Étude de la régulation des tachykinines et son impact sur l’expression des peptides opioïdes à l'aide de la chromatographie liquide à haute performance
et de la spectrométrie de masse

Les peptides appartenant à la famille des tachykinines telle que la substance P (SP) sont des acteurs essentiels contribuant à l’hyperalgésie primaire et secondaire. La SP libérée par les neurones afférents primaires, ne provoque pas à elle seule des décharges nociceptives, mais elle potentialise l’effet de divers neurotransmetteurs tel que le glutamate. Pour ces différentes raisons, de nombreuses recherches ont été effectuées avec des antagonistes des récepteurs neurokinines et en particulier des récepteurs NK1. Cependant, malgré des études pré-cliniques prometteuses, les antagonistes du récepteur NK1 n’ont pas montré d’effet significatif chez l’Homme. La biosynthèse des neuropeptides actifs passe par la maturation protéolytique des pro-neuropeptides. La compréhension des mécanismes de la maturation enzymatique des précurseurs des tachykinines, ainsi que l’étude de la stabilité métabolique de la substance P (SP) permettraient d’élucider des stratégies de traitement innovateur en favorisant l’inhibition du processus de maturation ou la production de fragments peptidiques moins actifs ou inactifs. Le premier objectif de cette étude était d’élucider le rôle de la Proproteine convertase 1 (PC1) et de la Proproteine convertase 2 (PC2) dans la maturation de la protachykinine en utilisant des fractions S9 de la moelle épinière des souris du type sauvage (WT), PC1-/+ et PC2-/+. La caractérisation et la quantification des neuropeptides ont été réalisées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance et de la spectrométrie de masse. Les résultats montrent que PC1 et PC2 interviennent dans la maturation de la protachykinine et ces deux enzymes sont essentielles pour la biosynthèse de la Tachykinine58-71, le précurseur de la SP. Une réduction de plus de 50% de la vitesse de formation dans les fractions S9 de la moelle épinière de souris mutantes PC1 et PC2 a été observée. Les résultats obtenus révèlent que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de la protachykinine et suggèrent un rôle important de ces enzymes dans la maturation de la protachykinine-1.    La protéolyse régule probablement les concentrations extracellulaires de la SP, mais peu d'études ont été menées sur le métabolisme des tachykinines. Dans ce présent travail, nous démontrons que la protéolyse contrôle le niveau de la SP dans la moelle épinière menant à la formation de fragments C-terminaux actifs. La stabilité métabolique de la β-tachykinine58-71 et de la SP était très courte, avec une demi-vie de 5.7 et 3.5 min, respectivement. Plusieurs fragments C-terminaux ont été identifiés, y compris la SP3-11, la SP5-11 et la SP8-11, qui conservent leurs affinités vis-à-vis des récepteurs neurokinines. La stabilité métabolique des fragments C-terminaux était significativement supérieure à celle de la β-Tachykinine58-71 et de la SP. Deux inhibiteurs de Prolyl endopeptidase spécifiques ont été utilisés et ont montré une réduction significative de la vitesse de formation de SP3-11 et de SP5-11. Ainsi, nous avons démontré que le Prolyl endopeptidase est impliqué dans le traitement N-terminal de la SP dans la moelle épinière et dans la formation de la SP3-11 et la SP5-11.    Étant donné que la régulation des niveaux endogènes de peptides opioïdes (DynA, Leu-Enk, Met-Enk) et des tachykinines (Tach58-71, SP) dépend fondamentalement de l'activité de PC1 et de celle de PC2, l'analyse des tachykinines et des neuropeptides opioïdes ont été réalisées. Les résultats obtenus révèlent une diminution significative des neuropeptides pro nociceptifs la Tach58-71 (p <0,05), de la SP (p <0,01) et du NKA (P <0,001)), et des neuropeptides opioïdes DynA (p <0,01), de Leu-Enk (p <0,001), de Met-Enk (p <0,001), dans la moelle épinière de souris PC1 - / + et PC2 - / +. Par conséquent, la modulation de l'activité des PCs a un impact important sur les peptides pro-nociceptifs, mais également sur le système opioïde endogène et par conséquent elle affectera significativement les voies modulatrices de la douleur. Ces résultats suggèrent également que la réduction significative des concentrations de peptides pro-nociceptifs peut altérer la réponse du système opioïde endogène. Les analyses des concentrations des peptides opioïdes chez les souris Tac1-/- ont montré spécifiquement que les concentrations en Endomorphine-2 (EM2), en Leu-Enk et en Dyn A sont significativement inférieures que celles obtenues dans la moelle épinière chez les souris WT. Par conséquent, l’absence de la SP a un impact sur les mécanismes endogènes de modulation de la douleur.    Mots clés : Tachykinines, substance P, proprotéines convertases, protéolyse, peptides opioïdes, moelle épinière, douleur, chromatographie liquide à haute performance, spectrométrie de masse.

Keyphrases: Tachykinines, Substance P, Proprotéines convertases, Protéolyse, Peptides opioïdes, Moelle épinière, Douleur, Chromatographie liquide à haute performance, Spectrométrie de masse