Étude de la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus dans la noirceur

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est  sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit  indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes  diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation  d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote  gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant,  ce processus est très complexe et  nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup  d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce  phénomène est rigoureusement régulé.  Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité  de faire la fixation de l’azote.  Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance  préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme  responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une  régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif),  une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la  transcription des autres gènes  nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la  nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de  régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et  les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est  aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais  jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette  régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent  se poser: quelles sont les protéines qui  interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à  la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes,  amtB- ,  glnK- ,  glnB-  et  amtY-   poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre  à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot,  on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la  nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii      tout le système déjà impliqué dans la réponse à un  choc d’ammoniaque, est également  nécessaire pour une réponse à un manque de lumière  ou d’énergie (les protéines AmtB,  GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or,  Rhodobacter capsulatus est capable de fixer  l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions  de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu  étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le  complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de  telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la  croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires  (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de  cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10%  mélangé avec de l’azote.

Keyphrases: Métabolisme de l’azote, Nitrogénase, Noirceur, Microaérobie, Régulation transcriptionnelle, Transcriptionnel regulation