Identification biochimique et fonctionnelle des domaines structuraux d’une sous-unité des canaux calciques

Les canaux calciques CaV1.2 activés par la dépolarisation membranaire jouent un rôle majeur dans le couplage excitation-contraction en promouvant l’entrée de Ca2+ dans les cellules cardiaques. Une perturbation de la fonction de ces canaux a été associé avec l’apparition de maladies cardiovasculaires telles que les arythmies cardiaques. Ces canaux forment un complexe hétéromérique constitués de la sous-unité principale CaVa1C formant le pore et de l’association d’au moins deux sous-unités auxiliaires. L’interaction avec la sous- unité cytoplasmique CaVb est importante pour l’adressage membranaire du canal tandis que la liaison de la sous-unité extracellulaire CaVa2d1 augmente les densités de courant d’un facteur 5 à 10 et permet l’activation du canal à des potentiels physiologiques. L’ensemble de ces sous- unités est donc nécessaire pour reproduire les propriétés biophysiques du canal natif. Tandis que la modulation fonctionnelle du canal CaVa1 par CaVb a été bien caractérisée, les mécanismes de régulation par la protéine CaVa2d1 ne sont pas encore élucidés. La caractérisation structurale de CaVa2d1 a été entreprise mais l’extrême complexité d’organisation de cette protéine en raison de ces multiples modifications post-traductionnelles (seize sites de glycosylation, ponts disulfures intra- et intermoléculaires, délétion du C- terminal pour son ancrage membranaire) a limitée cette étude. Notre stratégie alternative a alors été de purifier séparément les domaines structuraux de CaVa2d1 dans le but d’étudier leurs structures 3D. La structure du domaine Cache2 obtenue à basse résolution par diffusion des rayons X aux petits angles a révélé un repliement majoritairement en feuillets-b et la présence de nombreuses régions flexibles. Cependant, la publication en 2016 de la structure du canal calcique homologue CaV1.1 purifié à partir de muscle squelettique à une résolution de 3.6 Å par cryo-microscopie électronique a fourni l’essentiel des détails structuraux sur la sous- unité CaVa2d1. Cette structure a montré que le domaine VWA de CaVa2d1 se situe à une distance atomique de CaVa1S. Dans le but de mieux comprendre comment cette association contribue à la fonction de CaVa2d1 dans les cellules cardiaques, nous a amené à étudier les déterminants moléculaires responsables de l’interaction entre CaVa1C (CaV1.2) et CaVa2d1. Nos études combinées de modélisation par homologie, électrophysiologie et co-immunoprécipitation ont montré, dans un premier temps, que les deux résidus aspartates (Asp- 180 et Asp-181) situés dans la boucle S1S2 du domaine I (IS1S2) de CaV1.2 étaient critiques pour la modulation du canal par CaVa2d1. Plus particulièrement, l’Asp-181 est crucial pour l’interaction physique avec CaVa2d1 tandis que l’Asp-180 joue un rôle important dans le déplacement du potentiel d’activation du canal vers des valeurs hyperpolarisantes. Nous avons, dans un second temps, montré que l’Asp-259 dans CaVa2d1 était nécessaire pour capter un ion Ca2+ et permettre le repliement optimal du site MIDAS (metal-ion-dependant adhesion site) sur le domaine VWA (Won Willebrand factor A) de la protéine. Dans cette conformation, la Ser-261 et la Ser-263 de CaVa2d1 peuvent alternativement établir une liaison électrostatique avec l’Asp-181 de CaV1.2 ce qui stabilise l’interface et permet la régulation du canal par CaVa2d1. Nos travaux ont révélé de nouveaux mécanismes moléculaires, par lesquels, la liaison de CaVa2d1 avec la boucle IS1S2 de CaV1.2 induit un réarrangement structural local à travers de multiples interactions fonctionnant en synergie ce qui facilite l’ouverture du canal, et indirectement l’augmentation des densités de courants à travers le pore. Voltage-gated calcium channels play a key role in the excitation-contraction coupling by promoting Ca2+ influx through CaV1.2 into the cardiac cells. A dysregulation in the function of this channel has been involved in cardiac arrhythmias. L-type voltage-gated calcium channels are formed by the main pore-forming CaVa1C subunit assembled with two auxiliary subunits. The cytoplasmic CaVb subunit strongly interacts with the intracellular loop between repeat I and II of CaVa1 and promote cell surface expression of the channel whereas the interaction with the extracellular CaVa2d1 subunit increases by 5- to 10-fold the peak current density and promote channel activation within a physiological range. The full set of subunits is required to reproduce the biophysical properties of the native channel. For L-type voltage-gated calcium channel, the mechanism whereby CaVa2d1 exerts its function is still not fully understood. A structural determination of CaVa2d1 conducted using a typical biochemical approach was initiated but many post-translational modifications (16 Nglycosylation sites, intra- and extra-disulfide bonds, glycosylphosphatidylinositol anchor) prevented the purification of the entire protein. We then devised a “divide-and-conquer” strategy that lead to the purification of the Cache2 domain of CaVa2d1. The low-resolution structure of the Cache2 domain by small angle X-rays scattering revealed a predominantly fold in b-sheet with multiple flexible regions. The publication in 2016 of the high-resolution structure of the homologous CaV1.1 channel complex at 3.6 Å of resolution solved by cryoelectronic microscopy provided crucial molecular details regarding the organization of the structural domains of CaVa2d1 but also its spatial orientation within the CaV1.1 complex. In particular, the VWA domain of CaVa2d1 appears to come within atomic distance of many extracellular loops of CaVa1 subunit. To establish whether physical interaction between the two proteins is essential to mediate the functional regulation of CaV1.2 current by CaVa2d1, we investigated the molecular determinants responsible for the interaction between CaVa1C (CaV1.2) and CaVa2d1. Using homology modeling, electrophysiology and coimmunoprecipitation experiments we demonstrated that residues in the first extracellular loop in repeat I of CaV1.2 play a dominant role in the interaction and modulation by CaVa2d1. In particular, CaV1.2 Asp-181 anchors the physical interaction with CaVa2d1 while CaV1.2 Asp- 180 mediates the channel activation in a physiological range of membrane potential. In addition, we have explored the contribution of metal ion-dependant adhesion site (MIDAS) residues within the Won Willebrand Factor-A (VWA) domain of CaVa2d1 in mediating channel modulation. Our results show that mutating side chain at position Asp-259 and Ser- 261 eliminate channel modulation although these residues are not predicted to be within atomic distance of CaVa1. Hence, we propose that CaVa2d1 Asp-259 captures the Ca2+ ion which in turn folds the MIDAS motif within the VWA domain of CaVa2d1. The folding of the MIDAS around the Ca2+ locks CaVa2d1 Ser-261 and Ser-263 within atomic distance of CaVa1C Asp-181. This network of molecular interactions stabilizes the protein-protein interface demonstrating that high affinity binding of CaVa2d1 induce a local structural rearrangement that facilitate CaV1.2 channel opening and consequently increase Ca2+ influx through the pore. Al together, the result emerging from these studies provide novel mechanism insight regarding the function of the cardiac CaV1.2 channel.

Keyphrases: Canaux calciques, domaine Cache2, interface macromoléculaire, interaction protéine-protéine, co-immunoprécipitation, électrophysiologie, modélisation moléculaire par homologie, dynamique moléculaire, CaV1.2-CaVa2d1, Calcium channels, Cache2 domain structure, macromolecular interface, protein-protein interaction, co-immunoprecipitation, electrophysiology, 3D homology modelling, molecular dynamics simulations