Avaliação do perfil de metilação em Síndrome Mielodisplásica – Estudo comparativo entre sangue periférico e medula óssea

Palavras-chave: Síndrome Mielodisplásica,Metilação,Folato/vitaminaB12,Sangue periférico,Medula óssea

A Síndrome Mielodisplásica (SMD) consiste num grupo heterogéneo de doenças clonais da célula estaminal hematopoiética essencialmente caracterizado por displasia morfológica, citopenias periféricas com medula hipercelular, e uma hematopoiese ineficaz resultado de um excesso de apoptose e uma anormal proliferação de blastos na medula óssea. Estes doentes apresentam uma elevada probabilidade de evolução para leucemia aguda, nomeadamente para Leucemia Mieloide Aguda (LMA). A alteração que desencadeia esta doença não é conhecida, mas pensa-se que terá origem numa célula estaminal hematopoiética com elevada suscetibilidade a alterações genéticas e/ou epigenéticas que induzem alterações na proliferação, diferenciação e sobrevivência, culminando na evolução do clone maligno. Os mecanismos envolvidos na patogénese de SMD são ainda, na sua maioria desconhecidos. No entanto, sabe-se que envolvem alterações em genes fundamentais no processo hematopoiético, que regulam a maturação e proliferação celular, o ciclo celular, a reparação do ADN e a apoptose. Um dos mecanismos fortemente associado à patogénese da SMD é a metilação do ADN, que demonstrou ser responsável pelo silenciamento de genes essenciais ao funcionamento celular normal, nomeadamente de genes supressores tumorais, que se sabe estarem transcricionalmente silenciados, em consequência da metilação das suas regiões promotoras. Os padrões de metilação aberrante são mecanismos extremamente comuns nas mais variadas neoplasia humanas, nomeadamente em doenças hematológicas, e sabe-se estarem associados ao início do desenvolvimento tumoral bem como na sua progressão. Os grupos metilos necessários ao processo de metilação podem ter origem em vias metabólicas que envolvem produtos da dieta, nomeadamente o folato e a vitamina B12. Estas vitaminas são elementos chave no metabolismo do carbono, responsável não só pela produção de moléculas necessárias para a síntese e reparação do ADN, mas também pela manutenção dos níveis de S-adenosilmetionina (SAM), o principal dador de grupos metilo endógeno na maioria das reações de metilação, incluído a metilação do ADN.A avaliação do perfil de metilação de ADN pode ser efetuada em diferentes tipos de amostras biológicas, nomeadamente em sangue periférico, medula óssea e tecido tumoral. A utilização de amostras de sangue periférico poderá constituir uma forma nãoinvasiva de análise de marcadores tumorais com elevado potencial clínico, nomeadamente na avaliação do tratamento com agentes hipometilantes. Apesar da avaliação do perfil de metilação em leucócitos do sangue periférico já ser utilizado como marcador tumoral em alguns tumores sólidos, como no cancro colorectal, o seu significado clínico em neoplasias hematológicas permanece desconhecido. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o perfil de metilação de genes supressores tumorais e de recetores de morte em amostras de sangue periférico e de medula óssea de doentes com SMD, relacionando-os com os subtipos e com os grupos de risco. Além disso, avaliámos o envolvimento do folato e da vitamina B12 na metilação do ADN, correlacionando-os com os dados obtidos. Para tal, analisamos o perfil de metilação de genes supressores tumorais (p15, p16, p53, DAPK e MGMT) e de recetores de morte (TRAIL DcR1, TRAIL DcR2, TRAIL DR4 e TRAIL DR5) em ADN genómico de amostras de sangue periférico (SP) e de medula óssea (MO) de 82 doentes com SMD de novo, colhidas aquando do diagnóstico, e de 14 controlos não neoplásicos. A análise foi efetuada após a modificação do ADN genómico pelo método do bissulfito, utilizado a Polymerase Chain Reaction (PCR) especifica de metilação (MS-PCR). Os doentes apresentam uma mediana de idade de 76 anos (22-92), com um ratio Masculino/Feminino de 40/42. Os subtipos segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) são CRDU (n=10), ARSA/CRDM-SA (n=8), CRDU (n=41), AREB-1 (n=5), AREB-2 (n=9), SMD/NMP (n=8) e 5q- (n=1). De acordo com o International Prognostic Scoring System (IPSS) são: baixo (n=12), intermédio-1 (n=42) e intermédio-2 (n=9). Os nossos resultados indicam que 88,6% das amostras de SP e 61,5% das amostras de MO dos doentes com SMD apresentam metilação do gene p15, e que 22,7% das amostras de SP e 21,8% das de MO apresentam metilação do gene p16. O gene DAPK encontra-se metilado em 59,1% das amostras de SP e em 66% das amostras de MO. Os genes TRAIL DcR1 e TRAIL DcR2 apresentam metilação em 11,4% e 18,2% das amostras de SP, e em 8% e 16% das amostras de MO, respetivamente. O gene TRAIL DR4 apresenta-se metilado em 15,9% das amostras de SP e em 24% das de MO. X Por último, 29,5% das amostras de SP e 28% das amostras de MO apresentam metilação do gene TRAIL DR5. Nenhuma das amostras de doentes ou controlos apresentou metilação dos genes p53 e MGMT. De um modo geral, observa-se que 97,7% e 83,3% das amostras de SP e de MO dos doentes, respetivamente, apresentam metilação de pelo menos um gene, e 79,5% e 56,4% apresentam mais de dois genes metilados. Além disso, a metilação dos genes estudados apresentam percentagens elevadas de concordância entre amostras de SP e MO (p15: 72,5%, p16: 77,5%, DAPK: 67,5%, TRAIL DcR1: 85%, TRAIL DcR2: 65%, TRAIL DR4: 62,5%), à exceção do gene TRAIL DR5 (40%). No entanto, apenas os genes DAPK e TRAIL DR5 apresentam resultados significativos (p= 0,04 e p=0,031). Todos os subtipos de SMD apresentam metilação dos vários genes. A metilação do gene p16 encontra-se maioritariamente nos subtipos mais avançados (AREB-1 e AREB-2). Os genes p15 e DAPK encontram-se metilados em todos os subtipos, verificando-se tendência para diminuição muito ligeira com a severidade da doença. A metilação dos genes que codificam os recetores de morte é também comum a todos os subtipos, à exceção do gene TRAIL DR4 cuja metilação foi apenas observada em doentes dos subtipos menos agressivos (CDRU, ARSA e CRDM). Nos grupos do IPSS, verificamos haver metilação em todos os grupos de risco, no entanto, os grupos de risco baixo e intermédio parecem apresentar frequências de metilação ligeiramente superiores às do grupo intermédio-2. A metilação dos genes varia de acordo com os níveis de folato e de vitamina B12, sendo que, de uma forma geral, os doentes com concentrações séricas de folato e de vitamina B12 de altas a elevadas apresentam maiores frequências de metilação. No entanto, este padrão varia entre os vários genes, e com o tipo de amostra em que a metilação foi analisada. Os níveis de 5-metilcitosina (5-mC) são superiores em doentes com SMD (8,4 ± 4,9) (%) quando comparados aos controlos (1,4 ± 0,518). Os níveis de 5-mC variam com a concentração de folato, sendo que diminuem com o aumento da concentração do folato. No entanto, não se verificou uma relação direta entre os níveis de 5-mC e as concentrações de vitamina B12, uma vez que os níveis de 5mC não variam muito nos três grupos de doentes. Assim, concluímos que a metilação aberrante é um evento bastante comum nos doentes com Síndrome Mielodisplásica e pode estar relacionada com os subtipos da doença e com os grupos de risco do IPSS, confirmando o papel da metilação do ADN na patogénese desta doença. Os níveis séricos de folato e de vitamina B12 parecem estar relacionados com o perfil de metilação dos genes estudados, bem como com os níveis de 5-metilcitosina observados nos doentes com SMD. Além disso, existe uma correlação dos padrões de metilação dos vários genes entre as amostras de sangue periférico e as amostras de medula óssea dos doentes com SMD, sugerindo que o sangue periférico poderá eventualmente constituir um marcador periférico do status de metilação em doentes com SMD.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais