Analyse du rôle de l’interaction de VirB6 avec VirB10 dans le système de sécrétion de type IV

Les maladies infectieuses sont un problème majeur au niveau mondial. La propagation de ces maladies ainsi que les résistances aux traitements sont en partie dues au fait que plusieurs pathogènes bactériens utilisent des complexes multiprotéiques, tels que les systèmes de sécrétion de type IV (T4SSs), pour transférer des macromolécules directement dans d’autres cellules. Les T4SSs sont importants pour deux raisons fondamentales : l’échange génétique et le transfert d’effecteurs dans la cellule hôte. Ces fonctions permettent l'adaptation des pathogènes aux changements d'environnement et entrainent la perturbation des mécanismes de défense de l'hôte. Les T4SSs sont typiquement composés de 12 protéines (VirB1-VirB11, VirD4) qui peuvent être divisées en trois groupes, les composants du pilus, du pore central et les ATPases.  Mon sujet de doctorat est focalisé sur VirB6, une protéine membranaire essentielle du T4SS, et en particulier sur son interaction avec VirB10, afin d’établir son rôle dans la structure et la fonction des T4SSs. Grâce à notre première publication, suggérant une interaction entre ces protéines, nous avons pu émettre l’hypothèse principale : VirB6 interagit avec VirB10 dans le but de transférer les substrats dans la partie périplasmique du T4SS et de recruter le complexe VirB2/VirB5, permettant ainsi l’assemblage du pilus et le transfert du substrat.  Pour tester cette hypothèse, nous utilisons une approche en trois volets dans le but d’obtenir des informations sur ces interactions ainsi que leurs rôles fonctionnels. Premièrement, une mutagenèse dirigée a été réalisée sur VirB6, puis les conséquences pour l’interaction avec VirB10 ont été évaluées par une analyse de double hybride bactérien afin de connaître les résidus spécifiques impliqués dans l’interaction. Ensuite, une fois les résidus spécifiques identifiés, les effets sur la complémentation ont été testés en utilisant des essais in vivo avec les modèles des T4SSs d’Agrobacterium tumefaciens et de pKM101. Enfin, nous avons surexprimé et purifié VirB6 pour effectuer une caractérisation structurale in vitro, notamment par SAXS, microscopie électronique et diverses méthodes biochimiques.  Comprendre comment ces systèmes permettent aux bactéries d'envahir leurs hôtes et de survivre est essentiel au développement de nouveaux traitements antimicrobiens. Il est indispensable de comprendre les détails moléculaires des interactions protéine-protéine pour évaluer leurs dynamiques et leurs fonctions au sein de ces machineries. Une meilleure vue d’ensemble permettra une compréhension plus précise du mécanisme de ces systèmes facilitant ensuite la recherche d’inhibiteurs qui pourraient améliorer le traitement de maladies infectieuses. Infectious diseases are a major problem worldwide. Propagation and resistance to treatment are partly due to the fact that several bacterial pathogens use multiprotein complexes, such as type IV secretion systems (T4SSs), to deliver macromolecules directly to other cells. T4SSs are important for two fundamental reasons: the genetic exchange of plasmid DNA and the transfer of effectors in the target cell. These functions allow adaptation of pathogens to environmental changes and disruption of host defense mechanisms. T4SSs are typically composed of 12 proteins (VirB1-VirB11, VirD4) that can be divided into three groups, the pilus components, the central pore and the ATPases.  My Ph.D. research is focused on VirB6, an essential membrane protein of the T4SS, and in particular on its interaction with VirB10, to define its role for the structure and function of T4SS. In our first publication, we showed an interaction between these proteins leading to the main hypothesis: VirB6 interacts with VirB10 to deliver the substrates to the periplasmic components of the T4SS and to recruit VirB2/VirB5 complex, enabling pilus assembly and substrate transfer. To test this hypothesis, we used a three-pronged approach to obtain information on these interactions and on their functions. Firstly, site-directed mutagenesis was performed on VirB6 and we then evaluated the consequences on the interaction with VirB10 using the bacterial two-hybrid assay to identify the specific residues involved in the interaction. Then the effects of changes of these residues on complementation were tested using in vivo assays with the Agrobacterium tumefaciens and pKM101 T4SSs. Finally, we overexpressed and purified VirB6 for in vitro structural characterization, including SAXS, electron microscopy and various biochemical methods.  Understanding how these systems allow bacteria to invade hosts and survive is critical for the development of new antimicrobial treatments. It is essential to understand the molecular details of protein-protein interactions to evaluate their dynamics and their functions within these machineries. Better mechanistic insights into these systems will enable targeted inhibitor design that may lead to improved treatment of infectious diseases.

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