Introduzione 
La biologia molecolare è la scienza che studia i dettagli molecolari dei processi biologici. 

Essa si basa su di un approccio riduzionistico per la comprensione e risoluzione di problemi complessi. Il riduzionismo poggia sulla convinzione che tutto quello che succede nel mondo risponde alle leggi fondamentali della chimica e della fisica, perciò anche i processi biologici. Ne è un esempio la legge di azione di massa, che descrive l’andamento di una reazione chimica quantificando le concentrazioni delle varie specie chimiche che vi prendono parte. 
Il metodo scientifico è ciò che caratterizza la scienza. Essa cerca di derivare dei modelli di come funzionino i fenomeni naturali, in modo tale da poterli applicare anche a questioni pratiche. Per giungere al modello sono necessarie delle misure sperimentali, che vengono utilizzate per fare delle predizioni, le ipotesi. Partendo da tali ipotesi, si possono compiere degli esperimenti, che possono confermare o confutare il proprio modello. 
Non tutto è riconducibile però ad un riduzionismo semplice, in quanto, pur conoscendo tutte le caratteristiche fondamentali dell’organismo, non sappiamo ancora come funzionino i vari processi. Risulta pertanto fondamentale studiare i processi che interessano da vicino la specie umana anche su organismi molto distanti da noi, utilizzati come modello (Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Saccaromyces cerevisiae). Possiamo utilizzare dei modelli così semplici per studiare l’uomo in quanto ci siamo tutti evoluti a partire da una cellula ancestrale. 
Il genoma 
In ogni cellula del nostro corpo umano sono contenuti all’incirca 2 metri di DNA, che è spesso solo alcuni nanometri. Le informazioni contenute all’interno del DNA sono fortemente compresse, per far sì che esse possano essere contenute nel nucleo della cellula. Il genoma è come un CD audio, in cui le varie informazioni sono codificate, con apposite sequenze di start e di fine per distinguere le diverse tracce (i geni). Per l’effettivo ascolto del CD (l’espressione dell’informazione contenuta in esso), inoltre, sono necessari un apparato di lettura e delle casse, proprio come nel genoma le informazioni devono essere lette e tradotte in proteine dai ribosomi (con l’intermedio dell’mRNA e relativo apparato trascrizionale). 
Le varie funzioni della cellula, pertanto, sono svolte mediante complessi apparati molecolari, costituiti da proteine e talvolta da molecole di RNA. 
L’ibridazione degli acidi nucleici 
La struttura della doppia elica di DNA, scoperta nel 1953 da Watson e Crick, con il contributo essenziale di Rosalind Franklin, è un insieme di forze attrattive e repulsive. 
I filamenti tendono ad essere carichi negativamente a causa della presenza dei gruppi fosfato del backbone, tuttavia questa è una carica in equilibrio dinamico, in cui alcuni gruppi fosfato sono dissociati, mentre altri no. Questa carica dello stesso segno fa sì che i due filamenti si respingano, tuttavia, la presenza di ponti idrogeno specifici tra le basi azotate all’interno della doppia elica e la presenza di interazioni idrofobiche più aspecifiche consente ai due filamenti di rimanere appaiati. 
La rottura del DNA può avvenire in due modi: 
»  La  rottura  dei ponti idrogeno  tra  le basi  azotate  prende il  nome  di  denaturazione,  è  un  evento  
abbastanza semplice da produrre ed è facilmente reversibile  
»  La rottura dei legami fosfodiesterici tra gli zuccheri e i gruppi fosfato del backbone è invece un processo  
che porta alla degradazione del DNA e può avvenire per traumi meccanici oppure per l’attività di appositi  
enzimi detti nucleasi  

Di solito, anche negli studi di biologia molecolare, è più utile la rottura dei ponti idrogeno (con delle importanti 
eccezioni, che vedremo più avanti). La denaturazione si può ottenere in diversi modi: » Aumento della temperatura: aumentando l’energia cinetica, aumenta la probabilità che una collisione porti alla formazione di un ponte idrogeno tra una molecola d’acqua ed una base azotata. La temperatura fa aumentare la tensione della molecola di DNA che, se non viene ridotta, porta alla rottura della doppia elica. Nelle cellule esistono due enzimi principali deputati al rilascio di tale tensione di superavvolgimento, la elicasi (che è un’ATPasi) e le topoisomerasi (che invece non richiedono ATP) 
» 	pH estremamente alcalino: in condizioni fisiologiche il DNA è esposto a pH leggermente alcalini (~7,4), se si aumenta la basicità della soluzione fino a raggiungere pH superiori a 12, i protoni dissociati dei gruppi fosfato del DNA vanno a combinarsi con gli ossidrilioni OH -. In questo modo si crea uno squilibrio verso la forma dissociata dei gruppi fosfato (carichi negativamente) e la forza di repulsione elettrostatica separa i due filamenti. 
» 	Utilizzo di sostanze che formano facilmente ponti idrogeno: ad esempio urea o formammide. 
» 	Diminuzione della forza ionica (concentrazione salina): la presenza di sali disciolti in soluzione contrasta la denaturazione del DNA, in quanto crea una nuvola di controioni attorno alle cariche negative dei gruppi fosfato. Diminuendo la forza ionica, pertanto, si aumenta la forza di repulsione tra i due backbones. 
La denaturazione del DNA porta alla diminuzione della viscosità della soluzione. Mentre la doppia elica è una struttura maggiormente rigida, in quanto i due filamenti sono vincolati dai ponti idrogeno e il passo dell’elica si mantiene abbastanza costante (ovvero la molecola ha un’alta viscosità intrinseca), quando i filamenti si separano essi sono liberi di assumere una conformazione random, più libera, che permette un maggiore movimento (la molecola ha una minore viscosità intrinseca). La denaturazione porta anche ad una variazione dell’attività ottica della molecola (ovvero la sua capacità di deviare il piano della luce polarizzata) e soprattutto ad un aumento dell’assorbanza (la capacità dei nucleotidi di assorbire i raggi ultravioletti) il cui picco è a 260 nm. 
Le curve di denaturazione sono delle curve sigmoidi che mettono in correlazione la temperatura con la differenza di assorbanza di un determinato campione di DNA. La temperatura di melting (Tm) è la temperatura a cui il 50% delle molecole sono dissociate. Nell’immagine sono presentate le curve di denaturazione di un DNA batterico e di uno virale. Si può notare che la temperatura a cui l’assorbanza inizia a variare è differente. Inoltre, nel caso del virus basta un piccolo aumento di temperatura per portare alla completa denaturazione del campione, mentre nel batterio il processo è più graduale. Perché i due DNA si comportano in modo differente? Perché la sequenza delle basi azotate non è la stessa. Ci sono delle sequenze che si denaturano prima e altre che si denaturano dopo. Questo è dovuto al fatto che le coppie di basi adenina -timina formano due soli ponti idrogeno, mentre le coppie di basi guanina – citosina 

formano tre ponti idrogeno. 
Evidentemente, il DNA virale presenta delle caratteristiche molto più omogenee, per cui quando si inizia a denaturare 
una porzione, si denatura tutto (non si hanno sequenze con composizioni in basi particolari). Questo è ovviamente 
dovuto anche alla minore lunghezza del campione. 
Il genoma umano è ancora più eterogeneo di quello batterico, per cui la sua denaturazione risulta molto più graduale. 
Lo studio dell’assorbanza, pertanto, permette di capire quanto un DNA sia eterogeneo. 
Quasi tutte le tecnologie di biologia molecolare sono basate sulla denaturazione del DNA, in quanto essa rende più 
facilmente disponibile (“leggibile”) l’informazione contenuta all’interno dell’acido nucleico. 

La denaturazione, tuttavia, non è un processo irreversibile. I ponti idrogeno, in condizioni opportune, si possono 
riformare, nel processo chiamato rinaturazione (annealing). 
Se il campione denaturato viene raffreddato bruscamente, si ha la formazione di ponti idrogeno intermolecolari e 
intramolecolari con le basi più vicine, in quanto si hanno regioni idrofobiche esposte all’acqua (ovvero ad alta energia 
potenziale). 
Se la temperatura viene abbassata gradualmente, invece, le molecole complementari riescono a trovarsi. Se si 
tengono infatti le molecole in soluzione a temperatura leggermente inferiore a quella di denaturazione, ci saranno 
collisioni che potrebbero formare alcuni ponti idrogeno, ma troppo pochi per la temperatura limite in cui le molecole 
sono tenute “stirate” (collisione fuori registro). Tuttavia, se si ha una collisione fortunata, si formano molti ponti 
idrogeno, l’energia potenziale si abbassa di colpo e si viene a 
formare la doppia elica. L’evento iniziale è molto raro, ma il resto 
avviene molto velocemente, col fenomeno noto come rapid 
zippering. 

Il processo è anche chiamato di ibridazione, in quanto i filamenti che si riappaiano non sono esattamente quelli originari, ma si ha avuto uno “scambio di coppia”. Se i filamenti non sono proprio complementari, si ha la mancanza di alcuni ponti idrogeno (mismatching). Il grafico mostra le cinetiche di rinaturazione per quanto riguarda il genoma di E. coli (2) e di H. sapiens sapiens (1). Nel batterio, trascorre un intervallo di tempo abbastanza grande prima che avvenga l’appaiamento corretto, ma poi si ha una variazione rapida 


dell’assorbanza, segno di una rapida rinaturazione. 
Nell’uomo, invece, si ha un grafico molto diverso da quanto ci si aspetterebbe: il processo inizia molto prima di E. coli. 
Questo è dovuto al fatto che sono presenti molte sequenze complementari ripetute (più del 45% dell’intero genoma). 
Come si può notare, la curva è bifasica: la rinaturazione inizia rapidamente, dopodiché si ha una parte del processo 
molto più lenta di quella del batterio, che fa completare il processo dopo (vari tentativi prima di trovare l’appaiamento 
tra le basi corretto). 

La stringenza è l’insieme delle caratteristiche di denaturazione (temperatura, pH, forza ionica, presenza di solventi che 
formano ponti idrogeno). Variando tali condizioni, si può determinare la precisione della rinaturazione che si desidera. 
Alte condizioni di stringenza permettono solo la formazione di ibridi perfetti, in quanto gli ibridi che presentano 
mismatch sono troppo sfavoriti energeticamente. Condizioni di stringenza minori permettono invece un’ibridazione 
anche solo parziale. 

La marcatura degli acidi nucleici 
Esistono differenti tecniche di biologia molecolare che permettono di ottenere molecole di DNA in vitro, senza 
l’utilizzo di una coltura cellulare. Il primo metodo è la sintesi di oligonucleotidi, che avviene mediante un processo 
chimico ciclico, con aggiunta di un nucleotide (dNTP/NTP) per volta. Questo è un processo che permette la sintesi di 
frammenti lunghi fino a 100 basi, per lunghezze superiori esso non è efficiente. Un altro metodo prevede invece 
l’utilizzo di un DNA stampo e di DNA polimerasi batteriche (nelle opportune condizioni, presenza di dNTP e di un 
primer al 5’) per la sintesi di un filamento complementare. 
Questi DNA possono essere utilizzati per ibridizzare dei campioni e rilevare la presenza di determinate sequenze. 
Qualora invece non si conosca la sequenza del DNA è possibile la creazione di primer random, alcuni dei quali si 
attaccheranno alle sequenze del campione. 
Dal momento che la sequenza del DNA non può essere visualizzata direttamente, è necessario marcare tali molecole 
con traccianti che rendano visibili i punti di avvenuta ibridazione. 

P 33P 35
I primi traccianti utilizzati per tale scopo furono dei nucleotidi trifosfato marcati con isotopi radioattivi (32S 3H). Essi sono molto comodi, in quanto non modificano le proprietà chimiche della molecola (e pertanto gli enzimi la riconosceranno in tutto e per tutto come una molecola normale) e sono attualmente utilizzati per alcuni studi particolari. Tuttavia, l’utilizzo di traccianti radioattivi è problematico per la sicurezza degli operatori e anche per la difficoltà di produzione e quindi per il costo di tali isotopi. Attualmente vengono utilizzati dei nuovi traccianti non radioattivi, in cui la struttura nucleotidica è stata modificata. In particolare, alle basi azotate (sempre in grado di stabilire i corretti legami idrogeno) è legata una catena organica detta spacer e una molecola derivata dal colesterolo, la digossigenina. 
Questa molecola può essere riconosciuta da specifici anticorpi (marcati solitamente in maniera fluorescente). Altri traccianti, appunto, sfruttano il fenomeno della fluorescenza: determinate molecole, quando sono colpite da un fotone, lo assorbono e lo riemettono successivamente a differenti lunghezze d’onda (ne sono esempi la fluoresceina e la tetrametilrodamina). Queste molecole sono dette fluorocromi. Nel caso di legame diretto di un fluorocromo ad un nucleotide, è necessaria la presenza di una sequenza spacer, che allontani l’ingombro sterico dall’asse della doppia elica. Altre sostanze non radioattive utilizzate per marcare determinate molecole sono gli enzimi (perossidasi) o la biotina. 
Il controllo dell’espressione di un gene: estrazione di mRNA 
La base del differenziamento cellulare che porta alla straordinaria quantità di tipi tissutali e cellulari differenti è la differente espressione genica, sia per quanto riguarda il tipo di geni espressi (con tutta l’enorme complessità delle loro interazioni) sia per quanto riguarda quanto un determinato gene è espresso. Esistono dei geni che sono tessuto-specifici, i cui prodotti sono presenti esclusivamente in un determinato tipo cellulare, e dei geni che sono espressi in tutte le cellule ma non allo stesso livello. Questi geni sono detti housekeeping, in quanto sono deputati genericamente al funzionamento di base della cellula (ad esempio, i geni che codificano le proteine ribosomali). In che modo si può capire quali geni esprime (o non esprime) un determinato tipo cellulare? Per quanto riguarda i geni che codificano per proteine, essi si dicono espressi qualora siano trascritti in mRNA e vengano quindi tradotti nel rispettivo prodotto polipeptidico. 

I livelli di mRNA, e quindi di espressione, invece, dipendono da un bilancio dinamico tra quanto mRNA è prodotto e 
quanto ne viene distrutto. 
Ogni cellula esprime circa la metà del genoma, ma le molecole di mRNA rappresentano solo il 2-4% di tutto l’RNA 
presente in una cellula. I messaggeri, inoltre, sono estremamente eterogenei e sono espressi in maniera molto 
differente (alcuni in molteplici copie molto stabili, altri in pochissime copie con turnover elevato). 
Tuttavia, tutti gli mRNA (maturi) sono caratterizzati dalla presenza di una coda poliadenilata alla loro estremità 3’. 
Risulta comodo, pertanto, utilizzare una cromatografia di affinità mediante oligonucleotidi poliT legati a supporti solidi 
per la loro purificazione. 

Elettroforesi 
Una delle analisi di base che si compie sui campioni di DNA, cDNA, mRNA e proteine è l’elettroforesi. Essa può essere 
compiuta su gel di agarosio o su gel di poliacrilamide (PAGE). 
I campioni sono posti all’interno di appositi pozzetti in un gel, un composto reticolare che ostacola lo spostamento 
delle molecole al suo interno. Il campione viene quindi sottoposto ad una differenza di potenziale. Le molecole di 
acido nucleico, che sono cariche negativamente, si muovono verso il polo positivo a velocità differenti. 
Da cosa è determinata la velocità di spostamento delle diverse molecole? Dalla massa, dalla carica e dalla forma. 
Dal momento che il rapporto massa/carica negli acidi nucleici è pressoché costante, per poter fare in modo che lo 
spostamento dipenda solamente dalla massa è necessario porre i campioni in soluzione denaturante (formammide e 
formaldeide). 

I campioni più leggeri si muoveranno più velocemente, 
distanziandosi maggiormente. 
Utilizzando una miscela campione con frammenti di massa nota, 
si possono quindi stimare anche le masse delle differenti fasce 
che si vengono a formare nella corsa elettroforetica. 
Nel caso di una corsa elettroforetica dell’RNA totale, però, si 
otterrà soltanto una strisciata continua, con tre fasce più 
intense corrispondenti agli rRNA e ai tRNA. Per quanto riguarda la corsa del solo mRNA, si ottiene una striscia continua, 
in realtà formata da tante bande vicine e poco intense. In questo modo, però, non si possono distinguere i singoli 
mRNA e stimarne di conseguenza il loro peso. 

Blotting 
La tecnica utilizzata per poter individuare l’acido nucleico di proprio interesse all’interno di una corsa elettroforetica prevede la sua ibridazione con una sonda marcata. Tuttavia, la reazione di ibridazione non può avvenire all’interno del gel. La striscia elettroforetica viene quindi trasferita su di una membrana di nylon o nitrocellulosa mediante una tecnica nota come blotting. Nel caso l’acido trasferito sia DNA si parla di Southern blot (in onore del suo inventore, che di cognome si chiamava Southern). Nel caso l’acido sia invece un RNA, si parla di Northern blot. La tecnica è sostanzialmente la stessa: sotto il gel sono posti dei filtri bagnati. Sopra di esso sono posti in ordine la membrana di nitrocellulosa o nylon, una pila di filtri asciutti e un peso. In questo modo, nel tempo, il liquido sale per capillarità e nel flusso sono trasportate le molecole, che si fermano sul supporto, mantenendo inalterata la posizione. Questo supporto permette l’ibridazione. Prima di procedere con tale reazione, però, è necessario bloccare tutti i siti della membrana su cui non si è legato il DNA con altre molecole (DNA eterologo, albumina), in modo tale da impedire alla sonda di legarsi indiscriminatamente. Dopo la reazione di ibridazione con sonda marcata, si opera un lavaggio con le condizioni di stringenza desiderate e dall’analisi del risultato si può capire in quali tipi cellulari un determinato RNA sia espresso, quanto sia espresso (a seconda dell’intensità del segnale) e il suo peso molecolare. Tale tecnica è utile per lavorare su molecole purificate (richiede infatti l’uccisione delle cellule) ma non permette la localizzazione dell’mRNA all’interno della cellula, che è un fattore particolarmente importante per il differenziamento cellulare e per i tipi cellulari asimmetrici. Inoltre, per poter applicare tale tecnica il campione non deve essere danneggiato. L’RNA, tuttavia, è una molecola molto delicata. Il mondo è pieno di ribonucleasi (enzimi che tagliano l’RNA), in quanto sono le prime molecole che si attivano alla morte della cellula. Basta un solo taglio nella sequenza di un RNA per ottenere una strisciata invece di una banda dopo l’ibridazione e perdere quindi ogni possibilità di studio. 


Esso è particolarmente funzionale per lo studio gene per gene, ma è poco flessibile per la visione moderna di studio genomico. Dal momento che sono state messe a punto tecniche più moderne ed efficienti, il Northern blotting è poco utilizzato. 
Ibridazione in situ Per sapere dove sia espresso un gene (dove sia localizzato l’mRNA di tale gene) è necessaria la tecnica dell’ibridazione in situ (che nel caso sia condotta con sonde fluorescenti assume l’acronimo di FISH – fluorescent in situ hybridization). Essa è particolarmente importante nello studio dello sviluppo embrionale, in quanto i geni non sono espressi omogeneamente nelle poche cellule che costituiranno l’organismo completo. Essa consiste nell’ibridazione degli acidi nucleici senza separarli o purificarli, direttamente all’interno della cellula. Tra le altre applicazioni di questa metodica, che consente la localizzazione delle sequenze geniche, si ha quella per la diagnosi della sindrome di Down con parziale duplicazione del cromosoma 21, che non è visibile normalmente al microscopio. Il materiale che si ibrida può essere o una sezione istologica, oppure un materiale non sezionato (tecnica whole­mount). 
Western blot 
L’espressione di un determinato gene può essere analizzata anche mediante lo studio direttamente della proteina prodotto di tale gene. In primo luogo, se si vuole determinare il peso della molecola, si può compiere una corsa elettroforetica. Tuttavia, è necessario denaturare le proteine, in quanto la velocità di movimento nel gel risulta influenzata dalla forma. Nel caso delle proteine, inoltre, il rapporto carica/massa non è più costante: la carica dipende dalla loro composizione in amminoacidi. Esistono proteine come gli istoni, che sono cariche positivamente e proteine acide, cariche negativamente (a causa della notevole presenza di acido aspartico e glutammico). Le proteine sono denaturate con il calore, inoltre le cariche sono annullate mediante l’utilizzo di detergenti (in particolare il sodio-dodecil-solfato, in questo caso si parla di SDS-PAGE) che, essendo anfipatici ed avendo un gruppo solfato molto carico sulla porzione idrofilica, circondano la proteina con una nuvola di cariche negative. Per quanto riguarda i ponti disolfuro tra le catene laterali delle cisteine, si utilizzano sostanze riducenti, quali il mercaptoetanolo, che ne causano la rottura. L’elettroforesi, in questo caso, viene compiuta in verticale. Tuttavia, si presenta lo stesso problema che si presenta nella corsa elettroforetica dell’mRNA: si forma una striscia continua. In questo caso, per il riconoscimento, si utilizzano anticorpi monoclonali che si legano con elevata affinità alla proteina di interesse. Anche in questo caso la procedura non può avvenire all’interno del gel di poliacrilamide, ma le proteine devono essere trasferite su di una membrana di nylon. La procedura di trasferimento prende il nome di Western blot e prevede l’applicazione di un campo elettrico perpendicolarmente al gel elettroforetico. Il riconoscimento avviene mediante attacco primario di anticorpi (immunoglobuline) alla proteina di interesse e a successivo attacco di anticorpi contro i primi marcati 


solitamente in maniera fluorescente. 
Anche in questo caso manca la localizzazione della proteina all’interno della cellula. Esistono tecniche per ovviare a 
questo problema di immunofluorescenza e di immunoistochimica. 

Microarray e macroarray 
Studiare l’espressione di un singolo gene, tuttavia, è molto limitativo, in quanto non si può 

avere una visione complessiva delle interazioni intracellulari ed intercellulari. 
Da un singolo gene, pertanto, non si riesce a studiare il comportamento della cellula. 
La capacità di capire con un solo test di laboratorio l’espressione di tutto il genoma 

dell’individuo in una determinata cellula è reso possibile dalla metodica dell’ibridazione 
inversa. 
Le sonde, non marcate, vengono attaccate ad un supporto solido (una membrana nel caso 
dei macroarray, un vetrino nel caso dei microarray). Il campione, retrotrascritto in cDNA, 
viene marcato in maniera indiscriminata e fatto ibridare con la matrice. In questo modo, 
dopo l’opportuno lavaggio alle condizioni di stringenza desiderate, i punti marcati 


corrispondono ai geni espressi. 
Tale metodica è possibile per qualsiasi acido nucleico, è sufficiente possedere delle sonde omogenee in punti conosciuti ed essere in grado di marcare il materiale da analizzare. Le sonde devono o essere purificate da cellule realmente esistenti (library ordinate) oppure essere oligonucleotidi sintetizzati in laboratorio. L’mRNA ottenuto dalla popolazione cellulare che si vuole studiare deve essere trasformato in DNA complementare (cDNA) da una trascrittasi inversa. Il metodo più comodo per marcare tale cDNA è quello di far operare l’enzima in presenza di nucleotidi marcati. Si noti che la trascrittasi inversa (che è una DNA polimerasi RNA dipendente) necessita di un primer di poliT. L’analisi dell’intensità del segnale permette anche la quantificazione dell’espressione. I primi metodi di ibridazione inversa furono i macroarray, basati su membrane di nylon e su campioni marcati radioattivamente, che permettevano l’analisi dell’espressione di qualche centinaio di geni per volta. Attualmente si utilizzano i microarray, basati su vetrini da microscopio, in cui le sonde sono legate mediante stampa a getto (robotizzata), e che utilizzano marcatori fluorescenti. Essi permettono l’analisi dell’intero genoma. Si noti che, per evitare una mancata ibridazione dovuta alla casualità della distribuzione del campione, sui microarray sono presenti più spot per lo stesso gene, in modo tale da garantirla comunque. I vetrini sono quindi “scannerizzati” ed analizzati dal computer, sotto forma di numeri. 
Col confronto dei microarray è possibile notare migliaia di differenze nell’espressione genica tra cellule sane e cellule tumorali, anche per quanto riguarda i livelli di espressione dei singoli geni. Tuttavia, queste differenze non hanno tutte la stessa importanza. Ibridando lo stesso microarray con i trascrittomi provenienti da entrambe le cellule, marcati con colori differenti, si possono notare effettivamente quali sono le differenze più significative tra i due. Tuttavia, l’analisi non si ferma a questo punto, ma procede con il clustering dei dati, ovvero con l’incrocio delle informazioni provenienti da più ibridazioni inverse di diversi tipi di cellule tumorali. In questo modo si è scoperto che certi geni, espressi o silenziati, caratterizzano particolarmente il fenotipo tumorale (sono chiamati geni signature). Questo, attualmente, è importante per la stadiazione del tumore della mammella: si studia l’espressione di 70 geni nelle cellule neoplastiche (i geni più importanti, tutti gli altri costituiscono per ora “rumore” che non si sa come utilizzare) e si è in grado di fare previsioni sul decorso della patologia neoplastica più precise di quelle ottenute dalla tecnica “tradizionale”, attualmente ancora più utilizzata, dell’esame istologico condotto dall’anatomopatologo. Un’altra applicazione importante di queste metodiche è la farmacogenomica: essa permette ad esempio di cambiare approccio rispetto alle cosiddette “reazioni idiosincrasiche” inspiegabili alla somministrazione di un farmaco. Ne è un esempio la reazione avversa all’anestetico generale succinilcolina. Talvolta questa è prevedibile in quanto è dovuta al deficit di un enzima, la pseudocolinesterasi. Talvolta, invece, l’effetto avverso non è prevedibile. Forse un approccio di tipo genomico potrà permettere di comprendere il perché di tali eventi attualmente inspiegabili e consentirne la prevenzione. 
Il clonaggio del DNA Tutte le tecniche di cui abbiamo discusso finora necessitano di acidi nucleici purificati, ossia in grandi quantità e privi di contaminazioni da parte di altri tipi di molecole o di altri acidi nucleici differenti da quelli di interesse. Risulta quindi necessario poter produrre grandi quantità delle sequenze di interesse e procedere alla loro estrazione e purificazione. I microrganismi sono lo strumento più comodo per ottenere ciò in quanto il loro genoma può essere facilmente manipolato, permettendo l’inserzione di sequenze esogene di interesse. Esso, infatti, è piccolo e maneggevole, è facilmente duplicabile, in quanto basta far riprodurre il batterio/virus, ed è facilmente isolabile. Il clonaggio del DNA consiste sostanzialmente in questo: inserzione del frammento di interesse (inserto) all’interno di una molecola di DNA di un microrganismo (vettore), successiva trasformazione di un ceppo di tali microrganismi con questo DNA, loro riproduzione e successiva estrazione e purificazione dell’acido nucleico. 
I plasmidi 
I plasmidi sono la tipologia di vettore più semplice e più utilizzata. Essi sono molecole di DNA cellulare extracromosomico, caratterizzate dalla presenza di una sequenza di origine di replicazione (ori). Hanno un grande rilievo in medicina perché spesso portano geni che causano resistenza agli antibiotici (in particolare il gene della ß lattamasi – AmpR) e che possono essere trasmessi da un ceppo ad un altro. Essi quindi, mediante la trasformazione, hanno un elevato grado di mobilità. Il plasmide non è necessario normalmente alla vita della cellula batterica, ma talvolta le fornisce delle caratteristiche che sono positive per la selezione naturale (anche perché normalmente plasmidi che non forniscono tali caratteristiche sono un peso per la cellula e quindi vengono selezionati negativamente). I plasmidi risultano molto utili ai biologi molecolari in quanto è facile lisare le cellule batteriche e separare il DNA plasmidico dal resto, per ottenere DNA purificato. Inoltre, tali molecole possono contenere un certo tratto di DNA estraneo (eterologo) a patto che non sia troppo grande. 
La purificazione è resa facile dal fatto che il DNA plasmidico posto all’interno di una cellula batterica assume una tensione di superavvolgimento che ne modifica le proprietà elettroforetiche. 
I plasmidi utilizzati dai biologi molecolari posseggono almeno due sequenze specifiche: 
una sequenza di origine della replicazione (ORI), che permette appunto la duplicazione del 
plasmide, e un gene di selezione, solitamente per la resistenza ad un antibiotico, che 
permette di isolare i batteri contenenti il plasmide da quelli che non lo contengono (e che 
quindi non sono resistenti all’antibiotico). 
Spesso è anche presente un cosiddetto sito di clonaggio multiplo (MCS – multiple cloning 
site) che, contenendo più sequenze specifiche per diversi enzimi di restrizione (vedi dopo), 
permette l’inserzione di più frammenti di DNA esogeno. 

Endonucleasi di restrizione e DNA ligasi 
Il DNA umano è una molecola lunghissima e assai fragile, come è possibile ottenerne molte copie purificate? È più 
pratico lavorare con porzioni di genoma. 
Per ottenere frammenti del genoma e inserirli in un plasmide o in un altro vettore, è necessario tagliare le molecole di 
acido nucleico e quindi rilegarle. 
Gli enzimi di restrizione (RE) sono degli enzimi endonucleasici che riconoscono brevissime sequenze specifiche di 4/6/8 
nucleotidi e le tagliano in maniera sito-specifica. 

Essi furono scoperti agli albori della biologia molecolare e da allora hanno avuto un ampissimo uso in tutte le sue 
tecniche. Si notò che alcuni batteriofagi (in particolare il fago .) che erano in grado di infettare un ceppo di Escherichia 
coli, non erano in grado di infettare un altro ceppo. 
Questo fenomeno non era dovuto alla mancanza di recettori, o al mancato ingresso del DNA virale all’interno del 
batterio, ma dal fatto che esso era ridotto in frammenti all’interno del citoplasma. Questo è per l’appunto dovuto ad 
una serie di desossiribonucleasi, chiamate enzimi di restrizione in quanto “restringono” la capacità infettiva del fago. 
A volte alcuni dei virus risultarono in grado di infettare il secondo ceppo ma, una volta riprodotti, non furono più in 
grado di infettare il ceppo originario. Appurato che questo non era ascrivibile ad una mutazione del DNA, si scoprì che 
gli enzimi di restrizione tagliano su sequenze particolari. 
Ci si domandò come fosse possibile che il genoma del batterio rimanesse integro, ovvero perché l’endonucleasi non 
agisse su di esso. 
Si scoprì la presenza di metiltransferasi che metilano i residui di adenosina, impedendo ai RE l’attacco della sequenza. 
Questo è un esempio di modificazione epigenetica, indipendente dalla sequenza delle basi. 



Gli enzimi di restrizione utilizzati dai biologi molecolari sono di tipo II: essi tagliano sequenze palindromiche, ovvero tratti che presentano la stessa sequenza nelle due direzioni opposte sui due filamenti, ad esempio G/AATTC-CTTAA/G (vedi immagine precedente). Essi si legano a tali sequenze in quanto sono enzimi dimerici che legano e clivano il DNA in maniera speculare. Lasciano l’estremità 3’ libera e l’estremità 5’ con il fosfato attaccato. Le estremità che formano possono essere piatte (blunt) qualora il punto di taglio sia esattamente al centro della sequenza riconosciuta, oppure più frequentemente coesive (sticky o protruding). Le estremità coesive possono possedere basi spaiate sull’estremità 5’ oppure su quella 3’. Esse sono complementari, pertanto possono formare ponti idrogeno, che danno una minima stabilità alla struttura. Questa proprietà è alla base della tecnologia del DNA ricombinante. I frammenti generati dagli enzimi di restrizione dipendono dalla sequenza del DNA tipica dell’organismo e quindi sono caratteristici e possono mettere in evidenza le differenze tra individuo ed individuo (vedi dopo RFLP). 

La loro dimensione media, se si presuppone che le basi siano presenti in proporzioni uguali e siano disposte casualmente (ipotesi entrambe abbastanza lontane dalla realtà), dipende dalla lunghezza della sequenza riconosciuta. Una sequenza di 4 paia di basi sarà presente ogni 44 paia di basi, ovvero si avrà un taglio ogni 256 nucleotidi. Per un enzima che riconosce sequenze di 6bp si avranno frammenti di lunghezza media di 4096 nucleotidi. 
La DNA ligasi è un enzima che permette di ri-legare i frammenti clivati di DNA. Essa consuma ATP per collegare l’estremità 3’ e l’estremità 5’ con un legame fosfodiesterico. Un altro enzima che può essere utilizzato, in maniera leggermente differente, è la DNA topoisomerasi I. 
Il DNA ricombinante 
Nella tecnologia del DNA ricombinante, due molecole di acido nucleico sono unite, sfruttando le proprietà degli enzimi di restrizione e della ligasi. Le due molecole sono tagliate con lo stesso enzima di restrizione (uno dei più comuni è EcoRI, ricavato da E. coli), in modo tale da generare estremità coesive complementari. In questo modo, nelle opportune condizioni di reazione, la ligasi riesce a legare i due frammenti di DNA, formando una molecola di DNA ricombinante. I due frammenti, infatti, formano degli intermedi in soluzione tenuti assieme da ponti idrogeno a bassa energia dovuti alle estremità coesive (massimo 8). Mentre i due frammenti sono così precariamente stabilizzati, la ligasi può operare, creando un legame fosfodiesterico 5’-3’ e ricostituendo la normale doppia elica di DNA. Nel caso di enzimi di restrizione che creano estremità piatte, l’efficienza della ligazione si abbassa drasticamente, in quanto devono trovarsi vicine contemporaneamente, per caso, le due estremità di interesse e la ligasi. Per ligare due frammenti aventi estremità coesive non compatibili, è necessario creare dei frammenti ad estremità piatte e quindi ligarli. Per ottenere delle estremità blunt è possibile utilizzare la tecnica del filling in (per le estremità 5’), ovvero l’utilizzo di una DNA polimerasi che sintetizzi la parte mancante del filamento, oppure la tecnica del trimming (per entrambe le estremità), che richiede l’intervento di esonucleasi. Esistono anche degli adapter che presentano estremità coesive complementari rispettivamente al vettore e all’inserto e ne permettono la ligazione. 
Il clonaggio 
La tecnica del clonaggio consiste nel ricombinare l’inserto di DNA di interesse in un vettore e di introdurlo all’interno di un organismo al fine di consentirne la replicazione. In biologia molecolare per clone si intende una colonia discendente da un unico capostipite, contenente perciò lo stesso patrimonio genetico. Le colonie più semplici da utilizzare sono quelle batteriche, che crescono nelle capsule di Petri in un gel nutriente di agarosio. Tuttavia, per molti scopi è necessario utilizzare cellule eucariotiche, quali i lieviti oppure colture cellulari di animale. In questo modo è possibile generare popolazioni contenenti porzioni di DNA umano per poterlo replicare in grande quantità e quindi purificarlo. In primo luogo è necessario rendere più maneggevole il DNA umano, riducendolo in più frammenti mediante digestione con enzimi di restrizione oppure per rottura meccanica. Questi frammenti sono quindi introdotti all’interno di un vettore a formare molecole di DNA ricombinante. Come già detto, i vettori più comuni e semplici da utilizzare sono i plasmidi. Digerendo anche il plasmide con lo stesso enzima di restrizione, avendo la cura di sceglierne uno che tagli una sola volta l’anello, si ottengono estremità coesive compatibili che si possono sottoporre a ligazione. È possibile inserire inizialmente una sequenza sintetica, detta sito di clonaggio multiplo (o polylinker), contenente più siti di riconoscimento per enzimi di restrizione diversi, permettendo più inserzioni. Il plasmide deve quindi essere introdotto all’interno di cellule batteriche (trasformazione) e, dal momento che sono pochissime le specie che sono in grado di assumere spontaneamente DNA esogeno, è necessario utilizzare la tecnica della elettroporazione: questa consiste nel sottoporre le cellule batteriche a una lieve differenza di potenziale pulsata, che apre varchi temporanei nella membrana attraverso cui il DNA entra secondo gradiente di concentrazione. Sia la ricombinazione che la trasformazione sono processi a bassissima efficienza (1%), pertanto è stato necessario sviluppare delle strategie per poter riconoscere rapidamente i batteri in cui effettivamente sono entrati plasmidi e quelli contenenti un plasmide in cui il processo di ricombinazione è andato a buon fine. Per il primo problema, come già si è detto, si utilizzano plasmidi contenenti geni di selezione, che forniscono alle cellule trasformate la resistenza ad un particolare antibiotico. Per il secondo problema, invece, si utilizza una strategia differente: il sito di restrizione utilizzato per la ricombinazione è posto all’interno di un gene specifico (ß galattosidasi). Il prodotto di tale gene colora il substrato apposito di blu, altrimenti la colonia risulterebbe bianca. Quando la ricombinazione va a buon fine, il DNA esogeno si inserisce all’interno del gene, impedendone l’espressione. In questo modo le colonie trasformate e ricombinanti resisteranno all’antibiotico e saranno colorate di bianco. Se si fanno ricombinare plasmidi tutti uguali a frammenti rappresentanti l’intero genoma umano e quindi si sviluppano molte colonie, si otterrà una libreria genomica. 

I vettori virali sono un’altra tipologia di vettori, molto utilizzata per la loro elevata efficienza di trasduzione. Essi sono dei virus ricombinanti modificati in modo tale da bloccare la replicazione (ovvero la loro virulenza) ma permettendo l’inserzione del DNA esogeno, in modo tale da annullare i rischi di una possibile infezione da virus mutanti. 
I retrovirus sono composti da più strati che circondano la molecola di DNA virale e gli altri 
enzimi contenuti in esso (in particolare la trascrittasi inversa – reverse transcriptase RT): un nucleocapside formato da proteine e un doppio strato lipidico che presenta numerose proteine di membrana, in grado di legare i recettori della cellula da attaccare. Quando questo evento si verifica, la membrana virale si fonde con la membrana cellulare e il nucleocapside è iniettato all’interno del citoplasma. Il materiale genomico, che è sotto forma di RNA, viene attivato e la RT produce un cDNA a doppio filamento. Essa ha bisogno di un primer, una poli-timidina che si lega al poli-A. Inoltre, vengono allungate le sequenze terminali (Long 

Terminal Repeats LTR) che affiancano il genoma virale e servono per la sua integrazione con il genoma della cellula ospite. Il DNA virale, quindi, attraversa la membrana nucleare: in alcuni virus (tra cui gli oncoretrovirus) tale ingresso avviene solo successivamente ad una mitosi, in cui l’involucro nucleare si disgrega, in altri si ha invece un trasporto attivo attraverso il complesso del poro nucleare (nuclear pore complex NPC). Il materiale virale deve quindi essere integrato nel genoma della cellula ospite, in modo tale che quando la cellula si replica, replichi anch’esso. Come già detto le sequenze LTR sono fondamentali. Esse fungono anche da promotore per la trascrizione: parte dell’mRNA viene trascritta a formare l’RNA virale, parte invece viene espressa a formare le proteine del virus. Queste non costituiscono la struttura definitiva, ma sono necessarie delle proteasi che attivano le proteine del nucleocapside. La membrana virale viene invece prodotta a livello del reticolo endoplasmatico e dell’apparato di Golgi. Tutti i vettori retrovirali contengono, oltre alle LTR, 3 geni essenziali e un punto, il punto ., fondamentale per 
l’impacchettamento del virus. Tali geni sono gag, che codifica per 
le proteine del nucleocapside, pol, che codifica per la trascrittasi inversa, e che codifica per le proteine dell’envelope. Per poter utilizzare un virus come vettore, è necessario avere un virus difettivo, che dopo essersi integrato nel genoma di una linea cellulare, non possa produrre altri virus. È necessario eliminare psi ., in modo tale che il genoma virale non si possa impacchettare all’interno del nucleocapside. È necessario stare attenti anche agli eventi casuali di ricombinazione genica, per cui sono necessarie alcune precauzioni nella linea di packaging (vedi dopo in “Terapia genica”). 
Il sequenziamento del DNA 
Per quanto riguarda il sequenziamento del genoma, il problema principale è che i frammenti, all’interno delle libraries, 
sono posti a caso, non se ne conosce l’esatto ordine. Il metodo migliore è quindi quello di “ricostruire il puzzle”. 
All’inizio, quindi, ci si è concentrati sui singoli frammenti. 
Il primo metodo di sequenziamento del DNA, ormai superato, è stato il cosiddetto metodo Sanger. Tale metodo 
richiede la conoscenza di almeno una breve parte della sequenza, in modo tale da poter sintetizzare un primer 


oligonucleotidico. A questo scopo si utilizza la sequenza conosciuta dei polylinker. Il processo che permette il sequenziamento è sostanzialmente una replicazione in presenza di nucleotidi leggermente modificati. 

I nucleotidi utilizzati per la polimerizzazione nella tecnica di sequenziamento Sanger sono didesossinucleotidi trifosfato (ddNTP), ovvero dei desossinucleotidi in cui l’ossidrile 3’ è sostituito da un atomo di idrogeno. Essi, inoltre, sono marcati con fluorofori differenti a seconda della base azotata. Quando si attacca uno di questi ddNTP al filamento nascente, la reazione di polimerizzazione non può proseguire, in quanto l’estremità 3’ manca dell’ossidrile a cui si dovrebbe attaccare il gruppo fosfato in 5’ del nucleotide successivo. Se si mischiano desossinucleotidi e didesossinucleotidi trifosfato, la sintesi si fermerà in punti differenti casualmente e, statisticamente, ci sarà una molecola in cui la reazione si sarà fermata per ogni base. Effettuando una corsa elettroforetica in gel di poliacrilamide, che permetta la distinzione di frammenti che differiscono di una sola base, ed analizzando in contemporanea la fluorescenza emessa mentre passano da parte di un fluorimetro, si ottiene un 
elettroferogramma, che indica la sequenza del filamento dall’estremità 5’ (più corta, quindi più leggera) all’estremità 3’. 
Reazione a catena della polimerasi: polymerase chain reaction (PCR) 
Esiste un altro metodo per ottenere una grande quantità di DNA purificato, la reazione a catena della polimerasi. Questa metodica di amplificazione prevede l’utilizzo di DNA polimerasi in grado di resistere al calore (termostabili). La prima ad essere utilizzata fu ottenuta dal Thermus aquaticus, e per questo è detta Taq-polimerasi. Il T. aquaticus è un batterio che vive nelle sorgenti termali sottomarine, a temperature vicine a quelle di ebollizione dell’acqua. Per questo, l’evoluzione ha selezionato quei geni che producevano enzimi molto resistenti al calore. La PCR permette di ottenere più di un miliardo di copie di un tratto di DNA partendo anche solo da una molecola. La metodica consente di concentrarsi su uno specifico frammento, conoscendo almeno due brevi sequenze fiancheggianti il target, in modo tale da poter sintetizzare primer oligomerici (20 basi ciascuno). Si noti che, per avere una reazione efficiente ed accurata, il frammento da amplificare deve essere di poche migliaia di basi e non superare le 20kb. Si introducono nella provetta il frammento di DNA che deve fungere da stampo, i primer, la Taq-polimerasi e i dNTP. La temperatura iniziale è di 35 °C. Il primo passo comporta l’esposizione delle basi mediante denaturazione a 95°C. La polimerasi resiste a questa temperatura. In seguito la temperatura viene abbassata a 60°C in modo tale che i primer siano in grado di appaiarsi con lo stampo (la reazione è avvantaggiata rispetto al riappaiamento dei due filamenti in quanto la concentrazione molare dei primer è molto superiore). Si devono utilizzare primer con estremità 3’ che puntano verso l’interno del segmento da sintetizzare. La temperatura viene quindi portata a circa 72°C per ottimizzare la reazione delle polimerasi termostabili. Queste polimerasi sono altamente processive ma poco precise, in quanto mancano di attività di proofreading. Esse non si fermano alla lunghezza del frammento che si vuole duplicare, ma vanno avanti fino alla fine dello stampo, a meno che non si innalzi nuovamente la temperatura. 


Al secondo ciclo si avrà la produzione di 2 frammenti della lunghezza desiderata e di 2 lunghi. Man mano che si va avanti con i cicli, la proporzione di frammenti della lunghezza desiderata si fa nettamente prevalente, anche per l’andamento esponenziale della replicazione. Al trentesimo ciclo si avrà circa un miliardo di molecole target e 60 molecole lunghe. La PCR è uno strumento estremamente utile, in quanto è rapida e consente l’analisi di campioni minimi o danneggiati (importanza forense). Tuttavia, la sua elevata sensibilità può portare a problemi, in quanto una contaminazione del campione dovuta ad un maneggiamento poco accurato del DNA verrà amplificata anch’essa in maniera esponenziale. Altri svantaggi sono l’imprecisione della Taq-polimerasi e la necessità di conoscere almeno due frammenti della sequenza. Col tempo sono anche state sviluppate delle tecniche quantitative: la real time PCR. Infatti, se si analizza il campione soltanto alla fine dei cicli di PCR, si avrà sempre lo stesso risultato. Questo è dovuto al fatto che i reagenti sono limitati, si accumula pirofosfato, la polimerasi si rovina. Pertanto, ad un certo punto, la concentrazione di prodotti non varierà più. Tuttavia, se si considerano le quantità parziali dei vari prodotti si può comprendere la quantità iniziale dei campioni. Utilizzando la trascrittasi inversa sull’estratto di mRNA di una popolazione cellulare, ottenendo delle molecole di cDNA, ed applicando su di esse la tecnica della PCR (che prende il nome di RT-PCR), si può avere una analisi molto sensibile di quali geni siano effettivamente espressi in tale tipo cellulare (ma non quantitativamente). Essa, infatti, amplifica di molto anche gli mRNA di quei geni che sono espressi anche solo in un singolo messaggero. 
» Locus genico: punto 
Varianti del DNA 
del genoma umano. 
Il DNA può cambiare (mutazione). Di per sé questo evento, non è né positivo, né Nella sequenza totale 
negativo. Le mutazioni sono alla base della variabilità genetica su cui opera la selezione sono posti riferimenti 
naturale. 
assoluti. 
Alcune mutazioni, però, sono così dannose da portare direttamente a fenotipi letali. In » Allele: variante che si 
altri casi, le cose sono molto più sfumate. Si prendano ad esempio alcune trova in un certo locus. 
emoglobinopatie (anemia falciforme): esse sono malattie gravi, ma esistono zone in cui 
» Polimorfismo: 
la frequenza dell’allele è altissima, in quanto ad esempio i portatori sani (eterozigoti) presenza di più alleli per 
sono più resistenti alla malaria. 
un locus specifico 
I cambiamenti del DNA sono importanti solo se inseriti all’interno di una specifica 
situazione. 
Si possono avere differenze di tipi diversi: 

»  Differenze di un singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism SNP). Spesso sono presenti in punti non  
codificanti, tuttavia, a volte tali modificazioni possono avere un significato. Molto spesso, quello che distingue  
una mutazione (patologica) da un polimorfismo è la frequenza molto minore della prima rispetto al secondo.  
»  Satelliti:  sono  unità ripetitive, presenti  un  numero  differente di volte. Questa è  una  situazione molto  
frequente, che è alla base di un numero di alleli molto maggiore per un determinato gene contenente tale  
tipo di polimorfismo. Non sono quasi mai mutazioni che portano ad uno spostamento della cornice di lettura  


(reading frame shift). Si parla di minisatelliti quando l’unità è lunga fino a 5bp e la lunghezza del frammento raggiunge al massimo le 25bp (tipico della còrea di Huntington). Si parla di microsatelliti (o STRp short tandem repeat polymorphisms) quando l’unità è inferiore alle 4bp e il frammento può raggiungere le 150 bp. Il nome satellite deriva dal fatto che, se poste in ipercentrifugazione con metalli pesanti, tali sequenze si distanziano dallo strato principale di DNA, in quanto costituite da proporzioni differenti di basi (G-C densità molto alta A-T densità molto bassa). 

Tuttavia, come è possibile evidenziare la presenza di queste varianti? 
Il metodo più semplice intellettualmente, soprattutto per le mutazioni puntiformi (ad esempio l’a. falciforme) è 
l’utilizzo della PCR (su DNA genomico o su cDNA derivato da mRNA) per amplificare il gene di interesse (nell’esempio 
la ß globina) e quindi utilizzare il sequenziamento diretto per individuare i casi di eterozigosi (picco 50%). 

RFLP Restriction fragment length polymorphism 
Il polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione funge da “spia”, indicando la presenza di altri polimorfismi. La tecnica prevede la digestione del DNA da analizzare mediante enzimi di restrizione, una successiva elettroforesi su gel e un southern blot per poter ibridare il DNA con una sonda per il frammento di interesse. Qualora nella sequenza sia presente un polimorfismo di satellite (VNTR = variable number of tandem repeats) oppure un SNP che interessi proprio il sito di riconoscimento per l’enzima di restrizione, allora la digestione produrrà frammenti di lunghezza diversa, riscontrabili sulla membrana del southern blot. 

Questo tipo di polimorfismo, però, interessa solo un numero ristretto di alleli. Qualora si conosca invece una precisa variante allelica molto presente nella popolazione, la PCR con successivo southern blot e ibridazione con una molecola specifica per tale variante può permettere un rapido screening senza la necessità di dover sequenziare tutti i geni dei vari individui. 
Dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici 
La tecnica del dot blot (o slot blot) con ibridazione allele specifica è utilizzata particolarmente per la diagnosi prenatale ed è valida per molti tipi di mutazioni. L’idea di base è semplice. Dopo aver amplificato il campione mediante PCR, si fa un blotting “al buio” su due membrane. Esse devono essere ibridate con oligonucleotidi specifici, uno per l’allele mutato e uno per l’allele normale. Le condizioni di stringenza devono essere tali da permettere solamente la formazione di ibridi perfetti (spesso si deve 

discriminare tra sequenze differenti per un solo nucleotide). Nell’ibridazione con oligonucleotidi per l’allele normale si avranno ibridazioni nel caso di omozigote normale ed eterozigote (portatore 
sano). Nell’ibridazione con oligonucleotidi per l’allele mutato si avranno ibridazioni nel caso di omozigote mutato ed eterozigote. 
Amplificazione allele-specifica 
Un’altra tecnica per poter individuare le varianti alleliche è l’amplificazione mediante PCR, utilizzando un primer comune ed un primer allele specifico (ASP allele specific primer) in modo tale da amplificare solamente l’allele di interesse. Gli omozigoti normali amplificheranno con un ASP e non con l’altro e viceversa. Gli eterozigoti si amplificheranno con entrambi. 
Utilizzi dell’analisi dei polimorfismi 
L’utilizzo della PCR, con vari traccianti fluorescenti, consente l’analisi simultanea di moltissimi polimorfismi. Queste tecniche possono essere importanti per la diagnosi preimpianto e prenatale. Quest’ultima si effettua mediante analisi da liquido amniotico (tecnica meno affidabile) o da villi coriali. Tuttavia, bisogna prestare molta attenzione in quanto c’è la possibilità di contaminazione da parte del DNA materno. Per questo, è preferibile un’analisi di PCR quantitativa real time. La mappatura del genoma umano è stata effettuata inizialmente utilizzando i marcatori polimorfici STR: questo perché essi offrono la presenza di molti alleli, a seconda del numero di ripetizioni (ne è un esempio il gene HLA per l’istocompatibilità). I marcatori polimorfici sono molto utili anche nell’attività forense, in quanto essendo molto variabili, una loro combinazione permette di conoscere con certezza l’identità di una persona. Questo meccanismo prende in considerazione 13 loci su cromosomi differenti molto polimorfici. Un altro metodo è l’analisi dei polimorfismi del DNA mitocondriale, presente in numerose copie nelle cellule (bisogna però ricordare che tale DNA è completamente ereditato dalla madre). L’analisi dei loci polimorfici rende possibile l’attribuzione di paternità. Un tempo, invece, era possibile solamente l’esclusione di una paternità mediante i gruppi sanguigni, il fattore Rh, l’antigene di istocompatibilità. 
Isolamento dei geni umani 
Isolare i vari geni umani e determinarne quindi la sequenza può essere utile sia per la diagnosi di una qualche patologia determinata dalla mutazione di quello specifico gene, sia per approntare una qualche terapia sostitutiva. Soprattutto per quanto riguarda le tecniche di ingegneria genetica, è necessario possedere la sequenza di tale gene. Per quanto riguarda gli eucarioti, quindi anche gli uomini, si aggiunge il problema della presenza di introni. Risulta necessario, quindi, non solo avere tutta la sequenza del genoma umano, ma anche conoscere come sia fatto l’mRNA attraverso le libraries di cDNA. Il punto di partenza è la formazione di una library genomica (o genoteca). Essa è costituita da cloni trasformati, contenenti vettori con frammenti di DNA. Il problema principale è che si tratta di frammenti spezzati e mischiati senza nessun ordine. In primo luogo bisogna tener conto che una library deve essere rappresentativa, ovvero contenere un numero di cloni che sia in grado di rappresentare l’intera sequenza dell’individuo con un certo grado di precisione (non si può mai avere la certezza che sia contenuto tutto il genoma di un individuo, ma avere ottime approssimazioni). Durante la preparazione di una library bisogna cercare di evitare una digestione completa del genoma, in quanto altrimenti si formerebbero frammenti tutti esattamente con le stesse estremità, non sovrapponibili, e pertanto inservibili per un successivo lavoro di accoppiamento necessario per stabilire la sequenza completa del gene. La digestione parziale è ottenuta mediante l’utilizzo di piccole quantità di endonucleasi di restrizione, di brevi tempi di digestione o di temperature non ottimali. Così facendo, non tutti i siti di clivaggio saranno riconosciuti dall’enzima e si formeranno frammenti sovrapponibili. Questa tecnica è stata utilizzata quando non era possibile il sequenziamento di grandi quantità di DNA e ci si concentrava su singoli geni. Ora è direttamente disponibile la sequenza di tutto il genoma umano. L’analisi sulla sequenza che permette di sapere quali sono gli introni e quali gli esoni di un determinato gene è estremamente complicata. Essa si basa sull’identificazione di ORF (Open reading frame), ovvero sequenze sufficientemente lunghe in cui non si incontrino codoni di stop. Questo approccio si basa sul fatto che le cornici di lettura “alternative” a quella corretta, così come gli introni, contengono solitamente più stop codon (è un meccanismo di controllo della cellula, che si assicura così la traduzione solo della sequenza corretta). È molto più efficace sequenziare l’mRNA, attraverso lo studio delle libraries di cDNA, in cui il riconoscimento è già stato compiuto dai macchinari molecolari atti a questo, ovvero lo spliceosoma. La creazione di una library di cDNA ha come punto di partenza l’estrazione di tutto l’RNA messaggero contenuto all’interno di una determinata popolazione cellulare (rappresenta l’espressione genica caratteristica di quel tipo cellulare in una determinata situazione). Questo è possibile mediante cromatografia su colonna per affinità, utilizzando oligonucleotidi poli-T, che si legano all’estremità 3’ poliadenilata dell’RNA maturo. L’mRNA così estratto deve essere espresso come DNA complementare (cDNA). Questo è possibile grazie all’uso della trascrittasi inversa (una DNA polimerasi RNA dipendente). Dal momento che la RT richiede un primer, è possibile utilizzare generici primer poli-T, oppure primer casuali, che aumentano la probabilità che all’interno della library ogni mRNA sia espresso completamente (la trascrittasi inversa, infatti, difficilmente riesce a sintetizzare un intero mRNA da capo a capo, anche a causa della formazione di strutture secondarie nel singolo filamento che ne causano il distacco – partendo sempre dalla coda poliA si avrebbe una sovraespressione dell’estremità 3’ dell’mRNA). L’utilizzo di una RNasi H, della DNA polimerasi I e della DNA ligasi permette l’eliminazione dei primer e il collegamento dei vari frammenti. L’estremità 3’ del primo filamento di DNA forma un loop, ripiegandosi su se stessa e fornendo alla DNA polimerasi un primer di attacco per la sintesi del 

filamento complementare. Una nucleasi taglia quindi linearmente le estremità, pareggiandole. Esiste la possibilità di utilizzare una dNTP terminal-transferasi per permettere l’allungamento del primo filamento ed evitare la perdita di informazioni derivante dalla formazione e taglio del loop. Inserito il cDNA all’interno di un vettore opportuno (solitamente plasmidi o vettori lambda) e clonata la library, si può analizzare il tutto. Dalla library, possedendo solo un piccolo frammento di sequenza, si può riuscire a ricostruire l’mRNA completo. Questa procedura prende il nome di screening della library. Parte delle colonie di cDNA vengono trasferite su di un supporto solido, un filtro di nitrocellulosa che permette l’ibridazione con i DNA esposti. Sulla membrana vengono praticati dei puntini asimmetrici, riportati anche sulla piastra della library, in modo tale da poter orientare il filtro ibridato con la 

colonia corretta rimasta sulla piastra. 
»  Cromatografia per gel-filtrazione: il gel è costituito da palline contenenti buchi  
microscopici. Facendo passare il plasma attraverso questo gel, le componenti più  
piccole possono scorrere attraverso i buchi, muovendosi più velocemente di quelle  
grosse. Si ha quindi un frazionamento delle varie particelle a seconda della loro  
grandezza.  
»  Cromatografia a scambio ionico: il gel è costituito da palline cariche elettricamente.  
Esse, pertanto, permettono il passaggio soltanto delle particelle con carica netta  
opposta,  trattenendo  le  altre.  L’estrazione  di  queste  ultime  avviene  mediante  
diluizione  con  sali.  Questa  tecnica  permette  di  capire  la  composizione  
amminoacidica.  


La membrana è quindi sottoposta ad un lavaggio con detergenti per esporre gli acidi nucleici e con agenti denaturanti per distenderli. È anche necessaria una preibridazione con materiale estraneo in modo tale che le sonde non si leghino alla membrana ma ibridino soltanto col DNA. L’ibridazione con il DNA batterico presente sulla membrana è prevenuta mediante l’utilizzo di condizioni di elevata stringenza. La sonda radioattiva indica quali colonie abbiano cDNA complementare. Le colonie positive, fatte espandere, sono sequenziate e unite mediante i punti di sovrapposizione. La procedura deve essere ripetuta fintanto che non si è raggiunta la sequenza completa dell’mRNA. Questa tecnica, che può anche essere applicata su library genomiche, prende il nome di walking cromosomico. L’insieme di cloni contenenti sequenze contigue, che permettono di coprire l’intera lunghezza del gene, sono detti contig. 
Problema Identificazione del gene che codifica per il fattore di coagulazione VIII, assente nell’emofilia A 
Abbiamo un paziente a cui non coagula il sangue. Si nota che con la somministrazione di plasma si corregge il problema. Probabilmente, quindi, si tratta di una proteina. Tuttavia, qual è la proteina che manca? Nel plasma sono presenti migliaia di proteine in rapporti variabilissimi. È possibile isolare le varie proteine? Esistono tecniche di cromatografia che, sfruttando diverse proprietà delle proteine, ne permettono l’isolamento e la purificazione. 
Attraverso la cromatografia, ci si avvicina progressivamente alla proteina di interesse. Quindi, mediante una lunghissima analisi, si può ottenere la sua sequenza amminoacidica completa, o almeno di una piccola porzione. (Attualmente risulta più comodo sequenziare il cDNA e quindi da esso dedurre la sequenza amminoacidica) Tuttavia, pur conoscendo la sequenza amminoacidica, non si conosce con certezza la sequenza dell’mRNA che l’ha generata, in quanto il codice genetico è degenerato (ovvero ad uno stesso amminoacido possono corrispondere più codoni). Risulta quindi necessario individuare delle sequenze amminoacidiche della proteina che abbiano poche alternative (ovvero che contengano preferibilmente dei triptofani e delle metionine). Si creano quindi delle sonde miscelate in tutte le possibilità, le si ibridizza con la cDNA library degli organi maggiori sospettati della produzione della proteina di interesse. Se una delle sonde si ibridizza, si riesce a individuare qual è l’mRNA che codifica per la proteina giusta (mediante walking cromosomico lo si può completare). Tale ibridazione si può compiere anche basandosi sulla sequenza della proteina di un altro organismo (ad esempio il maiale) ed utilizzando condizioni di stringenza medie. 
Il clonaggio posizionale 
Anche se si conosce la proteina, è molto difficile studiare i geni: ad esempio per la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) non si può ricorrere alla strategia utilizzata per il problema precedente (prova in provetta per controllare l’avvenuta coagulazione). Il clonaggio posizionale è l’identificazione di un gene a partire dalla sua collocazione fisica su di un determinato cromosoma. Nel caso di malattie genetiche X-linked si sa qual è il cromosoma su cui è localizzata la mutazione, tuttavia esso è ancora molto grosso come punto di partenza. Nel caso di malattie che provocano aberrazioni cromosomiche, si può restringere il campo di azione. Nella DMD, ad esempio, si scoprì la presenza di una delezione sul cromosoma X. Pur essendo a conoscenza della mancanza di un frammento, non lo si poteva sequenziare, se non conoscendo gli altri geni vicini. La citogenetica dà un ottimo punto di partenza attraverso l’analisi del cariotipo. Tuttavia, affinché le mutazioni siano visibili in esso, devono coinvolgere milioni di paia di basi. 
Un ulteriore problema sta nell’eterogeneità genetica: due individui, pur presentando lo stesso fenotipo malato, non è detto che posseggano una mutazione sullo stesso gene. Questo è ben visibile nel caso in cui due individui con stesso fenotipo mutato recessivo si incrociano e hanno una progenie con individui che non presentano il fenotipo mutato. Una malattia rara, autosomica dominante, permette di escludere i geni sessuali (altrimenti tutti i maschi sarebbero malati) e permette di escludere i geni mitocondriali (altrimenti tutti i figli della stessa donna dovrebbero essere malati). Non tutti i geni segregano in modo indipendente, ma talvolta mostrano il fenomeno di linkage, ovvero di maggiore probabilità di segregare assieme. L’analisi di linkage consiste nello studio di un certo tratto mediante la sua maggiore 
o minore probabilità ad essere ereditato insieme a diversi siti polimorfici. Due geni posti su cromosomi differenti segregheranno indipendentemente. Due geni posti sullo stesso cromosoma avranno maggior probabilità di segregare assieme, maggiore è la loro vicinanza fisica sul cromosoma. Thomas Hunt Morgan fu il primo che cercò di mettere in ordine il genoma utilizzando Drosophila. Egli mappò i geni della Drosophila pur non sapendo specificamente come fossero fatti i geni, definendone la distanza a seconda della frequenza con la quale si potevano osservare dei fenomeni di ricombinazione allelica. Un centimorgan (cM) corrisponde alla probabilità dell’1% di ricombinazione tra due geni. Due geni con 50% di frequenza di ricombinazione non sono in linkage: si ha infatti una segregazione indipendente, non si può dire quanto essi siano distanti, ma se si trova invece una violazione a tale legge, allora si sa che i due geni sono linkati, sono vicini. La frequenza di ricombinazione, inoltre, non è costante lungo tutto il genoma, ci sono punti a maggiore frequenza di ricombinazione, detti hot spots. Pertanto, la distanza in centimorgan non corrisponde esattamente alla distanza fisica tra due geni. Possedendo una mappa del genoma, in cui si hanno numerosissimi geni polimorfici con distanze relative (riconosciute tramite i microsatelliti), si possono trovare i loci vicini al gene mutato quando si trova un assortimento non indipendente tra il marcatore polimorfico e il fenotipo mutato (ovvero se una certa sequenza polimorfica si presenta sempre o molto spesso quando il fenotipo è quello mutato). Il whole genome scan è l’analisi genomica di tutta una famiglia per poche regioni misurate polimorfiche. Tuttavia, per poter far sì che lo studio della ricombinazione e del linkage sia sufficientemente attendibile, è necessario prendere in considerazione famiglie molto grandi. Inoltre, come già detto più volte, è fondamentale che si prendano dei marcatori con un alto tasso di eterozigosi. Ripetendo l’analisi ci si può avvicinare sempre di più al locus del gene mutato. 
L’identificazione del gene della Fibrosi Cistica (FC) 
La fibrosi cistica è una malattia autosomica recessiva, con un’elevata frequenza dell’allele nella popolazione. Essa causa un’anomalia nella struttura di una proteina canale del cloro, che si manifesta con secrezioni molto viscose, di difficile espettorazione. Questo, a lungo termine, può portare alla chiusura del dotto pancreatico, causando una cattiva digestione, e l’ostruzione dei bronchi che porta alla morte per soffocamento. In primo luogo, ci si avvicinò al locus grazie ad un linkage con la proteina cMet e si compì un mappaggio più fine arrivando ad una regione di 500kb. Un chromosome walking utilizzando cloni che consentono l’inserzione di un grande numero di basi (YACs Yeast artificial chromosomes e BACs Bacterial artificial chromosomes) permise la clonazione dell’intera regione. Il sequenziamento permise il riconoscimento di nuovi marcatori polimorfici, squilibrati per quanto riguardava il linkage con il gene della FC (la maggior parte degli alleli mutati derivano tutti da un’unica mutazione mantenuta). Uno screening di cDNA libraries di pancreas ha quindi permesso l’identificazione dell’intero gene e l’identificazione delle mutazioni tipiche della FC (nel 70% dei casi la delezione di un codone) 
Il progetto genoma umano Nel 2000 è stato completato lo Human Genome Project. Qual è l’utilità di conoscere la sequenza del genoma umano, dal momento che la maggior parte di esso è, almeno apparentemente, non codificante e non ha nemmeno funzioni regolatorie? La disponibilità della sequenza del genoma ha reso più facile il riconoscimento dei geni coinvolti nelle malattie genetiche, ha permesso di conoscere la sequenza completa di tutti i geni, la determinazione della struttura intronica ed esonica, lo studio delle regioni di controllo non codificanti e l’identificazione delle regioni polimorfiche. Inoltre, ha permesso di scoprire ciò che non si cercava né ci si aspettava. Il progetto genoma umano, quindi, ha rappresentato un grande risparmio di risorse, nonostante l’elevato costo, in quanto tutti gli altri metodi sono dispendiosi e poco efficienti. Il progetto fu ideato nel 1984 da un gruppo di scienziati comprendente anche Renato Dulbecco e ad esso presero parte molti centri di diversi paesi. Il progetto originario prevedeva di ottenere inizialmente una mappa a bassa risoluzione mediante marcatori RFLP (1987) e quindi una mappa ad alta risoluzione (1cM), basata sullo studio dei microsatelliti (1994). Tra le ricadute immediate, oltre al riconoscimento di marcatori utili per il clonaggio posizionale, si ebbe l’utilizzo degli stessi per l’attività forense (DNA fingerprint). Non potendo lavorare con il genoma intero, l’idea era di lavorare mediante frammenti posti in vettori clonali ed assemblare quindi i contigs, fino ad ottenere una sequenza col 99,99% di accuratezza. Tuttavia, questa tecnica era costosa e difficoltosa. Il metodo migliore prevedeva di avere dei cloni che si sovrapponessero di poco (per evitare di sequenziare più volte lo stesso frammento del genoma). L’approccio che utilizzarono gli scienziati del progetto fu di clonare inizialmente pochi frammenti lunghi (BAC, YAC, PAC, P1) per ottenere un assemblaggio di contigs con il minimo di ridondanza. Tali frammenti, quindi, clonati nuovamente in vettori più piccoli, poterono essere sequenziati. Lo sviluppo dei sequenziatori automatici rappresentò un grande passo avanti (fu sviluppato dalla stessa azienda che aveva ottenuto le royalties sulla PCR). La guida del consorzio pubblico fu data a Francis Collins. Craig Venter, inizialmente, fu un accanito detrattore del progetto, in quanto sosteneva l’inutilità di conoscere una sequenza priva di utilità. Egli si concentrò quindi sul trascrittoma, ovvero su ciò che poteva essere subito di un certo interesse per la scienza, il DNA codificante. Lavorò quindi su libaries di cDNA. Invece di cercare di identificare i vari mRNA (cosa che richiede la disponibilità di una molecola da cui partire), egli si concentrò genericamente su tutta la library e, attraverso i sequenziatori automatici, ottenne grandi quantità di sequenze. Si limitò alle Expressed Sequence Tags (ESTs), di 300­700bp, ovvero a singole sequenze non eccessivamente precise di porzioni di cDNA. Egli depositò le sequenze che man mano venivano prodotte in una banca dati. Dal momento che le library di cDNA sono tessuto-specifiche e variano a seconda dei momenti di sviluppo, Venter analizzò più libraries, inoltre sviluppò delle tecniche che potessero normalizzare le libraries, diminuendo l’abbondanza dei messaggeri molto espressi e aumentando quella dei messaggeri rari. Sfruttando i tratti di sovrapposizione era possibile ricostruire la sequenza integrale dei vari mRNA. Tali basi dati, dal momento che erano state messe a punto da una società privata, furono rese disponibili a pagamento. Si cercò anche di brevettare tali sequenze, tuttavia l’ufficio brevetti degli Stati Uniti d’America rifiutò la richiesta, affermando che si potevano brevettare soltanto le invenzioni, non le scoperte di sequenze esistenti già in precedenza. Sarebbe stato possibile brevettare la sequenza solamente se se ne fosse dimostrata un’utilità pratica. A breve, anche il consorzio pubblico decise di produrre delle basi dati di EST, adottando i sequenziatori automatici. Venter utilizzò un approccio diverso per quanto riguardava il sequenziamento dell’intero genoma umano, il cosiddetto whole genome shotgun. Partì da frammenti sia lunghi che corti, derivanti dalla rottura meccanica del DNA, sovrapponibili in quanto la rottura di più molecole, casuale, genera frammenti differenti. Egli sequenziò quindi tali frammenti senza preoccuparsi del loro ordine o della loro funzione, introducendo man mano i dati all’interno di banche dati che, elaborate dai computer, individuavano i contig e li univano a formare la sequenza continua di regioni sempre più estese di genoma. Questo approccio fu reso possibile da un accordo con la ditta che possedeva il brevetto dei sequenziatori automatici, dando vita alla Celera Genomics, l’azienda che sequenziò il DNA umano parallelamente al Consorzio Pubblico. Dal momento che l’approccio shotgun è molto rudimentale, la Celera Genomics sequenziò come prova il genoma di Haemophilus influenzae (1,8 Mb). Per questo tentativo utilizzò e sequenziò circa 10 volte tanto del genoma completo del batterio. Un ulteriore problema del genoma umano era la presenza di DNA ripetuto. Nessuno credeva fosse possibile anche solo teoricamente, ma fu dimostrato in Drosophila. Tuttavia, la combinazione dell’approccio del consorzio pubblico all’approccio shotgun di Venter permise di ottenere la prima sequenza del genoma umano (draft) 5 anni prima del previsto, nel 2000. La sequenza fu ulteriormente raffinata e nel 2005 si è giunti ad una sequenza praticamente definitiva. Dal momento che il progetto utilizzò più libraries, provenienti da individui di etnie differenti, il confronto delle sequenze ha permesso l’identificazione di innumerevoli sequenze polimorfiche. In questo modo è anche stato possibile controllare più volte la correttezza della base (si tratta in fondo di una sequenza consensus). La Celera Genomics riuscì lo stesso a poter trarre profitto dal suo lavoro, fornendo la possibilità di confrontare i due database e di poter così riempire i buchi delle due sequenze. Inoltre, molti governi avevano stretto accordi e il sequenziamento del genoma di topo (Mus musculus) risultò fondamentale per gli scienziati di tutto il mondo. Ad oggi sono stati sequenziati molti altri organismi, passo fondamentale per poter confrontare le sequenze altamente conservate ed identificare quindi con alta precisione le sequenze di controllo e le sequenze codificanti. Sono stati sequenziati tra gli altri: Escherichia coli, Saccaromyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus… Negli organismi ciò che si conserva di più è la struttura terziaria delle proteine (diretta responsabile della loro funzione), seguita dalla sequenza amminoacidica e quindi dalla sequenza nucleotidica (in quanto quest’ultima può sopportare cambiamenti che non causano cambiamento nella sequenza amminoacidica, grazie alla degenerazione del codice). 

La bioinformatica 
La bioinformatica è un approccio multidisciplinare al problema dell’immagazzinamento e dell’analisi delle enormi quantità di dati derivanti dal sequenziamento di interi genomi. Il suo scopo è quello di riuscire ad estrarre dalla sequenza nucleotidica qualche informazione utile per l’avanzamento delle conoscenze biomediche (teoriche, diagnostiche, terapeutiche). In essa convergono, oltre alle conoscenze biologiche, anche le conoscenze chimiche, fisiche e matematiche, oltre all’informatica. Tre sono le basi dati più importanti al mondo, in cui sono depositate tutte le sequenze e le analisi su di esse: la GenBank statunitense, il DNA database nipponico e l’EMBL europeo. Nelle basi dati si possono trovare le sequenze complete di molte libraries di cDNA, analizzate e tradotte in sequenze amminoacidiche, le sequenze EST (parziali di mRNA, molto utili anche per la creazione di sonde), le sequenze non codificanti (rRNA, tRNA…), sequenze genomiche complete, incomplete e non ancora analizzate (comprendenti anche i genomi virali e mitocondriali), analisi dei polimorfismi e sequenze dei vettori di clonazione. Esistono delle malattie essenziali, ovvero senza cause conosciute, quali l’infarto miocardico acuto e l’ipertensione, che dipendono dal genoma dell’individuo (lo si nota dalla familiarità della patologia) ma che tuttavia non si possono diagnosticare in precedenza, partendo dal genoma, in quanto sono fortemente influenzate dai fattori ambientali. Tuttavia, essere a conoscenza ad esempio di quale rischio si abbia di contrarre una certa forma di cancro può essere utile per decidere se effettuare dei controlli periodici e con quale frequenza, in modo tale da poter diagnosticare precocemente l’insogenza del fenomeno neoplastico ed agire di conseguenza, con maggiori probabilità di guarigione. Un'altra possibilità, nonostante sia ancora nelle fasi di sviluppo più precoci, è quella di conoscere in anticipo la risposta del paziente alla somministrazione di un farmaco. Per gran parte di questi problemi risulta necessario poter disporre della struttura tridimensionale delle proteine. Ottenere la sequenza degli amminoacidi è relativamente facile partendo dalla sequenza delle basi, dai trascritti e da predizioni computazionali, tuttavia la determinazione effettiva della struttura della molecola è un problema di difficile soluzione ed avviene ancora sostanzialmente per cristallografia. Questa tecnica pone però dei limiti di risoluzione e dei limiti seri, in quanto non tutte le proteine sono facilmente purificabili e cristallizzabili (si pensi ad esempio alle proteine di membrana). Quando si conosce la struttura tridimensionale, allora si passa alla progettazione cosciente di farmaci mirati. Dal momento che la struttura non è computabile, si utilizzano tecniche euristiche, basate sui meccanismi evolutivi. Esse partono dalla considerazione che molte zone con funzioni simili di proteine differenti tendono a conservare la loro struttura più della sequenza e che le mutazioni che interessano il centro catalitico sono solitamente più gravi delle mutazioni che invece interessano regioni laterali e difficilmente saranno mantenute dalla selezione naturale. Ancora una volta è utile sottolineare che l’evoluzione non agisce sul DNA: esso è la causa dei cambiamenti ma non la causa della selezione, diversi nucleotidi non cambiano la sequenza amminoacidica (mutazione silente) così come diversi amminoacidi non cambiano la struttura della proteina e quindi la sua funzione (mutazione neutra). La comparazione tra le sequenze omologhe è fondamentale perché permette l’identificazione delle regioni più importanti sia dal punto di vista strutturale che funzionale. Nello studio non cristallografico delle sequenze è importante tenere conto che sequenze amminoacidiche simili tenderanno ad assumere conformazioni secondarie e terziarie simili, e che oltre al grado di identità, ovvero alla corrispondenza esatta della sequenza amminoacidica, si deve tener conto anche del grado di omologia, ovvero della corrispondenza di amminoacidi con proprietà simili (carica, idrofobicità…). L’allineamento delle sequenze omologhe tra specie differenti o tra proteine differenti della stessa specie risulta importante, come già detto in altri passi, per determinare quali siano le sequenze fondamentali per una determinata proprietà e quali amminoacidi siano responsabili delle somiglianze/differenze tra le varie proteine. Si dicono ortologhi quei geni appartenenti a specie diverse con struttura e funzioni simili. Essi derivano da una proteina ancestrale comune e probabilmente hanno struttura tridimensionale simile. Si dicono paraloghi quei geni derivanti da duplicazioni nella stessa specie ed andati incontro ad evoluzione differente. Essi possono essere alla base di famiglie proteiche con componenti che si differenziano anche notevolmente per la loro funzione gli uni dagli altri. 


Espressione genica 
Il controllo dell’espressione genica è il punto di volta per il collegamento tra diagnosi e terapia. La medicina spesso lavora a livello post traduzionale, tuttavia lo studio del controllo dell’espressione genica a più livelli e l’utilizzo di nuove tecniche biomolecolari possono essere alla base di una nuova visione della terapia, che affianchi la terapia così come essa viene tradizionalmente intesa. 
In primo luogo occorre analizzare le differenze nell’organizzazione del genoma tra i vari organismi e il suo funzionamento. Negli organismi unicellulari il genoma serve a contenere le informazioni necessarie alla duplicazione cellulare (ossia alla riproduzione) e alla risposta agli stimoli esterni. Negli organismi pluricellulari sono molte di più le informazioni che esso deve contenere. Oltre alle informazioni per la duplicazione cellulare e la risposta agli stimoli esterni, esso deve poter contare sul differenziamento cellulare, che è alla base dello sviluppo, e sul coordinamento delle funzioni dei diversi tipi cellulari. Nei virus, che non sono veri e propri organismi viventi, il genoma sfrutta i meccanismi molecolari delle cellule infettate per poter riprodurre il virus stesso. Per questo il virus più adatto è quello che riesce a condensare nello spazio limitato del capside il numero maggiore di informazioni. Si noti che, se si prende come unità di misura dell’evoluzione il tempo, il topolino, così come Escherichia coli sono evoluti ugualmente, in quanto derivano dallo stesso progenitore ancestrale. Se si prende come unità di misura il numero di generazioni, allora è più evoluto il batterio, mentre se si prende come unità di misura la complessità, allora è più evoluto il topo. Le cellule, solitamente, non vivono in ambienti semplici e devono essere perciò in grado di rispondere in modo complesso a stimoli complessi. Questo livello di complessità si fa notevole negli organismi pluricellulari, in cui ogni cellula si deve rapportare con le cellule vicine e con l’ambiente esterno, e in cui nessuna risposta biologica dipende da un solo gene e da una sola proteina. In ogni risposta cellulare sono coinvolti più geni, che devono essere coordinati. Il vantaggio selettivo delle risposte efficienti ha portato ad una sofisticazione dei meccanismi di controllo. Si noti che nel genoma di ogni cellula somatica sono presenti tutte le informazioni necessarie per costituire un individuo completo (si vedano a conferma i vari esperimenti di clonazione con genoma derivante da cellule completamente differenziate). Tuttavia, le cellule esprimono di volta in volta solo alcuni geni. È questo che le differenzia. Si hanno delle categorie sfumate per i vari geni: 
»  Geni ad espressione costitutiva, detti anche housekeeping: sono espressi in tutte le cellule, ma in livelli  
differenti da tipo cellulare a tipo cellulare.  
»  Geni ad espressione condizionale: sono espressi o non espressi a seconda delle condizioni dell’ambiente intra  


ed extracellulare. Essi si dividono quindi in inducibili, normalmente non espressi, e in reprimibili, normalmente espressi. 
» 	Geni specializzati: sono geni tessuto-specifici, che vengono espressi solamente in alcune cellule. A loro volta sono divisibili in costitutivi e condizionali. Non tutti i geni caratteristici di un tipo cellulare sono espressi in maniera continuativa. 
Il confine tra le varie categorie sta nel fatto che la risposta dei geni inducibili e reprimibili non può mai essere del 100% o dello 0%: la differenza tra un gene housekeeping fortemente modulato ed un gene condizionale non è poi così netta. Le cellule di un organismo pluricellulare, pertanto, sono differenti sia biochimicamente che strutturalmente. 
Il processo che determina quali geni una cellula debba esprimere e in che livello è detto differenziamento cellulare e prende le mosse dalle cellule staminali. Le cellule staminali totipotenti sono le cellule più indifferenziate che esistano: esse sono in grado di 

originare tutti i tipi cellulari che costituiscono un organismo più gli annessi embrionali necessari al suo sviluppo. In pratica, sono soltanto zigoti e embrioni prima della blastocisti. Le cellule staminali multipotenti sono cellule leggermente più differenziate, sono le cellule embrionali della inner cell mass blastocistica, che possono dare origine a qualunque cellula dell’organismo, ma non agli annessi embrionali. Le cellule staminali pluripotenti sono cellule con funzioni particolari, in grado di generare tipi cellulari con compiti simili (ad esempio le cellule ematopoietiche del midollo osseo). Tali cellule hanno la capacità di rinnovare sé stesse e quindi di produrre per ogni duplicazione cellulare una nuova cellula staminale e una cellula committed, ovvero maggiormente differenziata. Fino a poco tempo fa si credeva che il programma di differenziamento cellulare fosse a senso unico, ovvero verso un grado di differenziazione sempre maggiore. Tuttavia, si è visto che in particolari condizioni, si è in grado di tornare indietro a cellule staminali meno differenziate (vedi dopo, induzione di pluripotenza). 
Come si sa che tutte le cellule del corpo umano posseggono lo stesso DNA, ad eccezione dei linfociti che subiscono dei riarrangiamenti genici? La prova più evidente, come si è già detto, è sicuramente la clonazione. In questa procedura si è riuscito a riprodurre un individuo geneticamente identico all’individuo parente iniettando in una cellula uovo enucleata il genoma di una cellula somatica completamente differenziata di tale individuo, sottoponendola ad opportuni trattamenti. 
Se con il termine genoma si indica l’insieme delle informazioni ereditarie sotto forma di DNA che caratterizzano un individuo, il trascrittoma è l’insieme degli RNA prodotti da una determinata popolazione cellulare, di cui alcuni sono utilizzati direttamente sotto forma di RNA (ribosomali, di trasporto…). Il proteoma è l’insieme delle proteine derivanti dagli mRNA di un certo tipo cellulare. Questo passaggio marca un elevato salto di complessità, in quanto i geni sono molto flessibili, codificando per più proteine a seconda della maturazione dell’mRNA (vedi splicing alternativo). 

Il controllo dell’espressione genica si può attuare a diversi livelli nel passaggio delle informazioni DNA . trascrizione 
. pre-mRNA . maturazione . mRNA . traduzione . proteina Condizione necessaria affinché un gene sia trascritto è che la RNA polimerasi si attacchi ad esso. Come viene regolato questo passaggio, ovvero la trascrizione? 
Nei procarioti, che posseggono un cromosoma circolare con geni particolarmente compatti, esiste un’unica RNA polimerasi, che non necessita di primer né di ulteriori proteine per legarsi al DNA. La sua subunità s riconosce sequenze consensus specifiche dette promotori. Queste, essendo asimmetriche, permettono l’orientamento corretto della RNA polimerasi e quindi la corretta direzione di trascrizione. Il controllo avviene mediante diversi promotori e diverse subunità s, con affinità differenti per le differenti sequenze, fattore regolatorio importante. Le strategie di controllo dell’espressione genica nei batteri si basano in special modo sulla struttura ad operone, che permette di utilizzare un’unica sequenza di controllo (promotore e terminatore) per la trascrizione di più geni funzionalmente correlati, in modo tale da garantire anche la produzione ottimale del numero di unità e subunità proteiche necessarie. Esso è quindi costituito da più sequenze codificanti, trascritte in un unico mRNA (policistronico). Il sito di aggancio per il ribosoma è una sequenza consensus, detta di Shine-Dalgarno. Si ricordi che, dal momento che nei batteri non si ha compartimentazione nucleare e maturazione dell’RNA messaggero, la traduzione della sequenza in proteine è un evento cotrascrizionale. Un esempio molto utilizzato per descrivere il funzionamento di tale struttura di controllo trascrizionale è l’operone per la biosintesi del triptofano (Trp/W). Esso è costituito da una sequenza che codifica per cinque enzimi differenti ed è un gene condizionale, ovvero regolabile, in quanto la sintesi di Trp non è necessaria qualora sia presente naturalmente nell’ambiente. La regolazione batterica allosterica è solitamente del tipo a feedback negativo, ovvero il prodotto finale dell’operone agisce da inibitore della trascrizione. Tale prodotto agisce da ligando per una proteina, il repressore, che è in grado di legare specificamente la sequenza operatore, all’interno o nei pressi della sequenza promotore, impedendo con il proprio ingombro sterico l’attacco della RNA polimerasi e, quindi, la trascrizione della sequenza in RNA messaggero. Un esempio più complesso di regolazione è l’operone lac, che codifica per una serie di enzimi coinvolti nel catabolismo del lattosio. Esso possiede una sequenza promotore debole, per cui in condizioni normali si ha pochissimo RNA messaggero trascritto, in quanto la RNA polimerasi si legherà raramente alla sequenza promotore. In presenza di glucosio l’operone deve essere spento, in quanto il glucosio può andare direttamente alla glicolisi e non si ha la necessità di sfruttare il lattosio. In assenza di lattosio l’operone deve essere altrettanto spento, per evitare lo spreco di energia nella sintesi di proteine inutili in quanto prive di substrato. La regolazione della trascrizione dell’operone lac avviene pertanto attraverso un repressore, che si lega in assenza di lattosio, e di una proteina che, aumentando l’affinità della sequenza per la RNA polimerasi, stimola la trascrizione. Questa proteina è il CAP (Cyclic AMP responsive protein) che viene attivata in presenza di cAMP, un segnale di carenza di glucosio (e di energia in generale). 


I regolatori sono molto più complessi di un semplice controllo positivo o negativo. 
Nei virus, quale ad esempio il batteriofago ., si ha una complessa regolazione dei meccanismi che portano alla via litica, in cui la replicazione del genoma avviene separatamente da quella del genoma del batterio ed è volta alla produzione di altri virus con conseguente uccisione della cellula ospite, o alla via lisogenica, caratterizzata dall’integrazione del DNA e dalla riproduzione che va di pari passo con la riproduzione batterica. Tale decisione non è definitiva in quanto, ad esempio, i raggi ultravioletti riattivano il gene, causando il passaggio da via lisogenica a via litica. Tale regolazione è dovuta ad un interruttore genetico. Nel genoma virale sono presenti due promotori principali, destro e sinistro, essenziali per l’espressione dei geni litici. Tra questi due promotori è presente la sola regione essenziale per la crescita lisogenica, affiancata dalla sequenza di controllo dell’intero genoma. L’unica proteina prodotta durante il ciclo lisogenico è chiamata cI o repressore lambda. Essa, mediante dimerizzazione, si lega all’operatore inibendo la trascrizione dei geni virali, fungendo pertanto da repressore, ma attiva nello stesso momento la trascrizione del proprio stesso gene, mediante un circuito a feedback positivo. Quindi, a seconda del sito di legame che impegna (a seconda ad esempio dei livelli di specificità della sequenza), può fungere da attivatore o da repressore. Quando cI non è più in grado di legare tali sequenze perché, ad esempio, i raggi UV hanno attivato una proteasi cellulare che taglia il polipeptide nel sito di dimerizzazione, i geni litici possono essere trascritti e la cellula entra nel ciclo litico. 
Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è infinitamente più complesso di quanto non sia nei procarioti e nei virus: in primo luogo la trascrizione e la traduzione non avvengono in contemporanea, ma avvengono in compartimenti separati (rispettivamente, il nucleo e il citosol). L’RNA messaggero, prima di poter essere tradotto dai ribosomi, necessita di un processo di maturazione. Inoltre, il DNA eucariote è molto dispersivo, i geni sono molto grandi e distanti tra loro. La RNA polimerasi, pertanto, non è in grado di iniziare la sintesi senza la presenza di ulteriori fattori di trascrizione. Inoltre, i geni eucariotici non sono quasi mai organizzati in operoni, ma sono trascritti separatamente l’uno dall’altro. Ovvero, sono monocistronici. Un primo fattore fondamentale per la regolazione dell’espressione genica è il grado di condensazione del DNA nella cromatina, attorno a dei nuclei proteici detti nucleosomi, costituiti dagli istoni. La regolazione a distanza avviene su sequenze, riconosciute da apposite proteine dette fattori di trascrizione specifici, dette enhancer. Queste sequenze, quando sono legate a tali TF, aumentano i livelli di trascrizione e sono più o meno indipendenti dalla distanza dal promotore, in quanto il DNA forma delle ampie anse che portano vicine regioni anche molto distanti della doppia elica (sono stati anche svolti degli esperimenti di bioingegneria, avvicinando o allontanando gli enhancer, in cui si è osservato che, entro limiti ragionevoli, il risultato è sostanzialmente lo stesso). Sulla regione del promotore, invece, affinché la RNA polimerasi si possa attaccare al filamento nella posizione corretta, sono necessari tutta una serie di fattori generali di trascrizione, comuni per tutti i geni, che riconoscono la sequenza promotore (in particolare la TATA box). Tutti i geni codificanti per proteine sono trascritti dalla RNA polimerasi di tipo II (le RNA pol I e III trascrivono altri particolari geni) e i fattori generali di trascrizione che utilizza sono perciò chiamati gTFII. La trascrizione negli eucarioti procede quindi in varie fasi: Il promotore essenziale (core promoter) è la regione di controllo del gene in cui si legano i fattori generali di trascrizione e la RNA polimerasi. Funzione dei gTFII è proprio quella di facilitare l’assemblaggio del complesso basale di trascrizione sul promotore. Tra i promotori essenziali più comuni si ricorda la TATA box (TATAAA), con sequenza altamente conservata, utilizzata in particolar modo nel caso di geni che richiedono una rapida espressione, posta a -25/30 basi. Essa indirizza la trascrizione a siti ben definiti. Le isole CpG, invece, sono sequenze importanti per l’espressione dei geni housekeeping, fanno iniziare la trascrizione in siti multipli su un’area di 200bp. I fattori di trascrizione generali, insieme alla RNA polimerasi formano l’apparato trascrizionale di base. TFIID è il primo fattore che si lega. Esso è costituito da una porzione, detta TBP (TATA binding protein), che lega il DNA nella sequenza TATA e, piegando la doppia elica, espone maggiormente le basi. I TAF sono i fattori associati a TBP. Altri fattori sono TFIIB, TFIIF, TFIIE e TFIIH. Quest’ultimo è importante perché, fosforilando la coda C terminale della RNA polimerasi (CTD – C terminal domain) provoca il rilascio dei GTFs e l’inizio della trascrizione. I fattori di trascrizione specifici sono delle proteine formate essenzialmente da due domini, uno in grado di legare il DNA e uno di riconoscimento. Essi possono essere posti prima o dopo il gene specifico e, mediante la formazione di anse di DNA e l’attacco alla proteina Mediatore, facilitano la formazione dell’apparato trascrizionale di base. Altri TF reclutano invece proteine coattivatore/corepressore che contengono complessi di rimodellamento della cromatina (HAT istone acetilasi). L’insieme di tutte queste molecole forma l’enhanceosoma, in cui proteine differenti operano sia in sinergia che in cooperazione. La sinergia è quella proprietà per cui l’effetto di più proteine combinate è maggiore della somma dei singoli effetti, mentre la cooperazione è l’intervento di più proteine differenti per ottenere un effetto. 
»  Preattivazione: si genera sul promotore una situazione favorevole all’inizio  
della trascrizione mediante attacco di fattori di trascrizione specifici a varie  
regioni  enhancer,  il  reclutamento  di  opportuni  enzimi  per  il  
rimodellamento della cromatina (istone acetilasi..), legame dei GTFs e della  
RNA polimerasi.  
»  Inizio  
»  Elongazione  
»  Terminazione  




Come abbiamo visto, la regolazione è infinitamente complessa, coinvolge molte 


proteine che a seconda delle interazioni possono fungere da attivatori o da inibitori, che si assemblano in molti modi differenti a seconda della situazione intracellulare ed extracellulare (rispondendo ad esempio alla presenza di ormoni). La necessità di una regolazione così fine è dovuta al fatto che, a fronte di una complessità enormemente maggiore rispetto a quella di un batterio, il numero di geni è pressoché lo stesso. La complessità non è quindi dovuta a molta più informazione, ma all’utilizzo di poca informazione in un modo molto flessibile. Per questo i geni eucariotici non sono organizzati in operoni per cui alcune proteine o sono prodotte tutte insieme oppure non sono prodotte. Gli operoni, infatti sono efficienti ma non sono flessibili, il metodo di controllo eucariotico è flessibile e può anche essere efficiente. Tuttavia, per una questione di opportunità, geni funzionalmente correlati, sono comunque regolati in maniera simile. Sembrerebbe tuttavia che negli eucarioti siano presenti troppi pochi fattori trascrizionali specifici, che legano sempre più o meno le stesse sequenze di DNA. La complessità dell’espressione genica è conseguenza della combinazione di tali fattori. Ne è un esempio la differente risposta di espressione genica in differenti tipi tissutali da parte dello stesso ormone (ad esempio un glucocorticoide). Esso lega i propri recettori che, nel caso del cortisolo, sono fattori di trascrizione. Il legame della proteina con l’ormone determina una transizione conformazionale che permette il legame con il DNA. Nei vari tessuti non sono presenti differenti fattori di trascrizione che legano il cortisolo, ma sono presenti combinazioni di fattori di trascrizione differenti, tessuto-specifiche. 
Si è anche notato che alcuni fattori di trascrizione fungono da master regulator, controllando interi programmi genetici di differenziamento: la loro presenza completa un quadro di fattori trascrizionali potendo indurre tutto un programma genetico ma, necessitando degli altri TFs, non sono sufficienti da soli. Un esempio notevole di tale complessità di differenziamento è possibile osservarla nella segmentazione della Drosophila e nella presenza di differenti fattori trascrizionali nelle varie aree. I mutanti omeotici sono degli esempi di come l’espressione di particolari fattori trascrizionali in posizioni anomale possa indurre allo sviluppo di strutture normali in posizioni inappropriate. La complessità della interazione fra fattori trascrizionali differenti è di fondamentale importanza per lo sviluppo embrionale, in cui le varie cellule, esprimendo differenti combinazioni, intraprendono vie differenziative differenti che porteranno infine all’individuo completo. 

All’interno dello stesso cromosoma sono presenti delle strutture cromatiniche che impediscono agli enhancer specifici di un gene di andare ad interferire con l’espressione di un altro gene (ricordiamo che essi facilitano l’attacco del complesso generale). Essi sono detti isolatori cromatinici e fungono proprio da “limite” tra le regioni di competenza dei vari enhanceosomi. 
Nelle cellule eucariote esiste anche una eredità epigenetica, ovvero ad un livello differente dalla sequenza nucleotidica, che è alla base della memoria cellulare. Questo fenomeno è visibile nel fatto che, anche dopo la replicazione del DNA, che fa perdere molte delle sue interazioni con le proteine, le cellule figlie che nascono dopo la mitosi mantengono memoria del programma di differenziamento cellulare. Questo è dovuto al fatto che le proteine iniziali, indicanti ad esempio l’inattivazione di un gene, sono distribuite in maniera casuale ed uguale tra le due doppie eliche, in modo tale che le proteine neosintetizzate possano utilizzare quelle già presenti sul filamento come stampo per poter ripristinare la situazione iniziale in entrambi. La metilazione delle basi azotate è un meccanismo epigenetico utile al mantenimento dell’eredità genetica. Essa comporta uno spegnimento dei geni. Nei batteri la base che viene metilata è l’adenina, negli eucarioti è la citosina, ma solo quando è presente nelle cosiddette sequenze CG: tali sequenze, infatti, sono palindromiche e in questo modo saranno presenti basi metilabili su entrambi i filamenti, cosa fondamentale per la trasmissione dell’eredità epigenetica durante la replicazione del DNA. Esistono due famiglie di enzimi deputate alla metilazione delle basi: le metilasi de novo, responsabili dell’aggiunta di CH3 su sequenze non metilate in precedenza, su entrambi i filamenti, e le metilasi di mantenimento, in grado di riconoscere la metilazione di un filamento e riprodurla anche nel filamento fratello. Tuttavia negli eucarioti opera una forte pressione selettiva negativa sulla metilazione delle citosine, in quanto una citosina metilata che vada incontro a metilazione, viene mutata in timina. Questo è un problema perché, mentre la 

citosina non metilata può mutare in uracile, facilmente riconoscibile dai meccanismi di riparazione del DNA, la timina derivante da mutazione della citosina metilata non è riconoscibile da una normale timina e pertanto difficilmente riparabile dai meccanismi molecolari del nucleo. La metilazione è fondamentale per il differenziamento cellulare e deve pertanto essere cambiata drasticamente durante tutta la fase dello sviluppo embrionale. Lo sviluppo dei gameti (spermatozoo e ovocita) prevede una metilazione de novo che ne determini le caratteristiche. Tuttavia, dopo la fecondazione dell’ovulo con la formazione dello zigote, si ha un’ondata demetilante, fondamentale perché da quella cellula dovranno originare tutte le cellule del corpo dell’individuo che, nel complesso, richiederanno l’espressione di tutti i geni del DNA. Man mano che si procede nel differenziamento 

cellulare si hanno metilazioni de novo, differenti a seconda del tipo cellulare, minori per quanto riguarda le cellule staminali, maggiori per quanto riguarda le cellule fortemente specializzate. Ogni tipo cellulare presenta pertanto un suo schema di metilazione caratteristico. Tuttavia, come mai i geni metilati non vengono trascritti? Il DNA metilato recluta degli enzimi che deacetilano gli istoni (deacetilasi istoniche). Questo provoca un ricompattamento della cromatina, rendendo difficilmente accessibile la sequenza al grosso complesso proteico di trascrizione. Le metilazioni e demetilazioni sono pertanto bersagli farmacologici molto importanti: nelle neoplasie, ad esempio, molto spesso i geni oncosoppressori non sono espressi perché i loro promotori sono metilati. 
Un aspetto importante che contempla la modificazione epigenetica del genoma è la cosiddetta inattivazione dell’X nella donna. Dal momento che il gene X è uno dei geni umani più grossi mentre il gene Y è responsabile di pochi geni, se nella donna tutti e due i cromosomi X fossero espressi, si avrebbe uno squilibrio nell’informazione genomica femminile rispetto a quella maschile. Risulta necessaria pertanto una dosage compensation, per poter riequilibrare il livello di espressione dei geni. Quando l’embrione è formato a livello della inner cell mass da 100 cellule, negli individui di sesso femminile o in quelli affetti da Sindrome di Klinefelter (XXY) uno dei due cromosomi X viene disattivato casualmente. Per questo, 
l’individuo adulto risulterà un mosaico in cui alcune regioni avranno un cromosoma X espresso e altre lo avranno 
represso. 
L’imprinting genomico è un fenomeno simile di disattivazione di uno dei due alleli di un gene correlato alla 
provenienza parentale di tale allele. 

L’espressione genica negli eucarioti può essere regolata finemente in maniera cotrascrizionale 
e posttrascrizionale, a partire dalla sequenza di eventi che dal pre-mRNA porta all’RNA 
messaggero maturo (maturazione dell’mRNA). Tre sono gli eventi principali della maturazione: 
l’aggiunta di un cappuccio di 7-metilguanosina con legame 5’-5’ (capping), il taglio delle sezioni 
introniche e la ricongiunzione degli esoni (splicing) e la poliadenilazione all’estremità 3’. 
Il capping prevede l’azione consecutiva di tre enzimi e viene completato non appena 
l’estremità 5’ del pre-mRNA esce dalla RNA polimerasi II. Gli enzimi sono una fosfatasi che 
toglie uno ione fosfato al 5’ del pre-mRNA, una guanidiltransferasi che aggiunge un GMP con 
legame 5’-5’ (rilascio di ione pirofosfato) e una metilasi che metila la guanosina in posizione 7. 

Lo splicing è un evento che avviene in maniera cotrascrizionale (almeno in parte) ed è 
fondamentale, soprattutto per gli eucarioti superiori. Questo evento può essere regolato in 
maniera molto differente a seconda del tipo cellulare preso in considerazione, per cui, con 
quello che si chiama comunemente splicing alternativo, alcune sequenze possono essere 
considerate a volte esoni a volte introni, formando mRNA differenti. Nell’uomo, tuttavia, viene solitamente rispettata 
la sequenzialità degli esoni. I meccanismi molecolari della cellula riconoscono le giunzioni tra esone e introne, le 
tagliano e le ricuciono in sequenza corretta. 

Talvolta per un gene è molto facile codificare per una funzione e per la sua funzione opposta grazie allo splicing alternativo: l’uso alternativo dell’informazione contenuta nei geni permette l’utilizzo di domini che già sono funzionanti per ottenere risultati differenti. Il gene DSCAM di Drosophila è un tipo estremo di splicing alternativo, per cui una sola sequenza di DNA può produrre 38000 trascritti 


differenti. Anche noi umani possediamo un gene simile, con una possibilità di splicing alternativo notevole. Lo splicing deve necessariamente essere preciso, in quanto un minimo sbaglio nel sito di taglio potrebbe risultare in un cambiamento della cornice di lettura, con conseguente sintesi di una sequenza amminoacidica differente da quel punto in avanti. Le sequenze di riconoscimento sono abbastanza semplici, raramente presenti negli esoni. All’interno degli introni vi è anche il cosiddetto punto di ramificazione (branch point), fondamentale per la creazione del laccio intronico. La base che fa da punto di giunzione è un’adenina. A volte nell’introne eliminato come lariato sono presenti porzioni di sequenza che servono da controllo. Le sequenze di riconoscimento sono tuttavia abbastanza flessibili: il consensus si trova raramente nella sua interezza, si trovano molto spesso delle sue varianti. Inoltre, molto spesso, sono presenti delle sequenze consensus che invece non sono riconosciute come sequenze di splicing. Lo spliceosoma è il macchinario ribonucleoproteico deputato allo splicing. Esso è composto da snRNP (small nuclear ribonuclear proteins). Tuttavia, come fanno tali ribonucleoproteine a riconoscere i punti corretti in cui agire? Gli hnRNP riconoscono le sequenze introniche ed esoniche. Esse variano in maniera particolare: esistono zone ricche di AT e altre di GC. La semplice frequenza delle basi non discrimina gli introni dagli esoni, e nemmeno guardando le coppie di basi o le triplette si riesce a trovare un qualche schema ripetuto. Se si prendono in considerazione gruppi di 5 nucleotidi si riesce a discriminare abbastanza bene, in quanto le frequenze sono differenti tra introni ed esoni. Probabilmente questa stessa proprietà può essere riconosciuta dalle hnRNP. Altre proteine molto importanti per il riconoscimento delle sequenze esoniche sono le cosiddette SR (serine rich). I meccanismi che controllano lo splicing alternativo si basano su proteine che legano l’RNA (RNA binding proteins). Alcune sequenze possono facilitare lo splicing (enhancers) altre lo possono impedire (suppressors). Esse possono essere all’interno dell’esone o dell’introne. Le proteine che riconoscono tali sequenze possono fungere da attivatori o inibitori dello splicing. Delle mutazioni in queste sequenze possono causare problemi allo splicing, con possibile slittamento della cornice di lettura e produzione di una proteina inattiva o dannosa. Una volta completato il processo di splicing, i siti di giunzione vengono legati da una serie di proteine che prendono il nome di complesso di giunzione esonica (exon junction complex EJC). Queste servono a marcare l’avvenuta maturazione dell’RNA messaggero e il conseguente trasporto attraverso il complesso del poro nucleare al citosol. Gli EJC hanno un ruolo molto importante anche nella degradazione mediata da nonsenso (vedi dopo). 

La poliadenilazione è un processo mediato da due proteine, CPF e CstF, che sono responsabili del clivaggio e della poliadenilazione dell’RNA uscente dalla polimerasi, in seguito ad un segnale preciso. L’aggiunta delle adenosine al 3’ a partire da ATP è compiuta da una poliA polimerasi, che non necessita di alcuno stampo. La sequenza poliadenilata è una delle responsabili della regolazione dell’inizio della traduzione. 
Per lo stesso gene sono possibili poliadenilazioni alternative. Un esempio di tale meccanismo è quello degli anticorpi: i linfociti fanno tanti tentativi per produrre degli anticorpi efficaci contro un determinato antigene. Queste proteine sono delle molecole che posseggono al C terminale delle a eliche idrofobiche che le legano alla membrana. Quando viene prodotto un anticorpo efficace, il linfocita diventa una plasmacellula e produce molte immunoglobuline, non più integrali di membrana perché prive della sezione ad a elica. Questo è possibile in quanto sono presenti due sequenze di poliadenilazione/stop sul gene: una posta in un introne e una in un esone. 
L’RNA messaggero può anche andare incontro ad un processo molto più fine, detto di editing, per cui alcune adenine molto specifiche, sono riconosciute e deaminate da enzimi appositi (ADAR Adenosina deaminasi agenti su RNA) in inosine. Questo è molto importante in quanto se le adenine si appaiano all’uracile (timina nel DNA), l’inosina si appaia alla guanosina, pertanto il codone si comporta come se al posto dell’inosina ci fosse una citosina. Questo è importante per alcuni canali del calcio che, invece di esprimere una specifica glutammina, esprimono un’arginina. Mutazioni nella deaminasi possono causare epilessia. 
Una volta maturato, l’RNA messaggero non può passare per il complesso del foro nucleare (NPC) senza che ad esso siano legati degli specifici segnali di export. Tali segnali si legano solamente se esso è stato editato correttamente (ovvero presenta cap binding complex CBC, EJC e proteine che legano poli-A). Solo il 2% dell’RNA prodotto nel nucleo viene esportato. Solitamente appena uscito dal poro nucleare, l’RNA viene tradotto una volta, come meccanismo di controllo dell’assenza di mutazioni. Molte mutazioni puntiformi sono nonsense, ovvero provocano lo spostamento della cornice di lettura e la formazione di codoni di stop precoci. Normalmente ci si aspetta un codone di stop nell’ultimo esone dell’mRNA, quindi dopo l’ultimo EJC presente su di esso (anche se non è sempre così e non si è ancora compreso a fondo come la cellula riesca in questi casi). Nel caso di mutazione nonsense si avrà un codone di stop seguito da uno o più EJC: quando un ribosoma incontra tale situazione si ha uno stallo per cui le due subunità non si rilasciano e l’RNA messaggero viene distrutto (insieme alla proteina parziale) per evitare che esso venga tradotto potendo recar danno alla cellula. Tale meccanismo si chiama nonsense mediated decay. 
Dal momento che alcune proteine si localizzano asimmetricamente all’interno della cellula (e soprattutto sulla sua superficie), gli mRNA sono spesso localizzati e tradotti nelle varie regioni. Questo è reso possibile dalle sequenze non tradotte poste al 3’ e al 5’ dell’RNA messaggero, dette sequenze UTR (Untranslated regions) che fungono da codice di avviamento postale (zip code). 
Nel citosol inizia la traduzione dell’RNA messaggero in una sequenza di amminoacidi da parte dei ribosomi. Il suo inizio è regolato da proteine dette fattori eucariotici di inizio (eIF eukaryotic initiation factors). La subunità ribosomale minore, che si è legata al tRNA iniziatore recante metionina e all’eIF2 viene reclutata da un complesso proteico molto grande, comprendente le proteine che legano poliA, il CBC (eIF4E) ed eIF4G. In questo modo ci si accerta nuovamente che l’mRNA sia completo. Tali proteine sono regolate genericamente mediante fosforilazione Inizia pertanto la procedura di codon scanning, alla ricerca del codone AUG di inizio. 


Le UTR sono sequenze non codificanti molto importanti per l’espressione genica oltre che per la localizzazione della traduzione. I ribosomi nella loro scansione devono ignorare i codoni AUG presenti nell’UTR 5’. Il fatto che possano venire conosciuti codoni di inizio differenti può portare alla sintesi di proteine con un N terminale differente e, nel caso i due codoni fossero posti in quadri di lettura differenti, l’intera struttura del polipeptide. Questo ultima modificazione, in particolare nell’uomo, non avviene quasi mai, mentre è utilizzata dai batteri per poter produrre proteine differenti con il minimo di informazione ereditaria possibile. Molto spesso questi segnali di inizio AUG sono deboli e può succedere che il ribosoma talvolta legga un AUG, talvolta lo salti. Questa lettura è detta leaky scanning ed è utilizzata molto spesso dai virus. Qualche volta la traduzione può iniziare a metà dell’mRNA che, nel caso dei virus, assumono la forma di vere e proprie strutture simili ad operoni, che possono permettere la sintesi di più proteine differenti. Questo è reso possibile dalle cosiddette sequenze IRES (internal ribosome entry site): esse mimano la configurazione di eIF4E (che si lega al cap) e, stabilizzando l’eIF4G reclutano il complesso di inizio. Un altro meccanismo di controllo dell’espressione genica (in particolare per quanto riguarda la quantità di prodotto) è la poliadenilazione citoplasmatica: essa può aumentare l’emivita di un mRNA. Tale meccanismo è importante negli ovociti: in essi gli RNA messaggeri, devono essere già pronti ma inattivi. Per questo essi presentano code poliadenilate brevissime. Subito dopo la fecondazione, quando deve iniziare rapidamente la sintesi di nuovo materiale, viene attivata una poli A polimerasi citoplasmatica che, allungando le code 3’, attiva la traduzione dei messaggeri accumulati. 
Un altro meccanismo di controllo della traduzione di particolari mRNA è la loro capacità di formare strutture secondarie nelle sequenze UTR che, venendo riconosciute da una proteina particolare, possono attivare o reprimere la traduzione. Un esempio molto importante di questo meccanismo è il controllo della concentrazione di ferro nel sangue. Quando si ha troppo ferro (caso patologico: emocromatosi) la ferritina lo segrega, mentre quando si ha poco ferro (caso patologico: anemia sideropenica) la transferrina trasporta il ferro all’interno del torrente circolatorio e nelle cellule che ne necessitano. Entrambe queste proteine sono molto espresse a livello del fegato, a 

seconda della necessità del momento. Come viene regolata questa bilancia del ferro? In parte è regolata a livello trascrizionale, ma ciò che ha un ruolo fondamentale è il controllo post trascrizionale. Sia l’RNA messaggero della ferritina che quello della transferrina hanno una sequenza che assume una struttura secondaria a forcina, detta Iron Response Element (IRE). Nel caso del recettore della transferrina l’IRE è posto al 3’UTR, nel caso della ferritina al 5’UTR. La proteina Aconitasi citosolica può legare queste sequenze. Inoltre, essa può legare 3 o 4 atomi di ferro, cambiando di struttura. Quando si ha poco ferro, e l’aconitasi è legata fino a 3 atomi di ferro, essa assume una conformazione che la fa rimanere legata agli IRE. Questo blocca la ferritina e attiva la transferrina. Quando si ha molto ferro e l’aconitasi è legata a 4 atomi, allora essa subisce un cambiamento conformazionale che ne causa il distacco dall’RNA messaggero, attivando la traduzione della ferritina e inibendo la transferrina. Questa differente risposta all’attacco/stacco dell’aconitasi da parte dei due mRNA dipende dalla posizione della sequenza IRE. Quando l’aconitasi è legata all’mRNA della transferrina (in 3’) essa lo stabilizza, inibendone l’attacco da parte di ribonucleasi. Quando invece l’aconitasi è legata all’RNA messaggero della ferritina (in 5’) essa rende difficile la traduzione, impedendo le giuste interazioni tra i vari complessi del macchinario traduzionale. 
Un altro potente meccanismo di controllo della traduzione di mRNA specifici coinvolge delle piccole molecole di RNA, lunghe 25 paia di basi, dette micro RNA (miRNA). Tale meccanismo ha inoltre suscitato molto entusiasmo nel mondo della ricerca per quanto riguarda la possibilità di progettare miRNA appositi per interferire con la traduzione di determinati geni (in particolare gli oncogeni nelle neoplasie). I precursori dei miRNA vengono sintetizzati nel nucleo. Essi formano una struttura secondaria a stelo-ansa. Una endoribonucleasi presente nel compartimento nucleare, Drosha, cliva l’RNA in una posizione specifica, mantenendo la struttura a stelo ansa, che viene trasportata nel citosol attraverso il complesso del poro nucleare. Qui va incontro ad un altro clivaggio da parte della endoribonucleasi Dicer, che taglia l’ansa, lasciando un tratto di RNA a doppio filamento. Questo viene riconosciuto da un complesso ribonucleoproteico, RISC che, riconoscendo sequenze specifiche di mRNA (attraverso lo stampo di miRNA), può indurne la degradazione o bloccarne la traduzione. Tali sequenze riconosciute sono solitamente poste nell’UTR 3’. Questo impedisce l’interazione tra 3’ e 5’, fondamentale per l’inizio della traduzione. I miRNA, pertanto, operando su una regione non tradotta, possono regolare tantissimi geni. Come già detto, questa scoperta ha un risvolto clinico, in quanto esistono dei tumori metastatizzati di cui non si conosce il tumore principale. Questo dato è importante per la scelta di terapie differenti e mirate a seconda del tessuto di origine. Si è notato che, effettuando un’ibridazione con microarray e concentrandosi solamente sull’espressione dei geni per i miRNA la precisione aumenta enormemente, permettendo l’utilizzo di una terapia appropriata. Per quanto riguarda le possibilità terapeutiche dei miRNA, gli studi sono ancora in fase iniziale, in quanto il problema principale è quali mRNA siano influenzati dalla presenza di un determinato miRNA: brevi sequenze di 8 basi come quelle di RISC si trovano in molti RNA messaggeri differenti, tuttavia non tutti sono influenzati dallo stesso miRNA. 

L’ultimo possibile controllo post-trascrizionale sugli RNA messaggeri è la regolazione della loro stabilità: la degradazione dell’mRNA può procedere lentamente mediante una esonucleasi 3’-5’ che, accorciando la coda di poliA residuo per residuo, impiega del tempo per distruggere il messaggero, oppure mediante una endonucleasi che, tagliando il messaggero in mezzo alla sequenza 3’UTR espone il messaggero a degradazione esonucleasica sia in direzione 3’5’ che 5’3’. Dopo la traduzione le proteine eucariote possono andare incontro a tutta una serie di modificazioni post-traduzionali che coinvolgono l’aggiunta di sostituenti sulle catene laterali di specifici amminoacidi. Tali modificazioni comprendono: fosforilazione (aggiunta di gruppi fosfato PO43-), glicosilazione (aggiunta di zuccheri), aggiunta di lipidi, acetilazione 
(aggiunta di residui acetile CH3COO -), monoubiquitinazione e sumoilazione (aggiunta di proteine specifiche). 
La stabilità delle proteine è regolata da una poliubiquitinazione, che costituisce il segnale di degradazione verso il proteasoma (un complesso proteico). Un esempio importante di degradazione mediata da poliubiquitinazione è coinvolto nell’inizio della segregazione dei cromosomi omologhi durante l’anafase: l’APC poliubiquitina la securina che, venendo degradata libera la separasi che, poliubiquitinando le coesine, permette la separazione dei cromosomi omologhi. 
Definizione di gene 
Ma che cos’è un gene? Un tempo si era assunto il dogma che un gene fosse un segmento di DNA codificante per una proteina (un gene = una proteina). Tuttavia, soprattutto negli eucarioti, non è così: esistono geni che codificano per RNA che rimangono tali (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, miRNA, scaRNA…). La definizione è quindi stata modificata: un gene sarebbe un segmento di DNA codificante per una molecola di RNA o di proteina. Tuttavia, con lo splicing alternativo, lo stesso gene può portare a prodotti differenti: esso codifica una o più molecole, aventi almeno un tratto in comune a livello del messaggero. Però ci possono essere delle eccezioni. Sostanzialmente, non si è d’accordo sulla definizione precisa di gene, si parla più comunemente di unità trascrizionali. L’unica definizione perfettamente valida è quella di Mendel, estremamente generica e pertanto omnicomprensiva di tutte le eccezioni, in quanto include ad esempio tutte le sequenze di controllo. 
Ingegneria genetica e produzione di proteine 
Per molto tempo gli organismi geneticamente modificati sono stati selezionati basandosi sulle loro mutazioni casuali. 
Tuttavia, con l’avvento dell’ingegneria genetica, non è più necessario basarsi sulle mutazioni naturali. 
Mediante queste nuove tecnologie è possibile la produzione di proteine per interesse terapeutico, commerciale 
(enzimi) e per la produzione di anticorpi monoclonali. 
Le proteine di interesse possono essere prodotte in batteri, quali E. coli, in lieviti, come S. cerevisiae e Pichia pastoris, 
e in cellule di insetto e mammifero in coltura. Possono anche essere utilizzati animali e piante transgenici a questo 
scopo. 
In primo luogo è necessario un vettore in cui inserire il gene di interesse. Il gene non può essere introdotto così com’è 
al suo interno: le cellule ospiti spesso hanno meccanismi di regolazione differente o non possono effettuare lo splicing. 
Inoltre, spesso non sono in grado di ottenere un ripiegamento corretto della proteina e non sono in grado di 
modificarla post-traduzionalmente. 


I geni introdotti devono possedere dei promotori forti e regolabili, in modo da poter ottenere un’espressione modulabile della proteina transgenica. La produzione continua potrebbe infatti essere tossica per la cellula ospite, causare la perdita del plasmide e del gene inserito. 
Prendiamo ad esempio la sintesi dell’insulina nel pancreas e i problemi che incontra la sua espressione in un batterio come Escherichia coli. Un tempo si utilizzava l’insulina purificata da pancreas di maiale. Oltre al fatto che servivano 70 pancreas all’anno per un solo paziente, dopo un po’ di tempo si scatenava la risposta immune e pertanto l’insulina eterologa non faceva più effetto. L’insulina è una proteina costituita da due catene (A 30aa B 21aa) unite da ponti disolfuro tra le catene laterali di alcune cisteine specifiche. Essa, tuttavia, deriva da un singolo gene. Questo gene consiste di esoni ed introni che, in seguito a splicing e traduzione, producono un’unica catena polipeptidica, la preproinsulina. Questa proteina va incontro ad un primo taglio proteasico all’N terminale che, rimuovendo un frammento detto peptide segnale, origina la proinsulina, che possiede già i ponti disolfuro definitivi. Una volta raggiunto l’apparato di Golgi, la proinsulina va incontro ad un nuovo taglio proteasico e, dopo la rimozione del peptide C, si ottiene l’insulina finita. In un batterio l’inserzione del gene “as it is” non è funzionale, in quanto esso non possiede un macchinario di splicing e nemmeno i vari apparati di ossidazione dei doppi legami e di clivaggio della proteina. In primo luogo nei vettori di espressione l’informazione fornita deve essere esclusivamente codificante, priva degli introni, ovvero essere il cDNA dell’mRNA di interesse, privo anche delle sequenze UTR. Ad essa deve essere legato un promotore batterico, inducibile, (solitamente il lac) e nella sequenza deve essere presente il punto di inizio della traduzione tipico dei procarioti, la sequenza di Shine-Dalgarno. Questo è posto all’interno di un pezzo batterico (MBP maltose binding protein o GST glutatione transferasi), in quanto le proteine contenenti una porzione batterica risultano più stabili. Le proteine totalmente eterologhe rischiano di essere digerite dalle proteasi oppure di precipitare, formando un agglomerato che uccide la cellula. Inoltre, bisogna assicurarsi che la fusione, oltre ad essere trascrizionale, sia anche traduzionale, in quanto non bisogna avere uno spostamento del quadro di lettura tra MBP/GST e la sequenza MCS. L’importante è porre un punto di taglio specifico per una proteasi tra il frammento batterico e il frammento eterologo. Dopo aver indotto l’espressione della proteina di fusione essa è facilmente estraibile, in quanto il frammento batterico è in grado di legare un substrato specifico. In questo caso una cromatografia di affinità è il metodo più utilizzato. In seguito, si procede al taglio proteolitico e alla separazione del frammento effettivamente di interesse e la “sonda” batterica. Per quanto riguarda l’insulina, però, non è di interesse medico il propreormone, pertanto si è sviluppata una strategia leggermente più complessa. Sono state create due proteine di fusione separate per la catena A e per la catena B, con promotore del triptofano (trp). Una volta estratte le due catene, esse sono sottoposte a vari trattamenti per ottenere la proteina finale. In primo luogo il taglio proteolitico viene compiuto non mediante un enzima di clivaggio ma mediante il bromuro di cianato (CNBr). La formazione di ponti disolfuro tra le catene laterali delle cisteine è catalizzata da un’alta concentrazione di ossidante: abbassando man mano il livello, vengono a formarsi i ponti disolfuro. Un’altra importante applicazione dell’ingegneria genetica è la produzione dell’ormone della crescita (GH, detto anche ormone somatotropo STH) all’interno di cellule batteriche. La sua carenza causa il nanismo ipofisario, tuttavia, l’analogo di tale proteina animale non è efficace come terapia sull’uomo. L’unica terapia fino a quando non sono state ingegnerizzate delle cellule in coltura era utilizzare l’STH estratto da ipofisi di cadavere (circa 80 ipofisi all’anno per paziente) con problemi sia per quanto riguarda la carenza di materiale, sia per quanto riguarda l’elevata incidenza di patologie in seguito alla cura. È stato possibile ingegnerizzare una cellula batterica perché esprima l’ormone della crescita. Il fatto che le proteine prodotte da batteri contengano come primo amminoacido una formilmetionina non è di alcun problema, in quanto naturalmente i batteri idrolizzano tale amminoacido di inizio appena terminata la sintesi della catena polipeptidica. 


Come abbiamo visto, la produzione di proteine all’interno di cellule procariote è molto vantaggiosa in quanto le tecniche di ingegneria sono relativamente semplici e si ottiene una grande quantità di proteina purificata a basso costo e priva di rischi per il paziente in quanto autologa. Tuttavia, il modello ha dei limiti notevoli che sono la mancanza di un apparato di folding corretto (e la produzione quindi di proteine inservibili se non dannose) e la mancanza di un apparato di modificazione post-traduzionale (glicosilazione, clivaggio, ecc.) che può avere serie conseguenze sia sulla funzionalità della proteina sia sul suo riconoscimento da parte del sistema immunitario. Per ovviare a gran parte di questi problemi si possono ingegnerizzare delle cellule eucariote, in particolare di lievito (Saccaromyces cerevisiae). Queste permettono di ottenere un folding corretto, la formazione naturale dei ponti 
disolfuro e tutte le modificazioni post-traduzionali. È possibile ingegnerizzare dei plasmidi per l’espressione eucariote: essi contengono lo stesso un’origine di replicazione batterica (ori) e un gene marker (AmpR) in quanto i costrutti sono assemblati e selezionati nei batteri. Inoltre è necessario un promotore eucariotico del sistema dell’organismo, una sequenza di terminazione e poliadenilazione e un marcatore di selezione eucariotico. 
Si parla di trasformazione quando un vettore di DNA eterologo è inserito all’interno di un batterio, si parla di trasfezione quando il vettore è introdotto in una cellula eucariote. Tuttavia, non è facile introdurre del DNA nelle cellule, e questo è un limite fondamentale di 

cui tener conto. Esistono varie metodiche differenti: la microiniezione oppure la formazione di buchi sulla membrana plasmatica attraverso vari mezzi, tra cui l’elettricità (elettroporazione) e il bombardamento con pallini di tungsteno. Questo è un processo inefficiente, sempre all’equilibrio tra la vita e la morte delle cellule. I metodi migliori di introduzione sembrano essere i virus (che sono progettati apposta per introdurre acidi nucleici all’interno di cellule) e i liposomi. L’ingresso del DNA all’interno del nucleo (nelle cellule eucariote) non è generalmente un problema. Ciò che invece è difficile è fare in modo che la molecola di DNA eterologo si leghi stabilmente al genoma. Nelle cellule, infatti, il DNA iniettato non è benaccolto, in quanto presenta estremità libere, che sono riconosciute dalle nucleasi come frammenti di cromosomi rotti. Pertanto, quando si vuole modificare stabilmente una cellula, è necessaria l’integrazione del DNA nel genoma. Questo evento può capitare casualmente, spesso come copie multiple in tandem. Il meccanismo migliore, però è la ricombinazione omologa, ovvero la sostituzione di un frammento con un altro fiancheggiati dalle stesse sequenze e all’incirca della stessa grandezza. Si “accompagna” il gene di interesse con altre sequenze già presenti nel genoma. Tuttavia, si è ancora molto lontani dall’ottenere questo risultato. Si utilizza una tecnica simile, inducendo una rottura all’interno del plasmide in un solo punto e quindi questo si integra col genoma. La tecnica relativamente più affidabile è la ricombinazione sito-specifica, che assomiglia in parte a quella compiuta naturalmente dal fago . che, mediante una piccola sezione sovrapponibile del vettore col genoma, ne media l’inserzione. 
Si parla di trasfezione stabile quando il DNA è incorporato all’interno del genoma e vengono selezionate le cellule con inserzione più stabile. Si parla di trasfezione transiente quando invece il DNA non è incorporato e le cellule non sono selezionate. 
Un esempio di espressione proteica in cellule di lievito è la produzione del vaccino per il virus dell’epatite B (HBV). Tale virus è rivestito da due proteine fondamentali per il riconoscimento anticorpale: HBsAg e HBcAg. I vaccini tradizionali sono ottenuti da virus attenuati, ottenuti da “portatori sani”, che esprimono solo HBsAg. Tuttavia, il vaccino ottenuto dal sangue di questi portatori sani è rischioso, perché il virus potrebbe resistere alla bollitura. Il beneficio del trattamento, comunque, si rivela maggiore del rischio. Con l’avvento dell’ingegneria genetica e la possibilità di produrre solamente gli antigeni senza che sia necessaria la presenza di alcun virus, il rischio si è praticamente annullato (salvo casi di risposta eccessiva all’antigene). La produzione dell’antigene nei batteri fallì in quanto la molecola prodotta non era biologicamente equivalente a quella prodotta dai sistemi complessi di folding e modificazione post-traduzionale delle cellule eucariote. Fu possibile però produrre HBsAg in Saccaromyces cerevisiae, annullando ogni rischio di infezione, in quanto era stato trasfettato solamente il gene di HBsAg. 


