The roles of the small pMEKK subfamily comprising MAPKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana

Les cascades de signalisation MAPK (mitogen-activated protein kinase) sont impliquées dans un large éventail d’activités biologiques chez les eucaryotes. La diversité des combinaisons « à trois niveaux » (MAPKKK, MAPKK, MAPK) et des régulateurs associés rend possible la transduction précise d’une grande variété de signaux. En particulier, de nombreuses cascades MAPK permettant la réponse aux stress biotiques et abiotiques ont été découvertes chez les plantes.  Dans ce travail, nous présentons une nouvelle cascade MAPK complète (MKKK20, MKK3, MPK6) fonctionnant en aval du récepteur CRK21 (cysteine-rich receptor-like protein kinase 21) chez Arabidopsis. La technique du double hybride chez la levure (yeast two-hybrid, Y2H) nous a également permis d’identifier plusieurs régulateurs candidats se liant à MKKK20, incluant une protéine phosphatase 2C (PP2C), une protéine calmodulin-like (CML10) ainsi que cinq calmodulines (CaM1, 4, 6, 7 et 9).   La mutation de n’importe quel membre de cette cascade MAPK, ou de CaM7, entraîne la susceptibilité à la fois aux pathogènes bactériens (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst3000) et fongiques (Botrytis cinerea, souche B191), tandis que la mutation de la PP2C MFH8.8 confère une résistance aux pathogènes. Ceci indique que la voie de signalisation CRK21-MKKK20-MKK3-MPK6 joue un rôle important dans les défenses immunitaires de la plante, et qu’elle est régulée par la phosphatase MFH8.8 et la CaM7.  De plus, sept autres CRK (CRK12, 14, 16, 18, 24, 30 et 33) présentant un domaine kinase proche de celui de CRK21 interagissent tous avec MKKK20 en Y2H et régulent la phosphorylation de MKKK20 de différentes manières. Les résultats de RT-PCR ont notamment montré que CRK12, 14, 18, 21 et 24 sont fortement exprimés après un traitement aux pathogènes (Pst3000), mais faiblement (CRK14, 18, 21 et 24) voire plus du tout dans des conditions normales. Cela suggère que les CRK forment une grande famille agissant en amont de MKKK20 et jouant un rôle important dans la résistance des plantes aux pathogènes.  Les MKKK19, 20 et 21 forment un clade unique au sein des MEKK d’Arabidopsis. L’alignement de leurs séquences et la prédiction de leurs structures protéiques ont montré que ces trois MKKK sont très similaires en termes de structure primaire, secondaire et même tertiaire. Pour analyser en détail les relations entre les MKKK19, 20 et 21, tous les CRK interagissant avec MKKK20, ainsi que MKK3 et les régulateurs candidats ont été testés en Y2H contre MKKK19 et 21, séparément. Les résultats montrent que les trois MKKK partagent certains interactants, dont des éléments en amont (CRK12, 21 et 33) et en aval (MKK3). Les MKKK19 et 20 partagent également une interaction avec CRK18, 24 et 30 ainsi qu’avec plusieurs régulateurs candidats comme MFH8.8, CML10, CaM4, 6 et 9.  Les résultats de l’essai kinase indiquent que CRK14, CRK24 et MKKK19 sont des protéines autophosphorylées, et que l’autophosphorylation de MKKK19 est inhibée par CRK12, 16, 18, 24 et 30. Ceci montre que les CRK jouent également un rôle important dans les voies de signalisation médiées par MKKK19, et donc que MKKK19 et 20 pourraient accomplir des rôles biologiques identiques ou proches sous le contrôle des mêmes régulateurs. Par ailleurs, MKKK19 et 21 sont toutes les deux phosphorylées in vitro par le complexe CRK21-MKKK20, ce qui suggère que MKKK19 et 21 pourraient non seulement intervenir dans le même niveau hiérarchique que MKKK20, mais aussi en aval.  Enfin, le domaine de liaison de MKKK20 permettant l’arrimage de MKK3 a été identifié au moyen d’un criblage protéine-protéine approfondi par Y2H et BiFC, ce qui constitue une première pour des MAPKKK végétales. La dissection fine de la MKKK20 et de la MKK3 nous a permis de cerner la région C-terminale de la MKKK20 comme étant la section interagissant avec la MKK3. Le domaine C-terminal de MKKK20 contient deux sous-domaines courts fortement conservés entre MKKK19, 20 et 21 sans être retrouvés dans les 18 autres MEKK d’Arabidopsis, ce qui laisse penser que cette région est essentielle pour la liaison de MKKK20 à MKK3.  Dans son ensemble, ce projet aura permis de mettre au jour une nouvelle cascade de signalisation MAPK complète impliquée dans la réponse immunitaire, d’identifier plusieurs acteurs en amont des MKKK19, 20 et 21, trois protéines constituant un même clade parmi les MEKK d’Arabidopsis, et de présenter la première caractérisation du domaine de MKKK20 permettant la liaison à MKK3. Ces résultats fournissent un nouvel éclairage sur la remarquable diversité des cascades MAPK et de leurs modes d’action.

Keyphrases: CRK, MAPK, Réponse immunitaire, CaM, Phosphatase, Domaine de liaison, Arabidopsis