Comparison of vitrification protocols in immature equine oocytes

La cryoconservation d'ovocytes est une méthode qui faciliterait la conservation du potentiel génétique chez la femelle et permettrait plus de flexibilité dans l'application des techniques de reproduction assistée chez les animaux domestiques et les espèces en voie de disparition. Chez le cheval, le taux de réussite de cette technique est faible comparée à celui obtenu chez d’autres espèces animales. Par conséquent, plus d’études seront nécessaires pour élucider les mécanismes spécifiques responsables du faible taux de succès après la cryopréservation. Le but de cette étude était d'évaluer l'effet de la vitrification d'ovocytes équins immatures sur leur taux de maturation, de clivage et le développement de blastocystes en utilisant un protocole de vitrification en trois étapes avec de l’ethylène glycol (EG) et du diméthylsulfoxyde (DMSO), ainsi que comparer l'effet des milieux hors congélation. Le protocole de vitrification utilisé dans la présente étude a été conçu en fonction des résultats obtenus au cours d’études préliminaires. Des ovocytes provenant de follicules immatures de juments ont été conservés pendant une nuit (14-18 heures) à température ambiante (~22⁰C) dans un milieu de maintien. Le lendemain, les ovocytes ont été dénudés et placés dans une solution de base (BS) composée de 20% de sérum de veau foetal (FBS) + M199/Hanks’ salts. Les ovocytes ont ensuite été répartis au hasard dans différents groupes : contrôle, vitrification et exposés aux agents cryoprotecteurs (CPA)-. Les ovocytes du groupe contrôle ont été immédiatement mis en maturation in vitro (IVM). Trois ovocytes ont été exposés à un protocole de vitrification en trois étapes décomposées en (1) solution de pré-vitrification (PVS) 1 (5% EG / 5 DMSO) 40s. (2) PVS 2 (10% EG / 10% DMSO) 40s et enfin, (3) solution de vitrification (VIT) (17,5% EG / 17,5% DMSO / 3 M saccharose) 10s. Le groupe vitrification est plongé dans l'azote liquide alors que les groupes CPA-exposés ont été exposés aux cryoprotecteurs mais n’ont pas été congelés. Les ovocytes ont ensuite été transférés sur un maillage en acier inoxydable stérile puis réchauffés à 42 ° C dans un BS pendant 5 min. Les ovocytes ont ensuite été soumis à l’IVM, fécondés par injection intracytoplasmique d’un spermatozoïde puis mis en culture dans le but de produire des embryons. Les différences en termes de maturation, de clivage et de taux de blastocystes entre les groupes ont été analysées par le test exact de Fisher. Le taux de maturation des deux groupes vitrification et CPA-exposés ne différait pas significativement avec le groupe contrôle. Aucun blastocyste n'a cependant été obtenu des groupes vitrification et CPA-exposés. Ces résultats ont montré que les ovocytes équins immatures peuvent maintenir une viabilité et une compétence méiotique après vitrification similaires à celles du groupe contrôle; de plus, l'exposition aux cryoprotecteurs n'a pas abouti à la formation de blastocystes en comparaison avec le groupe contrôle. Une étude plus approfondie sur la physiologie des ovocytes équins est nécessaire afin de pouvoir optimiser la production d’embryons.

Keyphrases: Cryoconservation, Vitrification, Équidés, Cryoprotecteurs, Vitrification