-1), una modificazione del citoscheletro e quindi la diapedesi e l’extravasazione dei leucociti. Si ha una leggera specificità dell’infiammazione per la reclutazione di vari compartimenti leucocitari e un accumulo di essi dovuto all’espressione combinata e controllata dei vari fattori. 
La fagocitosi è innescata dal riconoscimento dell’invasore mediante i PRR oppure i recettori per le opsonine (anticorpi, complemento, lectine). Il fagosoma si fonde con il lisosoma a formare il fagolisosoma per uccidere l’invasore, grazie alla presenza di enzimi proteolitici (elastasi, catepsina, ROS). La iNOS (sintetasi dell’ossido nitrico inducibile) produce perossinitriti radicali. Una sua forte attivazione può danneggiare i tessuti per rilascio di radicali. I fagociti secernono anche citochine proinfiammatorie e stimolanti gli altri compartimenti dell’immunità innata e adattativa, oltre a fattori di crescita per i fibroblasti e l’endotelio. 
Le citochine 
Le citochine sono proteine secrete in risposta a microbi od altri antigeni dalle cellule del sistema immunitario. Rappresentano una richiesta di “aiuto” dalle cellule che hanno riconosciuto l’invasore. Anticamente erano state suddivise a seconda dalla sorgente in linfochine e monochine, ed erano anche dette interleuchine perché prodotte e agenti su leucociti. Tra le loro funzioni si hanno quelle di: 
­Attivazione delle cellule vicine (endoteli) 
­Messaggi che reclutano cellule di passaggio 
­Messaggi al midollo osseo, per aumentare la produzione cellulare 
­Blocco del passaggio dei microrganismi 

Esse hanno diversi effetti su differenti popolazioni cellulari ­Aumento delle molecole di adesione endoteliale, che favoriscono l’extravasazione ­Dilatazione dell’endotelio, liberazione granulocitica dai depositi del midollo osseo ­Attivazione del sistema della coagulazione 
Le citochine sono molecole rilasciate da cellule che, diffondendo, vengono recepite da altre cellule e le “mettono in movimento”, le attivano o le modificano in qualche modo. Esse presentano vari nomi perché, intorno agli anni 1980, si è incominciato a capire che le cellule attivate rilasciano sostanze nel terreno di coltura. Tale terreno condizionato è in grado di attivare cellule mai esposte ad agenti esterni. Si iniziò, pertanto, a parlare di T/B cell growth factor, B cell differentiation factor, macrophage inhibiting factor (MIF). Il nome era un acronimo derivante dalla loro attività biologica. Con l’avvento della biologia molecolare, si sono iniziati a clonare i geni di tali citochine, nominandole interleuchine, sostanze prodotte da leucociti, che sono in grado di mettere in movimento le cellule tra di loro. IL-1…IL-32 TCGF=IL-2 BCGF=IL-4 Nonostante si sia operato per mettere ordine nella nomenclatura delle interleuchine, ad alcune di esse non è stato cambiato il nome, in quanto ormai diventato di uso comune: è il caso della famiglia degli interferoni (IFNa, IFNß, IFN.) e del tumor necrosis factor (TNF). Così, alcune citochine, che agiscono sul midollo osseo, per stimolare la produzione di varie popolazioni leucocitarie, sono rimaste i colony stimulating factors (CSF): G-CSF (granulociti) M-CSF (macrofagi) GM-CSF (granulociti-monociti) Una famiglia di citochine è accomunata dall’azione biologica di fungere da fattori chemotattici. Per questo sono state denominate chemochine. 
Le citochine possono fungere da ormoni, trasmettitori del messaggio cellula-cellula. La secrezione delle citochine è abitualmente polarizzata nel microambiente, da contatto con la cellula che ha causato l’attivazione. Essa può agire in più modi: autocrino, paracrino ed endocrino. Quest’ultima modalità è la meno frequente nel mondo citochinico (necessità di una risposta localizzata). 
Tutte le citochine sono caratterizzate da alcune proprietà generali: 
­Il peso molecolare è basso, si aggira attorno ai 15-20 kDa, essendo costituite da circa 110 amminoacidi. Sono proteine molto piccole , sintetizzate de novo (non vengono accumulate) e in maniera transiente (hanno un mRNA molto instabile). La loro secrezione, pertanto, è rapida e limitata nel tempo. 
­Hanno un’emivita bassa, del tempo di minuti (2-3). L’azione, quindi, è fisiologicamente localizzata nel microambiente, lì dove sono state prodotte. In circolo sono anche presenti degli inibitori delle citochine, che ne bloccano l’attività biologica. Si ha un notevole metabolismo renale delle citochine. 
­Molte hanno azione locale, paracrina o autocrina. Solo in grandi quantità riescono a dare effetti sistemici di tipo endocrino (TNF) 
­Sono riconosciute da specifici recettori di membrana ad alta affinità (Kd=10-10/10-11), che permettono l’utilizzo di basse quantità di citochine e l’espressione di un basso numero di recettori (100/1000) 
­L’espressione di tali recettori può essere in parte costitutiva, ma in genere la loro produzione massiccia è regolata da segnali esogeni, spesso provenienti dai recettori antigenici (che permettono il mantenimento della specificità della risposta) 
­Danno effetti di cambiamento nell’espressione di geni target e, talvolta, nella proliferazione cellulare. Le chemochine hanno invece effetto sulla mobilità cellulare. ­Esiste un sistema di feedback negativo, per spegnere la risposta. 
I recettori per le citochine sono di tipo molto differente tra loro. Talvolta il recettore è una molecola sola con coda citoplasmatica in grado di trasdurre. Altre volte si ha un dimero (a/ß) in cui o entrambe le catene legano la citochina, ma solo una funge da trasduttore, oppure solo una lega la citochina senza poter trasdurre, ma, in seguito a cambiamento conformazionale, si associa lateralmente ad una catena trasducente. Si hanno anche situazioni più complesse, in cui si hanno tre catene differenti (a/ß/.), come nel caso dell’IL-2R. In questo caso le catene a e ß legano la citochina, conferendo al recettore un’elevata selettività e affinità. Ad esse si associa la catena .. Delle tre catene, solo la ß e la . trasducono. Quest’ultima, che non riconosce la citochina, è una catena trasducente comune per il signaling di varie interleuchine (IL-4 IL-9 IL-15…) In tal modo si spiega come citochine differenti condividano in parte la stessa attività biologica. Il network di tali citochine è perciò ridondante: durante una risposta immunitaria non si ha mai la presenza di una sola citochina, perché si ha una cascata inducente varie citochine (con citochine primarie, secondarie, terziarie…) Essi sono eventi diversi che però a valle trovano sempre NF.B, che attiva diversi set genici. 


Le citochine, pertanto, sono molecole pleiotropiche, in quanto attivano popolazioni cellulari differenti; ridondanti, per garantire alla fine una risposta, anche se manca parte del sistema, e, talvolta, sinergiche. In altri casi, invece, l’azione di due diverse citochine è antagonista. 
Trasduzione del segnale Molti recettori delle citochine, ma non tutti, sono associati a tirosina-chinasi della famiglia Janus. Esse permettono il passaggio del segnale dall’esterno all’interno della cellula (Giano era il dio romano delle porte). Tali chinasi prendono il nome di JAK. Si hanno amplissime combinazioni, dovute all’assortimento di recettori dimerici e di JAK ad essi accoppiate. La citochina media la dimerizzazione delle due catene recettoriali, con transautofosforilazione delle code citoplasmatiche da parte di JAK. Le proteine della famiglia STAT, citosoliche, attraccano alla tirosina fosforilata e, in tale posizione, vengono fosforilate anch’esse da JAK. Le proteine STAT fosforilate, staccandosi dalla catena recettoriale, dimerizzano. Il dimero di STAT è in grado di spostarsi nel compartimento nucleare, agendo direttamente da fattore di trascrizione. La diversa combinazione di STAT, che dipende dal recettore, causa una diversa attivazione trascrizionale. In tale pathway di trasduzione del segnale, si ha un meccanismo a feedback negativo: ad un certo 
punto si ha l’espressione di un gene della famiglia SOCS (Suppressors of cytokine signaling). Le proteine codificate da tale gene, per bloccare la trasduzione, attivano la ubiquitin-ligasi. Tra i vari target, viene mediata l’ubiquitinazione di JAK. Altre SOCS impediscono l’attacco di STAT alla fosfotirosina del recettore. Le SOCS, quindi, bloccano la possibilità che il segnale continui ad essere trasdotto. Topi SOCS-/-muoiono immediatamente per degenerazione epatica, dovuta ad una risposta aberrante all’IFN.. Topi SOCS KO/IFN. KO sono normali. 
Chemochine e recettori chemochinici 
Le chemochine, proteine di 8-12kDa, sono accomunate dalla presenza di una coppia di residui cisteinici, posta in un determinato punto della sequenza. Esistono due famiglie di chemochine, suddivise a seconda dell’organizzazione di tale coppia cisteinica. La famiglia CXC è caratterizzata da una coppia di cisteine separata da un amminoacido qualsiasi. Tra le azioni, ha quella di attivare i granulociti neutrofili. La famiglia CC presenta le due cisteine contigue tra loro, ed attiva le cellule della linea monocitico/macrofagica. Le chemochine possono essere espresse costitutivamente, oppure essere indotte. Esse mediano l’homing delle varie sottopopolazioni leucocitarie nelle zone ad esse specifiche (zone B/T specifiche). Sono prodotte da varie popolazioni cellulari: leucociti, cellule endoteliali, cellule epiteliali, fibroblasti. La loro produzione è indotta dall’ingaggio dei TLR, dal TNFa e da IL-1. I recettori chemochinici sono accoppiati a proteine G trimeriche, a sette domini transmembrana (GPCR G protein-coupled receptor). Il segnale da essi trasdotto media modificazioni del citoscheletro di actina. Sono rapidamente downregolati, con meccanismo a feedback negativo, dalla presenza delle chemochine che legano. Una particolarità è che alcuni microrganismi hanno sfruttato la presenza di tali recettori per poter entrare nelle cellule. Ne sono esempi il Plasmodium vivax e il virus dell’HIV (CCR5, CXCR4). Anche i recettori si suddividono, grossolanamente in CCR e CXCR per una maggiore affinità di legame a chemochine di una piuttosto che dell’altra famiglia. I recettori chemochinici, infatti, sono dei recettori promiscui, per cui uno stesso recettore può legare diverse chemochine e la stessa chemochina può legare recettori diversi. Viene quindi a mancare la specificità tipica, invece, dei recettori citochinici. L’azione biologica di chemochine differenti è simile o uguale, perché legano un recettore che trasduce lo stesso segnale. Esiste, tuttavia, una preferenzialità di legame alla stessa famiglia. Nel reclutamento leucocitario ai siti di infezione, le chemochine si legano agli eparan solfati sull’endotelio ed aumentano l’affinità delle integrine, oltre a favorire il cambiamento citoscheletrico. CCL2 per i monociti, CCL11 per gli eosinofili, CXCL1/2/3 per i neutrofili, CXCL9/10/11 per i TH1. Esse mediano anche l’angiogenesi, la guarigione delle ferite e lo sviluppo degli organi non linfoidi (oltre che linfoidi). 
IL-12  Mediatrice dell’immunità cellulomediata, stimola le NK e il differenziamento delle TH1, con conseguente produzione di IFN., che stimola a sua volta IL-12. Essa è prodotta da cellule dendritiche attivate e macrofagi, in seguito all’ingaggio dei TLR. Aumenta l’attività citotossica di CTL e NK.  
IFNa/ß  La loro secrezione è stimolata da acidi nucleici virali e la loro azione è mediata dal legame con gli IRF (Interferon regulatory factors). Sono prodotte da cellule dendritiche plasmocitoidi, fagociti e fibroblasti. Proteggono contro le infezioni virali e promuovono l’attività cellulomediata: enzimi che interferiscono con la replicazione virale, upregolazione MHC-I, potenziamento dell’attività citotossica, sviluppo di TH1 (mediante upregolazione di IL-12R), inibizione della proliferazione cellulare.  
IL-10  Attività immunomodulatoria, inibisce l’attività di macrofagi e cellule dendritiche attivate. Inibisce la secrezione di citochine che attivano i linfociti T, quali IL-12 (e quindi IFN.) e downmodula MHC-II. È prodotta da macrofagi ed altre cellule non linfoidi. Il virus di Epstein-Barr produce una molecola omologa che spegne le risposte immunitarie.  
IL-6  È prodotta dalle cellule mononucleate del sangue, dall’endotelio e dai fibroblasti in risposta a microbi, IL-1 e TNFa. Stimola la produzione di neutrofili, la crescita dei B differenziati e costituisce un fattore di crescita per il mieloma multiplo.  
IL-2  Media la crescita, la sopravvivenza e il differenziamento delle cellule che ne esprimono il recettore. È prodotta dalle cellule T CD4+ , dopo ingaggio del TCR, con un picco di produzione tra le 8 e le 12 ore. È secreta a livello dello SMAC, così come IL-2R è maggiormente aggregato presso esso. Il recettore presenta tre catene. La catena a è specifica e lega a bassa affinità, la catena ß è comune e contribuisce al legame e all’inizio della trasduzione (JAK-STAT). La catena . infine, è la catena trasducente comune (MAPK, PI3K). Mentre il dimero ß. è espresso a bassi livelli sui linfociti T a riposo ed è a bassa affinità (Kd=10-9M), il trimero con CD25 (catena a) è espresso solo sui linfociti attivati ed ha alta affinità (Kd=10-11M). Si ha una competizione per IL-2, in quanto le Treg esprimono il recettore dimerico e CD25 viene sheddato in seguito a stimolazione cronica. IL-2 media la sopravvivenza e la funzione delle T regolatorie; la sopravvivenza, la proliferazione e il differenziamento delle cellule T attivate (mediante attivazione di Bcl2, cicline e degradazione di p27); la proliferazione e il differenziamento delle cellule NK (LAK, lymphokine activated killer) ad alti livelli; e funge infine da fattore di crescita e stimolo alla secrezione anticorpale per il compartimento B.  
TNFa  Media l’infiammazione nel caso di invasione da batteri Gram ­e causa complicanze nelle infezioni gravi. Viene detto alfa per distinguerlo dalla linfotossina (LT-TNFß). È prodotto dai fagociti attivati (ma anche dalle NK, dai T e dai mastociti), in risposta a LPS e IFN.. È  

sintetizzato come una proteina transmembrana di tipo II, non glicosilata, come omotrimero di membrana in grado di legare TNFRII. È clivato da metalloproteasi MMP in un peptide di 17kDa, risultando in un peptide circolante triangolare. I suoi recettori sono relativamente a bassa affinità rispetto agli altri citochinici (10-9/10-10M). Il legame fa associare nel citosol le molecole TRAF (TNFR-associated factors), che attivano le vie di NF.B e AP-1). Un’altra via attiva le caspasi per indurre l’apoptosi (TRADD – TNFR­associated death domain). Il TNF recluta i neutrofili e i monociti e li attiva. Sull’endotelio media l’upregolazione di molecole di adesione (prima per i neutrofili e quindi per monociti e linfociti), e l’upregolazione di chemochine. Sui macrofagi media la produzione di IL-1 e l’espressione dell’attività fagocitica. Quando è presente in elevata quantità e quindi ha funzione endocrina, produce problemi sistemici: a livello ipotalamico induce febbre, agendo da pirogeno endogeno (aumento prostaglandine), presso gli epatociti media la produzione di amiloide A e fibrinogeno (risposta della fase acuta), induce cachessia (riduzione di tessuto muscolare e adiposo in seguito alla riduzione dell’appetito e della lipoproteina lipasi LPL), induce shock pressorio per diminuzione dell’inotropismo cardiaco e del tono vascolare, induce trombosi per perdita dell’attività anticoagulante dell’endotelio e induce ipoglicemia. Questo quadro è tipico dello shock settico da batteri Gram ­.  
IL-1  Ha attività simile a quella del TNF. È prodotta dai fagociti mononucleati attivati (da LPS, TNF), neutrofili, cellule epiteliali ed endoteliali. Si distinguono IL-1a e IL-1ß, che agiscono sugli stessi recettori, hanno le stesse attività, sono prodotti come precursori, quindi clivati e secreti in maniera non canonica (non hanno sequenze per il reticolo endoplasmatico). Il recettore per IL-1 presenta un dominio TIR (simile a quello dei TLR) e media l’attivazione di NF.B. Diversamente dal TNF, non induce morte per apoptosi e non induce shock settico.  
IL-4  Stimola la produzione di IgE e il differenziamento TH2. È prodotta dai TH2 stessi e dai mastociti attivati.  
IL-5  Attiva gli eosinofili, è prodotta dai TH2 e dai mastociti attivati. Stimola anche la proliferazione dei B e la produzione di IgA  
IFN.  È la principale citochina attivatoria dei macrofagi, è un interferone di tipo II, che non ha alcuna attività antivirale ma attiva le cellule effettrici. È un omodimero prodotto dalle cellule NK (in risposta a ligandi attivatori espressi sulla superficie di cellule stressate), dai CTL e dai TH1 (in seguito a riconoscimento dell’antigene e a presenza di IL-12/IL-18). Induce l’eterodimerizzazione .R1/.R2, con attivazione della via JAK1/2-STAT1. Attiva i macrofagi per uccidere i microbi, di concerto con il CD40L, mediando la produzione di ROS e NO. Favorisce il differenziamento verso TH1 e inibisce quello TH2 (anche indirettamente mediante la secrezione di IL-12), promuove la commutazione verso certe classi anticorpali ed inibisce quelle stimolate da IL-4), upregola MHC-I e II sulle APC e altre proteine coinvolte nella presentazione dell’antigene (TAP, LMP, HLA-DR), attiva le cellule endoteliali.  
TGFß  Inibisce la proliferazione e il differenziamento linfocitario. È un omodimero prodotto dalle cellule T stimolate dal legame con l’antigene, dalle cellule mononucleate attivate, per molte delle quali in concerto con IL-10. Inibisce la proliferazione e le funzioni effettrici dei linfociti T e dei macrofagi, contrasta la proinfiammazione dei neutrofili e dell’endotelio, favorisce il differenziamento TH17, lo switch IgA e la riparazione dei tessuti dopo le risposte infiammatorie.  

Tempistica delle risposte innate 
Quando si dice che le risposte immunitarie innate intervengono “subito”, è necessario spiegare quanto tempo impiegano esse ad attivarsi. A seguito dell’invasione, immediatamente, intervengono le molecole solubili già presenti nell’ambiente, e le cellule che esprimono costitutivamente i TLR. Dopo minuti, le cellule dell’immunità innata producono citochine, favorenti l’aggregazione piastrinica, la coagulazione del sangue (volte alla delimitazione dell’invasione), l’attivazione del sistema del complemento, interferoni, la degranulazione dei basofili tissutali. Dopo 1-2 ore l’endotelio, attivato, garantisce una maggiore permeabilità (si ha edema della parte interessata) ed esprime molecole di adesione. Si ha quindi il rolling delle cellule attivate da stimoli chemiotattici sulla superficie endoteliale. Esse rallentano e, quindi, aderiscono alla parete endoteliale e si schiacciano per poter extravasare. Tale fenomeno è detto diapèdesi. Dopo 4-6 ore si ha la produzione di citochine e chemochine da parte di neutrofili e monociti. IL-8 agisce sui granulociti neutrofili, IL-12 sulle cellule NK, il TNF e IL-1 sugli endoteli, sulla coagulazione, sul controllo della febbre (agiscono sull’ipotalamo anteriore). Le citochine si comportano da pirogeni endogeni: questo è importante per contrastare i virus, che patiscono temperature superiori ai 37°C. Dopo 8-12 ore si ha un aumento della trascrizione genica, con IL-1 e IL-6, che agiscono a livello del fegato. Si ha la cosiddetta reazione epatica, con produzione di proteine della fase acuta. Tali proteine segnalano in circolo che vi è un’infiammazione nel corpo sono: 
­Proteina C-reattiva, in grado di legare il polisaccaride C dello pneumococco, ma anche altri lipopolisaccaridi. Una volta legata, contatta C19, per l’attivazione del complemento (opsonizzazione). La forma biologicamente attiva è pentamerica. Fa parte della famiglia delle pentraxine. 
­Proteina che lega il mannosio, lega i carboidrati dei microrganismi. Una volta legata, attiva il sistema del complemento in quanto somiglia al C19. Si ha opsonizzazione anche in questo caso. 
Risposte naturali: caratteristiche riassuntive Le risposte naturali sono delle risposte filogeneticamente antiche, che si mettono in moto subito, in maniera rapida. Il riconoscimento è basato su recettori di membrana, espressi su tutte le cellule di una popolazione, e sono prodotte tali e quali (il gene non viene modificato). Tali recettori riconoscono strutture essenziali, immutate e condivise da microrganismi, ma assenti nell’ospite. Alla fine della risposta immune, tali meccanismi tornano allo stato di partenza. Non si ha memoria dell’incontro con l’invasore. Tutte le volte che vengono attivate le risposte naturali, vengono anche innescate le risposte adattative: questi ultimi meccanismi determinano l’instaurarsi di una memoria immunitaria specifica, così che, tornando in contatto con tale microrganismo, non si abbia più l’instaurarsi della malattia. 
L’immunità adattativa 
Dopo un certo lasso di tempo (pochi giorni), si ha l’espansione clonale delle cellule che riconoscono specificamente l’invasore. Tali cellule permangono nell’organismo in quantità elevata come cellule memoria. L’immunità adattativa è comparsa più recentemente nella storia dell’evoluzione rispetto all’immunità naturale, attorno a 400 milioni di anni fa, nei pesci cartilaginei. L’induzione di tale risposta è lenta, non è istantanea, in quanto richiede circa una settimana. 
Il riconoscimento è basato su specifici recettori antigenici di membrana, espressi diversamente su cellule della stessa popolazione. Essi sono codificati da geni che riarrangiano, per permettere la creazione di 107-108 recettori da un piccolo pool di DNA. Le risposte adattative sono mono o oligoclonali: di tutto il repertorio cellulare, solo poche cellule esprimono un recettore adatto a riconoscere un particolare microrganismo. Ulteriore caratteristica di tale risposta è la memoria, in modo tale che la risposta ad una seconda esposizione sia più efficace e pronta della prima. Subito dopo la penetrazione del microbo, si ha l’attivazione delle difese naturali e la cosiddetta “fase afferente” dell’immunità adattativa, con riconoscimento immunitario localizzato in organi specializzati. Le cellule dell’immunità adattativa non riconoscono l’antigene in circolo, ma a livello di tessuto linfoide specializzato, quali i linfonodi, la milza o il MALT (tessuto linfoide associato alle mucose). Questo processo permette la “concentrazione” dell’antigene in tali luoghi ed aumenta quindi la possibilità di incontro dell’antigene. Si ricordi infatti che normalmente si ha poco antigene (inizialmente), poche cellule in grado di riconoscerlo e risposte localizzate in specifici punti anatomici. Una volta riconosciuto l’antigene, l’espansione clonale e il differenziamento dei meccanismi effettori (plasmacellule, T helper, T citotossici), si ha la “fase efferente”, con l’attivazione di vari meccanismi di reazione. Anche le cellule B presentano l’antigene ai linfociti TH, iniziando un dialogo con la popolazione T. Il linfocita B, ricevendo citochine e segnali di membrana, si espande clonalmente. Le cellule espanse in parte acquisiscono capacità effettrice, differenziandosi in plasmacellule, tramite la secrezione di anticorpi nel circolo ematico o sulla superficie delle mucose. Altre cellule del compartimento B permangono come cellule B memoria. 
Riassumendo, le caratteristiche delle risposte adattative sono: 
­Specificità per diversi antigeni (epitopi o determinanti antigenici), dovuta alla presenza di recettori differenti per riarrangiamento somatico. Il repertorio linfocitico è in grado di riconoscere da 107 a 109 antigeni. 
­Memoria, per cui la riesposizione ad un antigene stimola una risposta più pronta ed efficace, dovuta ad espansione clonale delle cellule con recettore specifico. 
­Espansione clonale in seguito al riconoscimento dell’antigene da parte di cellule del sistema immunitario specifico, susseguente all’attivazione. Si ha pertanto la formazione di tante cellule con lo stesso recettore, specifico per l’antigene riconosciuto. 
­Contrazione ed omeostasi in quanto la risposta deve prima o poi terminare. ­Non reattività al self per avere tolleranza nei confronti delle strutture proprie dell’organismo. 
Il sistema maggiore di istocompatibilità MHC 
Dopo l’ingresso nell’organismo, gli invasori devono lottare contro l’immunità adattativa, che agisce mediando l’uccisione, l’opsonizzazione e la fagocitosi dei microbi. I microrganismi, per difendersi da tali meccanismi, cercano di penetrare le membrane delle cellule ospiti, “nascondendosi” e proliferando all’interno di esse. Il sistema immunitario, però, ha sviluppato un meccanismo per comprendere se una cellula sia stata invasa o meno: il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Esso è costituito da molecole di membrana, lievemente diverse da individuo ad individuo nella sequenza amminoacidica, responsabili dello scatenamento delle risposte immunitarie contro cellule con MHC differenti da quelli dell’organismo (rigetto). 
Per questo si dice che l’MHC costituisce l’individualità biologica di ognuno di noi. Le glicoproteine dell’MHC hanno la funzione fisiologica di presentare all’esterno ciò che avviene all’interno della cellula. Esistono molecole MHC di classe I e di classe II, con espressione e funzioni leggermente differenti. Particolarità notevole di tale famiglia di proteine è che, durante il corso dell’evoluzione, tutti i geni codificanti per esse sono rimasti raggruppati nel complesso HLA (Human Leukocyte Antigen), sul braccio p (corto) del cromosoma 6 nell’uomo. Tale raggruppamento è presente su cromosomi differenti anche negli altri animali. Il supergene è lungo circa 4 centimorgan (4x106 bp) e contiene i geni codificanti molecole MHC di classe I e II. Inoltre, nel locus sono contenuti geni non codificanti per molecole MHC ma per altro, dette molecole di classe III, per un totale di circa 200 geni. 

Caratteristica di tali geni è quella di avere sequenze regolatrici, promoter, enhancer molto lunghe. Questo permette un controllo molto fine dell’espressione. Tale spazio potrà essere utilizzato durante il percorso evolutivo per formare altri geni MHC. Il raggruppamento di tali geni nel complesso maggiore di istocompatibilità, opponendosi alla naturale “diaspora genica”, deve avere un’importanza funzionale notevole. La diversità delle proteine MHC da individuo ad individuo è dovuta alla presenza di un elevato polimorfismo di tali geni/proteine e dal fatto che tali geni sono codominanti. Il set di alleli MHC presente in ogni cromosoma di un individuo è detto aplotipo. Ciascun individuo ne eredita uno dal padre e uno dalla madre. Tutti gli alleli sono indicati con la lettera del gene e con un numero. Per un individuo completo eterozigote, per tutti i geni del locus HLA, si ha un individuo con lo stesso aplotipo ogni 40 milioni di individui. Al di fuori della famiglia, questo evento è molto difficile, per questo si cerca la maggiore compatibilità per gli alleli maggiormente polimorfici, ossia HLA-A/B/DQ/DR. Se durante la genotipizzazione si nota un solo allele per un gene si hanno due possibilità: o si è omozigoti per tale allele, o si presenta un allele non ancora descritto. 
In principio, erano stati predisposti dei pannelli di alloantisieri umani, ottenuti da donatori immunizzati da alloantigeni: donne pluripare (immunizzate per i geni paterni), volontari immunizzati, pazienti politrasfusi o trapiantati. Questi permisero la distinzione delle varie molecole. 
Le molecole di classe I e di classe II sono fra loro simili, ma non uguali. Presentano una unità strutturale di base, di circa 100-110 amminoacidi, con un ponte disolfuro fra le catene laterali di due residui cisteinici, che separa un’ansa di circa 60 amminoacidi. In realtà, tale struttura è formata da 7 foglietti ß antiparalleli, posti su due piani (4+3), con un ponte disolfuro tra il secondo e il sesto. Questa struttura può presentare residui amminoacidici molto differenti, e molecole con tale dominio sono classificate come appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline. Tale struttura è solida, resistente ma flessibile. Esistono molecole con tali domini replicati più volte in serie. La struttura tridimensionale delle molecole MHC è simile, presenta una tasca extracellulare per il legame con proteine, seguita da domini immunoglobulinici, una porzione transmembrana e una breve porzione citosolica. I residui polimorfici sono posti nella tasca o vicino ad essa. I domini monomorfici contengono siti per il legame di CD4 o di CD8, corecettori delle diverse popolazioni di cellule T. Si ha una sola tasca per ogni molecola, che può legare un solo peptide per volta, ma ogni molecola può legare più peptidi differenti. Alleli differenti permettono la presentazione di antigeni differenti. I geni MHC sono polimorfici perché garantiscono che tutti i peptidi microbici possano essere presentati da almeno alcuni individui della popolazione, evitando l’evasione di tale microrganismo dal sistema immune di tutti gli individui. 
MOLECOLE MHC DI CLASSE I Sono degli eterodimeri, costituiti da due catene, a/ß. La catena a (44-47kDa) è codificata da un gene MHC, e presenta 3 domini extracellulari, detti a1 a2 e a3, un dominio transmembrana e una coda citoplasmatica. Mentre la catena a è una proteina integrale di membrana, la catena ß (12kDa), fondamentale per la struttura, è associata alla membrana. Tale catena è detta ß2-microglobulina, con un dominio immunoglobulinico. Essa forza il ripiegamento del dominio a1, rendendolo capace di legare frammenti proteici. La ß2-microglobulina è formata da 99 amminoacidi, con un ponte disolfuro, ed è codificata da un gene che non è situato nel locus MHC, non è polimorfico ed è localizzato sul cromosoma 15. Tale molecola presenta un’elevata omologia di struttura tra le diverse specie. Senza di essa, non si avrebbe una conformazione stabile della catena a. Essa si associa fisicamente con il dominio a3 e prende contatto con a1 e a2. Le caratteristiche cristallografiche delle tasche di classe I presentano una conformazione standard, a 7 foglietti ß antiparalleli, un dominio a1 e un dominio a2, ciascuno costituito da 4 foglietti ß antiparalleli ed una zona ad a elica. Questo permette la formazione di una tasca, in cui il pavimento è formato dai 4 foglietti ß di a1, e dai 4 di a2. Le pareti sono costituite dalle a eliche di a1 e a2. Tale tasca permette di accogliere una breve sequenza amminoacidica, in conformazione flessibile e distesa. Le molecole MHC I “captano” sequenze amminoacidiche intracitoplasmatiche, processate, accogliendole nella tasca. La tasca ha uno spazio limitato, e non può accogliere più di 8-10 amminoacidi. La traslocazione della molecola in membrana richiede il legame con un peptide processato. Non sono importanti i polimorfismi del dominio a3, in quanto la sua funzione è sempre costante, prendere contatto con la ß2m e altre molecole, in particolare CD8 (espresso dai linfociti T citotossici). Sono invece importanti i polimorfismi nella parete e nel pavimento della tasca, che permettono di presentare o non presentare determinate sequenze amminoacidiche. 
Classe 1A: A-B-C, importanti perché molto polimorfiche. In ordine 5’ . 3’ BCA HLA-A possiede 309 varianti alleliche, HLA-B 559, HLA-C 150. Le varianti alleliche di questi tre geni vengono abitualmente tipizzate. Le molecole di classe 1A sono espresse da tutte le cellule nucleate, in misura minore nei tessuti nervoso, muscolare, delle ghiandole endocrine e degli spermatozoi (per evitare l’attacco alle cellule che costituiscono tali tessuti). Tutte le cellule sono quindi in grado di mostrare all’esterno ciò che avviene al loro interno. L’espressione di superficie conta 105 molecole per ogni gene HLA di classe 1A nella sua variante di derivazione paterna e materna. In condizione di eterozigosi completa per questi tre geni, le cellule dell’individuo presentano sulla superficie 6 differenti tipologie di tasche di classe 1A. 

Oltre a fattori tissutali, alcune citochine hanno tra i loro effetti la upregolazione delle molecole di 
classe I: sono le citochine della famiglia degli interferoni (IFNa-ß-.) e della famiglia del tumor 
necrosis factor (TNFa-ß). Se è in corso un’infezione, le molecole vengono iperespresse, perché si 
ha maggiore necessità di capire ciò che avviene all’interno delle cellule. 

Classe 1B: E-F-G-H, scarsamente espresse e poco polimorfiche. 
HLA-E possiede 6 varianti alleliche, è poco espresso, lega peptidi derivanti da sequenze leader di 
altre molecole MHC di classe I. Lega e inibisce le cellule NK. 
HLA-F è una proteina monomorfica, espressa sui linfociti B e specializzata nella presentazione di 
antigeni oligosaccaridici. 
HLA-G ha 14 alleli differenti, è espressa dal sinciziotrofoblasto e dalla placenta. Sembra coinvolta 
in qualche modo nella morfogenesi, nella tolleranza madre-feto ed inibisce le cellule NK. 
HLA-H è una molecola che regola l’assunzione del ferro interagendo con il recettore della 
transferrina, espresso sugli enterociti. 

MICA e MICB sono geni particolari, posti tra i geni MHC di classe III e le molecole MHC-I 1B. I loro prodotti proteici sono espressi sulle cellule epiteliali, in particolare gli enterociti, e sui fibroblasti. Tali molecole, tuttavia, sono sottoposte ad un controllo dell’espressione completamente diverso da quello delle altre molecole di classe prima. Rispondono a stress cellulari, comportandosi come heat shock protein. Attivano le cellule NK e i linfociti T ./d. 
MOLECOLE MHC DI CLASSE II Le molecole MHC di classe seconda sono dei dimeri a (32-34kDa)/ß (29-32kDa). Entrambe le catene sono proteine integrali di membrana, codificate da geni polimorfici del locus HLA. Le variabilità sono concentrate nei domini a1 e ß1. Il dominio ß2 interagisce con il CD4, espresso dai linfociti T helper. Il dominio a1 è costituito da 4 foglietti ß antiparalleli e da una a elica, così come il dominio ß1. Questo permette nuovamente la formazione di una tasca, in cui il pavimento è formato dai foglietti ß e le pareti dalle a eliche. La tasca ha caratteristiche leggermente differenti da quelle delle molecole di classe I: la tipologia dell’interazione tra le due catene comporta la presenza di una tasca aperta, senza ponti salini. Questo permette di accogliere frammenti peptidici fino a 12-25 amminoacidi. Alla formazione della tasca contribuiscono entrambe le catene. Due geni differenti codificano le due catene: si parla pertanto di locus genici che codificano le catene a e le catene ß 5’ –DPA–DPB –DOA–DMA–DMB –DOB –DQB – DQA –DRB1 –DRB3 –DRA –3’ 

alleli  Combinazioni  
DP  DPA  20  2160  
DPB  108  
DQ  DQA  23  1400  
DQB  56  
DRA  3  1320  
DR  DRB1  440  
DRB3  

Si hanno tre loci genici molto polimorfici e due loci non polimorfici. L’associazione extra-locus delle proteine non è favorita e può avvenire solo occasionalmente. Si può però avere complementazione in cis e in trans, ovvero tutte le combinazioni tra le catene alfa e beta di origine paterna e materna. Per un individuo completamente eterozigote, si hanno contemporaneamente quattro tasche differenti per lo stesso locus polimorfico. I due loci monomorfici sono DO e DM. 
La trascrizione dei geni MHC-II è attentamente regolata: per poter esprimere questi geni risulta necessaria la presenza di un gruppo di proteine che si assemblano tra di loro e permettono la trascrizione di tali loci genici. Tra queste, si ha la proteina attivatore trascrizionale di classe II (CIITA). Non tutte le cellule esprimono le molecole di classe II, ma queste possono essere indotte durante l’invasione: l’interferone ., attraverso la sua via di segnalazione, induce l’espressione di CIITA, inducendo indirettamente l’espressione di molecole MHC-II nelle cellule che normalmente non le esprimono 
o upregolandole in quelle che le esprimono in maniera costitutiva. 
L’importanza del complesso trascrizionale di CIITA è resa palese da una grave immunodeficienza 
dovuta a mutazione di una delle proteine di tale complesso, detta sindrome del linfocita nudo, in 
cui non si ha espressione di molecole di classe II. 

Le molecole MHC-II sono espresse costitutivamente da: cellule interdigitate dendritiche, cellule di 
Langerhans, cellule epiteliali timiche, linfociti B. 
L’espressione può essere indotta dall’IFN. sulle cellule endoteliali, epiteliali, sui macrofagi, i 
linfociti T, i granulociti neutrofili e eosinofili, i fibroblasti ed è ectopicamente espressa dalle cellule 
tumorali di melanoma. 
MHC-II non è mai espresso sugli eritrociti e sulle plasmacellule. 

La presenza di domini monomorfici nelle molecole MHC, siano esse di classe I o II è dovuta al fatto 
che tali regioni sono riconosciute da altre molecole che interagiscono con essi. È necessario che in 
almeno una porzione la proteina non cambi, per garantire un’associazione laterale di membrana. 
I linfociti T citotossici esprimono CD8 ed interagiscono con le porzioni monomorfiche di MHC-I. I 
linfociti T helper, invece, esprimono CD4 ed interagiscono con le porzioni monomorfiche di MHC-II. 

MOLECOLE MHC DI CLASSE III 
I geni codificanti per tali molecole sono posti tra i geni di classe II e quelli di classe I. Tali geni 
codificano per proteine dalle funzioni svariate: 21-ß-idrossilasi, costituenti del complemento (C4A 
C4B C2), due Hsp-70 (1-2) e i due geni del TNF (TNFa/ß) 
Perché in questa zona che codifica proteine HLA si trovano molecole apparentemente slegate dalla 
loro funzione? In tutti i vertebrati l’organizzazione è la stessa, quindi non può essere un caso. 
In questi geni si ha polimorfismo e si hanno geni con duplicazioni in tandem. 
C4B ha 16 alleli, C4A ha 13 alleli. Alcuni di questi sono funzionali e possono indurre alti livelli della 
proteina, alcuni sono silenti. Se tutti e due gli alleli non sono funzionali, si hanno difetti genici con 
deficit nel sistema del complemento. 
La 21-ß-idrossilasi è un enzima coinvolto nella sintesi degli steroidi. Un suo deficit causa iperplasia 
surrenalica congenita. Le Hsp70 sono proteine chaperone, la cui espressione è aumentata a 
seguito di stress cellulare. Esse, infatti, hanno la funzione di legare altre proteine e impedire la 
sintesi con una conformazione errata. RD è una proteina inusuale, a struttura periodica, di cui si sa 
poco. 

IMPORTANZA DELL’HLA 
L’importanza dell’HLA sta nel fatto che varianti alleliche differenti permettono l’associazione o 
meno di peptidi differenti all’interno della tasca, e quindi permettono o meno di mostrare al 
sistema immunitario ciò che succede intracellularmente. 
Tali molecole presentano l’antigene ma, in caso di presentazione di antigeni self, si può avere una 
rottura della tolleranza e l’induzione di una malattia autoimmune. 

L’importanza di tali molecole nella difesa dell’organismo dall’invasione del mondo microbico è stata evidenziata dall’osservazione di una frequenza non casuale di alcuni alleli in popolazioni differenti, in seguito a pressione selettiva. Ad esempio, l’allele B53 nella popolazione europea è presente solamente nell’1% degli individui, mentre in Gambia un quarto della popolazione ha almeno un allele B53. Si è osservato che tale allele correla con la resistenza dell’individuo alla malaria infantile, perché la variante proteica codificata da esso è particolarmente abile a presentare un peptidi derivante dal plasmodio malarico. Questo permette l’attivazione dei linfociti T citotossici contro le cellule infettate. Per questo, gli individui con tale variante allelica avranno maggiori probabilità di sopravvivenza fino all’età adulta e, per questo, di passare l’allele alle generazioni successive. 
LA PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE MHC-I Fisiologicamente, le cellule sintetizzano proteine ed eliminano quelle che, per qualche ragione, non funzionano più in maniera ottimale (prodotte in eccesso, oppure invecchiate). Il destino di tali proteine è segnalato da polimeri di ubiquitina. Le proteine ubiquitinilate sono distrutte da tre milioni di proteasomi in ogni cellula. Nel reticolo endoplasmatico si ha una sintesi costante delle molecole di classe I e di ß2­microglobulina. Queste sono legate ad una proteina chaperone, che ne impedisce il collasso, detta calnexina. I peptidi provenienti dal proteasoma entrano nel lume del reticolo endoplasmatico per azione di trasportatori attivi, eterodimeri dotati di attività ATPasica, detti TAP-1/2 (transporter associated with antigen processing). Nel reticolo endoplasmatico, tali peptidi trovano le nascenti proteine MHC di classe I: le due catene sono assemblate, si ha il rilascio della calnexina ma, dal momento che la tasca per il legame con il peptide è ancora vuota, essa viene sostenuta da due altre proteine chaperone, la calreticulina e la tapasina. Quest’ultima connette fisicamente la molecola con la tasca vuota a TAP­1/2. Il peptide più affine alla tasca (o più concentrato), presente nel lume dell’ER, vi si lega. La proteina con la tasca piena può quindi procedere verso l’apparato del Golgi ed essere esposta in membrana. I peptidi non legati devono essere di nuovo immessi nel citosol: dopo alcune ore si ha un meccanismo differente da quello delle TAP, che riporta i peptidi liberi nel citoplasma, permettendo la loro degradazione completa. Le molecole di classe I vanno quindi in membrana con pezzetti di peptidi self, in quanto derivanti da proteine dell’organismo. Quando la cellula è infettata, si ha una competizione tra i frammenti peptidici self e non self, con un eccesso di proteine dell’invasore (virali). Entro 24 ore i peptidi estranei sono mostrati in superficie dalle molecole MHC-I. La tasca lega il peptide più affine e più numeroso, indipendentemente dall’origine. La cellula infettata presenta quasi totalmente proteine virali. 
Il proteasoma (1300kDa) è formato da quattro anelli sovrapposti, ed ogni anello è costituito da 7 subunità, codificate da geni differenti, più varie subunità regolatorie. Il cavo è di soli 13Å, pertanto la proteina, per passarvi, deve essere svolta nella sua struttura primaria. Il proteasoma è associato con cinque diverse proteine a funzione ATPasica e presenta una regione regolatoria per legare l’ubiquitina. I due anelli centrali hanno funzione proteasica. Quando la cellula è infettata, interviene l’IFN., che modula positivamente la composizione e l’attività regolatoria del proteasoma, formando il cosiddetto immunoproteasoma: 
­Aumenta due unità a basso peso molecolare del proteasoma (LMP2/7), che vanno a sostituire alcune subunità enzimatiche degli anelli centrali. Questo composta un clivaggio dopo residui idrofobici oppure basici. I peptidi con tali caratteristiche sono traspostati preferenzialmente da TAP-1/2 e legano con maggiore affinità la tasca di classe I. 
TAP-1/2 sono molecole a quattro domini transmembrana, trasportatori della famiglia ABC (ATP­binding cassette). Tali molecole sono polimorfiche, i loro geni sono posti nella regione HLA-II. Al 5’ 
dei loro geni si ha il gene per la tapasina, in mezzo i geni di LMP2 – TAP1 – LMP7 – TAP2. 
Ogni individuo può fare entrare un set differente di peptidi all’interno dell’ER a seconda del 
proprio set allelico di TAP-1/2, e quindi esporli. 
Il polimorfismo di LMP è meno importante perché non causa una grande varietà di tipologie dei 
peptidi che vengono a prodursi nel proteasoma. 
Alcuni individui nascono con difetti di TAP-1/2, risultando in bassi livelli di espressione di 
membrana di MHC-I legante peptidi dalla sequenza leader clivata nell’ER. Questo è determinante 
per i linfociti T: non potranno maturare i T CD8+ (citotossici). 
Altri individui, invece, hanno deficit di ß2-microglobulina: non hanno classe I perché la 
conformazione instabile è incapace di legare il peptide. 

LA PRESENTAZIONE DELL’ANTIGENE MHC-II 
Durante l’invasione microbica, si hanno proteine estranee poste extracellularmente. Queste 
possono venire fagocitate all’interno di endosomi che, fondendosi con i lisosomi, vanno a formare 
gli endolisosomi, dove avviene la digestione della proteina (in seguito all’azione delle catepsine e 
del pH acido). 
La violenza dell’azione enzimatica digerirebbe le proteine in amminoacidi o dipeptidi, ma dei 
meccanismi in cui sono coinvolte le Hsp70 limitano la digestione a 10-80 amminoacidi. 
Nel compartimento trans-Golgi, oltre alle due catene di classe II, si ha la proteina invariante, 
prodotta in eccesso rispetto alle molecole MHC-II. Quando si forma l’eterodimero, la proteina 
invariante lega la molecola e ne maschera la tasca. In questo modo, la molecola di classe II non 
sarà in grado di mostrare peptidi di origine endogena, presenti a livello del reticolo 
endoplasmatico o dell’apparato di Golgi. Per l’esattezza, tre molecole di classe II sono legate da tre 
catene invarianti (si ha un trimero di dimeri). 
La catena invariante media anche la migrazione nel reticolo del trans-Golgi e nell’endolisosoma. 
Tale compartimento, con enzimi proteolitici e pH basso, libera la classe II dalla catena invariante. 
In questo modo, l’MHC-II può captare i peptidi esogeni presenti nel lume dell’organello e 
presentarli sulla superficie. 
Nell’endolisosoma le proteasi degradano la catena invariante, ma il pezzo legato alla tasca non si 
toglie. Tale frammento è detto CLIP: class II-associated invariant peptide. 
Il complesso catena a-catenaß-CLIP si associa lateralmente a HLA-DM, monomorfico, che non va in 
membrana e, avendo la tasca chiusa, non lega peptidi. L’associazione fisica provoca un 
cambiamento conformazionale della nascente molecola di classe II che permette l’uscita del 
frammento CLIP dalla tasca, lasciandola libera per il peptide più affine ad essa presente nel lume 
dell’endolisosoma. A questo punto HLA-DM si dissocia. 

I peptidi che si associano a MHC-I e MHC-II si legano sempre all’interno della cellula, le molecole 
non vanno mai in membrana nude, né possono cambiare il peptide che hanno legato nella tasca. 
Per comprendere quali tipologie di peptidi si leghino alle differenti molecole MHC si possono 
dissociare con acido trifluoroacetico (TFA). I peptidi eluiti da una variante proteica di uno specifico 
allele MHC presentano motifs amminoacidici e ancore caratteristiche. 
Si hanno siti di ancoraggio principali ed accessori. Si parla di peptide dominante: esso è più 
frequentemente presentato perché è più numeroso o ha maggiore affinità per una determinata 

tasca. Si ha una competizione tra i peptidi (e tra quelli self e quelli estranei). Non è l’MHC a scegliere cosa presentare. Uno stesso allele può legare diversi peptidi, circa 1000. Lo stesso peptide può legarsi a molecole MHC differenti o essere riconosciuto in maniera differente. Alcuni peptidi si legano solo a particolari varianti alleliche. Il legame MHC-peptide è di tipo debole, ma una volta formato non è dissociabile. Un individuo completamente eterozigote possiede 6 tasche di classe I e 18 tasche di classe II, con la possibilità di presentare in media 24000 peptidi differenti. Il fatto che il legame MHC-antigene sia di tipo permissivo e promiscuo, con competizione tra i peptidi self e i peptidi non-self, mentre il legame TCR-MHC-peptide è specifico, permette il fenomeno della restrizione MHC. Un TCR, per legare un complesso, ha due requisiti: che l’MHC sia specifico, che il peptide sia specifico. Un TCR non riconosce mai da solo il peptide, ma solo quando questo è presentato sull’MHC, in un contesto polimorfico. Zinkernagel e Doherty, alla fine degli anni 1970, effettuarono un esperimento che dimostrò tale evento: infettarono un topo di un particolare ceppo con HCMV (Citomegalovirus umano), quindi prelevarono i suoi CTL specifici per il virus ed effettuarono saggi di citotossicità in vitro su cellule infettate dello stesso ceppo o di ceppo differente, e su cellule non infettate. I CTL erano in grado di lisare solamente le cellule infettate del loro stesso ceppo (presentanti quindi l’antigene non-self su specifiche molecole MHC). 
MOLECOLE MHC-I SIMILI Esistono delle molecole che, dal punto di vista strutturale, sono simili alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità, ma non sono codificate da geni posti nel locus HLA. Una di esse è CD1, una molecola con una catena a simile a quella di MHC-I e accompagnata dalla ß2-microglobulina. Essa, però, si comporta come le molecole di classe II per la captazione dell’antigene, legandosi ad esso a livello dell’endolisosoma. CD1 lega molecole particolari: è in grado di legare peptidi, ma ha particolare affinità per i glicolipidi, molecole presenti nel mondo microbico (acido micolico, lipo-arabinomannani). È espressa su cellule dendritiche e della linea monocitico/macrofagica. 
I linfociti T 
Dopo che le cellule hanno esposto sulla membrana l’antigene, il linfocita T deve riconoscere tale 
antigene esposto. 
Tre sono i concetti fondamentali dell’immunità adattativa: 

­Riarrangiamento genico somatico 
­Clone cellulare 
­Selezione clonale indotta dall’antigene 

Negli organi linfatici primari, a partire dai precursori staminali, si ha la generazione casuale (non antigene-guidata) del repertorio recettoriale. Tali cellule vanno a popolare gli organi linfoidi secondari, dove vengono esposte agli antigeni estranei. Una su un milione esprimerà casualmente il recettore in grado di riconoscere specificamente un antigene estraneo esposto da una molecola MHC. In questo modo verrà selezionata e potrà andare incontro ad espansione clonale. I linfociti T sono cellule molto sensibili all’apoptosi e rimangono in vita solo se ricevono segnali anti-apoptotici. Ogni linfocita T naïve esprime un solo TCR, diverso da quelli altrui. Questo costituisce il repertorio dei TCR. Ogni linfocita esprime 105 TCR sulla membrana, tutti identici. 
IL RECETTORE ANTIGENICO DEI T (VEDI DOPO PER I DETTAGLI) 
Il T cell receptor è un eterodimero a/ß, con catene legate da un ponte disolfuro. Ciascuna catena 
presenta due domini immunoglobulinici. I domini prossimali alla membrana non sono variabili, ma 
sostengono le porzioni variabili (si noti che variabile non è sinonimo di polimorfico). Una 
minoranza di linfociti T, costituente circa il 5% dei T in circolo, esprime un diverso eterodimero, 
con catene codificate da altri geni, ./d. Tale eterodimero ha tuttavia una conformazione simile al 
dimero più comune, con due domini immunoglobulinici per catena. 
Si ha quindi un tratto transmembrana, costituito da amminoacidi idrofobici, con alcuni residui 
carichi positivamente di lisina e arginina, e una breve coda citoplasmatica, incapace di trasdurre 
alcun segnale. 
Ogni TCR riconosce uno specifico complesso MHC-peptide. Esistono TCR per molecole di classe I, 
altri per molecole di classe II. Per interagire con i complessi formati dalle molecole del complesso 
di istocompatibilità, associate a peptidi, si adatta, prendendo contatto con la porzione polimorfica 
dell’MHC e con l’antigene peptidico. Più vasto è il repertorio casualmente formatosi di TCR, 
maggiore sarà il numero di complessi MHC-peptide che l’individuo potrà riconoscere. 
In membrana, esso è sempre accompagnato ad un complesso di molecole trasducenti, sensibili al 
cambiamento conformazionale a cui va incontro il TCR quando lega il complesso MHC-antigene 
specifico. Tali catene che accompagnano il T cell receptor sono dette ., d, e, . e sono 
monomorfiche. Si hanno eterodimeri e. ed ed, che nel complesso formano il CD3, ed un 
omodimero .., tra le due catene del TCR. 
Il linfocita T naïve necessita, per attivarsi, non solo di riconoscere il complesso MHC-peptide, 
attraverso il TCR, ma anche di segnali costimolatori, forniti sempre dalle cellule presentanti 
l’antigene (APC). Questo assicura che il linfocita T si attivi con una cellula dendritica professionista 
e non con una cellula qualunque. 
Il linfocita T esprime in membrana tutta una serie di peptidi che migliorano l’attivazione. Si viene 
quindi a creare, tra la cellula T e la APC, la cosiddetta sinapsi immunologica, con ampi contatti tra 
le due cellule. Tra queste molecole si contano CD4 e CD8. I linfociti T maturi esprimono in maniera 
mutuamente esclusiva uno dei due antigeni di membrana, che conferisce loro specificità differenti 
e denota la loro funzione differente: i linfociti CD4+ sono presenti in misura doppia rispetto ai 
linfociti CD8+ in individui normali. 
Il linfocita T, se attivato e costimolato, prolifera, se invece è negletto e privato di segnale, va in 
apoptosi. 

IL T-CELL RECEPTOR 
Il recettore, che sia a/ß o ./d, mantiene in ogni catena un dominio costante, vicino alla membrana, 
e un dominio variabile, lontano da essa. 
La sua struttura è sovrapponibile a quella delle porzioni distali della catena pesante e alla catena 
leggera del BCR (immunoglobuline, vedi dopo), che ha un dominio variabile e uno costante. 
In che modo il genoma, che contiene solo 30000 geni, può codificare per un repertorio potenziale 
di 1011 diversi TCR? 
Questo è reso possibile da strategie somatiche: la ricombinazione casuale di segmenti genici 
multipli e l’insorgenza di errori nella ricombinazione. 
Si hanno tanti geni a disposizione per codificare la porzione variabile e quella costante. 
Le catene a e . hanno regioni codificate da vari geni: leader L, variable V, joining J, costante C, 
hinge H, transmembrana TM, citoplasmatica Cy. VJ forma la porzione variabile. 
Per le catene ß e d, si ha un terzo gene variabile, posto tra la regione V e la regione J, detto 
diversity D. Tali frammenti genici sono posti a grande distanza gli uni dagli altri. 

Il locus per la catena ß, posto sul cromosoma 7, è organizzato in questo modo, da 5’ a 3’: si ha un pacchetto di geni Vß (~52) preceduti ciascuno da una propria sequenza leader, un gene Dß, 7 geni Jß, 1 gene costante Cß. La porzione D-J-C è duplicata a tandem. I loci per le catene a e d sono posti sul cromosoma 14. I geni per la catena delta sono interposti tra i geni V e i geni J della catena alfa. O si fa la catena alfa, o si fa la catena delta, si perde ciò che è posto in mezzo. Inoltre, si ha una variabilità molto ridotta e il quarto gene Vd è posto dopo gli altri. Da 5’ a 3’: un pacchetto di geni Va (50-70), 3 geni Vd, 2 geni Dd, 3 geni Jd, il gene Cd, un quarto gene Vd, un pacchetto di geni Ja (~60), il gene costante Ca. Il locus per la catena . è posto sul cromosoma 7, e presenta, dal 5’ al 3’: un pacchetto di geni V. (~12), 3 geni J., il gene per la catena costante C., altri due geni J., e un altro gene C.. La trascrizione di RNA messaggeri per i recettori antigenici richiede una ricombinazione, che porti vicine le porzioni variabili. Tale ricombinazione è un processo non omologo. Nel timo si hanno fattori che stimolano il riarrangiamento genico. I primi loci a riarrangiare, sempre, sono i segmenti D con i segmenti J, in maniera casuale. Il DNA interposto tra i due geni si piega, formando un’ansa, e viene eliminato sotto forma di anello. Il complesso DJ, quindi, ricombina casualmente con uno dei geni V. Similmente, si forma un anello, viene eliminato il DNA interposto e si ottiene una sequenza VDJ. Il primo locus indotto a riarrangiare è quello della catena ß. L’RNA trascritto primario deve andare incontro a splicing, per formare un messaggero in cui le regioni VDJ e C siano vicine. Il frammento costante è più facilmente quello del pacchetto J scelto. In che modo i V con i D e i D con i J riescono a riarrangiare in maniera controllata? Tali geni presentano sequenze che segnalano alle recombinasi quali geni possono ricombinare tra loro. Tali RSS (recombination signal sequences) hanno sequenze particolari, conservate e presenti prima e dopo ogni gene delle catene, fra il BCR, il TCR e all’interno di essi. Tali sequenze presentano: un eptamero palindromico e un nonamero ricco di adenosine e timidine. Fra i due si ha una sequenza spaziatrice non conservata. Il numero di paia di basi, però, è conservato: 12, un singolo giro d’elica, o 23, un doppio giro. I diversi geni hanno RSS a monte e a valle: per la ricombinazione devono avere una sequenza spaziatrice di 12bp a monte e una di 23bp a valle. 5’ V-7-23-9 9-12-7 D 7-23-9 9-12-7 J 3’ La ricombinazione richiede gli enzimi RAG1 e RAG2 (recombination activating gene 1/2). Le recombinasi riconoscono il DNA da tagliare quando eptamero e nonamero “dimerizzano”. La rottura a doppio filamento è precisa, al limite tra i geni e l’eptamero. Si toglie la porzione in mezzo: 7-23-9-…-9-12-7. I due frammenti tagliati formano una forcina tra la base del filamento superiore con quella inferiore (in quanto sono code molto reattive). La recombinasi contribuisce a mantenere in prossimità i due hairpin. Per unirsi, i filamenti devono rompere la forcina. La endonucleasi Artemis, taglia la forcina in maniera non precisa, ma con un piccolo errore di 1-2-3 nucleotidi sopra o sotto, con uno spostamento di nucleotidi da un filamento all’altro. 



Si hanno quindi allungamenti asimmetrici a causa del taglio. Si ha allungamento delle estremità e 
quindi interviene la TdT (terminal desossiribonucleotidil transferasi), che aggiunge casualmente 
nucleotidi là dove le estremità si sono allungate. Ne può aggiungere fino a 20 senza copiare da 
alcuno stampo. Le nucleasi tagliano i nucleotidi che non si appaiano e quindi, dopo l’appaiamento, 
si ha la sintesi dei nucleotidi di riempimento. 
Fra la porzione D e la porzione J, per errori di giunzione, taglio e per aggiunta casuale della TdT, si 
hanno regioni palindromiche (P) e nuove (N), non presenti nella linea germinale. 
Le sequenze P sono dovute all’azione di Artemis, le N all’azione delle TdT. Questo meccanismo è 
fondamentale per la generazione di nuova diversità. 
Confrontando fra loro le varie catene ß, intorno al cinquantesimo amminoacido della sequenza, si 
ha una zona notevolmente ipervariabile. Si hanno altre due zone ipervariabili attorno al 70° e al 
90° amminoacido. Queste tre regioni sono dette complementarity determining regions (CDR), in 
quanto determinano la complementarietà del TCR con il complesso MHC-peptide. 
CDR3 è posta nella giunzione tra V e D e tra D e J, ed è dovuta all’errore di giunzione. CDR1 e 2, 
invece, derivano dall’allele V. 
Interponendo un numero di basi casuali tra le porzioni V-D-J, in seguito all’azione di Artemis e Tdt, 
si può avere un numero di basi che sfalsi la cornice di lettura del messaggero. 
Il gene D può essere letto in tutte le possibili cornici di lettura, e per questo è detto gene 
permissivo. 
Tra D e J, invece, viene aggiunto un numero di basi tale da creare, con le basi tra V e D, un multiplo 
di 3, così da permettere la lettura in frame dei frammenti successivi. 
In totale si è calcolata la possibilità di generare 4270 catene a e 2704 catene ß. Aggiungendo la 
libera combinazione eterotipica, si raggiunge la quota di 1,15·107 TCR differenti. Le variabilità 
giunzionali portano il repertorio dei TCR possibili a 1013 . 
Nella catena alfa la giunzione D non viene letta con diverse reading frames, mentre nella catena 
beta questo accade spesso. Si ha poca variabilità dovuta a mutazioni somatiche. 
Nel timo avviene la selezione dei TCR che non sono autoreattivi, ma riconoscono leggermente il 
polimorfismo MHC (si veda più avanti). 
Bisogna tener presente che ogni individuo possiede due corredi VDJC, uno paterno e uno materno, 
entrambi identici in quanto il locus non è polimorfico. 
I loci di entrambi i cromosomi omologhi riarrangiano. Uno dei due alleli, casualmente, completerà 
per primo il riarrangiamento. Se al termine del processo si ha la produzione di una proteina con la 
corretta struttura e funzionalità, si attivano dei meccanismi che bloccano il riarrangiamento 
dell’altro allele, con il meccanismo di esclusione allelica. 

IL CD3 
Gli eterodimeri a/ß ./d del TCR captano i ligando, ma la trasduzione del 
segnale è svolta dal complesso del CD3, con le catene ., e, d e .. Esso e 
presente su tutti i linfociti T. Per facilità di interazione, tutti gli anticorpi 
monoclonali sviluppati contro il CD3 riconoscono la catena e. Se c’è 
essa, ci sono anche tutte le altre catene. 
Le catene ., e e d sono tre catene simili, che appartengono alla 
superfamiglia delle immunoglobuline (posseggono un dominio 


immunoglobulinico e un residuo di aspartato conservato) e sono codificate da geni posti nel locus 11q23. La loro coda citoplasmatica contiene particolari sequenze, dette regioni ITAM (immune receptor tyrosine-based activating motif). Esse contengono due copie di un motivo caratteristico: YXXL-6/8-YXXL Le catene . sono unite da un ponte disolfuro e presentano tre regioni ITAM ciascuna. Non fanno parte della superfamiglia immunoglobulinica e sono codificate da un gene sul cromosoma 1, contenente mini-esoni. Posseggono una breve porzione extracellulare, una regione transmembrana con residui di acido aspartico e una regione citosolica molto lunga. La . è detta trasduttore universale, perché accompagna anche altre molecole, fungendo sempre da trasduttore a valle: CD16 e CD2. Le sequenze ITAM fosforilate sui residui di tirosina da chinasi della famiglia Src (Lck associata a CD4 e CD8, Fyn associata a CD3), legano i domini SH2 delle tirosinchinasi della famiglia Syk (ZAP-70), fondamentali per la propagazione del segnale. Esse riconoscono anche la leucina a valle. 

Si pensa che il TCR si organizzi come un dimero di dimeri. Questo perché, sperimentalmente, si è notato che nelle regioni transmembrana si hanno dei residui carichi positivamente di lisina e arginina: catena a ha 2 cariche, la catena ß una carica. Le catene del CD3 contengono ciascuna una carica negativa, un residuo di aspartato. Ogni TCR ha quindi un totale di 3 cariche positive, ogni CD3 un totale di 6 cariche negative. Per annullare le cariche è necessario un dimero. 
EDUCAZIONE DEI LINFOCITI T Nel midollo osseo si forma una cellula programmata per diventare linfocita T. I precursori, esprimendo sulla superficie cellulare poche molecole di adesione, non permangono nel midollo osseo, ma vanno in circolo e, da qui, nel timo, dove vanno incontro a differenziazione e ricombinazione somatica dei geni per il TCR. Il linfocita T va quindi incontro ad una educazione timica e ad un’educazione periferica, regolate da complessi segnali attivatori, che eliminano rispettivamente il 95% e il 5% dei linfociti T con TCR autoreattivo. In questi processi risulta fondamentale la segnalazione di Notch. La famiglia Notch è costituita da quattro recettori, in inglese detti fate specification receptors, e da due famiglie di ligandi, Delta e Jagged. Il frammento intracitoplasmatico del recettore Notch può essere clivato, fungendo direttamente da secondo messaggero citosolico e, traslocando nel nucleo, fungere da fattore trascrizionale. Il signaling Delta-Notch1 inibisce il differenziamento in senso B. Successivamente Notch fa maturare i linfociti T in Ta/ß e non in T./d e i TH in TH1 o in TH2. Le cellule precursori, muovendosi lentamente, subiscono influssi differenti all’interno del timo: ormoni timici, fattori solubili, citochine, chemochine, contatto con cellule stromali, dendritiche e macrofagi. Alcune molecole prodotte dallo stroma timico sono essenziali per lo sviluppo dei timociti: tra queste, le molecole MHC-I e MHC-II, IL-7, CCL21 e CCL19. 
Nello strato sottocapsulare si hanno i protimociti, dalla ottava settimana di sviluppo embrionale. Essi non esprimono ancora nulla di tipicamente T (CD3 -CD4 -CD8 -TdT -, timociti double negative). Lentamente, i protimociti si spostano nella corticale, dove diventano pre-timociti e sono dotati di altissima proliferazione. Qui si ha anche un elevato tasso di apoptosi in seguito a problemi nel riarrangiamento e alla selezione. Fenotipicamente, all’inizio sono identici ai protimociti: essi arrivano ad ondate e proliferano, man mano maturano. All’inizio non esprimono CD3, CD4 e CD8, ma esprimono catena ß citosolica e TdT (iniziano a riarrangiare Dß e Jß). In seguito acquisiscono un CD3, prima con un TCR contenente una pseudo catena alfa (faß), poi con un dimero completo. Il pre-TCR fornisce segnali di sopravvivenza e proliferazione, ed inibisce un ulteriore riarrangiamento della catena ß, permettendo l’esclusione allelica. Vengono posti in membrana contemporaneamente CD4 e CD8 (pre-T double positive CD4+ 
CD8+). Quando anche la catena a è riarrangiata, l’espressione della TdT e di Rag1/2 è soppressa 
(non è più necessario ricombinare). Si ha delezione del locus d, che è posto all’interno del locus a. 
Si hanno molte possibilità di riarrangiamento. 
Alla fine si ha un linfocita maturo naïve: CD3+ aß CD4+ o CD8+ (single positive). 
Nella midollare ci si ritrova con un 80% di linfociti T con TCR aß e con un 20% di linfociti T con TCR 
.d. Essi non esprimono più la TdT ed esprimono in maniera mutuamente esclusiva il CD4 o il CD8. 
I linfociti vanno quindi in ricircolo, con un homing temporaneo in tessuti linfatici secondari. Si ha la 
produzione di due milioni di linfociti T maturi, naïve. 
Si hanno diversi tentativi di riarrangiamento, con tentativi di riarrangiamento nei pacchetti 
successivi in caso di riarrangiamento errato. Per ogni cromosoma si hanno 2 possibilità. 
Il primo gene a riarrangiare è quello per la catena ß. Nel reticolo endoplasmatico, la catena 
prodotta incontra la catena fa, con un solo dominio immunoglobulinico e va in membrana. Se lo 
pseudo-TCR interagisce con le cellule timiche, si ha un blocco di ulteriore riarrangiamento per il 
locus ß, con degradazione della recombinasi specifica, a seguito di cascata fosforilativa. Inizia la 
proliferazione di questo clone e il gene per la catena a è indotto a riarrangiare. 
La catena a ha molte più possibilità di riarrangiare in maniera efficace. Se il TCR completo va in 
membrana, il segnale cessa e il gene a non può più riarrangiare. 

Inizia quindi il processo di educazione dei linfociti T prodotti. 
Il legame TCR-MHC-peptide dipende dall’affinità, ossia dalla forza di legame di un singolo 
recettore, e dalla avidità, ossia dalla forza di legame complessiva di un linfocita T. L’avidità 
corrisponde all’affinità moltiplicata per il numero di legami. 
Se il linfocita mostra un’avidità molto bassa, non si ha trasduzione del segnale da parte del CD3 e 
la cellula va incontro a morte programmata per apoptosi. 
Se l’avidità è debole, si ha un CD3 parzialmente attivo, che trasduce un segnale antiapoptotico e le 
cellule possono proliferare e lasciare il timo. 
Se l’avidità è forte, il CD3 attivo trasduce un segnale forte che può portare ad apoptosi 
(espressione di Bim) , differenziamento in Treg, in NKT o indurre il cambiamento del TCR. 
Un segnale forte dal CD3 porta a: 

­Rieditare il TCR ­Attivare il fattore trascrizionale Foxp3, fondamentale per il differenziamento a cellula T regolatoria (Treg) CD4+ CD25+ Foxp3+ che, secernendo IL-10 spegne l’autoimmunità ­Differenziare in cellula T natural killer (NKT) che, secernendo IL-13, sopprime il programma 
apoptotico I linfociti con un certo recettore riconoscente l’HLA self e un peptide self assente nel timo ma presente nei tessuti periferici, continuano a maturare. Tali cloni linfocitari sono potenzialmente autoreattivi, si deve pertanto avere in periferia un controllo della tolleranza: possono andare in anergia oppure in apoptosi, a seguito di un’attivazione continua dovuta all’interazione perenne con i complessi MHC-peptide self. Nel timo sono espressi tantissimi antigeni self: in esso, infatti è espresso il fattore trascrizionale AIRE (autoimmune regulator), che favorisce la trascrizione ectopica da parte dell’epitelio timico di molti peptidi, inducendo tolleranza centrale. Topi knockout per AIRE vanno incontro a notevoli episodi di autoimmunità. Un trasferimento dei linfociti AIRE-/-in topi Rag-/-porta allo sviluppo di malattie autoimmuni in questi ultimi. In seguito ad analisi mediante microarray, si è visto che i topi AIRE-/-mostrano molti meno geni attivati nelle cellule del timo rispetto a topi WT. Esistono malattie genetiche autosomiche recessive con mutazioni di AIRE che causano autoimmunità generalizzata. 
Perché il linfocita double positive va incontro ad una “scelta” tra CD4 e CD8, diventando single 
positive? 
Le molecole CD4 e CD8 appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline. A seconda se il 
TCR si è ricombinato per interagire con le molecole MHC di classe I o di classe II, il linfocita T 
differenzierà diversamente. 
Mentre il TCR contatta il complesso MHC-peptide, la molecola CD4/CD8 funge da corecettore, 
contattando una zona monomorfica dell’HLA. 
Per le molecole di classe II, CD4 contatta la porzione ß2. La forza e la durata del legame potranno 
attivare o meno il fattore trascrizionale Th-POK, che reprime il gene CD8 e porta all’attivazione 
definitiva del CD4, indirizzando il linfocita T verso un destino helper. 
Per le molecole di classe I, CD8 contatta la porzione a3. Il linfocita rimane CD8+ e spegne 
definitivamente CD4, indirizzandosi verso un destino da linfocita T citotossico. 

Cosa determina, invece, la produzione di un TCR aß o un TCR .d? 
Si hanno due linee indipendenti. La prima ondata di precursori provenienti dal midollo osseo e 
destinata al timo, attorno alla nona settimana gestazionale, è costituita da T.d. Soltanto 
successivamente, attorno alla decima settimana, si trovano i Taß. Quando l’individuo nasce, nel 
timo maturano in gran maggioranza i linfociti aß e in piccolo numero gli altri. 

La ricombinazione dei geni per le catene . e d è simile a quella per le catene a e ß. Topi knockout 
per la catena ß o per la catena d non presentano la popolazione corrispondente, ma presentano 
un numero normale dell’altra. I linfociti T.d maturi usano poco VDJ: riconoscono molecole dello 
stress cellulare, composti organici di origine micobatterica (non proteica ma liposaccaridica). 
Tali linfociti non sono ristretti dall’MHC, ma possono riconoscere anche senza la presentazione da 
parte di molecole MHC o MHC-simili. Essi sono la prima difesa contro i batteri incontrati, hanno 
funzione killer e di rilascio di citochine. Normalmente sono double negative CD4 -CD8 –. 

ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI T 
La membrana delle cellule, normalmente, esprime 6000 molecole MHC, presentanti i peptidi self 
derivanti dalla degradazione delle proteine della cellula stessa. In caso di infezione da 
microrganismi, si ha la produzione di peptidi batterici, e la conseguente competizione tra peptidi 
self e non self per associarsi alla molecola HLA di classe I. I peptidi non self sono favoriti perché 
sono più numerosi. 
Il linfocita T, interagendo con la cellula, deve essere in grado di discriminare se la cellula è normale 
oppure no. Se il complesso HLA-peptide lega ad alta affinità il TCR, in presenza di segnali 
costimolatori, il linfocita T si attiva. 
Si ha un clone di linfociti effettori e memoria che pattugliano, andando a svolgere la loro funzione 
effettrice sulla cellula infetta. 
L’attivazione linfocitaria richiede un segnale specifico, ovvero l’interazione TCR-MHC-peptide, e 
segnali aspecifici. 
Le zone CDR1 (più esterne) CDR2 (intermedie) e CDR3 (regione P ed N) interagiscono con il 
polimorfismo e la porzione peptidica. 
Il cambiamento conformazionale del TCR legato, induce una deformazione del CD3, nei complessi 
e. ed ed. Le catene . sono invece quelle maggiormente coinvolte nella trasduzione del segnale, 
possedendo tre regioni ITAM ciascuna. 
Non basta però questo semplice contatto ad indurre un’efficiente segnalazione: sono necessarie 
interazioni molteplici tra diversi TCR con più complessi HLA-peptide. 

Avendo ogni cellula 105 TCR totali, quanti contatti devono verificarsi per dare il primo segnale 
selettivo di attivazione? La soglia di segnalazione è raggiunta col sommarsi di segnalazioni multiple. 
Lo stesso TCR va incontro a contatti multipli, con movimento a pistone. 
L’interazione provoca la fosforilazione delle sequenze ITAM, con trasduzione a valle. Più TCR 
interagiscono con più comlessi MHC-peptide. Spostandosi, la cellula contatta più TCR, 
separatamente, con lo stesso complesso HLA-peptide. 
Nel momento in cui il recettore tocca, il CD8 contatta la porzione costante, e questo determina sia 
un’aumento dell’adesione tra le due cellule, sia segnalazione citoplasmatica mediante tirosina-
chinasi. La stessa cosa viene effettuata dal CD4. 
Durante l’interazione si ha uno spike di calcio, mantenuto costante per circa un’ora. In un’ora un 
solo complesso MHC-peptide può attivare 300 TCR. 
Se l’interazione dura più di 5 secondi si ha un’attivazione piena, se dura tra i 3 e i 5 secondi si ha 
un’attivazione parziale, se dura meno di tre secondi non si ha attivazione. 
È necessario del tempo, quindi, per attivare le sequenze ITAM, le TK e la propagazione del segnale. 
I corecettori abbassano la soglia di attivazione. Le citochine non intervengono al momento del 
riconoscimento, ma hanno un ruolo essenziale nella continuazione del processo attivatorio, con 
l’espansione clonale. 
Il primo segnale è specifico: l’incontro è casuale ma pilotato da molecole di adesione, chemochine 
e linfochine. 
I fattori che influenzano l’attivazione sono: 

­l’avidità del legame TCR-MHC-peptide 
­la stabilità di tale legame, resa possibile da molecole di adesione e corecettori. CD4 e CD8 aumentano da 10 a 100 volte la capacità di risposta (sono fondamentali quando si hanno poche molecole MHC presentanti il peptide). 
­la durata del legame 
­il numero di TCR interagenti La comunicazione inizia con il contatto. Esso è mediato da molecole della famiglia ICAM, che fan parte della superfamiglia delle integrine. Le principali in questo compartimento del sistema immune sono quelle della famiglia LFA (lymphocyte function-associated antigen), una integrina essenziale per la formazione della sinapsi immunologica. LFA contribuisce alla formazione dello SMAC (supramolecular activation cluster). Dopo 10-15 minuti si hanno più contatti con molecole che si aggregano nella zona, in seguito a riorganizzazione del citoscheletro: TCR, CD3, CD4/CD8, CD28. Quest’ultima molecola serve per ricevere il segnale costimolatorio. Nella zona periferica di tale SMAC rimangono le molecole di adesione e CD45. LFA-1 lega le molecole ICAM-1/2 e trasduce segnali all’interno della cellula tramite proteine G trimeriche. Altre molecole che prendono parte ai contatti aspecifici tra linfocita T e APC sono ICAM-3/DC-SIGN, CD2/LFA3. Se non vi è riconoscimento da parte del TCR, il legame dura poco, perché LFA-1 inizialmente crea legami a bassa affinità con ICAM-1/2. Se invece avviene il riconoscimento, LFA-1 stabilisce un legame ad alta affinità e le due cellule rimangono stabilmente accoppiate. La sinapsi perdura per circa 15-36 ore, con interazioni successive e piena attivazione del linfocita. Nella trasduzione intervengono anche CD45 e CD28/B7, che forniscono una costimolazione essenziale per l’attivazione. Se essa manca, la cellula T diviene anergica. Il TCR, dopo aver interagito, trasloca in una zattera lipidica, ricca in colesterolo, acidi grassi insaturi, sfingomieline e glicosfingolipidi. Tale traslocazione è importante, in quanto nei lipid rafts sono presenti chinasi inattive della famiglia Lyn e Fyn. È inattiva anche la chinasi Lck annessa a CD4/CD8. Tali chinasi sono inattive 
perché fosforilate. Nel lipid raft aggrega anche CD28 (recettore delle molecole B7). Si riarrangia il 
citoscheletro del linfocita. 
Nel T naïve non bastano TCR e CD4/8. Sono necessarie la costimolazione da CD28, i segnali 
mitogenici dell’IL-2. 
La costimolazione deriva da molecole espresse esclusivamente sulle cellule presentanti l’antigene, 
in particolare sulle cellule dendritiche e sulle cellule della linea B. Questo è importante per evitare 
risposte immunitarie incontrollate. Le APC attivano e danno una risposta T appropriata a seconda 
del tipo di invasione subìta. Si hanno due famiglie di proteine costimolatorie: 

­Le proteine della superfamiglia immunoglobulinica B7 e L-ICOS, che legano i recettori CD28 (>90% T CD4+ >50% T CD8+), CTLA-4, ICOS. CD28 interagisce con B7.1 (CD80, dimerico) e B7.2 (CD86, monomerico) 
­Le proteine della superfamiglia del TNF (OX40, 4-IBB, CD27, CD30). Esse legano 
trimericamente i recettori della superfamiglia TNF-R. La segnalazione stimolata da tali molecole potenzia i segnali del TCR, andando ad attivare gli stessi fattori trascrizionali. Altri segnali trasmessi da esse sono l’aumento della sopravvivenza, la proliferazione e la secrezione di citochine. Solo l’insieme dei segnali costimolatori e provenienti dal TCR porta all’espressione della catena a ad alta affinità del recettore trimerico dell’IL-2, detta anche CD25 e alla produzione di IL-2 con conseguente stimolazione autocrina. Questa porta ad una cascata di citochine, con proliferazione e generazione di un clone di linfociti T effettori e memoria. Dopo il trasloco nelle zattere lipidiche, si ha l’inizio della trasduzione del segnale: CD45 nelle prime fasi del riconoscimento si associa al TCR fisicamente, fungendo da recettore. Esso è anche definito leucocyte common antigen, perché è presente su tutte le cellule di origine ematopoietica. Presenta una coda intracitoplasmatica molto lunga, con attività tirosin-fosfatasica, che rimuove i fosfati alle catene laterali di tirosina C-terminali delle chinasi della famiglia Src, attivandole. Una volta esplicata la propria funzione, CD45 trasloca nella periferia dello SMAC. CD45 è codificato da un gene con molti esoni, e il suo mRNA è sottoposto a splicing alternativo nei primi 3 esoni, con conseguente sintesi di forme più o meno lunghe della proteina. Questo consente di distinguere lo stadio maturativi di un linfocita T. Le Lyk e Fyn attivate fosforilano i residui tirosinici delle sequenze ITAM delle catene costituenti il CD3. Si ha propagazione del segnale: intervengono le chinasi della famiglia Syk, tirosina chinasi presenti principalmente nelle cellule emopoietiche (Syk) e nei linfociti T (ZAP-70). Esse hanno due domini SH2 all’N-terminale, che legano bene le sequenze ITAM completamente fosforilate. ZAP-70 si aggrega alle ITAM della catena . e fosforila i substrati LAT (linker of activation in T cells) e SLP-76. Queste sono molecole adattatrici che regolano l’assemblaggio di complessi di trasduzione del segnale. Alla fine vengono reclutate chinasi della famiglia Tec, presenti nei linfociti. Nelle cellule T la chinasi in questione è Itk, che si associa a SLP-76 e viene fosforilata da Lck. Itk, attivata dalla fosforilazione, riconosce come proprio substrato la fosfolipasi-C gamma (PLC.). L’attivazione della PLC-. attiva la via del fosfatidilinositolo: PIP2 viene clivato in inositolo-3-fosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG). IP3 stimola il rilascio di ione calcio Ca2+ dal reticolo endoplasmatico, con aumento del calcio intracellulare e apertura dei canali del calcio di membrana (calcium­activated calcium release). Il calcio si lega alla calmodulina, che attiva numerosi enzimi, tra cui la calcineurina. Questa è una fosfatasi che defosforila NF-AT (nuclear factor of activated T cells), che dal citosol può traslocare nel nucleo. Questo è il primo fattore trascrizionale a raggiungere il nucleo durante l’attivazione delle cellule T. 
La ciclosporina, una molecola ad attività immunosoppressoria, si lega ad una proteina che blocca l’attività della calcineurina. L’ondata di calcio diffonde nel citosol e di propaga anche alla antigen presenting cell. La via della fosfolipasi C attiva anche, attraverso la produzione di DAG, la via di trasduzione del segnale della proteina chinasi C (PKC). Essa fosforila delle subunità inibenti NF.B, mediandone la degradazione. NF.B, libero, può traslocare nel nucleo, mediando l’espressione di diversi set genici. Nella trasduzione del segnale, prendono parte anche proteine GEF (GTP-exchange factors), che attivano le proteine G monomeriche Ras e Rac. La prima attiva la via delle MAPK, la seconda controlla l’attivazione e la modifica del citoscheletro. Le MAPK fosforilano le proteine C-JUN e C-FOS, che attivano il fattore trascrizionale AP-1. Questo porta all’espressione del gene dell’IL-2 e di CD25. Si hanno in realtà dei meccanismi più complessi, non basta il signaling del TCR. Per ottenere CD25 e IL-2 sono necessari i segnali costimolatori. Essi forniscono: più segnali analoghi al TCR e segnali differenti (aumento di sopravvivenza, proliferazione, secrezione di citochine). Non si ha mai un dialogo monodirezionale tra la APC e il linfocita T. Quest’ultimo fornisce a sua volta altri segnali che potenziano la capacità di presentazione dell’antigene. Le cellule APC professioniste (macrofagi e cellule dendritiche) hanno in membrana altre molecole. Una in particolare ha un ruolo fondamentale: CD40. Esso è un recettore che lega una molecola di superficie del linfocita T espressa dopo la stimolazione del TCR: CD40L. Il legame CD40L-CD40 induce l’espressione di B7. B7 lega il CD28 espresso dai linfociti T e si ha quindi un crosstalk tra il T e l’APC. CD28 possiede una coda che trasduce il segnale indotto dal legame con B7. Tale via di trasduzione dipende dal reclutamento presso la membrana della PI3K e di Itk (amplificazione del segnale di CD3). La produzione di PIP3 porta al reclutamento e all’attivazione di proteine adattatrici con diversi risultati a valle: 
­Espressione più stabile di IL-2 
­Espressione di CD25 
­Stabilizzazione del mRNA di IL-2 
­Espressione di fattori antiapoptotici (Bcl-2) 
­Controllo della sopravvivenza cellulare / riarrangiamento del citoscheletro 
­Inibizione dell’apoptosi mediata da Fas 

Un'altra forma di costimolazione riguarda le molecole della superfamiglia del TNF che agiscono in forma trimerica. I recettori, che agiscono anch’essi in forma trimerica, posseggono delle sequenze intracitoplasmatiche TRAF-2 che reclutano la PI3K. Questa attiva tre vie di trasduzione del segnale: ­Via di Akt, con conseguente sopravvivenza cellulare per upregolazione di proteine 
antiapoptotiche (Bcl-2) e downregolazione delle proteine proapoptotiche (Bad) 
­Via di JNK, che porta all’attivazione di AP-1 e alla espressione di IL-2 
­Via di NF.B, con espressione delle cicline 

Il terzo segnale coinvolto nell’espansione clonale è quello dato dall’interleuchina-2. Il recettore per l’interleuchina-2 (IL2-R) a bassa affinità è espresso costitutivamente ed è un eterodimero ß/.. La catena ß lega e trasduce, la catena . trasduce esclusivamente. Il linfocita T costimolato esprime la catena a (CD25) del recettore, che ha una breve coda intracitoplasmatica, incapace di trasdurre. La catena alfa, da sola, ha bassissima affinità per l’IL-2 (10-8M). Il recettore trimerico a/ß/. ha invece un’altissima affinità (10-11M). La catena a lega una porzione differente della citochina rispetto alla catena ß. Mettendole assieme, si sfruttano le due proprietà funzionali delle catene: la a è in grado di legare velocemente, la ß di dissociarsi meno velocemente. L’espressione di CD25 permette di distinguere i linfociti T attivati da quelli vergini. 
Anche la lunghezza di CD45 permette di riconoscere le due popolazioni: i vergini esprimono un 
CD45 più lungo. 
La trasduzione del segnale di IL-2 attraverso IL-2R avviene attraverso la via di JAK-STAT, che porta 
all’attivazione del ciclo cellulare (passaggio dalla fase G1 alla fase S). 

Il linfocita T effettore necessita, per svolgere la sua attività, solamente di incontrare l’antigene 
presentato da una molecola MHC. Una volta attivata la cellula, è necessario tenere conto 
dell’esistenza di meccanismi a feedback negativo, perché altrimenti le cellule porterebbero avanti 
la loro funzione effettrice, con rischio di infiammazione cronica. 
Si hanno cinque meccanismi di regolazione dell’attività del linfocita T attivato. Esso, in 2/3 giorni, 
esprime in membrana varie molecole: 

­CTLA-4 (molecola appartenente alla famiglia del CD28) ­CD95 (FAS) + ligando (FASL) . uccisione a vicenda dei linfociti T ­Espansione del compartimento Treg ­Soppressione da parte di macrofagi talmente attivati da esprimere l’enzima IDO 
(indoleamina-2,3-diossigenasi) che, interferendo con il metabolismo del triptofano, sopprimono la risposta immune ­Secrezione di citochine immunosoppressorie ed espressione del rispettivo recettore: IL-10, IL-4, TGFß 
L’espressione di CTLA-4 è indotta tardivamente (2-3 giorni dopo) dal legame del TCR con il complesso MHC-peptide. CTLA-4 lega B7 con affinità maggiore rispetto a CD28. La molecola presenta sequenze ITIM (inibenti l’attivazione) con residui tirosinici fosforilati. Vi attracca una tirosin-fosfatasi della famiglia SHP, che defosforila i residui tirosinici ed interrompe i segnali delle ITAM fosforilate, interrompendo i segnali attivatori che giungono al nucleo. Si è pensato di utilizzare CTLA-4 solubile come terapia per bloccare la costimolazione mediata da B7, per controllare il rigetto degli organi trapiantati. 
Le cellule presentanti l’antigene APC Le cellule presentanti l’antigene (APC Antigen presenting cells) sono macrofagi, linfociti B e cellule dendritiche. Le loro funzioni sono quelle di convertire le proteine antigeniche in peptidi e di esporle complessate a molecole MHC (processazione dell’antigene). Inoltre, provvedono a fornire segnali costimolatori. Le APC esprimono recettori di tipo Toll (TLR) che, se legati, stimolano tali attività. I macrofagi possono esprimere MHC-II sotto induzione da parte dell’IFN.. Possono essere costimolati da IFN., LPS, e CD40/CD40L. Sono dotati di attività fagocitica. Le cellule B esprimono MHC-II e CD40 in maniera costitutiva. Possono essere costimolate attraverso CD40/CD40L e attraverso crosslinking del BCR. Le cellule dendritiche (DC) nascono nel midollo osseo, esprimendo CD34, sono stimolate dal GM­CSF. Regolano la tolleranza nei confronti del self quando sono immature. Quando invece sono ormai mature, regolano la risposta dei linfociti T (sia CD4 che CD8) nei confronti dell’antigene. Dal midollo le cellule dendritiche immature passano nei tessuti periferici. Esprimono molti recettori per la fagocitosi, lectine C, alti livelli di recettori per l’Fc delle immunoglobuline (FcR). Hanno un’elevata capacità di fagocitosi e di processazione dell’antigene. Sono in grado di crosspresentare, ossia di presentare in classe I e non solo in classe II. Le tipiche cellule dendritiche immature sono le cellule del Langerhans presenti nella cute, con i granuli di Birbek, pieni di classe I. Secernono citochine che costituiscono segnali di pericolo e di maturazione. Le cellule dendritiche attivate cambiano i propri recettori chemochinici, migrando nei linfonodi. Hanno quindi la funzione di trasportare l’antigene dai siti di infezione ai linfonodi, concentrandolo e ponendolo nella condizione ottimale per incontrare il linfocita che presenta il recettore specifico per esso. La maturazione riduce la capacità di captare gli antigeni ma aumenta la capacità di presentarne i frammenti peptidici: aumenta l’espressione di HLA-I e HLA-II, aumenta l’espressione delle molecole costimolatorie B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86). Il signaling di CD40 induce l’espressione e secrezione di IL-12 con attivazione delle cellule NK. Le DC possono anche indurre tolleranza o stimolare la differenziazione dei TH in senso canonico (TH1) o alternativo (TH2). Le cellule dendritiche hanno moltissimi recettori per percepire ed acquisire i segnali in periferia, con elaborazione dell’informazione (maturazione). Migrano ai linfonodi per trasferire l’informazione ai linfociti T naïve lì residenti, attivandoli. 
Attivatori dei linfociti T 
I linfociti T possono essere attivati, naturalmente ed artificialmente, in diversi modi: ­Attivatori oligoclonali: complessi HLA-peptide ­Attivatori policlonali: 
o 	Mitogeni: 

• 	
Lectine vegetali: concanavallina, fitoemagglutinina: una testa globulare che lega gli zuccheri sposta sulla membrana le molecole che ha legato, ed alcune di esse possono trasdurre segnale 

• 	
Anticorpi aCD3-aCD28, attivano i complessi trasducenti di tutti i linfociti T, inducendo una deformazione del CD3 come se il TCR avesse legato il complesso HLA-peptide. 

• 	
Esteri del forbolo e ionomicina 



o 	Superantigeni: sono degli antigeni che attivano varie popolazioni linfocitarie. Gli antigeni convenzionali attivano una cellula ogni 105-108. I mitogeni attivano tutte le cellule. I superantigeni attivano 1 cellula su 10 (dal 5 al 25%). Tali superantigeni sono presentati da MHC-II non processati. Sono poco ristretti dagli aplotipi. Legano il TCR all’esterno del sito attivo, escludendo le CDR. Alcuni si legano alla catena a, altri a quella ß dell’MHC di classe II, in una porzione poco polimorfica. Comunque, contattano sempre la catena ß del TCR. Attivano i linfociti T che esprimono una particolare catena Vß. Hanno come conseguenza biologica quella di indurre una fortissima risposta immune, con conseguente tossicità sistemica e immunosoppressione. La presenza di superantigeni endogeni porta ad una grave lesione del repertorio, con perdita di intere popolazioni esprimenti specifiche Vß. 

• 	
Tossine stafilococciche 

• 	
Esotossine streptococciche 

• 	
Supernatanti di Mycoplasma arthritidis 

• 	
Esotossine della Pseudomonas aeruginosa 

• 	
Antigeni della Yersinia pestis 

• 	
Proteina M streptococcica 

• 	
Retrovirus 




Effetti biologici dei linfociti T 
In seguito ad espansione clonale si ha un aumento della quantità dei linfociti T reattivi contro il 
determinato antigene da 1 su 106 a 1 su 103. Per i linfociti CD8 si ha una frequenza anche superiore 
(1/10). 
Essi possono avere diverse funzioni: 


­Rilascio di citochine e guida dell’infiammazione (linfociti helper) 
­Uccisione, induzione dell’apoptosi, necrosi (linfociti citotossici) 
­Toccare e rilasciare citochine attivanti i linfociti B a produrre anticorpi e guidare la risposta 

immunitaria Finita l’attivazione, i linfociti T o muoiono per apoptosi o permangono come linfociti memoria, oppure nel circolo. Sono i responsabili della guarigione dalle malattie virali. 
LINFOCITI T CITOTOSSICI CD8+ Una volta che il linfocita T si è attivato e differenziato, non ha più bisogno che il bersaglio abbia particolari caratteristiche: sarà sufficiente che esso esprima la tasca MHC con il determinato peptide. I contatti con le cellule da eliminare sono determinati anche da molecole aspecifiche di adesione, quali LFA-1 CD2… Il TCR, interagendo con il complesso MHC-peptide, trasduce un segnale che fa sì che il linfocita riversi sul bersaglio tutto il potenziale citotossico. Questo comprende segnali apoptotici o meccanismi che inducono la necrosi per lisi delle membrane. Tale contatto intimo di membrana dura poco tempo, attorno ai 5 minuti, ed è detto bacio della morte. Dopo il distacco del linfocita T dalla membrana, la cellula bersaglio sembra apparentemente normale, ma nel giro di 2-6 ore cambia, gonfiandosi fino allo scoppio in caso di morte per lisi delle membrane, con necrosi da shock osmotico, oppure si rimpicciolisce a formare i corpi apoptotici. Il linfocita citotossico, invece, non presenta nulla di alterato ed è già pronto a contattare un’altra cellula: in un’ora esso è in grado di uccidere molte cellule bersaglio. Nei granuli del linfocita citotossico sono contenute: 
­Perforine, proteine in grado di polimerizzare in presenza di calcio Ca2+, a formare pori nelle membrane cellulari. Sono analoghe al componente 9 della cascata del complemento 
­Granzimi (A/B/C), serina proteasi/esterasi che, entrando nella cellula bersaglio attraverso i fori delle perforine, mimano l’azione delle caspasi, inducendo l’apoptosi per via mitocondriale (attivano caspasi 3 e Bid). Clivano specificamente dopo residui di aspartato 
­Serglicina, un proteoglicano solfato, grosso e pesante, a lenta diffusione e in grado di 
legare la perforina. Serve ad assemblare il complesso e a polarizzare la risposta Il contatto con il TCR porta al riarrangiamento del citoscheletro, facendo sì che molti granuli si spostino nella zona di contatto fra il linfocita citotossico e il bersaglio (SMAC) e vengano rilasciati per esocitosi (degranulazione). Le molecole sono rilasciate nello spazio virtuale tra il linfocita T ed i bersagli. Le perforine, molecole leggere, si assemblano in gruppi di 12, a formare un poro. I granzimi, da soli, non sono in grado di attraversare le membrane. Le attraversano grazie ai pori formati dalle perforine. Come fanno queste ultime ad assemblarsi soltanto sulla membrana della cellula bersaglio e non su quella dello stesso CTL? Le serglicine, lente a diffondere, rimangono praticamente a contatto con la membrana del linfocita e, legando le perforine, ne impediscono la polimerizzazione su di essa. Si ha anche la catepsina B, che impedisce l’assemblaggio delle perforine sulla membrana del CTL. I complessi possono anche venire endocitati dal bersaglio e, una volta all’interno della cellula, i granzimi possono essere rilasciati nel citosol. La morte per necrosi dipende dal numero di pori che si sono assemblati sulla membrana della cellula bersaglio. Se sono pochi, la cellula riesce a “riparare” i pori. Se sono di più, la cellula non riesce, entra acqua all’interno e la cellula si gonfia fino a scoppiare (essendo ipertonica rispetto all’ambiente extracellulare). Il granzima, comunque, agisce. In questo modo, se la cellula non muore per necrosi in 1-2 ore, muore per apoptosi in 6-12. Anche le cellule NK presentano lo stesso tipo di granuli (vedi dopo). 
Tra i due meccanismi di eliminazione delle cellule, il migliore è quello per apoptosi, per evitare il rilascio di materiale infetto nel liquido extracellulare e perché le proteasi a volte riescono a mediare la degradazione del DNA dell’invasore. I CTL esprimono anche in membrana o rilasciano altre molecole, che possono determinare la morte apoptotica: 
­ATP che, attraverso i recettori purinergici, media la formazione di pori di membrana e 
conseguente apoptosi 
­TNF, che agisce attraverso i suoi recettori TNFR in forma trimerica 
­FASL, che lega FAS, inducendo l’apoptosi (appartiene alla superfamiglia del TNF) 
­TRAIL, anch’esso membro della superfamiglia del TNF 

Si può anche avere uccisione mediata da citochine rilasciate nel liquido: esse possono attivare i macrofagi, i granulociti e le NK. 
Il recettore FAS agisce in forma trimerica, contenendo intracellularmente il Death-domain. In seguito ad interazione con il proprio ligando FASL, ad esso si associano le proteine FADD (Fas­associated death domain), che attivano la procaspasi 8 in caspasi 8, dando il via alla cascata apoptotica. I recettori della famiglia TNFR-1, contenenti anch’essi il death domain, legano TRADD (TNF­associated death domain), che recluta FADD, portando alla stessa cascata attivatoria per la procaspasi 8. 
CITOCHINE IMPORTANTI NEL COMPARTIMENTO T Le tre famiglie di interferoni (a ß .) hanno capacità di indurre RNA e proteine che conferiscono resistenza alle infezioni virali. La famiglia dell’interferone alfa (IFNa) comprende 23 isoforme di tale proteina, dai 18 ai 20 kDa, che condividono lo stesso recettore. Esso è espresso sulle cellule NK, sui macrofagi, i linfociti, le cellule dendritiche ed altre popolazioni cellulari. Spesso la sua espressione è costitutiva. L’interferone gamma (IFN.) è una proteina di 146 amminoacidi, dal peso di 20-35kDa, che non ha alcuna omologia con gli interferoni delle altre classi. È prodotta dai linfociti TH1, dai natural killer e dai linfociti T citotossici. Agisce come omodimero. La sua produzione e secrezione è indotta dal contatto con l’antigene e dalla presenza di IL-12. Agisce su macrofagi, linfociti (mediando il differenziamento verso il fato TH1 o inducendo l’apoptosi), sulle cellule endoteliali. Upregola le molecole MHC, B7, FcR (CD16 CD32 CD64), ICAM-1, CIITA. Upregola la secrezione di monossido di azoto NO nei macrofagi. Il riconoscimento dell’antigene presentato dalle APC induce la produzione di IFN., che agisce sulle T stesse e sulle APC. Inoltre le APC rilasciano IL-12, che stimola il rilascio di IFN. da parte del linfocita T. L’interleuchina 12 è una citochina particolare, perché è un eterodimero, formato dalle proteine p40 e p35. Il recettore per essa (IL-12R) è un dimero con catene ß1 e ß2, che riconoscono la citochina, presenti sui NK e sui linfociti T. Un linfocita CD4+ naïve stimolato con l’antigene e l’IL-12 differenzia in TH1, specializzato nella produzione di IFN. Il recettore per l’interferone . è un tetramero, con due catene .R1 e due catene .R2. L’interferone agisce come omodimero. Il tetramero recettoriale presenta 2 molecole JAK-1 e due molecole JAK­2, che attivano la trasduzione del segnale mediante la formazione di un omodimero STAT-1a sulla catena .R1. Solo queste catene legano la citochina e vengono fosforilate su residui tirosinici. 
I recettori IFN.R1 legano l’IFN. e sono espressi ubiquitariamente. IFN.R2 permettono la trasduzione del segnale al nucleo e sono espresse costitutivamente solo in alcuni tipi cellulari. La sua espressione è regolata sui linfociti T. Ricircola tra gli endosomi e la membrana. Se è molto espresso in membrana, la cellula va incontro ad apoptosi. 
L’interleuchina-2 è una proteina di 133 amminoacidi, dal peso di 14-22kDa, costituita da 4 a-eliche con porzioni random coil e un legame disolfuro interno. Per questo è dotata di notevole stabilità nei confronti di agenti chimici e fisici. È prodotta dalle cellule T ed NK, possiede un’emivita di minuti, come tutte le citochine e, pertanto, ha azione autocrina o paracrina. Essa ha azione fondamentale per la proliferazione dei linfociti T attivati, costituisce il fattore di progressione del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S. È in grado di attivare i linfociti B, i macrofagi e i granulociti neutrofili. L’attivazione macrofagica indotta dalla IL-2 è differente da quella indotta da IFN.. In grandi quantità, agisce anche sulle NK, generando le LAK (lymphokine activated killer) in vitro. In gran parte sono cellule NK con maggiore potenza killer e maggiore vastità di bersaglio. Somministrata ad alte dosi per via sistemica ha azione antitumorale (si utilizza come farmaco l’IL-2 ricombinante). Un T naïve presenta costitutivamente IL-2R con catene ß., a bassa affinità (kd=10-8M). Il linfocita T attivato mette in membrana CD25, la catena a del recettore. Essa porta ad un aumento enorme di affinità (kd=10-11M). La trasduzione avviene attraverso la via di trasduzione JAK1/3 – STAT5 e porta alla trascrizione e sintesi di cicline. Esse agiscono sulle chinasi ciclina-dipendenti e fanno avanzare il ciclo cellulare. Il segnale trasdotto ha anche altri effetti: inibisce p27, che è un’inibitore dei complessi ciclina-CdK, attiva la PI3K e la via delle Ras-MAPK, media la sintesi di Bcl2, antiapoptotico. L’interruzione della segnalazione è mediata da CD25. Il gene, ipertrascritto, porta ad avere un sovraffollamento di catena a sulla membrana cellulare, con conseguente shedding fisiologico. La catena a viene quindi rilasciata nel microambiente, dove funge da “tampone”, legando l’IL-2, competendo per essa con i recettori di membrana. La catena a non trasduce, quindi il legame sequestra l’IL-2 dai complessi trasducenti. La catena ., trasducente, è fondamentale per diversi recettori interleuchinici: IL-2R IL-6R IL-7R IL­9R IL-15R. Se il gene non funziona, si ha una grave immunodeficienza composita (SCID). Il sistema dell’IL-2 e del suo recettore viene manipolato terapeuticamente nell’immunoterapia dei tumori: 
­Linfociti estratti dal sangue periferico di un paziente possono essere incubati con IL-2 ricombinante a formare LAK, da reinoculare 3 volte a settimana insieme ad una terapia sistemica a base di IL-2 
­Somministrazione di IL-2 ad alte dosi (carcinoma renale, melanoma) 
­Somministrazione di IL-2 locale. 
­Cellule tumorali trasfettate con il gene di IL-2 

Il sistema deve invece essere modulato/inibito per indurre immunosoppressione nei trapianti o 
nelle malattie autoimmuni: la ciclosporina A inibisce l’azione di IL-2 e di altre citochine, la 
rapamicina agisce su CD25 e su IL-2R, il Tacrolimus (FK-506) modula la secrezione di IL-2. Sono 
possibili anche terapie con anticorpi monoclonali aCD25 o coniugati IL-2/tossina. 

LINFOCITI T HELPER CD4+ 
I linfociti T helper, quando si attivano, producono tante citochine di vario tipo. Sotto determinate 
condizioni, a seconda dell’invasore o del tipo di stimolo, specializzano in un senso (TH1) o nell’altro 
(TH2), determinando il quadro responsivo generale. 

I T helper 1 secernono IFN., IL-2 e TNF, i linfociti T helper 2 secernono IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. I batteri endocellulari e i virus stimolano le cellule NK e i macrofagi. I macrofagi secernono IL-12 e IFN., che stimolano il differenziamento TH1. Tali linfociti secernono IFN. con attività paracrina e autocrina, stimolante i macrofagi, IL-2 stimolante i CTL, e stimolano i linfociti B a produrre IgG per l’opsonizzazione dell’invasore. Inoltre, è fondamentale anche l’interazione CD40-CD40L per garantire la difesa mediata da fagociti. L’azione è garantita nel sito di infiammazione per l’espressione di un set di chimochine/recettori specifico. L’attivazione dei macrofagi permette la produzione di ROS, NO ed enzimi lisosomici, citochine e chemochine proinfiammatorie, PAF (platelet activating factor), prostaglandine, leucotrieni. Permette la riparazione dei tessuti mediante secrezione di fattori di crescita stimolanti i fibroblasti (PDGF platelet-derived growth factor) e la neoangiogenesi. In caso di allergeni o colonizzazione da elminti, sono stimolati i mastociti, che inibiscono la secrezione di IL-12 e l’infiammazione. La secrezione di IL-4 indirizza il differenziamento verso un fato TH2. Tali linfociti secernono IL-4 ad attività autocrina e stimolano le cellule B a secernere IgE e IgG4. L’IL-5 attiva gli eosinofili, con produzione di MBP (major basic protein), e la sintesi di IgA. La secrezione di IL-13 e, soprattutto, IL-10, inibisce l’attività macrofagica. L’espressione dei geni di interleuchine antagoniste quali IFN. e IL-4 sono controllate: i T naïve presentano solo il gene per IL-2 accessibile a NF-AT. L’accessibilità dipende dallo stato di condensazione della cromatina (l’acetilazione istonica facilita l’accesso ai geni interleuchinici) e dalla metilazione dei geni (che inibisce la trascrizione). 
Gene metilato  Istoni acetilati  Fattori trascrizionali  
T naïve  IL-4 IFN.  IL-2  NF-AT STAT5  
TH1  IL-4  IFN.  NF-AT STAT4 Tbet  
TH2  IFN.  IL-4 IL-5 IL-13  STAT6 GATA3  

Da dove proveiene IL-4 prima dello sviluppo della popolazione TH2, che lo produce, se il differenziamento di tale popolazione richiede IL-4? I linfociti T CD4+ stimolati dal riconoscimento dell’antigene presentato, producono IL-4 a bassi livelli. Se tale stimolazione persiste senza la presenza di IL-12, allora si ha un pieno differenziamento TH2, con stimolazione autocrina. È stata descritta una nuova popolazione di T helper, differenziata in presenza di TGFß e IL-6 (il solo TGFß media il differenziamento Treg), detta TH17. Essa presenta il recettore per IL-23 e secerne varie citochine. Tra esse le principali sono IL-17, IL-6 e TNFa. Tale popolazione media un forte stato infiammatorio ricco di granulociti neutrofili, regola la funzione e la maturazione delle cellule della linea B, attiva gli osteoclasti e può essere coinvolta nello scatenamento di reazioni autoimmuni. 
Le cellule natural killer NK 
Durante l’infezione da parte di un virus o nel caso di cellule tumorali, l’espressione di MHC-I può essere compromessa. In questo modo, l’attività di controllo del compartimento T con TCR specifici per le molecole di classe I risulta incapace di alcuna attività effettrice. Si è evoluto un meccanismo che permettesse di sorvegliare lo stesso anche tali cellule. Esse non mostrano in membrana una sufficiente quantità di peptidi self complessati alle molecole di classe prima. Viene quindi a mancare una corretta rappresentazione del self (missing self). Le cellule NK entrano in gioco in tali condizioni, in quanto esprimono recettori per le molecole di classe I. Quando tali recettori sono accoppiati al loro ligando, trasducono all’interno della cellula segnali inibitori. Si ha anche l’espressione di diversi recettori per lo stesso ligando, con gradi di affinità diversa. Alcuni recettori hanno coda citoplasmatica lunga con sequenze ITIM, altri coda 
breve. In questo modo si ha la trasduzione di segnali con funzioni opposte, a seconda della 
quantità di ligando disponibile. 
Le cellule natural killer si sviluppano nel midollo osseo, ed assumono, differenziandosi, l’aspetto di 
grandi linfociti con granulazioni (LGL large granular lymphocytes). Tuttavia, diversamente dagli 
altri linfociti, non esprimono recettori riarrangiati. Rappresentano un 10-15% di tutti i linfociti 
circolanti, sono presenti in misura minore anche nella milza, mentre sono spontaneamente 
presenti nei polmoni, fegato, villi intestinali e decidua mestruale. 
In superficie non esprimono né CD3 né il BCR. Esprimono però recettori per l’Fc delle 
immunoglobuline G (CD16), molecole d’adesione integriniche, CD2 e CD56 (N-CAM), oltre a 
svariati recettori citochinici. Quando percepiscono il bersaglio, lo uccidono e rilasciano citochine. 
L’attività è regolata dal bilancio tra segnali esogeni attivatori ed inibitori. 
I recettori inibitori presentano code lunghe e sequenze ITIM intracellulari. Si hanno recettori 
appartenenti alla superfamiglia immunoglobulinica, quali i KIR (killer Ig-like receptors) e gli ILT (Ig­like transcripts, CD85), e recettori della famiglia delle lectine C (CD94, NKG2-A, NKG2-B). 
Essi riconoscono gruppi di alleli delle molecole MHC IA e IB. Se sono accoppiati al loro ligando 
naturale, la sequenza ITIM, fosforilata su tirosine, media l’attracco delle tirosina fosfatasi SHP-1 e 2, 
che defosforilano, tra le altre, le sequenze ITAM di attivazione. Tale segnalazione è rapida e 
transiente per permettere il riconoscimento veloce di molte cellule. 
I recettori attivatori presentano code corte, incapaci di trasdurre direttamente segnali. Si hanno 
recettori che riconoscono ligandi attivatori non identificati, di tipo immunoglobulinico e lectinico, 
e recettori che legano le molecole MIC-A e MIC-B (HLA-IB), espresse da cellule sottoposte a stress, 
infettate da CMV o tumorali. 
MIC-A è presente in 50 forme alleliche differenti, espressa basalmente su cellule di endotelio, cute 
e mucosa intestinale. Può essere riconosciuta da NK-G2D. Anche i linfociti T.d possono riconoscerla. 
MIC-B presenta 20 isoforme alleliche e può anch’esso essere riconosciuto da NK-G2D e T.d. 

NK-G2D, una volta riconosciuto il proprio ligando (MIC-A/B), si associa lateralmente sulla 
membrana con la proteina DAP10. Essa è un dimero legato da ponte disolfuro extracellulare. La 
sua porzione esterna è alquanto limitata, mentre presenta una ampia catena intracellulare con 
sequenze fosforilate che reclutano la PI3K, portando ad attivazione della risposta citolitica. 
Si hanno anche recettori ad affinità più bassa rispetto a quelli inibitori per le molecole MHC-I, privi 
di coda citpolasmatica. Essi sono KIR-S (membro della famiglia immunoglobulinica), CD94 e NK­G2C, membri della famiglia delle lectine. 
Essi si associano alla proteina DAP12, con sequenze ITAM fosforilate, che permettono l’attracco 
della chinasi Syk, portando alla fine ad attivazione della risposta litica. 
CD16 è un’altra molecola di attivazione, in grado di legare a bassa affinità (10-6M) le IgG nella loro 
porzione Fc. È in grado di legarle solo quando formano immunocomplessi, ovvero quando sono 
legate all’antigene per cui sono specifiche (opsonizzazione). 
Mediano l’avvicinamento della cellula NK alla cellula bersaglio, ricoperta di immunoglobuline, 
causando la ADCC (antibody-dependent cell citotoxicity). L’attività effettrice è però dovuta al 
rilascio da parte del linfocita NK di granuli contenenti perforine e granzimi. 
CD16, ovvero il recettore per la porzione Fc delle IgG, agisce attraverso varie vie di segnalazione: 
esso può contattare un omodimero .., le cui catene sono le stesse del CD3, con 3 sequenze ITAM, 
un omodimero .., con catene differenti dalle altre . descritte in precedenza, contenenti 1 
sequenza ITAM ciascuna, e un eterodimero ... 
Alle fosfotirosine della catena . si associa ZAP-70, a quelle della catena . Syk. 

Come già detto, l’attività NK dipende da un bilancio dei segnali: il segnale attivatore è mediato dalle lectine ed ha attività fosforilante substrati proteici, il segnale inibitore è mediato da KIR, che lega le molecole MHC, ed ha attività fosfatasica. Il segnale inibitore domina su quello attivatore. Tra le funzioni delle cellule NK si ha la funzione di immunoregolazione: attraverso il rilascio di citochine, di cui la principale è l’IFN., si attivano i TH1, i CTL, i macrofagi e si ha autoattivazione delle NK,con conseguente guarigione dalle infezioni virali. Controllano l’infezione permettendo al sistema immunitario adattativo di svilupparsi appieno. Il rilascio di citochine controlla anche l’ematopoiesi. Le cellule NK sono dotate anche di citotossicità naturale contro le cellule non esprimenti più in maniera corretta le molecole self. L’attività delle NK è stimolata da fattori locali quali adesione, presenza di immunocomplessi, citochine e segnali di stress cellulare, e da fattori sistemici quali ormoni, altre citochine, situazioni di stress psicofisico. Una bassa attività NK aumenta la suscettibilità alle infezioni da Herpes quali H. zoster, EBV, CMV. A livello del midollo osseo, la presenza di IL-15 stimola il differenziamento delle cellule in NK. Anche i macrofagi e le cellule dendritiche possono stimolare le NK con secrezione di IL-12, IL-15, IL­18 e IFNa. A loro volta, gli NK producono TNFa che media la maturazione delle DC, e di IFN. che attiva macrofagi e cellule T 
Il compartimento B 
I linfociti B derivano da cellule precursori del midollo osseo, che rimangono a livello midollare, 
autorinnovandosi. 
La cellula staminale CD34+ può differenziare in senso linfocitario, NK o DC. I linfociti B sono 
scarsamente rappresentati in circolo, costituendo circa il 15% dei leucociti nel sangue periferico. 
Essi, infatti, si localizzano a livello dei tessuti linfoidi secondari, quali i linfonodi, la milza e il MALT. 
Le cellule sono poste a stretto contatto nello stroma midollare, dove subiscono l’influsso di varie 
citochine. 
Inizialmente, l’IL-3 media una prima, ampia differenziazione. Quindi, sotto l’influsso di IL-4, IL-5 e, 
soprattutto, IL-7 (prodotta dalle cellule stromali), la cellula progredisce in senso linfoide B, 
riarrangiando la catena pesante, quindi la catena leggera. Infine, la cellula sarà in grado di 
esprimere in membrana IgM. In seguito esprime anche IgD. Ogni linfocita B esprime circa 105 
immunoglobuline di superficie, tutte con la stessa porzione variabile. Interagiscono con l’antigene 
libero, non presentato. 
Il linfocita B che riconosce specificamente l’antigene va incontro ad attivazione e differenziamento, 
dipendenti dall’antigene. Esso diventerà una plasmacellula o un linfocita B memoria. 

IL RECETTORE DELLE CELLULE B (BCR) 
I linfociti B maturi vergini presentano in superficie IgM e IgD, accompagnate da proteine 
monomorfiche, necessarie alla trasduzione del segnale. Esse sono dette Iga e Igß. 
Nei linfociti B memoria, al posto delle IgM, si hanno IgG, IgE o IgA di membrana (nell’attivazione si 
ha il cambio di catena pesante). 
L’immunoglobulina che costituisce il recettore delle cellule B è un tetramero, costituito da due 
identiche catene pesanti (55-70kDa), che attraversano la membrana citoplasmatica, e due 
identiche catene leggere (24kDa), proteine periferiche di membrana. 
Nella porzione più esterna si ha un dominio variabile, formato da un segmento della catena 
pesante e da un segmento della catena leggera, quindi un primo dominio costante formato 
anch’esso in parte dalla catena pesante e in parte dalla catena leggera, ed altri tre domini costanti 

per la catena pesante (nel caso delle IgM). Si ha quindi una breve porzione transmembrana e una cortissima coda intracitoplasmatica. Le Iga e Igß formano eterodimeri, che prendono contatto in maniera debole e laterale con il dominio CH4. Tali catene presentano nel citosol delle sequenze ITAM. Le Iga hanno 2 sequenze ITAM, le Igß 1 soltanto. 
L’ATTIVAZIONE DEL LINFOCITA B Un antigene multivalente (con porzioni ripetute, più siti di legame identici) aggrega i BCR sulla superficie del linfocita, causando un cambiamento conformazionale recepito dalle catene trasducenti. CD45 si avvicina ai recettori aggregati ed espleta la sua attività fosfatasica, attivando le tirosinchinasi della famiglia Src (Blc, Lck, Lyn, Fyn), che fosforilano le sequenze ITAM. Alle ITAM fosforilate si associa Syk, una tirosinchinasi con dominio SH2. Syk viene fosforilata ed attivata. Così come ZAP-70, legando proteine adattatrici, attiva le vie di segnalazione della fosfolipasi-C e di Ras-MAPK, con attivazione finale di NF.B, NF-AT e AP-1, che attivano la trascrizione di vari target genici. Per proliferare, il linfocita B attivato necessita del supporto dei TH. Con il fenomeno del capping, ossia dell’aggregazione polare dei BCR legati all’antigene multivalente, si ha una riorganizzazione del citoscheletro con formazione di un endosoma: la cellula ha necessità di “liberarsi” da ciò che si è aggregato. In seguito all’endocitosi del complesso, si ha la digestione dell’antigene, con conseguente presentazione da parte delle molecole MHC di classe II. L’attivazione trascrizionale, nel frattempo, ha permesso l’espressione di recettori citochinici sulla superficie delle membrane. Se si ha una contemporanea presenza di citochine, costimolazione e presenza di T helper che interagiscono con il complesso MHC-peptide, il linfocita B andrà incontro a proliferazione ed ulteriore differenziamento. In caso contrario, il suo destino sarà l’apoptosi o l’anergia. 
Eventi dell’interazione tra linfocita B e linfocita T helper. 
1. 	
Il BCR interagisce con l’antigene: si ha segnalazione al nucleo, messa in membrana di recettori citochinici e concomitante presentazione dell’antigene digerito da molecole di classe II 

2. 	
Il linfocita T interagisce con il complesso MHC-II/peptide. Il contatto è mediato anche da molecole di adesione aspecifiche: LFA-1 ICAM-1 LFA-3 CD2. CD3 e CD4 riconoscono il complesso, portando alla messa in membrana ex-novo di CD40L 

3. 	
Il CD40 espresso costitutivamente dai linfociti B lega CD40L. Si ha trasduzione con espressione ex novo da parte del linfocita B di B7 e induzione di segnali antiapoptotici (espressione di Bcl2) 

4. 	
B7 interagisce con CD28, espresso costitutivamente dal 90% dei linfociti T. Si ha una trasduzione costimolatoria con secrezione di IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 e IFN. da parte dei linfociti T, recepite dal linfocita B, che ha già messo in membrana i recettori adatti. 


CD40/CD40L 
CD40 e CD40L fan parte della superfamiglia del TNF, ma il recettore non esprime death domain. 
L’interazione tra queste due molecole fornisce un segnale che coopera all’ingresso nel ciclo 
cellulare del linfocita B, inibisce l’apoptosi e induce l’espressione in membrana di B7. 
La mancanza di tale segnale porta ad una grave immunodeficienza, caratterizzata da anergia dei B. 
I linfociti B sono le uniche cellule capaci di riconoscere la struttura tridimensionale (terziaria) 
dell’antigene. Esse lo legano e lo endocitano continuamente, concentrandolo nel proprio 
citoplasma (fenomeno del pumping up), fino a raggiungere un valore soglia di 50-100 molecole 
MHC-II presentanti frammenti di tale antigene in grado di essere riconosciute dai T CD4+. 

Tuttavia, è poco probabile che il linfocita B su un milione specifico per l’antigene si trovi vicino al linfocita T su un milione specifico per tale antigene. I macrofagi e le cellule dendritiche captano l’antigene e attivano il linfocita T specifico. In questo modo si ha l’espansione clonale e più T specifici saranno in grado di contattare il B specifico (meccanismo cognate). Nel contempo, un altro linfocita che ha riconosciuto e si è attivato, sarà attivato per via paracrina. Un linfocita che non ha riconosciuto l’antigene non può attivarsi in modalità paracrina perché non esprime i recettori citochinici. 
CORECETTORE DEI LINFOCITI B Il corecettore dei linfociti B è più complesso di quello dei linfociti T: è un eterotrimero composto da CD19/CD21/CD81. CD21, detto anche CR2 (recettore 2 del complemento), possiede un dominio extracellulare molto lungo, ma non presenta catena citoplasmatica. Riconosce C3d, che fa parte del complemento. CD19, invece, presenta una coda intracitoplasmatica molto lunga. CD81 ha quattro domini transmembrana ma la sua funzione non è ancora conosciuta. Il corecettore dei linfociti B entra in funzione quando l’antigene è associato al complemento, a C3d. L’antigene è rivestito da pezzetti di complemento. Mentre il BCR riconosce l’antigene, CD21 lega C3d. In tal modo, le code citoplasmatiche di recettore e corecettore si avvicinano. La chinasi Syk, attivata, fosforila CD19, dove attraccano altre Src chinasi e si attiva la PI3K. Il corecettore, quindi, abbassa il threshold di attivazione. Il corecettore è attivato se si ha un batterio riconosciuto dal BCR e ricoperto dal complemento, oppure se un antigene peptidico è legato da anticorpi e l’immunocomplesso catalizza l’attracco del complemento. Nel follicolo linfoide si hanno le cellule follicolari dendritiche (FDC), diverse da quelle classiche sia per caratteristiche che per origine. Esse sono in grado di legare il complesso antigene-anticorpo su dei lunghissimi prolungamenti, senza endocitarlo. Tali prolungamenti ciroplasmatici si spezzano di tanto in tanto e possono andare a contattare le cellule che presentano recettori per le molecole espresse su tali frammenti (iccosomi). CD19 può contribuire al signaling del BCR anche senza CD21: il cross-linking del BCR induce il cocapping di CD19. Dopo 6-7 giorni, il linfocita B cambia morfologia, trasformandosi in plasmacellula. Il citosol si infarcisce di cisterne di ergastoplasma per la sintesi delle immunoglobuline. Le plasmacellule sono il differenziamento terminale del lineage B, bloccate in fase G1/S. Esse si trasferiscono nel midollo, dove continuano a secernere, alcuni Autori dicono anche per anni. Ogni plasmacellula ha una sola specificità immunoglobulinica e produce una sola classe anticorpale, quella che il linfocita B aveva in membrana. Lo switch isotipico, o commutazione di classe, dipende dal linfocita B. La plasmacellula sintetizza le catene pesante e leggera indipendentemente, con un ritmo di produzione di 2000 molecole Ig al minuto. Nel siero si ha una concentrazione di circa 15mg Ig/ml. Con un peso medio di 150kDa, si hanno 6x108 molecole/ml. Le immunoglobuline neutralizzano le molecole, legandosi ad esse. Con l’Fc attivano il complemento, promuovono la fagocitosi e l’uccisione delle cellule, attivano l’infiammazione. Nel microambiente la scelta di un linfocita B attivato di differenziarsi in plasmacellula o in linfocita B memoria dipende da contatti casuali: CD40/CD40L bloccano l’apoptosi in modo “perpetuo”, favorendo lo sviluppo di Bm. Senza l’aiuto di CD40L, CD23 sulla cellula follicolare dendritica media il differenziamento a plasmacellula. In tale processo sono coinvolti anche molti altri segnali. 
GENERAZIONE DEL REPERTORIO IMMUNOGLOBULINICO Le immunoglobuline poste in membrana fungono da BCR. Forme solubili sono presenti in tutti i liquidi organici, in quantità diverse a seconda della parte costante, e con funzione diversa. Esse possono legare FcR di membrana su diverse popolazioni leucocitarie. Si hanno più geni costanti, che sono influenti per le proprietà biologiche, ma sono ininfluenti per quanto riguarda il BCR. I geni delle catene pesanti e leggere sono posti su cromosomi differenti. Le porzioni costanti e variabili della catena pesante sono localizzati al locus 14q32. I geni variabili vanno incontro a riarrangiamento somatico e si ha possibilità di switch isotipico tra le varie porzioni costanti (µ d . e a), dando vita ai vari isotipi,o classi immunoglobuliniche, con funzioni differenti. Le catene leggere presentano due geni differenti: il gene ., posto nel locus 2p11, e il gene ., nel locus 22q21. L’utilizzo di tali geni non è casuale, ma programmato. Non conferisce proprietà alla immunoglobulina, ma ne determina il tipo. Le catene costanti, sul cromosoma, sono poste in quest’ordine: Cµ Cd C.3 Ca1 C.2 C.4 Ce Ca2 C.1. Le catene leggere non presentano frammento D. I meccanismi di riarrangiamento somatico sono gli stessi che operano nei linfociti T per generare il TCR. A monte della sequenza genica si ha un segmento conservato 9-12-7, a valle un segmento 7­23-9. Si ha sempre delezione dei geni interposti. Prima riarrangiano D e J e poi V con DJ. Si ha quindi un trascritto con le porzioni costanti µ e d. Lo splicing differenziale, all’inizio, è solo monodirezionale e si possono utilizzare solo Cµ. Il riarrangiamento è un fenomeno sequenziale: dal DNA germ-line si ha un riarrangiamento della catena pesante, in contemporanea, su entrambi i cromosomi (si noti che la lettura di D è rigida, non permissiva, devono essere aggiunte basi dalla TdT esattamente multiple di 3). Se il riarrangiamento funziona, si riarrangia la catena leggera .. Se il riarrangiamento della catena leggera funziona, si ha un’immunoglobulina completa, se non funziona, prima si tenta il riarrangiamento del locus L. dell’altro cromosoma, poi il riarrangiamento delle catene leggere . su uno e sull’altro cromosoma. Se non funziona il riarrangiamento di nessuna catena leggera, non si hanno più possibilità di riarrangiamento. Una cellula B, e le immunoglobuline da essa prodotte, non possono presentare contemporaneamente catene leggere sia . che .. Il riarrangiamento è stimolato da segnali provenienti dal microambiente: conformazione aperta della cromatina dei loci coinvolti, presenza di Rag1/Rag2, TdT, trascrizione dei geni H, NF.B. Perché si ha esclusione allelica: quando si ha la formazione di una catena µ perfetta, si ha un meccanismo che blocca il riarrangiamento delle catene pesanti e stimola le catene leggere a riarrangiare. Si ha anche esclusione isotipica tra le catene leggere. Il rapporto .:. è di 60:40. Si noti che i linfociti B che esprimono catena leggera . possiedono ancora un corredo genico per la catena . intatto, mentre i linfociti B che esprimono catena leggera ., hanno geni . non più funzionanti (in quanto sono andati incontro a riarrangiamento non funzionale). La cellula staminale interagisce direttamente con lo stroma midollare, che esprime CD44 e acido ialuronico. È necessaria IL-3 per proseguire nella maturazione. Il pro-B precoce esprime altre molecole di adesione: VLA-4 (che lega VCAM) e KIT (che lega SCF, stem cell factor). Tali interazioni determinano la messa in membrana del recettore di IL-7 e il riarrangiamento delle catene pesanti. Si ha quindi il passaggio a pre-B. Esso esprime una finta catena leggera, con due catene che si assemblano: VpreB/.5, permettendo ad uno pseudo-BCR di andare in membrana. Se esso non funziona, si ha il blocco della maturazione e la cellula va in apoptosi, se invece funziona, si ha la trasduzione di un segnale al nucleo che innesca la proliferazione, blocca il riarrangiamento H e attiva il riarrangiamento della catena L. L’interazione persiste finché la catena leggera definitiva L spiazza il complesso VpreB/.5. Nel midollo osseo, i linfociti B autoreattivi proseguono nel riarrangiamento, soprattutto nella porzione variabile della catena leggera, per ottenere un recettore non autoreattivo (processo di editing del recettore). In che modo in membrana sono espresse le stesse parti variabili montate su diverse porzioni costanti, ovvero si ha coespressione di IgM e IgD? Il trascritto della catena pesante ha un’organizzazione particolare: dopo la sequenza leader e la porzione VDJ, si ha la porzione Cµ, un sito di poliadenilazione, la porzione Cd e un nuovo sito di poliadenilazione. Il processo di splicing dell’mRNA porta alla produzione di mRNA per le IgM e per le IgD. Quando il linfocita B matura, produce ed esprime in membrana entrambe le immunoglobuline. In che modo l’immunoglobulina viene posta in membrana o secreta? Il gene per le immunoglobuline è costituito da tanti esoni quanti sono i domini della catena. L’mRNA della catena Hµ presenta, oltre alla porzione LVDJ, degli esoni Cµ1-Cµ2-Cµ3-Cµ4, un esone per 20 aminoacidi caratteristici, un punto di terminazione, l’esone per la porzione transmembrana, l’esone per la porzione citoplasmatica, un sito di terminazione. Lo splicing alternativo per molecole integrali di membrana prende tutto, ma evita il pezzo dell’esone 4 con 20 aminoacidi idrofilici. Lo splicing per molecole secrete, invece, prende tutto tranne le porzioni transmembrana e citoplasmatica, inoltre mantiene la porzione dell’esone 4 che codifica per un C terminale idrofilico. La plasmacellula, in membrana, non presenta più Ig. 
Come avviene la commutazione di classe o switch isotipico? Cambiano le catene pesanti. Il linfocita vergine può trascrivere solo i loci Cµ e Cd, gli altri sono chiusi alla trascrizione. L’intervento citochinico, con interazione tra i linfociti T e B in seguito a presentazione antigenica (proteica), produce una DNA binding protein, che lega prima dei vari geni costanti. Le regioni switch non sono conservate tra i diversi geni, ogni gene costante ha la sua regione, ricca di G e T. Il legame della DNA binding protein comporta l’apertura del gene alla trascrizione e un movimento, per cui la regione switch si avvicina alla regione switch della catena µ, si forma un’ansa e la regione interposta viene persa. Il cambio della catena pesante è condizionato dalla prevalenza citochinica, fino ad aver raggiunto, al massimo, l’ultimo gene a1. Lo switch è un fenomeno non reversibile. Il linfocita naïve, in seguito al riconoscimento dell’antigene, si attiva, producendo IgM, che attivano il complemento. L’interazione con i T helper può portare a una commutazione differente, a seconda delle citochine presenti, con risultati effettori molto diversi: in presenza di IFN. (TH1), si ha una commutazione verso gli isotipi IgG1-2-3, con risposte dovute all’opsonizzazione dei microrganismi e all’interazione con gli FcR (complemento, immunità neonatale, in quanto passano la placenta). In presenza di IL-4 (TH2), si ha una polarizzazione verso la produzione di IgE, che mediano le risposte contro i vermi elminti, attivano la degranulazione dei mastociti e sono coinvolte nei meccanismi dell’ipersensibilità. In presenza di TGFß e IL-5, infine, si ha la produzione di IgA, fondamentali per l’immunità mucosale. 
Nel linfocita B si verificano mutazioni che coinvolgono i geni variabili sia della catena pesante sia di quella leggera. La frequenza delle mutazioni è molto più elevata tra le IgG che non tra le IgM ed aumenta dopo ogni immunizzazione. La normale frequenza di mutazione è 1/1012 paia di basi. Nei geni V si ha una frequenza di 1/103 paia di basi (ipermutazione somatica). I geni per le immunoglobuline presentano circa 700bp, quindi si ha circa una mutazione per mitosi. 
Il gene per le IgG di un clone di linfociti B differisce dall’1 al 5% dalla sequenza germinale da cui il clone è stato ottenuto. Questo permette una selezione dell’immunoglobulina più affine all’antigene, permettendo la cosiddetta maturazione di affinità della risposta verso antigeni proteici. La selezione ha luogo nei centri germintativi dei linfonodi e dei tessuti linfatici periferici in generale (vedi dopo). Con le mutazioni somatiche un BCR può diventare autoreattivo, si ha quindi un processo di revisione recettoriale, con nuovo riarrangiamento della catena leggera. Tale elevato tasso di mutazione è dovuto alla formazione di rotture a doppio filamento durante la fase G2, con conseguente riparazione difettosa a causa dell’enzima citidina deaminasi indotta dall’attivazione (activation-induced cytidine-deaminase AID). Essa deamina il DNA a livello delle citosine, causando un cambio permanente da C.TeG.A. Questo comporta la mutazione delle basi adiacenti AT. 
D  J  Combinazioni  
.  40  - 5  200  
.  30  - 4  120  
H  65  27  6  11000  

La diversità anticorpale, quindi, è dovuta a: diversi geni VDJ ereditati, diversa combinazione dei frammenti VDJ, diversità giunzionale (errori di giunzione P e, nelle catene pesanti, nucleotidi N della TdT) e combinazione tra catena H e catena L. Inoltre, si hanno le mutazioni somatiche e la revisione del recettore. La combinazione casuale tra catene leggere e pesanti porta alla possibilità di 3,5x106 combinazioni possibili. In presenza di antigene, si hanno risposte mono-o oligoclonali. Si possono avere risposte policlonali indotte da mitogeni. I linfociti B sono anche in grado di riconoscere glicidi e lipidi, senza l’aiuto dei linfociti T helper. Questi ultimi, infatti, non possono riconoscere antigeni non peptidici, detti per questo antigeni timo-indipendenti. Essi sono polisaccaridi, LPS, proteine polimeriche. 
1a 
classe di antigeni timo-indipendenti, attivatori policlonali ad alta dose: LPS (riconosciuto da CD14 e TLR) a bassa dose, specifici, che attivano segnali mitogenici via BCR. 2a 
classe di antigeni timo-indipendenti, polisaccaridi altamente ripetuti, mitogeni intrinseci, per cross-linking del BCR. Tali attivazioni in assenza di citochine portano a risposte con prevalenza di IgM a bassa affinità: i linfociti B non sono andati incontro a commutazione di classe, né a ipermutazione somatica, e non hanno sviluppato un pool memoria. Sono detti apteni gli antigeni non immunogeni se non presentati da una proteina. La sintesi delle immunoglobuline avviene nel reticolo endoplasmatico rugoso. Le catene pesanti sono quindi glicosilate e, nel lume reticolare le chaperonine calnexina e BiP (binding protein) permettono l’appaiamento tra catena leggera e catena pesante. Nell’apparato di Golgi, la molecola va incontro a modificazione dei residui glicidici sulla superficie. 
CARATTERISTICHE ISOTIPICHE Isotipo: in tutti i membri della specie, si hanno classi e sottoclassi delle catene pesanti e tipi di catene leggere Allotipo: nella regione costante, non presente in tutti gli individui, dovuti alla variabilità allelica Idiotipo: nella regione variabile, cambia da immunoglobulina a immunoglobulina. È localizzato in particolare nelle regioni ipervariabili CDR1-2-3 
La regione hinge, cardine, è una regione molto flessibile, costituita da 60 aminoacidi, con residui di prolina e di cisteina (questi ultimi per la formazione di ponti disolfuro tra le due catene pesanti). Manca nelle IgM e nelle IgE. È posta tra i domini costanti della catena pesante 1 e 2. I ponti disolfuro tra catena pesante e catena leggera si instaurano prima del dominio CH1 e CL. 
VH e VL mediano il riconoscimento e il legame dell’Ig con l’antigene. Si ha un foglietto ß in più 
rispetto al dominio immunoglobulinico (8 foglietti). Sono riconosciute da anticorpi anti-idiotipo. 
CH1 e CL sono necessari per spaziatura conformazionale. Vi si lega anche il costituente 4 attivato 
del complemento C4b. 
CH2 controlla il catabolismo dell’immunoglobulina e lega C1q. Da esso dipende l’emivita della 
proteina. 
CH3 interagisce con gli FcR. 
CH2 e 3 controllano la secrezione nelle mucose e il passaggio transplacentare. 

Le IgD sono immunoglobuline che non sono in grado di fissare il complemento e sono espresse 
solo in membrana. La loro presenza segna il passaggio da linfocita B immaturo a linfocita B maturo. 
Scompaiono nel passaggio da linfocita B a plasmacellula. Hanno funzione recettoriale e sono molto 
flessibili. 
Le IgM, in membrana, sono espresse come monomeri. Quando invece devono essere secrete, si 
assemblano a formare un pentamero. Esso si assembla per intervento del polipeptide J (15kDa), 
che instaura legami disolfuro con l’ultima cisteina del dominio CH4 (le IgM hanno un dominio 
costante in più). Una volta formato il dimero tra due IgM, questo innesta la formazione diretta di 
ponti disolfuro fra le cisteine terminali delle catene pesanti. Quando si è formato il pentamero, si 
ha un’ulteriore fila di legami covalenti tra le catene laterali delle cisteine terminali del dominio CH3. 
I pentameri di IgM hanno una struttura rigida planare, ma, quando legano l’antigene, si flettono. 
La valenza, ovvero la capacità di legare l’antigene, che potenzialmente è 10, per ingombro sterico 
è in realtà di 5. Le IgM secrete sono in grado di attivare efficacemente il complemento quando 
ripiegate in seguito a legame con l’antigene. Non sono in grado di attraversare le membrane e 
sono prodotte al primo incontro con l’antigene. 
Le IgG presentano quattro sottoclassi in diverse proporzioni, e complessivamente costituiscono il 
70-80% delle immunoglobuline circolanti. Esse sono presenti in forma monomerica. La diversità 
tra le varie IgG, che risulta in differenti conformazioni strutturali, è il numero di ponti disolfuro tra 
le catene pesanti e la loro posizione. Tutte e quattro le sottoclassi sono in grado di attraversare la 
barriera placentare. 
Le IgA presentano due sottoclassi e sono le immunoglobuline più numerose nelle secrezioni e in 
assoluto. Alcuni batteri (ad esempio Haemophilus influenzae) hanno sviluppato delle proteasi che 
attaccano la regione cardine delle IgA. Le catene a2 mancano di una sequenza amminoacidica di 
13 residui nell’hinge, resistendo di conseguenza all’azione proteasica. Sono il 15% delle 
immunoglobuline sieriche, per la maggior parte in forma monomerica (80%). Si hanno due allotipi: 
l’allotipo IgA2m1 è presente negli individui caucasici, l’allotipo IgA2m2 è presente nelle 
popolazioni non caucasiche. 
Le IgA secretorie sono dei dimeri, in cui il polipeptide J media la formazione di ponti disolfuro tra le 
due catene. Sono presenti nel latte, nel colostro, nella saliva, nelle lacrime, sulla superficie delle 
mucose respiratorie, del tratto digerente e nella bile. Oltre al trasferimento transplacentare delle 
IgG, il neonato riceve, attraverso l’allattamento, le IgA. Lo switch in senso a è raro nel neonato, e si 
ha solo attorno ai 2 anni. 
Il pezzo secretorio è una proteina integrale di membrana, espressa costitutivamente sul versante 
basolaterale degli epiteli mucosi. Esso stabilisce ponti disolfuro con le cisteine del dominio CH2. Si 
lega, avvoltolandosi sulla porzione terminale delle IgA. Il complesso, per transcitosi, si riversa nel 
lume dell’organo, ma attraverso un processo di clivaggio, le IgA secrete presentano il pezzo 
secretorio. Esso protegge le IgA dalla degradazione enzimatica. 
Le IgE mediano le risposte allergiche e di immunità contro l’invasione da parassiti (elminti), e 
posseggono quattro domini immunoglobulinici nelle regioni costanti, come le IgM. 

RECETTORI DELL’Fc 
I vari frammenti cristallizzabili degli anticorpi presentano caratteristiche differenti e mediano 
azioni fisiologiche differenti. Per questo sono riconosciuti da recettori diversi. Essi hanno una 
catena a che lega l’Fc specificamente e sono associati a catene comuni per la trasduzione del 
segnale. Si hanno recettori ad alta affinità (10-10M) e a bassa affinità ma alta avidità (10-6M). 
CD64 (Fc.RI), recettore ad alta affinità per le IgG, CD16 (Fc.RIII) a bassa affinità per le IgG, FceRI, 
ad alta affinità per le IgE. 
Gli FcR possono avere funzione di trasporto o funzione attivante la risposta immune (funzione 
effettrice). 
CD32 (Fc.RIIB) è un recettore in grado di legare gli immunocomplessi e bloccare l’attivazione di 
linfociti B vergini, per regolare la produzione anticorpale con feedback negativo. 
Le IgM attivano il complemento ma non gli FcR, la produzione di IgG media la formazione di 
immunocomplessi. 
L’antigene media il crosslinking dei BCR, con conseguente attivazione del linfocita B e la 
produzione di anticorpi. Gli anticorpi formano immunocomplessi, che vanno a legare e 
crosslinkare più molecole di CD32, che reclutano la fosfatasi SHP-1 sul proprio dominio 
citoplasmatico. Essa agisce sui fosfoinositoli, rimuovendo il substrato della fosfolipasi e bloccando, 
quindi, la via del calcio e quindi di sintesi di Ig e altre proteine. 

ANTICORPI MONOCLONALI 
L’invenzione degli anticorpi monoclonali si deve nel 1975 a Kohler e Milstein. Il procedimento per 
ottenere un anticorpo monoclonale è il seguente: si immunizza un animale con l’antigene di 
interesse, inducendo una risposta policlonale all’antigene stesso. Una volta ottenute (dalla milza) 
le cellule B dell’animale, le si fonde con una linea di plasmocitoma (un tumore plasmacellulare in 
grado di crescere indefinitamente in vitro e realizzato per essere incapace di sopravvivere in 
mezzo selettivo). Si selezionano quindi solo le cellule che si sono fuse correttamente, le si clona 
espandendole, in modo da avere popolazioni derivanti tutte da un’unica cellula iniziale (cloni) e si 
testa la produzione dell’anticorpo di interesse da tali ibridomi. 
I linfociti B della milza murina non sono immortalizzati e sono proni all’apoptosi. È necessario 
fonderli con un plasmocitoma. Esso è stato selezionato in modo da non produrre Ig proprie e da 
non essere in grado di sopravvivere nel terreno selettivo HAT (ipoxantina, aminopterina, timidina). 
Il plasmocitoma, solitamente, è deficitario dell’enzima HGPRT (ipoxantina-guanina fosforibosil 
transferasi) e, per questo, non possiede la via di salvataggio delle purine. L’aminopterina è un 
veleno che blocca la via di sintesi de novo dei nucleotidi, bloccando la diidrofolato redattasi. La 
fusione splenocita-splenocita è destinata all’apoptosi, non essendo immortalizzata. La fusione 
plasmocitoma-plasmocitoma muore in terreno selettivo in quanto non possiede la via di 
salvataggio ed ha la via de novo bloccata. L’ibrido splenocita-plasmocitoma, invece, è in grado di 
sopravvivere in quanto, nonostante la via de novo sia bloccata dall’aminopterina, possiede la via di 
salvataggio (per complementazione genica dello splenocita) e il terreno contiene le basi azotate 
necessarie per tale via. 

Mentre la risposta anticorpale è eterogenea, tipica di ogni individuo e dinamica, la possibilità di 
ottenere anticorpi monoclonali permette di avere una specificità definita, un’attività molto elevata, 
una produzione illimitata e purificabile. 
La digestione dell’anticorpo con papaina permette la separazione di un frammento cristallizzabile 
Fc e di due un frammenti leganti Fab (Fragment/antigen binding). La digestione con pepsina, 
invece, permette il mantenimento di una porzione con legami disolfuro costante, formando il 
cosiddetto F(ab’)2. 

Si è quindi cercato di ottenere anticorpi monoclonali umani, in quanto gli anticorpi murini sono immunogeni per l’uomo e quindi non utilizzabili in vivo. Si sono tentate diverse strade: ­Fusione plasmocitoma murino con linfociti B umani: instabilità dell’ibridoma con perdita dei cromosomi umani 
­Fusione mielomi umani con linfociti B umani. Si ha il problema di realizzare anticorpi umani contro una struttura umana. In vitro non si può riprodurre il microambiente per sensibilizzare i linfociti B artificialmente. Si è pensato all’utilizzo di topi SCID ripopolati con linfociti T da timo o linfonodi di feti umani, quindi immunizzati per avere PC con anticorpi monoclonali umani, ma non è molto agevole. 
­I linfociti B immortalizzati mediante infezione con EBV, spesso, producono basse quantità 
di IgM. Sono quindi stati disegnati degli anticorpi chimerici, contenenti domini variabili murini e domini costanti umani, permettendo quindi anche la scelta dell’isotipo. Essi possono essere utilizzati contro patogeni/tumori (IgG1) o per scopo diagnostico (IgG4). Questi anticorpi chimerici, comunque, possono essere ancora immunogenici (per l’idiotipo murino). Si sono prodotti quindi anticorpi umanizzati, in cui solo le CDR murine sono mantenute in un telaio umano. Una nuova tecnica per ottenere anticorpi monoclonali è isolare i geni per le regioni variabili, fonderli con i geni codificanti le proteine di rivestimento dei batteriofagi, ottenendo fagi ricombinanti. Questi vengono selezionati in modo da riconoscere l’antigene di interesse (antigene legato sulla plastica). Si recuperano quindi i geni e si uniscono alle porzioni della catena costante, trasfettando quindi i plasmocitomi con essi. 
Le applicazioni dei mAb sono numerose: ­Immunodiagnostica (tipizzazione HLA, AB0) ­Identificazione di popolazioni cellulari (funzionale di molecole di membrana o secrete) ­Anticorpi agonisti ­Purificazione di sostanze farmacologicamente attive ­Terapia e diagnosi dei tumori (coniugati a sostanza radioattive, chemioterapici, enzimi, 
tossine) 
Sono stati sviluppati anche anticorpi bispecifici, con metà della molecola proveniente da un certo anticorpo e l’altra metà da un altro, mediante eteroconiugazione biochimica o fusione biologica. 
Di recente, è stato sviluppato un nuovo metodo per generare HumAb. (Lanzavecchia et al. Nat Med, 2004). La SARS è una grave patologia dell’apparato respiratorio dovuta all’infezione di un Coronavirus. Per essa non esistono vaccini, ma l’unica cura è l’immunizzazione passiva. Si è notato che il siero di pazienti guariti dalla malattia presenta IgG neutralizzanti il virus. Sono quindi stati isolati i linfociti B memoria dal sangue periferico del paziente (IgG+) con citometria a flusso ed infettati con EBV. In contemporanea, sono stati stimolati con ligandi per il TLR (CpG non metilate), aumentando l’efficienza di immortalizzazione di ~100 volte. Si è quindi effettuato un clonaggio per diluizione limite, selezionando i cloni producenti anticorpi anti SARS-CoV, caratterizzati da elevata capacità neutralizzante. 
CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE La risposta primaria all’antigene è caratterizzata inizialmente da un periodo di latenza, la cui durata dipende dall’antigene, seguito da una fase di incremento esponenziale, che dura anche molti giorni. Ad essa segue una fase stazionaria, in cui la degradazione degli anticorpi è bilanciata dalla nuova sintesi degli stessi, per poi terminare con una fase di declino graduale. La risposta secondaria, invece, è caratterizzata da una fase di latenza molto più breve (circa la metà), un incremento più rapido, con raggiungimento di una fase stazionaria più duratura, con produzione di immunocomplessi e una fase di declino più lenta. La risposta secondaria richiede una minore quantità di antigene, produce principalmente IgG ad alta affinità per lo stesso. 
Il sistema del complemento 
Il complemento fu chiamato così perché si pensava che nel siero fosse presente una sostanza che 
complementasse/aiutasse gli anticorpi. 
Una serie di esperimenti effettuati da Bordet portò alla definizione del complemento e, 
conseguentemente, del suo funzionamento. 
Un siero fresco, posto in una coltura batterica con anticorpi specifici contro il batterio, porta alla 
lisi dei batteri. Un siero vecchio, o riscaldato a 56°C, posto nelle medesime condizioni di coltura, 
non porta alla lisi dei batteri. 
Ci si è quindi domandati se la risposta litica dipendesse strettamente dal fatto che il siero derivasse 
da un individuo immunizzato o meno. Una coltura in cui sono posti un siero immune scaldato a 
56°C e un siero fresco non immune porta ad una lisi dei batteri (sempre in presenza di anticorpi 
specifici). 
56°C è la temperatura tale per cui le immunoglobuline riarrangiano in conformazione nativa. 
Il complemento è un insieme di proteine plasmatiche, riscontrabile in tutti i fluidi all’interno del 
corpo in forma inattiva. L’azione del complemento dipende da una reazione a cascata enzimatica, 
per cui una proteina del complemento attivata cliva, attivandola, la successiva proteina del 
complemento, permettendo una amplificazione della risposta. Le proteine del complemento, 
attivate, legano microbi o anticorpi legati a microbi, spesso in maniera covalente. Il complemento 
è inibito da proteine regolatorie espresse sulle cellule self, ma assenti nel mondo microbico. 
La proteina viene tagliata in un pezzo grande b, che continua la cascata, e un pezzo piccolo a, che 
diffonde e può avere potenziale effettore. Tale cascata è strettamente regolata. Ha varie attività: 

­lisi cellulare ­opsonizzazione cellulare ­attivazione dell’infiammazione da parte dei pezzi a, che hanno attività chemotattica 
(anafilotossine) 
­eliminazione degli immunocomplessi Si hanno tre differenti vie di attivazione per il complemento: la classica via degli immunocomplessi antigene-anticorpo, la via lectinica e la via alternativa, direttamente sulla superficie dei patogeni. 
Via classica del complemento 
La via classica del complemento, che richiede la presenza di anticorpi, prende avvio dal fattore C1, 
che è un complesso di tre molecole (a loro volta multimeriche): C1q C1r C1s. 
C1q è costituito da sei subunità identiche, legate attraverso una porzione bastoncellare, da cui si 
dipartono altri bastoncelli terminanti con una testa globulare. 
All’interno di C1q, tra i bracci delle singole subunità, si ha un tetramero formato da due subunità 
C1s e da due subunità C1r alternate. 
Il primo evento attivante non è enzimatico, ma dovuto a un cambiamento conformazionale: 
questo è indotto quando almeno due teste di C1q prendono contatto con il frammento 
cristallizzabile di immunoglobuline che han legato l’antigene (IgG1-2-3). Questo cambiamento 

conformazionale attiva il dominio proteolitico delle teste contattate di C1q, che clivano C1r. Questo, a sua volta, cliva C1s. Per l’attivazione del complesso del C1 sono necessari due Fc distinti, posti a non oltre 10nm di distanza l’uno dall’altro. Perché questa conformazione sia statisticamente probabile, è necessario che almeno 1000 molecole di immunoglobuline siano legate alla superficie cellulare. Questa azione può essere svolta anche da una sola molecola (pentamerica) di IgM. Le IgM circolanti non legano il complemento in quanto sono in conformazione planare e non mettono a disposizione i siti di legame per esso. Una volta legate, invece, vanno incontro a cambiamento conformazionale e la molecola, non più planare, espone i siti di riconoscimento per C1q. C1s, quindi, taglia C4 in due pezzi, C4a e C4b. Quest’ultimo mette allo scoperto un ponte tioesterico, avido nel legare i gruppi amminici ed ossidrilici di peptidi e glicidi di membrana. Molte molecole di C4b vanno perse perché si legano all’acqua (circa il 90%), mentre il restante 10% si lega vicino, sulla membrana cellulare, stabilendo legami covalenti. C2 si lega al C4b sulla membrana. C1s, attivato, cliva anche C2 legato a C4b in C2a e C2b. Il complesso C4b2b agisce da C3 convertasi, tagliando il componente C3 in C3b e C3a. Il legame è mediato dalla componente C4b, il clivaggio da C2b. C3b, a sua volta, mette allo scoperto un ponte tioesterico. In parte viene persa andando a legare molecole d’acqua, ma almeno il 10% lega la membrana cellulare, formando un complesso trimolecolare C4b2b3b, che agisce da C5 convertasi. Ad ogni ciclo si ha una amplificazione del fenomeno, in quanto ogni molecola è in grado di attivare un numero molto più alto di molecole a valle, che a loro volta attiveranno un numero più elevato di molecole a valle. 
Via alternativa di attivazione del complemento 
Nella via alternativa del complemento non partecipano alcuni costituenti della via classica, quali C1, C2 e C4. Sono tuttavia coinvolte proteine non presenti nella via classica: i fattori B, D, H, I, la properdina; oltre al C3. La molecola C3, solubile, presenta il ponte tioesterico all’interno, fintanto che la molecola non è clivata. La molecola intatta, però, assume una molecola di acqua sul suo ponte tioesterico. C3(H2O) 
viene legato dal fattore B. Il fattore D , unica eccezione nella via del complemento, è già presente in forma attiva nei fluidi, a bassissime dosi, e taglia il fattore B. Il complesso C3(H2O)Bb così formato, in fase fluida, acquisisce funzione C3 convertasica. Si forma così C3b, che si lega alla membrana cellulare. Il fattore B lega il C3b sulla membrana, formando il complesso C3bB. Il fattore 
D taglia il complesso, formando C3bBb , che ha funzione di C3 convertasi in fase solida, posta sulla membrana cellulare. Il suo funzionamento è stabilizzato dal legame con la properdina. La C3 convertasi può proseguire la sua attività di clivaggio sino a 30 minuti dalla sua attivazione. Parte del C3b può andare a formare il complesso C3bBb3b, con funzione C5 convertasica. In questo modo si ha una minima formazione di base, autonoma, di C3b, con un turnover minimo (loop autocrino del C3). Nella via alternativa non sono richiesti anticorpi. 
Tratto comune della via del complemento 
L’enzima C5 convertasi, sia essa C4b2b3b o C3bBb3b, è in membrana e cliva il componente C5 del complemento. Questa è l’ultima azione di attivazione enzimatica che viene ad essere effettuata. C5b si lega alla C5 convertasi, e C6 si associa al C5b in essa. Il C7 si lega al C6, formando un complesso C5bC6C7. Dopo il legame, la molecola C7 diventa anfifilica. La porzione idrofobica di essa si lega alla membrana, mediando il distacco dalla C5 convertasi. Questo è il primo evento che perturba la membrana. C8, un trimero, si lega ad esso e si innesta nella membrana. In alcuni casi, già il complesso C5b678, stabilmente attaccato alla membrana, potrebbe causare la lisi cellulare. Tuttavia, di solito, prende parte all’attività citotossica il componente C9, che polimerizza (12-15 
molecole) e si lega al complesso. Si ha quindi una sorta di tubo innestato profondamente nel 
plasmalemma, formando un poro (100Å) simile alle poliperforine dei CTL e degli NK. 
Il complesso C5b678poliC9 viene definito MAC (membrane attack complex). 

La via classica coinvolge C1-C9, viene attivata dai complessi antigene-anticorpo costituiti da IgM e 
IgG. La C3 convertasi è costituita da C4b2b, la C5 convertasi da C4b2b3b. La via alternativa 
coinvolge le proteine B P D C3 C5-C9. È attivata da polisaccaridi posti sulla superficie microbica. La 
C3 convertasi è costituita da C3Bb, la C5 convertasi da C3bBb3b. 

Via lectinica di attivazione del complemento 
La proteina legante il mannosio è simile, strutturalmente, al C1q e attiva la via classica. In mezzo si ha o il tetramero vero e proprio C1r/C1s, oppure una esterasi con attività analoga. È attivata da polisaccaridi in assenza di anticorpi. 
Regolazione della via del complemento 
Il C1s deve avere un’azione enzimatica limitata nel tempo. Questo è reso possibile dall’azione del C1 INH. Esso fa parte della famiglia delle serpine, inibitori delle serinesterasi. C1INH mima il substrato di C1r/C1s, bloccandolo covalentemente in seguito al taglio. Quando manca, si ha edema angioneurotico. C1INH inibisce anche la callicreina e il fattore XII della coagulazione. Si ha poi tutta una serie di molecole che limita l’azione della C3 convertasi: questo è possibile o in seguito a competizione per i substrati, o per dissociazione dei complessi stessi. Tali molecole sono: DAF (decoy accelerating factor), CR1 (recettore per il complemento), C4b binding protein, fattore 
H. Il fattore I, invece, taglia C3b/C4b dissociati. Nella formazione del MAC interviene la proteina S, che si lega a C5b67 solubile, inibendo e limitando il legame di tale complesso alla membrana. CD59 e HRF (fattore omologo di restrizione) inibiscono la formazione del MAC. Questo determina l’azione preferenziale del complemento sui microrganismi, che non possiedono CD59 e DAF sulla superficie della membrana. CD59 e DAF sono legati alla membrana da una coda glicolipidica. Negli individui che hanno un difetto per cui non riescono a mettere in membrana le molecole di tale tipologia (enzima codificato da un gene sul cromosoma X), si ha emoglobinuria parossistica notturna. I globuli rossi vengono distrutti, l’emoglobina viene liberata nelle urine, ma perché in maniera parossistica e di notte? Gli anticorpi a bassa affinità si legano ai globuli rossi, ma di notte, con una minore temperatura corporea media, l’affinità di tali anticorpi aumenta e quindi aumenta la fissazione del complemento agli eritrociti. 
Recettori dei fattori del complemento 
CR1 (CD35, lega C3b e C4b) è espresso da macrofagi, granulociti neutrofili ed eosinofili, eritrociti (cedono gli immunocomplessi alle cellule di von Kuppfer epatiche), linfociti, cellule follicolari dendritiche. Media la fagocitosi, la rimozione degli immunocomplessi, regola l’attività della C5 convertasi. CR2 (CD21, lega C3b) è espresso sui linfociti B, dove funge da corecettore, e dalle cellule follicolari dendritiche, dove impedisce l’endocitosi del complesso. Attiva i linfociti B, intrappola gli immunocomplessi a livello del follicolo ed è il recettore per il virus di Epstein-Barr (EBV). Stimola la risposta umorale. CR3 (dimero CD11b/CD18) è espresso dai fagociti e media la fagocitosi, dai mastociti e dalle NK. Fa parte della famiglia delle integrine, così come CR4 (dimero CD11c/CD18, che lega C3bi e ICAM), è espresso dalle cellule natural killer, e ne media l’adesione all’endotelio. 
Anafilotossine 
I fattori liberati dal clivaggio dei componenti del complemento C5a C3a C4a hanno funzione fisiologica, che mima cià che avviene nell’anafilassi (e per questo si chiamano in tal modo). I loro recettori sono a 7 domini transmembrana, accoppiati a proteine G trimeriche (GPCR). Mediano la contrazione della muscolaruta liscia e l’aumento della permeabilità vascolare. C3a e C5a attivano mastociti, mediandone il rilascio di istamina. Fungono da fattore di richiamo per neutrofili e monociti nel sito di infezione. Ha azione indiretta su neutrofili e monociti, migliorandone la diapedesi, la migrazione e upregolando CR1 e CR3, favorendo la fagocitosi. Tra i due, C5a è l’attivatore più potente, perché viene liberato più avanti nella cascata enzimatica del complemento. Inducono uno stato di infiammazione acuta. 
I vaccini 
Il vaccino ideale è un vaccino non pericoloso, stabile, economico, semplice da somministrare, e deve fornire un’immunità persistente. I vaccini “storici”, tuttora utilizzati, sono stati ottenuti da microrganismi uccisi, vivi attenuati, da anatossine o da antigeni purificati. I nuovi vaccini, alcuni ancora in fase sperimentale, sono ottenuti da peptidi sintetici, vaccini chimerici, antigeni ricombinanti, vettori ricombinanti, vaccini anti-idiotipo, DNA plasmidico. 
Vaccini ottenuti da microrganismi uccisi 
Sono di facile preparazione, economici e sicuri, in quanto di per sé non possono trasmettere la malattia e si possono conservare facilmente (è agevole distribuirli nei paesi in via di sviluppo). Nel caso di un vaccino contro un batterio, esso può essere ucciso in formaldeide. I virus, invece, sono uccisi solitamente in fenolo. Il calore non è un metodo adatto di uccisione dei microrganismi, in quanto denatura le proteine. Si hanno tuttavia dei limiti a tali tipologie vaccinali: uno di essi è la scarsa immunogenicità. Il microbo, infatti, non si replica e la dose introdotta è quella che rimane in circolo e stimola la risposta. La durata della protezione è breve, e si rendono necessari richiami (inoltre si tenga conto che ad ogni richiamo si “perde” circa un quarto della popolazione da immunizzare, perché non si sottopone alla nuova somministrazione). Vaccini di questo tipo sono adatti quando l’immunità debba essere portata avanti da anticorpi, ma non da CTL, perché l’antigene non può essere presentato come endogeno dalle APC (attraverso MHC-I). Si ha esclusivamente presentazione in MHC-II, con stimolazione dei T helper CD4+. Tali vaccini vengono somministrati per via intramuscolare. La linfa drena quindi ai linfonodi locali, dove le APC assumono l’antigene e lo presentano. Si ha la formazione di un pool TH1, con produzione di IgM e IgG, ma non di IgA. Tali vaccini, quindi, stimolano scarsamente l’immunità locale. 
Vaccini contenenti microrganismi vivi attenuati 
Il vantaggio di tali vaccini è che il microrganismo è vivo, simula l’infezione naturale ed ha una 
prima fase di replicazione. In questo modo, la dose che viene inoculata è efficace perché la 
replicazione in vivo aumenta la quantità di antigene a cui il soggetto è esposto. Si ha un’immunità 
mediata da linfociti T citotossici CD8+, perché si ha presentazione in MHC-I. Alcuni vaccini, inoltre, 
possono essere somministrati per via mucosale, in modo tale da stimolare la produzione di IgA. 
Tali tipologie vaccinali forniscono protezione di lunga durata. 
Il vaccino del micobatterio tubercolotico viene coltivato su un medium non adatto, con glicerina. 
Dopo 230 passaggi circa, il batterio ha perso la sua patogenicità. Per il vaccino contro il poliovirus, 
esso è coltivato su cellule di rene di scimmia. In questo modo sono selezionati i ceppi con 

maggiore capacità di infettare la scimmia e con minore capacità di infettare l’uomo. In questo modo, il virus attenuato può moltiplicare soltanto a livello intestinale e ha perso il proprio neurotropismo. Il vaccino Sulk contro la poliomielite prevede il virus ucciso: nell’ambiente rimangono persone con il virus, che possono propagarlo. Il vaccino Sabin, invece, prevede il virus attenuato. Gli individui vaccinati col Sabin, che hanno sviluppato una risposta IgA, impediscono la proliferazione del virus e l’immissione nell’ambiente di altri virus. Inoltre, non è necessario alcun richiamo. I rischi di tali vaccini sono quelli di retromutazioni: solo 10 paia di basi sono mutate nel vaccino contro il poliovirus. 1 dose su 4 miliardi di vaccino conteneva un virus effettivamente virulento. Il problema è stato risolto eliminando un gene patogenetico o isolando e inducendo mutagenesi in vitro per geni specifici. Si ha anche il rischio di contaminanti: la produzione su cellule di scimmia aveva portato alla presenza nel vaccino di un virus oncogeno di scimmia. Ora non è più così in quanto si verifica la presenza di DNA estraneo all’interno dei vaccini. Un ulteriore problema è il fatto che individui immunodepressi contraggono la malattia vera e propria in seguito ad immunizzazione col vaccino. La vitalità del microrganismo attenuato è però limitata, per questo il vaccino richiede di essere conservato in frigorifero e non a temperatura ambiente. 
Vaccini contenenti macromolecole purificate 
Tali vaccini contengono soltanto particolari molecole, spesso polisaccaridi. Ne sono esempi i vaccini per il meningococco e lo pneumococco o contro le tossine (tetano e difterite). Il limite a tale modalità vaccinale è che utilizza antigeni timo indipendenti e, perciò, porta alla produzione di IgM a bassa affinità e non permette l’instaurarsi di una memoria efficace (non si ha l’intervento di T helper con il loro CD40L). Per ovviare a tali problemi, si può coniugare il polisaccaride a un carrier proteico. In questo modo, il linfocita B riconosce il polisaccaride, lo endocita, ma presenta in classe II pezzi di proteina carrier. Tali frammenti presentati vengono riconosciuti da T helper specifici. I TH peptide-specifici cooperano con i B polisaccaride-specifici. Si ha quindi produzione di IgA e IgG, con B memoria. 
Vaccini contenenti peptidi sintetici 
Dallo studio dei peptidi microbici si possono produrre anticorpi contenenti solamente epitopi importanti per qualche motivo (accessibilità, funzione nella patogenesi). Si possono avere epitopi sequenziali (ovvero continui nella struttura primaria del peptide) oppure epitopi conformazionali (ovvero discontinui, formati da porzioni distanti del peptide). Si può valutare o frammentando la proteina con metodi chimici o enzimatici, oppure sintetizzando tutti i peptidi di 7 amminoacidi. Non si sa quali siano gli epitopi che inducono la risposta efficace. Si hanno anticorpi presenti nel siero di pazienti guariti, che legano ad alta affinità l’epitopo “corretto”. Si hanno come vantaggi la concentrazione solo sul peptide essenziale per una risposta efficace, inoltre si possono attaccare più peptidi allo stesso carrier, ottenendo vaccini polivalenti di sintesi (chimerici) per facilitare il crosslinking del BCR, più efficienti del singolo peptide. Si hanno i SUMAA (complessi matrice solida-anticorpo-antigene), di solito in resina, che possono presentare epitopi specifici per i B ed epitopi specifici per i T, ottenendo una forte risposta da entrambi i compartimenti linfocitari. Il linfocita B endocita la microsfera con l’epitopo per il B e presenta in classe II l’epitopo per i T. Si possono anche produrre gli ISCOM (complessi immunostimolatori), costituiti da micelle lipidiche con peptidi all’interno. La micella si fonde nella membrana e il peptide è rilasciato nel citosol della cellula (permettendo anche una presentazione in classe I). 
Vaccini contenenti antigeni ricombinanti 
Contengono subunità del corpo di un batterio/virus (ad esempio HBsAg), il problema è che sono processati come antigeni esogeni e, pertanto, non stimolano una risposta di tipo CTL. 
Vaccini contenenti vettori ricombinanti 
Si può inserire in un vettore virale o batterico il gene codificante per l’antigene di nostro interesse, ed immunizzare con tale vettore. Il vantaggio di tale approccio è la possibilità di una immunità cellulare e di incorporare nel vettore antigeni di diversa origine. Uno dei grossi limiti è l’impossibilità di effettuare richiami, in quanto la risposta primaria stimola una immunità al vettore. Il vettore (inteso come agente che media il rilascio del gene) ideale, inoltre, è un virus (vaccinia o vaiolo, per cui non si è più vaccinati, che sono virus grossi e in cui si possono eliminare pezzi di DNA endogeno per far spazio). Tale approccio, tuttavia, è impossibile in pazienti immunodepressi. Possono anche essere utilizzati batteri come la Salmonella per mediare la produzione di IgA. Tale approccio è ancora in fase sperimentale. 
Vaccini a DNA 
È possibile immunizzare con il gene, inserendolo in un vettore plasmidico. La somministrazione può avvenire per iniezione intramuscolare, seguita da una piccola scarica elettrica (elettroporazione) che faciliti la penetrazione del DNA nelle fibre muscolari. Può anche avvenire mediante l’uso di gene gun: oro colloidale mischiato con frammenti genici. L’oro è adatto perché è un materiale inerte e può andare in profondità, essendo pesante. La propulsione avviene grazie all’elio, un gas inerte. A seconda della pressione, si ha una penetrazione più o meno profonda a livello dei tessuti. L’elettroporazione, inoltre, infiamma ed attrae le APC. Il vantaggio di tale tecnica sta nella possibilità di trasfettare anche cellule quiescenti o terminalmente differenziate. Il DNA può essere prodotto da alcuni giorni ad un mese dal trattamento. 
Vaccini ottenuti da piante transgeniche 
Si possono produrre piante transgeniche, esprimenti l’antigene di interesse, infettandole con un virus delle piante. Il peptide deve essere incorporato in proteine chimeriche di rivestimento della cellula vegetale. Si è già sperimentato tale vaccino con piante di spinaci infettate dal virus del mosaico del tabacco, trasportante il DNA di un antigene del virus della rabbia. Un topo alimentato con tali spinaci transgenici mostra protezione dall’infezione con il virus della rabbia. 
Vaccini anti-idiotipo 
Un antigene può venire riconosciuto da un particolare anticorpo (Ab1), che possiede quindi un sito 
complementare all’antigene. Nel corpo sono presenti milioni di molecole con idiotipo diverso. Un 
anticorpo Ab2 può essere rivolto specificamente contro la sequenza amminoacidica del sito 
combinatorio di Ab1, che lega l’antigene ed è visto come non self. L’idiotipo di Ab2 è come fosse 
l’immagine interna dell’antigene stesso. Si può quindi indurre una risposta immune con una terza 
generazione anticorpale Ab3, contro l’idiotipo di Ab2. Ab1 e Ab3 possono quindi avere la stessa 
specificità e si può usare Ab2 come vaccino. Esso è un vaccino di assoluta sicurezza (lo si sta 
provando contro il virus dell’epatite C), ad elevata immunogenicità (superiore perfino a quella 
dell’antigene originale). 

La vaccinazione può essere utilizzata in caso di infezioni croniche? 
La risposta immunitaria può non eliminare i microrganismi (Schistosoma mansonii, Plasmodium, 
Leishmania, HBV, HBC), non vedere il virus (Herpes simplex virus, presenta una proteina che blocca 

TAP). La terapia può basarsi sulla stimolazione con citochine o sulla vaccinazione con antigeni ed adiuvanti. 
La memoria immunologica 
Gli anticorpi hanno un’emivita di 21/23 giorni. Le plasmacellule che migrano nel midollo osseo hanno un’emivita non ben definita, che può raggiungere gli anni. La memoria esiste indipendentemente dalla presenza del patogeno nell’ambiente interno dell’organismo. Le prime osservazioni sulla memoria immunologica sono derivate da due epidemie di morbillo che hanno colpito la popolazione delle isole Fær Øer nel 1781 e nel 1846. Nessuno degli individui che aveva contratto il morbillo durante la prima epidemia si ammalò di morbillo, mentre si ammalarono i nati dopo il 1781. La memoria, quindi, può persistere senza che nell’ambiente si abbia la presenza del patogeno. L’affinità minima per avere una risposta immunitaria è di 107/108 /M. Si hanno anche delle espansioni periodiche del pool memoria, che coinvolgono il 5% circa della popolazione. Due sono le teorie che sono state avanzate. La prima afferma che la memoria sia un fenomeno antigene dipendente, per cui ogni tanto è necessaria una ristimolazione del sistema immune con l’antigene (virus persistenti, microrganismi crossreattivi, antigeni crossreattivi). I meccanismi regolatori si avvarrebbero delle cellule follicolari dendritiche, che permetterebbero stimolazioni periodiche. Si noti che le cellule B memoria sono differenti dalle cellule B naïve: hanno un’attivazione più rapida, esprimono isotipi immunoglobulinici differenti, con affinità maggiore e richiedono segnali differenti per l’attivazione. La seconda corrente di pensiero afferma che la memoria sia un evento antigene indipendente: i linfociti T memoria si espanderebbero a basso livello in risposta a IL-7 e IL-15, in particolare i linfociti citotossici CD8+. 
Anatomia della risposta immunitaria 
Negli organi linfatici primari si ha la nascita e la maturazione delle cellule specifiche dell’immunità. 
Tali organi sono il midollo osseo, il timo e, nella vita intrauterina, il fegato. 
Gli organi linfatici secondari sono i siti del riconoscimento, dell’attivazione e dell’espansione 
clonale. Essi comprendono milza, linfonodi e MALT. 
I linfonodi, presenti nei mammiferi, sono delle strutture posizionate in regioni drenanti 
determinati spazi tissutali. In un grammo di tessuto linfonodale si hanno circa 20 milioni di linfociti. 
Dai vasi linfatici afferenti giunge al linfonodo circa un milione di leucociti all’ora, di cui il 75% T, il 
6% B, il 15% macrofagi, cellule dendritiche e simili. 
Dai vasi linfatici efferenti escono 20 milioni di leucociti ogni ora, di cui il 75% T, il 24%B e l’1% 
macrofagi. Il 90% di essi derivano dal sangue, il 6% dalla linfa e il 4% dalla produzione locale. 
I linfociti vergini esprimono la selectina L, potendo quindi entrare nel linfonodo extravasando 
attraverso le venule ad endotelio alto (HEV high endothelium venules), mentre quelli attivati no. 
La regolazione del traffico leucocitario è complessa e mediata da vari fattori: 

­Recettore della sfingosina-1-fosfato, che regola la fuoriuscita dal linfonodo (maggiormente presente nei leucociti del sangue). Dopo l’attivazione tali recettori sono inibiti e i linfociti permangono nel linfonodo 
­Recettori chemochinici (CCR-CXCR) ­L-selectine ­Moto spontaneo di 10-30µm al minuto ­Interazioni con le cellule dendritiche ­Dopo 24 ore i linfociti non attivati riesprimono i recettori per S1P, e fuoriescono dal 
linfonodo Nel follicolo linfoide,o centro germinativo, sono presenti le cellule dendritiche follicolari (FDC), che presentano prolungamenti simili a neuroni ed esprimono sia marcatori di differenziamento linfoide che mieloide. Non derivano dal midollo osseo. Esprimono recettori per l’Fc. e CR. Sono fondamentali per la presentazione degli immunocomplessi. I prolungamenti, talvolta, si frammentano, formando piccoli corpi, gli iccosomi, delle dimensioni di 0,3-0,4µm. Le FDC esprimono anche TNFR privi di death domain. In esse, il legame con il TNF inibisce l’apoptosi. Nella zona marginale del follicolo linfoide si ha l’espansione clonale dei linfociti T specifici, che poi possono andare ad interagire con i linfociti B specifici. Dopo una prima piccola espansione dei linfociti B attivati, essi vogliono penetrare nel centro germinativo, in parte accompagnati dai T helper. Nel centro germinativo si ha una veloce proliferazione delle cellule B attivate. Il follicolo è suddivisibile in una zona chiara e una zona scura, circondate da una corona di linfociti B in stato quiescente. In seguito ad attivazione (follicolo secondario, 4-7 giorni) le cellule blastiche, quasi esclusivamente formate da nucleo, vanno incontro ad una proliferazione talmente veloce che non fanno in tempo ad esprimere immunoglobuline di membrana. Dopo alcuni cicli di espansione clonale, mutazione somatica e commutazione di classe, escono dal ciclo. Nella zona chiara si hanno i centrociti, che hanno tempo di esprimere immunoglobuline di superficie. I centrociti sono instabili, interagiscono con gli immunocomplessi che si formano sulle cellule follicolari dendritiche. Si ha una competizione di affinità tra le varie immunoglobuline di superficie per gli immunocomplessi, che sono essenziali per l’espressione di Bcl-2. Quelli che non riescono a legarsi vanno incontro ad apopotosi, mentre quelli che sopravvivono, perché sono riusciti ad interagire, tornano nella zona scura del centro germinativo, blastizzando nuovamente. Si ha quindi il differenziamento in plasmacellula. Esso è stimolato da segnali provenienti da CD40 e dalle citochine (IL-2 IL-4 e IL-6). Questi favoriscono la trascrizione dei geni immunoglobulinici e la formazione di mRNA codificante per la forma solubile degli anticorpi. Esse negli organi linfoidi escono dai centri germinativi. Il differenziamento terminale dipende dall’induzione del fattore trascrizionale Blimp-1. Le short-lived plasma cells compaiono presto in una risposta timo dipendente e in una timo indipendente. Le long-lived plasma cells compaiono solamente dopo la reazione del centro germinativo. Migrano quindi nel midollo osseo, dove la loro sopravvivenza è supportata da BAFF. Dopo 2-3 settimane, il midollo osseo diventa il sito principale di produzione dell’anticorpo. Tali plasmacellule a lunga vita possono sopravvivere anche anni, fornendo una protezione immediata di tipo umorale in caso di riesposizione all’antigene. 
Linfociti T vergini . in circolo con CD45RA (lungo), upregolazione delle L-selectine, interazione con i carboidrati delle HEV. Marginazione nella paracorticale del linfonodo. Interazione con macrofagi e cellule dendritiche con conseguente attivazione. Espressione di CD45RO (corto) e downregolazione delle L-selectine. Ritorno in circolo e nei tessuti. 
La tolleranza 
La generazione casuale di recettori per l’immunità adattativa è necessaria per poter prevedere di riconoscere ciò che non si può sapere, l’incontro con qualcosa di sconosciuto. Questo richiede d’altra parte la generazione di un “buco” nel repertorio casuale, per evitare il riconoscimento del self (tolleranza immunologica). Le prime osservazioni sulla tolleranza si ebbero osservando che vitelli freemartin dizigotici, pur essendo geneticamente diversi, imparavano a riconoscere l’MHC del fratello, non rigettando trapianti di tessuto provenienti da esso. 
Questo portò all’ipotesi che, durante l’ontogenesi, si imparasse a riconoscere come self tutto ciò con cui si viene e a contatto: la circolazione placentare comune permette la mescolanza e il contatto dei leucociti tra due gemelli eterozigoti. Topi C5-/-, se vengono inoculati con C5, sviluppano anticorpi anti-C5. Sui linfociti T è presente l’antigene H-Y, una proteina di istocompatibilità minore, codificata sul cromosoma Y. Tale antigene è espresso da molecole MHC-I in quanto è una proteina intracitoplasmatica. Una femmina con un TCR transgenico specifico per il riconoscimento del complesso MHC-I-HY presenta il 95% dei linfociti T con un TCR anti-HY. Se incrociata con un maschio wildtype, la prima generazione (F1) presenterà il 95% dei timociti con un TCR anti-HY. In periferia, però, i maschi non presentano quasi linfociti anti-HY. La tolleranza viene acquisita mediante l’eliminazione clonale dei linfociti autoreattivi. I linfociti B possono riconoscere molecole solubili e di membrana. Si è realizzato un ceppo transgenico per il gene che codifica la regione variabile dell’immunoglobulina, in modo tale da riconoscere un particolare allele di classe I (H2 nel topo). Se indotto in un animale che non presenta tale allele, la maggior parte dei linfociti B periferici presenta in membrana la immunoglobulina transgenica. Se invece si inserisce tale gene in un topo con il complesso H2, in periferia si nota una carenza di linfociti B e la totale assenza di B producenti immunoglobuline transgeniche. Si ha quindi anche in questo caso un’eliminazione clonale. Per studiare la tolleranza verso gli antigeni solubili, invece, si sono prodotti topi transgenici con immunoglobuline anti-lisozima di gallina (HEL). Molti linfociti B periferici presentano quindi un BCR specifico per HEL e, se immunizzati, producono alti livelli di anticorpi anti-HEL. Si è creato un secondo ceppo, transgenico per l’espressione di HEL. Si ha un’induzione di tolleranza dei linfociti T e B per HEL. Incrociando i due ceppi, la prima generazione mostra alti livelli di HEL circolanti, assenza di immunoglobuline circolanti che riconoscano tale antigene, ma assenza di delezione clonale: molti linfociti B presentano ancora BCR anti-HEL. Le IgD sono presenti in quantità normale, mentre le IgM sono presenti in quantità ridotte. Si ha quindi un’anergia clonale. Essa, però, è dovuta ai linfociti B stessi o all’assenza di help da parte dei linfociti T o alla soppressione della risposta. In un topo irradiato, privo quindi di linfociti T e B propri, si sono trasferiti linfociti B anergici e T helper normali, anti-HEL. In seguito ad immunizzazione con HEL, non si ha comunque produzione di Ig anti-HEL: il blocco funzionale dei linfociti B è indipendente dal compartimento T. Ad una seconda immunizzazione con HEL si ha una risposta secondaria a HEL. L’anergia clonale dei B è quindi intrinseca e di breve durata, caratterizzata da un basso livello di IgM. Richiede una continua presenza di antigene, perché il clone torna funzionale in assenza di antigene. 
I meccanismi che mediano la tolleranza sono: ­95% di eliminazione centrale, nel timo, 5% di eliminazione periferica dei linfociti T autoreattivi ­ignoranza immunologica: quando il peptide è poco presentato, perché poco espresso o si 
lega male all’MHC o la cellula esprime poco MHC, il sistema immune ignora tale antigene ­alte dosi di antigene: tolleranza dei linfociti B ­mancanza di segnali costimolatori: anergia clonale ­mancanza di segnali di pericolo: citochine proinfiammatorie, prodotti batterici ­circuiti soppressori: APC soppressorie, citochine soppressorie, linfociti soppressori Si ricordi la differenza tra la tolleranza, che è specifica, e la soppressione, che è aspecifica. Si può indurre tolleranza nei confronti di un antigene convenzionale. La tolleranza, indotta nell’adulto, dipende dalle proprietà fisiche dell’antigene, dalla sua presentazione, dal peso molecolare, dalla dose, dalla via di somministrazione, dalla rapidità di eliminazione degli antigeni e dal fatto se essi siano polisaccaridici o meno. Per ogni proteina si ha una dose ottimale per indurre una risposta immunitaria: al di sopra o al di sotto di essa si induce tolleranza. Questa, nel compartimento T, si instaura rapidamente, nel corso di giorni, e dura molti mesi. La tolleranza del compartimento B, invece, si instaura lentamente (richiede circa 20 giorni) e dura poco nel tempo (in assenza di antigene). Se si vuole indurre una risposta con IgG è necessario inoculare l’antigene nella dose corretta per via intramuscolare, per l’induzione di IgA è necessaria un’esposizione mucosale. L’induzione della tolleranza avviene per somministrazione endovenosa. 
L’autoimmunità 
L’autoimmunità è una risposta del sistema immunitario contro strutture self, proprie 
dell’organismo. Essa può essere sistemica, ossia indirizzata contro antigeni largamente diffusi 
nell’organismo o contro vari antigeni; oppure organo-specifica. 
Essa è causata da una produzione di anticorpi o dalla presenza di linfociti autoreattivi, per cui il self 
viene visto come non self. 
L’insorgenza dell’autoimmunità richiede sempre un’infezione per cui, intervenendo una delle 
cause, si ha rottura della tolleranza. 
Le cause per l’insorgenza di malattie autoimmuni possono essere almeno cinque: 

1. 	
Aumentato rilascio di antigeni fino a quel momento tollerati, in presenza di un ambiente con citochine proinfiammatorie. L’infezione causa infiammazione, con rilascio nei tessuti dell’antigene. Un linfocita B capterà tale antigene rilasciato e lo esporrà ai linfociti T ignoranti, mai esposti prima a livello timico a tale antigene. In presenza di citochine infiammatorie tali TH ignoranti possono cooperare con il linfocita B e portare a autoimmunità. 

2. 	
Aumento della crossreattività tra antigeni estranei e self. Questo è dovuto alla presenza di proteine omologhe tra specie differenti. I linfociti TH specifici per la proteina self sono stati rimossi nel timo. Quando si ha l’esposizione ad un antigene con una porzione uguale a quella di una proteina self, e una porzione differente, i linfociti T CD4+ riconoscono il frammento differente e in modo “improprio” aiutano i linfociti B autoreattivi. La risposta è B dipendente in questo caso. 

3. 	
Espressione alterata degli antigeni ignorati fino ad allora. Durante un’infezione, la produzione di IFN. induce la upregolazione delle molecole di istocompatibilità e, quindi, aumenta la presentazione degli antigeni self, tra cui anche quella di antigeni prima ignorati. Linfociti CD8+ che riconoscono tale autoantigene presentato, in presenza di citochine proinfiammatorie, differenziano in CTL. Nel contempo, le cellule infettate si lisano, rilasciando i propri antigeni in circolo. Essi possono essere captati dai linfociti B e da macrofagi, che in presenza di IFN. esprimono MHC-II e inducono la conseguente attivazione dei linfociti T helper, con sviluppo di cloni B autoreattivi. 

4. 	
Difetti dei meccanismi di immunoregolazione. Si può avere uno shift della risposta T helper dalla polarizzazione TH1 a TH2. Si possono avere anche difetti a livello del compartimento Treg CD4+ CD25+ Foxp3+, che inibisce l’attività dell’IL-2, produce IL-10 e inibisce la proliferazione dei linfociti T. Si possono avere anche problemi a livello dei TH3 CD4+, presenti a livello mucosale e secernenti IL-4, IL-10, TGFß e aventi funzione soppressoria, 

oppure dei TR1 CD4+, presenti nelle mucose e secernenti IL-10 e TGFß, differenziati su presentazione di DC immature (tolerogeniche), producenti IL-10 e IFNa. 

5. 	
Attivazione policlonale dei linfociti B. I linfociti B autoreattivi sono presenti, ma sono anergici perché mancano della risposta T helper. Una stimolazione attraverso i TLR può portare all’attivazione con produzione di IgM a bassa affinità verso il DNA, Ig, timociti, eritrociti. Si sviluppa il lupus eritematoso sistemico (LES). È una condizione transitoria, fintanto che permane lo stimolo attivatore policlonale (LPS batterico). Anche EBV funge da attivatore policlonale, attraverso il suo recettore CD21, con produzione di IgM a bassa affinità. I T, con i superantigeni, possono attivarsi fino a percentuali del 20-25%. 


Patogenesi delle malattie autoimmuni: il riconoscimento degli eritrociti da parte di autoanticorpi e successiva lisi guidata dal complemento porta a emoglobinuria parossistica notturna. La fagocitosi degli immunocomplessi sulle piastrine dà trombocitopenia autoimmune. Una generalizzata inibizione dei recettori, in particolare dell’acetilcolina, ha come risultato la miastenia grave. Anticorpi agonisti possono dare una tiroidite autoimmune (morbo di Graves), stimolando il recettore del TSH e favorendo quindi una secrezione abnorme di ormoni tiroidei. La formazione di immunocomplessi può dare LES: inizialmente si può manifestare con un eritema a farfalla sulla faccia del paziente, che viene paragonato ai colori differenti del muso di lupo. Il LES è caratterizzato da immunocomplessi che si depositano a livello delle membrane basali e delle giunzioni dermo-epidermiche (riacutizzazione in seguito a stress o esposizione al sole per l’aumentata apoptosi cellulare). Tutti i pazienti presentano anticorpi anti-DNA, alcuni contro fosfolipidi, ecc. Il LES porta a danno funzionale, attivazione del complemento, chemiotassi dei granulociti e distruzione dei tessuti (per il rilascio dei granuli). Si possono anche avere linfociti T che mediano un’infiammazione locale con uccisione cellulare: artrite reumatoide (contro antigeni sinoviali), sclerosi multipla (contro le lipoproteine mieliniche, vi prendono parte sia i TH2 che i TH17), encefalite autoimmune (sempre contro proteine mieliniche), diabete mellito insulino-dipendente di tipo 1 (p64 delle cellule ß del pancreas). In quest’ultima patologia si ha, attorno agli isolotti del Langerhans, un infiltrato linfocitario notevole. Le cellule ß overesprimono MHC di classe II, sotto l’influenza dell’IFN.. Solo queste sono uccise, perché si hanno soltanto autoanticorpi contro esse e/o contro l’insulina. In parte il rischio di sviluppare diabete di tipo 1 è legato all’HLA: per il 50% è ereditario. È comunque una malattia poligenica e multifattoriale. HLA-DQ-ß1 in posizione 57 può presentare residui di Val-Ser-Ala oppure di Asp. Nel primo caso si ha suscettibilità al DMID, nel secondo no. Un ponte salino Asp-Arg sulla catena a cambia la conformazione, rendendo possibile o meno la presentazione del peptide che elimina gli autoreattivi. Questo comunque non basta. È almeno necessaria un’infezione con infiammazione e produzione di IFN.. 
Ipersensibilità 
I disturbi da ipersensibilità sono stati classificati da Coombs e Gell in base a quattro prototipi di danno: I tipi I, II e III sono mediati da anticorpi ma differiscono per la rapidità di insorgenza. Il tipo I è detto ipersensibilità immediata (2 minuti) ed è guidata dalle IgE. Il tipo II insorge in 5-8 ore, mentre il tipo III in 2-8. Entrambi sono mediati da IgG. Il tipo IV di ipersensibilità è mediato dai linfociti T ed è detto di ipersensibilità ritardata (24/72 ore). Si noti che la rapidità riguarda la risposta secondaria, perché montare la risposta primaria richiede comunque tempo. 
Ipersensibilità di tipo I 
Di questa categoria fa parte l’allergia o atopia. Tali risposte sono sostenute dall’incontro con un antigene che di per sé è innocuo, una semplice proteina, non un batterio, virus o protozoo. Tale proteina viene riconosciuta in modo specifico, con conseguente produzione di immunoglobuline. I sintomi possono comprendere asma, eczema, rinite allergica, allergie alimentari. Le sostanze allergeniche sono assai varie, vanno dal polline alle proteine presenti nelle feci degli acari, a sostanze tossiche di vespe e api. Esse, tuttavia, sono accomunate da alcune caratteristiche: innanzitutto sono proteine, antigeni timo-dipendenti. I linfociti T mediano la commutazione verso la classe E di immunoglobuline. Inoltre, sono caratterizzate da un basso peso molecolare, che le rende facilmente diffusibili nell’ambiente, e sono molto solubili: sono presenti su frammenti secchi che, se ingeriti o inalati, si solubilizzano. Sono anche stabili, per resistere su tali frammenti disseccati. Non è necessaria una dose elevata per sensibilizzarsi, è stato valutato che basta 1µg l’anno circa di esposizione. Una APC che ha riconosciuto l’allergene può produrre IL-10, inducendo un differenziamento dei T CD4+ verso un fenotipo TH2. Questi, producendo IL-4 e IL-13, mediano uno switch e della porzione costante della catena pesante. Le IgE rimangono in circolo solo per due giorni e mezzo, ma si legano facilmente a recettori specifici per il loro Fc, presenti su mastociti, basofili e eosinofili (anche se su questi ultimi non sembrano avere funzione effettrice). Quando si viene esposti all’allergene per la seconda volta, l’IgE media il crosslinking, con trasduzione, tramite la catena dell’omodimero .. (diverso da quello del CD3) con sequenze ITAM, e da una catena ß a quattro domini transmembrana, che presenta anch’essa sequenze ITAM. Questo media un immediato rilascio dei granuli dei basofili e mastociti, contenenti istamina, eparina, PAF (platelet activating factor), leucotrieni, slow reacting substance, fattori chemotattici (per eosinofili e neutrofili). L’istamina, principalmente, è responsabile della contrazione delle fibrocellule muscolari lisce e dell’attivazione dell’endotelio con aumentata permeabilità vasale ed edema. Se si ha una caduta pressoria generalizzata, si ha shock anafilattico. Il tipo di reazione è differente se si viene a contatto con l’antigene per via locale o sistemica (es. calabrone). Inoltre, la reazione dipende dalla dose dell’allergene con cui si è venuti in contatto. Se l’antigene è sistemico si ha la reazione di anafilassi, definita da Portier e Richet all’inizio del XX secolo effettuando studi su antigeni delle anemoni di mare. Immunizzando un cane con tale antigene, al secondo richiamo si aveva una controprotezione, ovvero il cane moriva invece di essere protetto dall’antigene. Anche dei farmaci, come la penicillina, possono essere allergenici, perché si legano a proteine presenti nel nostro organismo. Il fatto che alcuni individui siano allergici mentre altri non lo sono è dovuto a vari fattori: alcuni possiedono le tasche adatte a presentare l’allergene, altri no, alcuni producono più citochine (IL-10 IL-4 IL-13) per polimorfismi nella regione promotore. Si hanno inoltre fattori ambientali: inibizione dei TH2 (TBC, lebbra, infezioni batteriche) per induzione di IFN./IL-12 
Ipersensibilità di tipo II 
È caratterizzata da danni litici mediati da anticorpi: l’antigene riconosciuto è posto su una membrana cellulare e, venendo riconosciuto da IgM o IgG, la cellula è lisata mediante l’attivazione del complemento. In tale categoria possono rientrare le malattie autoimmuni provocate da anticorpi diretti verso antigeni self dei tessuti, la sindrome di Goodpasture (nefrite), le reazioni verso trasfusioni di sangue (perché ogni individuo esprime naturalmente anticorpi contro gli altri gruppi sanguigni, essendo di natura glicidica, presenti nel mondo microbico e non avendo selezionato negativamente per essi), la reazione verso gli antigeni Rh (eritroblastosi fetale), alcune malattie emolitiche e il rigetto iperacuto. I neutrofili, macrofagi, cellule NK prendono parte a tali casi di ipersensibilità, esprimendo recettori per le Ig e per il complemento. 
Ipersensibilità di tipo III 
L’ipersensibilità di tipo III è caratterizzata da danni da immunocomplessi: infezioni persistenti, malattie autoimmuni e inalazioni ripetute di antigene portano ad una produzione cronica, a bassa quantità, di anticorpi. Questo porta ad un eccesso di immuncomplessi circolanti e ad un sovraccarico di macrofagi ed eritrociti, deputati al loro trasporto verso gli organi emocateretici (fegato e milza). I danni causati da tale accumulo di immunocomplessi dipendono dalle caratteristiche dell’anticorpo e dell’antigene e dalla dimensione degli IC stessi. Nel caso gli immunocomplessi fissassero il complemento, si ha danno tissutale, cheratosi, infiammazione, produzione di linfochine e formazione di microtrombi piastrinici. I macrofagi e i granulociti non riescono a fagocitare efficacemente gli immunocomplessi (fagocitosi frustrata) e, pertanto, si degranulano nell’ambiente extracellulare, causando ampi danni ai tessuti interessati. Si ha inoltre un aumento della vascolarizzazione nel tessuto, con circolo vizioso in quanto giungono più anticorpi e leucociti nella zona colpita. 
Ipersensibilità di tipo IV 
È un’ipersensibilità mediata da contatto (tubercolina/reazione granulomatosa). Nell’uomo è indotta da dinitrofenolo, nichel, cromo, additivi della gomma. Inoltre è secondaria a malattie quali tubercolosi, lebbra, leishmaniosi, listeriosi. Il corpo cerca di bloccare la zona dove è posto l’antigene, portando alla formazione di un granuloma, ovvero uno strato di fibroblasti che racchiude la zona con l’antigene. Nel centro di esso sono posti linfociti, macrofagi e cellule multinucleate di Langhans, derivanti dalla fusione di cellule macrofagiche. 
Coevoluzione sistema immune-microbi 
Il sistema immunitario si è coevoluto con il mondo microbico. Quest’ultimo, di conseguenza, ha sviluppato delle difese contro il sistema immunitario. Contro l’immunità innata si sono evoluti meccanismi di inibizione della chemiotassi, di inibizione dell’endocitosi (capsula), di inibizione della fusione dell’endosoma con i lisosomi (Mycobacterium tuberculosis), resistenza alla distruzione, fuga dall’endolisosoma (Lysteria monocytogenes). Contro l’immunità specifica si sono evolute varie tecniche di difesa: variabilità ontogenica (più di 84 ceppi di Streptococcus pneumoniae), mutazioni (virus dell’influenza con deviazione ontogenica 
o modificazione ontogenica), variazioni sequenziali (Trypanosoma), rifugi in zone immunoprivilegiate (Herpes zoster in nervi, che esprimono poco MHC). 
Immunodeficienze 
Le immunodeficienze sono patologie del sistema immunitario che si distinguono in primarie 
(ereditarie) e secondarie (acquisite). 
Le immunodeficienze primarie rappresentano il 53% di tutte le immunodeficienze. 23% sono 
immunodeficienze combinate ereditarie B+T, 7% immunodeficienze ereditarie che colpiscono i T, 
14% colpiscono i fagociti. Le immunodeficienze che colpiscono il sistema del complemento sono 
una piccolissima parte. 

