Développement et caractérisation d’une méthode photonique pour créer des distributions spatiales de protéines

Les cellules sont capables de détecter les distributions spatiales de protéines et ainsi de migrer ou s’étendre dans la direction appropriée. Une compréhension de la réponse cellulaire aux modifications de ces distributions spatiales de protéines est essentielle pour l’avancement des connaissances dans plusieurs domaines de recherches tels que le développement, l’immunologie ou l’oncologie. Un exemple particulièrement complexe est le guidage d’axones se déroulant pendant le développement du système nerveux. Ce dernier nécessite la présence de plusieurs distributions de molécules de guidages étant attractives ou répulsives pour connecter correctement ce réseau complexe qu’est le système nerveux. Puisque plusieurs indices de guidage collaborent, il est particulièrement difficile d’identifier la contribution individuelle ou la voie de signalisation qui est déclenchée in vivo, il est donc nécessaire d’utiliser des méthodes pour reproduire ces distributions de protéines in vitro. Plusieurs méthodes existent pour produire des gradients de protéines solubles ou liées aux substrats. Quelques méthodes pour produire des gradients solubles sont déjà couramment utilisées dans plusieurs laboratoires, mais elles limitent l’étude aux distributions de protéines qui sont normalement sécrétées in vivo. Les méthodes permettant de produire des distributions liées au substrat sont particulièrement complexes, ce qui restreint leur utilisation à quelques laboratoires. Premièrement, nous présentons une méthode simple qui exploite le photoblanchiment de molécules fluorescentes pour créer des motifs de protéines liées au substrat : Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). Cette méthode permet de produire des motifs de protéines complexes d’une résolution micrométrique et d’une grande portée dynamique. Une caractérisation de la technique a été faite et en tant que preuve de fonctionnalité, des axones de neurones du ganglion spinal ont été guidés sur des gradients d’un peptide provenant de la laminine. Deuxièmement, LAPAP a été amélioré de manière à pouvoir fabriquer des motifs avec plusieurs composantes grâce à l’utilisation de lasers à différentes longueurs d’onde et d’anticorps conjugués à des fluorophores correspondants à ces longueurs d’onde. De plus, pour accélérer et simplifier le processus de fabrication, nous avons développé LAPAP à illumination à champ large qui utilise un modulateur spatial de lumière, une diode électroluminescente et un microscope standard pour imprimer directement un motif de protéines. Cette méthode est particulièrement simple comparativement à la version originale de LAPAP puisqu’elle n’implique pas le contrôle de la puissance laser et de platines motorisées, mais seulement d’envoyer l’image du motif désiré au modulateur spatial. Finalement, nous avons utilisé LAPAP pour démontrer que notre technique peut être utilisée dans des analyses de haut contenu pour quantifier les changements morphologiques résultant de la croissance neuronale sur des gradients de protéines de guidage. Nous avons produit des milliers de gradients de laminin-1 ayant différentes pentes et analysé les variations au niveau du guidage de neurites provenant d’une lignée cellulaire neuronale (RGC-5). Un algorithme pour analyser les images des cellules sur les gradients a été développé pour détecter chaque cellule et quantifier la position du centroïde du soma ainsi que les angles d’initiation, final et de braquage de chaque neurite. Ces données ont démontré que les gradients de laminine influencent l’angle d’initiation des neurites des RGC-5, mais n’influencent pas leur braquage. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse faciliteront l’utilisation de motifs de protéines liées au substrat dans les laboratoires des sciences de la vie, puisque LAPAP peut être effectué à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope standard légèrement modifié. Cela pourrait contribuer à l’augmentation du nombre de laboratoires travaillant sur le guidage avec des gradients liés au substrat afin d’atteindre la masse critique nécessaire à des percées majeures en neuroscience. Cells are able to sense spatial distribution of proteins and accordingly migrate or extend in the appropriate direction. Understanding cellular responses to modifications in molecular spatial distributions is essential for advances in several fields such as development, immunology and oncology. A particularly complex example is axonal guidance that occurs during the development of the nervous system, which relies on distributions of attractive and repulsive guidance molecules to correctly wire this intricate network. Since several guidance cues collaborate to development of the nervous system, it is particularly difficult to assess the individual contribution of each cue and the signaling cascade each trigger in vivo; therefore methods to reproduce those distributions individually in vitro are necessary to study in detail the effect of each guidance cue. Several methods exist to produce graded distributions of protein that are either soluble or substrate-bound. A few methods making solution gradients are already widely used in several laboratories to perform experiments with the guidance cues that are normally diffusing in vivo. However, current methods allowing the fabrication of substrate-bound gradients are quite complex, which restrict their use to a few laboratories. First, we present a straightforward method exploiting photobleaching of a fluorescently tagged molecule using a visible laser to generating substrate-bound protein patterns: Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). This method allows producing complex patterns of protein with micron spatial resolution and high dynamic range. An extensive characterization of the technique was performed and as proof of functionality, axons from dorsal root ganglions cells were guided on laminin peptide gradients. Secondly, LAPAP was improved in order to produce multicomponent patterns by using lasers at different wavelengths and antibodies conjugated to fluorophores corresponding to these wavelengths. Moreover, to speed-up the fabrication process and simplify the device, we developed widefield illumination LAPAP which uses a spatial light modulator, a light emitting diode and a standard microscope to directly print patterns. This patterning method is relatively simple compared to the original LAPAP setup, since it does not involve controlling the laser power or a motorized stage, but only sends an image of the desired pattern to a spatial light modulator. Finally, we used LAPAP to show how it could be used in automated high-content screening assays to quantify the morphological changes resulting from axon growth on gradients of guidance proteins. We produced thousands of laminin-1 gradients of different slopes and analyzed the variations in neurite guidance of neuron-like cells (RGC-5). An image analysis algorithm was developed to process bright field microscopy images, detecting each cell and quantifying the soma centroid and the initiation, terminal and turning angles of the maximal neurite. This data showed that laminin gradients influence the initiation angle of neurite extension of RGC-5, but does not contribute to its turning. We believe that the results presented in this thesis will facilitate the use of substrate- bound protein patterning in typical life science laboratories, since a confocal microscope or a slightly modified standard microscope is the only specialized equipment needed to fabricate patterns by LAPAP. This could increase the number of laboratories working with substrate-bound protein patterns in order to reach the critical mass necessary for major advances in neuroscience.

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