Étude du rôle de la tyrosine kinase Src dans la régulation de la signalisation des récepteurs opioïdes delta (∆OR)

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée  par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le  rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation  des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur  la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats  démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20-  40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations  d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la  durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se  lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations  d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant  négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste  DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de  ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une  inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de  fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors  que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs.  Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à  évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite  par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc,  préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum  d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30  min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée.  Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant  d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet  protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de  l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant  tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit  cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du  récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons  donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du  DOR soit survenue. Opioids are the most effective analgesics available but their use is limited by  tolerance. Tolerance is related, at least in part, to receptor desensitization. Hence, the  role of the present study was to better characterize the desensitization process, in  particular concerning the role of the tyrosine kinase Src on regulation of delta opioid  receptor signalling. Our results show that pharmacological inhibition with PP2  (administered at low concentration: 20-40µM) or molecular inhibition of the kinase  with low expression levels of a dominant negative mutant of Src (0,2µg of DNA)  potentiate the magnitude and duration of agonist-dependent (DPDPE; 1µM; 5 min)  activation of the ERK pathway. We also showed that higher concentrations of Src  inhibitors (80 and 100µM of PP2 or 1µg/ml of dominant negative mutant DNA)  block the MAPK cascade following DOR stimulation by DPDPE. These  observations indicate that Src has a biphasic effect on ERK activity, respectively  potentiating or inhibiting agonist stimulation of the MAPK cascade at low and high  levels of Src inhibition. We reasoned that high levels of Src blockers were interfering  with ERK activation mechanism while low levels of inhibition were interfering with  receptor desensitization. This possibility was tested by using cAMP accumulation  assays to evaluate the effect of Src blockers (PP2, 20 µM; 1h) on agonist-induced  desensitization. DOR stimulation by DPDPE inhibited forskolin stimulated cAMP  production in a dose dependent manner with a maximal reduction of 61%. This  inhibitory response was reduced by 72% following pre-exposure to DPDPE (1 µM,  30 min), an effect that was blocked by pre-treating cells with PP2 (PP2, 20 µM; 1 h)  before desensitization. The protective effect of Src blockers did not involve changes  in DOR internalization but interfering with internalization by using an  internalization-deficient DOR mutant or hypertonic medium (0.4M sucrose) reduced  this protection, indicating the need for optimal internalization in order for the  protective effect of Src blockers to take place. Based on the latter observation it was  possible to conclude that Src contribution to DOR desensitization is post-endocytic.

Keyphrases: Désensibilisation, récepteur mutant delta opioïde tronqué (DOR344T), Src, PP2, DPDPE, Internalisation, Tolérance, kinase activant les protéines mitogéniques (MAPK), kinase régulatrice de signaux extracellulaires (ERK), Adénosine monophosphate cyclique (AMPc), Desensitization, truncated mutant delta opioid receptor (DOR344T), Src, PP2, DPDPE, Internalization, Tolerance, mitogen-activated protein kinase (MAPK), Extracellular Signal-Regulated Protein Kinase (ERK), cyclic adenosine monophosphate (cAMP)