Déterminants structuraux et moléculaires de la sélectivité fonctionnelle du récepteur β2-adrénergique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. En raison de leur grande variété de ligands ainsi que leur capacité à activer plusieurs voies de signalisation, ils sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques et sont par conséquent des cibles thérapeutiques de choix pour plusieurs conditions pathologiques. Il a été démontré que le même RCPG peut activer plusieurs voies de signalisation et que différents ligands, du même RCPG, peuvent différentiellement activer ces dernières; concept connu sous le nom de signalisation biaisée du ligand. Ces découvertes ouvrent la possibilité de développer des médicaments qui activent de façon spécifique les voies de signalisation thérapeutiques tout en évitant celles menant aux effets secondaires. Cependant, les mécanismes qui gouvernent la signalisation biaisée du ligand demeurent mal connus.  Le premier objectif de ma thèse fut de développer un capteur de conformation pour le récepteur β2-adrénergique (β2AR), un RCPG prototypique, ainsi que de caractériser les changements conformationnels induits par différents ligands et effecteurs. Les résultats ont démontré la stabilisation de différents ensembles de conformations pour les ligands non biaisés et les ligands biaisés contre la β-arrestine. Le deuxième objectif de ma thèse fut d’identifier les points de contact entre le récepteur et son ligand responsable de la sélectivité fonctionnelle. Pour ce faire, nous avons comparé les interactions entre le récepteur et le ligand complet épinéphrine et ceux entre le récepteur et le ligand partiel et biaisé salmétérol dans les structures cristallines du β2AR. À partir de cette analyse, nous avons identifié un réseau d’interactions polaires différent entre les deux ligands et confirmé le rôle de ce réseau dans la signalisation biaisée du ligand via une étude de mutagenèse. Le dernier objectif de ma thèse fut d’étudier le rôle de résidus connectant des motifs structuraux importants pour l’activation des RCPGs, connus sous le nom de « microswitchs », dans la signalisation biaisée. Plus spécifiquement, l’étude s’est portée sur le résidu L1243.43 du β2AR qui forme des interactions avec le motif PIF et le motif NPxxY. Les résultats ont démontré qu’une perte des interactions entre cette position et les deux motifs se traduit par un gain d’activité constitutive pour Gs et une perte de recrutement de la β-arrestine ainsi qu’une perte de changement de conformation induit par les ligands. Par contre, le gain d’interactions entre la position 124 et les motifs PIF et NPxxY se traduit par un gain de recrutement de la β-arrestine et de changements conformationnels induits par les ligands biaisés. Ces données suggèrent que le lien entre le PIF et NPxxY est important pour la sélection des voies de signalisation engagées par le ligand. L’ensemble de ces résultats ont permis d’identifier des changements conformationnels différents entre les ligands non biaisés et biaisés ainsi que d’identifier deux régions importantes pour l’activation spécifique de voies de signalisation menant à une meilleure compréhension des mécanismes régulant la signalisation biaisée. G proteins-coupled receptors (GPCRs) form the largest family of membrane receptor. Due to their variety of ligands and their capacity to activate several signaling pathways, they are involved in various biological processes and are a target of choice for the development of drugs in many clinical indications. It has been shown that a given GPCR can activate several pathways and that different ligands of the same GPCR can differentially activate these pathways, a concept known as ligand biased signaling. These discoveries open the possibility to generate drugs that selectively activate the therapeutically relevant pathways while avoiding the one leading to side effects. However, the mechanisms leading to bias signaling remains unclear. The first objective of my thesis was to develop a conformational sensor of the β2-adrenergic receptor (β2AR), a prototypical GPCR and to characterize the conformational changes induced by different ligands and effectors. The results have shown the stabilization of different conformation ensembles for unbiased ligands and ligands biased against β-arrestin. The second objective of my thesis was to identify the interactions between the receptor and the ligand leading to functional selectivity. To achieve that objective, we did a structural comparison between the epinephrine and salmeterol bound crystal structures. The analysis has revealed a network of polar interactions that might help stabilize the binding pocket contraction. The role of these residues has been confirmed by a mutagenesis study. The last objective of my thesis was to study the role of residues connecting structural motifs important for GPCR activation, known as “microswitches”, for ligand biased signaling. More specifically, the study was on the residue L1243.43 of the β2AR that forms interactions with the v PIF and NPxxY motifs. The results have shown that a loss of interaction between the position 124 and the two motifs lead to a gain of constitutive activation of Gs and a loss of β-arrestin recruitment and observed conformational changes upon ligand stimulation. In contrast the gain of interaction between the two motifs and the position 124 lead to increased β-arrestin recruitment and observed conformational changes induced by bias ligands. These data suggest that the link between the PIF and NPxxY motifs is important for the selection of which pathways are activated by the receptor. The results of the three projects have allowed the identification of different conformational changes between unbiased and biased ligands and the identification of two regions playing an important role for specific activation of β-arrestin leading to a better understanding of mechanisms governing ligand bias signaling.

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