Influência do stresse oxidativo na morte de células de Leucemia Aguda em cultura : relação com os níveis de 5-hidroximetilcitosina

Palavras-chave: Leucemia,Stresse Oxidativo5-hidroximetilcitosina,Espécies Reactivas,5-hidroximetilcitosina

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia do sistema hematopoiético que resulta da transformação maligna das células progenitoras linfoides, B ou T, com consequente desregulação da proliferação e/ou bloqueio da diferenciação destas células, conduzindo à acumulação de células imaturas (linfoblastos). No entanto, a maioria das alterações genéticas que ocorrem na LLA não são suficientes para induzir a progressão da doença, o que sugere que existem outros factores genéticos e epigenéticos que contribuem para a transformação leucémica. Um dos mecanismos envolvidos na morte celular por apoptose e/ou proliferação anómala da célula tumoral pode estar relacionado com a produção de radicais livres de oxigénio. Estas espécies reactivas de oxigénio (ROS) são poderosos agentes indutores de lesões do ADN, podendo contribuir para a inactivação de genes supressores tumorais ou para a activação de proto-oncogenes. Contudo, a célula possui um conjunto de defesas antioxidantes, enzimáticas e não enzimáticas, responsáveis pela prevenção das lesões oxidativas. Outro mecanismo implicado no desenvolvimento e progressão do cancro, especialmente no sistema hematopoiético, é a modulação epigenética. Sabe-se que diversos genes supressores tumorais são inactivados devido à hipermetilação das regiões promotoras. Diversos estudos sugerem que as lesões oxidativas do ADN podem afectar os padrões de metilação, levando à expressão génica anómala o que pode contribuir para o desenvolvimento do cancro. Neste sentido, os principais objectivos deste trabalho foram avaliar o papel das espécies reactivas de oxigénio, em particular do peróxido de hidrogénio e do anião superóxido, nos mecanismos de morte celular de células de leucemia linfoblástica aguda em cultura, e a sua relação com o estado de metilação em particular com os níveis de 5-hidroximetilcitosina, de forma a perceber a importância destas alterações e suas repercussões no tratamento da doença. Para atingir estes objectivos foi utilizada uma linha celular de leucemia linfoblástica aguda T, as células CEM. Para avaliar o efeito do stresse oxidativo na proliferação/densidade e viabilidade, das células CEM recorreu-se ao teste de exclusão com azul tripano, após incubação das mesmas na ausência e na presença de diferentes concentrações de peróxido de hidrogénio e menadiona (dador do anião superóxido) IV durante 24 a 72h. Os níveis intracelulares do H2O2, do O2 - e da defesa antioxidante não enzimática GSH, foram determinados por citometria de fluxo através das sondas fluorescentes DCFH-DA, DHE e Alaranjado de Mercúrio, respectivamente. O potencial de membrana mitocondrial foi analisado por citometria de fluxo através da sonda JC-1. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica (coloração de May-Grünwald- Giemsa), por citometria de fluxo com a dupla marcação anexina V e iodeto de propídeo e pela avaliação dos níveis de expressão de proteínas envolvidas nos processos de morte celular, como as proteínas BAX, BCL-2, FAS, FAS ligando e caspases. O ciclo celular também foi avaliado por citometria de fluxo através da marcação com Iodeto de Propídeo/RNase. A hidroximetilação global do ADN (níveis de 5-hidroximetilcitosina,5-hmC) das células tratadas com diferentes concentrações de indutores do stresse oxidativo foi analisada através de um kit comercial baseado num teste imuno-enzimático. Os resultados obtidos mostram que o peróxido de hidrogénio e a menadiona induzem diminuição da viabilidade celular de uma forma dependente da concentração. A avaliação da morte celular por microscopia óptica e citometria de fluxo mostram que estes compostos induzem morte celular principalmente por apoptose, o que está de acordo com o aumento das caspases activadas, da proteína pró-apoptótica BAX e do receptor FAS. A diminuição do potencial mitocondrial e o aumento do pico pré-G0/G1 visualizado na análise do ciclo celular suportam os resultados anteriores. Estes compostos também induzem bloqueio do ciclo celular em fase S, o que poderá estar relacionado com lesão oxidativa do ADN. Além disso, as células submetidas aos indutores de stresse oxidativo mostram níveis de expressão de H2O2, de O2 - e de GSH aumentados. Finalmente, também se observou diminuição da quantidade de 5- hidroximetilcitosina, o que pode resultar num ou de um estado de hipometilação generalizado. Em conclusão, este estudo sugere que, apesar da presença de baixas concentrações de H2O2 e de O2 - induzirem proliferação celular, níveis mais elevados destas espécies reactivas podem levar à morte celular por apoptose. A persistência do stresse oxidativo pode também causar alterações no estado de metilação do ADN, e consequentemente nos níveis de 5-hidroximetilcitosina. Desta forma, torna-seevidente que os indutores do stresse oxidativo além de poderem constituir uma nova abordagem terapêutica em neoplasias hematológicas, poderão interfererir nos mecanismos de regulação epigenética.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais