Inibidores de Proteinases Aspárticas com Actividade Antimicrobiana

Palavras-chave: Cynara cardunculus L.,Proteinases aspárticas,Inibidores de proteinases aspárticas,Actividade inibitória,Actividade antimicrobiana

Os inibidores de proteinases encontram-se amplamente distribuídos no reino das plantas, particularmente em sementes e outros órgãos de reserva. Apesar de existir uma vasta literatura sobre a ocorrência de inibidores de proteinases serínicas, cisteínicas e metaloproteinases, há uma lacuna significativa na literatura sobre inibidores naturais de proteinases aspárticas. No entanto, as proteinases aspárticas são uma classe de enzimas que se encontra amplamente distribuída na natureza e tem sido implicada em vários processos fisiológicos e patológicos, como a hipertensão, a SIDA, a doença de Alzheimer e a infecção por microrganismos patogénicos. A raridade de inibidores naturais desta classe de proteinases pode ser devido ao facto de a maior parte das proteinases aspárticas ser sintetizada já numa forma inactiva (zimogénio) por si só, que é apenas clivada e activada quando necessário. Assim sendo, o primeiro objectivo deste trabalho consistiu na identificação, purificação e caracterização de inibidores de proteinases aspárticas em extractos de sementes dormentes de Cynara cardunculus L. Para isso foi criada a melhor abordagem possível de extracção, seguida de análise do conteúdo proteico, por técnicas de PAGE, e da actividade proteolítica e inibitória dos extractos, por técnicas de zimografia e ensaios enzimáticos. Após detecção de actividade inibitória da pepsina nos extractos de sementes, procedeu-se à purificação das fracções inibitórias do extracto desnaturado, por cromatografia de exclusão molecular seguida de cromatografia de fase reversa. As fracções recolhidas foram analisadas para actividade inibitória da pepsina, sendo que as fracções da exclusão molecular inibiram significativamente a enzima, enquanto as fracções da fase reversa não apresentaram qualquer inibição. As fracções da exclusão molecular apresentaram também actividade inibitória contra outras proteinases aspárticas, como a quimosina e a cardosina A. Em termos de conteúdo proteico, nenhuma das fracções apresentou bandas proteicas em SDS-PAGE e Tricina-SDS-PAGE, indicando que as moléculas responsáveis pela inibição ou são péptidos pequenos, que não são detectados pelas técnicas de PAGE, ou são moléculas de natureza proteica. XII De modo a caracterizar parte do conteúdo das fracções inibitórias, estas foram sujeitas a uma cromatografia bidimensional de camada fina, tendo-se detectado a presença de fracções lipídicas com características amino- e glicolipídicas. Estas foram isoladas e separadas por cromatografia de fase reversa, tendo-se obtido um perfil semelhante para ambas as fracções, o que indica que podemos estar na presença de moléculas glicolipídicas incorporadas com resíduos aminoácidos. O segundo objectivo do trabalho consistiu na avaliação da capacidade antimicrobiana das fracções inibitórias purificadas do extracto desnaturado. Para isso foram realizados ensaios antimicrobianos, pelo método de difusão em discos, contra estirpes patogénicas de bactérias (Escherichia coli e Staphylococcus aureus) e de leveduras (Candida albicans e Saccharomyces cerevisae). Os resultados obtidos mostraram uma actividade inibitória das fracções apenas contra E.coli.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais