Étude de la Structure-Fonction du Prosegment et du domaine CHRD de la PCSK9 humaine

L’excès des particules de LDL dans le sang constitue un facteur de risque majeur dans le développement des maladies cardiovasculaires. Dans ce contexte, nous étudions la protéine PCSK9 qui favorise directement ce facteur de risque. Cette protéine est sécrétée en majorité au niveau du foie par les hépatocytes et possède la capacité de reconnaître et de lier le récepteur LDLR. Le rôle premier de ce dernier est d’éliminer les particules de LDL circulant dans le plasma. Ainsi, lorsque la PCSK9 forme un complexe avec le LDLR et l’amène à la dégradation, la conséquence directe de la diminution des ces récepteurs est une accumulation malsaine des particules LDL dans le plasma.  L’importante implication de la PCSK9 dans le métabolisme des lipides nous a menés vers des recherches de caractérisation de cette protéine ainsi que dans l’étude de son mode d’action. La PCSK9 est composée de trois domaines et notre intérêt s’est porté sur l’étude structure-fonction des deux domaines dont la fonction était inconnue, soit le domaine en N-terminal : le prodomaine et de son domaine en C-terminal : CHRD.  Le premier article présenté dans cette thèse révèle l’importance d’une région acide (acide aminés 33-58)  régulatrice de l’activité de la PCSK9 localisée en N-terminal du prodomaine ainsi que l’effet du pH acide, équivalent à celui des endosomes tardifs, qui accroît la capacité de la PCSK9 à induire la dégradation du LDLR. Le deuxième article dissèque davantage la structure de la PCSK9 et met en lumière la différence des prérequis structurels de la région ‘’Hinge’’ ainsi que du module M2, composant du domaine CHRD, dans la voie intracellulaire et la voie extracellulaire d’activité de la PCSK9. La mutation R434W localisée dans la région ‘’Hinge’’ résulte dans une inhibition totale de l’activité intracellulaire de la PCSK9 tandis que son activité extracellulaire est réduite à ~70%. Contrairement, la perte du module M2 du domaine CHRD est bien tolérée par la PCSK9 lors de son activité intracellulaire mais totalement inhibitrice pour son activité extracellulaire.  Le troisième article se distingue en présentant une nouvelle stratégie d’inhibition de l’activité de la PCSK9 en utilisant une chimère composée de la fraction Fc de l’immunoglobuline IgG1 humaine couplée avec le prodomaine de la PCSK9. La protéine fusion Fcpro lie directement la PCSK9, crée un encombrement structurel qui résulte dans une régulation négative l’activité de la PCSK9. En résumé, nous présentons dans cette thèse, trois manuscrits qui apportent une contribution à la connaissance des composantes structurelles de la PCSK9 et leur implication dans le rôle de la protéine en tant que régulateur négatif du LDLR. Hypercholesterolemia is one of the major risk factors leading to cardiovascular disease. In this context, we focused our study on a protein that directly influences hypercholesterolemia: PCSK9. Since 2003, the coding gene for PCSK9 has been identified as the third locus responsible for familial hypercholesterolemia (FH3). PCSK9 is a protein secreted mostly from the liver by hepatocytes and has the capacity to recognize, bind and direct to degradation the LDLR receptor. The latter is responsible for the elimination the LDL particles from the plasma. The direct consequence of the LDLR degradation induced by PCSK9 is the harmful accumulation of the bad cholesterol in the blood.   Since PCSK9 activity has undesirable consequences on lipid metabolism homeostasis, we directed our research to characterize this protein to better understand its mechanism of action. Three domains compose PCSK9 structure and we focused on the ‘’structure-function study’’ of two domains, of which roles were still unknown: the prodomain located at the N-terminal extremity and the CHRD domain at the C-terminus of PCSK9.  The first manuscript presented in this thesis brings to light the importance of the acidic N-terminal sequence of the prosegment (amino acids 33-58) and its effect on the activity of PCSK9. It also presents a novel mechanism for fine-tuning the activity of PCSK9, which is enhanced at acidic pHs close to those of late endosomes. The second manuscript dissects further the PCSK9 structure, revealing that the structural requirements of the hinge and the M2 module located in the CHRD domain are not the same for the intracellular and extracellular pathways of PCSK9-induced LDLR degradation. Although the R434W natural mutation in the hinge region is absolutely deleterious for the intracellular activity of PCSK9, it reduces by ~70% the extracellular one. In contrast, the loss of M2 module of the CHRD domain is tolerated for the intracellular activity of PCSK9 but not for the extracellular one. The third manuscript demonstrates for the first time that a chimera containing the prosegment (Fcpro) directly binds PCSK9 and effectively acts as a negative regulator (inhibitor) of its ability to induce LDLR degradation.  Our work presents a new strategy to develop such inhibitors by interfering with the structure of PCSK9 and exploiting the properties of the PCSK9 prosegment and the advantage of its fusion to a humanized Fc of IgG1. In summary, the present research data sheds new light on the functional contribution of the prodomain and the CHRD domain of PCSK9.

Keyphrases: CHRD, Structure-fonction, Fc, Inhibiteur, Hypercholestérolémie, Prodomain, Prodomaine, Module M2, Dégradation du LDLR, CHRD, Fc, M2 module, Structure-function, Inhibitor, LDLR degradation, Hypercholesterolemia, Prodomain