Role of the orphan nuclear receptor NR5A2 in ovarian function

Le récepteur nucléaire orphelin NR5A2, également connu sous le nom de liver receptor homolog 1 (LRH-1), est exprimé dans l’ovaire, spécifiquement au niveau des cellules de granulosa. L’activation et le développement des follicules ovariens sont caractérisés par la multiplication des cellules de granulosa, des follicules primordiaux et leur unique rang de cellules de prégranulosa, aux follicules préovulatoires avec de nombreuses couches de cellules de granulosa cuboïdales. NR5A2 est un acteur bien connu de la régulation de la prolifération cellulaire dans des organes comme l’intestin et des pathologies comme le cancer du sein. L’hypothèse explorée est que NR5A2 régule le développement folliculaire en agissant sur la prolifération des cellules de granulosa et la régulation de l’activation des follicules primordiaux de la réserve ovarienne. Pour étudier ce facteur de transcription, un modèle de souris transgéniques caractérisées par la déplétion conditionnelle de NR5A2 dans les cellules de granulosa de tous les follicules (génotype Nr5a2f/f; Amhr2Cre+) a été développé. Les souris femelles mutantes, désignées comme cKO (pour conditional knock-out) sont infertiles suite à l’absence d’ovulation. La première partie de l’étude a mis en évidence, et ce aussi bien in vivo qu’in vitro, une déplétion significative du nombre de cellules en phase S, phase du cycle cellulaire au cours de laquelle a lieu la réplication de l’ADN. Cette diminution du nombre de cellules en division s’accompagne d’une déplétion significative de l’expression de gènes essentiels pour la prolifération des cellules de granulosa, parmi lesquels les cyclines D et E. De plus, démonstration a été faite que la régulation de la multiplication cellulaire passait en partie par l’interaction de NR5A2 avec b-caténine et que l’impact négatif de la déplétion de NR5A2 sur la prolifération des cellules de granulosa ne pouvait être secouru par l’adjonction d’estrogènes, un puissant mitogène des cellules ovariennes. Pour ce qui est du mécanisme, il a été déterminé que la régulation négative de CDKN1A, un inhibiteur du cycle cellulaire, est interropue en cas de déplétion de NR5A2. Ce gène a de ce fait été identifié comme un des principaux médiateurs de l’abrogation de la prolifération des cellules de granulosa gonadotropine-dépendante observée dans les souris cKO. La seconde partie de l’étude s’intéresse à l’impact de la déplétion de NR5A2 sur la population de follicules primordiaux. Dans ce même modèle murin, la déplétion de NR5A2 engendre la multiplication des follicules primordiaux et coincide avec la surexpression de marqueurs liés à leur formation et à la survie cellulaire. Ces changements s’accompagnent également de la diminution de la quantité de transcrits codant pour des gènes favorisant l’activation folliculaire. Dans des souris de type sauvage, l’analyse de la localisation de NR5A2 par immunocytochimie a confirmé l’existence de deux sous-populations de follicules primordiaux, l’une exprimant NR5A2 dans les cellules de granulosa est considérée comme prête à s’activer, l’autre caractérisée par l’absence de ce même facteur de transcription est constituée de follicules primordiaux quiescents. Chez les souris cKO une augmentation significative dans l’abondance de la quantité de transcrits de gènes favorisant la quiescence a aussi été établie, ce qui plaide en faveur du concept des deux populations de follicules primordiaux. En conclusion, NR5A2 joue un rôle dans la formation des follicules primordiaux, leur survie et leur activation. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que le récepteur nucléaire orphelin NR5A2 est un des régulateurs clé des évènements pré et peri-ovulatoires en agissant en particulier sur l’activation des follicules primordiaux et la prolifération des cellules de granulosa. The orphan nuclear receptor NR5A2, also known as liver receptor homolog 1 (LRH1), is expressed in the ovary, specifically in granulosa cells. Activation and development of ovarian follicles are characterized by the multiplication of granulosa cells, from primordial with only one layer of pregranulosa cells, to pre-ovulatory stage with multiples layers of cuboidal granulosa cells. NR5A2 is a well known actor in regulation of cell proliferation in organs such as the intestine and in conditions such as breast cancer. The hypothesis that NR5A2 regulates follicular development by acting on granulosa cells proliferation and the regulation of the primordial follicle pool activation was tested. To study this transcription factor, a knock-out mouse model characterized by the conditional depletion of NR5A2 in granulosa cells of all follicles (genotype Nr5a2f/f, Amrh2Cre/+) was developed. These female mutant mice, designated as cKO (conditional knock-out), were infertile due to the absence of ovulation. The first part of the study highlighted, in vivo and in vitro, a significant decrease of the number of cells reaching the S phase, where the DNA is replicated. This decrease in the dividing cells was accompanied by significant depletion of genes essential for granulosa cell proliferation, the cyclins D and E among others. Moreover, an effect of the depletion of NR5A2 on granulosa cell proliferation, via its interaction with b-catenin, was demonstrated and proliferation could not be rescued by the ovarian mitogen, estrogen. In terms of the mechanism, it was shown that the expected negative regulation of CDKN1A, a cell cycle inhibitor, did not occur following the depletion of NR5A2. This gene was therefore identified as the main mediator of the abrogation of gonadotropin dependent granulosa cell proliferation observed in the cKO mice. The impact of NR5A2 depletion on primordial follicles population was next studied. In this mouse genotype, there was a several fold increase in the number of primordial follicles, with concomitant upregulation of markers linked to their formation and cell survival. These changes were accompanied by a decrease in the transcripts coding for genes linked to follicle activation. In wild type mice, quantitative analysis by immunocytochemistry confirmed that there are two subpopulations of primordial follicles, one where NR5A2 is expressed in granulosa cells and one where it is absent, the former was judged to be poised for activation, while the latter was quiescent. The cKO mice are characterized by a significant increase in transcript abundance of genes promoting quiescence, support for this concept. We conclude that Nr5a2 plays a role in primordial follicle formation, survival and activation. Taken together these results demonstrate that the orphan nuclear receptor NR5A2 plays a key role in pre and peri-ovulatory events, acting particularly on primordial follicles activation and granulosa cells proliferation

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