Altre proteine importanti terapeuticamente, l’attivatore del plasminogeno tissutale (t-Pa utilizzato per dilatare le arterie coronarie) e l’interferone ß-1a (utilizzato nella terapia della sclerosi multipla). Esse non possono essere prodotte né nelle cellule batteriche né nelle cellule di lievito. Per esse sono utilizzate le cellule della linea CHO, di mammifero (derivano da criceti) 
Ingegnerizzazione di cellule – gli OGM Gli organismi geneticamente modificati possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti, in modo tale che si abbiano modificazioni in tutte le cellule somatiche. Bisogna quindi procedere sullo zigote. Nella blastocisti, infatti, si ha già la inner cell mass, costituita da cellule multipotenti che danno origine all’embrione, e lo strato esterno, che formerà gli annessi embrionali. È necessario creare un costrutto di espressione, costituito da un promotore, che può essere costitutivo o inducibile a seconda dei casi, una sequenza codificante e il sito di poliadenilazione. Quando il costrutto viene integrato, a volte può funzionare, a volte no: se un costrutto va a finire in una regione cromatinica, esso avrà un’espressione tessuto-specifica. L’introduzione del costrutto di espressione avviene mediante microiniezione nei pronuclei maschili o femminili (solitamente in quelli maschili che sono più grandi). Sono necessari più ovuli fecondati per ottenere un animale transgenico. L’integrazione avviene nei primissimi momenti di sviluppo, con la formazione di concatenameri, ovvero l’introduzione di più costrutti di espressione in tandem nello stesso punto. In seguito vengono studiati i neonati per capire se essi abbiano integrato il gene o meno. Come si ottengono cellule embrionali totipotenti per creare degli organismi geneticamente modificati? Attraverso la distruzione degli embrioni fino allo stadio di blastocisti. Una volta modificate, esse sono re-iniettate in una blastocisti. L’organismo che se ne ottiene è una chimera, in quanto possiederà sia cellule modificate che cellule normali (solitamente si può notare introducendo cellule modificate di topo nero all’interno di una blastocisti di topo bianco). Affinché la modifica sia trasmessa alla progenie, le cellule iniettate devono contribuire alla formazione delle cellule germinali dell’individuo adulto. Con gene targeting si intende il bersagliamento preciso di un gene attraverso la ricombinazione omologa, in modo tale da attivare/disattivare tale gene. Solitamente questo si effettua con la creazione di topi cosiddetti knockout che permettono studi particolari sulle malattie genetiche umane e non solo. 
Patologia molecolare 
Per poter affermare che un gene è responsabile di una certa patologia è necessario dimostrare che esso porta delle mutazioni. Tali mutazioni possono essere puntiformi, oppure riarrangiamenti genici (delezioni, inversioni, inserzioni). 
Prendiamo ad esempio la còrea di Huntington: essa è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni extrapiramidali, coinvolti nell’azione dei movimenti involontari. Nello stadio avanzato di progressione della malattia sono colpiti anche gli altri neuroni, portando l’individuo ad una grave forma di demenza e ad uno stato vegetativo. Come molte altre malattie neurodegenerative, è autosomica dominante e mostra il fenomeno clinico dell’anticipazione, che comporta una manifestazione più precoce e grave del fenotipo ad ogni generazione successiva. Ci si è posti quindi il problema di identificare il gene responsabile di tale quadro patologico. Mediante un’analisi di linkage si notò che esso era molto vicino ad una sequenza STR del cromosoma 4. Il sequenziamento non portò all’identificazione di nessuna delle mutazioni più comuni, tuttavia studiando individui imparentati ci si accorse che l’allele mutato passato al figlio non aveva peso molecolare sempre identico ad uno dei due alleli del genitore. Si giunse alla conclusione che esiste un frammento di DNA instabile, che si accompagna a cambiamenti di peso molecolare. Tale instabilità era dovuta alla ripetizione di una sequenza di tre nucleotidi, CAG, codificanti per la glutammina, all’interno della sequenza codificante (in un esone). Tale ripetizione non causa alcun cambiamento della cornice di lettura né un’alterazione nel livello di espressione della proteina. Tuttavia, al di sopra di un certo numero di ripetizioni del codone CAG, l’espansione del tratto di poliglutammine ne causa l’aggregazione con conseguente neurotossicità. 

L’espansione del tratto ripetuto è dovuta al fenomeno di slippage, ovvero di scivolamento della DNA polimerasi all’interno della sequenza ripetuta, con la formazione di “bolle” di triplette più lunghe di quelle di partenza. Al di sotto della soglia critica di ripetizione questo è poco probabile, pertanto la malattia 
non è presente. Questo meccanismo spiega anche il fenomeno dell’anticipazione, che è correlata alle dimensioni del 
tratto ripetuto. 
Esistono altre malattie causate anch’esse dalla espansione di tratti CAG, quali l’atrofia dentatorubro-pallidoluysiana, la 
malattia di Kennedy e varie atassie spino-cerebellari. 

La distrofia miotonica è una malattia con causa simile ma meccanismo differente. Essa ha come segno principale 
l’impossibilità per un muscolo, una volta contratto, di decontrarsi. Tale gene presenta un’espansione di triplette CGG 
ma, mentre nella corea di Huntington non si superano spesso le 100 ripetizioni, in questo caso si raggiungono anche le 
1000 ripetizioni. Il tratto ripetuto, però, si trova in una sequenza non codificante. Non si è ancora stati in grado di 
comprendere come questo possa causare il fenotipo patologico: forse esso altera la maturazione dell’RNA messaggero, 
impedendone la traduzione. 

Altre malattie che presentano quest’espansione di triplette sono la sindrome dell’X fragile, una malattia X-linked 
recessiva dovuta alla mutazione di almeno due geni sul cromosoma X (espansione di un tratto ripetuto o in UTR 5’ o 
sul promotore CCG/CGG) che causa uno spegnimento trascrizionale dovuto ad una metilazione costitutiva in seguito a 
tale espansione. 
Il meccanismo è sempre lo stesso, la iperripetizione di sequenze STR, mentre la conseguenza varia a seconda delle 
malattie. 

Quali sono i meccanismi molecolari che fanno sì che una patologia genetica sia dominante o recessiva? 
Per quanto riguarda le patologie recessive, solitamente la mutazione causa una perdita di funzione del prodotto 
proteico, quella che viene generalmente denominata come loss of function: la quantità di proteina residua prodotta 
dall’allele omologo è sufficiente al mantenimento del tipo normale. Pertanto, affinché si manifesti il fenotipo 
patologico, lo stesso gene deve possedere due mutazioni inattivanti in entrambi gli omologhi. Talvolta, però, le 
mutazioni loss of function possono avere un carattere dominante, si parla allora di aploinsufficienza (vedi dopo). 
Per quanto riguarda le patologie dominanti, sono diverse le possibilità: 

»  attivazione costitutiva: può derivare da mutazioni puntiformi o troncanti che impediscono la corretta  
regolazione della proteina, che quindi continua a svolgere la propria funzione ma in maniera anormale e  
sregolata. Ne è un esempio il protooncogene Ras, una proteina G monomerica, in grado di legare  
alternativamente GTP e GDP. Una mutazione rende Ras incapace di  
idrolizzare il nucleotide trifosfato, mantenendola sempre attiva. La  
mutazione anche solo di uno dei due alleli di Ras mantiene il circuito di  
trasmissione del segnale sempre acceso. Un altro esempio è la perdita di  
una sequenza, che agisce da proteolisi costituzionale e non indotta.  
»  effetto dominante negativo: la proteina per essere funzionale forma dei  
multimeri. Le proteine mutate interagiscono con quelle normali,  
annullandone l’attività. Ne è un esempio la mutazione dell’oncosoppressore p53:  
esso inizialmente fu considerato un oncogene in quanto mutazioni dominanti  
funzionavano da oncogeni. In realtà esse inibivano il corretto funzionamento del  
tetramero, sequestrando i prodotti funzionanti in un complesso inattivo.  
Un esempio di questo effetto dominante negativo è l’osteogenesi imperfetta.  
Tale patologia è caratterizzata dalla mancanza di collagene nelle ossa. Esso è un trimero, formato da due  
catene a1 e da una catena a2. Nel caso in cui la mutazione di un allele sia una loss of function, le  
consequenze non sono gravi, in quanto si riduce solamente il numero di molecole di collagene prodotte. Nel  
caso, invece, in cui si abbia una mutazione che causa la produzione di una proteina errata (simil-gain of  
function) si ha una malattia molto grave, in quanto la nuova proteina interferisce con le proteine sintetizzate  
correttamente, impedendo la polimerizzazione di gran parte del collagene.  
»  gain of function: la proteina ha acquisito una nuova funzione totalmente diversa da quella di partenza. Le  
mutazioni possono essere puntiformi o, più spesso, troncanti. Un altro evento abbastanza frequente è la  
ripetizione di cequenze CAG.  
»  loss of function: una mutazione che causa una perdita di funzionalità al gene interessato solitamente è una  
mutazione recessiva, tuttavia in alcuni casi particolari tali mutazioni sono dominanti. Questi sono casi di  
cosiddetta aploinsufficienza, in cui il prodotto di un solo allele non è sufficiente a compensare l’attività di  
quello mancante. Si noti che in questi casi il mutante omozigote presenta gli stessi fenomeni patologici più  
gravi dell’eterozigote e spesso non nasce neanche.  

Bisogna anche ricordare che mutazioni differenti dello stesso gene non sempre portano all’espressione dello stesso 
fenotipo patologico. Ne è un esempio il gene Pax3, un fattore trascrizionale che ha un ruolo fondamentale nello 
sviluppo dei melanociti. 
Qualora la mutazione causi una loss of function, il fenotipo corrisponderà alla sindrome di Waardenburg, 
caratterizzata da sordità e da pigmentazione cutanea. Nel caso invece la mutazione sia una gain of function, si avrà 
come risultato un’oncogenesi che porterà a rabdomiosarcoma. 
I fenotipi patologici sono molto difficili da studiare geneticamente in quanto il fenotipo viene regolato da più geni. 
Talvolta si ha un gene che è responsabile di un determinato fenotipo ma altri geni possono fungere da modificatori, 
aumentando o diminuendo la gravità del fenotipo che causa. Inoltre, è molto difficile essere predittivi sulla carta, in 
quanto i meccanismi che regolano le cellule sono assai complessi e in parte ancora sconosciuti. 

Terapia genica 
Prima di parlare della terapia genica è molto importante distinguerla da ciò che terapia genica non è. Per terapia 
cellulare si intende la tecnica di cura di una patologia per mezzo di cellule. Essa si manifesta nel trapianto, ovvero nel 
passaggio di tessuti o organi da un donatore ad un accettore. Tale approccio è possibile in quanto il difetto è 
assolutamente tessuto-specifico. 
Il trapianto può essere di tipologia differente a seconda del donatore da cui proviene l’organo: 

»  Allotrapianto: trapianto tra individui della stessa specie. Questa è la forma di trapianto più diffusa. Tuttavia,  
presenta gravi problemi in quanto è assai difficile trovare un’istocompatibilità perfetta tra donatore ed  
accettore ed allora si rende necessaria una terapia immunosoppressiva per evitare il rischio di rigetto. Tale  
terapia, però, espone il paziente a gravi rischi in caso di infezione.  
»  Xenotrapianto: trapianto tra individui di specie differenti.  
»  Autotrapianto: trapianto di tessuto proveniente dallo stesso individuo. In questo  caso  non  si ha alcun  
problema di compatibilità istoimmunitaria.  

Le terapie genetico-molecolari riguardano la produzione di proteine normali in sistemi di espressione differenti dall’uomo, in vitro (batteri, lieviti, cellule in coltura), per poi somministrare il prodotto al paziente. 
La terapia genica, invece, consiste nel processo di modificazione del DNA all’interno delle cellule del paziente, allo scopo di curare una malattia o di alleviarne i sintomi. Tale processo può essere effettuato in vivo, ovvero introducendo un qualcosa nel corpo che va a modificare selettivamente il DNA, oppure ex vivo, ovvero prelevando delle cellule, facendole espandere in vitro, modificandole e reimpiantandole nel paziente. I vantaggi teorici della terapia genica sono numerosi: in primo luogo essa è una correzione radicale del problema, che fornisce la possibilità di agire direttamente dall’interno su meccanismi molecolari di elevata complessità, difficilmente influenzabili agendo dall’esterno, fornendo vantaggi economici e un aumento della qualità della vita, in quanto non richiederebbe grandi cure ripetute nel tempo. Tuttavia, la terapia genica presenta anche delle possibili limitazioni: in primo luogo la disponibilità di terapie alternative rende difficile il finanziamento della ricerca per tale soluzione, inoltre essa potrebbe essere non efficace, senza considerare i grandi problemi tecnici e i costi. Ciò che però rappresenta il problema più importante è la possibilità di eventi indesiderati quali un’espressione non regolata, un’inserzione in una regione “delicata” causante mutagenesi, il passaggio della modifica alla linea germinale. Quest’ultimo punto è vietato dalla legge e dalla coscienza, in quanto si rischia di passare delle aberrazioni ai figli dell’individuo. Nella terapia in vivo è molto più difficile regolare questo punto. I problemi tecnici attuali comprendono la difficoltà nel fare entrare il DNA all’interno delle cellule in maniera selettiva (ovvero nel tessuto di interesse), nell’instabilità dell’espressione nel tempo e nella sua mancata regolazione, le possibili reazioni del sistema immunitario e i problemi etici. La terapia genica potrebbe essere indicata per la terapia di malattie 


pericolose per la vita ma potenzialmente reversibili, legate a mutazioni di cui il gene sano sia già stato clonato e non richieda una regolazione precisa. Risulta fondamentale, ovviamente, possedere un sistema di trasferimento efficiente, sicuro e stabile nell’espressione. Quali sono le strategie terapeutiche possibili? 
Il caso più semplice è quello di una mutazione loss of function recessiva, in cui è sufficiente l’introduzione di un gene funzionante. Più complesso è il caso delle malattie dominanti, in cui è necessario eliminare il gene mutato o mediante eliminazione fisica o mediante inibizione. La tecnica perfetta sarebbe la ricombinazione omologa, in grado di scambiare l’allele sano introdotto con l’allele mutato. Tuttavia, essa ha un’efficienza bassissima in quanto è un evento che raramente accade in maniera spontanea. L’inibizione selettiva di un determinato gene avviene invece mediante spegnimento epigenetico: vengono inibite perciò la trascrizione o (più spesso) la traduzione. Il punto dell’espressione genica su cui è più facile agire è l’RNA messaggero. Si può pensare di produrre degli antisenso specifici per gli mRNA mutati, sia sotto forma di oligonucleotidi sia sotto forma di vettori antisenso che, venendo trascritti, produrrebbero mRNA antisenso. La formazione di un ibrido RNA-RNA formerebbe una molecola a doppio filamento che, venendo riconosciuta come virale, sarebbe distrutta dalla cellula. Studi sperimentali hanno mostrato che l’antisenso possiede un certo grado di attività di legame all’mRNA ma, con grande sorpresa da parte dei ricercatori, anche l’RNA senso possiede un certo grado, seppur inferiore, di attività di legame. Cosa ancor più inaspettata, si è osservato che l’RNA duplex, che non dovrebbe proprio legare, lega con altissima affinità rispetto all’antisenso. La teoria, pertanto, era sbagliata. Il fenomeno della RNA interference (RNAi), che permette la degradazione del solo mRNA di interesse, è indotta dall’introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento. Tale meccanismo, infatti, ha un ruolo fisiologico nel riconoscimento delle infezioni virali: in esso è coinvolto lo stesso complesso molecolare che regola l’azione dei miRNA. Una prima ribonucleasi, Dicer, taglia a 25 paia di basi. La molecola viene quindi inserita nel complesso RISC (il suo substrato migliore è proprio l’RNA a doppio filamento) che, scansionando i messaggeri, riconosce quelli con una sequenza complementare a quella del frammento di RNA introdotto e mediante taglio endonucleasico espone le molecole alla digestione da parte di esonucleasi. Un problema nell’utilizzo di tale terapia è il fatto che le molecole di RNA duplex non possono essere più lunghe di 25bp, altrimenti la cellula entra in apoptosi. Inoltre, è necessario uno studio approfondito preliminare su tale sequenza, in modo da limitare i danni collaterali (off target effects) della RNAi. Di solito si utilizzano due sequenze, dirette entrambe sullo stesso mRNA, in modo tale da massimizzare l’effetto su di esso rispetto all’azione sui bersagli collaterali. Nel caso di malattie genetiche dominanti sono spesso sequenze di mRNA che non sono prodotte normalmente nelle cellule e pertanto presentano minori bersagli collaterali. Si noti che non si tratta di uno knockout, ovvero in una rimozione o in attivazione del gene, ma di uno knockdown. Al massimo, infatti, la RNAi blocca per il 90% l’espressione di un gene. Questo è però spesso più che sufficiente per gli scopi terapeutici. Si può agire terapeuticamente anche contro le proteine predisponendo anticorpi intracellulari appositamente studiati (intracorpi). Talvolta può essere utile l’uccisione selettiva di cellule patologiche (a partire dalle cellule infettate fino ad arrivare alle diverse tipologie di tessuto neoplastico). Una tecnica consiste nella somministrazione di profarmaci, ancora inattivi, che vengono attivati solamente nelle cellule 
malate da meccanismi specifici di esse. Ne è un esempio l’aciclovir, utilizzato ad esempio per combattere le infezioni di Herpes simplex. Altre tecniche di uccisione selettiva consistono nell’introduzione all’interno delle cellule malate di geni che codificano per una tossina, oppure per antigeni o citochine, in modo tale che il sistema immunitario possa mediarne l’eliminazione. Ne è un esempio la terapia per il melanoma. Tuttavia, come è comprensibile, il problema di tali metodiche sta nella selettività di ingresso del gene e nelle metodiche di trasfezione. 
Come si è già capito, gran parte della terapia genica richiede la possibilità di introdurre selettivamente del materiale genetico esogeno nelle cellule malate e nell’ottenerne una integrazione col genoma della cellula senza provocare danni collaterali rilevanti. L’inserimento può avvenire mediante vettori virali e vettori non virali. I vettori virali presentano un’elevata efficienza di trasduzione, tuttavia, oltre ai costi elevati di produzione e alle possibili reazioni immunitarie del paziente, presentano altri limiti più importanti. In primo luogo, esiste la possibilità di formazione di mutanti patogeni mediante ricombinazione con altri virus. Inoltre, le molecole di DNA hanno dimensioni limitate dalla grandezza del capside. Il problema più grave e difficilmente controllabile, però, è la maggiore o minore casualità di inserzione all’interno del genoma del frammento esogeno, che può causare mutagenesi inserzionale (inserendosi all’interno di una sequenza codificante oppure regolatrice). 



vettori non virali comprendono liposomi, molecole introdotte mediante endocitosi mediata da recessore, elettroporazione ed altre tecniche. Essi permettono l’inserimento nelle cellule di una vasta gamma di prodotti molecolari, con minori limiti di spazio e costi decisamente più bassi. Inoltre, eliminano il rischio di neoformazione di virus e abbassano le possibilità di risposta immunitaria. Tuttavia, essi sono scarsamente efficienti e possono dare mutagenesi inserzionale a loro volta. I vettori virali devono sempre essere difettivi, ovvero prodotti mediante linee cellulari (dette nel complesso “fabbrica del virus”) in modo tale da evitare che il virus sia in grado di riprodursi una volta introdotto all’interno del paziente e dare luogo ad infezioni (per di più mutanti). I virus utilizzati per la produzione di vettori virali ed il cui utilizzo per la terapia genica è in fasi di studio più o meno avanzate sono di tipi differenti: 
»  retrovirus: infettano solo cellule in divisione attiva, integrazione stabile e casuale  
»  lentivirus: derivati dall’HIV, infettano anche cellule quiescenti, integrazione stabile e casuale  
»  adenovirus: si esprimono ad alti livelli, non si integrano e causano forti reazioni immuni  
»  virus adeno-associati (AAV): forniscono un’espressione stabile ed un’integrazione sito-specifica, sono ancora  
difficili da produrre  

I vettori retrovirali sono quelli che per ora sono stati più studiati e sperimentati. I retrovirus, come già detto prima (vedi sezione clonazione), sono dei virus il cui genoma è costituito da due molecole di RNA che vengono retrotrascritte in molecole di cDNA. Esse entrano nel nucleo durante la mitosi e si integrano stabilmente nel genoma in maniera casuale. Il genoma è fiancheggiato da sequenze LTR, contenenti i segnali di trascrizione, espressione, poliadenilazione e ricombinazione. Nelle cellule infettate da virus normali, il genoma virale si 
integra nel genoma della cellula ospite e, essendo trascritto in RNA, in parte viene utilizzato come materiale genomico per i futuri virus, in parte viene tradotto per formare le proteine del capside, la trascrittasi inversa, l’integrasi e le proteine dell’envelope. L’impacchettamento del genoma all’interno del capside è reso possibile dalla presenza di una regione specifica, detta regione .. Si crea quindi un vettore virale, contenente il gene umano di interesse, che possiede le sequenze LTR e la regione .. Le cellule della linea di packaging contengono integrato nel loro genoma un provirus difettivo per la regione .. In questo modo, il DNA contenente i geni virali gag pol ed env non potrà essere introdotto all’interno del capside ma verrà tradotto nelle proteine tipiche del virus normale. Il vettore ricombinante contenente il gene di interesse sarà quindi introdotto anch’esso nella linea di packaging e, una volta trascritto in mRNA, contenendo la regione ., sarà introdotto nel capside, dando origine ad un virus non infettivo (difettivo). Risulta necessaria pertanto una discrepanza tra l’informazione che porta il virus e le proteine di cui è composto, in modo da renderlo non infettivo, fungendo da “siringa”. Una volta che il virus infetta le prime cellule, grazie alle proteine di cui è composto, esso non sarà più in grado di riprodursi indipendentemente dalla cellula (in quanto manca dei geni codificanti per le proteine virali) ma avrà introdotto il gene di interesse nella cellula. Quando questa si duplicherà, duplicherà anche tale gene, trasmettendolo a tutte le cellule figlie. Tuttavia, per evitare delle possibili ricombinazioni tra lo .+ del vettore ricombinante e lo .– del genoma virale, che potrebbe portare alla formazione di ceppi virulenti, conviene spezzare l’informazione virale in due provirus difettivi e complementari: ad esempio, un virus contenente i geni gag e pol e un altro contenente il gene env. In questo modo, sarebbero richiesti due eventi di ricombinazione per formare un genoma wildtype. Un esempio di utilizzo di vettori retrovirali è il trial clinico per deficit di adenosina deaminasi (ADA). Esso causa la SCID (Severe combined immunodeficiency), in cui le cellule più colpite sono sicuramente i linfociti T. Il trial prevede l’estrazione dal paziente di linfociti T, l’inserzione del gene ADA funzionante mediante vettore retrovirali e la reinfusione dei linfociti T al paziente. Una terapia alternativa potrebbe essere l’inserzione della proteina mediante PEG-ADA. In teoria, per risolvere definitivamente tale malattia genetica sarebbe necessario l’isolamento, l’inserzione del gene e il reimpianto nelle cellule staminali ematopoietiche. Tuttavia, i linfociti T che hanno accolto il virus possono essere espansi notevolmente in vitro ed essere successivamente reinfusi più volte. 


