Bcl-xL regulation and function in cell cycle checkpoints and progression

Quelques évidences suggèrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possède également des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrôle. Pour étudier la régulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons généré et exprimé dans des cellules humaines une série de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala.      L'analyse de cette série de mutants révèle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrôle G2 du cycle cellulaire comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les études de cinétiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronisées et suite à l'activation du point-contrôle en G2 médié par l'étoposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nucléolaires durant l'arrêt en G2 dans les cellules exposées au VP16. Une série d'expériences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interférant, nous révèlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protéines kinase impliquées dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nucléolaires pendant le point-contrôle en G2. Nos résultats indiquent que durant le point-contrôle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrôle l'entrée en mitose. Nos résultats suggèrent que dans les corps nucléolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrêt en G2 en séquestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entrée en mitose. Ces résultats soulignent également que les dommages à l'ADN influencent la composition des corps nucléolaires, structure nucléaire qui émerge maintenant comme une composante importante de la réponse aux dommages à l'ADN.   Dans une deuxième étude, nous décrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont également plus stables au point-contrôle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite à une exposition au taxol, comparées aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indépendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphorylé par PLK1 et MAPK14/SAPKp38α à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et déphosphorylé à la télophase et la cytokinèse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec γ-tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposées au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas à ce complexe. Ces résultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) accélère la résolution du SAC et l'entrée des cellules en anaphase. Des expériences bloquant l'expression de Bcl-xL révèlent ègalement un taux très élevé de cellules tétraploïdes et binuclées après un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilité génomique.   Dans la troisième étude, l'analyse fonctionnelle de cette série de mutants de phosphorylation indique également que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrôle G2 et entre en cytokinèse plus lentement dans des cellules exposées aux inhibiteurs de la polymérisation/dépolymérisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indépendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronisées, Bcl-xL(Ser49) est phosphorylé en phase S et G2, déphosphorylé à la prométaphase, la métaphase et à la frontière de l'anaphase, et re-phosphorylé durant la télophase et la cytokinèse. Au cours du point-contrôle G2 induit par les dommages à l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la régulation de l'entrée en mitose. Durant la télophase et la cytokinèse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protéine moteure dynéine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos résultats suggèrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protéine kinase impliquée pour l'entrée des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu'à la division cellulaire. Accumulating evidence suggest that Bcl-xL, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family, also functions in cell cycle progression and cell cycle checkpoints. To further understand Bcl-xL regulation and function in cell cycle progression, we first expressed a series of single-point Bcl-xL cDNA phospho-mutants, including Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala and Thr115Ala in human cancer cell lines and investigated their impact on cell cycle progression.         Analysis of this series of phosphorylation mutants reveals that cells expressing Bcl-xL(Ser62Ala) mutant are less stable at the G2 checkpoint and enter mitosis more rapidly than cells expressing wild type Bcl-xL or Bcl-xL phosphorylation mutants, including Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala and Thr115Ala. Dynamic phosphorylation and location studies on phospho-Bcl-xL(Ser62) in unperturbed, synchronized cells and during DNA damage-induced G2 arrest revealed that phospho-Bcl-xL(Ser62) translocates into nucleolar structures in VP16-exposed cells during G2 arrest. Using in vitro kinase assays, pharmacological inhibitors and specific siRNAs experiments, we found that Polo kinase 1 and MAPK9/JNK2 are major protein kinases involved in Bcl-xL(Ser62) phosphorylation and accumulation into nucleolar structures during the G2 checkpoint. In nucleoli, phospho-Bcl-xL(Ser62) binds to and co-localizes with CDK1(CDC2), the key cyclin-dependent kinase required for entry into mitosis. These data indicate that, during G2 checkpoint, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilizes G2 arrest by timely trapping CDK1(CDC2) in nucleolar structures to slow mitotic entry. It also highlights that DNA damage affects the dynamic composition of the nucleolus, which now emerges as a key event in the DNA damage response.  In a second study, we describe that cells expressing Bcl-xL(Ser62Ala) are also more stable at a sustained spindle-assembly checkpoint (SAC) after exposure to taxol than cells expressing wild-type Bcl-xL or other mutants, an effect that appears to be independent of its anti-apoptotic activity. Bcl-xL(Ser62) is strongly phosphorylated by PLK1 and MAPK14/SAPKp38α at prometaphase, metaphase and the anaphase boundary, while it is dephosphorylated at telophase and cytokinesis. Phospho-Bcl-xL(Ser62) localizes in centrosomes with γ-tubulin, along the mitotic spindle with dynein motor protein and in cytosol with SAC signaling components. In taxol-exposed cells, phospho-Bcl-xL(Ser62) binds to the CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3 complex, while Bcl-xL(Ser62Ala) does not. The data indicate that during SAC, Bcl-xL(Ser62) phosphorylation accelerates SAC resolution and cell entry into anaphase, even in the presence of unattached or misaligned chromosomes. Silencing Bcl-xL expression also leads nocodazole-exposed cells to tetraploidy and binucleation, consistent with a Bcl-xL function in SAC and genomic stability.      In the third study, the functional analysis of a Bcl-xL phosphorylation mutant series has revealed that cells expressing Bcl-xL(Ser49Ala) mutant are less stable at G2 checkpoint after DNA damage and enter cytokinesis much more slowly after microtubule poisoning than cells expressing wild-type Bcl-xL. These effects of Bcl-xL(Ser49Ala) mutant seem to be distinct from Bcl-xL function in apoptosis. Bcl-xL(Ser49) phosphorylation is cell cycle-dependent. In synchronized cells, phospho-Bcl-xL(Ser49) appears during the S phase and G2, whereas it disappears rapidly in early mitosis during prometaphase, metaphase and early anaphase, and re-appears during telophase and cytokinesis. During DNA damage-induced G2 arrest, an important pool of phospho-Bcl-xL(Ser49) accumulates in centrosomes which act as essential decision centers for progression from G2 to mitosis. During telophase/cytokinesis, phospho-Bcl-xL(Ser49) is found along microtubules and at midbody with dynein motor protein. In a series of in vitro kinase assays, specific small interfering RNA and pharmacological inhibition experiments, polo kinase 3 (PLK3) was implicated in Bcl-xL(Ser49) phosphorylation. These data indicate that during G2 checkpoint phospho-Bcl-xL(Ser49) is another downstream target of PLK3, acting to stabilize G2 arrest. Bcl-xL phosphorylation at Ser49 also correlates with essential PLK3 activity and function, enabling cytokinesis and mitotic exit.

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