Análise experimental da patogenicidade de variações de sequência novas no genoma mitocondrial

Palavras-chave: Genoma humano,Genoma,Mitocôndrias,Doenças mitocondriais,Mutação,Citopatias mitocondriais

As citopatias mitocondriais são um grupo de doenças heterogéneas, causadas por defeitos no sistema mitocondrial de produção de ATP. Este organelo tem o seu próprio genoma (mtDNA) que, quando sofre lesões/mutações, origina subunidades da cadeia respiratória mitocondrial (CRM) anormais, comprometendo o bom funcionamento da fosforilação oxidativa (OXPHOS) e, consequentemente, a síntese de ATP. Assim, é admissível que mutações, em qualquer gene essencial à integridade e funcionamento da CRM, possam causar alterações a nível da estrutura e função mitocondriais. Mutações pontuais no mtDNA incluem as que causam decréscimo na síntese de proteínas mitocondriais e as que afetam alguma das 13 subunidades da CRM, codificadas por aquele genoma. Uma vez que o mtDNA é altamente polimórfico, o significado patogénico de uma nova alteração de sequência detetada, necessita de ser determinado, usando uma série de critérios antes de se poder estabelecer o diagnóstico genético. O objetivo do presente trabalho é avaliar experimentalmente a patogenicidade de 12 novas variações de sequência no mtDNA, detetadas previamente no Laboratório de Bioquímica Genética do Centro de Neurociências e Biologia Celular, da Universidade de Coimbra (Responsável: Professora Doutora Manuela Grazina), em indivíduos portugueses com suspeita de citopatia mitocondrial, no período compreendido entre 1997 e 2010. No sentido de avaliar o impacto das variações de sequência, foram realizados diversos estudos, nomeadamente a verificação da sua ausência em controlos, por sequenciação automática. Foi ainda efetuada a determinação do seu efeito na expressão dos níveis dos transcritos respetivos por PCR em tempo real, na quantidade de proteína, por Western-blot, e na atividade dos complexos da CRM por espectrofotometria, em fibroblastos de cultura. Uma análise prévia in silico demonstrou que 4 das 12 alterações alteram o aminoácido e têm probabilidade de alterar a função da proteína, 2 alteram a estrutura de dois tRNAs e as restantes alteram o codão para outro menos frequentemente usado, no genoma mitocondrial. Os resultados experimentais obtidos no presente trabalho para a alteração m.14771C>A, no gene MT-CYB, que codifica uma subunidade do complexo III da CRM, mostram que, quando comparados com os valores controlo, os níveis do transcrito respetivo estão significativamente diminuídos, por outro lado os níveis da proteína que se encontram ligeiramente diminuídos. No que diz respeito à atividade dos complexos da CRM, verificou-se um aumento significativo na atividade do complexo III, nas células estudadas. É de notar que o presente trabalho representa uma contribuição científica original, dado que permite analisar o impacto das alterações em estudo de uma forma mais detalhada e precisa. Assim, de acordo com os critérios de patogenicidade, podemos concluir que a alteração m.12013G>A é “definitivamente” patogénica, a m.144771C>A obteve uma pontuação que permite atribuir a classificação de “provavelmente” patogénica, e as restantes alterações mantêm a previsão de “potencialmente” patogénicas, até poderem ser efetuados mais estudos.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde