Rôle fonctionnel de l'interaction du CD154 avec le CD40 associé au CD20

Le CD154 est une glycoprotéine transmembranaire de type II de 33-39 KDa appartenant à la famille des TNF (Tumor Necrosis Factor). Cette molécule est exprimée sous forme trimérique, d’une façon inductible et transitoire à la surface de plusieurs types cellulaires et principalement à la surface des lymphocytes T et des plaquettes activées. Le CD154 existe aussi sous une forme soluble de 18 KDa (sCD154) provenant en partie d’un clivage enzymatique de la membrane des cellules T activées et demeure un trimère biologiquement actif. Une corrélation étroite existe entre l’augmentation du niveau plasmatique du sCD154, chez les patients atteints de différentes pathologies auto-immunes ou cardiovasculaires, et la progression de ces pathologies.  Le CD40 est le récepteur principal du CD154. L’interaction du CD154 avec le CD40 induit des signaux bidirectionnels et elle est cruciale lors de la liaison des cellules T aux cellules B induisant par la suite une prolifération cellulaire, une production des cytokines, une différenciation des cellules B, la commutation isotypique des immunoglobulines et l’apoptose. D’autre part, le CD40 se trouve associé physiquement au CD20 à la surface des cellules B. Le CD20 ne possède pas de ligand et son rôle biologique est peu connu. Cependant, il présente des propriétés apoptotiques très importantes suite à sa liaison aux anticorps monoclonaux, tel que le Rituximab. Ce dernier a montré une efficacité très importante dans le traitement des maladies auto-immunes et de différents types de cancer. Outre le CD40, trois autres molécules appartenant à la famille des intégrines, l’αIIbβ3, l’α5β1 et l’αMβ2 ont été identifiées comme récepteurs du CD154. Nous avons montré que le CD154 interagit avec ces quatre récepteurs via différents résidus induisant ainsi différentes réponses biologiques. Cependant, nous avons démontré que seul le CD40, sous sa forme soluble ou membranaire, est capable d’induire le clivage du CD154 de la surface des cellules T. Ce clivage est médié par l’activation des ADAM-10 et ADAM-17 par la voie de la PKC. Le travail illustré dans cette thèse consiste à étudier le rôle fonctionnel de l’association du CD40 avec le CD20 et l’effet de cette association sur les réponses induites par le couple CD154/CD40; ainsi qu’à étudier l’impact des signaux bidirectionnels, induits par ce couple, dans la régulation de ces réponses.  Les résultats générés dans cette thèse montrent que l’association du CD40 avec le CD20 amplifie la mort cellulaire induite via le CD40 ou via le CD20, et que les signaux provenant du CD40 sont impliqués dans cette amplification. Cette association amplifie aussi le clivage du CD154. Cependant, la délétion du domaine cytoplasmique du CD40 affecte ce clivage, ce qui montre que les signaux provenant du CD40 sont impliqués aussi dans l’amplification de cette réponse cellulaire. De plus, une double délétion des domaines cytoplasmiques du CD40 et du CD154, abolit complètement le clivage du CD154. Et, comme le sCD154 joue un rôle dans la progression de plusieurs maladies, nous avons généré une forme CD154 résistante au clivage qui a montré une cytotoxicité plus importante que la forme normale clivable, due à la rétention du CD154 à la membrane cellulaire induisant des signaux pro-apoptotiques plus soutenus. Cette forme résistante a montré aussi une efficacité plus prononcée dans d’autres réponses cellulaires B comme la prolifération et la production des immunoglobulines. Ce travail va nous permettre d’élargir nos connaissances sur le rôle du couple CD154/CD40 dans la régulation de certaines réponses cellulaires, ainsi que celui de l’association du CD40 avec le CD20 dans l’amplification de ces réponses visant à optimiser le rendement de ces molécules dans le traitement de plusieurs maladies auto-immunes, cardiovasculaires et même dans le cancer. CD154 is a 33-39 KDa type II transmembrane glycoprotein, belonging to the TNF (Tumor Necrosis Factor) superfamily. This molecule is expressed in a trimeric, inducible and transient form on the surface of several cell types, mainly on the surface of activated T cells and platelets. CD154 also exists in a soluble form with a molecular weight of 18 KDa (sCD154). This form comes in part from an enzymatic cleavage of the membrane bound CD154 on activated T cells and remains a biological active trimer. A close correlation exists between the increase of sCD154 in the plasma and the progression of the pathology in various autoimmune or cardiovascular diseases.  CD40 is the principal receptor of CD154. The interaction of CD154 with CD40 induces a bidirectional signal which is crucial for T-B cells interaction involving cell proliferation, cytokine production, B-cell differentiation, isotypic immunoglobulin switching and apoptosis. On the other hand, CD40 is physically associated with CD20 on the surface of B cells. Until now, CD20 has no ligand and its biological role is little known. However, this molecule has a very important apoptotic function using monoclonal antibodies such as Rituximab. The latter has shown a very important efficacy in the treatment of cancer and different autoimmune diseases. In addition to CD40, three other receptors of CD154 have been identified: αIIbβ3, α5β1 and αMβ2, belonging to the integrin family. CD154 interacts with these four receptors via different residues and induces different biological responses. However, we have demonstrated that only CD40, in its soluble or membrane form, is capable of inducing CD154 cleavage from the surface of T cells. This cleavage is mediated by the activation of ADAM-10 and ADAM-17 by the PKC pathway. The work illustrated in this thesis consists in studying the functional role of the association of CD40 with CD20 and the effect of this association on the responses induced by the CD154/CD40 dyad; and in determining the impact of the bidirectional signals, induced by this dyad, in the regulation of these responses. The results generated here show that the association of CD40 with CD20 amplifies cell death induced via CD40 or via CD20, and that signals from CD40 are involved in this amplification. This association also up-regulated the cleavage of CD154. However, the deletion of the cytoplasmic domain of CD40 affects this cleavage, showing that the signals from CD40 are also involved in this response. In addition, the deletion of the cytoplasmic domains of both CD40 and CD154, abolished completely the cleavage of CD154. Since sCD154 plays a role in the progression of several diseases, we have generated a non-cleavable form of CD154 that has shown greater cytotoxicity than the cleavable form, due to the retention of CD154 at the cell membrane inducing more pronounced signals. This form also showed more pronounced efficacy in others B cell responses such as proliferation and immunoglobulin production. This work will allow us to broaden our knowledge on the role of the CD154/CD40 couple in the regulation of many cellular responses, as well as that of the association of CD40 with CD20 in the amplification of these responses in order to optimize the outcome of these molecules in the treatment of several autoimmune diseases, cardiovascular and even in cancer.

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