Optimização dos processos de isolamento e cultura de protoplastos de tamarilho ( Solanum betaceum Cav.)

Palavras-chave: Calo embriogénico,Cultura in vitro,Enzimas hidrolíticas,Explantes embriogenicamente induzidos,Mesófilo,Ploidia,Protoplastos

O tamarilho (Solanum betaceum Cav.) é uma espécie arbórea de pequeno porte, pertencente à família Solanaceae, e que apresenta características económicas, nutricionais e biotecnológicas bastante interessantes. No entanto, as populações naturais desta espécie possuem uma baixa variabilidade genética, a qual não é possível ultrapassar sem a aliança entre as técnicas de manipulação genética e os métodos de melhoramento mais convencionais. Os protoplastos podem assim ser considerados como uma ferramenta importante para o melhoramento desta espécie, na medida em que constituem um passo prévio a várias técnicas de manipulação genética, nomeadamente hibridação somática (por fusão de protoplastos) e transformação genética. Recorrendo ao método “one factor at a time”, analisaram-se os principais factores que afectam tanto o rendimento como a viabilidade dos protoplastos obtidos a partir de diferentes explantes em cultura in vitro de tamarilho. Estes dois parâmetros são influenciados pelo estabilizador osmótico (neste caso em concreto, a sacarose), tipos de enzimas hidrolíticas e sua concentração, temperatura e duração da digestão enzimática e métodos de purificação dos protoplastos. O maior rendimento de protoplastos isolados a partir de explantes foliares foi conseguido através da solução K3 com sacarose a 0,4 M contendo celulase “Onozuka” R-10 a 2% (w/v) e macerozima R-10 a 0,5% (w/v). As condições de incubação enzimática com melhores respostas foram a 27 ºC overnight e 30 ºC durante 6 horas para as linhas diplóide e tetraplóide, respectivamente. A centrifugação por gradiente de densidade a 100 g durante 10 min. com obtenção de uma banda interfásica revelou-se o método de purificação dos protoplastos mais eficiente. Para estimar a viabilidade dos protoplastos recorreu-se ao corante de exclusão Evans blue, registando-se valores de protoplastos viáveis acima dos 50%. No entanto, apesar de a quantidade de protoplastos viáveis por grama de peso fresco ser considerável, ainda não foi possível regenerar plantas a partir de protoplastos colocados em meio de cultura. As condições óptimas para o isolamento e purificação de protoplastos de calli e tecidos embriogenicamente induzidos envolveram a digestão enzimática com a combinação de celulase a 1%, driselase a 0,2% e pectinase a 0,02% (w/v), em solução K3 com sacarose a 0,4 M, durante 20 – 22 horas a 25 ºC (para calo embriogénico) ou overnight a 27 ºC (calo não embriogénico e explantes embriogenicamente induzidos), seguida de purificação por sedimentação dos protoplastos num pellet, quando sujeito a uma centrifugação inicial de 100 g durante 10 min. O desenvolvimento de um protocolo eficiente de isolamento e purificação de protoplastos a partir de diferentes explantes permitiu a avaliação do rendimento possível de obter com a extracção de RNA total e a sua aplicabilidade em futuras análises transcriptómicas de populações específicas de células.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais