Study of a novel evolutionarily conserved pattern of histone acetylation

Le génome eucaryote est empaqueté dans une structure hautement ordonnée appelée chromatine. Même si la structure de la chromatine est importante pour le maintien de l'intégrité génomique, elle constitue une barrière à de nombreux processus basés sur l'ADN tels que la réplication de l'ADN, la transcription et la réparation de l'ADN. Les histones contiennent une diversité déconcertante de modifications covalentes qui sont concentrées principalement, mais non exclusivement dans leurs queues amino-terminales. Les modifications des histones jouent un rôle central dans la régulation de la structure et de la fonction de la chromatine. Cependant, la détermination de la stoechiométrie des modifications à des sites spécifiques, l'identification des motifs de modifications et l'établissement de leurs rôles physiologiques restent des défis redoutables. Dans cette étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse pour déterminer la stoechiométrie de l'acétylation de résidus lysine spécifiques des histones. En général, les résidus lysine des histones dépourvus d'acétylation sont dérivatisés pour rendre les peptides résultants chimiquement équivalents à leurs homologues acétylés, mais pouvant être distingués par spectrométrie de masse. Cependant, cette méthode est insuffisante pour étudier les peptides contenant plus d'une lysine acétylable, tels que ceux dérivés de la queue N-terminale des histones H3 et H4. La digestion trypsique de tels peptides génère des «isomères de position», des isomères qui ont la même masse, mais qui portent des groupes acétyle à des positions différentes. La quantification précise de l'acétylation d'un site spécifique dans ces peptides est donc un défi analytique majeur. Dans le deuxième chapitre, nous décrivons une nouvelle méthode, pour quantifier l'acétylation à un site spécifique dans les peptides co-éluants isomériques et isobariques, qui combine des données LC-MS / MS à haute résolution avec un nouvel algorithme bioinformatique, Iso-PeptidAce. En utilisant des spectres de masse en tandem (MS/MS) de peptides synthétiques, les produits de fragmentation caractéristiques de chaque isomère de position ont été identifiés et utilisés pour déconvoluer des spectres provenant de mélanges d'isomères de position et quantifier l'abondance de chaque isomère. Nous avons ensuite testé l'applicabilité de l'Iso-PeptidAce pour quantifier les augmentations en fonction du temps de l'acétylation des histones des cellules d'érythroleucémie K562 traitées avec des inhibiteurs d’histone déacétylase (HDAC). En utilisant notre méthode, nous avons également trouvé que les histones H3 et H4 associées à CAF-1, un facteur d'assemblage de la chromatine, ont une stoechiométrie élevée d’acétylation sur plusieurs résidus de H3 et H4, par rapport aux histones totales. Dans le chapitre 3, nous avons appliqué Iso-PeptidAce pour déterminer la stoechiométrie de l'acétylation chez la levure de fission présentant un mutant d’histone désacétylase. Conformément aux études antérieures impliquant Clr3 et Sir2 dans la régulation de l’hétérochromatine, nous avons observé que les cellules dépourvues de ces HDAC présentaient une augmentation de l'acétylation H3-K14 uniquement sur les peptides coexistant avec H3-K9 di / tri méthylé, une marque caractéristique de l'hétérochromatine. Au chapitre 4, nous décrivons la découverte de très hauts niveaux d'acétylation sur deux résidus de lysine. Nous avons trouvé qu'une stoechiométrie élevée d’acétylation à H3-K14 et H3-K23 et une faible stoechiométrie d’acétylation à H3-K9 et H3-K18 est un profil global de H3 conservé sur le plan évolutif d’acétylation. En utilisant des souches de levures de fission (S. pombe) où la seule source de gènes d'histone porte des mutations H3-K14R et / ou H3-K23R qui empêchent l'acétylation, nous avons démontré que H3-K14 et H3-K23 ont des fonctions distinctes. De façon surprenante, nous avons trouvé que les phénotypes observés dans les cellules mutantes H3-K14R sont largement dus à la mutation du résidu lysine, plutôt qu'à la perte d'acétylation. En utilisant des souches de S. pombe dépourvues d'histone acétyltransférases (HAT), nous avons identifié les acétyltransférases qui contribuent à H3-K14ac et à H3-K23ac in vivo. Très peu d'études ont cherché à déterminer spécifiquement les stoechiométries d'acétylation des histones. Nos résultats suggèrent qu’en moyenne, sur l'ensemble du génome, chaque deuxième ou troisième nucléosome contient une molécule H3 avec une acétylation K14 et / ou K23. Cela nous amène à penser que l'acétylation de l'histone H3 à l'échelle du génome peut jouer un rôle important dans la fonction chromosomique. Il est impératif de comprendre la signification fonctionnelle de ce modèle d'acétylation étant donné que la thérapie épigénétique est activement étudiée comme stratégie pour traiter de nombreuses maladies. The eukaryotic genome is packaged into a highly ordered chromatin structure. Even though chromatin structure is important for maintaining genomic integrity, it is a barrier to numerous DNA-based processes such as DNA replication, transcription and DNA repair. Histones contain a bewildering diversity of covalent modifications that are mostly but not exclusively concentrated within their amino-terminal tails. Histone modifications play a central role in regulating chromatin structure and function. However, determining the stoichiometry of site-specific modifications, identifying patterns of modifications and establishing their physiological roles remain formidable challenges.    In this study, we exploited mass spectrometry to determine the stoichiometry of acetylation at specific histone lysine residues. In general, histone lysine residues lacking acetylation are derivatized to render the resulting peptides chemically equivalent but distinguishable by mass from their acetylated counterparts. However, this method is insufficient to study peptides that contain more than one acetylatable lysine, such as those derived from the N-terminal tail of histones H3 and H4. Tryptic digestion of such peptides generates ‘positional isomers’, isomers that have the same mass but bearing acetyl groups located at different positions. Accurate quantification of site-specific acetylation in those peptides is, therefore, a major analytical challenge.   In the second chapter, we describe a novel method for quantifying site-specific acetylation of co-eluting isomeric and isobaric peptides that combines high-resolution LC-MS/MS data with a novel bioinformatics algorithm, Iso-PeptidAce. Using tandem mass spectra (MS/MS) of synthetic peptides, fragmentation products diagnostic of each positional isomer were identified and were used to deconvolute spectra that arise from mixtures of positional isomers and quantify the abundance of each isomer. We then tested the applicability of Iso-PeptidAce to quantify time-dependent increases in histone acetylation of K562 erythroleukaemia cells treated with histone deacetylase (HDAC) inhibitors. Using our method, we also found that histones H3 and H4 associated with CAF-1, a chromatin assembly factor, have a high stoichiometry of acetylation on multiple residues of H3 and H4, compared with total histones.   In Chapter 3, we applied Iso-PeptidAce to determine the stoichiometry of acetylation in fission yeast histone deacetylase mutants. Consistent with previous reports implicating Clr3 and Sir2 in heterochromatin function, we observed that cells lacking these HDACs showed an increase in H3-K14 acetylation only on those peptides where it co-exists with di/trimethylated H3-K9, a mark of heterochromatin.   In chapter 4, we describe the discovery of very high levels of acetylation on two lysine residues. We found that a high stoichiometry of acetylation at H3-K14 and H3-K23, and low stoichiometry of acetylation at H3-K9 and H3-K18, is an evolutionarily conserved global pattern of H3 acetylation. Using fission yeast (S. pombe) strains harboring histone mutations H3-K14R and/or H3-K23R that prevent acetylation, we demonstrate that H3-K14 and H3-K23 have separable functions. Surprisingly, we found that the phenotypes observed in H3-K14R mutant cells are largely due to mutation of the lysine residue, rather than loss of acetylation. Using S. pombe strains that lack histone acetyltransferases (HATs) we identified the acetyltransferases that contribute to H3-K14ac and H3-K23ac in vivo.   Very few studies have aimed at specifically determining the acetylation stoichiometries of histones. Our results suggest that, on average, over the entire genome, every second or third nucleosome contains an H3 molecule with K14 and/or K23 acetylation. This leads us to surmise that genome-wide acetylation of histone H3 may have an important role in chromosome function. It is imperative to understand the functional significance of this acetylation pattern given that epigenetic therapy is actively pursued as a strategy to treat many diseases.

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