블루화이트 스크린

Blue–white screen LB 아가 평판, blue white screen 의 결과를 보여주고있다. **블루 화이트 스크린**(Blue–white screen)은 스크리닝 기술로 벡터의 성공적인 DNA접합을 검출하는 기술이다. 관심있는 DNA가 벡터에 들어가면 벡터는 형질전환되어 수용성세포(受容性細胞, competent cell)(박테리아)에 들어간다. 수용성세포들은 X-gal이 있는 평판에서 자라난다. 만약 접합이 성공적이라면, 박테리아 콜로니는 흰색이 될 것이고, 성공적이지 않다면, 파란색이 될 것이다. 이 기술은 DNA접합을 검출하는데 있어서 빠르고 쉬운 기술이다.
# 배경지식
분자복제는 분자생물학에 있어서 가장 흔하게 사용되는 기술이다. 관심있는 유전자는 DNA접합을 통해 플라스미드 벡터에 삽입된다. 그리고 플라스미드는 *E.coli*세포에 형질전환된다. 그러나, 모든 세포들에 관심있는 유전자가 삽입된 플라스미드가 들어가는 것은 아니다. 그리고 하나씩 콜로니에서 플라스미드가 들어갔는지 확인하는 것은 시간이 많이 걸린다. 그래서 초기의 방법들 중 하나가 blue white screening 의 방법이다. 이 기술을 통해 박테리아 콜로니의 색을 통해 반응을 알아볼 수 있다. 이 방법은 β-galactosidase의 유전자에 α-complementation(상보성)에 기반한다. α-complementation의 현상은 François Jacob과 Jacques Monod의 실험실에서 처음 발견되었는데, 그들은 유전자가 지워진 돌연변이로 작동하지 않는 β-galactosidase가 β-galactosidase와 같은 서열을 가진 α-donor peptide로부터 작동이 살아난 것을 보았다.doi=10.1016/0022-2836(67)90341-5 Langley *et al.* β-galactosidase가 작동하지 않는 돌연변이는 N-말단 잔기의 11-41이 삭제되어있다. β-galactosidase가 작동하려면 3-90 잔기들에 의해 펩티드가 만들어져야한다.doi=10.1073/pnas.72.4.1254 145개의 아미노산을 코딩하는 M13사상파지(filamentous phage)가 만들어졌고 *Messing et al.*, X-gal을 포함한 평판에서, 파지에 감염되어 작동하지 않는 단백질을 포함한 세포들은 파란 플라크를 만든다.doi=10.1073/pnas.74.9.3642 pUC 플라스미드 복제 벡터는 M13 시스템으로부터 개발되었고, 스크리닝 방법에 처음으로 득을 본 플라스미드이다.doi = 10.1016/0378-1119(82)90015-4 이 방법에서 DNA는 플라스미드로 접합이 되고, α peptide를 방해한다. 그래서 기능을 하는 β-galactosidase 가 만들어질 수 없다. 플라스미드를 포함한 형질전환된 세포들은 그러므로 흰색 콜로니를 만들고, 형질전환되지 않은 세포들은 파란 콜로니를 만든다.
# 분자생물학적 기작
그림으로 나타낸 blue white assay. β-galactosidase는 *lacZ*유전자로부터 단백질 암호화된 것으로 Lac오페론의 일부이다. β-galactosidase는 활성화 상태에서 homotetramer로 존재한다. 그러나, M15 균주로부터 나온 *E. coli* 돌연변이 β-galactosidase는 N-말단의 11-41잔기가 삭제되었고, 이 돌연변이체의 ω-peptide는 사량체(tetramer) 형성할 수 없기에 불활성상태이다. 그러나 α-peptide가 있는 상태에서 온전한 활성화 사량체로 전환될 수 있다. 이렇게 α-peptide가 돌연변이 β-galactosidase의 기능을 살리는 것을 "α-complementation" 이라 부른다. 이 방법으로, 숙주 *E. coli*균주는 *lacZ*가 삭제되어 ω-peptide를 만드는 돌연변이(*lacZΔM15*)를 가지고 다닌다. 플라스미드는 *lacZα*를 가지고 다니는데, β-galactosidase의 처음 59잔기를 암호화하는 서열이 포함되는 α-peptide이다. 돌연변이 *E. coli*와 플라스미드 모두 홀로 작용할 수 없다. 그러나, 두개의 단백질들이 함께 발현되면, 플라스미드의 *lacZα* 서열이 *lacZΔM15*로 형질전환되어 세포로 들어가게되면, 그들은 기능을 하는 β-galactosidase 효소를 만들 수 있다. blue white screen 방법은 이 α-complementation 과정을 방해하는 것이다. 플라스미드는 다복제구역 (multiple cloning site, MCS)에 *lacZα*서열을 들고다닌다. MCS안의 *lacZα* 서열은 제한효소로 잘릴 수 있으며, 외부 DNA가 들어 갈 수 있어서 기능을 하지 않는 β-galactosidase가 형성 될 수 있다. 활성화 형태의 β-galactosidase는 X-gal에 의해서 검출 될 수 있다. 색이 없는 젖당은 β-galactosidase에 의해 잘리게 되면 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole을 형성하게 되는데, 저절로 이량체가 되고 산화되어 밝은 색을 내는 녹지 않는 색소인 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo를 형성한다. 이 결과는 왜 기능을 하는 β-galactosidase가 있는 세포가 파란색을 띠게 되는지에 대한 이유이다. 파란 콜로니들은 그러므로 방해되지 않은, 즉 삽입되지 않은 *lacZα*가 있다는 것을 말해주고, 반면에 흰색 콜로니들은, X-gal이 수화되지 않았음을 말하며, *lacZα*에 삽입된 서열이 있어서 활성화된 β-galactosidase를 만들 수 없었음을 말한다.
# 실제적 고려
옳은 형태의 벡터와 컴피턴트세포들은 blue white screen을 할 때 중요한 고려대상이다. 플라스미드는 반드시 *lacZ*α를 포함하여야한다. 예를 들어 pUC19와 pBluescript 플라스미드는 *lacZ*α를 포함한다. *E. coli*세포는 *lacZ유전자의 일부 서열이 지*워진 돌연변이 *lacZ*유전자(즉, lacZΔM15)를 포함하여야한다. 또한 오페론이 포도당에도 영향을 받는 것도 생각해야한다. 포도당은 cAMP(cyclic adenosine monophsphate)의 양을 줄이고, cAMP는 CRP-cAMP복합체의 형성에도 중요하다. CRP-cAMP는 젖당오페론의 전사의 초기에 필요하다. 포도당의 존재는 젖당오페론을 불활성화시키고, 젖당 유전자는 포도당의 농도가 CRP-cAMP가 충분히 낮을 때 작동한다. 그래서 배지는 포도당을 포함하면 안 된다. X-gal은 빛에 민감하여, X-gal은 암실에서 보관되어야한다. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)는 젖당오페론의 유도자로 역할을 하는데, 배지에서 LacZ의 생산을 증가시키는데 사용한다.