The Role of Specific Amino Acids in the Formation of Ternary Complexes in Nitrogenase Regulation in the Photosynthetic Bacterium 
Rhodobacter capsulatus

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus.  La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire.  Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation.  Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +. Nitrogen is one of the most vital elements in the world for living creatures since it is essential for the production of the basic building blocks of the cell; amino acids, nucleic acids and other cellular constituents. The atmosphere is 78% nitrogen gas (N2), a source of nitrogen unusable by most organisms except for those possessing the enzyme nitrogenase, such as diazotrophic bacteria species. These microorganisms are capable of converting atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), which is one of the most preferable nitrogen sources. This ATP demanding reaction, called nitrogen fixation, is catalysed by the nitrogenase enzyme, which is the most important enzyme in the nitrogen cycle. Some proteins are potential regulators of nitrogenase synthesis and activity; AmtB, DraT, DraG, PII proteins and etc. In this thesis I performed various experiments in order to better understand their roles in Rhodobacter capsulatus, in more detail.  The membrane protein AmtB, which is widespread among archaea, bacteria and eukaryotes, is a member of the MEP/Amt/Rh family. The AmtB proteins are ammonium transporters, taking up external ammonium, and have also been suggested to sense the presence of ammonium. It has been shown that in Rhodobacter capsulatus AmtB functions as a sensor for the presence of external ammonium in order to regulate nitrogenase. Nitrogenase consists of two metalloprotein components named MoFe-protein and Fe-protein. The addition of ammonium to R. capsulatus culture medium leads to a series of reactions which result in the deactivation of nitrogenase, called “nitrogenase switch-off”. A critical reaction in this process is one in which DraT adds an ADP-ribose group to the Fe-protein of nitrogenase. The entrance of ammonia through the AmtB pore is regulated by GlnK sequestration. GlnK is a PII protein and PII proteins are one of the central proteins in the regulation of nitrogen metabolism. Not only is GlnK-AmtB sequestration important in nitrogenase regulation, but binding of ammonium by AmtB or its partial transport is also necessary. AmtB-GlnK complexes are thought to bind DraG, which is responsible for removing the ADP-ribose that DraT adds to nitrogenase, to form a ternary complex.   In this thesis details of the signal transduction mechanism and ammonium transport were examined by generating and characterizing RCZC, a (D335A) site- directed mutant of AmtB. The ability of this mutant, as well as previously constructed mutants RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) and RCIA4 (W237A), to “switch-off” nitrogenase activity was measured by gas chromatography. The results revealed that all the above amino acid residues have critical roles in nitrogenase regulation. Immunoblotting was also carried out to check the presence of ADP-ribosylated Fe-protein. D335, D388 and W237 seem to be crucial for NifH ADP-ribosylation, since their mutants (RCZC, RCIA1 and RCIA4 respectively) didn't show ADP-ribosylation on Fe-protein. In addition, although a slight ADP-ribosylation was observed for RCIA2 (G344C) we still consider it as an important amino acid residue in this matter whereas the remaining mutant RCIA3 (H193E) showed Fe-protein ADP-ribossylation after an ammonium shock, therefore it doesn't seem to be important in NifH ADP-ribosylation.  In addition R. capsulatus possesses a second Amt called AmtY, which in contrast to AmtB, doesn't appear to have any specific roles. In order to find out its functionality, AmtY was overexpressed in an E. coli strain lacking AmtB (GT1001 pRSG1) (which was carried out previously by other lab members) and AmtY-GlnK complex formation in response to ammonium addition was examined. It was shown that even though AmtY is able to take up ammonia when expressed in E. coli it fails to associate with GlnK in response to NH4+.

Keyphrases: AmtB, AmtY, Le transport d'ammonium, Mutagenèse dirigée, Fixation de l'azote, AmtB, AmtY, ADP ribosylation, Ammonium transport, Site directed mutagenesis, Nitrogen fixation