Evaluation of mitochondrial function in a model of developmental programming of hypertension associated with transient neonatal oxygen exposure

UNE EXPOSITION NÉONATALE À L’OXYGÈNE MÈNE À DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: L’exposition à l’oxygène (O2) des ratons nouveau-nés a des conséquences à l’âge adulte dont une hypertension artérielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une néphropénie et des indices de stress oxydant. En considérant que les reins sont encore en développement actif lors des premiers jours après la naissance chez les rats, jouent un rôle clé dans le développement de l’hypertension et qu’une dysfonction mitochondriale est associé à une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions délétères néonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rénal sur la modulation de l’expression de protéines clés du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive d’espèces réactives de l’ O2.  Méthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposés à 80% d’O2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considérant que plusieurs organes des rats sont encore en développement actif à la naissance, ces rongeurs sont un modèle reconnu pour étudier les complications d’une hyperoxie néonatale, comme celles liées à une naissance prématurée chez l’homme.  À 4 et à 16 semaines, les reins sont prélevés et les mitochondries sont extraites suivant une méthode d’extraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et différentes centrifugations. L’expression des protéines mitochondriales a été mesurée par Western blot, tandis que la production d’ H202 et les activités des enzymes clés du cycle de Krebs ont été évaluées par spectrophotométrie. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± SD. Résultats: Les rats mâles H de 16 semaines (n=6) présentent une activité de citrate synthase (considéré standard interne de l’expression protéique et de l’abondance mitochondriales) augmentée (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), une diminution de l’activité d’aconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondrie), ainsi qu’une augmentation dans la production de H202 (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg protéines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mâles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) présente également une diminution dans l’expression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 unité relative, -23%; p<0.05), une protéine impliquée dans l’élimination d’ H202, de l’expression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 unité relative, -15%; p<0.05), une protéine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que l’expression de la protéine de découplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), impliquée dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmentée (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 unité relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines démontrent une augmentation significative de l’activité de l’aconitase (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondrie), de l’expression de l’ATP synthase sous unité β (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 unité relative, +25%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 unité relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que l’expression de Prx3 est significativement réduite (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 unité relative, -24%; p<0.05). À 4 semaines, les mâles H (vs Ctrl) présentent une augmentation significative de l’expression de Prx3 (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 unité relative, +31%; p<0.05) et les femelles présentent une augmentation significative de l’expression d’UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 unité relative, +18%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 unité relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition néonatale à l’O2 chez le rat adulte mène à des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associée à une augmentation dans la production d’espèces réactives de l’oxygène, suggérant que ces modifications mitochondriales  pourraient jouer un rôle dans l’hypertension artérielle et d’un stress oxydant, et par conséquent, être un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires.    Mots-clés: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygène, Stress Oxydant, Programmation EVALUATION OF MITOCHONDRIAL FUNCTION IN A MODEL OF DEVELOPMENTAL PROGRAMMING OF HYPERTENSION ASSOCIATED WITH TRANSIENT NEONATAL OXYGEN EXPOSURE Introduction: Rats exposed to oxygen (O2) as newborns suffer complications in adulthood, including: arterial hypertension, vascular dysfunction, nephropenia and indices of oxidative stress. Although the rats are born at term, their organ development is equivalent to that of a preterm fetus, allowing organs of interest such as the kidney to be compared to premature infants. Given that impaired nephrogenesis or reduced nephron numbers has been shown to promote the development of hypertension and mitochondrial dysfunction is associated with increased oxidative stress, we hypothesised that exposure to high oxygen concentrations in the neonatal period would significantly impact the expression and activity of key proteins involved in renal mitochondrial function and lead to an excessive production of reactive oxygen species by the mitochondria.  Methods: Sprague-Dawley rat pups were exposed to 80% O2 (Hyperoxic (H) group; O2 exposed) or 21% O2 (Control (Ctrl) group)  from day 3 to day 10 of life. At 4 and 16 weeks of age, kidneys were rapidly excised and the mitochondria isolated following a standard protocol; with a buffer containing 0.32 M sucrose and differential centrifugations. Expression of mitochondrial proteins was assessed by Western blot, whereas the release of hydrogen peroxide (H202), activities of key citric acid cycle enzymes and mitochondrial swelling were assessed by spectrophotometry. Results are expressed as the means ± SE. Both male and female offspring were studied. Results: In male H rats at 16 weeks of age (n=6), citrate synthase activity (internal standard and measure of relative mitochondrial abundance) was significantly increased (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), whereas aconitase activity (sensitive to ROS) was significantly decreased (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondria) and H202 release was significantly increased (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg mitochondrial protein) compared to the controls (Ctrl, n=6 males and 4 females). The H group (vs Ctrl) also demonstrated a reduction in the expression of peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 relative units, -23%; p<0.05), a protein involved in the elimination of H202 and in the expression of cytochrome C oxidase (Complex IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 relative units, -15%; p<0.05), a protein in the mitochondrial respiratory chain, whereas the expression of uncoupling protein-2 (UCP2), a protein involved in dissipating the proton gradient, was significantly increased (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 relative units, +17%; p<0.05). Female H rats (n=6) (vs Ctrl, n=6) at 16 weeks of age demonstrated a significant increase in aconitase activity (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondria), in the expression of ATP synthase β subunit (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 relative units, +25%; p<0.05) (involved in ATP production) and in the expression of MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 relative units, +20%; p<0.05) (mitochondrial antioxidant involved in scavenging superoxide), whereas Prx3 expression was significantly reduced (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 relative units, -24%; p<0.05 ).  In male H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age, the expression of Prx3 was significantly increased (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 relative units, +31%; p<0.05). Female H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age demonstrated a significant increase in the expression of UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 relative units, +18%; p<0.05) and in the expression of MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 relative units, +14%; p<0.05). Conclusion: The findings of this study demonstrate that transient oxygen exposure in the neonatal rat modifies protein expression, enzymatic activity and leads to indices of mitochondrial dysfunction (increase in ROS) in the adult kidney; these adverse changes in the mitochondria were more pronounced in adult males than in females. Overall, these findings,  suggest that impaired mitochondrial function is associated with and could play a role in the development of arterial hypertension, oxidative stress and cardiovascular disease associated with transient neonatal hyperoxic stress.  Keywords: Mitochondria, Hypertension, Kidneys, Developmental Programming, Oxygen, ROS

Keyphrases: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygène, Stress oxydant, Programmation, ROS, Mitochondria, Hypertension, Hypertension, ROS, Developmental programming, Mitochondria, Hypertension, Kidneys, Oxygen