Potencial terapêutico de siRNA anti-FL T3 em neoplasias hematológicas

Palavras-chave: Receptor Flt3,siRNA,Leucemia Mielóide Aguda,Leucemia Mielóide Crónica,Fármacos anticancerígenos convencionais,Inibidores do proteasoma,Inibidores da farnesiltransferase

O cancro, apesar dos progressos conseguidos na sua profilaxia e tratamento, é ainda o responsável por um número elevado de mortes, nomeadamente no mundo ocidental. É uma doença multifactorial em que os genes possuem um papel fundamental. Estes, quando modificados, estimulados ou desreprimidos conferem à célula um fenótipo particular e conduzem ao crescimento desregulado e anárquico e/ou à resistência apoptose. De facto, o desenvolvimento de tumores humanos está associado a alterações genéticas e epigenéticas que determinam um perfil anormal da expressão génica a qual influencia o crescimento, a diferenciação e a morte celular. O receptor Flt3 ("FMS-like tyrosine kinase 3") é um exemplo de um receptor tirosina-cinase (RTK) da família dos RTK tipo III que desempenha uma função importante na sobrevivência, proliferação e diferenciação das células do sistema hematopoiético. A activação constitutiva do receptor Flt3 tem sido descrita em neoplasias hematológicas, conferindo pior prognóstico a estas doenças. É sabido que em cerca de 30% dos casos de Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e 3 a 5% dos casos de Leucemia Mielóide Crónica (LMC), o receptor FLT3 encontra-se mutado (mutação pontual D835 e/ou internas em tandem, ITD), levando à activação constitutiva do mesmo, o que leva à proliferação descontrolada das células, bem como à diminuição da apoptose. O conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nas neoplasias hematológicas tem permitido o desenvolvimento de novos fármacos dirigidos a alvos moleculares, os quais apresentam maior especificidade para a célula tumoral e portanto menor toxicidade. Entre estes é de salientar os inibidores da farnesiltransferase (IFTs), do proteasoma (IPs) e de tirosina-cinases (ITKs) como o Flt3. Uma vez que o receptor Flt3 tem um papel preponderante na LMA e LMC, o silenciamento de genes pode também ser uma potencial abordagem terapêutica nestas neoplasias. Neste sentido, o RNA de interferência (RNAi) é frequentemente utilizado como ferramenta de pesquisa do controlo da expressão de genes específicos, possuindo também, potencialidade terapêutica em inúmeras doenças, nomeadamente em doenças oncológicas. Este trabalho teve como objectivo analisar o potencial terapêutico de um siRNA anti-FLT3 em neoplasias hematológicas, nomeadamente na leucemia mielóide crónica (LMC) e na leucemia mielóide aguda (LMA), em monoterapia e em associação com fármacos anticancerígenos convencionais ou com novos fármacos dirigidos a alvos XIV moleculares. Procurou-se também correlacionar o potencial terapêutico desta estratégia com a presença ou ausência de mutações no gene FLT3. Para o efeito foram utilizadas duas linhas celulares de leucemias mielóides, as células HL-60 (Leucemia Promielocítica Aguda, um subtipo da LMA), e as células K562 (Leucemia Mielóide Crónica em crise blástica). As células foram transfectadas com um siRNA anti-FLT3 isoladamente e em associação com um inibidor do proteasoma, MG-262, um inibidor da farnesiltransferase, L-744,832, e com os fármacos anticancerígenos convencionais, ATRA e Imatinib, nas células HL-60 e K562 respectivamente. Para aumentar a eficácia da transfecção os siRNA anti-FLT3 foram entregues às células utilizando como veículo de transporte um agente de transfecção de base lipídica. Os resultados obtidos mostram que as células HL-60 e K562 não apresentam qualquer tipo de mutação no receptor FLT3. No entanto, verifica-se que o siRNA anti-FLT3 induz, nas células HL-60, diminuição da viabilidade celular, e morte celular por apoptose. Para além deste efeito citotóxico, o siRNA anti-FLT3 induz também, efeito citostático, observando-se após o tratamento diminuição da proliferação celular a qual é acompanhada por ligeira diminuição da expressão da ciclina D1. Nas células K562 observa-se também diminuição da viabilidade celular e aumento da morte celular por apoptose e necrose após o tratamento com o siRNA anti-FLT3. No entanto, nestas células não se verifica qualquer diminuição da proliferação celular. Além disso, após o tratamento com o siRNA anti-FLT3 observou-se diminuição da expressão do receptor em ambas as linhas celulares, demonstrando a eficácia do siRNA utilizado. Por outro lado, o siRNA anti-FLT3 não apresenta qualquer efeito sinergístico quando em associação com o ATRA nas células HL-60. No entanto, nas células K562 o efeito do Imatinib é potenciado quando em associação com o siRNA anti-FLT3. Os resultados evidenciam também que, a associação do siRNA anti-FLT3 com o MG-262 possui efeitos sinergísticos estatisticamente significativos apenas nas células HL-60, observando-se aumento do efeito citotóxico evidenciado pelo aumento da morte celular por apoptose e necrose. Por outro lado, a associação do siRNA anti-FLT3 com o L-744,832 nas células HL-60 e K562, não se mostrou eficaz, uma vez que não se verificou potenciação dos efeitos citotóxicos e/ou citostáticos. XV Embora a presença de mutação no receptor FLT3 seja um factor de pior prognóstico na LMA e LMC em crise blástica, este estudo sugere que a inibição do FLT3 pelo siRNA poderá constituir uma nova abordagem terapêutica nestes doentes mesmo na ausência de qualquer tipo de mutação neste receptor. A associação desta estratégia com fármacos já utilizados na clínica, como o imatinib, ou novos inibidores proteicos específicos, como os que interferem com o proteasoma, revelou-se também promissora. Desta forma a combinação destas terapias poderá ser uma mais-valia no tratamento destas neoplasias, as quais são caracterizadas por uma complexidade de eventos intracelulares, onde múltiplas vias estão comprometidas. O sucesso desta aplicação está também relacionado com o desenvolvimento de vectores de transporte do siRNA mais eficientes, os quais tenham aplicabilidade clínica.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais