Régulation de l’identité des membres postérieurs par le facteur de transcription à boîte T Tbx4

Bien que partageant une homologie structurelle évidente, les membres antérieurs (MA) sont toujours différents des membres postérieurs (MP). Ceci suggère l’existence d’un programme générique de formation d’un membre, un bauplan, qui doit être modulé de façon spécifique pour engendrer cette différence antéro-postérieure de l’identité. Nous avons donc voulu identifier les mécanismes déployés durant l’évolution pour permettre la mise en place de l’identité des membres. Le laboratoire avait précédemment caractérisé, chez les souris où le gène Pitx1 est inactivé, une transformation partielle des MP en MA couplée à une perte de croissance. Nous avons donc cherché à comprendre les mécanismes en aval de Pitx1 dans la détermination de l’identité postérieure. Notre démarche nous a permis d’identifier les gènes affectés par la perte de Pitx1 dans les MP, où nous avons confirmé une dérégulation de l’expression de Tbx4. Tbx4 et Tbx5 sont des candidats évidents pour déterminer l’identité, leur expression étant restreinte aux MP et MA, respectivement, mais leur implication dans ce processus était sujette à controverse.  Nous avons donc évalué l’apport de Tbx4 en aval de Pitx1 dans les processus d’identité en restaurant son expression dans les MP des souris Pitx1-/-. Ce faisant, nous avons pu montrer que Tbx4 est capable de pallier la perte de Pitx1 dans le MP, en rétablissant à la fois les caractères d’identité postérieure et la croissance. En parallèle, nous avons montré que Tbx5 était capable de rétablir la croissance mais non l’identité des MP Pitx1-/-, démontrant ainsi de façon définitive une propriété propre à Tbx4 dans la détermination de l’identité des membres postérieure.  La caractérisation de l’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 nous a permis de mettre en évidence un domaine activateur conservé mais aussi un domaine spécifique à Tbx4, répresseur de la transcription. Par ailleurs, une mutation faux-sens de TBX4 dans les patients atteints du syndrome coxo-podo-patellaire, TBX4Q531R, inactive le domaine répresseur, empêchant la compensation de l’identité mais non de la croissance des MP dépourvus de Pitx1, démontrant l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. La caractérisation de l’activité répressive de Tbx4, qui se manifeste seulement dans les membres postérieurs démontre l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. Nous avons aussi été en mesure d’identifier un corépresseur qui est suffisant pour supporter cette activité de Tbx4. Enfin, nous avons pu aussi démontrer l’activité transcriptionnelle d’un représentant du gène ancestral, présent chez Amphioxus, qui se comporte strictement comme un activateur et semble dépourvu du domaine répresseur. En somme, nous avons précisé le rôle de Tbx4 et Tbx5, ainsi que leur mécanisme, dans la détermination de l’identité des membres. Globalement, nos travaux permettent d’élaborer une théorie où une divergence d’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 est responsable de l’identité des membres et même entrevoir que cette divergence d’activité soit à la base de son apparition durant l’évolution. Forelimbs and hindlimbs are a classical example of serial homology, suggesting they share an evolutionary common generic program that directs their formation. Identity is presumably derived from specific modulations of that program in different limb type. Transcription factors are prime candidates to link these structural differences to specific modulations and three factors with limb-specific expression have been identified. Pitx1 and Tbx4 expression is restricted to the hindlimbs while Tbx5 is restricted to the forelimbs and they have all been ascribed functions in both growth and identity from knockout and overexpression studies. Recent studies have produce evidence that Tbx4 and Tbx5 are interchangeable, sharing identical properties to support growth but not identity of the limbs, the latter being a direct consequence of Pitx1 expression. Indeed, Pitx1 deficient mice have been previously described as undergoing a hindlimb-to-forelimb transformation in addition of growth defects.  To better assess the shared and specific properties of Tbx4 and Tbx5, we assessed their capacities to rescue identity and growth defects by expression studies in Pitx1-/- hindlimbs. Specifically, previous studies had shown that Pitx1 deficiency causes the loss of hindlimb features, the transformation of hindlimb features toward forelimb-like morphology, the gain of a forelimb feature and the asymmetric loss of growth at the level of the femur. Targeted expression in the limbs of both Tbx4 and Tbx5 rescued the growth defects similarly. Interestingly, only Tbx4 was able to restore identity features affected in absence of Pitx1. To further assess these shared and specific properties, we conducted transcriptional assays that revealed the presence of a shared and conserved transactivating domain in the C-terminal moiety of these proteins. Moreover, we could identify a repressor domain specific to Tbx4. Human small patella syndrome maps to TBX4 and a coding mutation, TBX4Q531R, that specifically inactivates the repressive properties of Tbx4 prevents it from rescuing identity to the Pitx1-/- hindlimbs but not from rescuing growth. We also conducted a yeast two-hybrid assay that allowed the identification of putative co-factors of Tbx4, of which one seems to act as a co-repressor.  Together, our results support the presence of a Tbx4/Tbx5 conserved activating domain required for limb outgrowth that is an integral part of the limb bauplan. Importantly, we identified a molecular basis for the determination of limb identity through the Tbx4-specific repressor domain and reveal a novel path through which limb identity may have emerged during evolution.

Keyphrases: Tbx4, Tbx5, Pitx1, Transcription, Développement des membres, Identité, Morphogénèse, Patrons squelettiques, Transgénèse, Tbx4, Tbx5, Pitx1, Transcription, Tbx4, Tbx5, Pitx1, Transcription, Tbx4, Tbx5, Pitx1, Transcription, Limb development, Identity, Morphogenesis, Skeletal pattern, Transgenesis