Knockout mouse model generated by CRISPR technology to study the function of BSP proteins on male fertility in vivo

L'infertilité est un problème mondial qui touche 15% des couples, les facteurs masculins et féminins contribuant de façon égale aux cas d'infertilité. La cause de l'infertilité masculine est inconnue dans la moitié des cas. Une série d'événements cellulaires coordonnés est responsable de l'interaction spermatozoïde-ovocyte et de la fécondation réussie. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes impliqués dans la production des spermatozoïdes est essentielle pour faciliter le diagnostic et le traitement de l'infertilité masculine, ainsi que la régulation de la fertilité. Au cours des trois dernières décennies, le laboratoire du Dr P. Manjunath a mené des recherches approfondies sur une famille particulière de protéines exprimées spécifiquement dans l'appareil reproducteur masculin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP). Cette famille de protéines a d’abord été identifiée dans le plasma séminal bovin, et par la suite, des protéines BSP ont été identifiées chez d’autres espèces de mammifères telles que l’étalon, le verrat, le bélier et la chèvre. Selon les espèces, ces petites protéines ubiquitaires sont exprimées par les vésicules séminales et/ou l'épididyme. Des travaux systématiques effectués par le groupe de Manjunath ont démontré que ces protéines se lient aux phospholipides portant un groupement choline sur le feuillet externe de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et/ou pendant le passage à travers l'épididyme, et favorisent la capacitation des spermatozoïdes. En 2007, les gènes BSP-homologues ont été identifiés dans l’épididyme humain (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). D'autres études ont montré que l'interaction des protéines BSP avec la membrane des spermatozoïdes entraîne une altération des lipides (phospholipides et cholestérol) et facilite la maturation des spermatozoïdes épididymaires. D’autres recherches sur les protéines BSP ont suggéré que ces protéines pourraient jouer un rôle important dans la fertilité masculine. Cependant, le rôle exact des protéines BSP dans la fertilité est resté largement inconnu. Dans le cadre de la présente étude, j'ai créé le premier modèle de souris BSP knockout simple et double pour déterminer si l'absence de protéines BSP pouvait affecter la fertilité masculine. Pour cibler et générer des modèles de souris knockout simple et double Bsph1 et Bsph2, l'approche de courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées (CRISPR/Cas9) fut utilisée. De plus, les techniques RT-PCR, Digital Droplet-PCR (dd-PCR) et chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont permis d'examiner l'expression des gènes Bsp au niveau de l'ARNm et des protéines afin de confirmer l'élimination des protéines BSP chez les souris knockout. Les lignées de souris BSP knockout ont été utilisées pour évaluer les paramètres de fertilité des spermatozoïdes. Aucune anomalie évidente n'a été observée dans la capacité de fertilisation ni dans le nombre de souriceaux engendrés par les mâles knockout par rapport au type sauvage. Le décompte du nombre de spermatozoïdes et l'analyse de leur motilité n'ont révélé aucune différence significative entre les souris BSP knockout et les souris contrôle. Il est intéressant de noter que des différences significatives en termes de poids corporel des souriceaux ont été observées dans le double knockout par rapport au type sauvage. Sur la base de ces résultats, nous concluons que les protéines BSP, individuellement ou ensemble, ne sont pas essentielles aux fonctions spermatiques et pour la fécondation chez la souris, et que l’absence de ces protéines n’affecte pas la fertilité masculine. D'autres études pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués et les voies possibles par lesquelles les protéines BSP pourraient être impliquées dans la régulation du poids des souriceaux. Infertility is a worldwide problem that affects 15% of couples, with male and female factors contributing equally to cases of infertility. The cause of male infertility in half of the cases is unknown. A series of coordinated cellular events are responsible for sperm-egg interaction and successful fertilization. Therefore, elucidating the mechanisms involved in sperm production and maturation is critical to facilitate the diagnosis and treatment of male infertility, as well as the regulation of fertility. Over the last three decades, the laboratory of Dr. P. Manjunath has been extensively investigating a particular family of proteins that is expressed specifically in the male reproductive tract, called the Binder of SPerm (BSP) proteins. This protein family was first identified in bovine seminal plasma and subsequently, BSP proteins were identified in other mammalian species such as stallion, boar, ram and goat. Depending on the species, these small ubiquitous proteins are expressed by the seminal vesicles and/or epididymis. Systematic work done by Manjunath’s group has demonstrated that these proteins bind to choline phospholipids on the outer leaflet of the sperm membrane upon ejaculation and/or during passage through the epididymis and promote sperm capacitation. In 2007, BSP-homologous genes were identified in human (BSPH1) and mouse (Bsph1 and Bsph2) epididymis. Further studies indicated that the interaction of BSP proteins with the sperm membrane results in lipid (phospholipid and cholesterol) alterations and facilitates epididymal sperm maturation. Additional research on BSP proteins suggested that these proteins may play an important role in male fertility. However, the exact role of BSP proteins in fertility has remained largely unknown. In the current study, I generated the first single and double BSP knockout mouse model to investigate whether the absence of BSP proteins could affect male fertility. To target and generate single and double knockout Bsph1 and Bsph2 mice models, the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR/Cas9) approach was utilized. I used RT-PCR, Digital Droplet-PCR (dd-PCR) and Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) techniques to examine Bsp gene expression at the mRNA and protein levels and confirm whether BSP proteins were completely eliminated in knockout animals. The knockout BSP mouse lines were used to evaluate sperm parameters of fertility. No obvious abnormalities were observed in the fertilizing ability nor in the number of pups for knockout compared to wild type male mice. Sperm count and motility analyses indicated no significant differences between BSP-null mice compared to control. Interestingly, significant differences in terms of the pup’s body weight were observed in double knockout compared to wild type. Based on these results, we conclude that BSP proteins, individually or together, are not essential for proper sperm function and fertilization in mice, and the absence of these proteins does not affect male fertility. Further studies could provide a better understanding of the mechanisms involved and possible pathways by which BSP proteins could be involved in regulating pup weight.

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