Accélération de l'exploration de l'espace chimique du cytochrome P450 BM3 par des méthodes de criblage à haut débit et bio-informatiques

L’application de la chimie organique est prépondérante dans plusieurs secteurs industriels tels que le pharmaceutique, le cosmétique, l’alimentaire ou les produits ménagers. La chimie organique évolue sans cesse pour rendre les synthèses plus efficaces et moins dispendieuses. Cependant, l’amélioration de voies de synthèse se fait souvent sans égard à leur effet sur l’environnement. Ceci a entrainé l’émergence de la chimie verte pour réduire leur impact environnemental. À cette fin, l’une des stratégies employées est la biocatalyse : l’utilisation d’enzymes due à leurs propriétés ‘vertes’ et leur grande efficacité réactionnelle.  Les oxydases de type cytochrome P450 sont reconnues pour leur grande promiscuité, liée à leur rôle dans la détoxification de composés xénobiotiques et de molécules endogènes dans le corps. Cette superfamille d’enzymes accomplit une diversité de réactions d’oxydations en une seule étape telles que l’hydroxylation, l’époxidation, la désamination, la déshalogénation et la cyclopropanation. La P450 BM3 (P450 BM3) de Bacillus megaterium possède l’une des plus grandes activités catalytiques de sa famille, justifiant l’intérêt grandissant de ses applications industrielles. Ce mémoire se penche sur la nécessité d’améliorer les essais afin d’augmenter la capacité de criblage pour obtenir une plus grande proportion de variants  capable de catalyser une réaction désirée.  Il a été proposé que la synthèse de l’indigo par les variants de P450 BM3 soit un indicateur de promiscuité envers de nouveaux substrats. Nous avons exploré l’espace mutationnel de P450 BM3 pour la synthèse de l’indigo en comparant différentes méthodes de criblage de librairies de variants.  Dans un premier temps, des librairies de variants furent créées par mutagénèse par saturation de site. Cela permet d’obtenir une représentation uniforme des variants à chaque position sélectionnée plus rapidement et à un coût modique. Ensuite, des méthodes de criblage furent optimisées pour quantifier les variants de P450 BM3 et les cribler de deux façons. Nous avons comparé un essai colorimétrique direct grâce à l’absorbance de l’indigo avec un essai général indirect combinant la fluorescence du cofacteur NADPH et la spectrométrie de masse (LC-MS, GC-MS et LC préparative). Cette deuxième approche permet de cribler les variants indépendamment du substrat. Afin d’augmenter le débit du criblage, nous avons optimisé les méthodes en utilisant des plaques 96 puits avec une station de pipetage automatisée. Nous avons découvert de multiples nouveaux variants de P450 BM3 synthétisant l’indigo dont une forte fraction de ces derniers s’est révélée aptes à synthétiser une molécule de valeur élevée en industrie : la cétone de framboise.  La corrélation de l’activité de P450 BM3 avec l’indigo et la cétone de framboise justifie l’exploration plus profonde de l’espace mutationnel de P450 BM3. La compréhension de cette corrélation permettrait de guider d’avantage l’ingénierie de P450 BM3 vers de nouveaux substrats. À cette fin, nous tentons d’expliquer la relation entre la structure, le dynamisme et l’activité des variants de P450 BM3. Les méthodes de criblage conventionnelles ne sont pas assez efficaces pour générer de grandes séries de données (« Big Data »). Nous appliquons le séquençage de nouvelle génération afin d’identifier >104 variants simultanément pour relier le génotype (ADN) au phénotype (synthèse d’indigo). L’analyse de ces données nécessite l’utilisation d’outils statistiques et informatiques tels que la modélisation, la dynamique moléculaire et l’analyse de composantes indépendantes du temps et de la structure (tICA). Nous observons une tendance commune des variants actifs de P450 BM3 représenté par un changement d’équilibre entre ses deux conformations majeures.  Ce changement conformationnel pourrait expliquer la propension de P450 BM3 à synthétiser l’indigo. Ce mémoire présente ainsi des méthodes permettant d’accélérer la découverte de variants actifs de P450 BM3 pour diverses réactions d’intérêt en industrie. Les méthodologies ci-développées pourront ensuite guider l’ingénierie d’autres systèmes enzymatiques. Organic chemistry plays a major role in the pharmaceutical, cosmetic, food and household product industries. Industrial organic synthesis has constantly evolved to be more efficient and less cost-effective. However, those improvements were often made regardless of their impact on the environment, spawning the creation of the discipline of Green Chemistry. One among many strategies to make chemistry more innocuous to the environment is to apply biocatalysis: the use of enzymes for their ‘green’ properties and catalytic efficacy. Cytochrome P450 oxidases are well known for their substrate promiscuity in detoxification of xenobiotics and endogenous molecules in the body. This superfamily of enzymes catalyzes a diversity of oxidation reactions in a single step, including hydroxylations, epoxidations, deaminations, dehalogenations and cyclopropanations. Cytochrome P450 BM3 (P450 BM3) from Bacillus megaterium is one of the most efficient of its family, justifying the growing interest for its industrial applications. This thesis considers the necessity to improve assays in order to increase the throughput of enzyme library screening and to improve the ratio of active variants. Indigo synthesis has been proposed to be an efficient predictor of promiscuity towards novel substrates of P450 BM3. We explore the mutational space of P450 BM3 for indigo synthesis and compare screening methods. We made variant libraries using site-directed saturation mutagenesis to obtain a uniform distribution of mutations at each position and reduce cost and time. We optimized a method to quantify P450 BM3 variants and two different screening methods. We compared a direct colorimetric assay using indigo absorbance and an indirect assay using NADPH fluorescence coupled with mass spectrometry (LC-MS, GC-MS and LC prep). This second approach circumvents the need to develop an assay dependent of the substrate. To increase screening throughput, we optimized methods in a 96-well plate format and use an automated pipetting station. We confirm the discovery of new indigo-producing variants. We further demonstrate that indigo can serve as a strong predictor of raspberry ketone production, a high value industrial compound.  The correlation of the activity of P450 BM3 with indigo and raspberry ketone justifies the exploration of the fitness landscape P450 BM3. Understanding this correlation would accelerate engineering of P450 BM3 for reaction with novel substrates. We attempt to explain the relationship between the structure, dynamism and activity through deep-mutational scanning of P450 BM3. Conventional screening methods are not sufficient to produce large datasets (Big Data); we apply next-generation sequencing (NGS) to identify >104 variants simultaneously and to link the genotype (DNA) and the phenotype (indigo production).  Analysis of NGS for enzyme engineering required the development of statistical and bioinformatics tools such as modeling, molecular dynamics and time-structure independent component analysis (tICA). Those methods allowed us to observe conformational perturbations that were shared between the active variants represented as a shift of equilibrium between two major conformations.  This shift may explain the propensity of diverse P450 BM3 variants to synthesize indigo. This master’s thesis successfully demonstrates the accelerated discovery of engineered variants of P450 BM3 with activity for industrially relevant reactions. The methodologies we have developed contribute to knowledge on enzyme engineering and have the potential to be applied more broadly in other enzyme systems.

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