Le médicament épigénétique 5-Azacytidine stabilise l’ARN messager du récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) via une voie IRE1α/EGFR/ERK1/2- dépendante

Les maladies cardiovasculaires (MCV) occupent la première place en tant que cause majeure de mortalité et de morbidité au Canada et dans le monde. Plusieurs essais cliniques montrent que la réduction du cholestérol associé aux lipoprotéines de faible densité (LDL-c) est une stratégie efficace pour prévenir l’athérosclérose et les maladies coronariennes pour réduire le taux de mortalité. Le récepteur de lipoprotéines de faible densité (LDLR) est une glycoprotéine transmembranaire qui sert à la liaison et  l'endocytose des particules LDL. Chez l'homme, le récepteur LDL est fortement exprimé au niveau du foie, et est responsable de l'élimination de 70% à 80% du LDL-c à partir du plasma. Des mutations génétiques peuvent entraîner un LDLR dysfonctionnel et provoquer l’hypercholestérolémie familiale (FH), une maladie caractérisée par un niveau de LDL-c sanguin très élevé et la formation de plaques d’athérosclérose prématurées.   L'expression du LDLR est strictement contrôlée par les facteurs de transcription appelés protéines de liaison aux éléments régulateurs de stérol «Sterol Regulatory element-binding proteins» (SREBP) en réponse à l'accumulation excessive ou à l'épuisement du cholestérol intracellulaire. La régulation post-traductionnelle du récepteur LDL est médiée par sa dégradation intracellulaire via la proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) ou par l’ubiquitine ligase E3 «Inducible degrader of LDLR» (IDOL). En revanche, nos connaissances sur le mécanisme de la régulation posttranscriptionnelle de l'ARNm du récepteur LDL sont encore très peu avancées.  La régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm du récepteur LDL est mediée par sa région 3’ non traduite (3'UTR). L'ARNm du récepteur LDL humain contient une séquence 3'UTR de 2,5 kb de long dans laquelle 3 régions riches en éléments AU (AREs) ont été précédemment identifiées en tant que médiateurs de la dégradation rapide de l'ARNm dans les cellules hépatiques.  Dans cet ouvrage, nous avons recherché des réponses aux questions suivantes: (1)  À quel niveau la 5-Azacytidine (5-AzaC), un antimétabolite utilisé pour le traitement de la leucémie et le syndrome myélodysplasique, induit-t-elle la régulation du récepteur LDL ? (2) Quelles sont les voies de signalisations cellulaires impliquées dans la stabilisation du récepteur LDL par la 5-AzaC ? (3) Est-ce que la stabilisation du récepteur LDL par la 5-AzaC est dépendante ou indépendante au stress du réticulum endoplasmique (RE) ?  1) Nous avons d'abord démontré que la 5-AzaC induisait l'augmentation de l'expression du récepteur LDL dans les cellules hépathiques humaines (HepG2 et Huh7) par un nouveau mécanisme indépendant des facteurs de transcription SREBP. Afin d’élucider les effets de la 5-AzaC sur le métabolisme des lipoprotéines, nous avons étudié son effet sur l’expression de l’ARNm du récepteur LDL. Nous avons constaté une stabilisation significative de son ARNm ainsi que l’augmentation du niveau de la protéine membranaire. Nos résultats montrent également que la 5-AzaC induit la stabilisation de l'ARNm du récepteur LDL par un mécanisme post-transcriptionnel nécessitant la présence de la séquence 3'UTR. Les mutations systématiques des trois motifs AREs (ARE1-3) situés au niveau de la séquence 3’UTR de l’ARNm du récepteur  LDL et leur expression, couplés à la luciférase, dans les cellules Huh-7, ont montré que le motif ARE1 est à la fois le principal déterminant de la labilité de l’ARNm du récepteur LDL et le médiateur principal de sa stabilisation par la 5-AzaC.  2) Nous avons identifié une nouvelle voie de signalisation requise pour la régulation post-transcriptionnelle du récepteur LDL, impliquant l'enzyme nécessitant l'inositol 1α «Inositol-requiring enzyme 1α» (IRE1α), la kinase N-terminale c-Jun «c-Jun N-terminal kinase» (JNK), le récepteur des facteurs de croissance épidermique «Epidermal growth factor receptor» (EGFR) et la kinase1/2 régulée par la signalisation extracellulaire «Extracellular signal-regulated kinase1/2» (ERK1/2). Dans les hépatocytes, la 5-AzaC entrainait l'activation du récepteur EGFR après 6h de traitement. Cet effet pourrait être expliqué par l'augmentation des ligands spécifiques du récepteur tels que l’amphiréguline (AREG) (40 fois) et l’épiréguline (EREG) (60 fois). La phosphorylation de ERK1/2 a été augmentée 2 h après l'activation de la voie JNK par IRE1α.  3) Contrairement aux résultats obtenus avec la thapsigargine (Th), un inducteur  efficace du stress au RE, nos résultats ont montré que la 5-AzaC activait la voie IRE1α indépendamment du stress au niveau du RE. Le blocage du domaine IRE1α kinase avec l’inhibiteur spécifique (KIRA 6) a inhibé la stabilisation de l'ARNm et l’augmentation de l’expression du récepteur LDL dans les cellules traitées par la 5-AzaC. Au contraire, l'inhibition du domaine endonucléase de IRE1α, en utilisant l'inhibiteur spécifique STF 083010 ou via sa mutation n’ont pas affecté la régulation positive du LDLR ni l'activation de ERK1/2 par la 5-AzaC.  Dans l’ensemble, ce présent travail nous a permis d'identifier la 5-AzaC comme étant un stabilisateur important de  l'ARNm du récepteur LDL dans les hépatocytes via la cascade de signalisation IRE1α /JNK-EGFR-ERK1/2. Ce mécanisme se déclenche par l'activation spécifique du domaine IRE1α kinase de façon indépendante du stress au niveau du RE et s’achève par l'activation de la phosphorylation de ERK1/2 et les protéines de liaison de l’ARNm «RNA-binding proteins» (RBPs) induisant la stabilité de l’ARNm du récepteur LDL. Cette étude a révélé que la séquence 3'UTR est nécessaire pour la stabilisation du récepteur LDL et que le 1er motif ARE1 le plus proche du codon stop est le responsable principal de la stabilisation via la 5-AzaC.  L'identification de cette nouvelle voie de régulation permettra de révéler des cibles potentielles pour améliorer la clairance du LDL-c  au niveau du foie  ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de réduire le niveau de cholestérol. Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality and morbidity in Canada and around the world. Several clinical trials have shown that reducing lowdensity lipoprotein (LDL-c) cholesterol is an effective strategy for preventing atherosclerosis and coronary heart disease to reduce mortality. The low density lipoprotein receptor (LDLR) is a transmembrane glycoprotein that serves for the binding and endocytosis of LDL particles. In humans, the LDLR is strongly expressed in the liver, and is responsible for the elimination of 70% to 80% of LDL-c from plasma. Genetic mutations can lead to dysfunctional LDLR and cause familial hypercholesterolemia (FH), a disease characterized by a very high level of blood LDL-c and the formation of premature atherosclerotic plaques.  The expression of LDLR is strictly controlled by transcription factors called sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) in response to excessive accumulation or depletion of intracellular cholesterol. Post-translational regulation of LDLR is mediated by its intracellular degradation via the proprotein convertase subtilisin / kexin type 9 (PCSK9) or by the ubiquitin ligase E3, the inducible degrader of LDLR (IDOL). On the other hand, our knowledge about the post-transcriptional regulation of LDLR mRNA is still very little advanced.  The post-transcriptional regulation of LDLR mRNA stability has been shown to be mediated through the mRNA 3’ untranslated region (3’UTR). Human LDLR mRNA contains a 2.5-kb-long stretch of 3’UTR in which 3 AU-rich elements (AREs) were previously identified as a mediators of rapid turnover rate of LDLR mRNA in liver cells.   In this thesis, we sought answers to the following questions: (1) At which level does 5-Azacytidine (5-AzaC), an antimetabolite used for the treatment of leukemia and myelodysplastic syndrome, induce regulation of the LDLR? (2) Which cell signaling pathways are involved in 5-AzaC LDLR stabilization? (3) Is the 5-AzaC LDLR mRNAstabilization - ER stress- dependent?  1) We first demonstrated that 5-AzaC increased the expression of LDLR in human hepatic cells (HepG2 and Huh7) by a new mechanism independent of the transcription factors SREBP. In order to elucidate the effects of 5-AzaC on lipoprotein metabolism, we investigated its effect on LDLR mRNA expression. We observed a significant stabilization of its mRNA as well as an increase in the level of the membrane protein. Our results also show that 5-AzaC induces the stabilization of the LDLR mRNA by a post-transcriptional mechanism requiring the presence of its 3'UTR sequence. Systematic mutations of the three AREs (ARE1-3) motifs located at the 3'UTR sequence of the LDLR mRNA and their luciferase-like expression in Huh-7 cells showed that the ARE1 motif is both the primary determinant of LDLR mRNA lability and the target of 5-AzaCinduced mRNA stabilization.  2) We pinpointed a new signaling pathway required in LDLR post-transcriptional regulation involving the inositol-requiring enzyme 1α (IRE1α), the c-Jun N-terminal kinase (JNK), the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the extracellular signaling-regulated kinase1/2 (ERK1/2). In hepatocytes, 5-AzaC induced the activation of the EGFR receptor after 6 h of treatment. This effect could be explained by the increase in receptor-specific ligands such as amphiregulin (AREG) (40-fold) and epiregulin (EREG) (60-fold). The phosphorylation of ERK1/2 was increased 2 h after the JNK pathway activation by IRE1α.  3) As opposed to the results obtained with thapsigargin (Th), a potent ER stress inducer, our results showed that 5-AzaC activates the IRE1α pathway independently of the ER stress. Blocking of the IRE1α kinase domain with the specific inhibitor (KIRA 6) blunted the increase of LDLR mRNA and protein levels in 5-AzaC-treated cells. Contrarily, the inhibition of the endonuclease domain of IRE1α, using the specific inhibitor STF 083010 or by its mutation, did not affect the 5-AzaC LDLR up-regulation neither IRE1α and p-ERK1/2 activation.  In summary, this work allowed us to identify 5-AzaC as an important stabilizer of the LDLR mRNA in hepatocytes via the IRE1α/JNK-EGFR-ERK1/2 signaling cascade. This mechanism started by the specific activation of the IRE1α kinase domain independently to the ER stress and finished by the phosphorylation of ERK1/2 and the binding of the RNA-binding proteins (RBPs) ensuring LDLR mRNA stability. This study revealed that the 3'UTR sequence is necessary for the stabilization of the LDLR mRNA  and that the first ARE1 motif closest to the stop codon is the main cause of stabilization via 5-AzaC.  The identification of this new regulatory pathway will reveal potential targets to enhance plasma LDL-c clearance in the liver as well as new therapeutic strategies to reduce cholesterol levels.

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