A radioterapia metabólica no tratamento do adenocarcinoma pacriático

Palavras-chave: cancro do pâncreas,carcinoma ductal pancreático,linhas celulares tumorais,quimioterapia,tumores neuroendócrinos,recetores da somatostatina,análogos e derivados,sunitinib,recetores de peptídeos,lutécio,cancer,pancreas,ductal carcinoma of the pancreas,cell lines,chemotherapy,neuroendocrine tumors

O adenocarcinoma ductal pancreático constitui cerca de 90% de todos os tumores do pâncreas. Aquando do diagnóstico o tumor já está localmente avançado ou mestastizado, sendo resistente à quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Neste trabalho propusemo-nos investigar se a radioterapia dirigida a recetores de peptídeos, quando associada à quimioterapia, pode representar uma forma alternativa e sinérgica de tratamento.  Para esse fim, selecionámos duas linhas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, a MIA PaCa-2 e a PANC-1 com diferenciação neuroendócrina e recetores de somatostatina. Para a sua caracterização fenotípica utilizámos imunohistoquímica e citometria de fluxo. Para a caracterização fenotípica por imunohistoquímica utilizámos marcadores epiteliais, mesenquimais, neuroendócrinos e recetores hormonais, como o anticorpo para o recetor da somatostatina 2. Para a caracterização fenotípica por citometria de fluxo na identificação de células estaminais, selecionámos os marcadores CD24, CD44 CD326/ESA e CD133. Para o perfil genético pesquisámos, por PCR e sequenciação, mutações nos genes KRAS, CDKN2A/p16INK4A, TP53 e SMAD4/DPC4 e, por eletroforese capilar estudámos instabilidade de microssatélites.  Efetuámos estudos de captação com três análogos da somatostatina radiomarcados, o 99mTc-TPC, o 68Ga-DOTA-NOC, e o 177Lu-DOTA-TATE e, por citometria de fluxo, estudámos, nas linhas celulares, a expressão dos recetores da somatostatina, SSTR1, SSTR2a, SSTR2b, SSTR3, SSTR4 e SSTR5. Procedemos a ensaios de quimioterapia, com os citostáticos gemcitabina, 5-FU, docetaxel, everolimus e sunitinib, que compreenderam estudos da atividade metabólica por MTT, de viabilidade e morte celulares com anexina V/iodeto de propídio, do ciclo celular com iodeto de propídio/RNase, e do perfil imunohistoquímico após quimioterapia. Analisámos, por citometria de fluxo, o efeito da incubação das linhas celulares com a concentração do IC50 das 72 h dos citostáticos selecionados, na expressão dos recetores da somatostatina. Seguiram-se estudos de captação do 177Lu-DOTA-TATE após prévia incubação das linhas com a concentração do IC50 das 24 h.  Constituímos, em ratinhos Balb/c atímicos, xenotransplantes heterotópicos das linhas celulares e, nos tumores resultantes, estudámos o perfil imunohistoquímico.  A linha celular MIA PaCA-2 evidenciou a presença de dois tipos morfológicos de células, células grandes e células pequenas, e a linha PANC-1 três tipos, células grandes, células estreladas, e células pequenas. Este padrão manteve-se após tratamento com citostáticos e nos xenotransplantes. Nas linhas, após quimioterapia, e in vivo, nos xenotransplantes, ocorreram alterações isoladas do perfil imunohistoquímico observado inicialmente nas linhas sem exposição a citostáticos, com expressão ou ausência de expressão de alguns marcadores e recetores mas, para além da perda da E-caderina na linha MIA PaCA-2 e da expressão de sinaptofisina na linha PANC-1, após quimioterapia, não se observou um padrão específico e regular de alterações. As duas linhas expressam um fenótipo epitelial-mesenquimal, que se mantém após quimioterapia, e nos xenotransplantes, mas este fenótipo, por ausência da E-caderina, é mais agressivo na linha PANC-1. A linha MIA PaCA-1 evidenciou um fenótipo CD24-CD44+/++CD326-/+ e CD133/1- e a linha PANC-1 CD24-/+CD44+CD326-/+ e CD133/1-. A linha celular MIA PaCa-2 apresentou uma mutação missense, sem heterozigotia, no codão 12 do KRAS (p.G12C; GGT>TGT), uma mutação missense, sem heterozigotia, no exão 7 do TP53 (p.R248W) (CGG>TGG). A linha PANC-1 apresentou uma mutação missense, em heterozigotia, no codão 12 do KRAS (p.G12D; GGT>GAT) e duas variações missense em dois exões distintos do TP53, uma no exão 4 (p.P72R; CCC>CGC), que corresponde a um polimorfismo comum, e outra no exão 8 (p.R273H; CGT>CAT). A amplificação dos exões 1-3 do gene CDKN2A/p16INK4A identificou uma delecção em homozigotia, incluindo os três exões, em ambas as linhas.  As duas linhas expressaram todos os recetores da somatostatina, com SSTR3, SSTR1 e SSTR2b predominando na linha MIA PACa-2, e SSTR2a e SSTR5 predominando na linha PANC-1. Os estudos de captação com 99mTc-TOC, 68Ga-DOTA-NOC e 177Lu-DOTA-TATE evidenciaram uma superior captação do 68Ga-DOTA-NOC em ambas as linhas celulares. Os estudos demonstraram que todos os citostáticos conseguiram inibir a atividade metabólica das linhas MIA PaCA-2 e PANC-1, com o docetaxel, e depois o sunitinib, revelando maior eficácia. Os estudos de viabilidade e morte evidenciaram que o sunitinib e o docetaxel foram os mais eficazes na indução de morte na linha MIA PaCa-2, e o sunitinib e a gemcitabina na linha PANC-1. A morte celular decorreu essencialmente por apoptose, com exceção do sunitinib, em que decorreu por apoptose/necrose. Os estudos de ciclo celular mostraram que, nas duas linhas, a sua paragem se deu essencialmente na fase G0/G1. Na linha PANC-1, para além da paragem em G0/G1, ocorreram paragens na fase S, com o 5-FU, e na fase G2/M, com o docetaxel. Após modulação celular com os citostáticos, ocorreu, nas duas linhas, de uma forma geral, aumento da expressão dos recetores. Este aumento foi mais pronunciado na linha PANC-1. Os estudos de captação do 177Lu-DOTA-TATE após modulação celular com as concentrações do IC50 dos citostáticos às 24 h demonstraram, na linha MIA PaCa-2 um aumento da captação relativamente ao controlo com todos os citostáticos, com exceção do 5-FU. Na linha PANC-1 só ocorreu aumento da captação com o sunitinib.  Os resultados obtidos in vitro apoiam a hipótese de que a associação da quimioterapia, particularmente do sunitinib, à radioterapia dirigida a recetores de peptídeos, particularmente com o 177Lu-DOTA-TATE, tem efeito sinérgico, e pode representar uma opção na terapêutica do adenocarcinoma ductal pancreático.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde