Genoma mitocondrial e défice energético no diagnóstico das doenças da cadeia respiratória mitocondrial

Palavras-chave: Genoma humano,Mitocôndrias,Doenças mitocondriais,Metabolismo da energia,Doenças da cadeia respiratória mitocondrial

As Doenças da Cadeia Respiratória Mitocondrial (DCRM) podem apresentar-se através de um largo espectro de manifestações clínicas. O seu diagnóstico laboratorial inclui um défice numa ou mais enzimas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CRM) e/ou alteração (mutação pontual, deleção, inserção) do genoma mitocondrial (mtDNA) ou nuclear (nDNA), para além de acidose láctica ou alterações histológicas que podem ser encontradas, destacando-se as fibras vermelhas rotas (ragged red fibbers , RRFs).. Contudo, nem todos os casos apresentam RRF’s, as análises bioquímicas nem sempre evidenciam défices enzimáticos e, na maioria dos doentes, não são encontradas alterações do mtDNA/nDNA. Em 1996, implementámos no nosso Laboratório, sito no Instituto de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Coimbra, a tecnologia necessária para o estudo bioquímico e molecular das patologias da CRM, com o objectivo de dar resposta ao diagnóstico deste grupo de doenças, principalmente para a zona Centro do País, mas que cobre toda a área geográfica Portuguesa. Nesse sentido, desde Janeiro de 1997 que recebemos amostras de doentes com suspeita clínica de DCRM e procedemos à sua análise bioquímica (estudo espectrofotométrico dos complexos enzimáticos da CRM) e molecular (análise genética de mutações e rearranjos do mtDNA). No presente trabalho, apresentamos os resultados obtidos na análise de parâmetros da CRM e de variações na sequência do mtDNA, num período de 7 anos (1997-2003), numa amostra de 577 indivíduos, dos quais 531 são doentes, provenientes de diversos Hospitais do País, maioritariamente do Hospital Pediátrico de Coimbra (346) e do Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (160). Os dados resultantes da determinação da actividade dos complexos da CRM foram analisados em valor absoluto e relativos à actividade da enzima marcadora da matriz mitocondrial, citrato sintetase (CS). Foi discutido o valor de ambos, tendo em conta os resultados de outros grupos, publicados recentemente, na tentativa de encontrar o critério mais adequado para definir um défice da CRM. Os resultados da pesquisa de alterações do mtDNA foram avaliados e foi efectuada uma análise de correlação com os dados bioquímicos, com o objectivo de conseguir um diagnóstico mais célere das referidas patologias, para aprofundar o conhecimento das alterações que levam ao aparecimento dos fenótipos clínicos. De entre os resultados obtidos, destaca-se a evidência estatística de que o critério mais adequado para definir um défice da CRM é a comparação do resultado com 40% do valor de referência médio (VRMed) normalizado para a CS, comparativamente ao valor de referência mínimo (VRMin). Demonstrámos também que é indispensável o estudo de vários tecidos para estabelecer o défice da CRM no doente com suspeita de DCRM, tal como já tinha sido mencionado na literatura. Os nossos resultados relativos aos défices da CRM demonstraram, de forma clara, uma elevada sensibilidade para a detecção de défice da CRM nos leucócitos isolados de sangue periférico (LEU), embora a especificidade fosse baixa, tendo em conta a confirmação do resultado noutro(s) tecido(s). As características clínicas são, em geral, determinantes na escolha de outros tecidos para a análise. Comprovámos também, de modo inequívoco, as diferenças existentes entre a análise da CRM em mitocôndrias isoladas (MIT) e homogeneizado de músculo. Destacase a informação adicional que os nossos resultados acrescentaram à possibilidade de efectuar uma análise bioquímica mais rigorosa no estudo do tecido muscular, tendo em conta as diferenças observadas nas fracções obtidas durante o isolamento das MIT. No estudo da CRM em função da idade, não observámos a diminuição que tem sido mencionada na literatura. Apenas se observou um decréscimo em alguns parâmetros, mas não em todos os tecidos, tendo sido possível constatar que, no músculo, a actividade pode ser menos elevada em doentes mais jovens. Podemos também concluir que a avaliação do consumo de oxigénio poderá vir a ser útil como parâmetro a incluir na componente bioquímica do diagnóstico de DCRM. A determinação da actividade de outras enzimas, nomeadamente da glicerol-3-fosfato desidrogenase, poderá ser relevante para o melhor entendimento dos mecanismos celulares envolvidos neste grupo de patologias. Demonstrámos que não é possível utilizar amostras de doentes com suspeita clínica de DCRM, em quem esta foi posteriormente excluída (OD), para servirem de controlo na avaliação de défice da CRM. Além disso, o facto do sangue ser o primeiro tecido de colheita poderá evitar a realização imediata de biópsia a indivíduos que venham a ser considerados como OD. Por outro lado, a análise genética do mtDNA permitiu identificar variações da sequência em 120 indivíduos (21,7%), incluindo seis novas alterações com probabilidade de serem patogénicas. Estes resultados contribuíram para o diagnóstico definitivo de DCRM em 89 doentes (17,5%), incluindo 56 adultos e 28 crianças da região Centro de Portugal, permitindo estimar a frequência de 8,3:100.000 (1:12.048) e 2,8:100.000 (1:35.714), para as mutações patogénicas do mtDNA em crianças e adultos, respectivamente. Tal como seria de esperar, encontrámos uma grande heterogeneidade nos resultados, tendo em conta todos os dados apresentados, tanto ao nível genético, como bioquímico, para além da informação clínica. No entanto, em alguns casos, foi possível uma concordância de resultados, no mesmo tecido, tendo em conta as duas abordagens, bioquímica e genética. Por exemplo, em LEU/sangue, 61,3% dos casos normais para a actividade da CRM foram também normais para a pesquisa de mutações. De entre os doentes com défices em vários complexos (MULTI), as alterações do mtDNA identificadas, foram diversas, com preponderância de deleções (mutações pontuais isoladas foram identificadas em apenas dois indivíduos). Também se observou uma correlação positiva, embora não absoluta, entre os dados da análise do mtDNA e o resultado da avaliação da CRM, mas apenas quando considerámos todos os tecidos estudados por indivíduo. Tendo em conta o número total de casos (adultos e crianças) em que foi possível estabelecer o diagnóstico com base nos nossos resultados, tendo por base os dados demográficos da População da região Centro (CENSOS 2001; fonte: INE), foi possível estimar uma frequência de 1:20.000 para a DCRM na população da região Centro.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde