Ensaios de embriogénese somática e transformação genética em tamarilho (Cyphomandra betacea [Cav.] Sendt.)

Palavras-chave: Agrobacteirum tumefaciens,Calo embriogénico,Plantas tetraplóides,Suspensões celulares,Segmentos internodais,Agrobacterium tumenafiens,cell suspension culture,embriogenic callus,internodal stem segments,tetraploid plants

O tamarilho (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt sin. Solanum betaceum), pertencente à família das solanáceas, é uma árvore que produz frutos comestíveis com elevado valor nutricional. Alguns estudos têm mostrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos particulares da morfogénese in vitro, particularmente a embriogénese somática (ES). A ES tem demostrado ser uma importante ferramenta na biotecnologia com um grande potencial para a rápida propagação de clones em larga-escala. Além disso, os procedimentos de transformação genética e criopreservação de muitas espécies vegetais, baseiam-se em protocolos eficazes de ES. Uma das formas de induzir ES no tamarilho consiste um processo em duas fases, no qual células embriogénicas são inicialmente induzidas num meio de cultura suplementado com uma auxina (fase de indução) e depois após a sua transferência para um meio de cultura desprovido de auxinas, desenvolvem-se embriões somáticos (fase de desenvolvimento). Vários tipos de explantes, com origem em material adulto ou previamente estabelecido in vitro, e várias condições de indução, têm sido testados para optimizar a resposta do tamarilho à indução de ES. Para superar o reduzido potencial de ES nos tecidos adultos, neste trabalho seguiu-se uma abordagem indirecta, na qual os rebentos de uma árvore adulta foram, primeiramente, estabelecidos in vitro, e uma abordagem directa, na qual se induziu ES em secções do caule de ramos jovens de tamarilho. De modo a optimizar o protocolo de indução de ES no tamarilho, precedeu-se à caracterização da resposta da indução de ES sob vários tipos de stresse, assim como face à indução de ES em diferentes genótipos, de plantas diploides e tetraploides, que foram previamente caracterizados citológica e morfologicamente. Os resultados demonstram que factores como o tipo de auxina, a concentração de sacarose, a presença de ácido ascórbico e o tempo de manutenção dos meios de cultura interferem na resposta à indução de ES. Na indução de ES em tamarilho, células embriogénicas e células não embriogénicas surgem lado a lado nos mesmos explantes, o que se trata de uma condição ideal para avaliar as alterações moleculares e bioquímicas observadas nos diferentes tipos de calos. No trabalho realizado estabeleceu-se, pela primeira vez, um protocolo para a multiplicação de massas de células embriogénicas através do uso de suspensões celulares. O teste de várias massas de células e vários volumes de meio de cultura permitiram analisar a cinética de crescimento das células e optimizar a razão x massa de células / volume a utilizar em ensaios futuros. Além disso, analisaram-se os perfis proteicos das secreções dos dois tipos diferentes de células, sendo as secreções do tecido não embriogénico as que apresentam mais diversidade e quantidade de proteínas. Este tipo de análise pode ser utilizada para compreender a embriogénese numa perspectiva mais integradora. Uma das muitas aplicações do calo embriogénico obtido por indução de ES é a transformação genética. Trabalhos anteriores para outras espécies têm demostrado que as taxas mais elevadas de sucesso na transformação genética têm sido obtidas com este tipo de explante. Neste trabalho procurou-se estabelecer um protocolo de transformação genéticas de células embriogénicas, utilizando três estirpes diferentes de Agrobacterium tumefaciens possuindo o plasmídeo p35SGUSINT. A quantificação da massa de células resistentes à canamicina e os resultados da coloração do ensaio GUS indicaram a estirpe C58C1,como a mais eficiente na transformação de células embriogénicas do tamarilho, sendo, no entanto, necessária uma análise mais detalhada em trabalhos futuros. A informação recolhida neste trabalho, nomeadamente com a análise comparativa da resposta de diferentes genótipos e com o desenvolvimento de um protocolo para a cultura de suspensões celulares, poderá contribuir para responder a alguns dos passos restritivos da ES e da transformação genética no tamarilho, para a qual os conhecimentos fundamentais sobre as plantas modelo tradicionais têm sido insuficientes. Encontrar as proteínas directamente envolvidas na aquisição de competência embriogénica poderá ajudar a compreender os mecanismos reguladores deste processo. Para além disso, o desenvolvimento de protocolos de transformação genética optimizados constitui um importante recurso, não apenas para o melhoramento da espécie, mas também como uma ferramenta da genómica funcional para a identificação e caracterização das vias moleculares envolvidas no processo de ES.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais