Pesquisa de inibidores enzimáticos em óleos essenciais. Estudo da actividade em BACE-1, uma protease aspártica envolvida na doença de Alzheimer

Palavras-chave: Óleos essenciais,Doença de Alzheimer,Inibidores enzimáticos

Os óleos essenciais têm vindo a ser utilizados em terapêutica com uma extensa lista de possíveis aplicações clínicas. Estes produtos de origem vegetal, obtidos quase exclusivamente por destilação, são constituídos por dezenas de compostos de baixa massa molecular e elevada hidrofobicidade, sendo, por isso, importantes fontes de compostos naturais capazes de ultrapassar barreiras fisiológicas e de permear membranas, com potencial intrínseco para interagir e modular alvos intracelulares e exercer efeitos biológicos.  Nos últimos anos, as proteases aspárticas mereceram atenção reforçada da comunidade científica por integrarem os mecanismos moleculares de diversas patologias graves e de elevada prevalência, tais como a síndrome da imunodeficiência humana adquirida, a malária, a doença de Alzheimer, algumas infecções fúngicas, etc. A identificação e caracterização de inibidores dessas proteases aspárticas e as suas potencialidades como agentes quimioterapêuticos assumiram, então, grande relevância. É o caso da BACE-1, protease aspártica reconhecida como enzima chave no processo neurodegenerativo da doença de Alzheimer, e dos seus potenciais inibidores que, tendo fins terapêuticos, devem demonstrar, não só, selectividade, mas também características favoráveis para passarem a barreira hemato-encefálica e permearem membranas celulares.  			Neste contexto, descrevemos nos próximos capítulos a investigação que desenvolvemos com vista à identificação de inibidores da BACE-1, hidrófobos e de baixa massa molecular, aptos para permearem membranas celulares. A primeira fase deste trabalho correspondeu a um rastreio, sobre várias dezenas de óleos essenciais, tendo em vista evidenciar os óleos que demonstravam efeitos inibitórios sobre a proBACE-1 recombinante. Todos os óleos ensaiados foram caracterizados por elucidação da sua composição. Entre os que revelaram capacidade inibitória, o óleo essencial de Lavandula luisieri foi distinguido como o mais promissor, tendo em conta a potência da inibição e a sua composição singular que inclui raros monoterpenos irregulares de núcleo ciclopentano penta-substituído, usualmente designados como monoterpenos derivados do necrodano.  O óleo de L. luisieri inibiu a BACE-1 de forma dependente da concentração, tanto em ensaios bioquímicos de inibição in vitro (IC50 de 121,5g.ml-1), como em ensaios de avaliação da redução da produção de A em linhas celulares (EC50 de 86,2g.ml-1) que, simultaneamente, comprovaram a capacidade dos componentes do óleo para permear membranas celulares.  	Na sequência de fraccionamentos bioguiados, que permitiram a obtenção de fracções com composições menos complexas, aprofundou-se o conhecimento sobre a composição do óleo essencial de Lavandula luisieri, até à data, insuficientemente caracterizado. Foram, então, identificados cerca de uma centena de componentes que representam mais de 85% da composição total.  A actividade inibitória das fracções foi avaliada, quer sobre a forma pró-, quer sobre a forma activa da enzima recombinante, caracterizando-se a fracção mais activa (#3.1), maioritariamente constituída por linalol e por um composto de núcleo necrodano, a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona, por valores de IC50 de 282,6g.ml-1 para a inibição enzimática, e de EC50 de 94,5g.ml-1 para a diminuição da produção de A na linha celular CHO-APPwt.  	O linalol e a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona, isolados a partir do óleo essencial e de origem sintética, foram avaliados isoladamente revelando que a actividade inibitória da fracção se devia à 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona. O linalol não produziu efeito algum nas concentrações testadas. Pelos ensaios de inibição da enzima recombinante com a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona não se evidenciaram diferenças na inibição da forma pró- e da forma activa. De igual modo, quer em termos de potência, quer em termos de modo de inibição não se assinalaram diferenças significativas entre a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada a partir do óleo de L. luisieri e a de origem sintética. Foi determinado um Kiapp de 415,8M, ajustando-se os dados a um modelo de inibição competitivo.  A 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona demonstrou capacidade de inibir a produção de A em duas linhas celulares, CHO-APPwt e SHSY5Y-APPwt, com EC50 de 72,8M e 217,4M, respectivamente, e sem alterações significativas da viabilidade celular nas concentrações inibitórias. A inibição da BACE-1 intracelular foi ainda comprovada pela diminuição da produção de sAPP, o produto directo da clivagem do APP por aquela enzima. A principal diferença encontrada nos resultados dos ensaios sobre linhas celulares, relativamente aos ensaios enzimáticos, foi o facto de a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada a partir do óleo de L. luisieri e a sintética não inibirem a produção de A exactamente com a mesma potência, sendo esta muito superior no primeiro caso. O linalol, contaminante residual da 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona isolada, parece desempenhar um papel no efeito celular, já que ao ser adicionado à 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona sintética aumenta ligeiramente a inibição.  	Na última fase deste trabalho avaliámos a capacidade dos compostos activos, 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona e linalol, diminuírem a produção de A in vivo, utilizando um modelo animal da doença de Alzheimer, o ratinho transgénico 3xTg-AD. Da mesma forma que o observado nas linhas celulares, o óleo total, a fracção e a 2,3,4,4-tetrametil-5-metileno-ciclopent-2-enona reduziram de forma significativa os níveis de A cerebral (aproximadamente 25% para as concentrações estudadas), sem sinais visíveis de toxicidade, após administração intranasal. Estes resultados permitiram demonstrar que o óleo estudado e alguns dos seus constituintes têm capacidade para inibir a BACE-1 não só in vitro, mas também in vivo, característica essencial para um inibidor com utilidade clínica.  Não obstante a falta de selectividade e a potência moderada, o óleo essencial de L. luisieri e alguns dos seus componentes apresentam potencial aplicabilidade como inibidores da BACE-1, quer para fins de investigação, quer como protótipos para desenvolvimento de inibidores mais potentes e selectivos com fins preventivos na doença de Alzheimer.

Área científica: Ciências Médicas e da Saúde