Purificação e Caracterização de uma Protease do Pólen de Chenopodium sp.

Palavras-chave: Pólenes,Chenopodium sp.,Proteases,Purificação,Caracterização,Permeabilidade transepitelial,Junções intercelulares

Os pólenes de plantas anemófilas são importantes indutores de doenças alérgicas, como a asma e a rinite. O pólen quando é hidratado, para além de libertar uma diversidade de alergénios, liberta também proteases. Estas podem desempenhar um papel relevante na sensibilização alérgica, uma vez que levam à fragilização da barreira epitelial, potenciando o contacto entre os alergénios e células do sistema imunitário. Podem também activar receptores específicos de proteases, que levam, por sua vez, a uma resposta inflamatória através da libertação de citocinas próinflamatórias e do recrutamento de células Th2. Para além disso, as proteases são capazes de clivar moléculas envolvidas na regulação da homeostase pulmonar, o que potencia ainda mais o desenvolvimento de reacções inflamatórias. Vários estudos têm demonstrado que a presença de actividade proteolitica em materiais alergénicos é responsável por potenciar a resposta alérgica. No entanto, poucos são os estudos em pólenes que se focam em purificar e caracterizar as proteases possivelmente responsáveis pelos mecanismos inerentes à sensibilização alérgica. Consequentemente, surge a necessidade de efectuar este tipo de estudo, de modo a poder encontrar possíveis alvos terapêuticos e tentar reduzir o impacto das doenças alérgicas. O pólen da planta Chenopodium sp. possui uma alergenicidade moderada e encontra-se bastante disseminado pela zona mediterrânica. Estudos anteriores conseguiram demonstrar a presença de proteases neste pólen, responsáveis pelo aumento da permeabilidade numa linha celular do epitélio humano (Gaspar, R., 2012). Neste trabalho procedeu-se à purificação da protease maioritariamente responsável por essa actividade, utilizando uma série de processos cromatográficos sequenciais: exclusão molecular, troca iónica e afinidade. Este processo de purificação permitiu isolar parcialmente uma protease de cerca de 60 kDa e de baixo pI . Posteriormente, a protease purificada foi caracterizada através de ensaios de inibição com vários inibidores para as diversas classes proteolíticas conhecidas. O perfil de inibição obtido apresenta maior semelhança com metaloaminopeptidases. Para além disso, este perfil X é semelhante ao obtido anteriormente para o extracto polínico de Chenopodium sp., o que pode indicar que a protease purificada é a principal responsável pela actividade enzimática obtida nesse extracto. Com o objectivo de avaliar o efeito da protease purificada na integridade da barreira epitelial recorreu-se às linhas celulares epiteliais células Calu-3 e MDCK. As células Calu-3 foram utilizadas para ensaios de permeabilidade transepitelial, enquanto que as MDCK foram utilizadas para estudos da degradação dos complexos proteicos intercelulares. A protease purificada não conseguiu induzir nenhum aumento da permeabilidade transepitelial, nem degradar proteinas das junções de oclusão, nomeadamente Claudina-1 e Ocludina. Por outro lado o extracto polínico de Chenopodium sp. continou a exercer um aumento da permeabilidade transepitelial, resultante da disrupção de proteínas constituintes das junções de oclusão. Esta disrupção foi inibida parcialmente na presença de um inibidor de proteases, o que indica que estas enzimas interferem de facto com a integridade da barreira epitelial.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais