A study of Kv channel dynamics using a fluorescent unnatural amino acid

Les protéines sont les nanomachines moléculaires de la nature et leurs diverses fonctions sont essentielles au fonctionnement de tous les mécanismes cellulaires. Une grande partie de la recherche fondamentale en physiologie se concentre présentement sur l’étude de la structure et de la fonction des protéines. L'objectif général de cette thèse est d'élargir la compréhension des canaux potassiques voltage-dépendants (KV), un groupe de protéines gouvernant la signalisation "électrique de divers aspects physiologiques, en particulier la propagation de potentiels d'action dans le système nerveux central et dans les cellules musculaires.  Dans le but d'obtenir des indices quant à la dynamique des canaux KV, la thèse met l´enphase sur l'utilisation d'un acide aminé non naturel et fluorescent (Anap) comme outil moléculaire pour étudier les changements de conformation protéique avec la fluorimétrie en voltage imposé (FVI). L'avantage de la technique Anap-FVI par rapport aux techniques traditionnelles de marquage fluorescent, tient au fait qu'il n'y a pas de restriction sur le site d'intérêt. Ainsi, Anap est incorporé génétiquement dans des régions clés du canal Shaker KV en utilisant la technique de substitution du "codon-stop amber", en utilisant une paire orthogonale d'ARNt/synthétase avec les ovocytes de Xenopus laevis comme modèle d’expression protéique.  Tout d'abord, la comparaison directe des deux extrémités du senseur de voltage (SV) est rendue possible par FVI bicolore dans lequel une cystéine externe est marquée avec TMR (tetramethylrhodamine), tandis que l'acide aminé (Anap) est incorporé du côté intracellulaire. On constate que la partie intracellulaire du SV s'active de façon similaire à la partie externe (chapitre 3). En outre, on constate que les portes S6 intracellulaires s'ouvrent essentiellement en deux étapes. Ensuite, Anap a été inséré aux deux extrémités de la boucle cytoplasmique S4-S5 afin d'en étudier le mouvement pendant le couplage électromécanique (chapitre 4). Les expériences FVI bicolores démontrent que la partie N-terminale de la boucle se déplace avec le senseur de voltage alors que le mouvement de la partie C-terminale est retardé. Les résultats supportent un modèle de couplage électromécanique dans lequel l'énergie est stockée au centre du de la jonction S4-S5. En outre, il est à noter que la boucle qui relie S4 et S5 subit des mouvements indépendants et coopératifs - une découverte qui s'aligne avec un rôle central de la boucle dans le transfert d'énergie du senseur de voltage vers le pore.  Dans un troisième projet, Anap a été inséré dans diverses positions de l'extrémité N-terminale cytosolique afin d'en sonder le mouvement pendant l'inactivation de type N (chapitre 5). Les données FVI montrent que la région hydrophile de la balle d'inactivation (BI) subit un mouvement qui est étroitement lié à l'inactivation mais qui ne joue pas un rôle dans l'obstruction finale du pore. Par contre, la pointe hydrophobe de la BI, subit un mouvement supplémentaire qui est sensible à l'état du pore, suggérant qu'il subit un mouvement qui impacte l'obstruction du pore. Les résultats supportent un modèle d'inactivation sous la forme de mécanisme d'étapes séquentielles d'au moins deux transitions.  Enfin, un quatrième projet se distingue de l'objectif général de la thèse. Il est démontré que les canaux avec un codon-stop N-terminal s’expriment malgré l'absence d'Anap (chapitre 6). Cette expression de fuite est causée par la réinitiation de la traduction de l’ARN messager, à des codons d’initiations non-canoniques en aval, et peut être réduite en supprimant ces codons. Les résultats mettent en évidence l'importance des expériences de contrôles lors d'utilisation d'acides aminés non naturels.

Keyphrases: Canaux Kv, acides aminés non-naturels, Anap, fluorimétrie en voltage imposé