Immunophenotypic, genetic and molecular characterization of B-cell chronic lymphoproliferative disorders: multiclonal versus monoclonal nature

Palavras-chave: B-cells,B-cell chronic lymphoproliferative disorders,monoclonal B-cell lymphocytosis,chronic lymphocytic leukemia,multiclonality,immunogenetics,cytogenetics,immunophenotyping

Hoje o conhecimento dos mecanismos envolvidos na patogenia das doenças linfoproliferativas crónicas de célula-B (B-CLPD) assume uma importância crescente. De forma geral, a sobrevivência e/ou proliferação da célula tumoral depende tanto das anomalias genéticas das células neoplásicas como do microambiente tumoral. Neste sentido, o desenvolvimento generalizado de técnicas moleculares para a caracterização quer das alterações genéticas presentes nas células tumorais, quer das características do recetor das células B (BCR), mostrou-se fundamental. Como consequência, a leucemia linfocítica crónica (CLL) é hoje considerada como o protótipo para várias doenças de células B em que as interações com o microambiente, mais que a presença de uma anomalia genética específica, são cruciais no surgimento, expansão ou mesmo na progressão da doença, em pelo menos uma fração dos casos. Neste sentido, a existência de um repertório de genes da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV) tendencioso juntamente com um estado mutacional particular e a recente identificação em casos não relacionados de locais de ligação ao antigénio (Ag) praticamente homólogos (BCR “estereotipados") é, regra geral, indicativo do envolvimento de um conjunto limitado de Ags, superantigénios ou ambos, no desenvolvimento da doença, fomentando a investigação das fases iniciais da mesma, p.e., através do estudo da linfocitose monoclonal de células B (MBL). Neste sentido, a citometria de fluxo veio facilitar a identificação de casos de MBL com (MBLhigh) ou sem (MBLlow) linfocitose B absoluta, a qual precede a maioria dos casos de CLL, permitindo assim a investigação de potenciais mecanismos envolvidos na transição de tais estados precursores tipo MBL, para CLL. Uma vez que a tumorigénese consiste num processo em várias etapas, os primeiros eventos transformantes podem ainda ocorrer em etapas mais precoces, quer diretamente na contrapartida normal da célula de CLL ou talvez, mesmo no compartimento de células estaminais hematopoiéticas de doentes com CLL. Para resolver esta questão, na presente tese de doutoramento investigámos múltiplas características fenotípicas e do BCR de células B clonais assim como do seu microambiente, numa série relativamente ampla de clones MBL, CLL/B-CLPD, tanto de casos monoclonais como multiclonais. De forma a explorar se determinados Ags poderão estar envolvidos em vias citogenéticas específicas durante as fases inicias do processo oncogénico, na primeira parte do estudo, focámos o nosso interesse na potencial associação entre determinados perfis citogenéticos e repertórios IGHV específicos. Num segundo passo, foram comparadas as características do BCR e as alterações citogenéticas dos clones de células B de casos monoclonais vs. casos multiclonais para determinar neste último grupo de doentes, a possível existência de uma maior homologia nos BCR que fosse potencialmente indicadora da ocorrência de respostas imunes mediadas por células B. Por fim, comparámos as características dos casos com clones MBL e CLL estereotipados vs. não estereotipados. De forma geral, foram detetados três grupos principais de clones com padrões distintos, mas parcialmente sobrepostos, relativamente ao uso dos genes IGHV, ao estado mutacional desses genes e às alterações citogenéticas: 1) um grupo enriquecido em clones MBLlow expressando genes IGHV específicos (p.e. VH3-23) sem alterações citogenéticas ou com alterações isoladas de bom prognóstico; 2) um grupo principalmente constituído por clones MBLhigh e estágios avançados de CLL com um repertório IGHV restrito, mas diferente (p.e., VH1-69), muitas vezes associado com cariótipos complexos e alterações citogenéticas de mau prognóstico, e; 3) um grupo com características intermédias, com prevalência de genes IGHV mutados e com números mais elevados de células clonais B del(13q)+. Estes resultados sugerem que as características do BCR de clones de células B com fenótipo de CLL podem modular o tipo de alterações citogenéticas adquiridas pela célula transformada, a sua taxa de aquisição, e eventualmente também, as suas consequências clínicas. Tal como referido anteriormente, os resultados recentes apoiam a existência em doentes com CLL, de uma estimulação crónica subjacente das células B por um conjunto restrito de epítopos. Neste sentido, expansões de ≥ 2 clones de células B têm sido frequentemente relatadas em B-CLPD, principalmente na MBL, a qual parece constituir um epifenómeno de estimulação antigénica crónica e persistente. Assim, foi colocada a hipótese de a multiclonalidade se encontrar associada com características particulares do BCR indicando uma maior probabilidade de interação com determinantes imunológicos partilhados. A análise comparativa de clones de células B com fenótipo de CLL e com fenótipo não-CLL de casos de MBL, CLL/B-CLPD multiclonais vs. monoclonais mostrou que, nos casos multiclonais o BCR clonotípico apresenta um grau ligeiramente maior de homologia de HCDR3, juntamente com características hematológicas e citogenéticas únicas, que estão tipicamente associadas com os estágios iniciais da doença. De entre estes casos foi ainda identificado um subgrupo de clones de células B (coexistentes) filogeneticamente relacionados que exibiam características moleculares e citogenéticas únicas. No seu conjunto, esses resultados apoiariam a natureza de tais expansões de células B multiclonais associada ao Ag e o potencial envolvimento de múltiplos epítopos em promover o desenvolvimento da MBL e favorecer a sua progressão para doença (p.e., LLC). No entanto, o cenário no qual podem ocorrer esses eventos permanece desconhecido. De forma a ganhar um maior conhecimento acerca deste cenário, na última parte do nosso trabalho, investigamos ainda a potencial relação entre uma hematopoiese alterada/ clonal e o estímulo antigénico durante a expansão dos clones de CLL e MBL estereotipados vs. não estereotipados. No geral, os casos estereotipados exibiam mais frequentemente genes IGHV1 em vez de IGHV3, juntamente com sequências HCDR3 mais longas e genes IGHV não mutados. O tamanho dos clones de células B estereotipados no sangue periférico (PB) não mostrou estar relacionado com o seu perfil citogenético, mas sim com a presença de imunofenótipos associados com mielodisplasia em células mielóides do PB. Tal associação particular sugere que o surgimento e/ou expansão de clones de células B de CLL nestes casos estereotipados pode ser favorecido por uma hematopoiese alterada subjacente. Em conclusão, os nossos resultados destacam o potencial envolvimento de diferentes vias induzidas pelo Ag nos estágios iniciais de desenvolvimento da MBL e de transformação para CLL, onde o reconhecimento de múltiplos epítopos pelo BCR, juntamente com a coexistência ou não de uma hematopoiese alterada subjacente, poderão modular os padrões de aquisição de alterações citogenéticas na patogénese da CLL, através de diferentes vias de transição desde os estágios de MBL multiclonal até aos clones de CLL monoclonal com perfis citogenéticos mais complexos.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais