Caracterização Clínica e Molecular da Síndrome Mielodisplásica - Implicações no Prognóstico e Terapêutica

Palavras-chave: Hematologia,Síndrome mielodisplásica,Myelodysplastic syndrome

A Síndrome Mielodisplásica (SMD) é um grupo heterogéneo de doenças hematológicas caracterizado por citopenia(s) periférica(s) com medula hipercelular, hematopoiese ineficaz devido a aumento da apoptose e proliferação anormal de blastos. Esta patologia está associada a elevado risco de progressão para leucemia aguda com sobrevivência global baixa e resistência às terapêuticas convencionais.  A etiologia e patogénese da SMD permanecem pouco esclarecidas. Para além da falência medular e das citopenias periféricas, comuns nas diversas formas de Síndrome Mielodisplásica, a proliferação clonal de progenitores hematopoiéticos associada a mutações genéticas e/ou epigenéticas hereditárias ou adquiridas pode também estar presente.  Apesar de múltiplas tentativas para explicar os mecanismos moleculares desta entidade, pouco se sabe sobre a patogénese do passo promotor ou do estádio inicial.  As alterações epigenéticas têm sido reconhecidas na última década como factores importantes no desenvolvimento do fenótipo maligno.  Os padrões aberrantes de metilação são um mecanismo comum nas neoplasias humanas, especialmente do sistema hematopoiético. Podem estar envolvidos vários genes, dentro dos quais o p15, um gene frequentemente inactivado na SMD por metilação aberrante das ilhas 5’CpG. A inactivação deste gene tem vindo a ser associada ao risco de evolução da doença para leucemia mieloblástica aguda, conferindo mau prognóstico. Outros genes, como o p16, p53, DPAK, MGMT e receptores do TRAIL, têm sido menos estudados em séries de doentes com Síndrome Mielodisplásica. Os polimorfismos funcionais em genes chave, nomeadamente, da enzima metilenotetrahidrofolatoreductase (MTHFR), também podem influenciar a metilação do ADN. São conhecidos dois polimorfismos no gene da MTHFR, C677T e A1298C.  Até à data, a Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA) e a Síndrome Mielodisplásica constituem desafios terapêuticos porque o único tratamento curativo é o transplante de células pluripotenciais hematopoiéticas. No entanto, a maioria destes doentes apresenta uma média de idades superior a 70 anos, estando mais susceptível aos efeitos colaterais da quimioterapia. Estas dificuldades podem ser ultrapassadas por terapêuticas dirigidas a alvos moleculares que passam pela modulação dos mecanismos epigenéticos envolvidos na patogénese destas neoplasias. Os objectivos deste trabalho foram avaliar as alterações moleculares envolvidas na Síndrome Mielodisplásica, nomeadamente a relevância clinica da célula estaminal leucémica, das alterações epigenéticas e da apopotose na patogénese dos vários subtipos da Organização Mundial de Saúde (OMS), na evolução para Leucemia Aguda, sobrevivência e grupos de risco prognóstico. Além disso, pretendeu-se analisar o potencial terapêutico de fármacos dirigidos a alvos moleculares, como um inibidor da farnesiltransferase (α-HFPA), um inibidor do proteasoma (MG262), um inibidor tirosina cinase (Imatinib) e moduladores epigenéticos (Tricostatina A e Decitabina), identificando a associação com menor dose e maior eficácia terapêutica. Para o efeito estudámos o perfil de metilação de genes reguladores do ciclo celular, p15, p16 e p53, genes moduladores da apoptose, DAPK e receptores do TRAIL, e genes envolvidos na reparação do ADN, como o MGMT, em células da medula óssea de 102 doentes com SMD de novo, utilizando a Polymerase Chain Reaction (PCR) específica de metilação (MS-PCR). Os polimorfismos da MTHFR (C677T e A1298C) foram analisados por PCR Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). A identificação e caracterização da célula estaminal hematopoiética (HSC) e estaminal leucémica (LSC) foi efectuada por citometria de fluxo recorrendo às marcações CD34/CD117/CD123/IL-6/TNF-α. A avaliação das proteínas reguladoras da apoptose (via membranar e mitocondial), em particular as proteínas da família BCL-2, BCL-2 e BAX, o TRAIL e seus receptores, o FAS-L, a IAP survivina, a caspase 3, o citocromo C e a p53, foi também realizada por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais marcados com sondas fluorescentes. O potencial terapêutico de fármacos em monoterapia e em associação foi avaliado em uma linha celular de SMD/LMA em cultura, as células F-36P, através de ensaios de proliferação celular recorrendo ao teste de azul de tripano. O tipo de morte celular foi analisado por citometria de fluxo, através da dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo, e por microscopia óptica, após coloração das células com May-Grümwald-Giemsa.  