Implication du Régulateur endogène de la Calcineurine 1 dans la transmission et la plasticité synaptique

Le régulateur endogène de la calcineurine 1 (RCAN1) est exprimé dans les neurones, cependant son rôle dans la régulation de la transmission et de la plasticité synaptique est mal connu. De manière intéressante, plusieurs études dans les cellules cardiaques et les levures montrent une double régulation de la calcineurine 1 (CaN1) par RCAN1. Il est décrit qu'en fonction de son état de phosphorylation par la kinase glycogène synthase 3β (GSK3β), RCAN1 réprime la CaN1 à l'état déphosphorylé, mais il faciliterait son activité à l'état phosphorylé. La régulation de la CaN1 par RCAN1 phosphorylé n'a encore jamais été étudiée dans les neurones et pourrait mettre en relation deux acteurs majeurs de la dépression à long terme (LTD), à savoir la CaN1 et la GSK3β. Par ailleurs une étude récente a montré que RCAN1 peut également être phosphorylé par la protéine kinase A (PKA), une kinase essentielle dans la mise en place de la potentialisation à long terme (LTP), entrainant ainsi une augmentation de l’inhibition de la CaN1 par RCAN1. Dans les neurones, RCAN1 pourrait donc potentiellement réguler à la fois la LTP et la LTD dépendamment de son état de phosphorylation. Mes travaux visent à élucider si RCAN1 est capable de réguler la transmission et de la plasticité synaptique en fonction de son état de phosphorylation et si son action dépend de la CaN1. Afin de déterminer le rôle de RCAN1 dans ces processus, une combinaison de techniques de biologie moléculaire, d’électrophysiologie et d'imagerie a été employée. Nous avons généré des mutations ponctuelles de RCAN1 sauvage de manière à rendre RCAN1 non phosphorylable par la GSK3β ou la PKA. L’expression virale de RCAN1 et de ses différents mutants dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe a révélé que RCAN1, dans ses versions sauvage et mutées, est localisé au niveau des épines dendritiques, suggérant une possible fonction de RCAN1 à la synapse. De manière à déterminer les effets de RCAN1 sur la transmission et la plasticité synaptique, j’ai exprimé de manière virale RCAN1 et ses différents mutants dans des tranches organotypiques d'hippocampes de rat et analysé leurs effets par enregistrement en ‘‘patch-clamp’’ en configuration de cellule entière. J’ai pu observer que le blocage du site de phosphorylation de RCAN1 par la GSK3β entraînait une augmentation de la transmission synaptique ainsi qu’un blocage de la LTD. De plus j’ai démontré que la LTP été bloquée lorsque la PKA ne pouvait pas phosphoryler RCAN1. Enfin nous avons pu déterminer que ces différents effets de RCAN1 sur la transmission et la plasticité synaptique étaient dépendants de la CaN1. Nous avons donc démontré une cascade d’évènements et mis en évidence le rôle clé de RCAN1 dans la régulation de la LTP et de la LTD. Nous proposons donc que RCAN1 permet de moduler la transmission et la plasticité synaptique en fonction de son état de phosphorylation par la GSK3β et la PKA en agissant sur la CaN1, en étant un effecteur de la GSK3β lors de l’induction de la LTD ainsi qu’un effecteur de la PKA lors de l’induction de la LTP. The endogenous regulator of calcineurin 1 (RCAN1) is expressed in neurons, nevertheless its role in the regulation of synaptic transmission and plasticity is not well understood. Interestingly, several studies in cardiac cells and yeasts show that RCAN1 is able to inhibit or activate CaN1 depending on its phosphorylation state by glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). RCAN1 is able to inhibit CaN1 when it is not phosphorylated by GSK3β and able to activate it in its phosphorylated state. The regulation of CaN1 by phosphorylated RCAN1 has never been studied in neurons although it could provide a critical link between two major actors of long-term depression (LTD), CaN1 and GSK3β. Furthermore, a recent study revealed that RCAN1 can also be phosphorylated by protein kinase A (PKA), a kinase involved in regulating long-term potentiation (LTP), leading to an increase of CaN1 inhibition by RCAN1. Thus, in neurons, the differential phosphorylation of RCAN1 could potentially regulate both LTP and LTD. My work therefore investigates how, depending on its phosphorylation state, RCAN1 affects synaptic transmission and plasticity and if this occurs via a direct action on CaN1. In order to determine the role of RCAN1 phosphorylation in synaptic plasticity, a combination of molecular biology, imaging and electrophysiology was used. We generated point mutations of wild type RCAN1 in order to obtain two non-phosphorylable forms of RCAN1: one that couldn’t be phosphorylated by GSK3β, and another one that PKA could not phosphorylate. Viral expression of RCAN1 and its phosphorylation deficient mutants in dissociated hippocampal cultures revealed that they are localized within dendritic spines, hinting at a synaptic function of RCAN1. To determine the effects of RCAN1 on synaptic transmission and plasticity, I virally expressed RCAN1 and the phosphorylation deficient mutants of RCAN1 in rat organotypic hippocampal slice cultures and analyzed their effects on synaptic plasticity by whole cell ‘‘patch-clamp’’ recordings. I observed that the blockade of the GSK3β phosphorylation site in RCAN1 increased synaptic transmission and blocked LTD induction. Furthermore, I demonstrate that LTP was blocked when PKA was unable to phosphorylate RCAN1. Finally, I determined that these distinct effects of RCAN1 on synaptic transmission and plasticity were directly dependent on CaN1. I thus define a cascade of events as well as demonstrate the key role of RCAN1 in the regulation of both LTP and LTD. Based on my results, I propose that iv RCAN1 modulates synaptic transmission and plasticity according to its phosphorylation states by GSK3β and PKA, via its direct action on CaN1, being an effector of both GSK3β during LTD and PKA during LTP induction.

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