Time-Resolved Phosphoproteomics Unravel the Dynamics of Intracellular Signaling

La phosphorylation des protéines est une modification post-traductionnelle très abondante qui cible les acides aminés sérine, thréonine et tyrosine. Les groupements phosphates sont ajoutés aux protéines par les kinases et retirés par les phosphatases. La phosphorylation d’une protéine régule sa conformation structurelle; ce qui modifie ses fonctions. C’est un vecteur de signalisation intracellulaire, impliqué notamment dans la régulation des interactions protéine-protéine et de l’activité des enzymes. La prolifération, la différenciation et la morphologie cellulaires sont autant de processus régulés par des événements de phosphorylation. Une meilleure compréhension des voies de phosphorylation est ainsi importante pour faire avancer la recherche contre le cancer. L’étude de la phosphorylation des protéines a grandement bénéficié de l’amélioration des techniques de protéomique basées sur la spectrométrie de masse, qui permettent d’analyser en quelques heures des milliers de sites de phosphorylation. Les expériences de spectrométrie de masse permettent habituellement d’étudier les effets de stimuli extracellulaires sur le phosphoprotéome en prenant des mesures à un seul temps post-stimulation donné. Ce type d’analyse ne permet toutefois pas de suivre les changements de phosphorylation dans le temps, ce qui serait utile pour comprendre le fonctionnement des voies de signalisation. La présente thèse décrit le développement et l’application de nouvelles techniques de phosphoprotéomique permettant de mesurer la phosphorylation avec une grande résolution temporelle. Cette approche a permis d’identifier de nouvelles voies de signalisation dépendantes de stimuli et de mieux caractériser certains réseaux de phosphorylation déjà connus.   Tout d’abord, une analyse temporelle du phosphoprotéome a été effectuée pour déterminer les effets de stress thermiques sur Saccharomyces cerevisiae dans les 30 minutes post-stimulation. 15 profils cinétiques différents ont été identifiés. Ces profils de phosphorylation ont permis de mieux définir des interactions kinase-substrat. L’information temporelle a notamment permis de caractériser les réseaux de signalisation des kinases Cdc28 et PKA suite à un choc thermique. De grands changements d’état de phosphorylation ont été observés pour des protéines impliquées dans la transcription, le repliement des protéines et la progression du cycle cellulaire.   Dans une seconde étude, des cellules humaines de cancer du côlon contenant des mutations somatiques de BRAF ou KRAS ont été traitées avec un inhibiteur de BRAF, le Vermurafenib. L’utilisation de la phosphoprotéomique temporelle a permis d’identifier de nouveaux substrats de la voie BRAF-RAS-ERK. De fait, il a été démontré que les facteurs de transcription MKL1/2 et TEAD3 sont des cibles directes de la kinase ERK.   Enfin, les effets sur le phosphoprotéome de petites molécules activatrices de la protéine phosphatase 2 A (PP2A) ont été étudiés. Des cellules hématopoïétiques murines ont été traitées avec les sphingolipides anti-oncogéniques C2-ceramide et SH-BC-893 ainsi qu’avec l’inhibiteur spécifique de PP2A, le LB-100. Les sphingolipides utilisés sont des activateurs connus de PP2A qui causent la mort cellulaire en privant les cellules de nutriments. De fait, les deux sphingolipides causent la perte de transporteurs de nutriments. SH-BC-893 mène en plus à la formation de vacuoles, un phénotype lié à la mobilisation de nutriments. La dynamique du phosphoprotéome a été suivie pendant les 60 minutes suivant le traitement, révélant une activation différentielle de PP2A en présence des sphingolipides. En comparant ces réponses avec le phosphoprotéome de cellules traitées avec le LB-100, il a été possible d’identifier des sites de PP2A sur de nombreuses GTPases et protéines du cytosquelette d’actine, notamment Arhgef2 et Paxilin. De plus, la privation de nutriments s’est avérée être partiellement  dépendante de la polymérisation de l’actine induite par les sphingolipides. Finalement, les phosphoprotéines lysosomales associées au kinase AKT et impliquées dans le recyclage des endosomes sont régulées différent par SH-BC-893 et C2-ceramide, ce qui explique partiellement pourquoi C2-ceramide ne cause pas la formation de vacuoles.   Somme toute, l’analyse temporelle du phosphoprotéome a permis d’étudier différents processus plus en profondeur que ce que permettent les techniques de phosphoprotéomique traditionnelles. Elles ont permis d’élucider des mécanismes biologiques d’importance pour la recherche contre le cancer.

Keyphrases: Phosphoprotéomique, Signalisation intracellulaire, Spectrométrie de Masse, Cancer, Petites Molécules médicamenteuses