Méthodes optiques d’attribution d’identifiants moléculaires à des cellules uniques pour assurer leur traçabilité

Bien qu’apparues récemment, les technologies de séquençage de cellules uniques ont déjà largement illustré l’immense variabilité observable entre les cellules d’un tissu. Dès lors, nombre de techniques permettant de caractériser un échantillon biologique évoluent rapidement vers l’analyse individuelle de chaque cellule constituant l’échantillon. Cette variabilité est en effet porteuse d’informations déterminantes qui sont perdues lorsqu’une étude est réalisée en moyenne sur des millions de cellules. Or, si l’on exclut la microscopie, la majorité des protocoles applicables aux cellules uniques requiert une homogénéisation de l’échantillon en une suspension de cellules. Dès que la structure de l’échantillon est brisée, toute information concernant des éléments distinctifs facilement observables au microscope tels que la position, la forme, les contacts avec l’environnement, la direction et la vitesse de déplacement de la cellule étudiée est perdue. Ces éléments sont pourtant des descripteurs clefs du développement d’un embryon ou d’une pathologie, des réponses immunitaires, du fonctionnement du système nerveux, de la croissance et de la différenciation cellulaire. L’objectif de ce travail est de développer une approche qui permette d’associer une identité aux cellules d’intérêt afin d’en assurer la traçabilité tout au long des protocoles expérimentaux auxquels elles seront soumises par la suite. Les informations obtenues sur chacune de ces cellules par observation au microscope pourront ainsi être corrélées à celles obtenues lors d’analyses subséquentes. Dans un premier temps, notre but a été d’attacher un marqueur fluorescent à des cellules arbitrairement choisies une à une dans une image de microscope. Nous avons pour cela développé « Cell labeling via photobleaching » (CLaP). Cette méthode repose sur l’utilisation d’un laser pour photoblanchir un fluorophore, ce qui génère un radical libre et permet la liaison d’une biotine à la membrane plasmique des cellules. Cette procédure est non toxique, n’affecte pas le transcriptome des cellules visées et le marquage peut être détecté plusieurs jours après avoir été placé. Nous faisons la démonstration de principe de l’utilisation de CLaP en conjonction avec la plateforme Fluidigm C1TM pour obtenir la séquence de quelques cellules choisies individuellement dans un échantillon. Nous étendons ensuite l’utilisation de cet outil à des échantillons tridimensionnels, ainsi qu’à l’ancrage simultané de plusieurs étiquettes de couleur, et à la génération de liaisons entre les cellules et leur substrat afin de permettre leur isolation. Nous changeons ensuite de paradigme et, plutôt que d’essayer de reconnaître les cellules d’intérêt après avoir séquencé toutes les cellules de l’échantillon, nous cherchons à les isoler. Ces cellules purifiées restent viables et peuvent ensuite être séquencées, réinjectées, cultivées… Pour cela, nous proposons « Single-Cell Magneto-Optical Capture », scMOCA, une adaptation du précédent protocole qui permet de coller des billes magnétiques à la surface de cellules d’intérêt pour les extraire à l’aide d’un simple aimant. Ces manipulations nous ont permis de purifier sans dommages des cellules reconnues très sensibles tels des neurones primaires et des cellules souches embryonnaires. Nous démontrons les capacités de cette procédure en générant des lignées de cellules choisies pour leur capacité exceptionnelle à réparer les dommages induits à l’ADN et ainsi qu’en purifiant des cellules multinucléées jouant un rôle déterminant dans l’apparition des résistances aux médicaments et les récidives de cancer et finalement en extrayant les premières cellules qui se différencient en adipocytes à partir d’une culture de cellules 3T3.

Keyphrases: Cellule unique, marquage, séquençage, tri cellulaire, cancer, labeling, photobleaching