The role of the human INO80 complex in telomere maintenance

Les extrémités des chromosomes contiennent des répétitions de séquences d’ADN appelées télomères qui empêchent l’activation inopportune de la réponse aux dommages de l'ADN afin de préserver l'intégrité génomique. Les télomères raccourcissent à chaque cycle de réplication d’ADN et la télomérase a pour fonction de contrebalancer cette érosion en allongeant les télomères. Les cellules somatiques n’expriment pas la télomérase, donc leur durée de vie est normalement limitée par ce raccourcissement progressif des télomères qui conduit à l'activation de la voie p53 entraînant un arrêt de la croissance cellulaire. En revanche, les cellules cancéreuses acquièrent l'immortalité cellulaire principalement en réactivant la télomérase ou en utilisant des méthodes alternatives d'allongement des télomères basées sur la recombinaison d’ADN. Auparavant, dans notre laboratoire, un criblage CRISPR à l'échelle du génome a été réalisé dans la lignée cellulaire pré-B NALM-6 traitée avec la molécule BIBR1532, un inhibiteur de la télomérase. Ces résultats suggéraient que cinq sous-unités du complexe de remodelage de la chromatine INO80, lorsque supprimées indépendamment, réduisaient la prolifération des cellules ayant un raccourcissement des télomères induit par le BIBR1532. Mon objectif était d'étudier cette interaction génétique afin de comprendre les processus biologiques impliqués dans cette létalité synthétique. Après l'élimination des gènes codant à la fois pour la sous-unité enzymatique de la télomérase humaine (hTERT) ainsi que les sous-unités spécifiques du complexe INO80 humain, nous avons constaté que les cellules double-négatives avaient une capacité proliférative réduite, ce qui démontre que l’interaction génétique mesurée par criblage CRISPR est bel et bien spécifique. Étant donné le rôle du facteur de transcription p53 dans la réponse cellulaire au raccourcissement télomérique, nous avons exploré l’importance de cette voie de signalisation pour l’interaction entre le complexe INO80 humain et la télomérase. Après l’activation de p53 avec un traitement avec la molécule nutlin-3a, les niveaux d'expression de plusieurs cibles de p53 tels que MDM2 et CDKN1A ont augmenté dans les cellules ayant une délétion du gène NFRKB, codant pour une sous-unité du complexe INO80 humain. Les cellules ayant une délétion du gène UCHL5, codant pour le partenaire d’interaction de NFRKB, ont également montré une augmentation de l’expression de MDM2 lorsque traitées avec nutlin-3a. Enfin, la perte de télomérase (hTERT) modifie les niveaux d'expression des composants de la 2 voie p53 CDKN1A, BAX et MDM2. En conclusion, la suppression des gènes codant pour des sous-unités du complexe INO80 telles que NFRKB ou UCHL5 est nuisible aux cellules ayant une délétion de la télomérase. Le complexe INO80 humain peut être impliqué dans l'inhibition de la voie p53, en réponse à l'activation de p53 soit par des télomères courts ou avec un traitement avec nutlin-3a. Des recherches plus approfondies sur cette interaction génétique pourraient mener au développement de nouvelles thérapies combinatoires afin d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses. The ends of chromosomes contain telomeric repeats that prevent the DNA damage response from being activated in order to preserve genomic integrity. Telomerase functions to alleviate incomplete DNA replication at telomeres, and to repair those telomeres damaged by various means including oxidative damage. The lifespan of telomerase negative somatic cells is normally restricted by gradual telomere shortening which can lead to the activation of the p53 pathway resulting in cellular growth arrest. Cancer cells often elongate their telomeres in order to acquire cellular immortality predominantly by reactivating telomerase or by using recombination-based, alternative telomere lengthening methods. Previously in our lab, a genome-wide CRISPR screen was conducted in the pre-B cell line NALM-6 treated with a small molecule inhibitor of telomerase, BIBR1532. These previous results suggested that five subunits of the INO80 chromatin-remodeling complex, when independently deleted, reduced cellular proliferation in cells with BIBR1532 induced telomere shortening. My goal was to investigate this genetic interaction in order to understand the biological processes implicated in this synthetic lethal relationship. After the knockout of the genes encoding both the enzymatic subunit of human telomerase (hTERT) and specific subunits of the human INO80 complex, I found that the proliferative capacity of NALM-6 cells was reduced. This result indicates the genetic interaction identified by CRISPR screening is in fact specific. In addition, after p53 stimulation with nutlin-3a treatment, expression levels of the p53 pathway component MDM2 were altered after the knockout of the genes encoding specific subunits of the human INO80 complex, NFRKB and UCHL5, individually. CDKN1A expression was also altered after nutlin-3a treatment and NFRKB knockout. Finally, the loss of telomerase (hTERT) alters the expression levels of the p53 pathway components CDKN1A, BAX and MDM2. In conclusion, the deletion of the genes encoding specific subunits of the INO80 complex, including NFRKB and UCHL5, is harmful to cells after hTERT knockout. The human INO80 complex may be involved in inhibiting the p53 pathway, in response to p53 activation by short telomeres or nutlin-3a treatment. Further investigation into this synthetic lethal relationship may shed light on new combinatorial therapeutics in cancer.

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