Modelos fosfolipídicos do sarcolema cardíaco : efeitos do cálcio e do pH

Palavras-chave: Sarcolema,Biomembranas,Assimetria lipídica,Isquemia,Modelos membranares,DSC,Fosfolipase D,Transfosfatidilação,Síntese enzimática

Aspectos ultra-estruturais do músculo cardíaco indicam que o sarcolema forma uma cadeia de invaginações (túbulos) transversais e longitudinais, favorecendo as zonas de justaposição com o retículo sarcoplasmático, designadas por fenda diádica. Por seu lado, canais e trocadores de Ca2+ envolvidos no ciclo contractivo estão preferencialmente localizados em zonas adjacentes à fenda diádica, e requerem na sua actividade fisiológica fluxos rápidos de Ca2+ e concentrações superiores às do citosol. A zona da fenda diádica é apontada como um compartimento de difusão restrita onde ocorre quase todo o fluxo celular de Ca2+, sendo os fosfolípidos aniónicos, existentes exclusivamente no folheto interno do sarcolema assimétrico, indicados como os principais locais de ligação do Ca2+ disponível para troca rápida. A situação patológica de isquemia (supressão da perfusão) associada intracelularmente com o esgotamento de energia e o decréscimo do pH (acidose), é também acompanhada por alterações estruturais do sarcolema como a perda de assimetria lipídica, o rearranjo lateral de constituintes membranares e perda de integridade. A reperfusão após períodos de isquemia prolongados pode resultar na extrusão de lípidos do sarcolema. Atendendo a que os fosfolípidos constituem a matriz estrutural das membranas biológicas, foram preparados modelos fosfolipídicos representativos do folheto interno do sarcolema cardíaco, constituídos pela espécie mais abundante de cada uma das classes fosfolipídicas mais representativas: 16:0/16:0-glicerofosfocolina (DPPC), 18:0/20:4-glicerofosfoetanolamina (SAPE) e 18:0/20:4-glicerofosfoserina (SAPS). A primeira parte do trabalho envolveu a síntese enzimática de 18:0/20:4- -glicerofosfoserina, catalisada pela fosfolipase D de Streptomyces sp., a partir 18:0/20:4-glicerofosfocolina (disponível comercialmente). A fosfolipase D catalisa a hidrólise da fosfatidilcolina com formação de ácido fosfatídico. No entanto, na presença de serina a enzima catalisa também a transferência do grupo fosfatidil para o aceitador nucleofílico (serina) com formação simultânea de fosfatidilserina, por transfosfatidilação. A reacção envolve uma enzima hidrossolúvel, um substrato e produtos lipossolúveis, pelo que a síntese foi estudada num sistema com duas fases, uma fase orgânica composta por éter dietílico e uma fase aquosa saturada com L-serina, a 30 ºC esob a agitação magnética. A conversão máxima foi atingida ao fim de 2 horas de reacção, sendo a transfosfatidilação marcadamente superior. A presença de Ca2+ não é essencial para a actividade da enzima mas é indispensável para se atingir a transfosfatidilação máxima, cerca de 74,32% de 18:0/20:4-glicerofosfoserina. Aliás, o Ca2+ estimula ambas as actividades, mas a transfosfatidilação é favorecida relativamente à hidrólise. O aumento do diâmetro do reactor ou a diminuição da velocidade de agitação do sistema traduzem-se numa redução da transfosfatidilação no sistema bifásico. No sistema bifásico, o substrato apresenta-se na forma monomérica e a actividade da enzima está dependente da eficiência da agitação. Para suprimir esta limitação e potenciar a interacção do substrato lipídico com a enzima, a reacção de síntese foi também estudada em micelas invertidas. A transfosfatidilação máxima foi cerca de 77,29% de 18:0/20:4-glicerofosfoserina. Nesta situação, a estimulação pelo Ca2+ foi menor, e ambas as actividades foram igualmente estimuladas, sugerindo uma maior importância das interacções substrato-substrato (lípido-lípido) na actividade da enzima. A actividade da enzima não foi alterado quando se reduziu a eficiência da agitação do sistema de micelas invertidas. Para detectar as alterações induzidas pelo Ca2+ e pelo H+ (em condições patológica e fisiologicamente relevantes) nas interacções inter-fosfolípidos e na distribuição lateral dos fosfolípidos do sarcolema, foram estudados os perfis termotrópicos por calorimetria diferencial de varrimento (DSC) e polarização de fluorescência do DPH, em modelos fosfolipídicos representativos do folheto interno do sarcolema cardíaco assimétrico. Foram também estudados modelos com as proporções representativas da fracção fosfolipídica total do sarcolema. Com o estudo da composição fosfolipídica total pretendeu-se simular as condições de perda de assimetria lipídica. No entanto, os estudos foram iniciados em misturas binárias com as espécies de fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina/fosfatidilserina, mantendo as proporções referidas para as misturas ternárias e substituindo a espécie ausente pela fosfatidilcolina. Nos estudos realizados com misturas binárias contendo SAPS constata-se que o seu comportamento termotrópico, caracterizado por uma transição única, não é alterado pela presença de concentrações crescentes de Ca2+, sendo apenas influenciado pelo aumento de H+, dado que se detecta de uma transição adicional quando a proporção deSAPS é reduzida, simulando a perda de assimetria. É assim possível sugerir que a fosfatidilserina deverá conferir ao sarcolema homogeneidade e capacidade de interacção com o Ca2+ em condições fisiológicas, devendo-se apresentar como factor de instabilidade em condições patológicas que envolvam a perda de assimetria seguida de acidose, como poderá ser o caso da isquemia. Por outro lado, nas misturas binárias contendo SAPE a pH fisiológico, apenas se detectou uma única transição para a proporção representativa do sarcolema assimétrico (33,7%). É também nesta proporção que as misturas com SAPE apresentaram susceptibilidade à presença e concentração de Ca2+ e à redução do pH com a detecção de transições adicionais. As misturas binárias com SAPE em proporção semelhante à do sarcolema simétrico apresentam sempre duas transições que não são susceptíveis aos catiões estudados. Estes resultados parecem indicar que a proporção de fosfatidiletanolamina no sarcolema tem de estar bem definida e mantida, a fim de conferir à membrana as propriedades físicas e a dinâmica características. Assim a fosfatidiletanolamina poderá constituir um elemento para a regulação da assimetria lipídica. As misturas ternárias, representativas do folheto citoplasmático do sarcolema assimétrico, apresentam um registo calorimétrico caracterizado por uma única transição com acentuada simetria, e que termina próximo da temperatura fisiológica, a 37 ºC. Esta coincide com um aumento da fluidez no interior da membrana característico de uma transição entre fases lamelares, como mostram os dados de polarização de fluorescência. O perfil termotrópico e a miscibilidade não são alterados na presença de concentrações de Ca2+ até 7500 μM e pH 5,5. Nas misturas representativas do sarcolema simétrico foram detectadas duas transições. A presença de Ca2+ induz o aparecimento de uma transição adicional, que se destaca com o aumento da concentração. O comportamento termotrópico não é alterado para valores de pH até 5,5. Estes resultados sugerem que em condições de perda de assimetria, os fosfolípidos se distribuem em domínios lipídicos distintos, com diferentes composições, de maneira a maximizar a interacção entre os seus constituintes. A composição do folheto interno do sarcolema assimétrico em termos de classes fosfolipídicas aproxima-se claramente dos valores previstos para um arranjo lateral regular de simetria hexagonal, pelo que os fosfolípidos deverão adoptar uma distribuição regular no plano da membrana, a qual é responsável pela miscibilidadedetectada. A perda de assimetria deverá traduzir-se num decréscimo significativo da miscibilidade dos fosfolípidos do sarcolema. Estudos adicionais com fosfolipídos saturados, indicam que a distribuição regular no plano da membrana deverá ser determinada pelas proporções das classes fosfolipídicas constituintes, sendo aparentemente independente das espécies. O grau de insaturação das cadeias acil deverá ser também muito importante, por garantir, à temperatura fisiológica, a fluidez da membrana e conferir resistência às variações do Ca2+ na fenda diádica. Considerando os resultados obtidos, foi proposta uma sequência para os eventos associados à situação patológica de isquemia.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais