Papel das antocianinas no contexto da prevenção da aterosclerose: mecanismos moleculares de protecção contra a apoptose e inflamação em células endoteliais

Palavras-chave: Aterosclerose,Antocianinas,Morte celular,Células endoteliais

Actualmente, a aterosclerose é reconhecida como uma doença resultante de uma resposta inflamatória da parede vascular a diferentes formas de lesão. O carácter crónico do processo conduz à formação de lesões na parede arterial ou placas que poderão ocluir o lúmen dos vasos, directamente ou através de complicações trombóticas. No decorrer das últimas duas décadas, diversos alvos moleculares de cascatas inflamatórias foram identificados. Níveis suprafisiológicos de espécies reactivas de oxigénio e de azoto, excedendo a capacidade dos sistemas scavenger celulares, causam stress oxidativo e a activação de mecanismos pró-inflamatórios. Nestas circunstâncias, o anião superóxido produzido reage com o óxido nítrico vascular gerando níveis elevados de peroxinitrito, donde resulta a diminuição drástica do óxido nítrico biodisponível. Para além de ser um poderoso oxidante, o peroxinitrito é, também, um agente nitrante de biomoléculas, particularmente de proteínas, comprometendo a sua função fisiológica. Assim, as espécies reactivas contribuem para a disfunção endotelial e subsequente formação de lesões ateroscleróticas. Neste contexto, estabelecer como alvo espécies altamente reactivas, como o peroxinitrito, constitui uma estratégia promissora na prevenção das doenças cardiovasculares. Os produtos naturais derivados de plantas têm sido uma fonte de moléculas bioactivas para o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios e dentro destas, os polifenóis, um dos principais grupos de metabolitos secundários das plantas de que fazem parte as antocianinas, têm merecido particular interesse. Os frutos e vegetais contêm uma panóplia de compostos benéficos considerados responsáveis pelos seus efeitos protectores contra uma série de patologias crónicas, incluindo as cardiovasculares. O papel das antocianinas na prevenção destas patologias é, de entre os produtos naturais, seguramente dos mais estudados e com mais evidências até à data. A causalidade de tal interesse recai na capacidade destes polifenóis actuarem sobre as principais células implicadas no processo aterosclerótico. É neste contexto que a presente tese encontrou motivação e razão para o seu desenvolvimento. Neste estudo, pretendeu-se, em primeiro lugar, investigar a capacidade de quatro antocianinas de reconhecida prevalência na dieta e com diferentes padrões de substituição no anel B, a cianidina-3-glucósido (Cy3glc), delfinidina-3-glucósido (Dp3glc), a malvidina-3- glucósido (Mv3glc) e a pelargonidina-3-glucósido (Pg3glc), em prevenirem a morte de células endoteliais mediada pelo peroxinitrito, utilizando como modelo experimental células endoteliais da aorta de bovinos (BAEC). Numa primeira fase deste trabalho, demonstrou-se que uma pré-incubação das células endoteliais com as diferentes antocianinas protege as mesmas da lesão oxidativa mediada pela adição de peroxinitrito 500 μM, de uma forma dependente da concentração. A concentração de X antocianina 25 μM foi a seleccionada para os estudos subsequentes, em virtude de proporcionar uma quantidade intracelular mensurável, de acordo com os resultados de análises por HPLC. Ulteriormente, investigaram-se os mecanismos através dos quais as antocianinas conseguem prevenir a morte celular apoptótica induzida pelo peroxinitrito, focando a atenção em vias a montante e a jusante da mitocôndria. Todas as antocianinas testadas impedem o dano celular infligido pelo peroxinitrito interrompendo a via de morte mitocondrial, ao inibirem a actividade das caspases-3 e -9, mas não da caspase-8; diminuem, igualmente, os níveis intracelulares da proteína Bax e inibem ainda a translocação nuclear desta proteína pró-apoptótica, facto demonstrado, pela primeira vez, neste trabalho, em células endoteliais, em consequência do processo de apoptose (Capítulo 2). No Capítulo 3, optou-se por seleccionar apenas uma das antocianias para prosseguir os estudos, considerando o grau de protecção similar manifestado por todas elas. Optou-se pela Mv3glc, tendo em conta a sua prevalência alimentar, as suas características estruturais particulares e, bem assim, a escassez de trabalhos com esta antocianina, quando comparada com as demais. Esclarecidos que estavam os principais aspectos relativos às suas propriedades antioxidantes, direccionou-se então o estudo para o seu papel na inflamação endotelial despoletada pelo peroxinitrito, em vias reconhecidamente implicadas no processo aterogénico. Em concreto, constatámos a capacidade da Mv3glc não só em aumentar a biodisponibilidade do •NO dependente da eNOS, através da fosforilação do Akt, como também em inibir a activação do NF-κB induzida pelo peroxinitrito o que se traduziu na supressão da produção de mediadores pró-inflamatórios como a IL-6, a COX- 2 e a iNOS, em células endoteliais activadas por aquele oxidante. Esta inibição da activação do NF-κB resultou do impedimento da nitração, devida ao peroxinitrito, do inibidor citoplasmático deste factor de transcrição, o IκBα. Confirmou-se, também, que a acção da Mv3glc se exerce ao nível transcricional, ao diminuir os níveis de mRNA da iNOS, aumentando os da eNOS, situação particularmente evidente em células tratadas com peroxinitrito. Por fim, consolidámos os estudos efectuados em células endoteliais isoladas de aortas bovinas, confirmando a transposição dos resultados obtidos para células endoteliais microvasculares de origem humana (HMEC) (Capítulo 4). Procurou-se ainda explorar, neste modelo celular, outras vias de acção da Mv3glc como agente de protecção endotelial, em particular, o seu papel modulador na activação do proteassoma e na produção de heme oxigenase-1 (HO-1) decorrente da activação do factor de transcrição Nrf2, induzidas pelo peroxinitrito. Os resultados alcançados, para além de corroborarem os obtidos até então, consentiram a conclusão de que a Mv3glc permite que seja alcançado um equilíbrio favorável entre os factores de transcrição NF-κB e Nrf2 através, respectivamente, da inibição e da estimulação, de proteínas resultantes da activação de ambos, balanço este crucial para a homeostase vascular. Em concreto, esta acção, por parte da antocianina estudada, parece dever-se a uma inibição não tóxica da actividade proteassómica exacerbada pelo peroxinitrito, traduzindo-se, por um lado, na estabilização citoplasmática do XI NF-κB e por outro, na activação dos sistemas de defesa orquestrados pelo Nrf2, traduzida no aumento dos níveis de HO-1. Conclui-se ainda, que a intervenção da Mv3glc contribui para a diminuição do grau de inflamação e do nível oxidativo do endotélio vascular sob a acção deletéria do peroxinitrito e, consequentemente, para o restabelecimento da homeostasia celular. Globalmente, os resultados apresentados neste trabalho esclarecem e desvendam novos mecanismos celulares implicados na actividade antiapoptótica e anti-inflamatória das antocianinas, expandindo assim, modesta mas convictamente, os nossos conhecimentos acerca dos seus potenciais efeitos protectores vasculares, no contexto da prevenção da disfunção endotelial e da aterosclerose. Reforçam ainda o potencial das antocianinas como moléculas promissoras no desenvolvimento de alimentos funcionais e nutracêuticos direccionados, fundamentalmente, para a normalização da disfunção endotelial.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde