Establishment of an in vivo model of human hematopoiesis on a three-dimensional (3D) humanized stroma

Palavras-chave: Medula óssea,Transplante de células estaminais hematopoiéticas

O transplante de células progenitoras/estaminais hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical (SCU) é uma das terapias disponíveis para a clínica e uma área em expansão na investigação. O obstáculo principal da utilização destes progenitores está associado a uma lenta recuperação dos doentes, levando a um aumento no risco de falência do enxerto, incrementando a incidência de mortalidade nestes doentes. Esta limitação pode ser ultrapassada quando os factores que influenciam o sucesso do enxerto de SCU forem conhecidos, sendo crucial o estudo das interacções que ocorrem entre as células progenitoras e o seu ambiente (estroma). Ainda não estão estabelecidos modelos experimentais empregando estromas a 3 dimensões (3D) que criam uma analogia ao complexo sistema que ocorre na medula óssea (MO) para estudos in vitro, sendo crucial o seu desenvolvimento. Neste trabalho procurou-se estabelecer um “nicho” artificial de MO usando um biomaterial - Conduit-TCP (3D), juntamente com células precursoras mesenquimatosas humanas de medula óssea. Estas células foram diferenciadas a estroma utilizando técnicas clássicas de cultivo a longo prazo de medula óssea. Para atingir o objectivo do estudo as células CD34+ de SCU foram cultivadas durante cinco semanas neste “nicho” a 3D, que demonstrou capacidade durante o tempo de cultura de manter em estado imaturo as células progenitoras hematopoiéticas. A produção de colónias (CFU-GM) provenientes destes sistemas é superior à produção de colónias quando comparados com o sistema de cultivo convencional a duas dimensões, contudo não são diferenças significativas. Para complementar a estudos in vitro, desenvolvemos um modelo experimental in vivo de forma a avaliar a capacidade de enxerto das células expandidas neste “nicho” artificial, para tal implantamos subcutaneamente este biomaterial proveniente de cultivos com 4 e 5 semanas em murganhos NOD/SCID (animais imunossuprimidos). Na terceira e sexta semana após o xenotransplante o grupo onde foram implantados os biomateriais com menos tempo de cultivo (4 semanas), apresentavam maior recuperação hematopoiética de células humanas (CD45+). Quando se compara com o grupo standard em que o “nicho” foi construído in vivo, verificamos um maior nível de células humanas CD45+ no sangue periférico nas três semanas pós-transplante e em medula óssea na sexta semana pós-transplante, com regeneração medular mielóide (CD13+) para o grupo experimental. No grupo standard as células CD34+ foram transplantadas 7 semanas após indução in vivo das células mesenquimatosas a estroma em que se verificou maior enxerto de células CD19+ quando as células CD34+ foram transplantadas por via intravenosa, contudo quando subcutaneamente transplantadas esta linhagem linfóide diminuía. Quando finalizadas as 6 semanas foram realizados estudos ex vivo por histologia, imunohistoquímica e imunofluorescência ao biomaterial subcutaneamente implantado e aos fémur dos animais dos diferentes grupos. No caso dos grupos em que foram transplantados com o “nicho” (biomaterial+estroma+célulasCD34+) construído in vitro as células progenitoras hematopoieticas conseguiram migrar (homing) deste sistema para a medula óssea dos animais. Verificou-se regeneração de novo tecido no ConduitTMTCP em que as células mesenquimatosas humanas não só contribuíram para a formação do estroma nestes implantes como também na angiogénese. Um dado muito interessante foi a confirmação de que estas células similarmente as células humanas hematopoiéticas também foram capazes de migrar para a medula óssea murina encontrando-se principalmente na zona endosteal Em resumo, o nicho medular construído in vitro num sistema a 3D permitiu o crescimento, diferenciação e migração das células progenitoras hematopoieticas criando uma analogia ao ambiente da medula óssea humana, o que permitiu a manutenção e proliferação de células hematopoiéticas in vivo e in vitro. Este modelo permite o estudo da hematopoiese normal e patológica e sua relação com o estroma.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde