Caractérisation biochimique, structurale et inhibition du système de sécrétion de type IV par l’étude des protéines VirB8

Chez tous les organismes vivants, les systèmes de sécrétion permettent le passage des macromolécules au travers des membranes cellulaires. Les bactéries à Gram-négatifs utilisent les systèmes de sécrétion de type IV (T4SS) pour réaliser une variété de processus impliqués dans les transports macromoléculaires incluant l’échange de matériel génétique. Le plasmide pKM101 code pour un T4SS similaire aux systèmes modèles bien étudiés provenant d’Agrobacterium tumefaciens et de Brucella suis. Dans le chapitre 2, nous avons étudié la structure et la fonction de TraE, un homologue de VirB8 provenant du pKM101, qui est un composant essentiel de tous les T4SSs et qui forme des dimères fonctionnels dans le noyau des T4SSs. Une analyse par cristallographie aux rayons X a révélé une structure similaire aux autres homologues de VirB8, mais possédant une interface de dimérisation modifiée. Cette interface de dimérisation a été corroborée en réalisant des essais de double hybride chez la bactérie, une caractérisation biochimique de la protéine purifiée et des essais de complémentation in vivo, démontrant qu’il existe différents modes de dimérisation parmi les homologues des protéines VirB8. De plus, l’analyse des interactions par BTH et des essais de réticulations ont montré que TraE et ses homologues provenant d’Agrobacterium, de Brucella et d’H. pylori forment des hétérodimères. Ils interagissent également avec des protéines VirB10 hétérologues, indiquant un certain degré de plasticité au niveau des interactions protéine- protéine pour les protéines de type VirB8 (VirB8-like). Enfin, pour évaluer d’avantage les caractéristiques communes des protéines de type VirB8, nous avons testé une série de petites molécules dérivées d’inhibiteurs de la dimérisation de VirB8 provenant de Brucella. Pour cela, nous avons prouvé que ces molécules se lient à TraE de manière in vitro, que par une prédiction in silico par arrimage moléculaire, qu’elles se lient à une surface structuralement conservée chez les protéines de type VirB8 et que certaines de ces molécules inhibent in vivo le transfert du pKM101. Pour conclure à propos de ce chapitre, nous pouvons dire que les protéines de type VirB8 partagent ainsi des sites fonctionnellement importants et cette caractéristique pourra être exploitée pour la conception d’inhibiteurs spécifiques de la fonction des T4SSs. L’augmentation de la fréquence de la résistance aux antimicrobiens est un problème d’importance mondiale. Le transfert plasmidique, réalisé par la fonction de conjugaison de i certains T4SSs, est un contributeur majeur au niveau du transfert des gènes de résistance aux antimicrobiens. Dans le chapitre 3, nous avons présenté une stratégie basée sur l’analyse structurale pour identifier des inhibiteurs de la conjugaison bactérienne réalisée par les T4SSs. Pour cela, nous avons tout d’abord criblé une banque de fragments, par la technique de la fluorimétrie différentielle à balayage, et identifié des molécules qui se lient à la protéine TraE. La co-cristallisation a révélé que des fragments se lient à deux sites alternatifs dont l’un d’entre eux est un nouveau site de liaison qui n’avait jamais été mis en évidence pour les autres protéines de type VirB8. Basé sur les informations structurales obtenues par cristallographie aux rayons X, nous avons conçu de nouvelles molécules qui ont une affinité de liaison améliorée. De plus, il a été montré que ces nouvelles molécules se lient au niveau des deux sites d’inhibition de TraE, inhibent de manière in vitro la dimérisation de TraE et aussi de manière in vivo le transfert par conjugaison du pKM101. Pour conclure, la stratégie présentée dans ce chapitre est généralement applicable pour la conception d’inhibiteurs de transfert des gènes de résistance aux antimicrobiens et de la virulence bactérienne. À ce jour, très peu d’informations sont disponibles sur les composants du T4SS liés à la membrane. Dans le chapitre 4, nous avons montré que TraE, dans sa forme entière, forme un complexe de masse moléculaire élevée distinct de la partie périplasmique de la protéine précédemment caractérisée. Ensuite, par la combinaison de la microscopie électronique et de la diffraction des rayons X aux petits angles nous avons démontré que TraE dans sa forme entière s’assemble en un complexe hexamérique avec un pore central. Nous avons également prouvé, que TraE peut se lier à TraD, qui est une protéine homologue à VirB6 provenant du pKM101, par des techniques de réticulation, de chromatographie d’exclusion stérique et de la microscopie électronique. Pour conclure, nos résultats suggèrent que TraE et TraD forment un pore au niveau du cœur central des T4SSs contribuant à la translocation du substrat. Cette étude, qui combine plusieurs disciplines, incluant de la biochimie, de la biologie structurale ainsi que de la chimie