Structure-function studies of class I aldolases - exploring novel activities : mechanism, moonlighting, and inhibition

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I est une enzyme glycolytique (EC 4.1.2.13) qui catalyse le clivage réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Des années de recherche sur FBP aldolase ont permis d’identifier les résidus impliqués dans son mécanisme réactionnel, ont tracé en grande partie les coordonnées de la réaction, ont révélé de nouvelles fonctions dites « moonlighting », et ont validé l’aldolase comme une cible attrayante pour des applications anti-glycolytiques tel que le cancer. Il existe néanmoins des questions en suspens relatives à ces activités que nous avons étudiées.   Tout d'abord, la trajectoire détaillée de l'aldéhyde relatif à sa liaison au site actif allant jusqu’à la formation du lien carbone-carbone par condensation aldolique est indéfini. Pour élucider les détails moléculaires liés à ces événements, nous avons déterminé des structures cristallographiques à hautes résolution de l’aldolase de classe I chez Toxoplasma gondii, qui porte une identité de séquence élevée avec l’aldolase humaine (57%), en complexe avec l’intermédiaire ternaire de pré-condensation. Le complexe ternaire révèle un mode de liaison non-productive inhabituel pour G3P dans une configuration cis qui permet l’alignement de l'aldéhyde à proximité du nucléophile naissant. La configuration compétente pour la condensation aldolique provient d'une transposition cis-trans de l'aldéhyde qui produit une liaison hydrogène courte permettant la polarisation de l'aldéhyde et le transfert de proton au niveau de Glu-189. Nos résultats informent les chimistes synthétiques qui cherchent à développer l’aldolase comme biocatalyseur pour des réactions stéréo-contrôlées.   Le rôle présumé de l’aldolase dans la production du méthyglyoxal (MGO), un métabolite dicarbonyle hautement réactif qui génère des « advanced glycation end products » (AGES) a également été étudié structurellement et enzymatiquement. Une enquête structurelle cristallographique de MGO générée par décomposition enzymatique chez l’aldolase de classe I a révélé que, contrairement aux indications préliminaires, l'apparition hypothétique de MGO et de phosphate inorganique (Pi) résultant de la décomposition enzymatique de DHAP dans le site actif de l’aldolase est mieux interprétée par une population mixte de DHAP et de molécules d'eau. Une étude enzymatique a révélé que la décomposition spontannée des trioses-phosphate est une source majeure de la production de MGO, alors qu’une production catalysée par l’aldolase est peu concluante. L’identification des sources de production de MGO continue d'être une priorité afin de développer des stratégies pour atténuer les manifestations cliniques de pathologies associées au MGO.   La FBP aldolase est également reconnu pour ses activités « moonlighting » - du fait qu’elle effectue plus d'une activité sans rapport avec sa fonction glycolytique. Divers partenaires de l’aldolase sont rapportés dans la littérature, y compris les adhésines de surface cellulaire chez les parasites apicomplexes, dans lequel l’aldolase exécute une fonction d'échafaudage entre le complexe actomyosine et les adhésines - une interaction qui est décisive pour la motilité et l'invasion des cellules hôte. Le mode de liaison de cette interaction a été étudié et nos résultats sont compatibles avec une liaison au site actif. Les détails précis de cette interaction ont des implications thérapeutiques, étant donné que le ciblage de celui-ci réduit l'invasion des cellules hôte par les parasites.   Enfin, l’aldolase de classe I est de plus en plus reconnu pour son potentiel comme cible anti-glycolytique dans les cellules qui sont fortement tributaires du flux glycolytique, comme les cellules cancéreuses et les parasites protozoaires. Le développement de nouveaux inhibiteurs de haute affinité est donc non seulement avantageux pour des études mécanistiques, mais représente un potentiel pharmacologique sans fin. Nous avons développé une nouvelle classe d’inhibiteurs de haute affinité de type inhibition lente et avons déterminé la base moléculaire de leur inhibition grâce à des structures cristallographiques à haute résolution et par un profilage enzymatique.   Cette étude, qui combine plusieurs disciplines, y compris la cristallographie, enzymologie et chimie organique, souligne l'intérêt et l'importance d'une approche multidisciplinaire.

Keyphrases: Toxoplasma gondii, Condensation aldolique, Mécanisme catalytique, Stéréosélectivité, Méthylglyoxal, Adhésine, Conception rationnelle d'inhibiteur, Biologie structurale, Cristallographie aux rayons-X, Aldolase de classe I, Enzymologie