Desenvolvimento de um biossensor para a deteção de óxido nítrico

Palavras-chave: Óxido nítrico,Técnicas biossensoriais

Descoberto nos anos 80s como poluente ambiental devido à formação de espécies reativas de oxigénio e azoto (RONS), o óxido nítrico (NO) despertou maior interesse por parte da comunidade científica devido aos vários processos de sinalização em que está envolvido nos tecidos biológicos. O óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) que promove a conversão de L-arginina a L-citrulina e NO na presença de inúmeros cofatores (BH4, NADPH, FAD, O2). As particulares características da molécula de óxido nítrico pressupõem a falta de interações específicas com os recetores membranares, o que lhe confere uma grande versatilidade para reações com alvos biológicos. A complexidade das reações com os seus alvos biológicos pode variar desde reações de segunda ordem irreversíveis à formação reversível do complexo nitrosilo. O NO pode modificar a atividade reguladora de proteínas por reação direta com o seu grupo heme ou indireta via S-nitrosilação e nitração dos resíduos de tirosina. Devido à abundância no meio fisiológico, as proteínas hémicas ferrosas adquirem um papel fundamental na compreensão do papel do óxido nítrico. No cérebro, a sua atuação como neuromodulador está intrinsecamente ligado à ativação do recetor de glutamato dependente de cálcio presente nos neurónios. A isoforma neuronal produz NO no tecido nervoso, tanto central como periférico e realiza um papel na comunicação celular ao associar-se com a membrana plasmática. O alvo melhor caracterizado para o NO é a sGC que por vezes é considerada um recetor específico para NO devido à diminuta interação com os interferentes do NO (O2 e CO). Apesar do seu curto tempo de meia vida e baixa concentração, a possibilidade da quantificação do NO in vivo e ex vivo revela-se um passo crucial na compreensão dos mecanismos a si inerentes. É portanto necessário o desenvolvimento de ferramentas metodológicas capazes de determinar de forma robusta os níveis de NO nos sistemas biológicos. Enquanto os métodos indiretos quantificam o NO segundo os seus produtos de oxidação/redução (colorimetria, EPR, etc), as técnicas eletroquímicas possibilitam uma quantificação direta e em tempo real do NO. Os microsensores acrescentam uma melhor resolução espacial com mínimos danos para os tecidos. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento de microeléctrodos de fibra de carbono para a quantificação de NO através da imobilização de proteínas hémicas. Após resultados preliminares com mioglobina, microperoxidase e hemina em eléctrodos de screen-printig e carbono vítreo, a hemina foi a macromolécula que reuniu as melhores condições eletroquímicas para o estudo sistemático em microeléctrodos. 10 A ligação covalente da hemina com MWNTs e quitosano com o agente cross-linking EDC foi o protocolo mais robusto no que diz respeito ao DET e estabilidade para a medição de NO. Os picos redox do par Fe2+/Fe3+ foram determinados por voltametria cíclica com um valor médio de 3.82 ± 1.95 nA V-1 s enquanto o potencial de redução do NO foi determinado por voltametria de onda quadrada a -0.762 ± 0.011 V na presenção de O2 e a - 0.719 ± 0.012 V na ausência de O2. Os microsensores hemina/MWNTs/Quit-EDC foram ainda caracterizados em termos de sensibilidade a NO, 1.72 ± 0.67 e 2.61 ± 1.67 nA/μM na presença e ausência de O2. O seu limite de deteção foi muito semelhante para ambos os meios, 25 ± 15 nM em meio anaeróbico e 26 ± 15 nM em meio aeróbio. Após a caracterização dos eléctrodos procedeu-se à quantificação de NO exógeno in vivo em cérebro de rato. Os valores obtidos estão de acordo com a calibração prévia do eléctrodo, o que demostra que o filme de MWNTs/Hemina/Quit-EDC mantém as suas características físico-química após a sua inserção em meio biológico.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde