Desenvolvimento de entidades químicas inovadoras para superar o desafio da resistência antimicrobiana

Palavras-chave: química Medicinal,microorganismos multirresistentes,macrociclos tetrapirrólicos,aPDT,biofilmes,medicinal chemistry,multidrug-resistant microorganisms,tetrapyrrolic macrocycles,aPDT,biofilms

O desenvolvimento de novos tratamentos eficazes contra doenças infeciosas constitui um dos maiores desafios da Química Medicinal na atualidade e, certamente, também no futuro. Dada a relevância da problemática mencionada, o objetivo central do trabalho apresentado nesta Tese consiste no design, síntese e desenvolvimento de novas entidades químicas antimicrobianas com mecanismos de ação alternativos, de modo a contribuir para superar este desafio. Neste sentido, o trabalho foi dividido em duas áreas clínicas de intervenção: as infeções tópicas causadas por bactérias e as infeções causadas por protozoários.  No capítulo 1 apresenta-se uma revisão crítica e minuciosa da literatura subjacente aos diferentes tópicos e às famílias de compostos químicos com atividade antimicrobiana abordados nos capítulos seguintes. Adicionalmente, são também apresentados os objetivos do trabalho desenvolvido.  Relativamente ao tratamento de doenças infeciosas provocadas por bactérias, no capítulo 2 descreve-se a síntese de novos fotossensibilizadores que possam ser aplicados numa terapia ativada pela luz (aPDT). O trabalho desenvolvido neste capítulo foca-se em três diferentes famílias: I - macrociclos tetrapirrólicos neutros (sulfonamido-porfirinas e sulfonamido-bacterioclorinas); II - macrociclos tetrapirrólicos catiónicos do tipo imidazolil-porfirinas e III - macrociclos pirrólicos do tipo (sub)ftalocianina. A família I foi baseada em moléculas bimodais, contendo na sua estrutura porfirinas neutras e sulfonamidas, compostos com atividade antibacteriana reconhecida. Neste capítulo descreve-se a síntese seletiva de compostos mono-substituídos e tetra-substituídos derivados da TPFPP por substituição com a metanosulfonamida, em concentrações de reação controladas, assim como as respetivas bacterioclorinas com bons rendimentos (70-90%). A família II centrou-se em fotossensibilizadores porfirínicos catiónicos derivados de 1-metilimidazol. Neste, foram exploradas rotas sintéticas para obter eficientemente meso-tetra-imidazolil-porfirinas simétricas e meso-di-imidazolil-porfirinas não-simétricas, compostos com esqueleto semelhante, mas com diferentes propriedades lipofílicas, pesos moleculares, número e distribuição de carga, cujos efeitos foram avaliados na atividade antibacteriana. No decurso da síntese da porfirina meso-tetra-imidazolil (2.6), foram efetuadas otimizações dos procedimentos sintéticos com recurso ao método por utilização do método de água/Mw, que permitiu diminuir o tempo de reação e aumentar a sustentabilidade do processo tendo-se obtido com bons rendimentos. Realizou-se a cationização de 2.6, tendo obtido a porfirina 2.7 e posteriormente o complexo de zinco (II) 2.8. A porfirina base da família das meso-di-imidazolil-porfirinas não-simétricas 2.9 foi sintetizada mediante uma condensação [2+2], seguida de oxidação, sendo obtida com um rendimento de 19%. De seguida sintetizou-se o complexo de zinco (II) 2.10 e consequente cationização, obtendo-se a porfirina 2.11. A família III foi baseada em ftalocianinas e subftalocianinas, pelo que se começou pela modulação dos precursores de ambos os compostos, ftalonitrilos, com grupos passíveis de serem cationizados. De seguida, procedeu-se à síntese eficiente de metaloftalocianinas de Zn (II) e posteriormente à preparação de subftalocianinas com os mesmos grupos. As subftalocianinas aminadas apresentaram baixa estabilidade química, coeficientes de absorção molar relativamente baixos, sem possibilidade de serem cationizadas. Consequentemente, não se prosseguiu com o desenvolvimento desta família. No capítulo 3, foi feita a caracterização fotofísica e fotoquímica dos compostos sintetizados e foram realizados estudos biológicos em bactérias planctónicas e biofilmes e em células eucarióticas. Os resultados mais promissores foram observados para a família II, observando-se uma boa capacidade de absorção de luz (log ε =5,31-4,29), razoável capacidade formação de ROS (ɸΔ= 0,18-0,75) assim como uma elevada fotoestabilidade (ɸPd= 4x10–5 e 8x10–6 para 2.8 e 2.11, respetivamente). De seguida, realizaram-se estudos de fotoinactivação de bactérias planctónicas, observando-se uma inativação bacteriana extremamente elevada para o fotossensibilizador 2.8, com maior peso molecular, quatro cargas positivas e metal central zinco (II), inativando bactérias de todas as estirpes com 1000 e 100 nM (redução de 7 log10 UFCs). Estes resultados promissores conduziram-nos à realização de estudos em bactérias multirresistentes coletadas de pacientes do Hospital da Universidade de Coimbra. Os graus de inativação obtidos foram elevados, sendo que o PS 2.8 demonstrou capacidade para inativar todas as estirpes usando uma concentração de apenas 1 µM, demonstrando a premissa original de que a aPDT tem potencial para ser aplicada com sucesso em estirpes com resistência aos antibióticos atuais. Deste modo, prosseguimos com a avaliação em biofilmes da estirpe S. aureus ATCC 25925 e, curiosamente, observou-se uma clara inversão dos resultados, sendo que o composto com menor peso molecular e apenas duas cargas, 2.11, apresentou um efeito microbicida praticamente total (6,9 log10) com apenas 5,2 nM de composto. Estudos de microscopia confocal revelaram uma diferença na localização preferencial de cada composto, sendo que o fotossensibilizador 2.8 se localiza maioritariamente na zona planctónica, enquanto que o 2.11 tem a capacidade de difundir para o interior do biofilme, explicando assim a inversão de atividade observada. Adicionalmente, nenhum dos compostos foi tóxico no escuro ou com irradiação em linhas celulares representativas da pele (HDFn – fibroblastos; HaCaT – queratinócitos), nas concentrações utilizadas nos estudos em bactérias planctónicas e biofilmes (5,2 nM-1 µM), tendo apenas sido observada toxicidade em concentrações várias ordens de grandeza acima destes valores. O capítulo 4 descreve a síntese de novos complexos de ferro (II) baseados em carbenos N-heterocíclicos funcionalizados com diversos grupos, com o fim de obter compostos com propriedades anfifílicas distintas com potencial atividade antibacteriana. Para este efeito, desenvolveram-se diversas estratégias sintéticas com vários passos, que conduziram à preparação de complexos de ferro (II) correspondentes a cada pró-ligando (4.6a-e), com rendimentos entre os 68-90%. A atividade antibacteriana destes compostos foi avaliada em estirpes Gram-positivas (Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli), demonstrando um efeito significativo da cadeia lateral do Fe (II) -NHC. O complexo mais lipofílico (4.6b) foi encontrado como sendo o mais ativo contra ambas as estirpes (8 µg/ml).  No capítulo 5 descreve-se o design de chalconas com grupos adequados para possuírem atividade antimalárica, de acordo com a análise de estudos estrutura-atividade previamente descritas. Além disso, desenvolveu-se um processo sintético sustentável alternativo, passível de scale-up (testado até 5g), para a síntese destes compostos, permitindo alcançar valores das métricas de sustentabilidade sem precedentes, obtendo-se um fator-E de apenas 4,2 e um Ecoscale de 72. De seguida, a capacidade destes compostos inibirem a infeção de linhas celulares de Huh-7 hepatócitos por Plasmodium berghei foi avaliada usando um protocolo baseado na medição de bioluminescência desenvolvido no Prudêncio Lab da Universidade de Lisboa. Após realização de uma avaliação preliminar, foram calculados os valores de IC50 para os mais promissores, tendo-se concluído que a chalcona mais ativa na fase hepática foi a 5.12, com um IC50= 1,45 ± 0,04 µM. Esta chalcona apresenta uma potência cerca de 7 vezes superior à da Primaquina®, um dos fármacos utilizados no tratamento da fase hepática.  No capítulo 6 apresentam-se detalhadamente os procedimentos experimentais referentes a todos os capítulos da tese bem como a caracterização química completa de todas as moléculas sintetizadas no decorrer do trabalho.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais