Knockout mouse model generated by CRISPR technology to study the function of BSP proteins on male fertility in vivo

L'infertilité est un problème mondial qui touche 15% des couples, les facteurs masculins et féminins contribuant de façon égale aux cas d'infertilité. La cause de l'infertilité masculine est inconnue dans la moitié des cas. Une série d'événements cellulaires coordonnés est responsable de l'interaction spermatozoïde-ovocyte et de la fécondation réussie. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes impliqués dans la production des spermatozoïdes est essentielle pour faciliter le diagnostic et le traitement de l'infertilité masculine, ainsi que la régulation de la fertilité. Au cours des trois dernières décennies, le laboratoire du Dr P. Manjunath a mené des recherches approfondies sur une famille particulière de protéines exprimées spécifiquement dans l'appareil reproducteur masculin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP). Cette famille de protéines a d’abord été identifiée dans le plasma séminal bovin, et par la suite, des protéines BSP ont été identifiées chez d’autres espèces de mammifères telles que l’étalon, le verrat, le bélier et la chèvre. Selon les espèces, ces petites protéines ubiquitaires sont exprimées par les vésicules séminales et/ou l'épididyme. Des travaux systématiques effectués par le groupe de Manjunath ont démontré que ces protéines se lient aux phospholipides portant un groupement choline sur le feuillet externe de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et/ou pendant le passage à travers l'épididyme, et favorisent la capacitation des spermatozoïdes. En 2007, les gènes BSP-homologues ont été identifiés dans l’épididyme humain (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). D'autres études ont montré que l'interaction des protéines BSP avec la membrane des spermatozoïdes entraîne une altération des lipides (phospholipides et cholestérol) et facilite la maturation des spermatozoïdes épididymaires. D’autres recherches sur les protéines BSP ont suggéré que ces protéines pourraient jouer un rôle important dans la fertilité masculine. Cependant, le rôle exact des protéines BSP dans la fertilité est resté largement inconnu. Dans le cadre de la présente étude, j'ai créé le premier modèle de souris BSP knockout simple et double pour déterminer si l'absence de protéines BSP pouvait affecter la fertilité masculine. Pour cibler et générer des modèles de souris knockout simple et double Bsph1 et Bsph2, l'approche de courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées (CRISPR/Cas9) fut utilisée. De plus, les techniques RT-PCR, Digital Droplet-PCR (dd-PCR) et chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont permis d'examiner l'expression des gènes Bsp au niveau de l'ARNm et des protéines afin de confirmer l'élimination des protéines BSP chez les souris knockout. Les lignées de souris BSP knockout ont été utilisées pour évaluer les paramètres de fertilité des spermatozoïdes. Aucune anomalie évidente n'a été observée dans la capacité de fertilisation ni dans le nombre de souriceaux engendrés par les mâles knockout par rapport au type sauvage. Le décompte du nombre de spermatozoïdes et l'analyse de leur motilité n'ont révélé aucune différence significative entre les souris BSP knockout et les souris contrôle. Il est intéressant de noter que des différences significatives en termes de poids corporel des souriceaux ont été observées dans le double knockout par rapport au type sauvage. Sur la base de ces résultats, nous concluons que les protéines BSP, individuellement ou ensemble, ne sont pas essentielles aux fonctions spermatiques et pour la fécondation chez la souris, et que l’absence de ces protéines n’affecte pas la fertilité masculine. D'autres études pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués et les voies possibles par lesquelles les protéines BSP pourraient être impliquées dans la régulation du poids des souriceaux.

Keyphrases: Infertilité masculine, Protéines binder of sperm homolog, Épididyme, Souris Knockout