Un deficit di IgA colpisce 1/500-2500 individui. L’agammaglobulinopatia (assenza totale di 
anticorpi) 1/50000. 

Agammaglobulinopatia legata al sesso 
Fu descritta per la prima volta nel 1952 da Bruton. Il caso clinico mostrava una madre e un padre normali ed un figlio maschio con dei problemi. Le cellule pre B si mostravano normali, con la catena µ riarrangiata ma con la catena leggera non riarrangiata. Il complesso µ+VpreB e .5 non segnala al nucleo, perché manca BTK (Bruton Tirosinchinasi). Si ha la totale assenza di linfociti B nel sangue e nei linfonodi, e conseguente mancanza di immunoglobuline nel siero. I pazienti affetti da questa agammaglobulinopatia sono proni ad infezioni multiple da parte di pneumococchi, stafilococchi, streptococchi, Haemophilus influenzae. La terapia prevede la somministrazione su base mensile di gammaglobuline. Nelle femmine eterozigoti maturano solo quei linfociti che non hanno inattivato l’X normale (l’inattivazione dell’X non è casuale nei linfociti B). 
Ipogammaglobulinemia transitoria dell’infanzia 
La madre passa al feto le IgG esattamente con le stesse proporzioni con cui sono presenti nel proprio siero. Alla nascita, nell’arco di 6 mesi circa, si ha una riduzione delle immunoglobuline di provenienza materna, e si ha la possibilità che il neonato produca da solo le proprie IgM. Per almeno due anni, rimarrà difficile lo switch verso una catena pesante a, con maggiore suscettibilità alle infezioni a sede mucosa. Il deficit da IgA è una malattia poligenica, associata con particolari HLA (A1 B8 DR3), asintomatica se non per le infezioni ricorrenti a sede mucosa (otiti, sinusiti, faringiti, bronchiti), diarrea e malassorbimento intestinale. 
Sindrome di DiGeorge 
La sindrome di DiGeorge si manifesta come un’anomalia nello sviluppo della 3a e della 4a tasca faringea embrionale, con difetti nella struttura facciale, dell’arco aortico, delle paratiroidi e del timo. Si può avere agenesia del timo o ipogenesia. Comunque sia, mancano moltissimi linfociti T, in particolare con TCR aß. In periferia mancano le aree T dipendenti, ossia la paracorticale e i manicotti periarteriolari splenici (PALS). Si hanno tuttavia T sufficienti a cooperare con i linfociti B, che sono aumentati di numero. Si ha l’incapacità dei linfociti T di controllare le infezioni intracellulari da parte di funghi, protozoi, virus. La sindrome si attenua un po’ man mano che l’individuo cresce, perché il MALT riesce a far maturare un certo numero di linfociti Taß. 
Deficit di ADA 
L’enzima adenosina deaminasi (ADA) media la trasformazione del nucleoside (desossi)adenosina in (desossi)inosina. La carenza di tale enzima porta ad un accumulo dei substrati (adenosina e desossiadenosina), che comporta un’alterata sintesi del DNA, principalmente a livello dei linfociti T e B. Tale deficit porta ad una linfopenia, con suscettibilità alle infezioni, alterazioni scheletriche e lesioni neurologiche. Per trattare questa grave patologia si sono tentati trapianti di midollo e somministrazione di ADA ricombinante, ma alla lunga non sortivano alcun effetto. Si è anche provato ad ingegnerizzare geneticamente le cellule staminali ematopoietiche in modo tale che esprimessero ADA, ma la strada è stata interrotta quando si sono notati casi di leucemia all’interno dei pazienti trattati sperimentalmente con terapia genica. 
Immunodeficienze fagocitarie (monociti-granulociti) 
Tali immunodeficienze sono caratterizzate da febbre in seguito a infezioni da batteri Gram -(LPS, IL-1), granulomi, ascessi, infezioni periungueali, gengivali, cutanee. I difetti che portano a deficit di tale tipo sono svariati: mieloperossidasi, recettori per complemento e citochine, molecole di adesione, incapacità di creare ROS (malattia granulomatosa cronica, sia autosomica sia X-linked), difetto nel citocromo b (X-linked) con assenza di H2O2 e O2­
Immunodeficienze da complemento 
I deficit possono colpire ogni via di attivazione, con accumulo di immunocomplessi, che non 
vengono degradati. 
Problemi nelle componenti terminali portano ad infezioni ricorrenti da piogeni, meningite, 
gonorrea: per la maggior parte della difesa dei batteri basta il C3b. 
Tra i problemi delle proteine regolatorie si ha una malattia autosomica dominante per deficit di 
inibitore del C1, l’angioedema ereditario, caratterizzato da edema sottoepiteliale, coliche 
addominali dovute ad aumento della permeabilità vascolare. La terapia prevede la 
somministrazione di inibitore di C1 ricombinante. 

SCID 
Se manca la catena . dell’IL-2R, codificata da un gene localizzato sul cromosoma X, si ha una SCID 
(severe combined immunodeficiency) X-linked con problemi ai linfociti B e T, in quanto manca 
segnalazione di sopravvivenza nello stroma midollare. 
Deficit delle recombinasi Rag-1 e Rag-2 portano ad una SCID autosomica recessiva, sempre con 
problemi ai linfociti B e T, che non possono riarrangiare i loro recettori antigenici. 
Difetti alla via delle PI3K portano ad una minore attività dei linfociti T, con maggiore 
radiosensibilità e predisposizione all’insorgenza di tumori. 
Difetti alla via delle JAK portano invece all’assenza totale di T e NK, mentre i B sono normali. 
Tuttavia, si ha ipogammaglobulinemia per assenza dell’aiuto da parte del compartimento T. 
Mutazioni dell’asse IL-12-IFN.-STAT1 portano alla mancata attivazione dei macrofagi infettati dal 
micobatterio in risposta a citochine e quindi a suscettibilità a tali infezioni. 

Immunodeficienze acquisite 
Le cause di immunodeficienze acquisite possono essere numerose: da causa iatrogena a trapianti e terapie antitumorali. La malnutrizione è l’immunodeficienza più diffusa, in quanto il sistema endocrino ed immunitario cooperano (leptina da parte degli adipociti). Anche le radiazioni sono causa di immunodeficienza. L’infezione da parte del virus HIV porta allo sviluppo di AIDS (sindrome da immunodeficienza acquisita). Nel 1981 si ebbe una epidemia di infezioni da parte di Pneumocystis carinii (detto anche 
P. jirovecii). Si scoprirono così due ceppi di HIV, HIV-2 che è endemico in Africa occidentale ed in India, e HIV-1, che è più virulento e si ipotizza sia stato trasmesso dallo scimpanzé. Le vie di infezione sono il contatto sessuale con individui affetti, la puntura con aghi infetti, la trasfusione di emoderivati infetti, il contatto con fluidi organici infetti (sangue, secreto vaginale, latte materno, sperma) e, in linea verticale, da madre a figlio (25% ma in diminuzione grazie alla zidovudina). HIV è un Lentivirus con glicoproteine di membrana (gp120 e gp41), contenente due eliche di RNA e trascrittasi inversa. Per l’infezione, utilizza due tipologie differenti di recettore: uno, obbligatorio, è il CD4. L’altro è un recettore chemochinico, o CXCR4 o CCR5, ma sono presenti almeno 7 recettori differenti che possono essere implicati nell’infezione. CCR5 è espresso su macrofagi, cellule dendritiche (che esprimono basse quantità di CD4) e T CD4+ (ceppi M-tropici di HIV). CXCR4 è espresso dai linfociti T CD4+ attivati (ceppi T-tropici). Il provirus viene trascritto a basso livello, in quanto NF.B lega anche i promotori virali. Si ha uno splicing multiplo dei geni virali grazie a TAT, il regolatore trascrizionale di HIV, permettendo una replicazione ad ampio livello. 
Tempo 0: penetrazione, infezione asintomatica, protezione naturale per CXCR4 CCR5 mutati o assenti, o occupati da citochine (RANTES, MIP-1a, MIP-1ß). Giorni: sindrome parainfluenzale 4-8 settimane: sieroconversione con anticorpi anti-gp120 Mesi: attivazione dei CD4 e CD8, e uccisione delle cellule infettate, scomparsa della viremia Anni: diminuzione dei linfociti CD4 perché o sono stati uccisi da HIV (lisi e apoptosi), o uccisi da CTL 
o formazione di sincizi. Immunodeficienza progressiva (infezioni opportunistiche, da P. jirovecii) AIDS conclamato: infezioni incontrollate, tumori quali il sarcoma di Kaposi, linfomi B. 
Sembra ci sia una correlazione tra HLA e prognosi: i pazienti con B57 e B27 hanno una prognosi migliore, mentre quelli con B35, una prognosi peggiore. Si hanno pazienti asintomatici, in cui si è avuta sieroconversione senza malattia conclamata, con bassi livelli di virus circolante. Si hanno anche individui sieronegativi, senza virus né malattia nonostante si abbia avuto un contatto sicuro con HIV. Alcuni presentano CTL e TH1 specifici. Circa l’1% degli individui caucasici è omozigote e il 10% eterozigote per una mutazione di CCR5. Si hanno anche polimorfismi del suo promotore. Gli africani e i giapponesi non hanno tale allele mutato. I serbatoi permanenti di infezione sono i linfociti CD4 memoria. Per impedire l’infezione di cellule non infettate, si hanno farmaci contro la retrotrascrizione e le proteasi. La strategia della vaccinazione deve affrontare il problema della mutazione. Si hanno 109 nuovi virioni al giorno, e molti possono presentare mutazioni. Il provirus, inoltre, può rimanere silente, senza esporre alcun bersaglio antigenico sulla superficie delle cellule infette. Un altro problema è la mancanza di modelli animali duttili (il più simile è il macaco affetto da SIV). 
Immunità verso i tumori 
Si distinguono due grandi categorie di tumori solidi: i sarcomi, che colpiscono i tessuti di origine 
mesodermica (osso, tessuto adiposo, fibroblasti) e i carcinomi, che colpiscono i tessuti di origine 
ectodermica ed endodermica (cute, ghiandole, epiteli in generale). 
Si ha poi la categoria di neoplasie che colpisce le cellule specializzate del sistema immunitario: 
plasmocitomi/mielomi, linfomi (in cui le cellule rimangono localizzate in un organo linfoide), 
leucemie (mieloidi/linfoidi, croniche/acute), in cui le cellule vanno in circolo nel torrente ematico. 

I modelli animali su cui si studiano i tumori possono essere tumori trapiantabili, tumori indotti da 
virus o tumori indotti da carcinogeni chimici. 

Come evolve il rapporto tra la neoplasia e il sistema immunitario? Esso può avere un ruolo di 
immunosorveglianza, ossia di controllo ed eliminazione delle cellule trasformate, ma può anche 
avere un effetto di immunostimolazione, in seguito al rilascio di citochine e fattori di crescita vari. 
All’inizio si possono avere entrambe le situazioni. A tumore conclamato, si hanno in circolo CTL e 
anticorpi, specificamente rivolti contro gli antigeni tumorali, e nella massa tumorale sono 
riscontrabili tumor infiltrating lymphocytes (TILs). Il sistema immunitario, quindi, è di per sé in 
grado di riconoscere il tumore, ma è incapace di eliminarlo. In uno stadio ormai avanzato della 
malattia neoplastica si ha una soppressione del sistema immunitario dovuta a proprietà del 
tumore stesso e cachessia, dovuta alle elevate dosi di TNFa in circolo: si perde tonicità muscolare 

perché l’attivazione del sistema immunitario stimola l’attivazione del catabolismo proteico, si perde anche tessuto adiposo per minore espressione di lipoprotein lipasi. Si possono intraprendere manovre di immunoterapia, per stimolare il sistema immunitario nel combattere i tumori. Le domande che fa sorgere tale approccio è se, una volta che il tumore si è sviluppato, il sistema immunitario possa ancora controllarne la crescita o meno, se sia possibile attivare una reazione immunitaria contro le neoplasia e se sia possibile la vaccinazione verso un tumore. 
La prima domanda a cui si è risposto è se esistano o meno antigeni tumorali. In topi singenici (inbred), trattati per via cutanea con metilcolantrene (un carcinogeno chimico), si ha sviluppo di un tumore. L’inoculo di tale tumore in altri animali singenici porta allo sviluppo del tumore anche in essi. Vaccinando dei topi con cellule tumorali uccise, non si ha sviluppo di tumore in seguito a inoculazione di cellule neoplastiche vive. Questo esperimento dimostra che esistono antigeni tumorali, è possibile vaccinare verso un tumore e si ha una risposta immunitaria specifica. Ma nell’uomo sono presenti antigeni tumorali? Nella massa neoplastica sono osservabili infiltrati leucocitari, si ha un’iperplasia dei linfonodi drenanti la zona colpita e si ha la presenza di citochine varie, tutti fattori che depongono a favore dell’ipotesi che ciò che è stato osservato nei topi possa essere riproducibile anche nell’umano. È stata perciò avanzata la teoria dell’immunosorveglianza. I suoi presupposti sono: 
­Le cellule neoplastiche derivano da cellule normali mutate che possono essere o sono antigenicamente differenti dalle cellule normali 
­Una volta al giorno in ogni individuo si sviluppa un clone neoplastico che il sistema immunitario è in grado di eliminare. In realtà studi recenti hanno dimostrato che si ha lo sviluppo di un clone una volta l’anno nel 25% della popolazione umana. 
Un fattore che depone a favore di tale ipotesi è il fatto che l’incidenza dei tumori aumenta nel caso di pazienti anziani e immunodepressi/immunodeficienti. Fattori che depongono contro tale ipotesi sono l’osservazione della carcinogenesi come un processo multifasico, l’esistenza discussa di antigeni tumore-specifici, lo sviluppo di neoplasie nel primo anno di vita di alcuni individui. 
Si possono distinguere i TSA (tumor-specific antigens) e i TAA (tumor-associated antigens). Mentre i primi sono propri delle cellule tumorali, i secondi sono anche espressi sulle cellule normali, ma sono iperespressi dal tumore. In quest’ultimo caso bisogna superare la tolleranza del sistema immunitario verso il self prima di avere una qualche risposta. Nel 1971 è stato effettuato il primo approccio sperimentale che ha permesso di dimostrare la presenza di antigeni tumore-specifici nel melanoma. Si sono presi dei linfociti di un paziente affetto da melanoma, in cui si hanno anche i linfociti che hanno riconosciuto il melanoma ma non sono stati in grado di eliminarlo, e li si unisce ad una linea in vitro del melanoma stesso, facendo una cosiddetta mixed lymphocyte tumor interaction. Si ha un’espansione dei linfociti citotossici anti-melanoma. Con essi è possibile screenare una libreria genica ottenuta dalla trasfezione di fibroblasti con frammenti del genoma tumorale. I cloni di fibroblasti che vengono lisati contengono anche il gene che codifica per l’antigene tumorale. Si può quindi clonare ciascun gene in modo da identificare quello che stimola la risposta CTL. Un altro approccio è quello di far presentare gli antigeni tumorali da APC, in modo da presentare in MHC-I anche l’antigene tumorale, e identificare le CTL specifiche. Con quest’altra tecnica si può identificare il peptide e, da questo, il gene. 
Un’altra metodica è la SEREX (serological analysis of antigen by recombinant expression cloning). Da una linea neoplastica si può ottenere una libreria di cDNA tumorale, in fago .. Si ampliano quindi i fagi infettando con essi E. coli su piastre di agar, in modo da avere un clonaggio. Si applica quindi sulla piastra un filtro di nitrocellulosa, a cui aderiscono le proteine tumorali espresse dai vari cloni. Si incuba tale membrana con il siero di paziente e con un anticorpo secondario marcato. Dopo autoradiografia della membrana, si identifica il clone esprimente il peptide riconosciuto dal siero, e lo si sequenzia. 
Un’altra analisi ancora è la SERPA (analisi serologica del proteasoma). Questa è una tecnica più duttile: permette di confrontare il profilo di espressione di cellule sane e neoplastiche, identificando di conseguenza ciò che individua il paziente dal sano (strutture tumorali non presenti nel sano). Questo è possibile anche qualora si sia in possesso di un campione biologico e non di una linea in vitro. In seguito a lisi cellulare, si estraggono le proteine dal campione e si effettua una SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di sodio dodecil solfato) bidimensionale. La prima corsa focalizza le proteine a seconda del loro punto isoelettrico pI, la seconda in base al peso molecolare MW. Si effettua quindi un western blot su membrana di nitrocellulosa per trasferire le proteine così separate. Ogni spot rappresenta una proteina singola. Marcando la membrana una volta con il siero del paziente e una volta con il siero di un controllo sano, si possono identificare gli antigeni tumorali. Replicando il gel e colorandolo, si può estrarre la proteina dallo spot di interesse, digerendola con la tripsina. L’analisi allo spettrometro di massa fornisce quindi la sequenza amminoacidica del peptide di interesse. Si possono anche avere “treni di proteine” di interesse, in quanto il punto isoelettrico differente può essere dovuto a differenze di fosforilazione (questo non può essere determinato dalla SEREX). 
Antigeni tumorali 
Sono codificati da geni cellulari silenti, non espressi normalmente nell’individuo, ma magari espressi durante la vita embrionale (MAGE1, presente in circa il 50% dei melanomi e nel 25% dei carcinomi di mammella, vescica, prostata e polmone). Possono anche essere codificati da oncogeni e onsocoppressori (p21 e Ras in posizione 12 nel 40% dei carcinomi, p210 Bcr-Abl nella leucemia mieloide cronica, p53 nel 53% dei tumori, ErbB2) 
Antigeni di virus oncogeni 
I virus oncogeni finora conosciuti (non tutti nell’uomo) sono: Tra gli adenovirus: ­Papovavirus/Adenovirus (poliomavirus, SV40), in roditori neonati o in adulti immunodeficienti ­Epstein-Barr Virus (EBV), può concorrere all’insorgenza di linfoma di Burkitt, linfomi B e carcinoma nasofaringeo ­Papillomavirus umano (HPV), può concorrere all’insorgenza di carcinomi della cervice uterina 
Tra i retrovirus, quelli che causano insorgenza di tumore a giorni/settimane dall’infezione: 
­Rous sarcoma virus (mutazioni Src) 
­Virus della mielocitomatosi degli uccelli (mutazioni Myc) 
­Virus del sarcoma murino di Kirsten (mutazioni K-Ras) 
Esistono altri retrovirus che non hanno un oncogene ben distinto, ma sono correlati all’insorgenza di tumori dopo mesi: o si inseriscono vicino ad oncogeni o disregolano geni della crescita cellulare. Tra essi si ha HTLV-1 (Human T cell lymphotropic virus 1), che colpisce i T CD4+. 
Si hanno anche antigeni codificati da geni tessuto-specifici, antigeni glicolipidici e glicoproteici alterati (ad esempio le mucine, in cui nei tumori si hanno enzimi delle catene laterali deregolati) 
Antigeni oncofetali 
Espressi durante la vita fetale e dunque non antigenici: 
­Alfa-fetoproteina, secreta dal sacco vitellino e dal fegato, e poi sostituita dall’albumina. È presente nei carcinomi epatocellulari, gastrico, pancreatico, e della linea germinale. Non ha valore diagnostico perché è upregolata anche nella cirrosi, ma è utile comunque per seguire l’evoluzione della neoplasia. 
­Antigene carcinoembrionario (CEA) è un antigene di membrana, che viene rilasciato a livello enterico, epatico e pancreatico nei primi sei mesi di gravidanza. Nell’adulto viene espresso dal colon e dalla mammella, durante la lattazione. 
La presentazione degli antigeni tumorali può essere diretta, sull’MHC della cellula stessa, indiretta, con il rilascio di antigeni dalle cellule tumorali. Le cellule dendritiche possono presentare gli antigeni in classe II e in classe I (crosspresentazione). Gli antigeni tumorali sono riconosciuti dai linfociti T, in quanto il repertorio di TCR è ampio, con recettori in grado di riconoscere anche questi antigeni tumorali. È importante la presenza di molecole di adesione. Si ha un accumulo di tali T nel tumore per la presenza di chemochine. Le cellule NK possono riconoscere ed uccidere i tumori per la perdita di MHC di classe I, i linfociti B possono produrre anticorpi diretti contro antigeni tumorali (nel 30-50% dei pazienti). Si hanno meccanismi di autodifesa del tumore, che fanno sì che il tumore non sia rigettato. Tra di essi si annoverano: 
­Mancata espressione del peptide antigenico, in quanto la distruzione di ciò che lo esprime 
seleziona le cellule che non lo esprimono ­La downregolazione di MHC-I, che impedisce il riconoscimento da parte dei CD8 ­L’assenza di molecole costimolatorie (B7), che impedisce l’attivazione dei linfociti vergini ­Alterazioni a livello della presentazione dell’antigene ­Fattori immunosoppressori (TGFß, inibisce le cellule T; IL-10, che media lo shift da TH1 a TH2, 
FasL) 
­L’attivazione costitutiva di STAT3, che attiva proteine antiapoptotiche. 

Si può anche avere un’inefficienza della risposta al tumore, a causa di: ­Anergia o ignoranza immunologica ­Alterata trasmissione del segnale dal TCR, in particolare della catena . ­Sequestro, blocco funzionale e apoptosi dei linfociti nella massa neoplastica ­Alterata espressione di molecole di adesione e insufficiente penetrazione nella massa 
tumorale 
­Bassa frequenza di cellule T tumore-specifiche 
­Sviluppo di cellule Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ 
­Presenza di cellule mieloidi soppressorie 

Immunoterapia 
L’immunoterapia può effettuarsi in molti modi: 
­Passiva, per somministrazione di anticorpi monoclonali specifici per antigeni tumorali. Gli anticorpi monoclonali possono essere utilizzati come veicoli per trasportare a livello della neoplasia tossine vegetali o batteriche, radionuclidi, farmaci citotossici. I problemi che sono stati incontrati in tale approccio sono la specificità, la rimozione anticorpale da parte dei fagociti, l’epatotossicità, il fatto che sono anticorpi non self (essendo prodotti in altre specie, sono immunogeni), la selezione dei cloni mutati che non esprimono l’antigene. La soluzione per quest’ultimo problema è la somministrazione di cocktail di anticorpi e l’utilizzo di anticorpi contro antigeni essenziali per la cellula tumorale. 
­Adottiva, per trasferimento di NK, LAK, TIL (approccio di Steve Rosenberg). Le cellule NK possono essere attivate in vitro in presenza di IFN. e IL-2 per produrre LAK. Esse ampliano la tipologia del bersaglio e la potenza dell’attività citotossica. Sono in grado di uccidere i tumori in vitro e inibiscono le metastasi in vivo, ma devono essere associate ad inoculo di IL-2 ad alte dosi. Nel carcinoma del rene, si ha un 5% di remissione completa, un 4% di remissione parziale e un 4% di morti iatrogene in seguito a terapia con LAK. Si possono anche attivare i TIL in vitro con IL-2 e altri attivatori specifici (che salvano anche le cellule dall’anergia) essi sono dal 50 al 100% più efficaci delle cellule LAK. Tuttavia, entrambe le procedure sono rischiose e laboriose (richiedono sterilità). 
­Attiva, per vaccinazione, immunostimolazione e somministrazione citochinica. Si può dare un’immunostimolazione aspecifica con prodotti batterici derivanti dal bacillo di Guerin, poli I:C, poli A:U per stimolare i TLR. Si possono utilizzare citochine per via sistemica 
o per via locale (nei linfonodi vicini al sito tumorale), oppure l’utilizzo di proteine o cellule ingegnerizzate o vettori a DNA. I vaccini tumorali che sono stati sperimentati finora sono composti da: cellule tumorali uccise, pezzi di cellule, antigeni tumorali (poco efficienti perché mancano i “segnali di pericolo” costimolatori), cellule tumorali modificate per esprimere molecole costimolatorie (non più utilizzato). Si è anche sviluppato un vaccino con cellule dendritiche, caricate di antigeni tumorali. Esse si possono far differenziare dai monociti del sangue periferico, che rappresentano il 10-12% dei leucociti mononucleati nel sangue periferico, in vitro. Esse possono anche essere trasfettate con il gene dell’antigene di interesse.