Caractérisation du domaine C-terminal de l'ARN polymérase II et de la phosphatase Glc7 dans la terminaison transcriptionnelle chez Saccharomyces cerevisiae

La terminaison transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (ARNPII) est l’étape de la transcription la moins bien comprise. Deux modèles ont toutefois été proposés pour la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour les gènes codants, il est suggéré que la phosphorylation de la Ser2 du domaine C-terminal (CTD) de l’ARNPII, en concomitance avec la déphosphorylation de la Tyr1, permet le recrutement des facteurs de terminaison Rtt103 et Pcf11 (complexe CPF-CF). Pour les ARN non-codants, la terminaison nécessiterait la phosphorylation de la Ser5 du CTD pour le recrutement du facteur de terminaison Nrd1 (complexe Nrd1-Nab3-Sen1 (NNS)). Même si le rôle du complexe CPF-CF est souvent présenté comme étant exclusif aux gènes codants, il a aussi été démontré que certains de ses constituants sont impliqués dans la terminaison des ARN non-codants. Il a notamment été proposé qu’une des phosphatases du CPF-CF, Glc7, soit impliquée dans l’activation de l’hélicase Sen1. Ces différents modèles de la terminaison transcriptionnelle comportent, cependant, des limitations. En effet, les mécanismes impliquant le CTD sont basés principalement sur l’utilisation de mutants des kinases et des phosphatases du CTD, car les mutants du domaine sont pour la plupart létaux. Puis, pour ce qui est du rôle de Glc7 dans l’activation de Sen1, aucune évidence in vivo ne le démontre.   Le projet principal de mon doctorat consistait donc à réévaluer, par des approches génomiques, l’implication du CTD de l’ARNPII dans la terminaison à l’aide de différents systèmes d’expression ectopique rendant possible l’utilisation de mutants du CTD. Comme attendu, les résultats obtenus démontrent des défauts globaux de terminaison aux gènes codants avec les mutants de la Ser2 et de la Thr4. Étonnamment, aucun défaut de terminaison n’est observé aux ARN non-codants avec le mutant de la Ser5. Les défauts de terminaison à ces ARN sont plutôt observés avec le mutant de la Tyr1, tandis que seulement un nombre limité de gènes codants est affecté par ce mutant. De plus, nous avons découvert que la Tyr1 est essentielle pour l’établissement de pauses de l’ARNPII dans la région 5’ des gènes et que ces évènements sont essentiels à une terminaison efficace aux ARN non-codants à l’aide du NNS.   Le deuxième projet consistait, quant à lui, à déterminer le rôle de la déphosphorylation de Sen1 par la phosphatase Glc7. Les résultats obtenus démontrent que Sen1 est une enzyme stable, mais que cette stabilité dépend de Glc7. De plus, l’effet de Glc7 sur Sen1 est dépendant de l’activité catalytique de Glc7 et du protéasome. Enfin, ce rôle de Glc7 est indépendant de son interaction avec les complexes CPF-CF ou APT.   En somme, les résultats obtenus durant mes études permettent d’effectuer une mise à jour importante quant au rôle que joue le CTD dans la terminaison transcriptionnelle et celui que joue Glc7 dans la terminaison des ARN non-codants. Transcriptional termination of RNA polymerase II (RNAPII) is the least understood step of transcription. Two models have been proposed in Saccharomyces cerevisiae. At protein-coding genes, it is proposed that the phosphorylation of Ser2 of the RNAPII C-terminal domain (CTD), in concomitance with the dephosphorylation of Tyr1, triggers the recruitment of termination factors Rtt103 and Pcf11 (CPF-CF complex). At non-coding RNAs, it is proposed that Ser5 phosphorylation is required for Nrd1 recruitment (Nrd1-Nab3-Sen1 complex (NNS)). Although the CPF-CF complex is often presented as exclusive to protein-coding genes, some of its components have also been shown to be involved in the termination of non-coding RNAs. Notably, it has been proposed that one of the two phosphatases present in CPF-CF, Glc7, is involved in the activation of the helicase Sen1. These different models of termination have, however, limitations. Indeed, the mechanisms involving the CTD are mainly based on the use of mutants of CTD kinases and phosphatases since most CTD mutants are sick or lethal. In addition, the role of Glc7 in the activation of Sen1 has not been demonstrated in vivo.   The main project of my Ph.D. was therefore to reinvestigate, using genomic approaches, the role of the RNAPII CTD in termination using different ectopic expression systems making possible the use of CTD mutants. As expected, the results obtained demonstrate a global termination defect at protein-coding genes with the Ser2 and Thr4 mutants. Surprisingly, however, no termination defect was observed at non-coding RNAs with the Ser5 mutant. Defects in non-coding RNA terminations were rather observed with the Tyr1 mutant, whereas only a limited number of protein-coding genes was affected in this mutant. In addition, we found that Tyr1 is essential for RNAPII pausing in the 5' region of genes and that these events are essential to allow efficient NNS-dependent termination.  The second project consisted in determining the role of Sen1 dephosphorylation by the phosphatase Glc7. The results obtained demonstrate that Sen1 is a stable enzyme, but also that its stability requires Glc7. In addition, the effect of Glc7 on Sen1 is dependent on the catalytic activity of Glc7 and is proteasome-dependent. Finally, this role of Glc7 is independent of its interaction with CPF-CF or APT.  In conclusion, the results obtained during my PhD allowed for an important update of the role of the CTD in the transcriptional termination and the mechanism through which Glc7 regulates the termination of non-coding RNAs.

Keyphrases: Terminaison transcriptionnelle, ARN polymérase II, CTD, pause, Nrd1, Sen1, Glc7, Pcf11, Rtt103, CTD, Tyrosine 1, Nrd1, Sen1, Glc7, Pcf11, Rtt103, Transcription termination, RNA polymerase II, pausing