Avaliação da inibição de Metaloproteinases da Matriz como alvo terapêutico em Neoplasias Hematológicas

Palavras-chave: Metaloproteinases da Matriz,Batimastat,Microambiente medular,Neoplasias hematológicas

O microambiente medular sendo o principal suporte da hematopoiese normal, é a estrutura que fornece proteção às células estaminais hematopoiéticas de agressões externas, bem como indicações fisiológicas necessárias à regulação destas células. No entanto, esta estrutura também é importante na formação, sustentação e desenvolvimento de clones neoplásicos. Um dos seus componentes, as metaloproteinases da matriz (MMPs), são enzimas que são responsáveis pela degradação e modulação da matriz extracelular. Estas são enzimas altamente reguladas no organismo e a mais pequena desregulação pode originar um descontrolo dos processos celulares, promovendo a formação de neoplasias. Uma vez que as terapêuticas atuais não são eficazes em todos os doentes com neoplasias hematológicas e as recidivas são frequentes, a inibição das MMPs poderá constituir uma nova abordagem terapêutica para os doentes com estas neoplasias. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial terapêutico do Batimastat (BB- 94), um inibidor das MMPs, em modelos in vitro de neoplasias hematológicas. Para o efeito, foram utilizadas quatro linhas celulares de neoplasias hematológicas, 2 de Leucemia Promielocítica Aguda, sem e com a translocação t(15;17), as células HL-60 e NB-4, respetivamente; 1 de Mieloma Múltiplo, as células H929, e 1 de Síndrome Mielodisplásica, as células F36-P. Primeiro foi determinada a expressão basal das MMPs, por Citometria de Fluxo (CF), com recurso a anticorpos específicos marcados com sondas fluorescentes. As células foram incubadas na ausência e na presença de diferentes concentrações de BB-94, entre 0,1 e 10μM, administrado em toma única ou fraccionada. Para avaliar o efeito deste inibidor na viabilidade e na densidade celular foi usado o teste de exclusão por azul de tripano. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica, após coloração de esfregaços usando o método de May-Grünwald-Giemsa, e por CF, através da dupla marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo. Foi também avaliada a activação de caspases, utilizando a sonda Apostat, bem como o ciclo celular, com recurso a Iodeto de Propídeo, ambos avaliados por CF. Para confirmar a atividade gelatinolítica das MMPs, utilizou-se também o método de zimografia em gelatina, antes e após a incubação com oinibidor. Por fim, verificou-se a influência do inibidor nas vias de sinalização celular, através da expressão das proteínas ERK 1/2 e AKT, por western blot. Os resultados mostram que o BB-94 reduz a viabilidade e a proliferação celular de uma forma dependente do tempo, da dose e das características da linha celular. O IC50 do fármaco, após 48h de exposição é, aproximadamente, 7,5 μM para a linha NB-4, 10 μM para a linha F36-P e entre 7,5 e 10 μM para as linhas celulares HL-60 e H929. Além disso, os resultados sugerem que a administração diária do fármaco é mais eficaz na redução da viabilidade e da proliferação celular quando comparado à mesma dose (total) em administração única. Por outro lado, o efeito citotóxico do BB-94 é mais acentuado na linha celular de LPA que apresenta a translocação t(15;17), e este efeito aparenta ser independente da expressão de MMPs. O BB-94 induz morte celular por apoptose com activação de caspases, de forma dependente da dose. A análise do ciclo celular confirma a atividade anti-proliferativa do fármaco, uma vez que é observado um bloqueio na fase G0/G1 nas células HL-60 e H929, na fase S nas células NB-4 e na fase G2/M nas células F36-P. A zimografia em gelatina confirma a atividade do BB-94, ao ser possível observar-se um bloqueio na atividade gelatinolítica das MMPs diretamente proporcional à dose de fármaco administrada. A análise do western blot indicam que há um aumento da expressão da ERK nas células tratadas com o BB-94, quando comparado com as células sem tratamento, nas linhas celulares HL-60 e F36-P, não se observando diferenças significativas nas linhas NB-4. Por outro lado, o BB-94 induziu um aumento na expressão de AKT nas células HL-60, enquanto nas H929 foi observada uma diminuição, em comparação com o controlo. Em conclusão, estes resultados sugerem que o BB-94 poderá constituir uma potencial e nova abordagem terapêutica no tratamento de neoplasias hematológicas, apresentando um papel importante na regulação das vias de sinalização celular que controlam papéis fundamentais tanto no crescimento e desenvolvimento celular, como no controlo da morte celular. Contudo, a eficácia terapêutica poderá depender do tipo e das características genéticas da neoplasia, bem como do esquema terapêutico utilizado.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais