Síntese e Optimização de Nanopartículas Funcionalizadas para a Recuperação Selectiva de Glicoproteínas em Fluídos Humanos

Palavras-chave: Nanopartículas,Lectinas,Glicoproteínas

A glicosilação é uma das modificações pós-traducionais mais complexas e abundantes na natureza. Este tipo de modificação tem um papel fundamental na actividade e na síntese proteica, assim como na sinalização, crescimento e diferenciação celular. Padrões alterados e glicosilação aberrante são dois fenómenos profundamente correlacionados com diversas doenças, incluindo o cancro. Assim, a monitorização e a descoberta de padrões de glicosilação em fluídos humanos é de enorme importância para a detecção, acompanhamento e desenvolvimento de novos tratamentos. Os fluídos humanos são extremamente complexos e muitos possíveis biomarcadores estão presentes em concentrações muito baixas (na ordem dos nano aos fentomolar), o que os torna muito difíceis de encontrar e monitorizar, fazendo com que o enriquecimento seja um passo fundamental para o seu estudo. Uma das estratégias de enriquecimento mais eficientes tira partido da capacidade das lectinas se ligarem selectivamente a mono ou oligossacarídeos das glicoproteínas, que, associadas a um suporte de imobilização, permitem a captura e enriquecimento destes biomarcadores. Assim, é necessário um suporte de imobilização que permita que a captura seja simples, eficiente e específica. As nanopartículas magnéticas (MNP) vieram, em associação com as lectinas, permitir responder a esta demanda, pois promovem uma interacção tridimensional e multivalente das lectinas com as glicoproteínas, aumentando a especificidade e a eficiência da captura. Neste trabalho, as nanopartículas magnéticas foram revestidas com três lectinas com um largo espectro de captura: Concanavalina A (ConA), wheat germ agglutinin (WGA) e lectina de Maackia amurensis (MA). Uma nova estratégia, baseada na protecção das lectinas pelos seus açúcares de ligação específica antes da ligação às MNPs foi proposta para superar a natureza não-específica desta conjugação. Esta nova metodologia permitiu a preservação da conformação da lectina, aumentando em 40% e 90% a afinidade da ConA e da MA com as glicoproteínas, quando comparadas com a síntese das MNPs com lectina não-protegida. As condições óptimas de trabalho (temperatura e tempo) e as capacidades máximas de ligação foram determinadas para cada lectina, utilizando a fetuína como referência. A comparação com outras estratégias de imobilização foi realizada recorrendo a Sepharose@ConA. As MNP@ConA demonstraram uma afinidade 5 vezes superior para as glicoproteínas que a Sepharose@ConA, quando incubadas com ovalbumina e fetuína. As MNP@Lectinas foram, depois, aplicadas a soro, saliva e urina humana e as proteínas capturadas digeridas com tripsina e analisadas por nano-HPLC MALDI-TOF/TOF. Esta metodologia permitiu a identificação de 180 proteínas, 90% das quais se encontravam glicosiladas de acordo com as ferramentas bioinformáticas utilizadas, revelando um nível muito baixo de ligações inespecíficas. Assim, as MNP@Lectinas demonstraram ser uma ferramenta de elevado valor para estudos glicoproteómicos, especialmente quando lidamos com baixas quantidades de glicoproteínas.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais