The role of ThPOK and T cell receptor signaling in CD4+ versus CD8+ T-cell lineage fate

Les lymphocytes T sont au coeur du système immunitaire adaptatif et leur dérégulation est à la base de pathologies. Les cellules T se développent dans le thymus et passent par de nombreuses étapes de maturations identifiables par l'expression des corécepteurs CD4+/CD8+ à la surface des cellules. À leur sortie du thymus, les cellules T sont divisées en deux sous-types principaux: les cellules T auxiliaires CD4+ spécifique aux antigènes présentés sur complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et les cellules T cytotoxiques CD8+ reconnaissant un antigène présenté sur un CMH-I. Toutes les cellules T proviennent d’un précurseur commun. Leur différenciation en cellule T CD4+ et T CD8+ est influencée par l'intensité et la durée de la signalisation du récepteur des cellules T (RCT) et des cytokines. Cette signalisation résulte en l’expression des facteurs de transcription ThPOK pour la différenciation de cellule T CD4+ et Runx3 pour les cellules T CD8+. Il a été démontré que ThPOK est à la fois nécessaire et suffisant pour le développement des lymphocytes T CD4+, puisque le gain et la perte de la fonction de ThPOK favorise le développement de cellules lymphocytes T CD4+ et CD8+, respectivement. Ma thèse vise à approfondir notre compréhension du choix de la lignée CD4+/CD8+ en explorant les mécanismes moléculaires de la voix de signalisation de ThPOK et du RCT. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact d'un gain-de-fonction de ThPOK sur la différenciation des thymocytes, en utilisant trois lignées transgéniques exprimant des niveaux variables de ThPOK. Une analyse approfondie de ces transgènes chez des souris dont le RCT est restreint soit au CMH de classe I ou de classe II, a démontré que, comparés aux thymocytes restreints au CMH-II, les thymocytes restreints au CMH-I requéraient des niveaux plus importants de ThPOK pour se différencier en CD4+. L’introduction d’un transgène exprimant un niveau moins élevé de ThPOK comparé aux deux autres transgènes, mais un niveau plus élevé de ThPOK par rapport au niveau endogène dans les cellules CD4+ WT, n'induit qu'une réorientation partielle des cellules T CD8+ en CD4+, ce qui a mené à la génération, à la fois de lymphocytes T CD4+, DN (doubles négatifs) et CD8+ matures. L'analyse génotypique, plus précisément celle des cellules DN chez les souris porteuses du transgène ThPOK et dont le RCT est restreint au CMH-I, a révélé que l’inhibition des gènes spécifiques à la lignée CD8+ 2 nécessitait des niveaux d'expression différents de ThPOK comparés à ceux requis pour l’induction des gènes spécifiques à la lignée CD4+. En effet, cette étude nous a permis de démontrer que l’intensité du signal dérivé du RCT ainsi que sa spécificité pour un CMH donné jouent un rôle essentiel dans le choix de différentiation CD4+/CD8+ induit par ThPOK. Ainsi, la réorientation CD8+/CD4+ chez les souris exprimant le transgène ThPOK-H est significativement augmentée par l'amplification de l’intensité du signal dérivé du RCT dans les cellules spécifiques aux CMH-I. De plus, la fréquence des cellules CD4+ était plus élevée lorsqu’une quantité identique de ThPOK était exprimée dans des lymphocytes T spécifiques au CMH-II, suggérant qu’il existe un aspect qualitatif quant à la régulation de la différenciation des lymphocytes T CD4+ par la signalisation induite par le RCT. Nous avons également tenté d’étudier la voie de différenciation CD4+ en l’absence de ThPOK, à la suite de la perturbation physiologique de la voie de signalisation induite par le RCT, par rapport à la perte de fonction de ThPOK. Bien que nous ayons observé une réorientation des thymocytes spécifiques au CMH-II vers la lignée CD8+, aussi bien à la suite d'une délétion de Thpok, qu’à la perturbation de la signalisation RCT les deux modes de redirections semblent toutefois être différents. En effet, notre investigation a démontré qu’en l’absence de ThPOK, la signalisation induite par le RCT dans les cellules restreintes au CHM-II induit l’activation de certains gènes, suggérant ainsi leur implication dans la voie de différenciation CD4+. Ces résultats suggèrent également que la contribution de la signalisation du RTC dans la différenciation des thymocytes restreints au CMH-II ne se limitait pas à l'induction de ThPOK. Étonnamment, seul un effet synergique limité a été observé sur la différenciation des thymocytes restreints au CMH-I, lorsque Gata3, un autre facteur de transcription également induit dans les thymocytes restreints au CMH-II, et ThPOK étaient surexprimés en même temps dans ces cellules, suggérant peu de chevauchement fonctionnel entre ces deux facteurs de transcription. L’ensemble de ces résultats indique que ThPOK et la signalisation induite par le RCT fonctionnent en synergie durant le développement des lymphocytes T CD4+. T lymphocytes are at the core of the adaptive immune system and their dysfunction is associated with several disorders and pathologies, which are at times fatal. The two main types of T-cells in mice and man are: the major histocompatibility complex (MHC) class-II-restricted CD4+ helper T-cells, and the MHC-I-restricted CD8+ cytotoxic T-cells. Developmental stages of the two types of T-cells occurs in the thymus in multiple sequential maturation stages that are identified by cell-surface CD4+/CD8+ co-receptor expression. Differentiation of the two types of T-cells in the thymus from a common precursor is influenced by the intensity and duration of signals derived from the T-cell receptor (TCR) and cytokines secreted by the thymic stromal cells. These signals lead to the activation of ThPOK or Runx/CBF transcription factors, which control the transcriptional network regulating CD4+ and CD8+ lineage fate, respectively. Studies have demonstrated that ThPOK is both necessary and sufficient for CD4+ T-cell development as gain- and loss-of-ThPOK function redirects positively selected MHC-I- and MHC-II-restricted thymocytes into CD4+ and CD8+ T-cell lineage fate, respectively. However, the role of TCR signaling and the extent to which ThPOK expression influences CD4+ lineage choice remains to be investigated. My thesis aims to elucidate the fundamental basis the CD4+/CD8+ lineage choice by exploring the molecular mechanism of action of ThPOK and TCR signaling in CD4+ lineage fate of MHC-I- and MHC-II-specific thymocytes. In this study, we have characterized gain-of-function of ThPOK in three independent transgenic mouse lines expressing varying amounts of ThPOK. Extensive analysis of the three ThPOK transgenic lines expressing MHC-I- and MHC-II-specific monoclonal TCR indicated that MHC-I-restricted, compared to MHC-II-restricted, thymocytes required significantly more ThPOK for efficient differentiation into the CD4+ lineage. Interestingly, the founder line with the lowest transgene expression, despite expressing significantly higher amounts of ThPOK compared to the endogenous levels in WT CD4+ T cells, induced a partial CD8+ to CD4+ redirection of MHC-I-restricted cells, leading to the generation of mature CD4+, DN and CD8+ T-cells in the same mouse. Lineage specific gene expression analysis, specifically in DN mature T cells from ThPOK transgenic mice expressing MHC-I-specific TCR, showed that, compared to induction of helper program, suppression of cytotoxic program required lower amount of ThPOK. Further investigation showed that TCR signal strength and MHC specificity of 4 developing thymocytes played a critical role in determining ThPOK-induced CD4+ lineage fate. While increase in TCR signal strength augmented the efficiency of ThPOK-induced CD4+ lineage choice of MHC-I-restricted thymocytes in part via endogenous ThPOK induction, it appeared to have ThPOK independent function as well as judged by significantly different CD4+ T-cell frequencies in OTI mice expressing the same amount of ThPOK but transduced quantitatively different TCR signal. Importantly, the efficiency of CD4+ lineage choice of MHC-I-specific thymocytes with augmented TCR signal strength was still significantly lower compared to the efficiency of CD4+ lineage choice of MHC-II-restricted thymocytes expressing only the transgene-encoded ThPOK suggesting a qualitative role for TCR signaling as well in CD4+ lineage choice. We then evaluated CD4+ lineage fate decision in the absence of ThPOK induction in physiologically relevant alteration in TCR signaling versus loss of ThPOK function. While we observed CD4+ to CD8+ lineage redirection of MHC-II-specific thymocytes due to Thpok-deficiency as well as lack of ThPOK induction due to disruption of TCR signaling, the two modes of lineage redirection appeared to be due to different mechanisms. Our investigation demonstrates that TCR signaling in MHC-II-restricted thymocytes induces the expression of select genes in loss-of-function of ThPOK model suggesting potential role for these genes in establishing the CD4+ helper program. These results also suggest that the contribution of MHC-II-specific TCR signaling in driving CD4+ lineage choice is not limited to Thpok induction. Interestingly, only a limited synergistic effect was observed when both Gata3, which is also induced in MHC-II-signaled thymocytes, and ThPOK were overexpressed in MHC-I-restricted thymocytes suggesting a limited functional overlap between the two transcription factors. Collectively, these data indicate that ThPOK and TCR signaling work synergistically to promote the development of CD4+ T-cells with some ThPOK independent function for TCR signaling.

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