A influência da sitagliptina no vasorrelaxamento induzido pela acetilcolina na aorta isolada de rato: comparação com um modelo animal de Diabetes Mellitus tipo 1 Maria

Palavras-chave: Diabetes Mellitus Tipo 1,Sitagliptina,Dipeptidil-peptidase-IV,Disfunção endotelial,Stress oxidativo

As Gliptinas são fármacos inibidores da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV), que constituem uma nova classe de agentes orais para o tratamento da DMT2 e a sitagliptina é conhecida pelo seu interesse terapêutico através do aumento dos níveis de hormonas incretinas activas GLP-1 e GIP. A DPP-IV degrada rapidamente o GLP-1 (7-36), obtendo-se o GLP-1 (9-36), que inicialmente se pensava ser biologicamente inactivo. Posteriormente, o GLP-1 (9-36) mostrou efeitos independentes do receptor GLP-1R na melhoria da função cardíaca e vasodilatação. Os estudos também sugerem que os efeitos cardioprotectores de ambos o GLP-1 e o GLP-1 (9-36) são parcialmente atribuídos ao seu mecanismo vasodilatador que é dependente de óxido nítrico (NO)/cGMP e também ao aumento da estabilidade do SDF-1α, na medida em que prolonga o seu tempo de vida e a sua acção fisiológica, envolvendo o recrutamento de células progenitoras endoteliais (EPCs) a partir da medula óssea. As EPCs contribuem para a endotelialização dos vasos lesados e a neovascularização induzida por eventos isquémicos. Um dos objectivos do presente estudo consistiu em avaliar o efeito da sitagliptina na reversão/atenuação da disfunção endotelial, por um mecanismo independente do aumento de secreção de insulina, num modelo animal de diabetes do tipo 1, isto é, diabetes induzida por STZ em ratos Wistar. A diabetes foi induzida com uma injecção intraperitoneal única de STZ (65 mg / kg em 10 mM de tampão citrato, pH 4,5) a ratos Wistar machos (8 semanas de idade). Após 2 semanas de indução do diabetes, os animais foram divididos em quatro grupos: controlos, diabéticos e controlos e diabéticos tratados com sitagliptina 5 mg/kg/dia durante as duas semanas seguintes. Os ratos foram em seguida anestesiados (cocktail intraperitoneal 2 mg/kg de uma solução 2:1 (v/v) de 50mg/mL de cloridrato de cetamina em 2,5% clorpromazina) e as amostras de sangue colhidas a partir da veia jugular para a medição de glicose, insulina e níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1c) e medição da actividade da DPP-IV. Os animais foram então sacrificados e três animais de cada grupo foram utilizados para o isolamento da aorta. Após uma pré-contracção com 10μM NA, procedeu-se ao registo do relaxamento isométrico de duas curvas cumulativas concentração-resposta (CR) de ACh (ACh, 0,01-90 μM), na ausência e na presença do éster metílico de NG-Nitro-L-arginina (NG-Nitro-L-arginine methylesther, L-NAME), um inibidor da eNOS, adicionado ao banho de órgãos 30 minutos antes da segunda curva CR, que permitiu confirmar a produção de NO induzida por ACh em todos os grupos. Cada anel funcionou como controlo de si próprio, já que as respostas à ACh da segunda curva foram expressas em percentagem do relaxamento máximo obtido na primeiracurva CR do respectivo anel. Os resultados finais de cada experiência foram expressos em percentagem da resposta obtida nos anéis controlo. A ACh foi mais potente em induzir o vasorrelaxamento em ratos de controlo tratados com sitagliptina (pEC50: 6,77 ± 0,09, n = 12, p= 0,039 vs. ratos controlo não tratados pEC50: 6,41 ± 0,14, n = 12, p= 0,039). Inesperadamente, em ratos diabéticos tratados, a sitagliptina parece comprometer o efeito vasorrelaxante mediado pela ACh com uma redução significativa da percentagem de inibição da contracção induzida pela NA (Emáx: 27,1 ± 5,1%, n = 12 vs. ratos diabéticos não tratados Emáx de 59,5 ± 8,2%, n = 12, p = 0,003). Para estudar os mecanismos subjacentes aos resultados obtidos anteriormente, recorreu-se à técnica de Western blotting para observar a expressão do GLP-1R e das formas totais e fosforiladas das enzimas eNOS e Akt, de forma a avaliar o estado da via de sinalização Akt/eNOS, na presença e na ausência de tratamento com sitagliptina, em ratos controlo e ratos diabéticos. Nos ratos diabéticos observou-se um aumento significativo na expressão do GLP-1R comparativamente com os animais controlo. No grupo de ratos diabéticos sujeitos a tratamento com sitagliptina, parece haver uma tendência para aproximação da situação controlo com uma redução da expressão do GLP-1R. No que diz respeito aos níveis de expressão de Akt activa, determinados através da razão p-Akt/Akt total, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados. No entanto, a administração de sitagliptina tendencialmente aumentou a razão p-Akt/Akt total em ratos controlo e ratos diabéticos, embora nestes últimos o aumento tenha sido mais ténue. Por fim, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão de eNOS activa entre os quatro grupos em estudo, determinados através da razão p-eNOS/eNOS total. Recorrendo a marcadores de stress oxidativo, avaliou-se a presença de aniões superóxido nos anéis de aorta dos 4 grupos de animais. Verificou-se um aumento no stress oxidativo nos anéis de aorta de ratos diabéticos, traduzido por um aumento da intensidade da fluorescência, comparativamente aos respectivos animais controlo. A administração de sitagliptina diminuiu significativamente a intensidade da fluorescência, quer nos animais controlo, quer nos diabéticos. Por fim, no sentido de complementar os estudos funcionais, realizaram-se estudos histoquímicos de modo a caracterizar a micro-anatomia dos anéis de aorta dos 4 grupos de animais. As alterações histológicas observadas no presente estudo demonstraram que a organização estrutural do tecido aórtico foi perturbada em ratos com diabetes induzida por STZ, tendo a administração de sitagliptina nestes animais conduzido a um aumento da densidade da matriz numa tentativa de aproximação da situação controlo.Em suma, os resultados obtidos permitem inferir que, na presença de diabetes, pode ocorrer um comprometimento da via de sinalização PI3K/Akt/eNOS, conduzindo ao desenvolvimento de disfunção endotelial diabética, caracterizada maioritariamente por anomalias na vasodilatação mediada pelo NO, associadas ao stress oxidativo. De facto, os efeitos benéficos da sitagliptina na função vascular, observados no grupo controlo deste estudo e que são independentes da secreção de insulina, não foram observados na presença da patologia, podendo estar subjacentes fenómenos que comprometem a via de sinalização comum e que não são revertidos pelo fármaco, pelo menos ao fim do curto período de tratamento a que os animais foram sujeitos.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais