Alteration of GABAAR trafficking during cerebral ischemia: the role of Huntingtin-associated protein 1

Palavras-chave: Proteína associada a huntingtina de tipo 1 (HAP1),Isquémia cerebral,Receptores de GABA do tipo GABAA,Privação de oxigénio e glucose (OGD),Neurónios

A isquémia cerebral resulta de um fornecimento insuficiente de sangue ao cérebro, levando a uma desregulação no equilíbrio entre a neurotransmissão excitatória/inibitória e consequente morte celular por excitotoxicidade. No sistema nervoso central (SNC) a regulação deste equilíbrio é determinada principalmente pelo balanço entre a neurotransmissão glutamatérgica e GABAérgica e diversos estudos têm mostrado que a neurotransmissão glutamatérgica e GABAérgica está aumentada e reduzida, respectivamente, nas lesões isquémicas. Ao contrário das alterações na neurotransmissão glutamatérgica na isquémia cerebral que têm sido amplamente investigadas, poucos estudos têm abordado os mecanismos moleculares que contribuem para as alterações na neurotransmissão GABAérgica. Resultados recentes do nosso laboratório, obtidos utilizando o modelo de isquémia cerebral baseado na privação de oxigénio e glicose (OGD), mostraram que o insulto isquémico induz a desfosforilação e consequente internalização dos receptores de GABA do tipo A (GABAAR), contribuindo para a morte neuronal. Após a internalização os GABAAR são rapidamente reciclados e voltam para a membrana plasmática ou são encaminhados para os lisossomas a fim de serem degradados. O rumo que os GABAAR endocitados tomam depende da interacção das subunidades β1-3 com a proteína associada à huntingtina 1 (HAP1). Estudos anteriores do nosso laboratório mostraram que a OGD transitória também reduz a reciclagem e o regresso para a membrana plasmática dos GABAAR, e diminui a interacção dos receptores com a proteína HAP1 em neurónios do hipocampo em cultura. A proteína HAP1 existe em duas isoformas, HAP1-A e HAP1-B, que compartilham a mesma região central (aminoácidos 277-445). A HAP1 está associada a microtúbulos e a diversos tipos de organelos, incluindo as mitocôndrias, lisossomas e vesículas sinápticas. Tendo em consideração estas observações, no presente trabalho investigámos o papel da HAP1 na redução da expressão à superfície e reciclagem dos GABAAR em neurónios de hipocampo em cultura após OGD. Os resultados obtidos mostram que a exposição transitória de neurónios de hipocampo a OGD (90 min) reduz os níveis da proteína HAP1, quando testado por western blot duas horas após o insulto isquémico. Este efeitodependente do tempo de incubação, não foi observado em neurónios incubados na presença do inibidor das calpaínas MDL28170. A inibição das fosfatases PP1/PP2A com ácido ocadáico também diminuiu a redução de HAP1 induzida pela OGD. A diminuição dos níveis da proteína HAP1 foi também observada em neurónios corticais expostos a OGD, à semelhança dos resultados obtidos em neurónios do hipocampo em cultura. Porém, a oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAO), um modelo in vivo de isquémia cerebral, teve o efeito oposto sobre os níveis da proteína HAP1 no núcleo isquémico, localizado na região cortical. Esta discrepância pode ser devida ao efeito do insulto isquémico sobre os níveis da proteína Hap1 em células da glia, presentes no tecido cerebral mas ausentes nas culturas neuronais. De acordo com essa hipótese, a análise por western blot realizada com extractos de células da glia em cultura expostas a 90 min de OGD seguido de 12 h de pós-incubação mostraram um aumento dos níveis de proteína HAP1. Para investigar o papel modulador de HAP1 nas alterações do tráfego dos GABAAR induzidas pelo OGD, foram realizadas experiências em culturas de neurónios de hipocampo transfectados com as isoformas HAP1-A ou-1B. A sobre-expressão das duas isoformas de HAP1, em neurónios de hipocampo em cultura, preveniu a redução da expressão superficial da subunidade β3 do GABAAR induzida pela OGD. Este efeito foi devido ao aumento da reciclagem da subunidade β3 do receptor GABAAR, como mostrado através do ensaio de reciclagem. Em resumo, os nossos resultados sugerem que a proteína HAP1 desempenha um papel fundamental na redução da neurotransmissão GABAérgica durante a isquémia cerebral.

Área científica: Ciências Exactas e Naturais