Neuronal changes under excitotoxic conditions: the role of 26S proteasome

Palavras-chave: Isquemia cerebral,Neurónios,Glucose,Oxigénio

Os neurónios são um tipo celular altamente especializado e em condições fisiológicas normais a transmissão sináptica está envolvida em processos homeostáticos essenciais, nomeadamente em fenómenos de aprendizagem e memória. No entanto, durante um episódio isquémico os níveis de ATP decrescem para níveis abaixo do limiar necessário para os neurónios manterem os seus gradientes iónicos. Como resultado, o neurotransmissor glutamato é massivamente libertado e acumulado no espaço extracelular. O excessivo influxo de Ca2+ para a célula pós-sináptica devido à sobreactivação dos receptores do glutamato é responsável por iniciar diversas cascadas responsáveis por induzir morte celular. Em condições fisiológicas normais o sistema ubiquitina-proteossoma (UPS) é responsável pela reciclagem de numerosas proteínas, assim como pela degradação de proteínas danificadas. O UPS é o principal sistema de proteólise intracelular em células eucarióticas. Antes de as proteínas serem degradadas no UPS são primeiro marcadas com quatro (ou mais) ubiquitinas, por acção de ligases de ubiquitina (E3), sendo posteriormente enviadas para degradação no proteossoma 26S, um grande complexo dependente de energia composto por uma subunidade reguladora (19S) e por uma subunidade catalítica (20S). Tem sido demonstrado em diversos modelos de isquémia transiente global que o proteossoma 26S é desmontado nas suas subunidades constituintes, 19S e 20S, sugerindo o seu comprometimento após isquemia. Tendo em conta o papel desempenhado pela activação excessiva dos receptores do glutamato na morte neuronal na isquemia cerebral, neste trabalho foi estudado o efeito da excitotoxicidade na actividade do proteossoma em culturas de neurónios do hipocampo. Verificou-se uma redução transitória da actividade de quimiotripsina do RESUMO 2 proteossoma, em cerca de 50%, 4 h após uma breve estimulação com glutamato (125 μM, 20min), tendo-se observado uma redução da viabilidade celular nas mesmas condições experimentais. A inibição do proteossoma em neurónios do hipocampo submetidos a condições de excitotoxicidade foi confirmada usando um repórter de actividade do proteossoma UbG76V-GFP. Foi observada um aumento de cerca de 2.67 vezes na acumulação de UbG76V-GFP em neurónios expostos a condições de excitotoxicidade quando comparado com o controlo. Ao contrário do estímulo excitotóxico que reduziu a actividade do proteossoma e induziu morte celular num período de 4 h após a lesão, a incubação dos neurónios do hipocampo com o inibidor do proteossoma MG132 durante 5 h não teve qualquer efeito sobre a viabilidade celular. Só foi observada morte celular em resposta a incubações prolongadas (superiores a 8 h) com 0.05 μM e 1 μM do inibidor do proteossoma β-lactona. Estes resultados sugerem que a inibição do proteossoma não desempenha um papel relevante na morte neuronal em condições de excitotoxicidade. Neste trabalho estabelecemos ainda um protocolo para OGD em culturas de neurónios corticais. Foi observado um aumento da morte celular em cerca de 13,8% após um período de OGD de 2 h, seguido da incubação em meio de cultura condicionado, durante 12 h. Demonstrámos ainda a formação rápida de produtos de clivagem da proteína do citoesqueleto α-espectrina, com 145 e 150 kDa, 30min após o estímulo de OGD. A formação destes fragmentos sugere que as calpaínas são activadas rapidamente após a lesão isquémica in vitro. No conjunto, estes resultados sugerem que em condições excitotóxicas, características da isquemia cerebral por exemplo, ocorrem alterações bioquímicas que levam à desregulação do proteossoma e que, durante OGD há clivagem de proteínas do citoesqueleto que sugerem uma activação rápida das calpaínas. A prevenção de todas RESUMO 3 estas alterações bioquímicas pode ser encarada com uma potencial estratégia neuroprotectora que valerá a pena ser explorada.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde