Avaliação molecular dos mecanismos envolvidos na sensibilidade e resistência ao Imatinib independente do BCR-ABL em leucemia mielóide crónicas

Palavras-chave: Leucemia mielóide crónica,Imatinib,Transportadores de influxo e Efluxo,Novos fármacos dirigidos a alvos moleculares,Moduladores de glicoproteína-P

A Leucemia mielóide crónica (LMC) é uma doença clonal mieloproliferativa que se caracteriza pela presença do gene fusão BCR-ABL. Este gene codifica o alvo terapêutico desta patologia, a oncoproteína BCR-ABL que possui actividade tirosina cinase desregulada. O tratamento de primeira linha em LMC é um inibidor tirosina cinase, o Imatinib, que bloqueia especificamente a actividade da oncoproteína BCR-ABL. Contudo, apesar dos bons resultados obtidos com esta terapêutica são conhecidos casos de resistência, cujos mecanismos moleculares podem ser mediados por múltiplas vias. Além das mutações no gene BCR-ABL, a resistência ao Imatinib pode resultar de alterações nos transportadores de influxo e efluxo, condicionando assim a concentração de fármaco acumulado no interior das células. Além destes factores, a oncoproteína BCR-ABL tem a capacidade de activar múltiplas vias de sinalização celular, que são particularmente responsáveis pelo aumento da capacidade de proliferação e pela resistência à apoptose. Assim, o conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos em todo este processo possibilitará o uso de novos fármacos na LMC. Os objectivos deste trabalho foram avaliar os mecanismos envolvidos na resistência ao Imatinib, em particular o envolvimento dos transportadores de influxo, OCT1 e OCTN2, e de efluxo, P-gP e de BCRP, e o potencial terapêutico do L-744,832 (inibidor da farnesiltransferase), do Everolimus (inibidor do mTOR) e da Reversina 205 (inibidor da P-gP) na modulação da resistência, num modelo in vitro de LMC. Para tal, foi utilizada a linha celular K562, a partir da qual foram geradas duas sublinhas resistentes ao Imatinib, as células K562 RC e K562 RD. Os níveis de expressão dos transportadores membranares, nomeadamente do OCT1, do OCTN2, da P-gP e do BCRP, foram determinados por citometria de fluxo recorrendo a anticorpos marcados com sondas fluorescentes. Através de ensaios de cinética com radiofármacos foi avaliada a actividade funcional da P-gP. De forma a avaliar os efeitos dos diversos fármacos na viabilidade celular, recorreu-se ao ensaio metabólico com resazurina, após as várias Resumo | IV linhas celulares terem sido incubadas na ausência e na presença dos compostos. A morte celular foi avaliada por microscopia óptica (coloração de May-Grünwald-Giemsa), por citometria de fluxo com a dupla marcação anexina V e iodeto de propídeo e pela avaliação dos níveis de expressão de proteínas envolvidas nos processos de morte celular, como a BAX, FAS e as caspases. Nas células resistentes observou-se diminuição dos níveis de expressão de OCT1 e OCNT2, acompanhados por aumento da expressão de P-gP e BCRP comparativamente com as células sensíveis, K562, sugerindo uma contribuição destes transportadores na resistência ao Imatinib. Além disso, e concordante com o resultado anterior, verificou-se uma diminuição na percentagem de captação do radiofármaco em relação ao observado na linha celular sensível. Os ensaios com o L-744,832, o Everolimus e com a Reversina 205, evidenciaram que estes compostos, em monoterapia, têm um efeito maioritariamente citotóxico quer na linha sensível quer nas resistentes, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose. Estes resultados foram confirmados tanto pela microscopia óptica (características morfológicas de apoptose) como pelos níveis de expressão de moléculas mediadoras da apoptose. Adicionalmente, a associação entre os diversos fármacos e o Imatinib revelou um efeito sinergístico, o que sugere que estas associações além de benéficas pela redução da toxicidade dos fármacos, poderão ser úteis para ultrapassar a resistência ao Imatinib. Por outro lado, a Reversina 205 mostrou-se útil na modulação da resistência ao Imatinib, tendo-se observado re-sensibilização das células para este inibidor de tirosina cinase. Em conclusão, os resultados sugerem o envolvimento dos transportadores de influxo e efluxo na aquisição de resistência ao Imatinib, sendo possível re-sensibilizar as células resistentes pela administração simultânea de Imatinib e Reversina 205. Adicionalmente, conclui-se que a utilização de outros inibidores da via de sinalização celular a jusante à da oncoproteína poderá vir a ser uma nova abordagem terapêutica no tratamento de LMC.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais