Régulation du complexe suppresseur de tumeurs BAP1/ASXL2 par ubiquitination

Introduction:  La monoubiquitination de l'histone H2A sur la lysine 119 (H2AK119ub) est une modification épigénomique, catalysée par le complexe Polycomb PRC1 par le biais de l’ubiquitine ligase Ring1B /BMI1. Cette modification joue un rôle important dans la régulation de l’expression génique, et est ainsi requise pour le contrôle de plusieurs processus cellulaires associés au développement et à la prolifération cellulaire. Cette modification est reversée par la déubiquitinase (DUB) BAP1, un suppresseur de tumeurs qui constitue la DUB la plus fréquemment mutée dans les cancers humains. Chez la drosophile, la déubiquitination de H2AK118ub, l’analogue de H2AK119ub, est catalysée par la protéine du groupe Polycomb Calypso, l’orthologue de BAP1, qui se trouve associée à son partenaire ASX, et forme ce qu’on appelle le complexe répresseur Polycomb (PR-DUB).  Nous avons précédemment montré que BAP1 forme, chez les mammifères, deux complexes mutuellement exclusifs avec des facteurs de la famille des protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2), qui sont deux orthologues d'ASX. L’association de BAP1 avec ASXL1/2 stimule son activité DUB et ceci est nécessaire pour une coordination harmonieuse du cycle cellulaire. Mais comment BAP1 agit en tant que suppresseur de tumeurs et comment ces protéines associées sont régulées au niveau moléculaire demeurent des questions importantes. De manière très intéressante, nous avons identifié une monoubiquitination constitutive qui apparait sur ASXL1/2 seulement en présence de BAP1, et nous avons émis l'hypothèse que cet événement de monoubiquitination joue un rôle essentiel dans la stabilité protéique du complexe BAP1/ASXL1/2 et la coordination de la fonction DUB de ce dernier.                                                                                                                                                                                   Méthodes et résultats: Dans notre étude, nous nous sommes intéressés au régulateur transcriptionnel ASXL2, qui interagit, via son domaine ASXM2, avec le domaine C-terminal (CTD) de BAP1. Cette interaction engendre une monoubiquitination qui se produit sur la lysine 370 du domaine ASXM2 et qui régule la fonction du complexe BAP1/ASXL2. De manière intéressante, la monoubiquitination de la lysine K370 stabilise ASXL2, mais peut aussi amorcer sa polyubiquitination et sa dégradation par le protéasome. De plus, nous avons démontré que la monoubiquitination d’ASXL2 stimule l’activité DUB de BAP1 envers H2AK119ub. En conduisant un criblage siRNA des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine (E2) et des DUBs du génome humain, nous avons démontré que la monoubiquitination d’ASXM2 est directement catalysé par les membres de la famille UBE2E (UBE2E1, UBE2E2 et UBE2E3) et est reversée par la déubiquitinase protéasomale PSMD14.  Au niveau cellulaire, nous avons observé que l’expression d’une forme mutée d’ASXL2 sur son site d’ubiquitination, K370R, retarde la prolifération cellulaire. Un délai de prolifération cellulaire est aussi observé suite à la déplétion d’UBE2E3 par l’approche CRISPR/Cas9.   Enfin, nous avons identifié des mutations de BAP1, retrouvés dans certains cancers, qui abolissent la monoubiquitination d’ASXL2 et ceci est observé lorsque ces formes mutées de BAP1 sont exprimées dans des cellules humaines suggérant ainsi l'importance de cette modification post-traductionnelle dans la suppression tumorale.  Conclusion et pertinence:  Nos résultats indiquent que BAP1 et ASXL2 sont intimement co-régulés par l’ubiquitination de ce dernier. Cela permet au complexe BAP1/ASXL2 de réguler son activité DUB et permettre une prolifération normale des cellules, empêchant ainsi la transformation maligne. Comprendre comment le complexe BAP1 est régulé par ces cofacteurs ASXL1/2 nous permettra de mieux établir son rôle suppresseur de tumeurs, et ainsi conduire au développement de nouvelles thérapies contre le cancer. Introduction: Monobiquitination of histone H2A on lysine 119 (H2AK119ub) is an epigenomic modification catalyzed by the Polycomb complex PRC1 via its ubiquitin ligase Ring1B/BMI1. This modification plays an important role in the regulation of gene expression, and is required for the control of several cellular processes associated with cell development and proliferation. This modification is reversed by the deubiquitinase (DUB) BAP1, a tumor suppressor considered as the most frequently mutated DUB in human cancers. In Drosophila, the deubiquitination of H2AK118ub, the analog of H2AK119ub, is catalyzed by the Polycomb protein Calypso, the ortholog of BAP1, which is associated with its partner ASX, and forms the Polycomb repressor complex (PR-DUB). We have previously shown that BAP1 forms, in mammals, two mutually exclusive complexes with two factors of the Polycomb proteins family, ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/2), which are two ASX orthologs. The association of BAP1 with ASXL1/2 stimulates its DUB activity and is necessary for the normal coordination of the cell cycle. But how BAP1 acts as a tumor suppressor, and how these associated proteins are regulated at the molecular level remain important questions to be addressed. Interestingly, we identified a constitutive monoubiquitination that appears on ASXL1/2 only in the presence of BAP1, and we hypothesized that this monoubiquitination event plays an essential role in the protein stability of the BAP1/ASXL1/2 complex and the coordination of its DUB function.                                                                                                                                                           Methods and results: In our study, we were interested in the ASXL2 transcriptional regulator, which interacts, via its ASXM2 domain, with the C-terminal domain (CTD) of BAP1. This interaction results in a monoubiquitination event on lysine 370 of the ASXM2 domain and this regulates the function of the BAP1/ASXL2 complex. Interestingly, monoubiquitination of lysine K370 stabilizes ASXL2, but can also initiate polyubiquitination and degradation by the proteasome. In addition, we demonstrated that monoubiquitination of ASXL2 stimulates DUB activity of BAP1 on H2AK119ub. By conducting siRNA screening of ubiquitin conjugating enzymes (E2) and DUBs of all the human genome, we demonstrated that monoubiquitination of ASXM2 is directly catalyzed by members of the UBE2E family (UBE2E1, UBE2E2 and UBE2E3) and is reversed by the proteasomal DUB PSMD14. At the cellular level, we have observed that the expression of a mutated form of ASXL2 on its ubiquitination site, K370R, delays cell proliferation. The same delay of cell proliferation is also observed following the depletion of UBE2E3 by the CRISPR/Cas9 approach. Finally, we have identified cancer mutations of BAP1, which abolish the monoubiquitination of ASXM2 when expressed in human cells, suggesting the importance of this post-translational modification for tumor suppression.  Conclusion and relevance: Our results indicate that BAP1 and ASXL2 are tightly co-regulated by ubiquitination. This allows the BAP1/ASXL2 complex to control its DUB activity and function, promoting normal cell proliferation and preventing malignant transformation. In conclusion, understanding how the BAP1 complex is regulated by ASXL1/2 cofactors will allow us to better establish its tumor suppressor role, and this might help in the development of new therapies against cancer.

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