Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques.  Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle.  Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires. Cardiac remodelling is the process by which cardiac structure and/or function change in response to pathophysiological imbalances such as hypertension, cardiac disease, prolonged arrhythmia or altered hormonal balance. The renin-angiotensin system (RAS) is an extensively studied hormonal system involved in numerous processes associated with cardiovascular remodelling. Classically viewed as a circulating and a local tissue system, emerging evidence suggests an independent and functionally active RAS within individual cells. Understanding intracellular RAS actions might lead to new therapeutic avenues that could prevent adverse cardiac remodelling. The purpose of this thesis was to elucidate the role of intracellular RAS in cardiac cells. Recently, G protein-coupled receptors (GPCRs), G proteins, and their downstream effectors have been detected on intracellular membranes, including the nuclear membrane, and the concept of functional intracellular GPCRs is slowly being accepted as a reality. We therefore hypothesized that nuclear-delimited angiotensin II (Ang-II) signalling is involved in controlling cardiac gene expression. We demonstrated the presence of nuclear angiotensin-type 1 (AT1R) and angiotensin-type 2 (AT2R) receptors in adult ventricular cardiomyocytes and in a purified nuclear preparation from cardiac tissue. Ang-II was detected in cardiomyocyte lysate and microinjected Ang-II-FITC preferentially bound to nuclear sites. Transcriptional analysis demonstrated that Ang-II enhanced de novo RNA synthesis in isolated nuclei and NF-κB mRNA expression was much greater when nuclei were exposed to Ang-II. Nuclear AT1R-stimulation produced Ca2+ mobilization via nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) Ca2+-channels, and IP3R-blockade attenuated the AT1R-mediated transcriptional responses in isolated nuclei.  Current methods available to study intracrine RAS signalling are limited to indirect methodologies because of a lack of selective intracellularly-acting probes. An aim of this thesis was to synthesize and characterize cell-permeant Ang-II analogues to probe intracellular RAS action with spatial and temporal precision. Using solid-phase peptide technology we synthesized and pharmacologically characterized light-sensitive caged Ang-II analogues. This was achieved by incorporating a photocleavable 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) moiety on sites of Ang-II responsible for receptor recognition and activation. All of the three synthesized and purified caged-Ang-II analogues: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB and [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB, showed two-to-three orders of magnitude reduced binding affinity towards the AT1R and AT2R in competition binding assays and reduced potency in contraction assays using thoracic aorta. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in HEK cells increased ERK1/2 phosphorylation (via AT1R) and cGMP production (via AT2R) whereas in isolated cardiomyocytes it induced an increase in nucleoplasmic Ca2+ and increased the abundance of 18S rRNA and NF-κB mRNA. Fibroblasts are the main drivers of cardiac structural remodelling. Atrial fibroblasts are more responsive to pro-fibrotic stimuli than ventricular fibroblasts. We hypothesized that intracellular Ang-II and associated nuclear AT1R and AT2R activation control fibroblast gene-expression patterns via discrete signalling systems and thereby play a key role in cardiac fibrosis. Atrial fibroblasts were found to express Ang-II, and nuclear AT1R and AT2R. The nuclear localisation of AT1R was increased in fibroblasts isolated from failing hearts whereas nuclear AT2R showed alterations in glycosylation. Heterotrimeric G protein subunits including Gαq/11, Gαi/3, and Gβ were observed in isolated fibroblast nuclei. AT1R and AT2R increased fibroblast transcription initiation via IP3R and NO signal transduction pathways, respectively. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in cultured atrial fibroblasts induced an increase in nucleoplasmic Ca2+, proliferation, collagen synthesis and secretion that was not prevented by extracellular AT1R and/or AT2R blockers.

Keyphrases: Système rénine-angiotensine, récepteurs intracellulaires, signalisation par les RCPG, remodelage cardiovasculaire, Renin-angiotensin system, intracellular receptors, GPCR signalling, cardiovascular remodelling, Nuclear GPCR, Photoreleasable Angiotensin-II