biologique, souligne l’intérêt et l’importance d’une approche multidisciplinaire. In all organisms, secretion systems mediate the passage of macromolecules across cellular membranes. Gram-negative bacteria use type IV secretion systems (T4SS) for a variety of macromolecular transport processes that include the exchange of genetic material. The pKM101 plasmid encodes a T4SS similar to the well-studied model systems from Agrobacterium tumefaciens and Brucella suis. In chapter 2, we studied the structure and function of TraE, a homolog of VirB8 from pKM101, that is an essential core component of all T4SS. Analysis by X-ray crystallography revealed a structure that is similar to other VirB8 homologs, but displayed an altered dimerization interface. The dimerization interface observed in the X-ray structure was corroborated using the bacterial two-hybrid assay, biochemical characterization of the purified protein and in vivo complementation, demonstrating that there are different modes of dimerization among VirB8 homologs. Analysis of interactions using the BTH and crosslinking assays showed that TraE and its homologs from Agrobacterium, Brucella and H. pylori form heterodimers. They also interact with heterologous VirB10 proteins, indicating a significant degree of plasticity of the protein-protein interactions of VirB8-like proteins. To further assess common features of VirB8-like proteins, we tested a series of small molecules derived from inhibitors of Brucella VirB8 dimerization. These molecules bound to TraE in vitro, in silico docking predicted that they bind to a structurally conserved surface groove of the protein and some of them inhibited pKM101 plasmid transfer. VirB8-like proteins thus share functionally important sites and these can be exploited for the design of specific inhibitors of T4SS function. The increasing prevalence of antimicrobial resistance is a problem of global importance. Novel strategies are urgently needed to understand and inhibit antimicrobial resistance gene transmission that is mechanistically related to bacterial virulence functions. The conjugative transfer of plasmids by T4SSs is a major contributor to antimicrobial resistance gene transfer. In chapter 3, we present a structure-based strategy to identify inhibitors of T4SS-mediated bacterial conjugation. Using differential scanning fluorimetry we screened a fragment library and identified molecules that bind the essential TraE protein of the plasmid pKM101 conjugation machinery. Co-crystallization revealed that fragments bind two alternative sites of iii the protein and one of them is a novel inhibitor binding site. Based on the structural information on fragment binding we designed novel small molecules that have improved binding affinity. These molecules inhibit the dimerization of TraE, bind to both inhibitor binding sites on TraE and inhibit the conjugative transfer of plasmid pKM101. The strategy presented here is generally applicable for the structure-based design of inhibitors of antimicrobial resistance gene transfer and of bacterial virulence. X-ray crystallographic and electron microscopic analyses have increasingly provided structural information on individual T4SS components and on the entire complex. But as of now, relatively little information has been available on the membrane-bound T4SS components. The overproduction and purification of membrane proteins is intrinsically difficult making their analysis challenging. In chapter 4, we show that the membrane-bound full-length version of the VirB8 homolog TraE from the plasmid pKM101 secretion system forms a high molecular mass complex that is distinct from the previously characterized periplasmic portion of the protein. Full-length TraE was extracted from the membranes with detergents and analysis by size- exclusion chromatography, crosslinking and the combination of SEC with multi-angle light scattering show that it forms a high molecular mass complex. Electron microscopy and small- angle X-ray scattering analysis demonstrate that full-length TraE assembles into a hexameric complex with a central pore. We also show by crosslinking, SEC and electron microscopy that TraE binds to the TraD protein. Our results suggest that TraE and TraD form a pore at the core of the secretion system contributing to substrate translocation. This study, which combined several disciplines, including biochemistry, structural biology and chemical biology, underscores the interest and significance of a multidisciplinary approach.

Keyphrases: plasmide, conjugaison, système de sécrétion de type IV, interaction protéine- protéine, criblage à base de fragments, conception de médicaments, résistance aux antimicrobiens, protéine de type VirB8, protéine de type VirB6, pore membranaire, plasmid, VirB8-like, plasmid, conjugation, type IV secretion system, protein-protein interaction, fragment-based screening, drug design, antimicrobial resistance, VirB8-like, VirB6-like, membrane pore