Avaliação dos mecanismos moleculares de resistência a hipometilantes em Leucemia Mieloide Aguda

Palavras-chave: Leucemia mieloide aguda,Azacitidina,Decitabina,Transportadores membranares, nuclear e enzima de metabolismo,Resistência farmacológica

A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia complexa e heterogénea da célula progenitora hematopoiética, cujas características incluem desregulação da diferenciação, proliferação clonal e acumulação na medula óssea de células mieloides imaturas. A leucemia promielocítica aguda é um subtipo raro de LMA em que existe acumulação de promielócitos na medula óssea. A maioria dos casos está associado a uma translocação reciproca t(15;17) (q24.1;q21.2) envolvendo os genes PML/RARα. Apesar dos bons resultados da terapêutica com o ácido all-trans retinóico (ATRA), um indutor da diferenciação, alguns doentes desenvolvem efeitos secundários (ex. síndrome do ATRA) e/ou resistência à terapêutica. Neste sentido, tornou-se necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Sabendo que as células tumorais estão geralmente, hipermetiladas na zona do promotor de genes supressores tumorais, o que conduz ao seu silenciamento epigenético, foi relevante a partir desta característica desenvolver novas terapias dirigidas a alvos moleculares. Assim surgiu a terapia epigenética através de moduladores epigenéticos, nomeadamente os agentes hipometilantes e os inibidores das desacetilases das histonas. Os hipometilantes como a 5-azacitidina (AZA) e a 2’-deoxy-5-decitabina (DAC) estão atualmente aprovados para o tratamento de algumas neoplasias hematológicas, incluindo leucemias mieloides agudas e síndromes mielodisplásicas. A eficácia da terapia epigenética depende da capacidade de transporte do fármaco para o tecido alvo, entre outros mecanismos. Alterações na atividade e/ou expressão dos transportadores de influxo e efluxo, e ainda em enzimas de metabolismo como a UDP (uridina difosfato) glucuronosil transferase família 1 membro A1 (UGT1A1), podem influenciar a eficiência farmacológica dos fármacos hipometilantes. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar alguns mecanismos moleculares envolvidos na resistência a moduladores epigenéticos (hipometilantes), em particular o envolvimento dos transportadores de efluxo da família ABC e das proteínas vault, na leucemia mieloide aguda. Para a realização do trabalho experimental foi utilizada uma linha celular de LMA/LPA (sem a translocação PML/RARα), a linha celular HL-60, e uma sublinharesistente ao fármaco azacitidina, as células HL-60AZA, (previamente estabelecida no Laboratório de Oncobiologia e Hematologia (LOH) da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra). Ambas as linhas celulares foram incubadas com doses crescentes de azacitidina e decitabina durante 72h. A proliferação e viabilidade celulares foram avaliadas através do teste de exclusão azul de tripano e o tipo de morte celular por microscopia ótica (morfologia celular) após coloração das células com May-Grünwald-Giemsa. Os níveis de expressão génica do transportador membranar ABCG2 (gene que codifica a proteína BCRP), assim como do gene da enzima UGT1A1, foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão proteica dos transportadores membranares da família ABC, glicoproteína-P (P-gp), MRP1 e da proteína transportadora nuclear major vault (MVP ou LRP), foram avaliados recorrendo à técnica de citometria de fluxo. Por fim, através da técnica de MS-MLPA (Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), analisou-se o perfil de metilação de vários genes supressores tumorais (TP73, MSH6, VHL, RARβ, ESR1, CDKN2A, PAX5, KLLN, MGMGT, PAX6, WT1, CD44, GSTP1, ATM, CADM1, CHF3, BRCA2, RB1, THBS1, PYCARD, CDH13, TP53, BCRA1, STK11, GATA5) nas duas linhas celulares em estudo. Em termos de resultados observou-se um efeito citostático (dependente da concentração do fármaco e da linha celular) e citotóxico (dependente da concentração, do tempo de incubação e da linha celular) induzidos pela azacitidina. Estes efeitos foram mais evidentes na linha HL-60 do que na linha resistente, HL-60AZA. O IC50 da linha HL-60AZA foi de 187,1 μM e o da linha HL-60 de 58,5 μM, o que demonstra que as células HL-60AZA são cerca de 3,2 vezes mais resistentes à azacitidina relativamente às células parentais sensíveis. De igual modo, a decitabina induziu um efeito citostático e citotóxico dependentes da concentração de fármaco, do tempo de incubação e da linha celular, superiores na linha celular sensível, comparativamente à linha resistente. No entanto, a concentração de decitabina necessária para atingir o IC50 foi inferior à da azacitidina. A sublinha celular HL-60AZA (cujo IC50 foi de 5195 μM) revelou ser resistente 110,8 vezes superior, comparativamente à linha celular sensível (cujo IC50 foi de 46,9 μM). No presente trabalho observou-se resistência cruzada à decitabina nas células resistentes à azacitidina, indicando, que em caso de resistência a um análogo de nucleósido, haverá resistência a fármacos da mesma família. 5 Morfologicamente, as células HL-60 incubadas durante 72h com 5 μM de azacitidina apresentam menor razão núcleo-citoplasma, comparativamente à situação controlo e às células HL-60AZA incubadas nas mesmas condições. A avaliação dos perfis de metilação e do número de cópias dos genes estudados, não revelou diferenças entre a linha celular HL-60AZA e a linha parental HL-60. No entanto, nas células resistentes observou-se um aumento estatisticamente significativo dos níveis de expressão proteica dos transportadores da família ABC, glicoproteína-P e MRP1, e de MVP e uma tendência para aumento dos níveis de expressão dos genes ABCG2 e UGT1A1. Em conclusão, os resultados sugerem o envolvimento dos transportadores glicoproteína-P, MRP1 e MVP no desenvolvimento de resistência à azacitidina na leucemia mieloide aguda.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais