Análise do envolvimento da proteína NEP-TC na embriogénese somática do tamarilho Cyphomandra betacea

Palavras-chave: Actividade enzimática,Calo embriogénico,Imunolocalização,RNA Metiltransferases,S-­‐adenosil-­‐L-­‐metionina

O tamarilho, Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt é uma pequena árvore da família Solanaceae que produz frutos comestíveis bastante nutritivos, com um interesse económico crescente. Várias linhas de investigação têm demonstrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos específicos da morfogénese in vitro, em particular da indução de embriogénese somática (ES), processo chave para a clonagem de plantas, o que abre portas para a propagação de plantas em larga escala. A indução de ES em tamarilho consiste num processo em duas fases no qual os calos embriogénicos (CE) e os calos não embriogénicos (CNE) são inicialmente produzidos (fase de indução) num meio rico em auxina e, após a sua transferência para um meio sem auxina, formam embriões (fase de desenvolvimento). Análises proteómicas comparativas de extractos proteicos de tamarilho permitiram identificar uma proteína (NEP-­‐TC, 26,5 kDa) presente de forma consistente em calos não embriogénicos, com um possível papel inibidor da embriogénese somática. Esta proteína foi associada à família SpoU de metiltransferases (MTase) de RNA dependentes de SAM, por elevada homologia da sua sequência com proteínas dessa família identificadas em Arabidopsis thaliana. Esta família de MTases está anotada como envolvida na metilação de RNA, especificamente tRNA e rRNA, sendo esta reacção essencial na sua estabilização. Neste trabalho, procurou-­‐se analisar o envolvimento da NEP-­‐TC no processo de embriogénese somática, partindo-­‐se da optimização dos protocolos de extracção, separação e caracterização de perfis proteicos de CNE e CE de tamarilho. Verificou-­‐se que a obtenção de um perfil característico deste material, num extracto adequado aos ensaios de actividade realizados, foi conseguido com a utilização do tampão de extracção Tris-­‐HCl pH 8,4 com 100mM de NaCl associado à maceração in vivo do material. A caracterização funcional da NEP-­‐TC como uma MTase de RNA dependente de SAM nunca foi até agora demonstrada experimentalmente. Procurou-­‐se, aclarar essa hipótese através de duas linhas de investigação: (1). Realização de ensaios de actividade enzimática de forma a avaliar a acção de metiltransferases em extratos proteicos totais de CE e CNE, com a presença da NEP-­‐TC. (2). Estudos imunocitoquímicos que permitissem a localização histológica da NEP-­‐TC. Os resultados mostraram que em extractos proteicos totais obtidos de CNE de tamarilho, a actividade específica de MTase é superior comparativamente a extractos obtidos de CE de tamarilho e de CNE de Arabidopsis wild type e knockout para o gene da proteína homóloga da NEP-­‐TC. Conseguiu-­‐se ainda, através da utilização de um soro com anticorpo anti-­‐NEP-­‐TC, localizar a proteína em células de CNE de tamarilho, em particular na região citosólica em torno do núcleo, enquanto que em CE essa detecção não se verificou. Os dados obtidos enquadram-­‐se na caracterização proteómica anteriormente feita para perfis proteicos de extractos destes materiais e na actividade de MTase desta enzima.Estes resultados juntamente com outros previamente obtidos, contribuem com mais informação para o estabelecimento da relação entre a NEP-­‐TC e as enzimas MTases SpoU bem como para a definição da NEP-­‐TC como uma proteína chave no controlo processo de indução de ES.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais