Biochemical mechanisms involved in pulmonary hypo-alveolarization induced by peroxides contaminating parenteral nutrition in newborn guinea pig

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP), caractérisée par un défaut de l’alvéolarisation, est une complication pathologique associée à un stress oxydant chez le nouveau-né prématuré. La DBP est présente chez près de 50 % des nouveau-nés de moins de 29 semaines de gestation. La nutrition parentérale (NP) que ces nouveau-nés reçoivent pour cause d’immaturité gastro-intestinale est une source importante de stress oxydant. En effet, leur NP est contaminée par des peroxydes, dont l’ascorbylperoxyde qui est une forme peroxydée du déshydroascorbate. La génération des peroxydes est catalysée par la lumière ambiante. La photoprotection de la NP, quoique difficile d’application en clinique, est associée à une diminution de l’incidence de la DBP chez les enfants prématurés. Chez l’animal nouveau-né, la photoprotection de la NP est associée à un meilleur développement alvéolaire. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que l’ascorbylperoxide infusé avec la NP cause la perte d’alvéoles suite à une apoptose exagérée induite par l’oxydation du potentiel redox du glutathion. Cette oxydation du potentiel redox serait occasionnée par l’inhibition de la transformation hépatique de la méthionine en cystéine, menant à une diminution de la synthèse de glutathion au foie et dans les tissus tels que les poumons. La confirmation de cette hypothèse suggérera qu’un ajout de glutathion dans la NP permettra une meilleure détoxification de l’ascorbylperoxide par l’action de la glutathion peroxydase, et préviendra l’oxydation du potentiel redox et ainsi, la perte d'alvéoles par apoptose. Objectifs : Le but de mon projet de recherche est de comprendre les mécanismes biochimiques liant la NP et le développement de la DBP chez le nouveau-né prématuré et de proposer une alternative nutritionnelle prévenant le développement de cette complication fréquemment observée dans cette population. Les objectifs spécifiques sont : 1) d’évaluer l’impact, au poumon, de l’infusion de l’ascorbylperoxyde sur l’axe métabolique potentiel redox du glutathion - apoptose - le développement alvéolaire; 2) d’étudier l’impact de l’ascorbylperoxyde et du potentiel redox sur l’activité hépatique de la méthionine adénosyltransférase (MAT), première enzyme de la cascade métabolique transformant la méthionine en cystéine; et 3) de tenter de prévenir l’impact négatif de la NP ou de l’infusion d’ascorbylperoxyde sur le poumon en améliorant le statut en glutathion. Méthodes: Par un cathéter fixé dans la jugulaire, des cochons d’Inde de trois jours de vie (n = 8 par groupe) ont reçu en continu durant 4 jours une NP ou une solution de base (dextrose + NaCl) enrichie des différentes molécules à l’essai. Le premier objectif a été atteint en enrichissant la solution de base en ascorbylperoxyde à 0, 20, 60 et 180 μM. Ces solutions contenaient ou non 350 μM H2O2 pour se rapprocher des conditions cliniques. Le second objectif a été atteint en investiguant les mécanismes d’inhibition de la MAT dans des animaux infusés ou non avec des solutions contenant la solution de base, des peroxydes, du glutathion et la NP (dextrose + acides aminés + multivitamines + lipides). Le troisième objectif a été atteint en ajoutant ou non à une solution d’ascorbylperoxide ou à la NP 10 μM de glutathion (GSSG), afin d’obtenir une concentration plasmatique normale de glutathion. Après 4 jours, les poumons étaient prélevés et traités pour la détermination de GSH et GSSG par électrophorèse capillaire, le potentiel redox était calculé selon l'équation de Nernst et le niveau de caspase-3 actif (marqueur d’apoptose) par Western blot et l’index d’alvéolarisation quantifié par le nombre d’interceptes entre des structures histologiques et une droite calibrée. Les données étaient comparées par ANOVA, les effets étaient considérés comme significatifs si le p était inférieur à 0,05. Résultats: L’infusion de l’ascorbylperoxyde, indépendamment du H2O2, a induit une hypoalvéolarisation, une activation de la caspase-3 et une oxydation du potentiel redox de manière dose-dépendante. Ces effets ont été empêchés par l’ajout de GSSG à la NP ou à la solution d’ascorbylperoxyde (180 M). L’ascorbylperoxyde et le H2O2 ont inhibé l’activité de MAT tandis qu’elle était linéairement modulée par la valeur du potentiel redox hépatique.  Conclusion : Nos résultats suggèrent que l’ascorbylperoxyde est l’agent actif de la NP conduisant au développement de la DBP. Ainsi la correction des bas niveaux de glutathion induits par les peroxydes de la NP favorise la détoxification des peroxydes et la correction du potentiel redox pulmonaire ; ce qui a protégé les poumons des effets délétères de la NP en outrepassant l’inhibition de la MAT hépatique. Nos résultats sont d'une grande importance car ils donnent de l'espoir pour une prévention possible de la DBP. Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a major complication of preterm newborns, affecting nearly 50% of infants born before 29 weeks of gestation. BPD is characterized by an arrest in alveolar development. The onset of BPD is related to oxidative stress. Research has shown that parenteral nutrition (PN), which is given to preterm newborns to bypass an immature gastrointestinal system, is a major source of oxidative stress. Indeed, PN is contaminated with peroxides, including ascorbylperoxide, an oxidized form of dehydroascorbic acid. Ambient light is a catalyst for the generation of peroxides. Photo-protection of PN, although difficult to apply in the clinical situation, is associated with a lower incidence of BPD in premature infants and with better alveolar outcomes in animal models of neonatal PN. We hypothesized that the ascorbylperoxide in PN disrupts alveolar development. The main mechanism of action is an inhibition of the transformation of methionine into cysteine in the liver, leading to a lower glutathione synthesis in the liver as well as in peripheral tissues such as lung. Lower glutathione (GSH) concentrations favour a shift of redox potential to a more oxidized state and consequently, to exaggerated apoptosis. If our hypothesis is correct, the addition of glutathione to PN would help detoxify ascorbylperoxide through the action of glutathione peroxidase and prevent the deleterious impact of PN. Objectives: The aims of my research project were to investigate the biochemical mechanisms linking PN to the development of BPD in premature newborns and to propose a nutritional alternative that would prevent the occurrence of this frequently observed complication. Specific objectives were: 1) to assess the effect of intravenously infused ascorbylperoxide on the metabolic axis redox potential of glutathione in the lung; specifically, apoptosis and the alveolarization index; 2) to study the impact of ascorbylperoxide and the redox potential on the activity of methionine adenosyltransferase (MAT) in the liver; methionine adenosyltransferase is the first enzyme in the metabolic cascade from methionine to cysteine; and 3) to try to prevent the deleterious impact of PN or ascorbylperoxide infusions on the lung by improving glutathione status.  Methods: Through a catheter in the jugular vein, 3-day-old guinea pigs (n = 8 per group) received continuous infusions of PN or a simple solution (dextrose + NaCl) enriched with different molecules for testing. The first objective was achieved by enriching the basic solution with ascorbylperoxide at concentrations of 0, 20, 60 and 180 M. To mimic clinical conditions, these solutions contained, or not, 350 M H2O2. The second objective was achieved by investigating the mechanisms of MAT inhibition in animals infused, or not, with solutions consisting of the basic solution, peroxides, glutathione, and PN (dextrose + amino acids + multivitamins + lipids). The third objective was achieved by adding, or not, 10 M of glutathione (GSSG) to the ascorbylperoxide or PN solution until a normal plasma concentration of glutathione was obtained. After 4 days, the lungs were removed. GSH and GSSG levels in the lungs were determined by capillary electrophoresis. The redox potential was calculated using the Nernst equation. The activation and the concentration of active caspase-3 (marker of apoptosis) were determined by Western blot, and the alveolarization index quantified by the number of intercepts between histological structures and a calibrated straight line. Data were compared by ANOVA; effects were considered significant if p was less than 0.05. Results: The infusion of ascorbylperoxide, independently of H2O2, induced hypoalveolarization, activation of caspase-3, and oxidation of the redox potential, in a dose-dependent manner. These effects were prevented by the addition of GSSG to the ascorbylperoxide (180 M) or PN solutions. Ascorbylperoxide and H2O2 inhibited MAT activity in the liver. Hepatic MAT activity was linearly modulated by the value of the redox potential. Conclusion: Our results suggest that ascorbylperoxide is the active ingredient in PN that leads to the development of BPD. Correcting the low glutathione levels induced by peroxides in PN solutions would promote the detoxification of peroxides and re-establish proper pulmonary redox potentials. Glutathione correction further protects the lungs from the deleterious effects of PN by bypassing hepatic MAT inhibition. This result is of great importance because it gives hope for the possible prevention of BPD.

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