Identification biochimique et fonctionnelle des domaines structuraux d’une sous-unité des canaux calciques

Les canaux calciques CaV1.2 activés par la dépolarisation membranaire jouent un rôle majeur dans le couplage excitation-contraction en promouvant l’entrée de Ca2+ dans les cellules cardiaques. Une perturbation de la fonction de ces canaux a été associé avec l’apparition de maladies cardiovasculaires telles que les arythmies cardiaques. Ces canaux forment un complexe hétéromérique constitués de la sous-unité principale CaVa1C formant le pore et de l’association d’au moins deux sous-unités auxiliaires. L’interaction avec la sous- unité cytoplasmique CaVb est importante pour l’adressage membranaire du canal tandis que la liaison de la sous-unité extracellulaire CaVa2d1 augmente les densités de courant d’un facteur 5 à 10 et permet l’activation du canal à des potentiels physiologiques. L’ensemble de ces sous- unités est donc nécessaire pour reproduire les propriétés biophysiques du canal natif. Tandis que la modulation fonctionnelle du canal CaVa1 par CaVb a été bien caractérisée, les mécanismes de régulation par la protéine CaVa2d1 ne sont pas encore élucidés. La caractérisation structurale de CaVa2d1 a été entreprise mais l’extrême complexité d’organisation de cette protéine en raison de ces multiples modifications post-traductionnelles (seize sites de glycosylation, ponts disulfures intra- et intermoléculaires, délétion du C- terminal pour son ancrage membranaire) a limitée cette étude. Notre stratégie alternative a alors été de purifier séparément les domaines structuraux de CaVa2d1 dans le but d’étudier leurs structures 3D. La structure du domaine Cache2 obtenue à basse résolution par diffusion des rayons X aux petits angles a révélé un repliement majoritairement en feuillets-b et la présence de nombreuses régions flexibles. Cependant, la publication en 2016 de la structure du canal calcique homologue CaV1.1 purifié à partir de muscle squelettique à une résolution de 3.6 Å par cryo-microscopie électronique a fourni l’essentiel des détails structuraux sur la sous- unité CaVa2d1. Cette structure a montré que le domaine VWA de CaVa2d1 se situe à une distance atomique de CaVa1S. Dans le but de mieux comprendre comment cette association contribue à la fonction de CaVa2d1 dans les cellules cardiaques, nous a amené à étudier les déterminants moléculaires responsables de l’interaction entre CaVa1C (CaV1.2) et CaVa2d1. Nos études combinées de modélisation par homologie, électrophysiologie et co-immunoprécipitation ont montré, dans un premier temps, que les deux résidus aspartates (Asp- 180 et Asp-181) situés dans la boucle S1S2 du domaine I (IS1S2) de CaV1.2 étaient critiques pour la modulation du canal par CaVa2d1. Plus particulièrement, l’Asp-181 est crucial pour l’interaction physique avec CaVa2d1 tandis que l’Asp-180 joue un rôle important dans le déplacement du potentiel d’activation du canal vers des valeurs hyperpolarisantes. Nous avons, dans un second temps, montré que l’Asp-259 dans CaVa2d1 était nécessaire pour capter un ion Ca2+ et permettre le repliement optimal du site MIDAS (metal-ion-dependant adhesion site) sur le domaine VWA (Won Willebrand factor A) de la protéine. Dans cette conformation, la Ser-261 et la Ser-263 de CaVa2d1 peuvent alternativement établir une liaison électrostatique avec l’Asp-181 de CaV1.2 ce qui stabilise l’interface et permet la régulation du canal par CaVa2d1. Nos travaux ont révélé de nouveaux mécanismes moléculaires, par lesquels, la liaison de CaVa2d1 avec la boucle IS1S2 de CaV1.2 induit un réarrangement structural local à travers de multiples interactions fonctionnant en synergie ce qui facilite l’ouverture du canal, et indirectement l’augmentation des densités de courants à travers le pore.

Keyphrases: Canaux calciques, domaine Cache2, interface macromoléculaire, interaction protéine-protéine, co-immunoprécipitation, électrophysiologie, modélisation moléculaire par homologie, dynamique moléculaire