Optimisation du vecteur adénoviral pour la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine.  La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo.  La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, progressive and orphan disease that is characterized by the absence of the functional muscle protein dystrophin. Gene therapy is currently investigated as a therapeutic approach to deliver dystrophin into muscles. Helper-dependent adenoviral vectors (HD) are promising gene transfer vehicles for gene therapy of DMD. Because HD are devoid of all adenoviral genes, they are weakly toxic, poorly immunogenic and possess sufficient cargo capacity to carry the full-length dystrophin cDNA. Although HD can provide dystrophin therapeutically in dystrophic mice, gene expression decays months after intramuscular injection. Two strategies that both aimed to stabilize dystrophin expression were explored here.  The first strategy involved the integration of HD DNA into cellular chromosomes. Stabilizing HD DNA could prevent its elimination from muscles. A site-specific integrase from phage ΦC31 was used to integrate an HD carrying a selection marker in human cells and murine myoblasts. Efficacy of integration (obtained after selection) reached up to 0.5% per cell, and up to 76% of integration events (in clones) were mediated site-specifically. Although some deletions in HD extremities occurred, 70% of clones analyzed showed one integrated copy of HD (as expected). Only a small increase in the number of double-strand breaks was found in myoblasts expressing the integrase. In conclusion, HD integration was relatively efficient, specific and safe. This method could be used to stabilize dystrophin expression in vivo.  The second strategy involved using a muscle-specific promoter (ΔUSEx3) to reduce potential toxicity induced by widespread expression of dystrophin. Because ΔUSEx3 would be delivered by HD, we investigated whether or not the viral context could affect ΔUSEx3 activity. We constructed an HD and a lentiviral vector (LV) carrying a reporter gene under its control. Strong, muscle-specific and stable (with LV) expression was obtained in vitro. Intramuscular injection of HD resulted into a powerful transgene expression contrasting with LV, where expression was relatively weak. Delivery of ΔUSEx3 in multiple tissues by HD demonstrated its muscle-specificity. Therefore, both the viral context and the muscular environments modulate ΔUSEx3 activity. Further studies are required to determine whether or not ΔUSEx3 can stabilize dystrophin expression in vivo.

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