Un’altra forma di SCID è la cosiddetta SCID-X-linked. Essa colpisce una proteina G associata ad un recettore delle citochine. È stato effettuato uno studio simile a quello per la SCID legata a deficit di ADA, sulle cellule CD34+, i precursori ematopoietici pluripotenti. Questa terapia in vivo da cellule staminali aveva come obiettivo quello di mantenere stabilmente i risultati della terapia genica. Il problema che si presentò è che due pazienti sui dieci che avevano preso parte al trial clinico svilupparono una leucemia. Si notò che il virus si era inserito vicino a molti protooncogeni. Gli oncoretrovirus, infatti, si inseriscono nei geni attivi ma nelle cellule staminali sono attivi geni proliferativi potenziali oncogeni. Un altro problema frequente nel caso di vettori retrovirali è che i geni trasfettati dopo poco si spengono, soprattutto se si usa una sequenza LTR come promotore. 
Tuttavia, il vero limite dei vettori retrovirali è la loro impossibilità di trasferire materiale genetico alle cellule che non si duplicano più, un aspetto importante per la ricerca di una cura per le malattie neurodegenerative, in quanto il tessuto cerebrale è un tessuto perenne, che non va incontro a rinnovamento. Si è pensato al virus dell’HIV, che riesce ad infettare cellule post mitotiche. Tuttavia, esso ha un 

genoma complesso ed infetta solamente i linfociti e i macrofagi, causando un’infezione persistente. I lentivirus sono dei vettori virali derivati da HIV-1, più sicuri, in grado di infettare cellule post mitotiche e in attiva proliferazione, sono dotati di un genoma ad RNA, si integrano casualmente (quindi persiste il problema della mutagenesi inserzionale), danno minori reazioni immunitarie. Mediante complesse tecniche di produzione del pericapside, inoltre, si aumenta la possibilità di target e la maggiore specificità della loro azione. 


Un altro tipo di vettore utilizzato in passato è stato l’adenovirus: esso non possiede un envelope, ma è rivestito solamente dalle proteine del capside. Tuttavia, le cellule infettate assomigliano a delle cellule tumorali, in quanto proliferano molto. Essi sono virus oncògeni, ma solo in caso di immunocompromissione. Normalmente, infatti, le cellule infette vengono distrutte dal sistema immunitario. Dal momento che sono potenzialmente oncogeni non sono adatti alla terapia genica. Il loro genoma è lineare, grande e possiede molti geni. Essi sono affiancati da sequenze dette inverted terminal repeat (ITR). I loro geni si suddividono, a seconda del momento di attivazione, in immediate early genes, early genes e late genes. La regione di maggiore interesse clinico è la regione E1, contenente i due geni E1A ed E1B. E1A lega la proteina Rb, importante controllore della duplicazione del DNA, fungendo da CDK. Esso è un segnale anomalo in quanto repentino. La risposta della cellula a questo cambiamento innaturale è l’attivazione di p53 e l’ingresso in apoptosi o in senescenza replicativa. Il gene E1B, tuttavia, bloccano p53, inattivando la risposta della cellula. La regione E1, quindi, è fondamentale per la replicazione del virus, stimolando la sintesi del DNA. Molti virus oncògeni (ad esempio il virus del papilloma umano HPV) colpiscono proprio p53 e le altre proteine cruciali per il controllo della proliferazione e dell’apoptosi. Gli adenovirus sono in grado di attaccare un gran numero di tipi cellulari differenti. È possibile quindi la creazione di vettori virali difettivi per la regione E1 (6-7kb) attraverso una linea di packaging. Nei batteri verrebbe assemblato quindi un vettore ricombinante in cui al posto di E1 trova posto il promotore del gene di interesse. Nella linea di packaging, oltre alla trasfezione del gene inserito, è necessario introdurre anche E1, ponendo sempre attenzione alla produzione casuale di virus ricombinanti che abbiano riacquistato il gene E1. Gli adenovirus come vettori hanno come punti di vantaggio, oltre alla capacità di infettare più tipi cellulari, anche la facilità di produzione e il fatto che, non integrandosi con il genoma della cellula ospite, non danno mutagenesi inserzionale. Un limite insito nella struttura del genoma adenovirale è che esso viene mantenuto nella cellula sotto forma episomale e perciò dopo del tempo viene perduto, rendendo necessaria un’ulteriore somministrazione. Problema ancora più grave è stato il decesso di due pazienti durante il trial clinico, poco dopo la somministrazione di vettori adenovirali, in quanto alcuni soggetti posseggono già anticorpi specifici per questi virus e la somministrazione è pertanto fortemente immunogena. L’unico caso in cui potrebbe essere utile l’utilizzo di tali vettori è nel caso serva una forte risposta immunologica, come ad esempio nei tumori. 
Associati agli adenovirus, tuttavia, sono presenti degli altri virus, parassiti, conosciuti come adeno-associated viruses (AAV). Essi hanno genomi molto piccoli a singolo filamento di DNA, costituiti da una regione dedicata ai meccanismi di replicazione del DNA (rep) e una regione dedicata alle proteine del capside (cap), affiancate dalle regioni ITR. Questo è reso possibile dal fatto che molte delle proteine di cui necessita un AAV sono presenti nel genoma dell’adenovirus cui è associato. 

I virus adeno-associati presentano una elevata selettività per il tipo cellulare che infettano: sono molto specifici e si conosce per ogni specie quale sia il tessuto preferenzialmente colpito. Essi, inoltre, si integrano specificamente in pochissimi punti del genoma, preferenzialmente sul cromosoma 19 e talvolta non si integrano nemmeno. Questo conferisce loro una ridotta mutagenicità inserzionale. Un altro enorme vantaggio di eventuali vettori AAV è la possibilità di sostituire completamente il DNA virale, lungo circa 4000 basi, con frammenti esogeni di interesse terapeutico. Ciò che è complicato è riuscire a fare in modo da renderli svincolati dagli adenovirus. 
L’utilizzo di vettori derivati da Herpes simplex (HSV) è molto controverso in quanto comporta un notevole numero di controindicazioni a fronte di vantaggi minimi rispetto agli altri vettori. Tuttavia, si noti che nella terapia genica non in tutti i casi risulta necessario trasferire il genoma in tutte le cellule del tessuto per ottenere il risultato desiderato. Questo è dovuto al fatto che talvolta il prodotto del gene è capace di diffondere all’interno del tessuto e in questo modo le cellule trasfettate, anche se non sono tutte, produrranno proteina a sufficienza per ristabilire un fenotipo fisiologico. Un esempio di questo è il deficit di arilsulfatasi nei neuroni. L’unico caso in cui è assolutamente necessaria un infezione di tutte le cellule malate è nel caso del cancro in cui bisogna eliminare tutte le cellule modificate (in particolare le cellule staminali cancerose CSC). La linea di packaging è solitamente una coltura di cellule eucariotiche tumorali, in modo tale da permetterne una proliferazione indefinita. Solo i virus corretti che vengono prodotti sono iniettati per la terapia in vivo. Le terapie ex vivo attualmente coinvolgono il midollo osseo con le cellule staminali ematopoietiche, la cute e la cornea. Un esempio di terapia genica del cancro è quella che si sta studiando per la cura del glioblastoma. Esso è una delle neoplasie più maligne del sistema nervoso centrale. Dovrebbe essere facile colpire selettivamente il tessuto malato, in quanto in attiva replicazione, diversamente dai neuroni che non si replicano. I vettori preferibili, pertanto, sono gli oncoretrovirus, in grado di infettare solamente le cellule in attiva proliferazione. Un’altra tecnica possibile è l’innesto di cellule produttrici di vettori all’interno dell’encefalo. Scopo di entrambi i trattamenti è quello di trasfettare le cellule tumorali con un gene che esprime una timidina chinasi: tale enzima attiva il profarmaco ganciclovir, in grado di uccidere tali cellule, selettivamente, in quanto solo le cellule tumorali contengono la TK. 
Purificazione di cellule staminali 
Il grande interesse per le cellule staminali pluripotenti deriva dalla loro potenziale capacità di differenziare in tutti i tessuti somatici (non gli annessi embrionali, che derivano da cellule staminali totipotenti) e dall’eliminazione di ogni problema di istocompatibilità successivo al trapianto, qualora esse derivino dalle cellule del paziente stesso opportunamente manipolate. Il problema maggiore degli allotrapianti è l’istocompatibilità, con conseguente rischio di rigetto. Gli allotrapianti sono resi necessari per l’impossibilità di effettuare un autotrapianto di un tessuto specializzato compromesso. Tuttavia, la possibilità di far rigenerare tale tessuto da cellule staminali totipotenti derivanti dal paziente stesso, costituirebbe una forma di autotrapianto immune da ogni rischio di rigetto. Altro aspetto interessante dell’utilizzo delle cellule staminali nei trapianti è l’eliminazione della malattia del trapianto contro l’ospite (più conosciuta con il termine inglese graft versus host disease): in pazienti immunocompromessi a cui viene effettuato il trapianto di midollo osseo, spesso le cellule producono anticorpi del donatore che, riconoscendo l’organismo che li ospita come “non self”, attivano una risposta immunitaria contro l’accettore stesso. La scoperta dell’esistenza di cellule staminali unipotenti anche per i neuroni ha aperto un nuovo fronte di indagine scientifica per il trattamento delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, in questo caso, il problema ancora più maggiore è la incredibile difficoltà nella localizzazione delle cellule e nella formazione dei corretti collegamenti dendritici ed assonali. Fino a pochi anni fa si credeva che le cellule non potessero tornare indietro dal loro percorso differenziativo: in altre parole, non si riteneva possibile che una cellula committed potesse tornare ad essere una stem cell. Come già detto prima, si dice totipotente una cellula in grado di generare tutti i tessuti ed anche gli annessi embrionali (essa è in pratica lo zigote). Le cellule pluripotenti sono in grado di generare tutti i tessuti di un organismo (cellule della inner cell mass nella blastocisti). Si dicono multipotenti le cellule in grado di dare origine a diversi tipi di cellule di un tessuto (con differenti gradi intermedi di multipotenza) e unipotenti le cellule in grado di originare un solo tipo cellulare. 

La difficoltà tecnica attuale, tuttavia, non sta tanto nell’ottenere cellule staminali pluripotenti istocompatibili, ma nella differenziazione che origina il tessuto. Questo perché le interazioni tra segnali intracellulari ed extracellulari che fanno si che una cellula diventi committed sono troppo complessi per essere riprodotti attualmente in vitro e molto spesso non sono ancora conosciuti nei dettagli. Le cellule da cui si pensava di ottenere queste staminali totipotenti erano le cosiddette cellule staminali embrionali. Tuttavia, il problema è sempre quello dell’istocompatibilità. Si è pensato per molto tempo alla soluzione come alla clonazione dell’individuo: estrarre il genoma da una cellula somatica del paziente ed introdurlo in un ovocita enucleato. Il citoplasma dell’ovocita, infatti, è in grado di resettare il nucleo di una cellula differenziata, rendendola totipotente e quindi, nel corso delle fasi iniziali di proliferazione dello zigote, pluripotente. Tali cellule sono anche istocompatibili in quanto esprimono esattamente il genoma del paziente. Ovviamente, questo approccio pone numerosi problemi etici e tecnici sia sull’opportunità della clonazione umana, sia sulla provenienza dei tanti ovociti necessari per la tecnica. In realtà, non è necessaria la clonazione mediante questa tecnica complessa: mediante riprogrammazione del nucleo di una cellula somatica è possibile generare cellule totipotenti senza che ci sia bisogno di ovociti. Lo studioso che ha immaginato tale applicazione (Dr. Shinya Yamanaka) è partito dalla conoscenza che l’unica sostanza in grado di riprogrammare il genoma è il citoplasma di un ovocita. Egli ha anche osservato che nei topi sono presenti dei geni fondamentali per il differenziamento cellulare ed ha pensato che fossero quelli coinvolti nella riprogrammazione. Tali geni, tutti fattori di trascrizione, sono: Nanog, Pou5F1, Sox2, Lin28, Klf4 ed N-Myc. Si noti che questi ultimi due sono anche dei protooncogeni (le cellule cancerose posseggono infatti caratteristiche di staminalità). Trasfettando delle cellule somatiche completamente differenziate con vari vettori contenenti tali geni, la miscela portò alla formazione di cellule pluripotenti, che presero il nome di induced pluripotent stem cells (iPSC). La prova che tali cellule possono effettivamente differenziare in tutti gli altri tipi cellulari è la formazione di teratomi qualora esse vengano iniettate sotto cute. I teratomi, infatti, sono dei tumori che presentano i vari tipi di tessuto specializzato nel posto sbagliato. Altri studi per l’induzione della pluripotenza sono stati condotti mediante infusione dei prodotti di tali geni purificati. Effettivamente anche in questo modo si ottiene una riprogrammazione del genoma, tuttavia tale operazione più portare ad aberrazione cromosomica. Il problema di tutte le tecniche di induzione di pluripotenza è l’alto rischio di mutazioni che possono portare a cancro: con le attuali tecniche, infatti, si ha rischio di mutagenesi inserzionale, si introducono dei protooncogeni ricombinanti e solitamente si inibisce p53 (probabilmente il più importante oncosoppressore) per rendere più efficiente l’operazione. Tuttavia, esistono delle cellule, le cellule S, in cui la ricombinazione omologa avviene più di facilmente e pertanto nel futuro si potrebbero risolvere gran parte dei problemi sopra citati. Tali cellule non presentano più problemi etici, in quanto non comportano la distruzione di alcun embrione né la presenza di un donatore. La parte difficile è quella tecnica di sviluppo di tecnologie efficienti e sicure, e di tecniche per il differenziamento cellulare e la terapia dei pazienti che siano efficaci e maneggevoli. 
Giulio Cossu – Università San Raffaele Vita, Milano 
Il dottor Giulio Cossu è un esperto dello sviluppo dei muscoli scheletrici ed ha dedicato i suoi studi alla comprensione e alla ricerca di una cura per la Distrofia Muscolare. Per gli studi attuali si basa su dei modelli animali (cani) in modo tale da poter simulare la situazione patologica tipica della DM. Tale approccio sfrutta la provenienza dei modelli animali dallo stesso progenitore, in quanto molto spesso i geni sono ampiamente conservati. Tale sperimentazione è necessaria in quanto funge da filtro: qualcosa che funziona nelle linee cellulari non è detto che funzioni negli organismi animali e talvolta anche se funziona nei modelli non funziona nell’uomo. 


Cossu sta studiando la distrofia nei cani golden retriever. Il problema principale di tale studio è che nessuna molecola di cDNA può contenere tutto il gene della distrofina. 
In primo luogo è necessario dire che negli ultimi anni è stata posta troppa enfasi sulle potenzialità delle cellule staminali, Questo è un problema in quanto induce speranze nei pazienti, che spesso vengono disattese causando un forte disappunto. Bizzozzero fu il primo a stabilire la distinzione tra tessuti labili, stabili e perenni. Questi ultimi sono caratterizzati da cellule che non vanno incontro a mitosi e che non vengono rimpiazzate dopo la loro morte. Ne è un esempio il sistema nervoso. Tali cellule sono quindi vittima di malattie degenerative causate da questo mancato rimpiazzo. In realtà si è visto che anche nei tessuti perenni la situazione non è proprio così definita. In altri tessuti sono presenti (sangue, cute) delle cellule staminali locali, che però sono bersaglio di mutagenesi e di formazione di neoplasie. Il problema è che non si ha alcun mezzo per identificare le cellule staminali dalle cellule figlie che si svilupperanno dando vita ai tessuti. Una distinzione da fare, inoltre, è tra cellule staminali adulte e cellule staminali embrionali. Le prime, derivate dalle seconde, sono ristrette nella loro potenza, essendo in grado di generare cellule solo di un particolare tessuto o solo un particolare tipo cellulare. Le cellule staminali embrionali, invece, derivano dalla inner cell mass della blastocisti e possono essere duplicate indefinitamente in vitro. È anche possibile mandarle incontro a differenziamento. I problemi sono sia di ordine etico che di ordine tecnico. Il primo problema riguarda il fatto che non sono presenti cellule staminali embrionali pluripotenti all’interno del nostro organismo, forse sono presenti delle cellule multipotenti nel midollo osseo. Esse devono quindi essere ottenute sacrificando degli embrioni. I problemi tecnici riguardano in primo luogo il fatto che il sistema immunitario riconosce tali cellule come “non self”, in quanto provenienti da un donatore con istocompatibilità magari soltanto parziale. La soluzione potrebbe essere l’enucleazione di una cellula uovo e il trasferimento di DNA somatico all’interno di essa, con la formazione di un “embrione” con lo stesso genoma del donatore e quindi lo stesso MHC. In questo processo si ha una piccola contaminazione col genoma della cellula uovo, in quanto i mitocondri posseggono il genoma dei mitocondri dell’individuo “madre”. Se impiantato questo ovulo fecondato porta alla clonazione dell’individuo. Si noti che tuttavia i due individui non saranno perfettamente identici in quanto le influenze ambientali saranno sicuramente differenti e i telomeri del clone saranno più corti di quelli del genitore. L’idea di base, pertanto, è semplice: si ha un paziente con una malattia genetica, si fa in modo che il DNA somatico possa essere riparato in vitro e quindi lo si reimpianta nel paziente. Il problema di questo meccanismo è che richiede la disponibilità di un elevato numero di ovuli donati. Nel 2006 Yamanaka scoprì che trasfettando i fibroblasti è possibile portare indietro quelle cellule al livello della pluripotenza mediante l’attivazione di vari geni. La differenziazione cellulare, pertanto, non è propriamente a “senso unico”. Queste cellule, se iniettate dentro una blastocisti (in quanto la blastocisti comprende le cellule che formano gli annessi embrionali, derivanti dalla cellula totipotente) daranno origine ad un nuovo animale con caratteristiche chimeriche (in quanto alcune cellule presenteranno il genoma della blastocisti ed altre il genoma delle cellule pluripotenti iniettate. Con le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) non si hanno più problemi di ordine etico ma permangono quelli di ordine tecnico, che sono attualmente irrisolti: i meccanismi molecolari che portano al differenziamento dei vari tessuti, la tumorigenesi causata da tali manipolazioni. 
1. 
Numero sufficiente/espansione in vitro con perdita di staminalità 

2. 
Seri problemi di espianto ed impianto in posizioni differenti 

3. 
Differenziamento e integrazione funzionale all’interno del tessuto ospite 

4. 
Controllo del sistema immunitario anche in caso di autotrapianto, in quanto i vettori sono considerati 


antigeni da parte dell’individuo ospite. Quali terapie si possono intraprendere con le cellule staminali? Cura delle malattie del sangue, mediante trapianto di midollo osseo; trattamento di grandi ustioni, mediante autotrapianto di cellule staminali della pelle espanse in vitro; bruciature unilaterali della cornea. Sono in corso degli esperimenti che riguardano l’utilizzo delle cellule staminali per la cura dell’immunodeficienza acquisita, l’epidermolisi bullosa, le grandi fratture ossee con frammenti multipli. Nel trapianto normale: donatore sano . trapianto di organo/tessuto con immunosoppressione Nella terapia genica: paziente . cellule corrette mediante l’uso di vettori virali . autotrapianto 
Per quanto riguarda la distrofia muscolare gli studi e i trial su modelli animali dell’equipe del prof. Cossu si sono provate entrambe le terapie: allotrapianto da donatore sano con conseguente immunosoppressione oppure utilizzo di cellule del paziente corrette in vitro. Per gli studi sono stati utilizzati i precursori dei mesangioblasti rispetto alle cellule staminali. Essi, infatti, sono utili in quanto, trovandosi all’interno della parete dei vasi sanguigni, possono essere somministrati per iniezione senza alcun problema. Sono stati effettuati trial su topi, cani ed ora stanno iniziando i primi trial su esseri umani. I mesangioblasti vanno incontro a senescenza replicativi ma sono sufficienti per gli studi e per la terapia. 
L’allotrapianto su pazienti affetti da Distrofia muscolare di Duchenne di mesangioblasti è stato provato sia attraverso iniezione intramuscolare, sia attraverso iniezione nelle arterie femorali o nell’aorta discendente. È stato necessario mettere insieme la sicurezza con l’efficacia della procedura. Fino ad ora per la DMD non sono conosciute terapie, pertanto non si hanno a disposizione dati per confrontare l’efficacia del trattamento. Nella scelta dei pazienti volontari, alcuni esclusi hanno deciso comunque di proseguire nel trial in quanto non esiste alcuna terapia alternativa. Esperimenti su bambini affetti da DMD con terapia effettuata solamente su una gamba permetteranno di determinare se tale terapia sia o meno efficace, confrontando la situazione della gamba trattata e di quella non trattata. Se anche ci fossero dei piccoli vantaggi nella terapia, varrà la pena (dal punto di vista medico, non dal quello economico) mantenere i pazienti immunosoppressi, forse per tutta la vita.