Regulation of bone-derived hormones by post-translational modifications

Les fonctions endocriniennes des os sont médiées par au moins deux hormones, l’ostéocalcine et le facteur de croissance fibroblastique 23 « Fibroblast growth factor 23 » (FGF23), ces derniers sont secrétés par les cellules osseuses, les ostéoblastes et les ostéocytes. L’ostéocalcine est produite par les ostéoblastes et régule le métabolisme du glucose et énergétique. Elle améliore ainsi la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline. Également, elle favorise la sécrétion d’insuline et la prolifération des cellules β, elle augmente la dépense énergétique et réduit l’accumulation de graisse. L'ostéocalcine est gamma-carboxylée au niveau de trois résidus d'acide glutamique (Glu), un processus qui inhibe sa fonction endocrinienne chez la souris et l'humain. Le pH acide de la lacune de résorption décarboxyle l'ostéocalcine et libère sa forme non carboxylée (ucOCN), la forme active de cette hormone. Nos connaissances sur la régulation des fonctions endocriniennes d’ostéocalcine sont encore limitées à sa gamma-carboxylation. Puisque cette hormone est secrétée par les ostéoblastes et les ostéocytes, des cellules endocriniennes non classique, nous avons émis l’hypothèse que l'ostéocalcine pourrait être soumise à d'autres modifications post-traductionnelles (PTMs) au niveau de la voie de sécrétion contrôlant ses fonctions endocriniennes. Dans la première partie de cette thèse, nous avons montré que le propeptide de l'ostéocalcine pouvait être clivé dans son extrémité C-terminale au niveau du motif de base « RLRR » par la pro-protéine convertase furine, un processus qui se produit indépendamment de la gamma-carboxylation de l'ostéocalcine. L’inactivation du gène codant pour la furine, spécifiquement dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris, abolit totalement le clivage de la pro-ostéocalcine et altère son activation et sa libération lors de la résorption osseuse. Par conséquent, ces souris sont caractérisées par un niveau bas d'ucOCN dans le sérum, ce qui entraîne une altération de la tolérance au glucose, une diminution de la sécrétion d'insuline et de la dépense énergétique ainsi qu’une augmentation de l'accumulation de graisses. De plus, ces souris ont une perte d'appétit indépendamment de l'ostéocalcine. La restriction de la nourriture pour les souris contrôles ou « pair feeding » rend le phénotype des souris déficientes en furine plus apparent. Il apparait à un plus jeune âge avec une résistance à l'insuline. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons découvert que l'ostéocalcine de souris est O-glycosylée au niveau de la sérine 8, un processus qui se produit indépendamment de sa gamma-carboxylation et de son clivage. Cette modification, qui n'est pas présente chez l'ostéocalcine humaine, augmente la demi-vie de l'ostéocalcine de souris dans le plasma ex vivo et in vivo. Il est intéressant de noter que la tyrosine 12 dans l'ostéocalcine humaine correspond à la sérine 8 dans la séquence de la souris, tandis que la mutation Tyr12Ser est suffisante pour générer une ostéocalcine humaine O-glycosylée et lui conférer une demi-vie plus longue dans le plasma de la souris comparativement à la forme native.  FGF23 est une hormone secrétée par les ostéoblastes et les ostéocytes. Elle régule la réabsorption de phosphate et la production de vitamine D dans le tubule proximal du rein. Sa fonction endocrine est inhibée par un clivage endoprotéolytique qui libère ses fragments N- et C-terminaux. La mutation du motif « RHTR », un site de clivage consensus pour les proprotéines convertases PC(s), a été identifié chez les patients atteints du rachitisme hypophosphatémique génétiquement déterminés ou « Autosomal dominant hypophosphatemic rickets » (ADHR). Ces patients se caractérisent par une augmentation du taux de FGF23 intact, une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Malgré l’importance de FGF23 dans plusieurs maladies, l’identité de l’enzyme responsable du clivage de FGF23 n’est pas encore connue, même si la furine et la proprotéine convertase subtilisine/kexine type 5 (PC5) peuvent cliver FGF23 in vitro. Dans la troisième partie de cette thèse, nous tentons de répondre à cette question en utilisant des souris déficientes en furine et/ou PC5 spécifiquement dans les ostéoblastes et les ostéocytes. Sous des conditions physiologiques, l’inactivation du gène de furine dans les ostéoblastes et les ostéocytes augmente le niveau du FGF23 intact par 25%. Malgré cette augmentation ces souris maintiennent une phosphatémie normale et elles ne montrent pas de signe d’ostéomalacie. On a aussi montré qu’une déficience en fer, une condition qui augmente la production de FGF23 au niveau de l’ARN messager et protéique, le FGF23 est totalement en forme intact dans les souris déficientes en furine, montrant que le clivage de FGF23 est totalement inhibé dans cette condition. En revanche, l’injection d’érythropoïétine ou d’interleukine 1-β, des conditions qui augmentent la production de FGF23, induit une augmentation significative du taux de FGF23 total dans le sérum des souris déficientes en furine et/ou PC5 dans les ostéoblastes et les ostéocytes, tandis que le niveau du FGF23 intact n’a pas augmenté de la même façon, suggérant que la FGF23 est correctement clivée chez ces souris. D’une façon intéressante et malgré les défauts développementaux et le retard dans la minéralisation osseuse observée dans les souris complètement déficientes en PC5, la suppression conditionnelle de PC5 dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris n'a entraîné aucun défaut osseux. Cependant, l’inactivation du gène codant pour la furine dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris a augmenté les paramètres osseux trabéculaires et a diminué l'épaisseur de l’os cortical. De plus, ces souris ont eu une diminution de la densité minérale et la rigidité des os reflétant une mauvaise qualité osseuse.  En résumé, nous avons décrit pour la première fois que la furine est un régulateur multifonctionnel de la fonction des ostéoblastes et des ostéocytes in vivo. Elle régule le métabolisme du glucose en assurant le clivage de la pro-ostéocalcine, qui est nécessaire à la maturation et à la bio-activité de l'ostéocalcine, et en régulant l'appétit indépendamment de l'ostéocalcine. Ces résultats suggèrent la présence d'ostéokines supplémentaires régulant l'appétit et contrôlées par la furine. De plus, dans les ostéoblastes, la furine régule partiellement le clivage de FGF23 en assurant une phosphatémie normale, suggérant que la régulation de l'accumulation de masse osseuse par la furine est indépendante du FGF23. En outre, nous avons découvert que l'ostéocalcine de souris est soumise à l’O-glycosylation, une modification qui n'est pas conservée chez l'humain, ni chez d’autres espèces, et qui augmente la demi-vie de l'ostéocalcine de souris. La glycosylation artificielle confère à l'ostéocalcine humaine une demi-vie plus longue, offrant ainsi une approche permettant d'augmenter potentiellement la bio-activité de l'ostéocalcine humaine dans les futures applications thérapeutiques de l'ostéocalcine dans les maladies humaines.

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