Découverte et optimisation d’inhibiteurs pour des enzymes DfrBs impliquées dans la résistance 
bactérienne

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique utilisé en clinique ainsi que de façon préventive dans l’élevage de bétail et l’aquaculture, causant une pression sélective auprès des bactéries. La cible de cet antibiotique est l’enzyme dihydrofolate réductase (Dfr) bactérienne chromosomique qui est essentielle dans la voie de biosynthèse du folate et donc, à la prolifération cellulaire. Plusieurs types de résistances au TMP furent répertoriés, dont le transfert d’un plasmide de résistance entre bactéries pathogènes. En fait, dans le milieu hospitalier, ce plasmide est le plus dangereux, puisque ce milieu est propice à une plus forte sélection provoquant la prolifération des bactéries résistantes au TMP.  Des bactéries pathogènes résistantes au TMP possédant les gènes de Dfr de type B (dfrB) ont été identifiées dans l’aquaculture des poissons, l’élevage de bétail ainsi que dans les eaux usées. Les gènes des dfrBs sont normalement répertoriés indirectement par l’identification des éléments des intégrons. Ceci fait en sorte que la prévalence des gènes des dfrBs est sous-estimée. Il est impératif de déterminer la prévalence de ces gènes. Nous avons démontré le potentiel d’accomplir ceci par une recherche directe de ces gènes dans des échantillons cliniques Nord-Américains de Escherichia coli (E. coli) résistants au TMP.  À ce jour, aucun antibiotique n’est répertorié pour vaincre la résistance causée par les DfrBs. En fait, peu de travaux sont effectués sur cette famille émergente. Nous savons que les DfrBs ne possèdent aucune similarité de séquence ni de structure avec les Dfr chromosomiques procaryotes et eucaryotes. Il est d’une grande importance de développer des inhibiteurs sélectifs envers ces enzymes pouvant potentiellement servir d’antibiotiques. Éventuellement, une bithérapie avec le TMP et ce nouvel antibiotique augmentera l’efficacité antibactérienne du TMP. Pour y arriver, nous avons déployé plusieurs moyens dont la continuité de la conception d’inhibiteurs basée sur les fragments (FBLD) qui fût rapportée précédemment, la conception d’inhibiteurs visant deux cibles thérapeutiques basée sur la structure des substrats ainsi que le criblage à haut débit d’une librairie d’extraits d’invertébrés marins. Puisque la DfrB1 est la plus étudiée de la famille des DfrBs, nous l’utilisons comme modèle pour ces approches dans la découverte et l’optimisation des inhibiteurs. Lors de l’optimisation des inhibiteurs issus du FBLD, nous avons obtenu des indices provenant du mode de liaison de ces inhibiteurs à la cible enzymatique et de la caractérisation biophysique de cette liaison afin de diriger les efforts de synthèse de ceux-ci. Ainsi, les connaissances des domaines de l’enzymologie et de la pharmacologie nous permettent de comprendre le mode de liaison de ces inhibiteurs. Les DfrBs possèdent une similitude de séquence protéique de 77% - 100%. À notre connaissance, aucune caractérisation cinétique des autres membres des DfrBs n’a été effectuée. En fait, pour la plupart des membres, aucune confirmation n’a été obtenue concernant la corrélation de la résistance au TMP. Nous confirmons leur activité dihydrofolate réductase ainsi que leur faible sensibilité au TMP. Avec ces résultats encourageants, nous proposons un mode d’inhibition similaire entre elles. Ainsi, les inhibiteurs de la DfrB1 testés démontrent aussi une inhibition pour les DfrBs et ce, avec la même amplitude. Nos avancées indiquent qu’il serait possible de détenir une tête de série inhibant tous les membres de cette famille. Trimethoprim (TMP) is a widely used antibiotic, both clinically as well as preventively in livestock farming and aquaculture. This broad usage causes selective pressure on bacteria. The target of this antibiotic is the chromosomal bacterial dihydrofolate reductase enzyme (Dfr), which is essential in the folate biosynthesis pathway and, therefore, in cell proliferation. Several types of resistance to TMP have been identified, including the transfer of an antibiotic-resistant plasmid between pathogenic bacteria. In clinical environments, this plasmid is of great concern, since this environment is conducive to a greater selective pressure causing the proliferation of TMP-resistant bacteria. TMP-resistant pathogenic bacteria with the plasmids carrying Dfr type B genes (dfrB) have been identified in aquaculture, livestock and wastewater. The dfrBs genes are normally tracked indirectly by the identification of integron elements underestimating the prevalence of dfrBs genes. Because it is imperative to determine the prevalence of these genes, we have demonstrated the possibility to determine their prevalence by the direct search of these genes in a North American library of TMP-resistant clinical samples. To date, no antibiotics are known to overcome the resistance caused by DfrBs. In fact, there is limited data on this emerging family. We know that DfrBs are evolutionarily and structurally unrelated to prokaryotic and eukaryotic chromosomal Dfrs. It is of great importance to develop selective inhibitors for these enzymes that could subsequently serve as potential novel antibiotics. Eventually, dual therapy with TMP and this new antibiotic could increase the antibacterial effectiveness of TMP. In order to develop such molecules, we have deployed several approaches including a follow-up of previously reported fragment-based lead design (FBLD), the design of substrate analogs as inhibitors targeting two therapeutic enzymes, as well as high-throughput screening of a library of marine invertebrate extracts. Since DfrB1 is the best studied among the DfrB family, it was used as a model for these approaches. In the optimization of inhibitors from FBLD, we studied the inhibitor’s mode of binding to direct synthetic efforts for the next generation of potential inhibitors. Thus, knowledge in the fields of enzymology and pharmacology enhances our understanding of the mode of binding of these inhibitors. Members of the DfrB family share 77% to 100% protein sequence similarity. To our knowledge, no kinetic studies of DfrB members other than DfrB1 have been performed. For most members, the correlation of TMP resistance and their source have not been confirmed. We confirm their dihydrofolate reductase activity as well as their resistance to TMP. With these encouraging results, we propose a similar mode of inhibition for all DfrBs. We demonstrate that inhibitors of DfrB1 also inhibit other DfrBs. Our advances indicate that it would be possible to have a lead compound that inhibits all members of this family.

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