RAS small GTPase signalling to the enigmatic RASSF death effectors

Les petites GTPases RAS alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Ce mécanisme permet aux protéines RAS de transmettre les signaux des récepteurs se trouvant à la surface cellulaire vers divers réseaux de signalisation en aval. La protéine RAS joue un rôle important dans plusieurs fonctions biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et même l'apoptose. Les mutations des gènes de la famille RAS sont retrouvées dans environ un tiers des tumeurs. HRAS, KRAS et NRAS, les trois principaux homologues de la protéine RAS, sont principalement mutées au niveau des codons 12, 13 ou 61. Les mutations avec un effet de gain de fonction au niveau de ces codons rendent ces protéines RAS constitutivement actives et sont à l’origine des signaux hyperprolifératifs. Depuis la découverte de la protéine RAS, de nombreuses "protéines effectrices RAS" agissant en aval ont été identifiées. Le rôle biologique de la plupart de ces effecteurs RAS est lié à la prolifération et à la survie des cellules. Cependant, au cours des deux dernières décennies une nouvelle famille d'effecteurs RAS, les protéines RASSF, a été découverte comme ayant une fonction pro-apoptotique.    Les protéines suppresseures de tumeurs de la famille RASSF sont fréquemment inhibées dans les cellules cancéreuses humaines. Il existe 10 homologues de RASSF (RASSF1-10) chez humain, chacun comprenant un domaine d'association RAS (RA) impliqué dans la liaison avec les GTPases RAS. Plusieurs RASSF comportent également les domaines SARAH (Salvador-RASSF-Hippo), connus pour interagir avec les kinases Hippo contenant aussi les domaines SARAH. On ne sait toutefois pas si toutes les protéines RASSF sont de véritables effecteurs RAS. Il a été démontré qu'un seul membre de la famille RASSF, appelé RASSF5, s'associe directement à HRAS et cette interaction a été validée par des études cristallographiques à rayons X. Dans la première partie de cette thèse, je démontre qu'aucun autre membre de la famille RASSF n'interagit directement avec KRAS. En me servant de la modélisation par l'homologie du domaine RA hautement apparenté de RASSF1, j’ai identifié les acides aminés essentiels pour l’interaction avec la GTPase. Je démontre que la substitution d’un seul acide aminé dans la protéine RASSF1 permet l'interaction avec KRAS, et je pose l'hypothèse que ce résidu, ayant divergé au cours de l'évolution, a modifié la spécificité de RASSF1 pour les petites GTPases. En utilisant une approche informatique, nous avons prédit six GTPases candidates que pourraient interagir avec RASSF1 : GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS et DIRAS3. J'ai validé les interactions avec plusieurs GTPases RGK (GEM, REM1, REM2) et j’ai démontré que la co-expression des GTPases RGK avec RASSF1 active la voie Hippo. Ainsi, je propose un nouveau lien entre ces GTPases peu étudiées et la régulation de la voie de signalisation Hippo.  Dans la deuxième partie de ma thèse, je tente de rediriger la signalisation de prolifération cellulaire de KRAS (RAF/MAPK) vers une signalisation impliquant les effecteurs pro-apoptotiques (RASSF-Hippo). Pour y parvenir, j'ai conçu des mutations dans KRAS dans le but d’augmenter son affinité pour RASSF5 et d’affaiblir son interaction avec BRAF. Comme deuxième stratégie, j'ai remplacé les résidus divergents de l'effecteur RASSF1 par les résidus correspondants de RASSF5 et j’ai démontré que cette variante de RASSF1 est capable de lier KRAS. Diverses approches biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour valider KRAS et RASSF1 mutés, impliquées dans cette signalisation redirigée. Les études de co-localisation montrent que ces mutants interagissent avec leurs nouveaux partenaires comme prévu. D’autre part, je démontre par les expériences intracellulaires que KRAS modifiée ne lie plus BRAF tout en interagissant fortement avec RASSF5 et RASSF1, et que les mutants établis activent la voie Hippo. Ainsi, j'ai développé deux approches qui nous aideront à étudier la signalisation de KRAS dans la voie pro-apoptotique impliquant RASSF en absence de l’activation de la voie des MAP kinases.  Les données présentées ici nous permettent de mieux comprendre la manière dont les protéines RASSF ont divergé au cours de l'évolution; cette divergence leur empêchant d’interagir avec les RAS. Ces données fournissent également une stratégie innovante pour rediriger les signaux RAS vers les effecteurs RASSF, qui pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie dans les études cliniques utilisant RAS comme cible thérapeutique.

Keyphrases: RASSF1, RASSF5, RAF, Signalisation Hippo