Implication du facteur IKAROS dans la régulation des gènes cibles de la voie NOTCH dans les cellules érythroïdes

IKAROS est un facteur de transcription majeur dans l’hématopoïèse qui agit en recrutant à la chromatine de nombreux partenaires décisifs dans le renouvellement cellulaire et l’engagement vers des lignages spécifiques. Il est notamment requis dans les cellules lymphoïdes pour réprimer les gènes cibles de la voie de signalisation NOTCH. IKAROS est aussi important dans le développement des cellules érythroïdes dans lesquelles il facilite le passage d’une globine fœtale à adulte chez l’embryon grâce au recrutement des complexes remodeleurs de la chromatine NuRD et BAF. En condition normale, la voie de signalisation NOTCH réprime la différenciation en cellules érythroïdes. Il est donc important que les gènes cibles de la voie NOTCH soient finement régulés afin d’amener une cellule progénitrice à se différencier en érythrocyte énucléé. Dans les cellules hématopoïétiques, incluant les cellules érythroïdes, IKAROS est un régulateur important du gène Hes1, cible effectrice majeure de la voie NOTCH. En effet, IKAROS participe activement à la répression du gène Hes1, permettant le développement des cellules érythroïdes. Nous avons donc émis l’hypothèse que dans ces cellules, IKAROS pourrait avoir une action plus généralisée sur le contrôle des gènes ciblés par NOTCH, comme observé dans les cellules lymphoïdes. Il pourrait ainsi agir en recrutant les complexes enzymatiques nécessaires à la régulation de ces gènes comme NuRD et BAF afin d’assurer le développement des cellules érythroïdes. Étant donné que la régulation des gènes est aussi dépendante du motif de méthylation de l’ADN, nous avons étendu notre questionnement à cet autre aspect de la régulation qu’IKAROS pourrait utiliser pour contrôler les gènes de la voie NOTCH. Pour ce faire, nous avons procédé à l’analyse bio-informatique d’un séquençage d’ARN de cellules érythroïdes murines préalablement réalisé au laboratoire afin d’en extraire les gènes régulés par IKAROS, mais aussi par NOTCH. L’analyse nous a permis d’extraire deux motifs d’expression intéressants observés dans les cellules érythroïdes pour lesquels IKAROS réprime ou active des gènes qui sont normalement réceptifs à l’activation de la voie NOTCH. Parmi les gènes réprimés par IKAROS en sont ressortis les gènes cibles de NOTCH Cdkn1a (P21WAF1/CIP1) et Trp53 (TP53), dont l’expression augmente fortement quand IKAROS est muté et que NOTCH est actif. Parmi les gènes activés par IKAROS en sont ressortis les gènes cibles de NOTCH Prdm16 et Nrarp, dont l’expression diminue fortement quand IKAROS est muté et que NOTCH est actif. IKAROS est donc un régulateur pouvant être répresseur, mais aussi activateur d’une multitude de gènes ciblés par NOTCH dans les cellules érythroïdes. Par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, nous avons pu observer qu’IKAROS semblait toujours agir en partenariat avec le complexe NuRD et que la présence du complexe BAF était plutôt dépendante de la voie NOTCH. L’association IKAROS-NuRD semble servir de plateforme pour imposer un état de chromatine bivalente (avec co-présence de H3K4me3 et de H3K27me3) associée à une pause transcriptionnelle. Dans ce contexte, les éléments nécessaires à l’initiation de la transcription (présence de la marque H3K4me3) des gènes ciblés par NOTCH sont recrutés mais, l’élongation transcriptionnelle est affectée. L’état de chromatine bivalente peut être associé à l’activité des déméthylases de l’ADN Ten-Eleven-Translocation (TET) qui empêchent alors l’hyperméthylation de ces régions. Nos résultats démontrent qu’IKAROS peut utiliser la protéine TET1 pour réguler des gènes cibles de la voie NOTCH, en y formant l’hydroxyméthylcytosine (5-hmC). Celle-ci peut aussi marquer les régions de régulation génique caractérisées par une chromatine bivalente et une pause transcriptionnelle. Ces travaux décrivent IKAROS comme un facteur agissant de façons multiples dans la régulation des gènes cibles de NOTCH dans les cellules érythroïdes. Nous proposons qu’IKAROS et son partenaire NuRD soient requis pour mettre en place un état de chromatine bivalente et de pause transcriptionnelle pour faciliter l’activation physiologique des gènes cibles de NOTCH lors de la signalisation. IKAROS peut ainsi prendre part à l’activation ou la répression de gènes cibles de NOTCH, tout en facilitant la déméthylation de l’ADN ainsi que le recrutement d’éléments transcriptionnels qui favorisent un état de pause transcriptionnelle. NOTCH ainsi que d’autres éléments de régulation sont alors requis pour induire l’activation ou la répression des gènes cibles. IKAROS is a critical transcription factor in hematopoiesis. It facilitates the chromatin binding of many important co-factors required for chromatin organization during cell renewal and lineage commitment. IKAROS is particularly important in lymphoid cells whereby it is involved in the repression of target genes of the NOTCH signaling pathway. IKAROS is also important in the development of other hematopoietic lineages, including the erythroid cells, in which it facilitates the passage of a fetal to adult globin in the embryo through the recruitment of the chromatin remodeling complexes NuRD and BAF. Under normal conditions, the NOTCH signaling pathway represses development of erythroid cells. It is therefore important to precisely understand how the NOTCH target genes are regulated during passage from hematopoietic progenitor to the enucleated circulating erythrocyte. IKAROS has been demonstrated to be an important regulator of Hes1 gene expression in hematopoietic cells of different lineages. Hes1 is the major effector target of the NOTCH pathway and IKAROS actively participates in its repression. In erythroid cells, the regulation of Hes1 imposed by IKAROS is required for terminal differentiation. We therefore investigated the importance of IKAROS in the regulation of NOTCH-targeted genes in erythroid cells. The combined effect of the mutation of IKAROS with NOTCH signaling was particularly investigated in these cells. To define how IKAROS influences the regulation of NOTCH target genes, we performed the bioinformatics analysis of a RNA-sequencing performed in murine erythroid cells activated or not for NOTCH signaling and whereby IKAROS is absent. We identified genes influenced by IKAROS expression and by NOTCH, and defined the effect of the combination of the absence of IKAROS expression and NOTCH pathway activation. Two particular expression patterns were identified and characterized the combined effect of the absence of IKAROS and NOTCH pathway activation in erythroid cells.  Indeed, the absence of IKAROS either favors the overexpression of NOTCH target genes or prevents their response to NOTCH pathway activation. To understand how IKAROS could have an opposite effect on different NOTCH target genes we analysed the effect of IKAROS on their regulation. Among the genes repressed by IKAROS are the target genes of NOTCH Cdkn1a (encoding the P21WAF1/CIP1 protein) and Trp53 (encoding the TP53 protein), whose expression increases strongly when IKAROS is mutated and the NOTCH pathway is activated. Prdm16 and Nrarp are, instead, requiring IKAROS expression for their activation by NOTCH. The characterization of these NOTCH target genes suggests that IKAROS can work in partnership with the NuRD complex to influence the expression. The chromatin characterization of these genes led us to posit that the IKAROS-NuRD could act as a ‘platform’ to impose a bivalent chromatin organization associated with poised transcription. Then, the regulation imposed by IKAROS-NuRD would be required for the physiological activation of NOTCH targets upon external signaling. Finally, since in embryonic stem cells the Ten-Eleven Translocation (TET) enzymes are reported to be frequently associated to bivalent chromatin in order to prevent DNA hypermethylation, we assessed whether IKAROS could interact and ‘use’ TET enzymes to regulate NOTCH target genes. We determined that IKAROS can co-immunoprecipitate with the TET1 enzymes. We show that IKAROS influences both recruitment and activity of TET1 to different NOTCH target genes and favors the accumulation of hydroxymethylcytosine (5-hmC) to these genes. 5-hmC can be considered as a mark of transcriptional pausing/bivalence. Thus, these studies bring new information on the mechanism used by IKAROS to influence gene regulation in hematopoietic cells. Our results suggest that IKAROS primary function is to organize a bivalent chromatin and to promote transcriptional pausing to multiple NOTCH target genes. IKAROS is required to set the epigenetic and promoter organization for rapid activation upon NOTCH signaling.

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