Differentiable PKC activation on pacemaking activity of cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells

Les maladies cardiovasculaires sont souvent causées par des arythmies qui proviennent d'une obstruction du système de conduction cardiaque. L'intervenant clé de ce système est le nœud sinu-atrial (SA), qui est responsable de l’initiation de chaque battement cardiaque. L’activation électrique à intervalles réguliers, assurant que le rythme cardiaque est un rythme normal. Le dysfonctionnement du nœud SA entraînerait des instabilités électriques dans le cœur.  Une maladie cardiaque acquise, comme la cardiopathie rhumatismale, ou un bloc de conduction ne sont que quelques-uns des nombreux cas qui nécessitent un stimulateur cardiaque électronique pour surveiller la fréquence cardiaque et générer une impulsion lorsqu'elle bat anormalement. Bien que le stimulateur cardiaque électrique soit considéré comme une thérapie fiable, il n'est pas sans limites. Ces limites comprennent les complications chirurgicales, l'infection au plomb ainsi que la durée de vie limitée de la batterie, qui doit être remplacée à intervalles de quelques années, ce qui alourdit le fardeau hospitalier.  Plusieurs approches ont été adoptées pour développer une méthode thérapeutique plus adéquate. Une stratégie qui sera étudiée implique l'utilisation d'une greffe de cellules de stimulateur cardiaque, créant fondamentalement un stimulateur biologique.  Les approches de thérapie cellulaire utilisent des cellules souches embryonnaires pour évoluer vers les lignées de cellules cardiaques, y compris les cellules stimulatrices cardiaques. Ces cellules de stimulation sont caractérisées par une dépolarisation spontanée qui crée les impulsions rythmiques dans le cœur et contrôle la fréquence cardiaque. Un élément important des cellules du stimulateur cardiaque qui donne lieu à la dépolarisation spontanée sont les canaux « hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated » qui sont activés pendant l’hyperpolarisation et conduisent le courant sous le nom de « funny current ». Ce courant augmente la perméabilité intérieure de la cellule aux courants de sodium et de potassium conduisant à la dépolarisation de la cellule. D'autre part, le taux de conduction est déterminé par la connexine 30.2 et la connexine 45, qui sont des protéines transmembranaires qui s’assemblent pour former des jonctions lacunaires. L'expression de HCN et l'expression de la connexine ont toutes deux étés liés au facteur T-box 3 (Tbx3) dans le développement des myocytes   auriculaires.  Une approche praticable pour moduler l'expression des gènes et par conséquent l'expression des protéines est l'utilisation du conditionnement chimique. Le Phorbol 12- myristate 13-acétate (PMA) est un activateur de Protéine Kinase C (PKC) lié à l'expression de Tbx3, et par conséquent à l'expression de HCN et de connexine, et entraînant une modification de l'activité spontanée.  Les cellules souches embryonnaires de souris sont des cellules qui sont isolées de la masse cellulaire interne des embryons. Ces cellules ont la capacité de se différencier en tous les types de cellules somatiques. En combinant les facteurs de croissance, ces cellules peuvent se différencier en cardiomyocytes.  Nous émettons l'hypothèse que le conditionnement chronique de cardiomyocytes de souris avec PMA entraîne une régulation à la hausse de l'expression de Tbx3 et par conséquent une régulation à la hausse de l'expression de HCN et de l'expression de connexine, favorisant ainsi le développement des cellules stimulatrices cardiaques dans la population des cardiomyocytes.  Afin de vérifier notre hypothèse, nous avons acheté des cellules de la lignée cellulaire E14TG2A de souris. Ces cellules ont été cultivées dans des pétris et différenciées en cardiomyocytes à l'aide d'un protocole en trois étapes (voir la section Méthodes). Les cardiomyocytes sont ensuite exposés à la PMA à des concentrations variables (0.1 µM vs 1 µM) pendant 1h (exposition aiguë) ou 24 h (exposition chronique). Les résultats variaient d'un groupe expérimental à l'autre par rapport au groupe témoin. Dans toutes les conditions expérimentales, il semble y avoir une augmentation initiale de l'activité spontanée, mais elle s'inverse rapidement à la marque des 24 heures, où le rythme diminue. Différentes concentrations jouent un rôle dose-dépendant dans l'effet inhibiteur de longue durée sur la stimulation des cellules. Cardiovascular diseases are often caused by arrhythmias that originate from an obstruction within the cardiac conduction system. The key player within that system is the sinoatrial (SA) node, which is responsible for initiation the electrical impulses at a regular interval, insuring the heartbeat at a normal pace. Dysfunction of the SA node would lead to electrical instabilities in the heart.  An acquired heart disease, such as rheumatic heart disease, or a conduction block are just some of many cases that would require an electronic pacemaker to monitor the heart rate and generate an impulse when it beats abnormally. Although the electric pacemaker is considered as a reliable therapy, it is not without limitations. These limitations include surgery complication, lead infection as well as limited battery lifespan, which requires replacement every few years thus adding to the hospital burden.  Several approaches have been taken to develop a more adequate therapeutic method. A strategy that will be investigated involves using a graft of pacemaker cells, fundamentally creating a biological pacemaker.  Cell therapy approaches use embryonic stem cells to evolve into the cardiac cell lines, including pacemaker cells. These pacing cells are characterized by spontaneous depolarization that create the rhythmic impulses in the heart and control the heart rate. An important element of the pacemaker cells that give rise to the spontaneous depolarization are the hyperpolarization- activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) channels that are activated during hyperpolarization and conduct the funny current by increasing the cell’s inward permeability to sodium-potassium currents. On the other hand, the conduction rate is determined by connexin 30.2 and connexin 45, which are transmembrane proteins that assemble to form gap junctions. Both HCN expression and connexin expression has been linked to T-box factor 3 (Tbx3) in the development of atrial myocytes.  A practicable approach to modulate gene expression and consequently protein expression is using chemical conditioning. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) is a Protein Kinase C (PKC) activator that has linked to Tbx3 expression, and consequently HCN and   connexin expression, and lead to a modification in spontaneous activity.  Mouse embryonic stem cells (ESCs) are cells that are isolated from the inner cell mass of early embryos. These cells can differentiate into all somatic cell types. Given the proper combination of growth factors, these cells can differentiate into cardiomyocytes.  We hypothesize that chronic conditioning of mice cardiomyocytes with PMA lead to an upregulation of Tbx3 expression and consequently an upregulation of HCN expression and connexin expression, therefore promoting the development of pacemaker cells within the cardiomyocyte population.  In order to test our hypothesis, we purchased cells from the mouse E14TG2A cell line. These cells were cultured in glass bottom petri dishes and differentiated into cardiomyocytes using a three-step protocol (shown in Methods section). The cardiomyocytes are then exposed to PMA in varying concentration (0.1 µM vs 1 µM) for either 1h (acute exposure) or 24 h (chronic exposure). The results varied between the experimental groups compared to the control. In all experimental conditions there seems to be an initial increase in spontaneous activity, but this is quickly reversed at the 24 h mark, where pacing decreased. Different concentration plays a dose-dependent role in long-lasting inhibitory effect on the pacing of the cells

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