Phosphoproteomic study on osmotic shock in Saccharomyces cerevisiae over sub-minute and half- hour timescales

La phosphorylation des protéines contribue de manière importante à la régulation cellulaire. Ainsi, les kinases et les phosphatases (KP) sont essentielles à la transduction de signal dans les cellules. Les signaux reçus par la cellule doivent être transmis efficacement pour garantir l'obtention d'une réponse adaptative appropriée. Le suivi de l'activité de phosphorylation des protéines nous aide à mieux comprendre comment les cellules fonctionnent. Dans notre étude, nous avons exposé Saccharomyces cerevisiae à une osmolarité élevée, soit 0,4 M de NaCl, ce qui a provoqué un choc hyperosmotique. La phosphorylation des protéines a été mesurée à l'aide d'une technique de spectrométrie de masse appelée `’Marquage en culture cellulaire avec des acides aminés dotés d’isotopes stables (SILAC)’. Il s'agit d'une technique quantitative de protéomique qui permet de comparer des cellules exposées au choc hyperosmotique à un groupe contrôle où les cellules n’ont pas subi ce choc. Cette comparaison entre les deux groupes nous permet de déduire une régulation dynamique des protéines spécifique au stimulus appliqué. Nous avons utilisé deux échelles de temps, la première inférieure à une minute et la seconde de 30 minutes, pour examiner les effets du choc osmotique chez S. cerevisiae. Dans ce mémoire, j'ai examiné la voie métabolique MAPK-Hog1 au cours de la demi-heure de mesure et l'ai comparée aux mesures prises lors de l’échelle inférieure à la minute, laquelle ayant été publiée précédemment par Kanshin & Bergeron- Sandoval et al., 2015 [26]. De plus, les données complètes contenaient 161 phosphopeptides dynamiques provenant de 100 protéines distinctes présentes lors des deux échelles de temps. Les phosphopeptides dynamiques découverts furent également comparés à une autre étude phosphoprotéomique ayant utilisé le stress froid / chaud comme stimulus (Kanshin et al., 2015 [25]). Il y avait des chevauchements remarquables des phosphopeptides kinétiques observés lors des chocs osmotiques et en particulier ceux observés lors du stress thermique. Cela nous a mené à examiner la possibilité d'une implication de TORC1 & 2 dans le processus i d'osmoadaptation. De plus, les cellules arrêtent temporairement leur cycle cellulaire lors de ce processus d'osmoadaptation. Conformément à cette observation, 68% des protéines impliquées dans la transition G1 / S ont subi des modifications de la phosphorylation, lesquelles reflétant peut-être leur régulation, au cours des 30 premières minutes de choc osmotique. Les kinases et les phosphatases sont connues pour fortement se réguler les unes les autres. Un réseau de KP actives interconnectées a révélé que Hog1 était la kinase la plus connectée dans les mesures à l’échelle de temps inférieure à la minute alors que Cdc28 était la plus connectée lors de l’échelle de temps d’une demi-heure. Cela est indicatif du mécanisme par lequel les cellules s'adaptent à une osmolarité élevée. Par exemple, Hog1 est responsable de la détection rapide et de l’adaptation, et Cdc28, de l’arrêt et de la régulation du cycle cellulaire. En résumé, j'ai soutenu qu'il était possible d'identifier des phosphopeptides dynamiques spécifiques à un stimulus dans l’échelle de temps d'une demi-heure. J'ai comparé les phosphopeptides dynamiques de l'échelle de temps inférieure à la minute à l'échelle de 30 minutes et j'ai examiné les processus biologiques qui jouent un rôle dans le processus d'osmoadaptif. Protein phosphorylation is an important cellular regulatory mechanism. Kinases and phosphatases (KP) are vital for the signalling transductions in cells. Signals received by the cell must be transmitted effectively to ensure an appropriate adaptive response is achieved. Monitoring the phosphorylation activity on proteins helps us gain a better understanding to how cells work. In our study we have exposed Saccharomyces cerevisiae to high osmolarity using 0.4M NaCl, and caused a hyper osmotic shock. Protein phosphorylation was measured using a mass spectrometry technique called Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture (SILAC). This is a quantitative proteomic technique that allows the comparison between cells that are exposed to NaCl and a control group, where cells are not exposed to NaCl. This comparison between the two groups allows us to deduce dynamic regulation of proteins specific to the stimulus applied. We have used a sub-minute and a half-hour timescales to examine the effects of osmotic shock in S. cerevisiae. In this memoir, I have examined the MAPK-Hog1 pathway during the half-hour timescale and have compared it to the sub-minute timescale, which was previously published in Kanshin & Bergeron-Sandoval et al., 2015 [26]. Moreover, the entire data had 161 dynamic phosphopeptide from 100 unique proteins that were present on both timescales. Dynamic phosphopeptides were also compared to another phosphoproteomic study that had used cold/hot stress as a stimulus (Kanshin et al., 2015 [25]). There were remarkable overlaps between osmotic shock and in particular heat stress. This led us to examine the possibility that TORC1&2 involvement in the osmoadaptation process. Furthermore, cells temporarily stop cell cycling during the osmoadaptation process. Consistent with this observation, 68% of the proteins involved in the G1/S transition underwent changes in phosphorylation, perhaps reflecting their regulation, during the first 30 minutes of osmotic shock.  Kinases and phosphatases are known to heavily regulate themselves. A network of  interconnected active KPs revealed Hog1 to be the most connected kinase in the sub-  . This is indicative of how cells adapt to high osmolarity; Hog1 being responsible for the fast sensing and adaptation, and Cdc28 for stopping and regulating the cell cycle. In summary, I have argued that it is possible to extract dynamic phosphopeptides that are stimulus-specific within the half-hour timescale. I have compared dynamic phosphopeptides from the sub-minute timescale to the half-hour timescale and have examined biological processes that play a part in the osmoadaptive process.

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