Potencial terapêutico do sirolimus e da metformina em células de leucemia linfoblástica aguda

Palavras-chave: Leucemia-linfoma linfoblástico de células precursoras,Metformina,Sirolimus,Terapia

A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais frequente em crianças e pode afetar a linhagem B ou T de linfócitos, caracterizando-se pelo bloqueio da diferenciação e excessiva proliferação de linfoblastos com deficiente produção de células hematopoiéticas. A LLA tem origem, maioritariamente, na ocorrência de alterações cromossómicas sendo as translocações que envolvem o gene MLL as mais frequentes em crianças com idade inferior a um ano e associadas a um prognóstico desfavorável. Apesar do evento inicial ser uma destas alterações, o estabelecimento do quadro da doença dá-se devido a mutações secundárias em recetores ou outras proteínas com consequente desregulação de vias de sinalização intracelulares que contribuem para a continuidade da proliferação das células leucémicas. Apesar do tratamento da LLA nos últimos anos ter melhorado significativamente os níveis de sobrevivência dos doentes, as percentagens de recaída e de insucesso obrigam ainda à procura de alternativas terapêuticas. Torna-se necessário conhecer as alterações citogenéticas e as vias desreguladas de forma a direcionar os fármacos e criar novas estratégias terapêuticas mais eficazes. Uma das vias frequentemente alteradas em células de LLA é a via de sinalização do mTOR, o regulador central de processos como o crescimento, proliferação e sobrevivência das células. Um outro processo associado à atividade do mTOR é a autofagia que tem sido estudada como possível mecanismo de morte, apesar de em alguns tipos de tumores estar assciada à resistência das células neoplásicas ao tratamento. Assim, a inibição da atividade do mTOR e a estimulação da autofagia por ativação de outros alvos como a AMPK, podem ser sinergicamente eficazes na eliminação das células de LLA. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial terapêutico da associação entre um inibidor do mTOR (Sirolimus) e de um ativador da AMPK (Metformina), em monoterapia e combinação terapêutica, num modelo in vitro de LLA de células precursoras B com a translocação t(11;19)(q23;p13) que origina a proteína de fusão MLL-ENL. As células foram incubadas na ausência e na presença do Sirolimus em concentrações entre 250 nM e 15 μM, da Metformina em concentrações entre 1 mM e 7,5 mM e do Sirolimus associado à Metformina nas concentrações de 250 nM e 1 mM, respectivamente. Com recurso ao teste de exclusão do azul de tripano avaliou-se os efeitos citotóxicos e citostáticos dos dois fármacos isoladamente e em associação. A administração fracionada do Sirolimus permitiu ainda avaliar a influência do esquema de administração deste fármaco. A morte celular foi avaliada por microscopia ótica, após coloração de esfregaços usando o método de May-Grünwald-Giemsa, e por Citometria de Fluxo (CF), através da dupla marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo. Foi também avaliada por CF a activação de caspases utilizando a sonda Apostat, o potencial de membrana com o JC-1, bem como o ciclo celular com recurso ao Iodeto de Propídeo/RNase. De forma a verificar se os fármacos induziam autofagia foi analisada por CF a expressão de LC3B, um marcador do processo autofágico. Os resultados mostram que o Sirolimus reduz a viabilidade e a proliferação celular de uma forma dependente do tempo e da dose. O IC50 do fármaco foi obtido após 48h de exposição sendo entre 7,5 μM e 10 μM. Além disso, os resultados sugerem que a administração diária do fármaco é mais eficaz na redução da viabilidade e da proliferação celular quando comparado com mesma dose total em administração única. O Sirolimus mostrou induzir morte celular por apoptose com ativação de caspases associada à despolarização da membrana. A análise do ciclo celular confirma a atividade anti-proliferativa do fármaco, uma vez que é observado um bloqueio na fase G0/G1. Também se verificou um aumento da LC3B dependente da dose que pode estar associado à morte celular. Por sua vez, a Metformina mostrou também induzir uma redução da viabilidade e da proliferação celular. O IC50 deste fármaco foi obtido mais tardiamente, às 72h de exposição, e está entre 2,5 mM e 5 mM. A morte celular induzida pela Metformina foi sobretudo por apoptose com activação de caspases associada também à despolarização da membrana. A exposição à Metformina levou igualmente a um aumento da expressão da LC3B dependente da dose que pode estar associado à morte celular. Seria expectável que a associação entre o Sirolimus e a Metformina intensificasse a atividade demonstrada por cada um dos fármacos individualmente especialmente em relação ao aumento da autofagia. No entanto, esta combinação não potenciou os seus efeitos. Futuramente seria importante uma avaliação mais profunda dos mecanismos subjacentes à ação do Sirolimus e da Metformina em associação, testar novos esquemas de administração e ainda novas doses dos fármacos.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde