Exploration bioinformatique des interactions pollen–pistil chez Solanum chacoense

Rassemblant 107 espèces distribuées dans toute l’Amérique latine, les pommes de terre sauvages (Solanum sect. Petota) forment un réservoir de germoplasme important pour l’amélioration de leur cousine cultivée (S. tuberosum). Pourtant, bien qu’elles vivent en sympatrie et qu’elles aient la capacité physiologique de s’hybrider avec de proches parentes, ces espèces sauvages présentent de fortes barrières d’isolement reproductif. Les résultats préliminaires sur lesquels se fondent cette thèse, présentés au chapitre 1, montrent que les interactions pollen-pistil sont au cœur de cet isolement: dans un pistil hétérospécifique, les tubes polliniques (TP) sont ralentis et leur réceptivité aux signaux chimioattractifs de l’ovule est compromise.  Comme nous le verrons au chapitre 2, l’examen de l’abondante littérature scientifique existante indique qu’un grand nombre de protéines exprimées dans le pistil et le TP ont été caractérisées chez d’autres espèces et que plusieurs contribuent, par leur divergence interspécifique, à l’établissement de points de contrôle précis tout le long du trajet du TP dans le pistil. Parmi elles, les protéines chimioattractives LURE contrôlant le guidage directionnel du TP chez Torenia et Arabidopsis sont un exemple remarquable de médiateurs moléculaires de l’isolement reproductif. L’objectif de cette thèse est d’isoler des gènes candidats jouant des fonctions analogues chez les Solanacées tubéreuses. C’est dans ce souci que nous avons entrepris d’explorer à grande échelle, dans une approche mêlant bioinformatique, protéomique et transcriptomique, la diversité des gènes exprimés dans les ovules de S. chacoense.  Au chapitre 3, nous présentons un nouvel outil de recherche de séquences, KAPPA, spécifiquement dédié à la recherche de peptides riches en cystéines (CRP), une catégorie de protéines particulière dont font partie les chimioattractants ovulaires connus, ainsi que plusieurs autres interactants pollen-pistil. Cet outil a facilité l’identification de nouvelles CRP dans les chapitres suivants.  Nous en détaillons l’algorithme, en présentons les principales fonctions et fournissons des résultats démontrant ses performances sur des jeux de données calibrés.  Dans le chapitre 4, nous décrivons une étude du sécrétome ovulaire de S. chacoense comparant le contenu protéique des exsudats d’ovules matures (qui sont capables d’attirer le TP) et d’ovules immatures (qui en sont incapables). Nous présentons la méthode tissue-free gravity-extraction method (tf-GEM) utilisée pour collecter les exsudats et détaillons l’analyse bioinformatique effectuée à partir des résultats de spectrométrie de masse. Nous passons en revue les 305 protéines sécrétées identifiées dans les exsudats d’ovules, dont environ la moitié sont régulées entre les deux conditions à l’étude, analysons les catégories fonctionnelles associées, et discutons des applications possibles pour la découverte de gènes candidats.  Le chapitre 5 présente les résultats d’une analyse par biopuce de la réponse transcriptionnelle des ovaires de S. chacoense à différents types de pollinisation : conspécifique compatible, conspécifique incompatible, et hétérospécifique compatible. Nous montrons que des gènes ovulaires sont activés ou réprimés à distance dès les premières heures suivant la pollinisation et que cette réponse s’amplifie et devient spécifique à chaque génotype mâle au fur et à mesure de la progression des TP dans le style jusqu’à la fécondation. Nous discutons du rôle de différents médiateurs, notamment l’éthylène, dans la transmission à longue distance du signal de pollinisation.  Au chapitre 6, nous présentons les résultats d’une analyse transcriptomique de plus grande profondeur réalisée par séquençage d’ARN sur des ovules de S. chacoense capables (ovules sauvages matures) ou incapables (ovules sauvages immatures, ovules du mutant frk1 dépourvus de sac embryonnaire) d’attirer les TP. Nous montrons comment notre méthode hybride, recourant à la fois à des assemblages de novo et ab initio contre le génome récemment publié de S. chacoense, nous a conduits à obtenir un jeu de 4353 transcrits enrichis dans l’ovule. Nous détaillons les améliorations portées aux annotations existantes du génome, avec notamment la découverte de nouveaux loci codant pour des CRP reproductives. Nous présentons une analyse du profil d’expression des gènes dans l’ovule, discutons des catégories fonctionnelles associées, et terminons avec l’identification d’une liste de chimioattractants candidats.  Enfin, le chapitre 7 présente en détail ces chimioattractants candidats, les techniques utilisées pour exprimer et purifier ces protéines en bactéries et en levures, ainsi que les dispositifs microfluidiques élaborés pour en vérifier la capacité à attirer le tube pollinique. Nous incluons les résultats préliminaires obtenus avec cette méthode et concluons sur les développements possibles de notre projet.

Keyphrases: Solanum, Pommes de terre sauvages, Isolement reproductif, Ovule, Guidage du tube pollinique, Protéines riches en cystéines, Transcriptomique, Sécrétomique, Microfluidique