Análise funcional de maltocinases e trealose sintases/maltocinases bifuncionais

Palavras-chave: Maltocinase,Trealose sintase,Maltose-1-fosfato,Trealose,Função

Foi recentemente descoberta em Mycobacterium tuberculosis uma nova via para a síntese de α-glucanos a partir de trealose, que foi validada a nível genético como um novo alvo promissor para o desenvolvimento de novos fármacos contra a tuberculose. Nesta via intervêm várias enzimas, nomeadamente a trealose sintase (TreS) e a maltocinase (Mak). A unidade transcripcional treS/mak está presente numa grande variedade de procariotas, incluindo apenas um arqueão. Em alguns microrganismos estes genes encontram-se fundidos num só, codificando uma enzima bifuncional, a trealose sintase/maltocinase (TreS/Mak). Foram construídas árvores filogenéticas com sequências de Maks, TreSs e TreS/Maks de diferentes microrganismos de modo a constatarmos a distribuição destas enzimas nos diferentes grupos filogenéticos. A partir de uma destas árvores, foram seleccionadas algumas enzimas Mak e TreS/Mak de microrganismos dos diferentes grupos formados para confirmação da sua função biológica. Efectuou-se seguidamente um estudo funcional das enzimas Mak e TreS/Mak seleccionadas. As sequências de algumas Maks apresentam valores de homologia moderados entre os diferentes organismos e, até à data, nenhuma fusão TreS/Mak foi caracterizada. Os genes mak e treS/mak selecionados foram amplificados, clonados e expressos em E. coli, que não possui actividade de Mak, tendo sido produzidas recombinantemente com sucesso quatro enzimas Mak e uma enzima TreS/Mak bifuncional. Seguidamente, foram realizados ensaios para testar a actividade destas enzimas em extracto, designadamente a sua especificidade para cada um dos substratos potenciais e a possível actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase observada em algumas enzimas com sequências com homologia relevante com Maks e responsáveis pela inactivação de alguns antibióticos desta classe. As enzimas Mak expressas com sucesso apresentaram a actividade esperada em extracto e, dos diferentes aceitadores de grupos fosfato testados, apenas a maltose foi utilizada com eficiência na síntese de maltose-1-fosfato, enquanto que ATP, GTP e UTP foram dadores de fosfato eficientes na síntese daquele metabolito. Nos ensaios efectuados com antibióticos aminoglicosídeos não detectámos actividade, o que indica que as enzimas estudadas não apresentam actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase nas condições testadas. A enzima recombinante TreS/Mak de Pseudomonas fluorescens não apresentou a actividade esperada, isto é, a conversão directa de trealose em maltose-1-fosfato, tendo sido obtido um composto desconhecido como produto. Foram obtidos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) com vista à identificação do composto, tratandose aparentemente de uma hexose bifosforilada. Esta enzima bifuncional utilizou maltose, trealose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose e maltoheptaose na síntese deste composto e apenas ATP foi utilizado como dador de grupos fosfato. Nos ensaios efectuados com antibióticos aminoglicosídeos, também não detectámos actividade, o que sugere que a TreS/Mak de Pseudomonas fluorescens não apresenta actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase. Os resultados obtidos com este trabalho fornecem provas concretas sobre a identidade de maltocinases hipotéticas de vários grupos taxonómicos e servirá como base para trabalhos futuros que visem explorar a evolução não só destas enzimas, como também da via metabólica que canaliza trealose para a síntese de importantes polissacáridos de reserva como o glicogénio, ou com função mais específica, como por exemplo os α-glucanos da cápsula ou os polissacáridos de metilglucose de micobactérias, através de maltose-1-fosfato sintetizada por maltocinases.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais