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Purificação e caracterização físico-química da protease de Cynara cardunculus L.

Palavras-chave: Protease do cardo - Purificação e caracterização

A flor do cardo (Cynara cardunculus L.) é tradicionalmente utilizada em Portugal no fabrico de queijo. A protease responsável pela actividade coagulante foi isolada a partir de flores secas com um rendimento de 80%, por extracção dos estiletes com citrato de sódio 0,1M pH 3,0 seguida de cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100 e liofilização. A protease migra em PAGE/SDS sob a forma de duas bandas distintas com massa molecular aparente 31000 e 16000 daltons. As duas bandas reagem positivamente à coloração com reagente de Schiff indicando que ambas são glicosiladas após desglicosilação com TFMS as subunidades migram em PAGE/SDS sob a forma de duas bandas com massa molecular de 27500 e 14400 daltons. As subunidades da protease de Cynara cardunculus L. foram isoladas por cromatografia de fase reversa em HPLC e por cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100 na presença de guanidina 6M. A composição em aminoacidos e em hidratos de carbono, a análise do terminal aminico e os mapas petidicos com CNBr, tripsina e protease da estirpe V8 de S. aureus mostraram que a subunidade de 16000 daltons não é um fragmento proteolítico nem um monomero da subunidade de 31000 daltons. A protease é inibida por pepstatina e tem actividade proteolitica a pH acidico; tem o máximo de actividade a 50o C e é activa na presença de ureia, Triton X-100 e de alguns solventes organicos, sendo inibida por SDS e cloreto de guanidina. A protease de Cynara cardunculus L. tem preferencia por ligações peptidicas que envolvam aminoacidos hidrofóbicos clivando preferencialmente ligações do tipo (Phe, Leu, ILe)-(Val, Tyr). Tal como a maioria das restantes enzimas coagulantes a protease de C. cardunculus L. inicia a coagulação do leite por clivagem da ligação Phe105-Met 106 da K-caseína. A actuação desta protease na IgG humana resulta na formação de Fc e F(ab)2 respectivamente a parte efectora do anticorpo e a região que reconhece o antigénio.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Caracterização físico-química e funcional de quelatos metálicos como radiofármacos

Palavras-chave: Quelatos

Radiofármacos são produtos de utilização médica em cuja composição entra um radionuclídeo. Quelatos de radiometais, sejam pequenas moléculas, ou na forma de bioconjugados (como é o caso dos radiopeptídeos ou anticorpos monoclonais), são correntemente utilizados no diagnóstico de uma grande variedade de patologias. >br> Foram estudados ao longo desta dissertação uma série de ligandos poliaza de estrutura linear ou macrocíclica. O nosso estudo incidiu principalmente nos complexos formados entre estes ligandos e os catiões In3+ e Ga3+, devido ao interesse dos radioisótopos 111In, 67Ga e 68Ga em Medicina Nuclear. Todos os trabalhos foram direccionados para a obtenção de relações estrutura/actividade biológica para os quelatos estudados. De facto, existe uma relação estreita entre propriedades fisico-químicas dos quelatos e a sua biodistribuição e eliminação do organismo, sendo de realçar a carga efectiva do quelato, o modo como essa carga está distribuída no complexo, o carácter lipofílico/hidrofílico, o grau de protonação a pH fisiológico, a capacidade de ligação a proteínas, entre tantas outras. Assim, aos estudo estruturais por espectroscopia de RMN (Ressonância Magnética Nuclear) em solução aquosa de uma série de quelatos de Ga3+ e In3+, seguiu-se a avaliação da sua distribuição in vivo recorrendo aos compostos radiomarcados e a modelos animais.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Efeitos bioquímicos de fármacos anticancerígenos em células humanas com características leucémicas: estudo em linhas celulares linfoblásticas

Palavras-chave: Fármacos anticancerígenos,Linhas celulares linfoblásticas,Leucemia

Neste trabalho foram estudados os efeitos de diferentes tipos de fármacos anticancerígenos a nível de alguns parâmetros bioquímicos e morfológicos de linfócitos-T leucémicos humanos em cultura, utilizando como modelos experimentais duas linhas celulares designadas CCRF-CEM e Jurkat. Analisou-se, em particular, a influência dos fármacos a nível de alguns mecanismos de transdução de sinais transmembranares relacionados com o controlo da proliferação celular. Foram seleccionados para este estudo seis agentes farmacológicos actualmente com aplicação clínica no tratamento de leucemias linfoblásticas agudas, nomeadamente, os compostos metotrexato (MTX), adriamicina (ADR), daunorubicina (DNR), vincristina (VCR), 6-mercaptopurina (6MP) e prednisolona (PRD). Os efeitos antiproliferativos e citotóxicos dos diversos fármacos foram avaliados com base na medição simultânea de diferentes parâmetros indicadores de proliferação e viabilidade celulares, incluindo o efeito dos compostos a nível do ciclo celular. No sentido de analisar a importância de mecanismos de transdução de sinais transmembranares para a determinação dos efeitos antiproliferativos e/ou citotóxicos dos fármacos em linfócitos leucémicos, estudou-se a acção destes agentes a nível de mecanismos de regulação do metabolismo de fosfoinositóis e da concentração de Ca2+ livre intracelular ([Ca2+]i). As perturbações da homeostase do Ca2+ em células previamente tratadas com MTX, DNR e VCR estimuladas através do complexo receptor de antigénio/CD3 (TCR/CD3) poderão representar uma fase inicial na sequência de alterações celulares conducentes à inibição do crescimento dos linfócitos leucémicos pelos referidos agentes. Foi também avaliado o papel de fenómenos de apoptose como mecanismo de indução de morte dos linfócitos leucémicos por acção dos fármacos anticancerígenos. O MTX, a DNR, a ADR e a VCR induzem um conjunto de alterações morfológicas e bioquímicas em linfócitos CCRF-CEM e Jurkat compatíveis com um processo comum de indução de morte celular por apoptose. O comportamento diferencial dos linfócitos CCRF-CEM e Jurkat face aos mesmos agentes anticancerígenos sugere que factores específicos da própria célula contribuem para a determinação do mecanismo de acção de agentes quimioterapêuticos apontando, por conseguinte, para uma participação activa da célula na iniciação da sua própria morte.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Estudo do efeito de insecticidas de uso comum na bioenergética mitocondrial

Palavras-chave: Insecticidas,Mitocôndria

A falta de selectividade dos insecticidas torna-os tóxicos para espécies úteis e para o próprio Homem. Os efeitos destes compostos não estão ainda devidamente esclarecidos, em particular os relacionados com mecanismos responsáveis pela toxicidade crónica induzida pelo contacto frequente com doses substanciais, embora não letais, ou pela exposição, durante largos períodos de tempo, a quantidades diminutas do composto. Estudos prévios demonstraram que certos insecticidas podem afectar o metabolismo mitocondrial. Contudo, esses estudos são escassos e frequentemente contraditórios nas suas conclusões. Em virtude da reconhecida importância da mitocôndria no metabolismo energético celular, desenvolvemos estudos visando o estabelecimento de relações de toxicidade de insecticidas de uso comum em mecanismos bioenergéticos básicos de mitocôndrias isoladas do fígado do rato. Em particular, foram estudados os efeitos de insecticidas pertencentes a 3 dos 4 grandes grupos químicos nos quais estes compostos vulgarmente são agrupados: DDT (organoclorados); paratião e malatião (organofosforados); carbaril (carbamatos). O DDT afecta a capacidade fosforilativa das mitocôndrias. A diminuição da eficiência fosforilativa resulta da acção do insecticida na cadeia respiratória, na ATP-sintetase e no transportador mitocondrial do fosfato. Aparentemente, o DDT interfere com circuitos protónicos localizados responsáveis pela transferência de energia para a ATP-sintetase, em particular ao nível do sistema constituído pelo transportador de nucleótidos/ATP-sintetase. O malatião não afecta as funções mitocondriais. Pelo contrário, o paratião afecta a capacidade fosforilativa das mitocôndrias devido a acções do insecticida ao nível da desidrogenase do succinato, da ATP-sintetase e do transportador de fosfato. O carbaril não afecta a capacidade fosforilativa das mitocôndrias. Não obstante, o insecticida diminui a capacidade oxidativa das mitocôndrias. Esta acção do carbaril diminui a velocidade de síntese do ATP ocasionando uma diminuição efectiva da capacidade de resposta das mitocôndrias às exigências energéticas da célula.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Mecanismos de neurossecreção : transporte do ácido gama - aminobutírico

Palavras-chave: Neurotransmissores,GABA,Sinoptossomas

O ácido y-aminobutírico (GABA) é o neurotransmissor de inibição mais abundante no sistema nervoso central dos mamíferos desempenhando um papel importante na farmacologia do stress e da ansiedade. Porém, a compartimentação e a origem (citoplasmática ou vesicular) do GABA libertado por despolarização não estão claramente esclarecidos. O GABA tritiado [3H]GABA adicionado exogenamente aos sinaptossomas isolados do cortéx cerebral do carneiro é acumulado em dois compartimentos diferentes que correspondem respectivamente aos espaços citoplasmático e vesicular. O [3H]GABA do compartimento citoplasmático é libertado, na ausência de Ca2+, quando o potencial electroquímico do Na+ é colapsado (por K+ ou ubaína) e troca com o composto análogo do GABA, o ácido diaminobutírico (DABA). Pelo contrário, o GABA acumulado no compartimento vesicular é libertado por despolarização com K+ na presença de Ca2+ e não troca com o DABA. A libertação de GABA independente de Ca2+, induzida por K+ ou por ubaína, depende de Na+ e ocorre pela inversão do transportador de GABA da membrana plasmática. A libertação dependente de Ca2+ não depende de Na+ e representa a exocitose das vesículas sinápticas. A despolarização da membrana plasmática parece ser um requisito absoluto para os mecanismos de libertação de GABA dependente e independente de Ca2+. Os bloqueadores dos canais de Ca2+ inibem os movimentos de Ca2+ e a libertação de GABA induzida por despolarização com K+ na ausência e na presença de Ca2+. Porém, a inibição de ambos os mecanismos só é observada por concentrações relativamente elevadas dos bloqueadores o que sugere que os seus efeitos não são mediados pela ligação de alta afinidade das drogas à membrana plasmática.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Função da proteína portal na encapsidação do DNA pelo bacteriofago SPP1 : evolução de um paradoxo funcional para um paradoxo estrutural

Palavras-chave: Encapsidação do DNA-Bacteriófago SPP1

SPP1 é um bacteriófago virulento de Bacillus subtilis que encapsida o DNA por um mecanismo de cabeça cheia (Streisinger et al., 1967, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 57, pp. 292-295; Tye et al. 1974, J. Mol. Biol., v. 85, pp. 501-532; Morelli et al., 1979, Mol. Gen. Genet., v. 168, pp. 153-164). De acordo com esta estratégia, após uma quantidade determinada de DNA estar presente no interior do pré-capsídeo viral, a molécula de DNA é clivada de forma inespecífica. Este corte define a dimensão do cromossoma viral maduro. A caracterização de diversos mutantes SPP1 siz, que encapsidam quantidades de DNA inferiores às da estirpe selvagem do fago, permitiu identificar o cistrão (gene 6) que codifica uma proteína (pg6) envolvida no dimensionamento do DNA maduro. As diversas versões do gene foram clonadas e sequenciadas permitindo relacionar três resíduos diferentes do pg6 com este processo. O facto de todas as substituições de aminoácidos conducentes ao fenótipo siz implicarem uma redução no carácter acídico do pg6 poderá indicar que a carga de resíduos-chave daquele desempenha um papel importante no dimensionamento do DNA encapsidado. O pg6 foi purificado. A observação ao microscópio electrónico da proteína revelou a presença de uma estrutura em forma de roda dentada com treze lóbulos que apresenta um poro interno electrodenso nas perspectivas de topo. Esta morfologia particular é associada a uma função do pg6 na translocação do DNA para o interior do pré-capsídeo fágico. O homo-oligómero possui 13 subunidades do pg6, constituindo a primeira proteína descrita com simetria redecamérica. Esta é um componente estrutural minoritário do bacteriófago localizado na conecção cabeça-cauda. As propriedades descritas permitiram identificar o pg6 como o polipeptídeo de SPP1 análogo às proteínas do vértice portal descritas para outros bacteriófagos ([[lambda]], T3, T4, P22, [[??]]29) (Bazinet e King, 1985, Annu. Rev. Microbiol., v. 39, pp. 109-129).

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Efeito da fonte de carbono e da concentração de solutos na acumulação intracelular de polióis em Debaryomyces hansenu, Candida famata, Psichia farinosa e Geotrichum candidum

Palavras-chave: Osmoregulação,Leveduras xerotolerantes,Solutos compatíveis,Polióis,Microbiologia

A maior parte das leveduras e dos fungos filamentosos, quando em situações de agressão osmótica, acumulam, como substâncias osmorregu-ladoras, polióis. A acumulação intracelular destes alcoóis está relacionada com a fase de crescimento e é proporcional à concentração externa de solutos osmoticamente activos, iónicos ou não iónicos. Nas leveduras Debaryomyces hansenii, Candida famata e Pichia farinosa, o glicerol é a substância osmorreguladora (soluto compatível) principal. Em meios em que é usada glicose, como fonte de carbono, as concentrações mais elevadas deste poliol ocorrem durante a fase exponencial de crescimento. O arabitol é acumulado em concentrações significativas, apenas durante a fase estacionária. Nestas leveduras a substituição da glicose por eritritol nos meios de cultura com NaCl 1 M conduz à acumulação deste poliol, durante a fase exponencial, em níveis comparáveis aos do glicerol em meio com glicose. Este facto demonstra que, nestas leveduras, o glicerol pode ser substituido nas suas funções de soluto compatível, por eritritol, quando este poliol é fornecido exogenamente. No fungo leveduriforme Geotrichum candidum, é o arabitol que desempenha o papel de soluto compatível principal, sendo acumulado durante a fase exponencial de crescimento em meios com glicose, em resposta à diminuição da actividade da água no meio. Durante a fase estacionária, observa-se a acumulação intracelular de manitol. Neste fungo, o glicerol não é acumulado nas células, quando este poliol é utilizado como fonte única de carbono. Nestas condições, o arabitol continua a ser acumulado em resposta ao aumento da concentração de NaCl no meio, desempenhando, assim, as funções de substância osmorreguladora principal.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Optimização de complexos lipossoma catiónico-ADN para transfecção de células neuronais

Palavras-chave: Lipossoma catiónico

O transporte e cedência intracelulares de genes e oligonucleotídeos é hoje considerado uma promissora estratégia terapêutica para o tratamento das doenças do sistema nervoso central (SNC), dado que as estratégias convencionais se têm revelado pouco eficazes. A aplicação bem sucedida desta metodologia passa pela concepção de veículos específicos para o transporte do material genético para as células alvo, de modo a que aí se possam verificar níveis adequados de expressão génica. Este projecto visou, fundamentalmente, desenvolver vectores não virais do tipo lipossómico, para um transporte e cedência eficazes de genes em células neuronais em cultura e in vivo. O nosso objectivo consistiu, especificamente, na promoção da internalização celular mediada por receptores dos complexos ternários – lipossoma catiónico/ADN/transferrina (lipoplexos-Tf) – e em garantir uma maior eficácia na cedência intracelular do material genético. Foi ainda nosso objectivo contribuir para o esclarecimento dos mecanismos pelos quais os lipoplexos cedem ADN ao citoplasma, realizando estudos sistemáticos de associação celular. Visando a utilização destes sistemas no tratamento de doenças do SNC, propusemo-nos testar estas estratégias na transfecção de células neuronais, incluindo o transporte de potenciais genes terapêuticos em modelo animal de lesão neuronal. A associação de Tf aos lipoplexos mostrou ser eficaz na potenciação da actividade e eficiência de transfecção das células neuronais, quer in vitro, quer in vivo após administração estereotáxica no estriado de ratos Wistar. A administração in vivo do plasmídeo codificando para o factor de crescimento neuronal (NGF), mediada por lipoplexos-Tf, revelou-se eficaz na diminuição da lesão excitotóxica causada pela injecção intraestriatal de ácido caínico, sugerindo que estes sistemas constituem uma estratégia promissora para a prevenção e/ou recuperação da degeneração neuronal.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Caracterização da flora vascular e do padrão e dinâmica da paisagem na Serra do Caramulo : análise do estado de conservação de taxa prioritários

Palavras-chave: Flora vascular -- Serra do Caramulo

A gestão do território e dos recursos naturais requer dados actualizados sobre a biodiversidade, raridade e alteração da cobertura do solo. Com o propósito de facultar esta informação biológica, estudou-se, na Serra do Caramulo, especificamente, a diversidade da flora vascular, a alteração do padrão da paisagem e o estado de conservação de taxa prioritários da flora vascular.  Foram herborizados e/ou reunidas citações bibliográficas e de herbário de 681 taxa, pertencentes a 383 géneros e agrupados em 102 famílias. Descreveu-se, também, um novo híbrido para a ciência, Narcissus x caramulensis P. Ribeiro, Paiva e Freitas. Alguns taxa constituem novidades fitogeográficas para Portugal e para as províncias da Beira Alta e Beira Litoral. De acordo com a bibliografia consultada, 5 taxa são endémicos de Portugal e 64 são endemismos ibéricos. A Serra contém 79 taxa introduzidos, 9 dos quais considerados invasores segundo a legislação nacional.  As alterações na cobertura do solo, entre 1990 e 2004, para a área da Serra do Caramulo acima dos 400 metros, consistiram, sobretudo, num grande aumento da extensão dos eucaliptais e numa acentuada diminuição, por fragmentação, das folhosas e resinosas. A paisagem tornou-se muito fragmentada durante o período estudado. Os factores socioeconómicos podem explicar grande parte desta dinâmica.   Tendo em conta a localização dos taxa prioritários na área de estudo, a sua ocorrência nos diferentes habitats, o número e tamanho dos grupos de indivíduos e as ameaças a que estão sujeitos, definiram-se prioridades, apresentaram-se estratégias de conservação e identificaram-se as áreas mais importantes para a protecção desses taxa.  Construiu-se, ainda, uma base de dados gráfica, integrando informação considerada útil para as autarquias locais, a fim de apoiar acções conservacionistas e promover o planeamento e a gestão da área num contexto sustentável.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Secreção diferencial nas células cromafins: relação com características da maquinaria exocitótica

Palavras-chave: Catecolaminas,Exocitose,Sintaxina,SNAP-25

Neste trabalho utilizámos as células cromafins em cultura para estudar a regulação da secreção das catecolaminas (CA) e da Leu-encefalina (Leu-Enk). Os estudos realizados com a (w-agatoxina IVA (w-Aga) permitiram esclarecer a participação de canais de Ca2+ do tipo P na exocitose nas células cromafins. A inibição da secreção pela w-Aga apresentou dois componentes com valores de IC50 que estão de acordo com as afinidades da toxina a bloquear os canais P e Q noutros sistemas. Além disso, a aditividade dos efeitos de uma baixa concentração de w-Aga e da w-conotoxina MVIIC, numa dose que inibe maximamente os canais Q, corrobora a hipótese das duas toxinas estarem a actuar em locais diferentes. A contribuição dos canais P para a secreção foi maior a baixas intensidades de estimulação. Para investigar se a libertação de diferentes transmissores químicos presentes nas células cromafins pode ser diferencialmente regulada, determinámos paralelamente a libertação de Adr e Leu-Enk em diferentes condições de estimulação. A libertação de Adr necessitou menores despolarizações e teve uma cinética mais rápida que a libertação de Leu-Enk. Ensaios com células permeabilizadas mostraram ainda diferenças significativas nas concentrações de Ca2+ às quais se registou a libertação máxima de Leu-Enk, Adr e NA. Em conjunto os resultados sugerem que as células cromafins têm uma população heterogénea de grânulos cromafins disponíveis para serem libertados, e que a libertação de CA e dos neuropeptídeos co-armazenados pode ser diferencialmente regulada. Para determinar se as diferenças na secreção nos dois tipos de células cromafins estão relacionadas com diferenças na maquinaria exocitótica recorremos às toxinas do botulismo (BoNT). A libertação de NA exibiu uma maior sensibilidade à clivagem da SNAP-25 e da sintaxina 1 pela BoNT/A e BoNT/C1. Estudos de imunocitoquímica revelaram que as células noradrenérgicas, mais afectadas pela BoNT/C1, expressam maiores quantidades sintaxina 1A e 1B enquanto que a SNAP-25 não apresentou diferenças significativas de expressão nos dois tipos de células. Estes resultados sugerem que as diferenças observadas na secreção nas células noradrenérgicas e adrenérgicas se podem relacionar com características da maquinaria exocitótica dos dois tipos de células.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais
Nanopartículas como potenciais agentes de contraste para imagem de ressonância magnética : caracterização físico-química de polioxometalatos (POMs) contendo iões lantanídeos (III) e suas nanopartículas revestidas de sílica

Palavras-chave: Lantanídeos,Nanopartículas,Polioxometalates,Ressonância magnética

Foram sintetizados Polioxometalatos (POMs) contendo diferentes iões lantanídeos (III) do tipo Lindqvist e também nanopartículas revestidas com sílica e contendo POMs de diferentes iões lantanídeos (III). As termogravimetrias permitiram verificar o número de moléculas de água de hidratação nos POMS e através de técnicas como a espectroscopia de infravermelhos (IV) foi possível comprovar a correcta estrutura lacunar Lindqvist de todos os POMs. Posteriores análises através de microscopia electrónica de transmissão e varrimento revelaram a estrutura em tipo “core-shell” das nanopartículas contendo estes POMs embora bastante aglomeradas. Os dados de potencial zeta e dispersão dinâmica da luz permitiram concluir que os POMs foram correctamente internalizados nestas nanopartículas e revestidos por SiO2, apresentando populações de nanopartículas com POMs contendo diferentes iões lantanídeos que se podem assumir homogéneas. Os estudos de relaxividade a campo baixo (20 MHz ) e campo alto (500 MHz) permitiram avaliar a sua eficácia como potenciais agentes de contraste para Imagem de Ressonância Magnética (IRM).

Área científica: Ciências Exactas e Naturais