La formation de biofilm des Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines : caractérisation et rôle du régulon Pho

Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont des bactéries pathogènes d'origine alimentaire responsables de diarrhées, de colites hémorragiques et du syndrome hémolytique et urémique, pouvant entraîner la mort. Une des priorités de l’industrie agro-alimentaire est d’éviter la présence des STEC dans l’environnement et dans les chaînes de production. Dans ce secteur, les bactéries sous forme de biofilm représentent un réel problème car en plus de contaminer les installations des chaînes de production, elles sont plus résistantes aux protocoles de nettoyage et de désinfection. Il est donc nécessaire de mieux caractériser les biofilms formés par les STEC et d’identifier les facteurs qui contribuent à leur développement.  Les objectifs de la première partie de cette thèse étaient de caractériser le potentiel de formation de biofilms de différents sérotypes STEC. Pour cela nous avons montré que la capacité de formation de biofilms des STEC est très variable. Nous avons identifié que les protéines jouent un rôle important dans l'intégrité des biofilms des STEC. De plus, les isolats du séropathotype A (O157:H7 et O157:NM), avaient un meilleur potentiel de formation de biofilm que les isolats du séropathotype B et C. Nous avons aussi montré que le traitement des biofilms STEC avec des désinfectants réduisait la viabilité mais n'éliminait pas complètement la matrice de biofilm. Nos données indiquent que la formation de biofilms dans l’environnement pourrait contribuer à la persistance des STEC et plus précisément des souches du séropathotype A dans l’environnement.  Dans une deuxième partie nous avons étudier comment la carence en phosphate (Pi) affectait la formation de biofilm de la souche O157:H7 EDL933. Les souches E. coli O157:H7 peuvent survivre pendant de longues périodes de temps dans un environnement pauvre en nutriments. Les biofilms pourraient contribuer à surmonter les stress rencontrés dans l’environnement. Lorsqu’E. coli est cultivée en conditions pauvres en Pi, le régulon Pho est induit par PhoB. Le système de transport spécifique au Pi (Pst) est le transporteur de haute affinité du Pi. Dans le mutant Δpst, PhoB est activée de manière constitutive. Nous avons montré que l'activation de PhoB conduisait à l'augmentation de la formation de biofilm chez la souche O157:H7 EDL933. En réponse à la carence en Pi, l'activation de PhoB stimulait directement l'expression des gènes waaH et ycgVEDL933, codant respectivement pour une glycosyltransférase et pour un autotransporteur, tous deux impliqués dans l'augmentation du biofilm. Nous avons également identifié que, dans le mutant Δpst, les lipopolysaccharides (LPS) étaient modifiés et que cela pourrait influencer la composition du biofilm.  Pris ensemble, nos résultats montrent que la formation de biofilms contribue à la persistance des STEC dans l'environnement et que les isolats de séropathotype A ont démontré une capacité accrue à former des biofilms. En réponse au stress environnemental tel que la carence en Pi, les STEC adaptent leur mode de vie et passent d'un état libre à un état sessile. Les connaissances acquises au cours de cette thèse pourrait permettrent l’exploration de deux nouvelles applications pour lutter contre la formation de biofilms des STEC, incluant l’utilisation de protéase pour dégrader le biofilm et l’utilisation de surface recouverte d’ions phosphate pour prévenir la formation de biofilm. Shiga-toxin producing Escherichia coli (STEC) are food-borne pathogens that cause diarrhea, hemorrhagic colitis, and hemolytic-uremic syndrome, which may result in death. A major priority for the food industry is to avoid the presence of STEC in the environment and the food production chain. In the latter sector, biofilm formed by bacteria represents a real problem because in addition to contaminating the facilities, they are more resistant to traditional cleaning and disinfection protocols. Therefore, it is necessary to better characterize the biofilms formed by STEC and to identify the factors that contribute to their development. The objective of the first part of this thesis was to evaluate the biofilm formation of human STEC isolates representing the most pathogenic seropathotypes, to characterize the matrix composition of the strongest STEC biofilms and to evaluate their tolerance to sanitizers. The results showed that biofilm formation by STEC strains was highly variable. We also identified that proteins were important for the biofilm integrity. Moreover, seropathotype A isolates (O157:H7 and O157:NM), which are associated to the highest relative incidence of human infection, had a greater ability to form biofilms than seropathotype B and C isolates. Treatment with sanitizers reduced the viability of STEC but did not completely remove the biofilm matrix. Overall, our data indicate that biofilm formation in the environment could contribute to the persistence of STEC and specifically seropathotype A isolates in the environment. In the second part of this thesis, we studied how the stress of phosphate (Pi) depletion affected the biofilm formation of O157:H7 EDL933. E. coli O157:H7 can survive for prolonged periods under nutrient-deprived environmental conditions. Biofilms are thought to participate in this environmental lifestyle. When O157:H7 strain EDL933 was grown under Pi starvation conditions, its Pho regulon was induced by the regulator PhoB. The Pi-specific transport (Pst) system is the high-affinity Pi transporter. In its isogenic Δpst mutant, PhoB was constitutively activated. We identified that PhoB activation lead to the increase of O157:H7 biofilm formation. We have shown that when it was activated, the regulator PhoB was directly controlling the expression of two genes, waaH and ycgVEDL933, encoding respectively a glycosyltransferase and an autotransporter. These two genes were both shown to be involved in the biofilm increase in response to Pi-starvation. We also identified that in the Δpst mutant, lipopolysaccharides (LPS) vi were modified and that this could influence the biofilm composition. Taken together our results show that biofilm formation contributes to the persistence of STEC in the environment and that seropathotype A isolates have an increased ability to form biofilm. In response to environmental stress such as Pi deficiency, STEC adapt and transit from a free state to a sessile state. The acquired knowledge during this thesis could allow the exploration of two new applications to fight against the biofilm formation of STEC, including the use of protease to degrade the biofilm and the use of surface covered with phosphate ions to prevent biofilm formation.

Keyphrases: Biofilm, STEC, Phosphate, LPS, Régulon Pho, Biofilm, STEC, Phosphate, LPS, Pho regulon