Approches de fractionnement biochimique couplé à la transcriptomique dans l’étude systématique de la localisation subcellulaire et extracellulaire des ARNs

Divers transcrits acquièrent une asymétrie spatiale au sein de certaines cellules procaryotes et eucaryotes, phénomène qualifié de « localisation des ARNs ».  Chez les types cellulaires dotés d’une polarisation marquée, notamment les neurones ou certains embryons, la localisation des ARNm constitue un mécanisme élégant permettant de restreindre l’expression et l’activité protéique associée à un contexte spatiotemporel précis. Bien que diverses techniques d’imagerie permettent d’apprécier la distribution spatiale des transcrits à haute résolution, elles se prêtent difficilement à l’étude systématique de l’asymétrie spatiale du transcriptome.   Cette thèse retrace d’abord le développement de méthodes biochimiques de fractionnement cellulaire et extracellulaire couplées au séquençage à haut débit des ARNs comme approche systématique dans l’étude de la localisation des ARNs. Ces méthodologies, qualifiées collectivement de CeFra-seq (« Cell Fractionation – RNA-seq »), se veulent complémentaires aux outils d’imagerie. Le chapitre 4 est consacré à une description technique détaillée de l’approche CeFra-seq chez les cellules humaines leucémiques K562, accompagnée d’étapes de validation et de transformation de données. Les chapitres subséquents traitent ensuite de l’application de ces méthodologies pour explorer quatre questions fonctionnelles chez divers systèmes biologiques.   Le chapitre 6 tire profit de l’approche CeFra-seq pour explorer les propriétés subcellulaires des ARNs ciblés aux vésicules extracellulaires (VEs). Les VEs correspondent à un groupe hétérogène de structures nanoscopiques constituées d’une bicouche lipidique qui contiennent un répertoire spécifique d’acides nucléiques et des protéines. Ubiquitaire au sein des liquides biologiques, les VEs ont été associées à la communication intercellulaire dans divers contextes, de la présentation des antigènes à la progression tumorale.  Or, les mécanismes qui déterminent la localisation préférentielle de certains ARNs aux VEs demeurent nébuleux. En contrastant de manière systématique les populations d’ARNs contenus dans ces structures aux répertoires subcellulaires obtenus par l’approche de CeFra-seq, mon travail a permis de mettre en évidence certaines propriétés associées au ciblage extracellulaire, notamment l’accessibilité cytosolique, la taille des ARNs ainsi que des éléments de séquence en cis.   Le chapitre 7 propose une comparaison extensive des propriétés morphologiques et transcriptomiques des VEs issues d’une série de lignées cellulaires humaines et de lignées embryonnaires de Drosophile. Ce travail révèle que les VEs de Drosophile sont plus petites que celles des cancers humains et que l’enrichissement d’ARNs courts transcrits par la polymérase III prévaut chez les VEs des deux espèces. Ensemble, ces résultats valident l’hypothèse d’une conservation élevée des phénomènes d’export de l’ARN.   Le chapitre 8 étend CeFra-seq à un nouveau contexte biologique : le développement embryonnaire de la Drosophile. Ici, cette méthodologie conduit à l’établissement de répertoires de transcrits dotés d’une forte asymétrie spatiale et temporelle au cours de l’embryogenèse. L’analyse des mutants SLBP, un facteur de maturation des ARNs d’histone, et de Chk1, régulateur des voies de dommage à l’ADN, montre ensuite que la déplétion de ces protéines compromet sélectivement l’expression des transcrits zygotiques, identifiés grâce à la méthode CeFra-seq.   Le chapitre 9 relate une étude des ARNs antisens issus du locus des histones pendant l’embryogenèse de la Drosophile. L’expression de ces transcrits non-polyadénylés fluctue pendant le développement et dépend de la protéine SLBP. Ici, l’approche CeFra-seq révèle que ces transcrits antisens, strictement zygotiques, co-ségréguent avec leurs ARNm complémentaires, un résultat qui évoque la formation d’ARN double-brin, puis de petits ARN interférents. Pour faire suite à cette hypothèse, j’ai démontré que de petits transcrits issus du locus des histones s’associent au facteur catalytique de la machinerie d’interférence aux ARNs, Argonaute-2. De plus, la déplétion d’Argonaute-2 mène à une dérepression des ARNm d’histones. Ensemble, ces résultats suggèrent un modèle de transcription antisens zygotique précoce menant à la formation de petits ARNs interférents qui contribuent à l’élimination des ARNm d’histones contribués maternellement.   Ainsi, cette thèse est échafaudée sur le développement d’une approche versatile de l’étude systématique de la localisation des ARN, CeFra-seq, décrite dans le chapitre 5. La mise au point de cette approche débouche ensuite sur des études fonctionnelles visant à mieux comprendre les propriétés des ARNs ciblés au VEs (Chapitre 6) et le degré de conservation de ce ciblage (Chapitre 7). La suite de la thèse exploite l’approche CeFra-seq pour explorer le phénotype transcriptomique de la déplétion de SLBP chez l’embryon de Drosophile (Chapitre 8), ainsi que les propriétés et fonctions d’ARN antisens issus du locus des histones chez l’embryon précoce (Chapitre 9).

Keyphrases: ARN, Vésicules extracellulaires, régulation post-transcriptionnelle, Développement embryonnaire, Drosophile, Histones