Histone H3 lysine 56 acetylation and deacetylation pathways as targets for novel antifungal therapies in Candida albicans

Candida albicans est un important agent pathogène fongique opportuniste qui est inoffensif pour les individus en bonne santé, mais provoque des infections systémiques potentiellement mortelles chez les personnes dont le système immunitaire est compromis. L’infection invasive causée par C. albicans chez les patients immunodéprimés conduit à un taux de mortalité significatif. Les options thérapeutiques actuelles sont limitées par l'émergence de souches pharmaco- résistantes ou d'effets secondaires indésirables. Par conséquent, il existe un besoin urgent de trouver de nouvelles cibles de médicaments spécifiques à ces levures pour surmonter les limites des médicaments existants. Cette thèse consiste en deux articles de recherche.  Le premier article fait l’étude de l'acétylation de l'histone H3 lysine 56 (H3K56), une modification post-traductionnelle abondante qui joue un rôle important dans la survie des dommages à l'ADN et favorise la virulence chez C. albicans. H3K56 est acétylée par l'histone acétyltransférase Rtt109 (HAT), et désacétylée par Hst3 (HDAC). Ces deux enzymes ont des propriétés spécifiques aux levures et sont des cibles antifongiques prometteuses. Des études antérieures chez Saccharomyces cerevisiae ont montré que les chaperons d'histones ScAsf1 et ScVps75 contrôlent l'activité de ScRtt109 et la spécificité du substrat. ScRttl09 et ScAsfl agissent de manière concertée pour acétyler H3K56, tandis que le complexe ScRttl09-Vps75 acétyle plusieurs résidus de lysine dans la queue N-terminale de l'histone H3. Chez C. albicans, les rôles de Rtt109 et H3K56ac dans la survie aux dommages de l'ADN sont conservés. Cependant, les spécificités fonctionnelles et de substrat de CaRtt109 quand elle coopère avec les chaperones d'histone CaAsf1 ou CaVps75 n'ont pas été étudiées. Dans cette étude, nous avons utilisé des méthodes de génétique, de biochimie et de spectrométrie de masse pour identifier et caractériser les rôles de Asf1 ou Vps75 et leur fonctionnement avec Rtt109 chez C. albicans. De manière inattendue, les cellules de C. albicans dépourvues de Vps75 présentent des niveaux plus faibles de H3K56ac que les cellules de type sauvage et, conséquemment, sont plus résistantes que les cellules de type sauvage au nicotinamide, un inhibiteur de la sirtuine Hst3 qui tue les cellules de C. albicans en provoquant une hyperacétylation de H3K56 et des dommages irréparables à l'ADN. Nous mettons en évidence que l'holoenzyme CaRtt109-Vps75 peut directement acétyler H3K56 in vitro. Nous montrons également que les faibles niveaux inattendus de H3K56ac trouvés dans des cellules dépourvues de Vps75 peuvent être attribués, au moins en partie, à l'instabilité de Rtt109 en l'absence de son partenaire Vps75. De plus, nos études montrent que, en plus d'aider Rtt109 à promouvoir   H3K56ac, Asf1 est essentiel pour la viabilité de C. albicans où il joue un rôle dans le maintien de l'intégrité des chromosomes.  Hst3 appartient à la classe des désacétylases NAD+, appelées sirtuines, qui peuvent être inhibées par le produit de la réaction nicotinamide (NAM). L'inhibition de Hst3 par NAM conduit à une hyper-acétylation de H3K56, à des dommages catastrophiques à l'ADN et à la létalité. Dans un effort pour améliorer le potentiel clinique de NAM, nous avons étudié son devenir métabolique chez C. albicans. NAM est un précurseur d'une voie de sauvetage canonique qui génère NAD +. Nous avons émis l'hypothèse que les cellules dépourvues de Pnc1 nicotinamidase, qui convertit le NAM en acide nicotinique (NA), seraient plus sensibles au NAM que les cellules de type sauvage. Malgré le fait que Pnc1 était la seule nicotinamidase chez C. albicans, les concentrations de NAM et la cytotoxicité étaient, au mieux, légèrement plus élevées chez les mutants pnc1 que chez les cellules de type sauvage. Ces résultats suggèrent l'existence d'un mécanisme indépendant de Pnc1 qui limite l'accumulation de NAM et, par conséquent, restreint sa capacité à inhiber Hst3. Pour identifier le mécanisme sous-jacent, nous avons généré plusieurs mutants dépourvus d'enzymes impliquées dans la biosynthèse de NAD+ et effectué des expériences avec la NAM marquée aux isotopes lourds et la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent l'existence d'une conversion non-canonique, indépendante de Pnc1, de NAM en NAD+ qui n'a jamais été rapportée chez les champignons. Nous montrons que cette conversion se produit, au