Pesquisa de marcadores genéticos para a retinopatia diabética pela genotipagem de SNPs em genes candidatos

Palavras-chave: Retinopatia diabética,SNPs,Genotipagem

A Diabetes Mellitus (DM) é uma doença metabólica caracterizada pela hiperglicémia, que a longo prazo leva a complicações que afetam vários órgãos, como os olhos, onde se desenvolve a retinopatia diabética (RD). A RD resulta de uma complicação microvascular da retina que pode culminar em cegueira. Esta doença afeta cada vez mais indivíduos com diabetes em todo o mundo. Em 2011, Portugal continental já registava 34,5% de diabéticos portadores de RD. Para além da hiperglicémia, outros fatores de risco estão envolvidos, nomeadamente a idade de início da diabetes, o estilo de vida e os fatores genéticos do diabético. Numa fase inicial, as lesões associadas à RD podem ser reversíveis, contudo, nessa fase, a doença não apresenta sintomas. A identificação de marcadores genéticos que permitam delinear os diabéticos com suscetibilidade para o desenvolvimento de RD agressiva e de progressão rápida pode constituir a base para a seleção dos indivíduos que necessitam de uma vigilância clínica mais apertada. Em adição, a identificação destes marcadores poderá contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares que acompanham o desenvolvimento da doença podendo contribuir para o aparecimento de novos alvos terapêuticos. O presente estudo teve como objetivo a pesquisa de alterações genéticas, os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), em 307 indivíduos, portugueses, diabéticos do tipo 2 com RD. Tratou-se de um estudo caso-controlo em que os doentes foram classificados em 3 fenótipos diferentes: A - indivíduos com RD não progressiva (grupo controlo), B - indivíduos com RD intermédia entre os fenótipos A e C, e C - indivíduos com RD agressiva e de progressão rápida. Num estudo prévio 200 SNPs foram selecionados a partir de 11 genes candidatos, de forma manual e com recurso a ferramentas bioinformáticas. Destes, 172 foram genotipados pelo sistema TaqMan® OpenArray®, tendo sido verificadas diferenças estatisticamente significativas entre o fenótipo A (controlo) e os fenótipos B e C para alguns SNPs dos genes NOS1, MTHFR, ACE e AGER, associando-os com o desenvolvimento de RD. Neste trabalho foram selecionados 8 SNPs dos 28 que não foram genotipados pelo sistema TaqMan® OpenArray®. Por apresentarem características com maior potencial foram escolhidos os SNPS: NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs8075924, ACE_rs4357, ACE_rs121912703, ACE_rs113110741 e ACE_rs12720744 e para a sua análise foi eleita a técnica Allele-Specific PCR (AS-PCR) com deteção por desnaturação de alta resolução (MeltDoctor). De acordo com os resultados finais, os SNPs NOS1_rs77074921, NOS1_rs76839820, MTHFR_rs72552099, ACE_rs121912703 e ACE_rs113110741 foram monomórficos nos 307 doentes. Para o ACE_rs8075924, foram detetados os 3 genótipos possíveis, mas as frequências alélicas e genotípicas foram distribuídas igualmente pelos 3 fenótipos pelo que não são associáveis com o desenvolvimento da doença. Os ACE_rs4357 e ACE_rs12720744 poderão ser interessantes e estar associados com a progressão da doença, mas estudos adicionais serão necessários para delinear estas eventuais correlações. A genotipagem por AS-PCR foi confirmada por sequenciação de Sanger. Neste processo foram identificados 3 novos SNPs: MTHFR_rs1801131, ACE_rs12720743 e ACE_rs4363. O rs1801131 verificou-se ser um tagged-SNP do rs4846049, estudado por TaqMan® OpenArray®. Os SNPs ACE_rs12720743 e ACE_rs4363, apesar do número de indivíduos estudados ser reduzido, poderão vir a ser interessantes, porque embora sejam intrónicos, o primeiro corresponde a uma deleção presente nas amostras que também apresentam heterozigotia para o ACE_rs12720744, não se registando esta heterozigotia para os indivíduos sem a deleção em ACE_rs12720743, e o segundo porque se situa numa zona de splicing (6 bases afastado do exão) e por isso pode afetar a transcrição e posteriormente a tradução na proteína.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais