Un nouveau clone et une nouvelle méthode pour la production et la purification de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli

Le gène de l’entérotoxine thermostable b (estB) d’Escherichia coli a été fusionné au gène de la protéine liant le maltose (malE) dans le vecteur pMAL-p via PCR. Par la suite, deux constructions plasmidiques ont été realisées à partir de ce nouveau vecteur, nommé pMAL-STb. Dans un premier temps, un marqueur hexahistidine (His6) a été ajouté entre malE et estB, et dans un deuxième temps, un marqueur décahistidine (His10) a été placé en amont de malE. La séquence signal de la protéine liant le maltose (MBP) dirige l’exportation de la protéine de fusion du cytoplasme vers le périplasme, où l’entérotoxine STb acquière sa conformation active. MBP est également reconnue pour améliorer le rendement et la solubilité de la protéine passagère tandis que le marqueur histidine, connu comme étant le meilleur marqueur d’affinité pour la purification protéique, facilite sa purification jusqu’à homogénéité. De plus, les gènes fusionnés sont sous le contrôle du promoteur tac (Ptac), un promoteur fort et inductible. Suite à l’induction par l’IPTG, la souche recombinante exprime une protéine d’environ 48 kDa, qui est facilement identifiable par électrophorèse à partir du surnageant obtenu via choc osmotique. Une séquence encodant un site de clivage spécifique au facteur Xa est présente dans le plasmide afin de séparer les marqueurs MBP et histidine de STb. Le clivage de la protéine de fusion avec le facteur Xa libère MBP (42 kDa) attachée au marqueur histidine et un polypeptide de 5.2 kDa, correspondant au poids moléculaire de STb mature. Avec cette méthode, nous visons à obtenir une méthode plus efficace pour la production et la purification de STb. The heat-stable enterotoxin b gene (estB) of Escherichia coli was fused to the gene for maltose-binding protein (malE) into the pMAL-p vector using PCR. Afterward, two plasmid constructs were realized from this new vector, named pMAL-STb. Firstly, a hexahistidine tag (His6) was added between malE and estB and secondly, a decahistidine tag (His10) was placed upstream of malE. The signal sequence of maltose-binding protein (MBP) directs the export of the fusion protein from the cytoplasm to the periplasm, where the enterotoxin STb acquires its active conformation. MBP is also known to improve the yield and solubility of the passenger protein while the histidine tag, viewed as the best affinity tag for protein purification, facilitates its purification to homogeneity. Furthermore, the fused genes are controlled by the tac promoter (Ptac), a strong inducible promoter. Following IPTG induction, the recombinant strain expressed a protein of approximately 48 kDa, which is easily identified from osmotic shock fluid following electrophoresis. A sequence encoding a factor Xa cleavage site is present in the plasmid to separate MBP and histidine tags from STb. The cleavage of the fusion protein with factor Xa generates the maltose-binding protein (42 kDa) attached to the histidine tag and a polypeptide of 5.2 kDa, corresponding to the molecular mass of mature STb. With this method, we aim at obtaining a more efficient way to produce and purify STb.

Keyphrases: Protéine liant le maltose (MBP), Hexahistidine (His6), Escherichia coli, entérotoxine STb, Production, purification, Escherichia coli, purification, Maltose binding protein (MBP), STb enterotoxin, Decahistidine (His10)