Altération de l’interaction entre la PTH et LRP6 dans les ostéoblastes humains arthrosiques via DKK2

L’ostéoarthrose (OA) se caractérise par une perte du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, et une inflammation de la membrane synoviale. Des études in vivo et in vitro indiquent que les modifications du tissu osseux sont responsables de la perte du cartilage articulaire. Les ostéoblastes (Ob) OA présentent une réduction de la réponse à l’hormone parathyroïdienne (PTH), un signal anabolique important pour le tissu osseux, versus les Ob normaux. Le récepteur à la PTH (PTH-R) interagit avec le LRP6, le récepteur des ligands Wnts, et les antagonistes Dickkopf (DKK) bloquent cette interaction. Puisque le niveau de DKK2 est élevé en réponse au TGF-β1 dans les OA Ob, nous proposons que DKK2 altère l’interaction LRP6/PTH-R, le recyclage de PTH-R, et inhibe la réponse à la PTH. Nous avons utilisé des Ob OA et normaux humains en culture primaire. L’expression de PTH-R, LPR6 et DKK2 est mesurée par RT-PCR. Les niveaux protéiques de LRP6, PTH-R et DKK2 ont été déterminés par immunobuvardage. L’inhibition de DKK2 s’est effectuée par siRNA et l’AMP cyclique (AMPc) a été mesurée par ELISA. L’effet de TGF-β1 sur l’expression de DKK2 et PTH-R a été testé sur des cellules d’ostéosarcome SaOS-2. L’expression de PTH-R et LRP6 est similaire entre Ob normaux et OA, mais le niveau protéique de PTH-R est réduit dans les Ob OA. Par contre, l’expression et la production de DKK2 sont plus élevées dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 ne modifia pas l’expression de LRP6 et PTH-R dans les Ob OA mais a augmenté le niveau protéique de PTH-R détecté par immunobuvardage alors que celui de LRP-6 demeura inchangé. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA entraîna une augmentation de PTH-R dans la fraction membranaire et une diminution de la fraction intracellulaire. Les résultats de l'inhibition de la voie de clathrine par le triflupromazine ont montré une expression accrue du récepteur PTH dans la fraction membranaire qui peut être due à l'inhibition de sa dégradation par la voie de clathrine. L’induction de DKK2 dans les cellules SaOS-2 par TGF-β1 entraîna l’inhibition de PTH-R mais non celle de LRP6. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA a stimulé la production d’AMPc en réponse à la PTH par les Ob OA. En outre, le traitement de TGF-β1 dans les cellules SaOS-2 réduit la production d'AMPc en réponse à la PTH.Ces résultats démontrent que les niveaux élevés de DKK2, via l’inhibition de la signalisation Wnt/bcaténine, sont aussi responsables de l’altération de la réponse à la PTH observée dans les Ob OA. Le niveau élevé de DKK2 diminue spécifiquement l’affichage membranaire de PTH-R dans ces cellules et non son expression. Ces résultats suggèrent donc une altération du cross-talk entre LRP6 et PTH-R dans les Ob OA en lien avec leur niveau de DKK2. Osteoarthritis (OA) is characterized by loss of articular cartilage, bone sclerosis and synovial membrane inflammation. In vivo and in vitro studies indicate that the changes in bone tissue are responsible for the loss of articular cartilage. OA Osteoblasts (Ob) show a reduced response to parathyroid hormone (PTH), an important anabolic signal for bone tissue, versus normal Ob. The PTH receptor (PTH-R) interacts with LRP6, a receptor of Wnt ligands, and DKK antagonists block this interaction. Since DKK2 production is high in OA Ob whereas DKK2 is increased in normal Ob in response to TGF-β1, we propose that DKK2 alters the LRP6/PTH-R interaction, PTH-R recycling and inhibits the response to PTH. We used human OA and normal osteoblasts in primary culture. PTH-R, DKK2 and LRP6 expression were measured by RT-PCR. LRP6, PTH-R and DKK2 protein levels were determined by immunoblotting. Inhibition of DKK2 levels in OA Ob was performed by DKK2-siRNA, and cAMP production was measured by ELISA. The effect of TGF-β1 on DKK2, PTH-R and cAMP production was tested in osteosarcoma cells SaOS-2. In OA Ob, PTH-R and LRP6 mRNA levels were not changed following DKK2 siRNA treatment. However, PTH-R protein expression increased while that for LRP-6 remained unchanged after treatment with DKK2-siRNA. Compared to control, the distribution of PTH-R was higher in the membrane fraction and lower in the intracellular fraction in OA Ob following DKK2 inhibition. In contrast, LRP6 levels remained almost unchanged following these treatments. The results of the inhibition of the clathrin pathway by triflupromazin showed an increased expression of the PTH receptor in the membrane fraction that may be due to inhibition of their degradation by clathrin pathway. In OA Ob, DKK2 inhibition stimulated cAMP production in response to PTH. DKK2 induction by TGF-β1 in SaOS-2 cells, as assessed by qRT-PCR, caused the inhibition of PTH-R protein expression but not of LRP6. In addition, TGF-β1 treatment in SaOS-2 cells reduced cAMP production in response to PTH. These results demonstrate that high levels of DKK2 in OA Ob are responsible for the altered response to PTH. DKK2 antagonists decrease specifically PTH-R membrane display while they do not affect LRP6 recycling. These results suggest an altered cross-talk between LRP6 and PTH-R in OA Ob due to high levels of DKK2 in these cells.

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