Single molecule characterization of the roles of long non-coding RNAs in eukaryotic transcription regulation

Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides, classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des LARNnc dans différents systèmes eucaryotes. Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84. Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil d'activation du promoteur PHO84. Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs (ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7 comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur. De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur.

Keyphrases: Transcription, SmFISH, S.cerevisiae, PHO84, ARN antisens, MCF7, ERα, ARN amplificateur, MLL1