Étude du mécanisme d’augmentation de la relâche virale par la protéine Vpu du VIH-1

Les différentes protéines accessoires du VIH-1, l’agent étiologique du SIDA, optimisent la réplication et la propagation du virus in vivo. Parmi ces dernières figure Vpu, l’antagoniste du facteur de restriction nommé Tetherin qui prévient la relâche des particules virales à partir de la surface de cellules infectées. En diminuant son expression de surface, Vpu prévient l’incorporation de ce facteur de restriction dans la particule virale en formation et conséquemment, empêche la formation d’une ancre protéique reliant le virus mature à la membrane plasmique de la cellule infectée. La mécanistique sous-jacente n’était cependant pas connue. Cette présente thèse relate nos travaux exécutés afin d’élucider la dynamique des mécanismes cellulaires responsables de cet antagonisme. Une approche de mutagénèse dirigée a d’abord permis d’identifier deux régions contenant des déterminants de la localisation de Vpu dans le réseau trans-Golgi (RTG), puis de démontrer la relation existante entre cette distribution et l’augmentation de la relâche des particules virales. Des expériences subséquentes de marquage métabolique suivi d’une chasse exécutées dans des systèmes cellulaires où Tetherin est exprimée de façon endogène ont suggéré le caractère dispensable de l’induction par Vpu de la dégradation du facteur de restriction lors de son antagonisme. En revanche, une approche de réexpression de Tetherin conduite en cytométrie en flux, confirmée en microscopie confocale, a mis en évidence une séquestration de Tetherin dans le RTG en présence de Vpu, phénomène qui s’est avéré nécessiter l’interaction entre les deux protéines. L’usage d’un système d’expression de Vpu inductible conjugué à des techniques de cytométrie en flux nous a permis d’apprécier l’effet majeur de Vpu sur la Tetherin néo-synthétisée et plus mineur sur la Tetherin de surface. En présence de Vpu, la séquestration intracellulaire de la Tetherin néo-synthétisée et la légère accélération de l’internalisation naturelle de celle en surface se sont avérées suffisantes à la réduction de son expression globale à la membrane plasmique et ce, à temps pour l’initiation du processus de relâche virale.  À la lumière de nos résultats, nous proposons un modèle où la séquestration de la Tetherin néo-synthétisée dans le RTG préviendrait le réapprovisionnement de Tetherin en surface qui, combinée avec l’internalisation naturelle de Tetherin à partir de la membrane plasmique, imposerait l’établissement d’un nouvel équilibre de Tetherin incompatible avec une restriction de la relâche des particules virales. Cette thèse nous a donc permis d’identifier un processus par lequel Vpu augmente la sécrétion de virus matures et établit une base mécanistique nécessaire à la compréhension de la contribution de Vpu à la propagation et à la pathogénèse du virus, ce qui pourrait mener à l’élaboration d’une stratégie visant à contrer l’effet de cette protéine virale. All accessory proteins of HIV-1, the ethiologic agent of AIDS, are thought to optimize viral replication and propagation in vivo. Among them, Vpu antagonizes Tetherin, a cellular factor that inhibits viral particle release. Downregulation of cell-surface Tetherin by Vpu is believed to prevent incorporation of this restriction factor into nascent viral particles, which would impede the formation of a Tetherin-derived protein anchor that bridges the virus to the plasma membrane of the infected cell. This thesis presents our studies on cellular mechanisms governing Tetherin antagonism by Vpu. A directed mutagenesis approach first identified two regions encompassing determinants of the localization of Vpu in the trans-Golgi network, and it correlated this intracellular distribution with enhanced release viral particle. Pulse-chase experiments in cellular systems wherein Tetherin was endogenously expressed showed that Vpu-induced Tetherin degradation is dispensable for restriction. In contrast, both a flow cytometry-based Tetherin re-expression assay and confocal microscopy analyses demonstrated that Vpu-mediated sequestration of Tetherin in the trans-Golgi network, a phenomenon that appeared to be triggered by the transmembrane association of the two proteins, was necessary for release inhibition. Vpu inducible expression in flow cytometry-based experiments provided evidence for an optimal antagonism of Tetherin at 6h after Vpu expression, following the interruption of Tetherin re-supply and a to the modest acceleration of the natural clearance of surface-localized Tetherin. Our work supports a model in which Tetherin sequestration in the trans-Golgi network prevents its re-supply, which, combined with its clearance from the surface, imposes a new equilibrium at the plasma membrane that is incompatible with the restriction of viral particle release. Overall, this thesis sheds light on the processes by which Vpu enhances the secretion of mature viruses and it establishes a mechanistic basis that could serve as starting point for the development of strategies aimed at interfering with Tetherin functions.

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