moins en partie, par l'inversion de l'activité de la sirtuine et fournit l'évidence de l'inversion des sirtuines in vivo. Cependant, nous avons pu démontrer que cette voie ne peut pas être la seule source de NAD+ et maintenir la viabilité aux concentrations physiologiques de NAM. Candida albicans is a major opportunistic fungal pathogen that is harmless to healthy individuals but causes life-threatening systemic infections in individuals whose immune system is compromised. Invasive infection caused by C. albicans in immunocompromised patients leads to a significant mortality. Current therapeutic options are limited by the emergence of drug resistant strains or adverse side effects. Hence, there is an urgent need to find novel fungal-specific drug targets to overcome the limitations of existing drugs. This thesis consists of two research articles.  The first article studies histone H3 lysine 56 (H3K56) acetylation, an abundant post-translational modification that plays an important role in the survival of DNA damage and promotes virulence in C. albicans. H3K56 is acetylated by the histone acetyltransferase Rtt109 (HAT), and deacetylated by Hst3 (HDAC). Both of these enzymes have fungal-specific properties and are promising antifungal targets. Previous studies in Saccharomyces cerevisiae have shown that the histone chaperones ScAsf1 and ScVps75 control ScRtt109 activity and substrate specificity. ScRtt109 and ScAsf1 act in a concerted fashion to acetylate H3K56, whereas the ScRtt109-Vps75 complex acetylates several lysine residues in the N- terminal tail of histone H3. In C. albicans, the roles of Rtt109 and H3K56ac in DNA damage survival are conserved. However, the functional and substrate specificities of CaRtt109 when it co-operates with the histone chaperones CaAsf1 or CaVps75 have not been studied. In this study, we used genetic, biochemical and mass spectrometry methods to identify and characterize the roles of Asf1 or Vps75 when they function with Rtt109 in C. albicans. Unexpectedly, C. albicans cells lacking Vps75 exhibit lower levels of H3K56ac than wild-type cells and, consistent with this, are more resistant than wild-type cells to nicotinamide, an inhibitor of the sirtuin Hst3 that kills C. albicans cells by causing hyperacetylation of H3K56 and irreparable DNA damage. We provide evidence that the CaRtt109-Vps75 holoenzyme can directly acetylate H3K56 in vitro. We also show that the unexpectedly low levels of H3K56ac found in cells lacking Vps75 can be attributed, at least in part, to instability of Rtt109 in the absence of its partner Vps75. Our studies also show that, apart from assisting Rtt109 to promote H3K56 acetylation, Asf1 is essential for viability in C. albicans where it plays a role in the maintenance of chromosome integrity.  Hst3 belongs to the class of NAD+-dependant deacetylases called sirtuins, which can be inhibited by the reaction product nicotinamide (NAM). Hst3 inhibition by NAM leads to hyper-acetylation of H3K56, catastrophic DNA   damage and lethality. In an effort to enhance the clinical potential of NAM, we studied its metabolic fate in C. albicans. NAM is a precursor of a canonical salvage pathway that generates NAD+. We hypothesized that cells lacking the Pnc1 nicotinamidase, which converts NAM into nicotinic acid (NA), would be more sensitive to NAM than wild-type cells. Despite the fact that Pnc1 was the sole nicotinamidase in C. albicans, NAM concentrations and cytotoxicity were, at best, modestly higher in pnc1 mutants than in wild-type cells. These results suggest the existence of a Pnc1-independent mechanism that limits the accumulation of NAM and, therefore, restricts its ability to inhibit Hst3. To identify the underlying mechanism, we generated several mutants lacking enzymes involved in the biosynthesis of NAD+ and performed experiments with heavy isotope-labeled NAM and mass spectrometry. Our results demonstrate the existence of a non- canonical, Pnc1-independent conversion of NAM into NAD+ that has never been reported in fungi. We show that this conversion occurs, at least in part, through reversal of sirtuin activity and provide the evidence of sirtuins reversal in vivo. However, we were able to demonstrate that this pathway cannot serve as the only source of NAD+ and sustain viability at physiological NAM concentrations.

Keyphrases: Candida albicans, Rtt109, Nicotinamide, Candida albicans, Acétylation de l'histone H3 lysine 56 (H3K56ac), Rtt109, Nicotinamide, Histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56ac)