Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique.   Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un  seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles. Cyanobacteria have a very important place in aquatic ecosystems and a significant number of species are considered harmful given their production of toxic metabolites. These cyanotoxins have various chemical proprieties and have often been associated with poisoning episodes. The frequency of cyanobacterial blooms is increasing and the study of cyanobacteria and their toxins is of increasing interest, especially considering the potential increase associated with climate changes. Given the chemical complexity of the cyanotoxins, the development of simple, sensitive and fast detection methods is an analytical challenge. Considering these issues, the development of new analytical approaches for the detection of cyanotoxins in water and fish samples contaminated with harmful cyanobacterial blooms have been proposed. A first approach consists of the use of an on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography and tandem mass spectrometry (SPE-LC-MS/MS) for the analysis of six microcystins (MCs), anatoxin-a (ANA-a) and cylindrospermopsin (CYN). This method allows a simple and rapid analysis and enables the chromatographic separation of ANA-a and its isobaric interference, phenylalanine. The detection limits ranged from 0.01 to 0.02 µg L-1 and concentrations in lake waters were found between 0.024 and 36 µg L-1. A second method consists of using manual solid phase extraction (SPE) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) for the determination of b-N-methylamino-L-alanine (BMAA), ANA-a, CYN and saxitoxin (STX) in contaminated lake water. The analysis of two conformational isomers of BMAA was done to improve the selectivity. Dansyl chloride-based derivatization allows simplified chromatography. The detection limits were obtained between 0.007 and 0.01 µg L-1. The analysis of bloom water samples detected concentrations of cyanotoxins between 0.01 and 0.3 µg L-1 allowing the confirmation of the presence of BMAA in algal blooms in Québec. A second part of the project consists in the use of an alternative sample introduction technology for MS analysis. It enables ultra-fast analysis (< 15 seconds/sample) without the use of a chromatographic step, and is called laser diode thermal desorption (LDTD) coupled with atmospheric pressure chemical ionization (APCI). The first LDTD project consists of the analysis of total MCs via Lemieux oxidation in order to obtain a common moiety of all MCs existing congeners. This fraction, the MMPB, is analyzed after a liquid-liquid extraction step, with the LDTD-APCI-MS/MS. A value of 0.2 µg L-1 was obtained for detection limit and concentrations between 1 and 425 µg L-1 have been found in contaminated water samples. In addition, a comparison with a parallel analysis using MCs congeners’ standards suggested the possible presence of undetected MCs or isomers. A second project involves the direct analysis of ANA-a using LDTD-APCI-HRMS in order to solve the isobaric interference, phenylalanine, which is possible due to the high resolution detection. The LDTD offers no chromatographic separation and by using HRMS, we can distinguish ANA-a signals from those of phenylalanine. A value of 0.2 µg L-1 was obtained as detection limit and the method has been applied on water bloom samples with a positive concentration of 0.21 µg L-1. Finally, using the LDTD-APCI-HRMS combination, analysis of total MCs has been adapted to fish tissues to determine the unbound and bound MCs and compare the results with standard analysis. The use of digestion with sodium hydroxide prior to Lemieux oxidation followed by SPE purification yielded a detection limit of 2.7 µg kg-1. Total MCs concentrations were found between 2.9 and 13.2 µg kg-1 in real field-collected contaminated fish samples and comparison was made with standard analysis which yield a single positive sample with a concentration of 2 µg kg-1. This indicates the possible presence of undetected MCs using conventional analytical methods.

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