Non-viral silencing of Machado-Joseph disease through the systemic route

Palavras-chave: Gene therapy,Neurosciences

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como ataxia espinocerebelosa do tipo 3, é uma doença neurodegenerativa e a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial. Geneticamente, esta doença é causada por uma expansão do trinucleótido CAG na região codificante do gene ATXN3/MJD1, o que confere à proteína ataxina-3 propriedades tóxicas que resultam em morte e disfunção neuronal em múltiplas regiões cerebrais. Até ao momento, não há nenhum tratamento que modifique a progressão da doença e, consequentemente, esta permanece uma doença fatal e incurável, para a qual as únicas opções disponíveis consistem na utilização de fisioterapia e compostos farmacológicos para aliviar sintomas específicos. O silenciamento de genes através do mecanismo de interferência de RNA (iRNA), representa uma das abordagens mais diretas para o tratamento da DMJ, permitindo bloquear a produção da proteína causadora da doença, e assim impedir a progressão da doença. Estudos anteriores exploraram o potencial da iRNA para o tratamento da DMJ e mostraram a sua eficácia em diferentes modelos animais. No entanto, estas experiências bem-sucedidas envolveram a administração intracraniana de vetores virais sendo desejável um procedimento menos invasivo e mais seguro. Portanto, o objetivo deste projeto foi desenvolver uma estratégia não-viral para entregar sequências silenciadoras ao cérebro através de uma via de administração não-invasiva, e a avaliação do seu potencial terapêutico em dois modelos animais geneticamente modificados da DMJ. Na primeira parte deste projeto, descrita no capítulo 2, gerámos com sucesso nanopartículas de base lipídica – SNALPs – direcionadas para o cérebro através da incorporação de um pequeno peptídeo derivado da glicoproteína do vírus da raiva (RVG-9r). Estes SNALPs direcionados para o cérebro apresentaram características importantes para administração sistémica: elevada eficiência de encapsulação para siRNAs, capacidade de proteger os siRNAs encapsulados, tamanho de partículas homogéneo e adequado. Estudos de citometria de fluxo e microscopia confocal revelaram a entrega específica dos siRNAs a células neuronais, in vitro. Além disso, os SNALPs direcionados para o cérebro diminuíram significativamente os níveis da ataxina-3 mutante, a proteína que causa a DMJ, numa linha celular neuronal. Experiências in vivo demonstraram que o peptídeo RVG-9r aumentou a acumulação das nanopartículas no cérebro de murganhos, após administração intravenosa, um dos objetivos mais importantes deste projeto. No capítulo 3, avaliámos o potencial terapêutico da administração intravenosa de SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r num modelo lentiviral murino da DMJ. Os nossos estudos facultam evidências que a administração não-invasiva de SNALPs direcionados para o cérebro diminuiu o número de inclusões ubiquitina-positivas e mediou neuroprotecção num modelo murino lentiviral e estriatal da DMJ, um resultado extremamente promissor. Por fim, no capítulo 4, como o cerebelo é uma das regiões cerebrais mais afetadas nos doentes de Machado-Joseph, avaliámos a eficácia e os resultados do silenciamento da ataxina-3 mutante usando SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r num modelo murino transgénico cerebelar da DMJ, quando implementado após o início da doença. Os SNALPs direcionados com o peptídeo RVG-9r internalizaram no parênquima cerebelar, onde os siRNAs entregues reduziram os níveis de ataxina-3 mutante, melhoraram o desempenho motor dos animais, atenuaram a neuropatologia e não induziram uma resposta imune evidente, constituindo assim uma terapia promissora para a DMJ. Em resumo, esta dissertação apresenta evidências que uma formulação clinicamente relevante baseada em nanopartículas é uma estratégia terapêutica promissora para tratar a DMJ. Os nossos estudos reforçam outros que revelaram os benefícios da iRNA para a terapia da DMJ, revelando uma nova estratégia que tem um elevado potencial para ser utilizada na prática clínica para o tratamento de diversas doenças neurodegenerativas ligadas à produção de proteínas patogénicas.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde