Time-Resolved Phosphoproteomics Unravel the Dynamics of Intracellular Signaling

La phosphorylation des protéines est une modification post-traductionnelle très abondante qui cible les acides aminés sérine, thréonine et tyrosine. Les groupements phosphates sont ajoutés aux protéines par les kinases et retirés par les phosphatases. La phosphorylation d’une protéine régule sa conformation structurelle; ce qui modifie ses fonctions. C’est un vecteur de signalisation intracellulaire, impliqué notamment dans la régulation des interactions protéine-protéine et de l’activité des enzymes. La prolifération, la différenciation et la morphologie cellulaires sont autant de processus régulés par des événements de phosphorylation. Une meilleure compréhension des voies de phosphorylation est ainsi importante pour faire avancer la recherche contre le cancer. L’étude de la phosphorylation des protéines a grandement bénéficié de l’amélioration des techniques de protéomique basées sur la spectrométrie de masse, qui permettent d’analyser en quelques heures des milliers de sites de phosphorylation. Les expériences de spectrométrie de masse permettent habituellement d’étudier les effets de stimuli extracellulaires sur le phosphoprotéome en prenant des mesures à un seul temps post-stimulation donné. Ce type d’analyse ne permet toutefois pas de suivre les changements de phosphorylation dans le temps, ce qui serait utile pour comprendre le fonctionnement des voies de signalisation. La présente thèse décrit le développement et l’application de nouvelles techniques de phosphoprotéomique permettant de mesurer la phosphorylation avec une grande résolution temporelle. Cette approche a permis d’identifier de nouvelles voies de signalisation dépendantes de stimuli et de mieux caractériser certains réseaux de phosphorylation déjà connus.   Tout d’abord, une analyse temporelle du phosphoprotéome a été effectuée pour déterminer les effets de stress thermiques sur Saccharomyces cerevisiae dans les 30 minutes post-stimulation. 15 profils cinétiques différents ont été identifiés. Ces profils de phosphorylation ont permis de mieux définir des interactions kinase-substrat. L’information temporelle a notamment permis de caractériser les réseaux de signalisation des kinases Cdc28 et PKA suite à un choc thermique. De grands changements d’état de phosphorylation ont été observés pour des protéines impliquées dans la transcription, le repliement des protéines et la progression du cycle cellulaire.   Dans une seconde étude, des cellules humaines de cancer du côlon contenant des mutations somatiques de BRAF ou KRAS ont été traitées avec un inhibiteur de BRAF, le Vermurafenib. L’utilisation de la phosphoprotéomique temporelle a permis d’identifier de nouveaux substrats de la voie BRAF-RAS-ERK. De fait, il a été démontré que les facteurs de transcription MKL1/2 et TEAD3 sont des cibles directes de la kinase ERK.   Enfin, les effets sur le phosphoprotéome de petites molécules activatrices de la protéine phosphatase 2 A (PP2A) ont été étudiés. Des cellules hématopoïétiques murines ont été traitées avec les sphingolipides anti-oncogéniques C2-ceramide et SH-BC-893 ainsi qu’avec l’inhibiteur spécifique de PP2A, le LB-100. Les sphingolipides utilisés sont des activateurs connus de PP2A qui causent la mort cellulaire en privant les cellules de nutriments. De fait, les deux sphingolipides causent la perte de transporteurs de nutriments. SH-BC-893 mène en plus à la formation de vacuoles, un phénotype lié à la mobilisation de nutriments. La dynamique du phosphoprotéome a été suivie pendant les 60 minutes suivant le traitement, révélant une activation différentielle de PP2A en présence des sphingolipides. En comparant ces réponses avec le phosphoprotéome de cellules traitées avec le LB-100, il a été possible d’identifier des sites de PP2A sur de nombreuses GTPases et protéines du cytosquelette d’actine, notamment Arhgef2 et Paxilin. De plus, la privation de nutriments s’est avérée être partiellement  dépendante de la polymérisation de l’actine induite par les sphingolipides. Finalement, les phosphoprotéines lysosomales associées au kinase AKT et impliquées dans le recyclage des endosomes sont régulées différent par SH-BC-893 et C2-ceramide, ce qui explique partiellement pourquoi C2-ceramide ne cause pas la formation de vacuoles.   Somme toute, l’analyse temporelle du phosphoprotéome a permis d’étudier différents processus plus en profondeur que ce que permettent les techniques de phosphoprotéomique traditionnelles. Elles ont permis d’élucider des mécanismes biologiques d’importance pour la recherche contre le cancer. Protein phosphorylation is a highly abundant post translational modification primarily observed on the amino acids Serine, Threonine and Tyrosine. Phosphate residues are transferred through kinases and are removed by protein phosphatases. Phosphorylation regulates the structural conformation of proteins, therefore modifying their function. It functions as an intracellular signaling mediator that regulates key processes such as protein-protein interactions and the activity of enzymes. Cell proliferation, differentiation and morphology are some of the most important cellular machineries regulated through phosphorylation signaling. Knowledge about phosphorylation pathways therefore is of high importance for cancer research. The study of protein phosphorylation has greatly benefited from the implementation of mass spectrometry based proteomics techniques that allows for the profiling of thousands of protein phosphorylation sites in a matter of hours. When investigating the effects of extracellular stimulations on the phosphoproteome, mass spectrometry experiments are typically designed by taking a snapshot of the phosphoproteome at a given time post stimulation. This type of analysis, however, does not allow to follow the temporal characteristics of phosphorylation that could explain the functioning of signaling pathways. This thesis describes the development and application of phosphoproteomics techniques that monitor phosphorylation signaling at high temporal resolution. This approach allowed the discovery of stimulation dependent signaling pathways and aided the refinement of already characterized phosphorylation networks.   At first, temporal profiling of the phosphoproteome was applied to study the effects of heat and cold stress on Saccharomyces cerevisiae within the first 30 minutes post stimulation. Fifteen different kinetic trends were discovered. Kinase-substrate interactions could be unraveled based on kinetic patterns of phosphorylation. In more detail, temporal information allowed the characterization of the signaling network of the kinases Cdc28 and PKA following temperature stress. These responses were associated with extensive changes in phosphorylation on proteins involved in transcription, protein folding and cell cycle progression.   In a second study, human colon cancer cells harboring somatic BRAF or KRAS mutations were subjected to treatments with the BRAF kinase inhibitor Vemurafenib. Temporally resolved phosphoprotoemics aided the discovery of novel targets of the BRAF-RAS-ERK signaling pathway. The transcription factors MKL1/2 and TEAD3 were found to be direct target of the kinase ERK. ERK mediated phosphorylation of MKL1/2 could be associated to actin binding, regulating their activity.   Third, a study investigating the effects of protein phosphatase 2 A (PP2A) small molecule activators on the phosphoprotoeme is described. Hematopoietic mouse cells were treated with the anti-oncogenic sphingolipids C2-ceramide and SH-BC-893 as well as the specific PP2A inhibitor LB-100. The investigated sphingolipids are known activators of PP2A that starve cancer cells to death. Both sphingolipids cause nutrient transporter loss, leading to cell starvation. In addition, SH-BC-893 causes vacuolation, a phenotype that is linked to nutrient mobilization. Phosphoprotoeme dynamics were monitored within 60 minutes post stimulation and unraveled differential activation of PP2A with sphingolipids. Comparison of sphingolipid response to the LB-100 perturbed phosphoprotoeme revealed PP2A directed phosphorylation on numerous GTPase and actin cytoskeletal proteins including Arhgef2 and Paxilin. Cell starvation was found to be partially dependent on sphingolipid induced actin polymerization. Lysosomal phosphoproteins affiliated with the kinase AKT and endosome recycling were differentially regulated by SH-BC-893 and C2-ceramide, partially explaining why C2-ceramide does not induce vacuolation.   Overall, temporal profiling of the phosphoproteome improved the depth of knowledge gained from phosphoproteomics experiments compared to conventional studies, and lead to the discovery of yet unknown biological mechanisms that are of importance to cancer research.

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