Effets de l'estradiol et du chargement mécanique sur la régulation de la POC5 et du récepteur ADGRG7 dans la scoliose idiopathique

La scoliose est une déformation complexe en 3D de la colonne vertébrale ayant une prévalence de 1.5-3% dans la population générale. La forme la plus commune est la scoliose idiopathique (SI) qui inclue la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) affectant principalement les filles au cours de la puberté. L’étiologie est largement inconnue, mais les observations cliniques révèlent un rôle de l’hérédité ainsi que d’une croissance rapide dans le développement de la SIA. Il existe une forte évidence qu’une composante génétique entre en jeu dans cette pathologie. Récemment, de nombreux gènes ont été suspectés d’être responsables ou de contribuer à la SI. Notre équipe a identifié des variantes du gène POC5, codant pour une protéine centriolaire, dans une large famille française dont plusieurs membres sont atteints de SI. Dans cette même famille, nous avons suspecté l’implication d’une mutation du gène ADGRG7 (récepteur orphelin appartenant aux récepteurs d’adhésion couplés aux protéines G) dans la pathogénicité de la SI. Au travers de nos travaux, nous nous sommes concentrés sur l’élucidation du rôle des protéines POC5 sauvages et mutantes (in vitro et in vivo) ainsi que sur la régulation de l’expression de POC5 et ADGRG7 par l’estradiol (E2), dans le but de tester si ces gènes pourraient être fonctionnellement liés à la scoliose.  Afin d’investiguer le rôle du gène POC5 dans la SI, nous avons surexprimé la protéine POC5 mutante dans des lignées cellulaires par transfection transitoire (in vitro) et nous avons induit une perte de fonction du gène POC5 dans un modèle animal, le poisson zèbre (in vivo). Le rôle de POC5 a été étudié par : 1) Analyses de spectroscopie de masse et co-immunoprécipitation afin d’identifier les différents partenaires de liaisons entre la protéine sauvage (wt POC5) et mutante (mut POC5); 2) immunolocalisation de la protéine sauvage et mutante au niveau cellulaire; 3) histologie et immunohistochimie réalisés sur des tissus issus de poissons zèbres contrôles (wt POC5) et scoliotiques (mut POC5). Notre travail a permis d’identifier plusieurs protéines partenaires  de la POC5, et nous avons trouvé des interactions fonctionnelles entre ces protéines et la POC5 reliées aux cils et  centrosome. Un certain nombre de protéines ciliaires ont été identifiées comme interagissant avec wt POC5 et non avec mut POC5 comme CEP290, RAB11, CKAP5, Annexine 2 et Septine 9. Au niveau cellulaire, la localisation et la colocalisation des protéines wt POC5 et POC5 mutée avec la tubuline alpha acétylée (marqueur ciliaire), confirme la conséquence de la mutation sur la localisation subcellulaire en relation avec la longueur et l’intensité de la coloration du cil. In vivo, nous avons identifié de nombreux défauts de la rétine et de l’oreille interne chez le poisson zèbre POC5 mutant par rapport au contrôle. Enfin, en utilisant différents marqueurs des couches rétiniennes et la tubuline acétylée, nous avons localisé ces défauts dans le segment externe et les cônes de la rétine.  Afin d’étudier le rôle possible de POC5 et ADGRG7 dans la SI, nous avons examiné comment  POC5 et ADGRG7 est régulé au niveau transcriptionnel. Nous avons utilisé des modèles cellulaires, des ostéoblastes humains dérivées de contrôles et de SIA patient, et nous avons étudié l’expression de la protéine POC5 et ADGRG7 en réponse à une stimulation par l’E2. La région promotrice du gène ADGRG7 a été clonée et analysée pour les éléments cis médiant les effets de l’E2. Les analyses de délétion du promoteur indiquent que le site SP1 dans le fragment 474bp est requis pour une activité basale ainsi que pour une activation hormone-dépendante, et des mutations dans les sites de liaison au sein de cette région résultent en la perte de transactivation. Les résultats d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont montré que le site SP1 ESRα lie le promoteur d’ADGRG7. Nos résultats suggèrent que la régulation de l’expression d’ADGRG7 par l’E2 est due à l’association des protéines ESRα et SP1 au promoteur d’ADGRG7.   La même stratégie expérimentale a été appliquée pour l'étude de la régulation de POC5 par E2. L'analyse de délétion et ChIP ont confirmé la régulation de POC5 à travers ESRα. Basé sur des études de promoteur, qPCR, Western blot et ChIP, cette étude clarifie comment  POC5 et ADGRG7 sont régulées par l’E2.  Un autre aspect de ce projet était d’étudier les différents effets du chargement mécanique sur des cellules, incluant des ostéoblastes humains, exprimant POC5 sauvage ou mutée. Les cellules ont été soumises à un stress mécanique à différents temps, et différentes voies de signalisations (incluant ERK, p38, NFκB) ont été testées. Nos résultats montrent une différence dans la réponse des cellules surexprimant POC5 mutée par rapport aux cellules contrôles. Les effets du chargement comprenant les différentes voies de signalisations ont été montrés comme étant initiés via TRPV4, un canal calcique perméable activé par l’étirement localisé dans le cil primaire et la membrane plasmique.

Keyphrases: Scoliose idiopathique de l’adolescent, Gène POC5, Protein d’adhesion –Couplé au Receptor-G7 (ADGRG7), Estradiol (E2), Stress mécanique, sigle anglais pour transient receptor potential vanilloide 4 récépteur (TRPV4), Cils, Cilia, POC5, ADGRG7, TRPV4, E2