Rôle des GTPases ARF dans la migration  des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité.  De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO.  Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse. ARF6 and ARF1 are small GTPases of the ARF family(s) that regulate several signalling pathways including vesicles trafficking, lipid membrane remodelling and actin cytoskeleton reorganization. To date, the role of ARF6 and ARF1 in GPCR and RTK signalling, in endothelial cells, is little known. In this thesis, we aimed to characterize the role of ARF6 in the migration of endothelial cells induced by Enodothelin-1, and the role of ARF1 in the secretion of NO induced by VEGF.  We show that ARF6 is essential for endothelial cell migration induced by endothelin-1. Inhibition of ARF6 expression using RNA interference markedly impaired basal and ET-1 stimulated cell migration. In this condition, FAK is found constitutively associated with Src. In contrast, depletion of ARF6 impairs the ability of GIT1 to form an agonist-promoted complex with FAK, thereby preventing disassembly of focal adhesions. As a consequence, adhesion of ARF6-depleted endothelial cells is increased and their motility is reduced. Furthermore, our result shows that ARF1 GTPase is essential for the activation of eNOS and the secretion of NO following VEGFR2 activation in endothelial cells.  Inhibition of ARF1 expression using RNA interference markedly impaired the recruitment of Akt to the plasma membrane and its phosphorylation by the VEGF. As a consequence, the inhibition of Akt leads to an inhibition of eNOS, a well known downstream target, which in turn leads to inhibition of NO production.  All together, our results indicate that ARF6 and ARF1 are essential for the ETB and the VEGFR2 signalling leading to cell migration and NO secretion respectively, two required steps for angiogenesis.

Keyphrases: ARF6, ARF1, FAK, Src, GIT, ETB, Migration, NO, eNOS, Akt, ARF6, ARF1, FAK, Src, GIT, ETB, Migration, NO, eNOS, Akt