Exploration bioinformatique des interactions pollen–pistil chez Solanum chacoense

Rassemblant 107 espèces distribuées dans toute l’Amérique latine, les pommes de terre sauvages (Solanum sect. Petota) forment un réservoir de germoplasme important pour l’amélioration de leur cousine cultivée (S. tuberosum). Pourtant, bien qu’elles vivent en sympatrie et qu’elles aient la capacité physiologique de s’hybrider avec de proches parentes, ces espèces sauvages présentent de fortes barrières d’isolement reproductif. Les résultats préliminaires sur lesquels se fondent cette thèse, présentés au chapitre 1, montrent que les interactions pollen-pistil sont au cœur de cet isolement: dans un pistil hétérospécifique, les tubes polliniques (TP) sont ralentis et leur réceptivité aux signaux chimioattractifs de l’ovule est compromise.  Comme nous le verrons au chapitre 2, l’examen de l’abondante littérature scientifique existante indique qu’un grand nombre de protéines exprimées dans le pistil et le TP ont été caractérisées chez d’autres espèces et que plusieurs contribuent, par leur divergence interspécifique, à l’établissement de points de contrôle précis tout le long du trajet du TP dans le pistil. Parmi elles, les protéines chimioattractives LURE contrôlant le guidage directionnel du TP chez Torenia et Arabidopsis sont un exemple remarquable de médiateurs moléculaires de l’isolement reproductif. L’objectif de cette thèse est d’isoler des gènes candidats jouant des fonctions analogues chez les Solanacées tubéreuses. C’est dans ce souci que nous avons entrepris d’explorer à grande échelle, dans une approche mêlant bioinformatique, protéomique et transcriptomique, la diversité des gènes exprimés dans les ovules de S. chacoense.  Au chapitre 3, nous présentons un nouvel outil de recherche de séquences, KAPPA, spécifiquement dédié à la recherche de peptides riches en cystéines (CRP), une catégorie de protéines particulière dont font partie les chimioattractants ovulaires connus, ainsi que plusieurs autres interactants pollen-pistil. Cet outil a facilité l’identification de nouvelles CRP dans les chapitres suivants.  Nous en détaillons l’algorithme, en présentons les principales fonctions et fournissons des résultats démontrant ses performances sur des jeux de données calibrés.  Dans le chapitre 4, nous décrivons une étude du sécrétome ovulaire de S. chacoense comparant le contenu protéique des exsudats d’ovules matures (qui sont capables d’attirer le TP) et d’ovules immatures (qui en sont incapables). Nous présentons la méthode tissue-free gravity-extraction method (tf-GEM) utilisée pour collecter les exsudats et détaillons l’analyse bioinformatique effectuée à partir des résultats de spectrométrie de masse. Nous passons en revue les 305 protéines sécrétées identifiées dans les exsudats d’ovules, dont environ la moitié sont régulées entre les deux conditions à l’étude, analysons les catégories fonctionnelles associées, et discutons des applications possibles pour la découverte de gènes candidats.  Le chapitre 5 présente les résultats d’une analyse par biopuce de la réponse transcriptionnelle des ovaires de S. chacoense à différents types de pollinisation : conspécifique compatible, conspécifique incompatible, et hétérospécifique compatible. Nous montrons que des gènes ovulaires sont activés ou réprimés à distance dès les premières heures suivant la pollinisation et que cette réponse s’amplifie et devient spécifique à chaque génotype mâle au fur et à mesure de la progression des TP dans le style jusqu’à la fécondation. Nous discutons du rôle de différents médiateurs, notamment l’éthylène, dans la transmission à longue distance du signal de pollinisation.  Au chapitre 6, nous présentons les résultats d’une analyse transcriptomique de plus grande profondeur réalisée par séquençage d’ARN sur des ovules de S. chacoense capables (ovules sauvages matures) ou incapables (ovules sauvages immatures, ovules du mutant frk1 dépourvus de sac embryonnaire) d’attirer les TP. Nous montrons comment notre méthode hybride, recourant à la fois à des assemblages de novo et ab initio contre le génome récemment publié de S. chacoense, nous a conduits à obtenir un jeu de 4353 transcrits enrichis dans l’ovule. Nous détaillons les améliorations portées aux annotations existantes du génome, avec notamment la découverte de nouveaux loci codant pour des CRP reproductives. Nous présentons une analyse du profil d’expression des gènes dans l’ovule, discutons des catégories fonctionnelles associées, et terminons avec l’identification d’une liste de chimioattractants candidats.  Enfin, le chapitre 7 présente en détail ces chimioattractants candidats, les techniques utilisées pour exprimer et purifier ces protéines en bactéries et en levures, ainsi que les dispositifs microfluidiques élaborés pour en vérifier la capacité à attirer le tube pollinique. Nous incluons les résultats préliminaires obtenus avec cette méthode et concluons sur les développements possibles de notre projet. With 107 species distributed throughout Latin America, wild potatoes (Solanum sect. Petota) form an important germplasm reservoir for the breeding of their cultivated cousin (S. tuberosum). Yet, although they live in sympatry and have the physiological ability to hybridize with close relatives, those wild species exhibit strong reproductive isolation barriers. The preliminary results on which this thesis is based, presented in chapter 1, show that pollen-pistil interactions are at the center of this isolation: in a heterospecific pistil, pollen tubes (PTs) are slowed down and their receptivity to ovular chemoattractive signals is compromised.  As we will see in chapter 2, the review of the abundant existing scientific literature indicates that a large number of proteins expressed in pistils and PTs have been characterized in other species and that several contribute, through their interspecific divergence, to the establishment of specific checkpoints along the entire path of PTs in pistil. Among them, the LURE chemoattractive proteins controlling the directional guidance of PTs in Torenia and Arabidopsis are an outstanding example of molecular mediators of reproductive isolation. The objective of this thesis is to isolate candidate genes playing similar functions in tuber-bearing Solanaceous species. It is with this in mind that we have undertaken a large-scale exploration of the diversity of genes expressed in the ovules of S. chacoense, in an approach combining bioinformatics, proteomics and transcriptomics.  In chapter 3, we present a new sequence search tool, KAPPA, specifically dedicated to the detection of cystein-rich peptides (CRPs), a particular class of proteins that includes known ovular chemoattractants, as well as several other pollen–pistil interactants. This tool has facilitated the identification of new CRPs in the following chapters.  We detail the algorithm, present its main functions and provide results demonstrating its performance on calibrated datasets.  In chapter 4, we describe a study of the ovule secretome of S. chacoense comparing the protein content of exudates from mature ovules (which are able to attract PTs) and immature ovules (which are unable to do so). We present the tissue-free gravity-extraction method (tf-GEM) used to collect exudates and detail the bioinformatics analysis performed on mass spectrometry results. We review the 305 secreted proteins identified in ovule exudates, about half of which are regulated between the two conditions under study, analyze the associated functional categories, and discuss possible applications for the discovery of candidate genes.  Chapter 5 presents the results of a microarray analysis of the transcriptional response of S. chacoense ovaries to different pollination types: conspecific compatible, conspecific incompatible, and heterospecific compatible. We show that ovarian genes are activated or repressed at a distance as early as the first few hours after pollination and that this response is amplified and becomes specific to each male genotype as the PTs progress in the style until fertilization. We discuss the role of different mediators, including ethylene, in the long-range transmission of the pollination signal.  In chapter 6, we present the results of a deeper transcriptomic analysis performed by sequencing RNAs from PT guidance-competent (mature wild-type) ovules and PT guidance-incompetent (immature wild-type and embryo sac-devoid frk1 mutant) ovules in S. chacoense. We show how our hybrid method, relying on both de novo and ab initio assemblies against the S. chacoense genome published recently, led us to obtain a set of 4353 ovule-enriched transcripts. We detail the improvements made to existing genome annotations, including the discovery of new loci encoding reproductive CRPs. We present an analysis of the gene expression profile in the ovule, discuss associated functional categories, and conclude with the identification of a list of candidate chemoattractants.  Finally, chapter 7 details these candidate chemoattractants, the techniques used to express and purify them in bacteria and yeasts, and the microfluidic devices developed to verify their ability to attract the pollen tube. We include preliminary results obtained with this method and conclude on possible developments of our project.

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