Rôle des MKKK19, 20 et 21 dans le développement d’Arabidopsis thaliana

La phosphorylation des protéines constitue la modification post-traductionnelle la plus importante chez les eucaryotes. Réalisée par des protéines kinases, elle intervient dans plusieurs processus cellulaires et en particulier dans la signalisation. La grande famille des kinases est subdivisée en plusieurs groupes dont les MAPKs qui sont caractérisées par un relais de phosphorylation comprenant trois niveaux (MAPKKK-MAPKK-MAPK). Le rôle des MAPKs a été démontré chez un grand nombre d’organismes et est lié fonctionnellement à plusieurs processus biologiques. Dans ce projet, nous avons essayé de mettre en évidence la fonction de trois MAPKKK (MKKK19, MKKK20 et MKKK21) chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle dont le génome a été entièrement séquencé en 2000. Ces trois kinases sont similaires aux kinases FRK1 et FRK2 qui sont impliquées dans le développement des gamètes mâles et femelles chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Les MKKK19-21 sont fortement exprimées au niveau de la fleur et plus précisément dans le pollen. L’analyse des lignées de plantes simples mutants pour ces trois kinases ne montre aucun défaut développemental évident en conditions normales suggérant fortement une redondance fonctionnelle entre ces gènes. Par contre, les plantes sous-exprimant les MKKK19-21 produisent un grand nombre de grains de pollen déformé et non viable. La croissance des tubes polliniques est aussi affectée dans ces mutants. Les observations microscopiques ont montré que c’est au stade tricellulaire de la microsporogenèse que ces lignées mutantes sont affectées. Ainsi, ces trois kinases joueraient un rôle important dans la phase tardive du développement pollinique chez Arabidopsis.  De façon à déterminer les protéines pouvant agir tant en amont qu’en aval des MKKK19-21, un criblage par la méthode de double hybride chez la levure a été réalisé à partir d’une banque d’ADNc des transcrits d’A.thaliana. Ceci nous a permis d’identifier un grand nombre d’interactants, dont plusieurs protéines kinases pouvant former des voies de signalisation avec les trois MKKK19-21. C’est le cas de la MPK18 qui interagit spécifiquement avec la MKKK20 et pour laquelle un rôle dans la régulation des microtubules corticaux (MTC) avait été démontré. Les résultats de l’analyse des mutants MKKK20 ainsi que les essais kinases nous ont permis de placer la MKKK20 en amont de la MPK18 dans la régulation des MTC. De plus, nous avons pu montrer que la MKK3 interagit spécifiquement avec la MKKK20 parmi les dix MKKs d’Arabidopsis et que ces deux kinases peuvent former un module MAPK aussi lié fonctionnellement aux MTC. L’analyse des doubles mutants (mkkk20/mpk18 et mkk3/mpk18) ainsi que les essais kinases et les observations microscopiques des polymères microtubulaires nous ont permis de caractériser deux voies impliquées dans la régulation des MTC. La première voie, celle de la MKKK20 et de la MPK18 est non canonique, ne nécessitant pas la présence d’une MKK entre les deux, alors que la deuxième voie serait canonique et comprend la MKKK20, MKK3 et possiblement d’autre(s) MPK(s) en aval. Nos résultats suggèrent que ces deux voies sont indépendantes et non synergiques jouant un rôle dans l’instabilité dynamique des MT chez Arabidopsis. Protein phosphorylation is the major post-translational molecular mechanism through which many eukaryotic proteins are regulated. Phosphorylation is involved in several biological processes and is carried out by kinase enzymes. The very large family of kinases is divided into many subgroups including MAPKs which function as a canonical module of three stepwise phosphorylation events (MAPKKK-MAPKK-MAPK). In this project, we aimed to study the function of three MAPKKK, MKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana, as it has been shown that two of their potential orthologues, FRK1 and 2 in Solanum chacoense are involved in male (pollen) and female (embryo sac) gametophyte development. We found that the MKKK19-21 were highly expressed in reproductive organs, more specifically inside pollen grains. MKKK19-21 single mutants showed WT phenotype under normal conditions, suggesting a possible functional redundancy from these genes. To overcome this, down-regulation of endogenous MKKK19-21 expression via transformation of WT A. thaliana with an artificial microRNA (amiRNA) construct was made. This led to the production of plants exhibiting a high number of dead pollen grains, as well as with defects in pollen tube growth for the viable ones. Microscopic observations of microsporogenesis showed that pollen developmental defects occurred at the tricellular stage. Consequently, the three MKKK19-21 are functionally important for the late stage of pollen development in A. thaliana. In order to find proteins acting both upstream and downstream of MKKK20, a yeast two-hybrid screen was performed against an Arabidopsis cDNA library. This led to the identification of a large number of interacting proteins. These proteins belong to several functional categories with some that could act in signaling pathways with MKKK19-21. Among them, MAPK18 that was demonstrated to regulate cortical microtubules (CMT) and that was found to interact specifically with MKKK20. The results of MKKK20 mutant plants analyses and kinase assays indicate that MKKK20 would act upstream of MPK18 in regulating CMT. The MKK3 was also found from a directed Y2H screen, and was shown to specifically interact with MKKK20 among the 10 Arabidopsis MKKs. MKK3 mutant analysis showed that both kinases could form a MAPK signaling pathway functionally linked to CMT. Furthermore, double mutants (mkkk20/mpk18 and mkk3/mpk18) analysis and kinase assays as well as microscopic observations of microtubule polymers allowed us to postulate that two different signaling pathways are involved in the regulation of CMT. The first one, considered as non-canonical MAPK pathway consists of MKK20 and MPK18, bypassing the need of an MKK, while the second one is a canonical pathway that comprises MKKK20, MKK3 and possibly other MPK(s). We concluded from these results that the two pathways are independent and do not work synergistically in MT dynamic instability in Arabidopsis cells.

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