Le médicament épigénétique 5-Azacytidine stabilise l’ARN messager du récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) via une voie IRE1α/EGFR/ERK1/2- dépendante

Les maladies cardiovasculaires (MCV) occupent la première place en tant que cause majeure de mortalité et de morbidité au Canada et dans le monde. Plusieurs essais cliniques montrent que la réduction du cholestérol associé aux lipoprotéines de faible densité (LDL-c) est une stratégie efficace pour prévenir l’athérosclérose et les maladies coronariennes pour réduire le taux de mortalité. Le récepteur de lipoprotéines de faible densité (LDLR) est une glycoprotéine transmembranaire qui sert à la liaison et  l'endocytose des particules LDL. Chez l'homme, le récepteur LDL est fortement exprimé au niveau du foie, et est responsable de l'élimination de 70% à 80% du LDL-c à partir du plasma. Des mutations génétiques peuvent entraîner un LDLR dysfonctionnel et provoquer l’hypercholestérolémie familiale (FH), une maladie caractérisée par un niveau de LDL-c sanguin très élevé et la formation de plaques d’athérosclérose prématurées.   L'expression du LDLR est strictement contrôlée par les facteurs de transcription appelés protéines de liaison aux éléments régulateurs de stérol «Sterol Regulatory element-binding proteins» (SREBP) en réponse à l'accumulation excessive ou à l'épuisement du cholestérol intracellulaire. La régulation post-traductionnelle du récepteur LDL est médiée par sa dégradation intracellulaire via la proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) ou par l’ubiquitine ligase E3 «Inducible degrader of LDLR» (IDOL). En revanche, nos connaissances sur le mécanisme de la régulation posttranscriptionnelle de l'ARNm du récepteur LDL sont encore très peu avancées.  La régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm du récepteur LDL est mediée par sa région 3’ non traduite (3'UTR). L'ARNm du récepteur LDL humain contient une séquence 3'UTR de 2,5 kb de long dans laquelle 3 régions riches en éléments AU (AREs) ont été précédemment identifiées en tant que médiateurs de la dégradation rapide de l'ARNm dans les cellules hépatiques.  Dans cet ouvrage, nous avons recherché des réponses aux questions suivantes: (1)  À quel niveau la 5-Azacytidine (5-AzaC), un antimétabolite utilisé pour le traitement de la leucémie et le syndrome myélodysplasique, induit-t-elle la régulation du récepteur LDL ? (2) Quelles sont les voies de signalisations cellulaires impliquées dans la stabilisation du récepteur LDL par la 5-AzaC ? (3) Est-ce que la stabilisation du récepteur LDL par la 5-AzaC est dépendante ou indépendante au stress du réticulum endoplasmique (RE) ?  1) Nous avons d'abord démontré que la 5-AzaC induisait l'augmentation de l'expression du récepteur LDL dans les cellules hépathiques humaines (HepG2 et Huh7) par un nouveau mécanisme indépendant des facteurs de transcription SREBP. Afin d’élucider les effets de la 5-AzaC sur le métabolisme des lipoprotéines, nous avons étudié son effet sur l’expression de l’ARNm du récepteur LDL. Nous avons constaté une stabilisation significative de son ARNm ainsi que l’augmentation du niveau de la protéine membranaire. Nos résultats montrent également que la 5-AzaC induit la stabilisation de l'ARNm du récepteur LDL par un mécanisme post-transcriptionnel nécessitant la présence de la séquence 3'UTR. Les mutations systématiques des trois motifs AREs (ARE1-3) situés au niveau de la séquence 3’UTR de l’ARNm du récepteur  LDL et leur expression, couplés à la luciférase, dans les cellules Huh-7, ont montré que le motif ARE1 est à la fois le principal déterminant de la labilité de l’ARNm du récepteur LDL et le médiateur principal de sa stabilisation par la 5-AzaC.  2) Nous avons identifié une nouvelle voie de signalisation requise pour la régulation post-transcriptionnelle du récepteur LDL, impliquant l'enzyme nécessitant l'inositol 1α «Inositol-requiring enzyme 1α» (IRE1α), la kinase N-terminale c-Jun «c-Jun N-terminal kinase» (JNK), le récepteur des facteurs de croissance épidermique «Epidermal growth factor receptor» (EGFR) et la kinase1/2 régulée par la signalisation extracellulaire «Extracellular signal-regulated kinase1/2» (ERK1/2). Dans les hépatocytes, la 5-AzaC entrainait l'activation du récepteur EGFR après 6h de traitement. Cet effet pourrait être expliqué par l'augmentation des ligands spécifiques du récepteur tels que l’amphiréguline (AREG) (40 fois) et l’épiréguline (EREG) (60 fois). La phosphorylation de ERK1/2 a été augmentée 2 h après l'activation de la voie JNK par IRE1α.  3) Contrairement aux résultats obtenus avec la thapsigargine (Th), un inducteur  efficace du stress au RE, nos résultats ont montré que la 5-AzaC activait la voie IRE1α indépendamment du stress au niveau du RE. Le blocage du domaine IRE1α kinase avec l’inhibiteur spécifique (KIRA 6) a inhibé la stabilisation de l'ARNm et l’augmentation de l’expression du récepteur LDL dans les cellules traitées par la 5-AzaC. Au contraire, l'inhibition du domaine endonucléase de IRE1α, en utilisant l'inhibiteur spécifique STF 083010 ou via sa mutation n’ont pas affecté la régulation positive du LDLR ni l'activation de ERK1/2 par la 5-AzaC.  Dans l’ensemble, ce présent travail nous a permis d'identifier la 5-AzaC comme étant un stabilisateur important de  l'ARNm du récepteur LDL dans les hépatocytes via la cascade de signalisation IRE1α /JNK-EGFR-ERK1/2. Ce mécanisme se déclenche par l'activation spécifique du domaine IRE1α kinase de façon indépendante du stress au niveau du RE et s’achève par l'activation de la phosphorylation de ERK1/2 et les protéines de liaison de l’ARNm «RNA-binding proteins» (RBPs) induisant la stabilité de l’ARNm du récepteur LDL. Cette étude a révélé que la séquence 3'UTR est nécessaire pour la stabilisation du récepteur LDL et que le 1er motif ARE1 le plus proche du codon stop est le responsable principal de la stabilisation via la 5-AzaC.  L'identification de cette nouvelle voie de régulation permettra de révéler des cibles potentielles pour améliorer la clairance du LDL-c  au niveau du foie  ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de réduire le niveau de cholestérol.

Keyphrases: 5-AzaC, LDLR, 3'UTR, ARE1, IRE1α, EGFR, ERK1/2