Étude de Necdin par un modèle de carcinogénèse lié à l’antigène grand T du Virus du polyome

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine.  L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés.  Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs.  Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse.  Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires.  Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables.  Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin.  Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques.  Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif.  Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante.  De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53.  Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53.   L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence.  La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer.  Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence.  La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative.  Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes.  De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires.  Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement.  Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain.  Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer.  D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage.  Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel.  De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel.  Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie.   L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin.  Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique.  La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today.  Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell.  To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents.  Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary.  Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis.  Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT.   The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene.  Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts.  We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells.  Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage.  We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner.  Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation.  These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence.  Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation.  As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence.  The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence.  The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure.  Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells.  However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated.  These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions.  We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models.  We characterized Necdin expression in two types of human cancers.  First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers.  Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene.  Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53.  Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53.  In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease.   The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin.  We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability.  The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation.  Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.

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