La formation de synapses par les neurones périphériques sur des surfaces synthétiques

Rationale: Les électrodes implantables pour la création d’une interface neurotechnologique avec le système nerveux périphérique représentent une solution prometteuse pour pallier aux limitations causées par des blessures ou maladies nerveuses. Leur viabilité à long terme pourrait être améliorée en enrobant l’électrode d’une substance synthétique tolérable par l’hôte. La synaptogenèse sur des matériaux artificiels serait un marqueur indirect de la biocompatibilité, démontrant la reconnaissance de la substance comme étant une cible post-synaptique viable. Notre objectif est de démontrer la propriété synaptogénique de la poly-D-lysine (PDL) et d’un polyglycérol hyperbranché expérimental (dendrimère, DND) dans le système nerveux périphérique humain in vitro et murin in vivo. Ultimement, nous visons la création d’un enrobage facilitant la synaptogenèse sur un objet synthétique qui sera inséré dans un nerf périphérique dans le but d’augmenter la longévité de l’implant.   Méthodes: In vitro, des neurones moteurs dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines ont été cultivés avec des microsphères (non-enrobé, enrobé de poly-D-lysine ou de dendrimère) pour 1, 3, 5, 7 ou 9 jours. In vivo, le nerf sciatique du rat a été écrasé avant l’injection de microsphères proximalement, distalement et au site de la blessure qui y demeureront pour 2, 7 ou 14 jours. Les cellules et les nerfs ont été traités à l’immunochimie pour les marqueurs présynaptiques synaptophysine et vesicular acetylcholine transporter (VAchT). Les images acquises à la microscopie confocale ont été analysées pour l’intensité de la fluorescence autour des microsphères sur le logiciel Fiji. Une imagerie en temps réel in vitro avec du FM-143 a été réalisée pour vérifier la présence d’exocytose près des sites de contact des microsphères.  Résultats: In vitro, les résultats démontrent significativement plus de fluorescence pour la synaptophysine (p<0.0001) et le VAchT (p<0.0001 pour 1, 3, 5, 9 jours ; p<0.001 pour 7 jours)  dans les deux conditions expérimentales par rapport au contrôle pour les cinq durées. Les résultats préliminaires de l’imagerie en temps réel démontre une exocytose des vésicules marquées au FM-143 plus importante chez les microsphères enrobées de DND que celles de PDL (p=0.006) à 3 jours d’incubation. In vivo à 14 jours, la présence de la synaptophysine est significativement supérieure autour des microsphères de PDL au site d’écrasement et en distal en comparaison avec celle des microsphères non-enrobées. Celle du VAchT est également significativement supérieure au contrôle à 14 jours au site d’écrasement. Les autres conditions expérimentales étudiées demeurent sans différence significative entre les microsphères enrobées et leur contrôle.  Conclusions: Notre étude démontre pour la première fois que la poly-D-lysine et le dendrimère sont des matériaux synaptogéniques pour les neurones moteurs humains in vitro. In vivo, nos résultats suggèrent que la PDL est synapotogénique pour les neurones périphériques murins. Ces résultats seraient intéressants dans le cadre de l’utilisation future de ces substances pour améliorer la longévité d’électrodes implantables pour diverses applications cliniques en neurosciences, tels que pour la stimulation ou l’enregistrement des nerfs dans diverses pathologies chroniques. Background: Implantable intraneural electrodes as a neurotechnological interface with the peripheral nervous system are a promising solution to overcome the limitations caused by injury or disease. Their long-term viability could be enhanced by coating electrodes with synthetic substances which are well tolerated by the host. Synaptogenesis onto artificial material can be seen as an indirect marker of biocompatibility as it demonstrates the recognition of the said substance as a viable post-synaptic target. Our objective is to demonstrate the synaptogenic properties of poly-D-lysine (PDL) and an experimental hyperbranched polyglycerol (dendrimer, DND) with human peripheral neurons in vitro and rat neurons in vivo. Ultimately, we aim to develop coatings that promote synaptogenesis onto a synthetic object embedded in a peripheral nerve with the objective of increasing its longevity.   Methods: Uncoated (control) and coated (poly-D-lysine or dendrimer) microspheres were used. In vitro, motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) were grown with microspheres for 1, 3, 5, 7 or 9 days. In vivo, a nerve crush injury was introduced to adult rat sciatic nerve to induce a regenerative state before injecting microspheres proximally, distally and at the crush site, which were left for 2, 7 and 14 days. Cells and nerves were immunostained for synaptophysin and VAchT (presynaptic markers). All experiments were visualized using confocal microscopy and images were analyzed for staining intensity surrounding the microspheres using Fiji. Live cell imaging of human motor neurons with FM-143 was performed to verify the presence of exocytosis at contact sites with the microspheres.  Results: In vitro, our results show significantly more staining for synaptophysin (p<0.0001) and VAchT (p<0.0001) in both experimental conditions when compared to the control for all five time points. Preliminary results of live cell imaging show a significantly more important exocytosis of FM-143 labelled vesicles in DND-coated microspheres than PDL-coated ones (p=0.006) at 3 days of incubation. In vivo, the presence of synaptophysin is significantly more important at 14 days surrounding PDL-coated microspheres at the crush site and distal to it when compared with controls. VAchT staining is also significantly superior at 14 days at the crush site. Other time points and locations tested do not show significant difference when comparing coated microspheres with respect to its control.  Conclusions: Our study shows for the first time that poly-D-lysine and dendrimer are synaptogenic substances for human motor neurons in vitro and rat peripheral neurons in vivo. These results support the future use of these substances in improving the longevity of implantable electrodes for various clinical uses in neurosciences, such as for nerve stimulation or recording in chronic pathologies.

Keyphrases: microsphère, poly-D-lysine, synaptophysine, VAchT, cellules souches pluripotentes, neurones moteurs, nerf sciatique, système nerveux périphérique, synaptophysin, synaptogenèse, poly-D-lysine, polyglycérol hyperbranché, VAchT, synaptogenesis, microsphere, hyperbranched polyglycerol, synaptophysin, iPSC, motor neurons, sciatic nerve, peripheral nervous system