Études de perturbations de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli : mécanismes de vulnérabilités ou de résistances

L'aumento dell’incidenza delle infezioni da batteri resistenti, multi-resistenti e anche estremamente resistenti agli antibiotici, combinata con la rarefazione della scoperta di nuove molecole fra gli anni 1960 e il sotto investimento cronico di certe nazioni nella ricerca pubblica, potrebbe costare la vita a 10 milioni di essere umano all'anno nel 2050. La stragrande maggioranza delle specie resistenti agli antibiotici sono batteri Gram- negativi. Questo è dovuto principalmente alla composizione intrinseca dei loro involucri che permette loro di essere insensibili a molte molecole che sono letali per altri tipi di batteri. Lo studio delle componenti e i meccanismi di sintesi dell’incurvo, che sono essenziali nell’integrità dei batteri e che possono essere coinvolti nella loro virulenza, dovrebbe permettere l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Nel primo capitolo, avremo una panoramica dei diversi elementi che compongono l'involucro dei batteri Gram-negativi, dei meccanismi di resistenza e della minaccia che i batteri Gram-negativi rappresentano. La presentazione del mio lavoro, diviso in quattro articoli dal capitolo due a cinque, sarà preceduta da una contestualizzazione dei progetti di ricerca specifici di ciascuno dei due laboratori, sul biofilm e la motilità di Vibrio cholerae da un lato e sull'involucro di Escherichia coli dall'altro. Nel primo articolo, abbiamo determinato il meccanismo con cui la polimixina B in concentrazione sub-inibitoria influenza la formazione de biofilm in Vibrio cholerae. Abbiamo osservato che la polimixina B danneggia principalmente il flagello attraverso un'azione meccanica. Poiché la formazione del biofilm richiede il flagello nelle prime fasi della sua formazione, abbiamo concluso che l'azione della polimixina B ha impedito questo cambiamento nello stile di vita di Vibrio cholerae. Nel secondo articolo, abbiamo messo a punto un protocollo di evoluzione sperimentale che ci ha permesso di identificare diversi geni che aumentano la motilità di Vibrio cholerae in presenza di una concentrazione sub-inibitoria di polimixina B. Abbiamo quindi identificato vari mutazioni in diversi varianti che hanno probabilmente provocato la riduzione o il soppresso della funzione delle proteine IhfA, DacB, VacJ (MlaA) e MlaF. Sulla base della letteratura, proponiamo che la perdita di funzione di queste proteine inducendo un aumento della   9 mobilità in presenza di polimixina B può essere spiegato attraverso tre meccanismi coinvolgendo la stabilità dell'involucro, la secrezione di vescicole di membrana o l’alterazione dell’espressione di diversi geni. Nel terzo articolo, abbiamo studiato il coinvolgimento dello stress ossidativo nell'arresto della sintesi del peptidoglicano che è fatale al mutante ∆elyC di Escherichia coli. Abbiamo poi dimostrato con numerosi esperimenti che la lisi del mutante ∆elyC è causata dalla sovrapproduzione di radicali idrossilici nel suo involucro. Questa molecola causa importanti danni nell’involucro provocando l’inibendo della sintesi del peptidoglicano. Il meccanismo che causa questa sovrapproduzione di radicali tossici deve ancora essere determinato. Studiando la funzione del fattore ElyC, abbiamo scoperto una nuova vulnerabilità nell'omeostasi dell’involucro che siamo in fretta di sfruttare. Nel nostro ultimo articolo, basandoci su un'ipotesi precedentemente formulata, abbiamo studiato l'importanza della via di sintesi dell'antigene comune agli enterobatteri nel processo letale che si svolge in assenza di ElyC. Abbiamo scoperto che il mutante ∆elyC accumula un elemento comune alle vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri, l'undecaprenil pirofosfato. Abbiamo anche scoperto che l'aumento del riciclaggio di quest'ultimo attraverso la sovraespressione del gene pgpB previene la lisi del mutante. Proponiamo che l'assenza di ElyC induce una allocazione diffetosa del undecaprenil fosfato tra le vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri. L'iperattivazione della via dell'antigene comune agli enterobatteri provoca l'accumulo di undecaprenil pirofosfato, causando l'inibizione di Pbp1b e dunque dell’aggiunta di nuove unità al peptidoglicano, provocandone quindi la lisi. Quindi, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione o identificazione delle vulnerabilità dell'involucro di Vibrio cholerae ed Escherichia coli, a chiarire certi meccanismi essenziali ma anche a intravedere il ruolo di vari fattori coinvolti nell'omeostasi del loro involucro.

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