Immune potential and differentiation of equine induced pluripotent stem cells (eiPSC)

Induced pluripotent stem cells (iPSC) have the capacity to self renew and differentiate into a myriad of cell types making them potential candidates for cell therapy and regenerative medicine. The goal of this thesis was to determine the characteristics of equine iPSC (eiPSC) that can be harnessed for potential use in veterinary regenerative medicine. Trauma to a horse’s limb often leads to the development of a chronic non-healing wound that lacks a keratinocyte cover, vital to healing. Thus, the overall hypothesis of this thesis was that eiPSC might offer a solution for providing wound coverage for such problematic wounds. Prior to considering eiPSC for clinical applications, their immunogenicity must be studied to ensure that the transplanted cells will be accepted and integrate into host tissues. The first objective of this thesis was to determine the immune response to eiPSC. To investigate the immunogenicity of eiPSC, the expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules by the selected lines was determined, then the cells were used in an intradermal transplantation model developed for this study. While transplantation of allogeneic, undifferentiated eiPSC elicited a moderate cellular response in experimental horses, it did not cause acute rejection. This strategy enabled the selection of weakly immunogenic eiPSC lines for subsequent differentiation into lineages of therapeutic importance. Equine iPSC offer a potential solution to deficient epithelial coverage by providing a keratinocyte graft with the ability to differentiate into other accessory structures of the epidermis. The second objective of this thesis was to develop a protocol for the differentiation of eiPSC into a keratinocyte lineage. The protocol was shown to be highly efficient at inducing the anticipated phenotype within 30 days. Indeed, the eiPSC derived vi keratinocytes (eiPSC-KC) showed both morphologic and functional characteristics of primary equine keratinocytes (PEK). Moreover, the proliferative capacity of eiPSC-KC was superior while the migratory capacity, measured as the ability to epithelialize in vitro wounds, was comparable to that of PEK, suggesting exciting potential for grafting onto in vivo wound models. In conclusion, equine iPSC-derived keratinocytes exhibit features that are promising to the development of a stem cell-based skin construct with the potential to fully regenerate lost or damaged skin in horses. However, since eiPSC do not fully escape immune surveillance despite low MHC expression, strategies to improve engraftment of iPSC derivatives must be pursued. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont la capacité de s'auto renouveler et de se différencier en une myriade de types cellulaires, ce qui en fait des outils intéressants pour la thérapie cellulaire et la médecine régénérative. Le but de cette thèse était de déterminer les caractéristiques des iPSC équines (eiPSC) qui peuvent être exploitées pour l'usage potentiel en médecine régénérative vétérinaire. Chez le cheval, une plaie cutanée est souvent cicatrisée par seconde intention et est sujette à de nombreuses complications lorsque située sur le membre, notamment une épithélialisation lente. Ainsi, l'hypothèse globale de cette thèse était que les eiPSC pourraient offrir une solution novatrice de couverture pour de telles blessures. Avant d'envisager l’utilisation d'eiPSC à des fins cliniques, leur immunogénicité doit être étudiée afin de s'assurer que les cellules transplantées seront acceptées et intégrées dans les tissus du receveur. Le premier objectif de cette thèse était de définir la réponse immunitaire suscitée par les eiPSC. Afin d'étudier l'immunogénicité d'eiPSC, l'expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) des lignes choisies a été déterminée, puis les cellules ont été utilisées dans un modèle de transplantation intradermique développé pour cette étude. Bien que la transplantation allogénique d'eiPSC non différenciées ait induit une réponse cellulaire modérée chez les chevaux d'expérimentation, elle n'a pas provoqué de rejet. Cette stratégie a permis la sélection de lignées d'eiPSC faiblement immunogènes pour la différenciation ultérieure en des lignées d'importance thérapeutique. Les eiPSC représentent une solution intéressante et qui, par l’entremise du développement d’une lignée de kératinocytes, pourraient servir à la création d’une greffe ayant la capacité de former non seulement l’épithélium manquant mais aussi d'autres structures accessoires de l'épiderme. Le deuxième objectif de cette thèse était donc de iv développer un protocole pour la différentiation des eiPSC en lignée de kératinocytes. Un protocole visant cette différenciation fut ainsi développé et ce dernier a démontré une grande efficacité à produire le phénotype attendu dans une période de 30 jours. En effet, les kératinocytes dérivés d'eiPSC (eiPSC-KC) ont montré des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des kératinocytes primaires équins (PEK). En outre, la capacité de prolifération d'eiPSC-KC est supérieure tandis que la capacité migratoire, mesurée comme l'aptitude à cicatriser les plaies in vitro, est comparable à celle du PEK. En conclusion, les eiPSC-KC ont des caractéristiques intéressantes pour le développement d'un substitut cutané à base de cellules souches, ayant le potentiel de régénérer la peau perdue lors de trauma ou de maladie, chez le cheval. Cependant, parce que les eiPSC n'échappent pas totalement à la surveillance immunitaire, malgré une faible expression du MHC, des stratégies pour améliorer la prise de greffe eiPSC-KC doivent être élaborées.

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