Régulation de l’activité de Dicer par TRBP dans la biogénèse des micro-ARN

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants ayant un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes. Ils font partie du complexe de répression induit par les miARN (RNA-induced silencing complex; RISC) où ils servent de guide pour cibler des ARN messagers (ARNm) par complémentarité de séquence et inhibent leur traduction. Les miARN ont le potentiel de réguler la traduction de pratiquement toutes les protéines cellulaires, ce qui leur confère un rôle central dans plusieurs processus cellulaires, dont le développement de l’organisme.  Afin d’être fonctionnels, les miARN doivent passer par une voie de biogénèse hautement régulée où ils sont d’abord transcrits, puis clivés en deux temps par les endonucléases Drosha et Dicer et, finalement, chargés sur Argonaute (AGO) pour former le complexe RISC. Cette thèse s’intéresse à l’étape de clivage par Dicer et sa régulation par le cofacteur TRBP, protéine pouvant à la fois lier Dicer et son substrat.  Le premier objectif de cette thèse est de développer un nouveau protocole pour l’expression et la purification de la protéine Dicer humaine afin de faciliter sa caractérisation in vitro en améliorant les rendements limités des méthodes existantes. Nous avons optimisé l’expression de Dicer dans un système d’expression basé sur des cellules humaines HEK293-6E cultivées en suspension. Ensuite, nous avons développé un protocole de purification en 3 étapes permettant la purification de Dicer en une seule journée, où chacune des étapes a été soigneusement optimisée pour minimiser les pertes et maximiser la stabilité de Dicer. Ensuite, par des études biophysiques de SEC-MALS et microscopie électronique à coloration négative, nous avons confirmé que Dicer était bien repliée sous forme monomérique. Finalement, nous avons fait la caractérisation biochimique de Dicer en mesurant sa liaison à un pre-miARN par études de retard sur gel et des études de cinétique à l’état-stationnaire. Ces expériences de cinétique nous ont permis de déterminer de nouvelles valeurs de kcat et KM qui concordent avec un modèle impliquant un changement de conformation du complexe Dicer-substrat avant la réaction de clivage.  Le deuxième objectif est de caractériser l’effet de TRBP sur l’activité de Dicer. Pour ce faire, nous avons testé quelques pre-miARN en présence de TRBP et montré que cette dernière pouvait être un activateur ou un inhibiteur de Dicer. En effet, TRBP active Dicer à faible concentration de substrat alors qu’elle inhibe Dicer à forte concentration de substrat. Nous avons ensuite caractérisé ce mécanisme enzymatique de manière détaillée par la combinaison d’expériences de liaison et de cinétique à l’état-stationnaire. Notre modèle final montre qu’une faible concentration de TRBP est nécessaire afin d’obtenir un effet d’activation à faible concentrations de substrat. Cela suggère que TRBP active Dicer sans modifier sa grande spécificité pour son substrat. Ces nouveaux résultats suggèrent que TRBP a évolué de manière à pouvoir activer efficacement Dicer sans modifier la spécificité de l'enzyme.

Keyphrases: Dicer, TRBP, purification, enzyme, miARN, Régulation, Cinétique