Alterações Moleculares e Celulares no Mieloma Múltiplo - Implicações Clínicas e Terapêuticas

Palavras-chave: mieloma múltiplo,gamapatia monoclonal de significado indeterminado,apoptose,epigenética,metilação,resistência,novas terapêuticas,multiple myeloma,monoclonal gammopathy of undetermined significance,apoptosis,epigenetics

O mieloma múltiplo sintomático (MM) é uma discrasia de plasmócitos consistentemente precedida por uma entidade pré-neoplásica, designada gamapatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS), com uma fase intermédia de mieloma múltiplo indolente (MMI). A expressão de moléculas envolvidas na apoptose, no ciclo celular, na angiogénese e na resistência, nos plasmócitos dos doentes com gamapatias monoclonais (GM), assim como o estado de metilação de genes relacionados com estes mecanismos não estão totalmente conhecidos. O nosso objetivo foi analisar e comparar os parâmetros referidos, nos subgrupos de GM, de modo a identificar novos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico, relevantes na etiopatogenia das GM e na progressão de MGUS para MM. Outro objetivo consistiu em avaliar os efeitos de novos fármacos, dirigidos a alvos moleculares e com mecanismos de ação relacionados, em monoterapia e em associação com o bortezomib, numa linha celular de MM. Deste modo, estudámos amostras de medula óssea de 142 doentes com GM ao diagnóstico (62 doentes com MM, 12 com MMI, 68 com MGUS), de cinco doentes com MM em recidiva ou refratário (MMRR) e de 11 controlos não neoplásicos. Avaliámos a expressão de proteínas pró-apoptóticas, BAX, TRAIL, TRAIL-R1, -R2, FAS, FAS Ligando, caspase 3, TNF-α e recetor 1 do TNF-α; proteínas antiapoptóticas, BCL-2, survivina, TRAIL-R3 e -R4; reguladoras do ciclo celular, P53 e ciclina D1; da angiogénese e da inflamação, VEGF, IL-6 e os seus recetores (VEGF-Rec2 e IL-6Rec); conjugados de ubiquitina; NF-κB e proteínas da família ABC, MRP-1 e gp-P, por citometria de fluxo, nos plasmócitos com fenótipos tumoral (CD138+/CD19-) e não tumoral (CD138+/CD19+) de doentes com GM e de controlos. O perfil de metilação das regiões promotoras de genes com funções moduladoras da apoptose (DAPK, recetores do TRAIL, R1, R2, R3 e R4) e reguladoras do ciclo celular (p15, p16 e p53) foi avaliado por PCR específico de metilação (MS-PCR). Analisámos os efeitos citotóxicos e antiproliferativos de novos fármacos (partenolide, elotuzumab, everolimus, silibinina, ácido gambógico, tricostatina A e decitabina), bem como o seu potencial efeito sinérgico com o bortezomib recorrendo a uma linha celular de MM, as células NCI-H929. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste da resazurina; o tipo de morte celular, recorrendo à dupla marcação com anexina V e iodeto de propídeo, e a expressão de caspases ativadas, foram analisados por citometria de fluxo. Os nossos estudos mostram que os plasmócitos CD138+/CD19- dos doentes com GM apresentam, no geral, diminuição da expressão das moléculas pró-apoptóticas, o que pode favorecer a sua resistência à apoptose e contribuir para a mielomagénese. A análise multivariada identificou o aumento da expressão de TRAIL-R2, P53, VEGF-Rec, MRP-1 membranar e gp-P citoplasmática, assim como a redução de ciclina D1 nos plasmócitos CD138+/CD19+, como marcadores com capacidade preditora independente de diagnóstico de GM, podendo estar implicados na sua etiopatogenia.  Nos doentes com MGUS observámos aumento da expressão de TRAIL-R2 e FAS, assim como diminuição de TRAIL–R3 e VEGF nos plasmócitos CD138+/CD19+, relativamente aos tumorais (p<0,05). Nos doentes com MM, verificámos que os plasmócitos CD138+/CD19+ apresentam um aumento da expressão de TRAIL-R3, TNF-α, P53 e NF-κB e uma diminuição da expressão de VEGF, quando comparados com os plasmócitos CD138+/CD19- (p<0,05). Além disso, em análise multivariada, verificámos que a diminuição da expressão de TRAIL-R2, survivina, ciclina D1 e gp-P citoplasmática, bem como o aumento de gp-P membranar nos plasmócitos CD138+/CD19+ de doentes com MM, apresentam potencial discriminatório entre MGUS e MM. Nos plasmócitos CD138+/CD19-, apenas o TRAIL-R2 e o VEGF apresentam esse potencial. Nestes plasmócitos o aumento da expressão de caspase 3 nos doentes com MM foi identificado como um marcador de falência de resposta; a diminuição da expressão de VEGF e o aumento da expressão de FAS, FAS ligando, TRAIL e NF-κB foram associados a benefício na sobrevivência global (SG) e, no caso do NF-κB, também a melhor resposta ao bortezomib, realçando a importância destas moléculas na agressividade e na evolução do MM. Os estudos de metilação mostram que 81% dos doentes com GM apresentam, pelo menos, um gene metilado, e 54% dois genes metilados, dos oito estudados; o TRAIL-R3 é o gene que se encontra mais frequentemente metilado (61%). Não se observaram diferenças entre subgrupos de GM, sugerindo que a metilação anómala, apesar de frequente, não parece ser determinante na progressão de MGUS para MM. Nos doentes com MM, a metilação de TRAIL-R3 foi associada a maior probabilidade de recidiva, sem impacto na SG. Os estudos in vitro para avaliação do potencial terapêutico de novos fármacos dirigidos a alvos moleculares mostram que o everolimus, o partenolide, a silibinina, o ácido gambógico e a decitabina, induzem redução significativa na viabilidade das células NCI-H929, dependente da dose e do tempo, e morte celular predominantemente por apoptose com aumento de caspases. Apenas o partenolide incrementou o efeito citotóxico do bortezomib de forma significativa quando administrados em combinação (p<0,01). Em suma, demonstramos que os plasmócitos não tumorais dos doentes com GM apresentam características moleculares que os diferenciam não apenas dos controlos, mas também dos plasmócitos tumorais destes doentes, parecendo influenciar a etiopatogenia das GM e a progressão de MGUS para MM, enquanto as características moleculares dos plasmócitos tumorais parecem ser mais relevantes na resposta à terapêutica e na sobrevivência. O nosso estudo permitiu a identificação de novos biomarcadores moleculares com potencial diagnóstico e prognóstico nas GM. As análises in vitro mostram que a associação do partenolide com o bortezomib poderá contribuir para ultrapassar as resistências a este fármaco e constituir uma nova estratégia terapêutica em doentes com MM.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde