Caractérisation structurale de la molécule HLA-DO

Les molécules classiques du CMH de classe II présentent des peptides antigéniques aux lymphocytes T CD4+.  Cette présentation est régulée par deux molécules non classiques : HLA-DM catalyse la relâche de CLIP et le chargement de peptides et HLA-DO module l’activité de DM.  Une expression insuffisante en cellules d’insectes empêche les expériences de cristallisation de DO, probablement en raison de sa conformation, rendant DO instable et inapte à sortir du réticulum endoplasmique (RE). DM corrige la conformation de DO et permet sa sortie du RE.  Aussi, par ses ponts disulfures uniques, DM adopte une conformation stable et peut sortir du RE sans lier d’autre molécule. Nous avons tenté de corriger la conformation de DO en introduisant des cystéines pour établir des ponts homologues à ceux de DM.  La conformation de DO ne fut pas corrigée.  Par ailleurs, nous avons augmenté l’expression de DO en introduisant une séquence partielle de Kozak.  Nous avons aussi étudié l’effet de DM sur l’expression de DO.  DM a favorisé l’expression de DO, probablement en diminuant sa dégradation.     Chaque chaîne du dimère DMαβ est impliquée dans l’oxydation de sa chaîne partenaire.  La conformation non-optimale de DO pourrait traduire une incapacité des chaînes α ou β à favoriser l’oxydation de sa partenaire; DM corrigerait ce problème.  Notre analyse d’immunobuvardage de type Western a toutefois démontré que DM ne modifie pas l’état d’oxydation de DOα et DOβ.   Finalement, nous avons étudié l’interaction DO-DM.  L’acide aminé DOαE41 est impliqué dans cette liaison.  Certains des acides aminés entre α80 et α84 pourraient être impliqués.  Nous avons muté des acides aminés de cette région de DOα.  Les résidus testés ne semblent pas impliqués dans la liaison DO-DM.    L’obtention de la structure tridimensionnelle de DO et la caractérisation de son état oxydatif et de sa liaison à DM permettront de mieux comprendre son rôle. Classical MHC class II molecules present antigenic peptides to CD4+ T cells.  This presentation is regulated by two non-classical molecules: HLA-DM catalyzes CLIP release and peptide loading and HLA-DO mediates the DM activity.  An insufficient expression in insect cells did not allow DO crystal production experiments, probably because of its conformation, rendering DO unstable and unable to leave the endoplasmic reticulum (ER).  DM corrects the conformation of DO and allows its egress from the ER. Also, because of its unique disulfide bonds, DM has a stable conformation and can egress from the ER without binding another molecule.  We tried to correct the conformation of DO by introducing cysteines to create disulfide bonds homologous to those of DM.  However, its conformation was not corrected.  Also, we increased DO expression by inserting a partial Kozak sequence.  We also studied the effect of DM on DO expression.  DM favoured DO expression, probably by reducing its degradation.  Each chain of the DMαβ dimer plays a role in the oxidation of its partner chain.  The non-optimal conformation of DO might result from an incapacity of its α and β chains to direct each other’s oxidation; DM would correct this problem.  Our Western blot analysis showed, however, that DM does not modify the oxidation state of DOα and DOβ.  Finally, we studied the DO-DM interaction.  The DOαE41 amino acid is involved in this interaction, as some of the α80 to α84 might be.  We mutated amino acids in this region of DO.  Tested amino acids did not seem involved in DO-DM binding.  The tridimensional structure of DO and the characterization of its oxidative state and its DM binding will allow a better understanding of its function.

Keyphrases: Conformation, HLA-DM, HLA-DO, Oxydation, Présentation antigénique, Structure, Conformation, CMH II, HLA-DM, HLA-DO, Structure, MHC II, Antigen presentation