RNA recurrent motifs : identification and characterization

La détermination de la structure tertiaire du ribosome fut une étape importante dans la compréhension du mécanisme de la synthèse des protéines. Par contre, l’élucidation de la structure du ribosome comme tel ne permet pas une compréhension de sa fonction. Pour mieux comprendre la nature des relations entre la structure et la fonction du ribosome, sa structure doit être étudiée de manière systématique. Au cours des dernières années, nous avons entrepris une démarche systématique afin d’identifier et de caractériser de nouveaux motifs structuraux qui existent dans la structure du ribosome et d’autres molécules contenant de l’ARN.  L’analyse de plusieurs exemples d’empaquetage de deux hélices d’ARN dans la structure du ribosome nous a permis d’identifier un nouveau motif structural, nommé « G-ribo ». Dans ce motif, l’interaction d’une guanosine dans une hélice avec le ribose d’un nucléotide d’une autre hélice donne naissance à un réseau d’interactions complexes entre les nucléotides voisins. Le motif G-ribo est retrouvé à 8 endroits dans la structure du ribosome. La structure du G-ribo possède certaines particularités qui lui permettent de favoriser la formation d’un certain type de pseudo-nœuds dans le ribosome.  L’analyse systématique de la structure du ribosome et de la ARNase P a permis d’identifier un autre motif structural, nommé « DTJ » ou « Double-Twist Joint motif ». Ce motif est formé de trois courtes hélices qui s’empilent l’une sur l’autre. Dans la zone de contact entre chaque paire d’hélices, deux paires de bases consécutives sont surenroulées par rapport à deux paires de bases consécutives retrouvées dans l’ARN de forme A. Un nucléotide d’une paire de bases est toujours connecté directement à un nucléotide de la paire de bases surenroulée, tandis que les nucléotides opposés sont connectés par un ou plusieurs nucléotides non appariés. L’introduction d’un surenroulement entre deux paires de bases consécutives brise l’empilement entre les nucléotides et déstabilise l’hélice d’ARN. Dans le motif DTJ, les nucléotides non appariés qui lient les deux paires de bases surenroulées interagissent avec une des trois hélices qui forment le motif, offrant ainsi une stratégie élégante de stabilisation de l’arrangement. Pour déterminer les contraintes de séquences imposées sur la structure tertiaire d’un motif récurrent dans le ribosome, nous avons développé une nouvelle approche expérimentale.  Nous avons introduit des librairies combinatoires de certains nucléotides retrouvés dans des motifs particuliers du ribosome. Suite à l’analyse des séquences alternatives sélectionnées in vivo pour différents représentants d’un motif, nous avons été en mesure d’identifier les contraintes responsables de l’intégrité d’un motif et celles responsables d’interactions avec les éléments qui forment le contexte structural du motif. Les résultats présentés dans cette thèse élargissent considérablement notre compréhension des principes de formation de la structure d’ARN et apportent une nouvelle façon d’identifier et de caractériser de nouveaux motifs structuraux d’ARN. Although determination of the ribosome tertiary structure has been an outstanding step towards elucidation of the mechanism of protein synthesis, the complexity of this structure does not provide an easy answer of how this large molecular complex works. In order to understand the nature of structure-function relationships in the ribosome, the ribosome structure itself should be subjected to thorough analysis. In the last years, we undertook systematic efforts toward identification and characterization of all recurrent structural motifs existing in the ribosomal RNA and in other RNA-containing molecules.  The analysis of many instances of helix-helix packing in the ribosome structure allowed us to identify a new structural motif which we called “G-ribo”. In this motif, an interaction of the sugar edge of a guanosine in one helix with the ribose of a nucleotide from another helix was found to be at the origin of a complex network of concomitant inter-nucleotide interactions. In total, the G-ribo motif was found at eight locations within the ribosomal RNA. A surprising feature of this motif consists in its ability to favor the formation of pseudoknots of a particular type. In the ribosome structure, there are four pseudoknots whose formation is mediated by the G-ribo motif.  Systematic analysis of the ribosome as well as the RNAseP crystal structures allowed for the identification of a new RNA motif, which we called “DTJ”, or Double-Twist Joint motif. This motif is made of three short RNA double helices, which stack one on top of another. In the contact zone of each pair of helices two consecutive base pairs are over-twisted compared to the regular helical twist of 32° of A-RNA. One nucleotide of the base pair is always directly connected to the one nucleotide of the over-twisted base pair, while the opposite nucleotides of these base pairs are connected with one or several unpaired nucleotides. Introduction of the helical over-twist between two consecutive base pairs breaks the inter-nucleotide stacking and destabilizes the RNA double helix. In the DTJ, the unpaired nucleotides that connect the two over-twisted base pairs interact with one of the three motif-forming helices, providing an elegant strategy for the stabilization of the whole arrangement. To determine the nucleotide sequence constraints imposed on the structure of recurrent RNA motifs in the functional ribosome we developed a new approach consisting in the selection of functional ribosomes from a combinatorial gene library in which certain nucleotides of the rRNA gene corresponding to a particular motif were randomized. Comparison of the constraints determined for different examples of the same motif allowed us to distinguish between constraints responsible for the integrity of the motif and for its interaction with surrounding elements, including ribosomal proteins.  The work significantly improves our understanding of the principles of RNA structure formation and opens a new way to identify and characterize RNA motifs.

Keyphrases: Recurrent motif, G-ribo, Ribosome, Motif recurrent, Structure d’ARN, RNA structure, G-ribo, Ribosome, In vivo selection, Selection in vivo