Os doentes têm idade mediana de 74 anos (22-89), com uma razão Masculino/Feminino de 0,8. Os subtipos de SMD segundo a Organização Mundial de Saúde são: Citopenia Refractária com displasia multilinha (CRDM) (n=52), Citopenia Refractária com displasia unilinha (CRDU) (n=12), Anemia Refractária com Excesso de Blastos (AREB)-1 (n=8), AREB-2 (n=8), Anemia Refractária com sideroblastos em anel (n=6), Síndrome 5q- (n=4) e Leucemia Mielomonocítica Crónica (LMMC) (n=12) com o seguinte International Prognostic Scoring System (IPSS): baixo (n=37), intermédio-1 (n=39), intermédio-2 (n=10) e alto (n=1). Onze dos 102 doentes evoluíram para LMA. Evidencia-se um predomínio de subtipos menos agressivos, o que se reflecte em índices de prognóstico de risco baixo e intermédio. A análise de parâmetros bioquímicos permitiu identificar a eritropoietina como factor de mau prognóstico, quando elevada, estando associada aos doentes que evoluíram para LMA e a taxas de sobrevivência inferiores. Além disso, os níveis de plaquetas (média mais baixa), a maior percentagem de blastos (média mais elevada) e de células estaminais mielóides com expressão de IL-6 (CD34+/CD117+/IL-6+) e os índices de prognóstico (riscos intermédio e alto) são entre todos os parâmetros avaliados os que podem influenciar a evolução para LMA (p<0,05). Destas variáveis estudadas, somente a LDH e a eritropoietina relevaram impacto na sobrevivência, quando os seus níveis séricos estão elevados. Neste sentido, elaborámos uma proposta de um novo índice de progressão, que denominámos Índice de Progressão para Leucemia Aguda (IPLA). Este índice é caracterizado por uma pontuação que corresponde à soma dos parâmetros: hematológicos e bioquímicos, célula estaminal, metilação e apoptose, quando alterados. Com este tipo de análise verificámos que os doentes com os subtipos da OMS que apresentavam as pontuações mais elevadas foram os que evoluíram para LMA. Desta forma, este novo índice de prognóstico, poderá constituir uma nova “ferramenta” para avaliar o risco de progressão para LMA. A análise da célula estaminal hematopoiética permitiu a identificação de dois grupos de células, um com características fenotípicas “normais”, as HSC, e outro com características neoplásicas, as LSC, as quais expressam diferencialmente IL-6 e TNF-α. No entanto, os resultados são mais evidentes nos doentes do subtipo AREB-2 (a IL-6 predomina na HSC e o TNF-α na LSC). Estes resultados sugerem a relevância destes dois marcadores na distinção destes dois grupos de células estaminais. O estudo da apoptose mostrou um aumento tendencial de moléculas pró-apoptóticas nos subtipos sem excesso de blastos, embora apenas a caspase 3 tenha significado estatístico. Estes resultados corroboram o envolvimento da apoptose na SMD, em particular em doentes de baixo risco, podendo a caspase 3 vir a constituir um novo marcador de diagnóstico e prognóstico em doentes com SMD. Os resultados do perfil de metilação mostram que mais de 50% dos doentes apresentam dois ou mais genes metilados e que, somente 14,7% da população estudada não apresenta metilação de nenhum gene. Como a metilação é um evento mais frequente nos subtipos iniciais da SMD, nesta população, sugere a interferência da metilação numa fase inicial da doença. Os genes mais frequentemente encontrados metilados são os genes p15 e DAPK, em 56% e 54% dos doentes, respectivamente. O genótipo AC do polimorfismo A1298C da MTHFR mostrou associação com a SMD, mas sem relação estatística com os doseamentos séricos do folato e da vitamina B12 ou com o status de metilação dos genes estudados. Os estudos efectuados na linha celular de SMD permitiram a obtenção de dados experimentais relativamente ao potencial terapêutico de novos fármacos em SMD, nomeadamente das associações do α-HFPA com MG262 e/ou Imatinib e da TSA A com a DEC, mostrando que estas combinações induzem diminuição da proliferação das células F-36P de modo dependente da concentração, do tempo de exposição, do modo e esquema de administração dos fármacos, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose. Em conclusão, este estudo sugere um papel da metilação na SMD, sobretudo nos grupos de baixo risco, o que poderá alterar a actual abordagem terapêutica. Revelou ainda uma associação entre o genótipo AC do polimorfismo A1298C da MTHFR com a SMD. Permitiu ainda identificar factores de mau prognóstico, como a eritropoietina e a LDH, e um novo índice de risco de progressão para LMA. Além disso, os novos fármacos testados na linha celular poderão constituir uma nova abordagem terapêutica na SMD, em monoterapia ou em esquemas terapêuticos combinados, o que permitirá a diminuição da toxicidade secundária, melhorando a qualidade de vida e a sobrevivência destes doentes.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde