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Preparação e avaliação da atividade anti-inflamatória de novos derivados polifenólicos glicosilados

Palavras-chave: Inflamação,Anti-inflamatórios,Polifenóis,Glicosídeos,Flavonóides,Rutina,Flavanonas

Os compostos polifenólicos glicosilados possuem diversas atividades fisiológicas de grande interesse, entre as quais se destacam a atividade anti-inflamatória. Devido à elevada prevalência e intensidade de seus sinais e sintomas, a inflamação é um dos mais antigos problemas de saúde documentados (ROCK et al., 2010). A inflamação pode ser definida como um mecanismo de resposta à perda de homeostasia tecidual e celular, apresentando papéis fisiológicos como defesa do hospedeiro, remodelação tecidual e regulação do metabolismo (MEDZHITOV et al., 2009). Macrófagos e outras células imunes ativadas por citocinas, produtos microbianos ou ambos, induzem a transcrição da isoforma indutível da enzima sintase do óxido nítrico (iNOS) e consequentemente a produção do mediador pró-inflamatório óxido nítrico (NO) (BOGDAN, 2001). Em células ativadas por lipopolissacarídeo (LPS), a indução da iNOS ocorre principalmente pela via de sinalização intracelular do fator nuclear de transcrição kappa B (NF-kB) (GUZIK et al., 2003). Neste sentido, compostos que têm como alvo intracelular a via de transdução de sinal NF-kB e que interrompem a cascata de produção de mediadores inflamatórios como o NO possuem um elevado potencial anti-inflamatório. O objetivo deste trabalho consiste em preparar novos derivados polifenólicos glicosilados por meio de reações biocatalíticas e estudar a sua atividade anti-inflamatória, nomeadamente na produção de óxido nítrico, induzida por LPS, numa linha celular de macrófagos de ratinho. Dessa forma, esta investigação permitiu identificar a atividade anti-inflamatória das moléculas testadas, e indicar os mecanismos de acção na via do NF-kB ou na produção de NO catalisada pela iNOS. Os novos compostos testados como anti-inflamatórios foram obtidos por semi-síntese a partir dos polifenóis naringina, rutina e polidatina, através de reações de acilação catalisadas por enzimas. A acilação enzimática constitui uma ferramenta poderosa para obter novos derivados de forma regiosseletiva sob condições reacionais suaves. Relativamente à naringina, os seus derivados acilados apresentaram melhor atividade na inibição da produção de óxido nítrico estimulada por LPS em macrófagos. Contrariamente, as acilações da rutina não alteraram significativamente a atividade da mesma. Por outro lado, as experiências realizadas com SNAP, um doador de NO, indicam que a atividade da rutina e derivados decorre de sua capacidade de “captar” NO (atividade antioxidante). As alterações físico-químicas geradas pelas acilações da polidatina, tornaram essas moléculas citotóxicas, sugerindo o seu potencial anti-tumoral, a ser futuramente investigado.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Colesterol oxidase, hormonas sexuais e suscetibilidade à tuberculose : um estudo exploratório

Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis,Tuberculose,Colesterol oxidase,Oxirredutases,Esteróis

A Tuberculose (TB) infecta cerca de um terço da população mundial e é responsável por mais de 1,5 milhões de mortes por ano. O seu agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é facilmente disseminado quando pessoas infetadas tossem e libertam gotículas transportando bacilos que são inalados por pessoas não infetadas. Os obstáculos ao controle da TB manifestamse na dificuldade do tratamento de pacientes em países em desenvolvimento, na sinergia com VIH e doenças crónicas como a diabetes e na emergência de resistências a diversos antibióticos em uso há décadas. A incidência de TB é em média 2-3 vezes mais elevada em homens do que em mulheres (Neyrolles & Quintana-Murci, 2009). Os fatores socioeconómicos e culturais podem criar barreiras no acesso a cuidados de saúde, particularmente nos países em desenvolvimento, levando a um menor número de diagnósticos nas mulheres. No entanto, alguns mecanismos biológicos podem ser responsáveis por uma parte significativa dessa diferença entre sexos. O papel do género foi investigado em algumas doenças infeciosas e não infeciosas, mas há ainda pouca informação sobre a influência biológica do género na TB. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel de hormonas sexuais, estrogénios e seus análogos, na inibição da enzima colesterol oxidase de M. tuberculosis uma enzima considerada crucial para sua a patogénese (Klink et al., 2013). Dos 250 genes anotados em Mtb como envolvidos no metabolismo de lípidos e ácidos gordos (Wipperman et al., 2014) foram selecionados para este trabalho dois genes que codificam proteínas anotadas como sendo responsáveis pela oxidação de colesterol: colesterol oxidase/ChoD (Rv3409c) e colesterol desidrogenase/3ß-HSD (Rv1106c). A função do gene Rv3409c está possivelmente mal anotada, não tendo sido detetada atividade de colesterol oxidase, sendo que o seu substrato fisiológico permanece um mistério. Estudos anteriores concluíram que 3ß-HSD é a única enzima de Mtb que oxida colesterol. Entre vários compostos esteróides testados como possíveis substratos de 3ß-HSD apenas colesterol, 16α- hidroxipregnenolona, pregnenolona e DHEA (desidroepiandrosterona) foram oxidados, mas com eficiência decrescente e apenas finasterida e colestanotriol inibiam ligeiramente a atividade nas condições testadas, e nenhuma das hormonas sexuais testadas inibiu a atividade de 3ß-HSD. Este estudo desvenda novos dados sobre uma enzima essencial ao metabolismo de colesterol em Mtb, o que poderá levar ao desenvolvimento de novas estratégias de intervenção terapêutica, Colesterol Oxidase, Hormonas Sexuais e Suscetibilidade à colocando-nos mais próximos de desvendar novas pistas que possam ajudar a compreender a distribuição desequilibrada de TB entre os géneros masculino e feminino.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Desenvolvimento de uma técnica de HPLC para a quantificação de colistina em plasma humano e a sua monitorização sérica em doentes internados no CHUC

Palavras-chave: Colistina,Farmacologia,Cromatografia líquida de alta pressão,Monitorização medicamentosa,Farmacocinética

A Colistina é um antibiótico catiónico polipeptídico constituído por pelo menos 30 componentes, dos quais se destacam a Colistina A e a Colistina B, e possui 5 grupos amina primários que lhe conferem características básicas. Na prática clínica é administrada como tratamento de última linha para infeções por bactérias Gram-negativo multirresistentes, sob a forma de colistimetato de sódio, um profármaco aniónico e instável, que é rapidamente hidrolisado em Colistina, o metabolito farmacologicamente ativo. Hoje em dia, o desenvolvimento de resistência bacteriana à Colistina é uma realidade, principalmente pelas bactérias Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoneae. Deste modo, é de extrema importância a monitorização terapêutica da Colistina, não só pelo aumento constante das resistências antibacterianas, como também pela toxicidade desencadeada por este fármaco que, desde cedo, suscitou preocupação pelos profissionais de saúde. No Centro Hospitalar da Universidade de Coimbra, E. P. E. (CHUC, E. P. E.), a utilização deste fármaco tem vindo a crescer novamente, sendo que para a sua monitorização no plasma, é necessário recorrer a uma técnica sensível e seletiva, que atualmente ainda não se encontra disponível. O objetivo principal do presente trabalho consistiu em desenvolver e validar uma técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) que quantificasse, com exatidão e precisão, a Colistina em plasma humano, sendo posteriormente utilizada na monitorização sérica do mesmo fármaco em doentes internados no CHUC, E. P. E.. Deste modo, com esta técnica poder-se-á, no futuro, determinar as concentrações séricas de cada doente e a cinética da Colistina para individualizar o seu regime posológico, visando aumentar a eficácia e segurança do tratamento das infeções, ao mesmo tempo que se combate as resistências hospitalares. A separação cromatográfica da Colistina A e B e do padrão interno (PI; cloridrato de anfetamina) foi alcançada em menos de 17 minutos, com recurso a uma coluna C18 de fase reversa a 30°C pela aplicação de um programa de eluição por gradiente utilizando uma fase móvel constituída por acetonitrilo (A) e água ultrapura (B). A deteção foi feita nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 343/500 nm. A curva de calibração foi linear (r2=0,993) na gama de concentrações de 0,09-9,0 μg/mL e o limite de quantificação foi definido como sendo 0,09 μg/mL. A precisão global não ultrapassou os 13,85% e a exatidão variou entre os -3,83 e 14,49%. 14 A técnica de HPLC desenvolvida e apresentada nesta dissertação, permitiu a quantificação da Colistina em amostras plasmáticas de doentes, sem interferência dos fármacos concomitantemente administrados.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio: mestrado em análises clínicas

Palavras-chave: Relatório,Técnicas e métodos de laboratório

O presente relatório refere-se ao estágio realizado no Centro Hospitalar São João do Porto, no âmbito das análises clínicas. O estágio teve como principal objectivo a minha integração no Serviço de Patologia Clínica do hospital, proporcionando-me a aquisição de habilidades práticas na execução das técnicas laboratoriais, sempre associadas a uma aplicação teórica dos conhecimentos adquiridos durante o mestrado, que me permita fazer a avaliação e interpretação dos resultados. As áreas aprofundadas neste relatório são a Bioquímica Clínica e a Imunologia

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio : mestrado em análises clínicas

Palavras-chave: Testes de química clínica,Técnicas de laboratório clínico

Com o presente relatório de estágio realizado, no âmbito do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra, nos Serviços de Patologia Clínica (SPC) do Hospital Sousa Martins – Unidade Local de Saúde (ULS) da Guarda e Centro Hospitalar Médio Tejo (CHMT) – Unidade Hospitalar de Tomar, pretende-se descrever todas as atividades desenvolvidas. Após uma breve introdução às instituições de acolhimento e descrição dos objetivos, será realizada a caracterização do SPC do CHMT, onde tive a oportunidade de colocar em prática, desenvolver e aprofundar, os saberes e conhecimentos adquiridos durante a frequência do mestrado. O Estágio englobou as diferentes áreas laboratoriais, nomeadamente a Hematologia, Microbiologia, Bioquímica e Imunologia. Em termos estruturais, será caracterizada a organização e funcionamento do Serviço, os equipamentos existentes e os princípios das metodologias utilizadas. Serão descritas com maior pormenor as atividades desenvolvidas e parâmetros analíticos executados nas áreas da Microbiologia e Imunologia. Será ainda descrito o controlo de qualidade realizado nestes setores, uma atividade que contribui para garantir que as determinações realizadas sejam credíveis e fiáveis.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio : mestrado em análises clínicas

Palavras-chave: Testes de química clínica,Técnicas de laboratório clínico,Anemia,Tromboembolia venosa,Neoplasias

As complicações associadas ao doente oncológico em tratamento são comuns e preocupantes, exigindo uma gestão e acompanhamento clínico por forma a manter a sustentabilidade e eficácia do plano terapêutico oncológico e a qualidade de vida do doente. A neutropenia febril, a anemia e a trombose estão entre as condições mais prevalentes e exigem particular atenção, por colocarem em risco a vida do doente. O risco de neutropenia febril em doentes sob tratamento oncológico depende de múltiplos fatores como idade do doente, comorbilidades, tipo de tumor e regimes de quimioterapia utilizados. Tendo em conta que em situação de neutropenia as infeções se desenvolvem mais rapidamente, está preconizada a avaliação laboratorial o mais precocemente possível para o esclarecimento das causas para a febre (infeção, a própria doença, fármacos ou trombose venosa profunda). A anemia no doente com cancro é muitas vezes multifatorial e pode ser atribuída às comorbilidades subjacentes ou ao cancro per si, como fator precipitante ou agravante da anemia. O efeito mielossupressor da quimioterapia sobre a medula óssea contribui significativamente para a anemia, assim como a radioterapia. Os doentes com cancro estão em alto risco de desenvolver acidentes tromboembólicos e são também mais suscetíveis a desenvolver complicações relativamente ao tratamento anticoagulante. O cancro, só por si, condiciona um estado pró-trombótico, havendo necessidade comprovada de seguimento do doente com parâmetros laboratoriais. Neste trabalho procura-se desenvolver cada um destes temas na perspetiva de quem trabalha no laboratório, enquadrando as situações e a sua tradução nos resultados laboratoriais.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar S. João, Porto

Palavras-chave: Testes de química clínica,Técnicas de laboratório clínico

O presente relatório de estágio, no âmbito do Mestrado em Análises Clínicas, contém informação relativa às atividades desenvolvidas durante o estágio no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar S. João (CHSJ), decorrido entre 16 de Dezembro de 2015 e 27 de Maio de 2016. Após uma breve introdução sobre o Serviço de Patologia Clínica, apresenta-se uma descrição mais detalhada das áreas de Microbiologia e Hematologia Clínicas: equipamentos, princípios das metodologias utilizadas e abordagem a alguns dos principais parâmetros laboratoriais com o respetivo enquadramento teórico e importância clínica.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio realizado no âmbito do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra

Palavras-chave: Testes de química clínica,Técnicas de laboratório clínico

O presente relatório tem como objetivo expor as atividades desenvolvidas no estágio realizado no serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, integrado no Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. Microbiologia e Hematologia são as áreas laboratoriais descritas mais pormenorizadamente, apesar do estágio ter incluído outras áreas - Bioquímica e Imunologia. Serão abordadas as metodologias utilizadas e a interpretação de resultados, acompanhados de um enquadramento teórico.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Análise comparativa dos perfis morfológicos e de libertação em implantes oculares de acetazolamida praparados por electrospinning

Palavras-chave: Implantes de medicamentos,Acetazolamida,Implantes absorvíveis,Administração oftálmica,Sistemas de libertação de medicamentos,Tecnologia farmacêutica

A deficiência visual que muitas vezes leva à cegueira está entre as doenças que causam maior taxa de morbidade. Os erros refrativos, o glaucoma, as cataratas e as infeções são alguns exemplos. O objetivo deste trabalho é criar um implante biodegradável obtido a partir de fibras coaxiais contendo o fármaco disperso – acetazolamida. O implante será inserido no segmento posterior do globo ocular do doente em contexto de cirurgia de ambulatório e o fármaco será libertado gradualmente, não necessitando de injeções periódicas, ao contrário das injeções intravítreas de esteroides. Durante este trabalho desenvolveram-se, em primeiro lugar, implantes sem revestimento, compostos por membranas fibrosas produzidas por electrospinning e enroladas na forma de pequenos cilindros. O fármaco foi imobilizado no interior das fibras durante a sua preparação, sendo estas fibras compostas por PCL (policaprolactona) e lutrol F127 (poli (oxietileno-b-oxipropileno-b-oxietileno)). Produziram-se fibras com uma estrutura uniaxial (compostas pela mistura de PCL, lutrol F127 e acetazolamida) e com uma estrutura coaxial (com um núcleo de lutrol F127 com acetazolamida e um revestimento de PCL). Os implantes preparados apresentaram uma velocidade de libertação de fármaco muito rápida, o que levou à preparação de novos implantes, incorporando as mesmas formulações que os primeiros, mas com a adição de um filme de revestimento, preparado por solvent casting e composto por PCL e lutrol F127 ou por PCL e luwax EVA 3 (poli (etileno-co-acetato de vinilo)). Os implantes e os seus constituintes (membranas fibrosas e filmes de revestimento) foram caracterizados por várias técnicas, tais como: SEM, FTIR-ATR, análise térmica simultânea e determinação de ângulos de contacto. Adicionalmente, procedeu-se à obtenção dos perfis de libertação in vitro da acetazolamida, em PBS e a 37ºC, utilizando um método espetrofotométrico para quantificar o fármaco libertado ao longo do tempo. Os resultados mostraram que o perfil de libertação da acetazolamida a partir dos implantes com revestimento é consideravelmente mais lenta e gradual, dado que estes sistemas apresentam uma barreira adicional à difusão do fármaco. No caso do revestimento contendo lutrol F127, polímero hidrofílico, ocorreu intumescimento do revestimento diminuindo a taxa de libertação do fármaco. No que se refere ao revestimento contendo luwax EVA 3, polímero hidrofóbico, a sua degradação por erosão permitiu diminuir a taxa de libertação do fármaco.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de Estágio em Análises Clínicas

Palavras-chave: Técnicas e métodos de laboratório

O presente relatório tem como objetivo relatar as atividades desenvolvidas durante o estágio realizado no âmbito do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. O estágio decorreu no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar de São João (CHSJ), no Porto e foi realizado em várias áreas, nomeadamente Microbiologia, Hematologia Laboratorial, Química Clínica e Imunologia. O relatório aborda as áreas de Microbiologia e Hematologia Laboratorial, realçando a importância das diferentes análises, os equipamentos e metodologias utilizadas e a respetiva interpretação e validação dos resultados, referindo a importância da realização do controlo de qualidade. Foi possível integrar uma rotina normal de trabalho aplicando vários conhecimentos e adquirir uma visão global relativamente à aplicabilidade clínica de um laboratório de análises clínicas inserido num hospital de referência como é o CHSJ

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Relatório de estágio : mestrado em análises clínicas

Palavras-chave: Testes de química clínica,Técnicas de laboratório clínico

Este relatório de estágio tem como finalidade descrever a minha experiencia no Laboratório Arunce, na Lousã, desenvolvendo, de um modo geral, todas as valências de um laboratório de análises clínicas, nomeadamente Microbiologia/Parasitologia, Endocrinologia, Imunologia mas destacando e aprofundando as áreas de Hematologia e Bioquímica. Apesar dos inúmeros parâmetros determinados neste laboratório, não são abordados todos, sendo referidos apenas os que são determinados com mais frequência na rotina. Em particular, são discutidos os mais relacionados com as áreas aprofundadas. A componente analítica subjacente aos estudos quantitativos realizados é devidamente descrita em termos das metodologias e fundamentos das técnicas utilizadas na determinação de parâmetros, bem como fundamentação teórica fundamental para a interpretação de resultados.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde
Avaliação da eficácia de desinfetantes e produtos de limpeza de superfícies usados em restaurantes em Portugal em biofilmes de Salmonella enterica

Palavras-chave: Desinfectantes,Salmonella enterica,Biofilmes,Portugal

Salmonella enterica é um microrganismo patogénico com grande expressão a nível mundial, tanto em países em desenvolvimento como industrializados. É responsável por inúmeros surtos de infeções intestinais, e é transmitido através de alimentos, especialmente de origem animal. O intestino de animais constitui o principal reservatório. S. enterica possui a capacidade de formar biofilmes, que lhe permite sobreviver a ambientes adversos. Os biofilmes podem ser encontrados na maioria dos ambientes, inclusivamente nos ambientes de processamento de alimentos, aumentando a probabilidade de contaminação dos mesmos e prejudicando a segurança dos produtos. Além disso, podem provocar outros problemas como bloqueios nas tubagens e degradação dos materiais. Devido à adesão às superfícies, são resistentes face a produtos antimicrobianos, dificultando o processo de limpeza e desinfeção e constituindo uma contínua fonte de contaminação dos alimentos. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a formação de biofilmes de diferentes serotipos de salmonela e diferentes isolados do serotipo Typhimurium, e determinar a sua resistência a desinfetantes, nomeadamente etanol 70 % e hipoclorito 12-16 %, e dois produtos de limpeza de superfícies usados em Portugal em restaurantes, designadamente o DMP-30 e o DLL-B ambos diluídos para 5 % em água estéril. A formação de biofilme foi avaliada recorrendo ao método de cristal de violeta em microplacas de 96 poços, e a relação genética dos isolados de S. Typhimurium foi determinada por electroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os resultados mostraram que a capacidade de formação de biofilme varia não só entre os diferentes serotipos estudados, mas também entre isolados do mesmo serotipo. Quanto à resistência aos produtos testados, observou-se que na generalidade o produto mais eficaz é o hipoclorito 12-16 % e o menos eficaz é o etanol 70 %, embora haja variações consoante as estirpes da bactéria. Além disso, a idade dos biofilmes influencia a eficácia dos desinfetantes. Os biofilmes com maior idade (48 h) parecem apresentar uma maior resistência aos produtos aplicados. O tempo de atuação do desinfetante revelou-se importante, quer com biofilmes de 24 h quer de 48 h. Os produtos foram mais eficazes quando aplicados durante mais tempo (30 min versus 5 min). Os resultados sugerem a necessidade de otimizar um protocolo de avaliação da atuação de desinfetantes em biofilmes de S. enterica.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde