Caractérisation biochimique, structurale et inhibition du système de sécrétion de type IV par l’étude des protéines VirB8

Chez tous les organismes vivants, les systèmes de sécrétion permettent le passage des macromolécules au travers des membranes cellulaires. Les bactéries à Gram-négatifs utilisent les systèmes de sécrétion de type IV (T4SS) pour réaliser une variété de processus impliqués dans les transports macromoléculaires incluant l’échange de matériel génétique. Le plasmide pKM101 code pour un T4SS similaire aux systèmes modèles bien étudiés provenant d’Agrobacterium tumefaciens et de Brucella suis. Dans le chapitre 2, nous avons étudié la structure et la fonction de TraE, un homologue de VirB8 provenant du pKM101, qui est un composant essentiel de tous les T4SSs et qui forme des dimères fonctionnels dans le noyau des T4SSs. Une analyse par cristallographie aux rayons X a révélé une structure similaire aux autres homologues de VirB8, mais possédant une interface de dimérisation modifiée. Cette interface de dimérisation a été corroborée en réalisant des essais de double hybride chez la bactérie, une caractérisation biochimique de la protéine purifiée et des essais de complémentation in vivo, démontrant qu’il existe différents modes de dimérisation parmi les homologues des protéines VirB8. De plus, l’analyse des interactions par BTH et des essais de réticulations ont montré que TraE et ses homologues provenant d’Agrobacterium, de Brucella et d’H. pylori forment des hétérodimères. Ils interagissent également avec des protéines VirB10 hétérologues, indiquant un certain degré de plasticité au niveau des interactions protéine- protéine pour les protéines de type VirB8 (VirB8-like). Enfin, pour évaluer d’avantage les caractéristiques communes des protéines de type VirB8, nous avons testé une série de petites molécules dérivées d’inhibiteurs de la dimérisation de VirB8 provenant de Brucella. Pour cela, nous avons prouvé que ces molécules se lient à TraE de manière in vitro, que par une prédiction in silico par arrimage moléculaire, qu’elles se lient à une surface structuralement conservée chez les protéines de type VirB8 et que certaines de ces molécules inhibent in vivo le transfert du pKM101. Pour conclure à propos de ce chapitre, nous pouvons dire que les protéines de type VirB8 partagent ainsi des sites fonctionnellement importants et cette caractéristique pourra être exploitée pour la conception d’inhibiteurs spécifiques de la fonction des T4SSs. L’augmentation de la fréquence de la résistance aux antimicrobiens est un problème d’importance mondiale. Le transfert plasmidique, réalisé par la fonction de conjugaison de i certains T4SSs, est un contributeur majeur au niveau du transfert des gènes de résistance aux antimicrobiens. Dans le chapitre 3, nous avons présenté une stratégie basée sur l’analyse structurale pour identifier des inhibiteurs de la conjugaison bactérienne réalisée par les T4SSs. Pour cela, nous avons tout d’abord criblé une banque de fragments, par la technique de la fluorimétrie différentielle à balayage, et identifié des molécules qui se lient à la protéine TraE. La co-cristallisation a révélé que des fragments se lient à deux sites alternatifs dont l’un d’entre eux est un nouveau site de liaison qui n’avait jamais été mis en évidence pour les autres protéines de type VirB8. Basé sur les informations structurales obtenues par cristallographie aux rayons X, nous avons conçu de nouvelles molécules qui ont une affinité de liaison améliorée. De plus, il a été montré que ces nouvelles molécules se lient au niveau des deux sites d’inhibition de TraE, inhibent de manière in vitro la dimérisation de TraE et aussi de manière in vivo le transfert par conjugaison du pKM101. Pour conclure, la stratégie présentée dans ce chapitre est généralement applicable pour la conception d’inhibiteurs de transfert des gènes de résistance aux antimicrobiens et de la virulence bactérienne. À ce jour, très peu d’informations sont disponibles sur les composants du T4SS liés à la membrane. Dans le chapitre 4, nous avons montré que TraE, dans sa forme entière, forme un complexe de masse moléculaire élevée distinct de la partie périplasmique de la protéine précédemment caractérisée. Ensuite, par la combinaison de la microscopie électronique et de la diffraction des rayons X aux petits angles nous avons démontré que TraE dans sa forme entière s’assemble en un complexe hexamérique avec un pore central. Nous avons également prouvé, que TraE peut se lier à TraD, qui est une protéine homologue à VirB6 provenant du pKM101, par des techniques de réticulation, de chromatographie d’exclusion stérique et de la microscopie électronique. Pour conclure, nos résultats suggèrent que TraE et TraD forment un pore au niveau du cœur central des T4SSs contribuant à la translocation du substrat. Cette étude, qui combine plusieurs disciplines, incluant de la biochimie, de la biologie structurale ainsi que de la chimie biologique, souligne l’intérêt et l’importance d’une approche multidisciplinaire.

Keyphrases: plasmide, conjugaison, système de sécrétion de type IV, interaction protéine- protéine, criblage à base de fragments, conception de médicaments, résistance aux antimicrobiens, protéine de type VirB8, protéine de type VirB6, pore membranaire, plasmid, VirB8-like