Impacts métaboliques et thérapeutiques de la vitamine A, sous forme d’acide rétinoïque, dans l’obésité, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2 chez la souris ob/ob = Metabolic and Therapeutic Impacts of Vitamin A as Retinoic Acid on Obesity, Insulin Resistance, and Type 2 Diabetes in ob/ob Mice

Résumé  Introduction : L’obésité et le diabète de type 2 (T2DM) sont associés à des perturbations des métabolismes énergétiques, de l’insuline et de la vitamine A (ROL-rétinol ; RE-rétinyl esters; AR-acide rétinoïque) ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires. La RBP4 (« retinol binding protein ») hépatique est le transporteur équimolaire du ROL dans le sérum. Elle est également sécrétée comme adipokine. La RBP4 sérique est augmentée dans l’obésité, la résistance à l’insuline (RI) et le T2DM, mais il n’avait pas été établi si le transport de ROL dans le sang était subséquemment augmenté dans ces maladies. Réduire la RBP4 sérique diminue la RI. Le défi est d’éviter une hypovitaminose A, par perte de ROL circulant, associée à la réduction artificielle de son transporteur sanguin, la RBP4. Notre laboratoire avait démontré qu’un traitement à l’AR diminuait le taux sanguin de ROL chez des rats normaux. Les risques d’hypovitaminose A étaient exclus car l’AR est le métabolite actif principal de la vitamine A. Il avait été suggéré que l’AR influence le poids, la RI et le cœur chez divers rongeurs obèses et RI, avec des résultats variables. Il n’existe pas encore de protocole standardisé de traitement à l’AR pour la RI et le T2DM. Les mécanismes sont à l’étude pour l’optimisation des doses, de la durée et des voies d’administration de l’AR. Les variations du ROL et de la RBP4 sériques et tissulaires n’avaient pas été évaluées, dans ces contextes. Il était pertinent de vérifier ces concentrations de ROL et de RBP4 dans un modèle murin obèse et diabétique certifié, peu ou pas étudié pour ces aspects, ainsi que l’effet d’un traitement à petite dose d’AR sur leurs variations en association avec la RI, le T2DM et les possibles améliorations post-traitement.  Hypothèse : Les concentrations sériques du ROL et de la RBP4 sont élevées chez la souris ob/ob, un modèle animal sévèrement obèse et diabétique. Elles s’accompagnent de concentrations tissulaires élevées de ROL et réduites de RBP4. Un traitement à court terme avec une petite dose d’AR diminuera le ROL circulant et subséquemment la RBP4 sérique, normalisera leurs taux tissulaires et diminuera la masse adipeuse et le poids corporel. Tous ces effets contribueront à la diminution de la RI, de l’intolérance au glucose et à l’insuline, et de la glycémie. Ces améliorations du métabolisme des rétinoïdes et de l’état diabétique seront associées à des profils tissulaires spécifiques d’expression de gènes du métabolisme de la vitamine A, et à des indices génomiques, histologiques et physiologiques d’amélioration du métabolisme énergétique. Un effet cardioprotecteur direct de l’AR est envisageable également.    Objectifs : Évaluer chez les souris ob/ob l’impact d’un traitement à l’AR sur : A) les taux sériques et tissulaires de vitamine A et de RBP4, la glycémie, la RI, l’intolérance au glucose et à   l’insuline, le poids corporel et la taille des adipocytes; B) l’expression des gènes (mRNA) du métabolisme de la vitamine A dans le gras sous-cutané (SF), le gras viscéral (VF), les muscles (SM) et le foie (LIV); l’expression des gènes PGC1α  et UCP1 impliqués dans le métabolisme énergétique du gras beige/brun (BAT); l’expression des gènes du système protecteur des peptides natriurétiques (NP) et de ceux associés à l’apoptose et à la fibrose des cardiomyocytes; C) la morphologie de tissus adipeux SF et VF et musculaire cardiaque (HT).    Méthodes : Seize souris B6.V-Lep/J ob/ob provenant de Jackson Labs USA et certifiées - avec des cages métaboliques et protocoles moteurs – comme étant hypométaboliques, léthargiques, sous-fertiles, hyperphagiques, obèses, RI, intolérantes au glucose et sévèrement hyperglycémiques (≥ 20 mmol/L), âgées de 9 semaines, ont été divisées en deux groupes égaux. Pendant 16 jours, la moitié des souris (n=8) furent traitées par intubage gastrique avec 100 μg at-RA/jour (2 μg/g poids corporel/jour) dans 100 μl d’huile de maïs (véhicule), et l’autre moitié (n=8) seulement avec le véhicule, servant ainsi de témoins diabétiques. Des souris de poids normal et en santé (n=5-9) ont servi de témoins sains. Toutes les souris ont reçu la diète standard internationale No.2018 pour les rongeurs de Harlan Teklad-USA, avec une valeur énergétique de 13.7 kJ/g, et un accès à l’eau ad libitum.  Le poids corporel et la consommation alimentaire furent mesurés et documentés quotidiennement, avec une balance de précision. Les glycémies à jeun (4h) furent mesurées les jours 9 et 16. Les tests de tolérance au glucose (IPGTT) et à l’insuline (IPITT) furent faits par injection intrapéritonéale, les jours 15 et 16. La concentration de la RBP4 dans le sang et dans les gras SF et VF, les SM et le LIV, ainsi que celle des protéines du système NP dans le HT, ont été mesurées par immuno-buvardage (WB). Les taux de vitamine A circulante et tissulaires ont été quantifiés par chromatographie HPLC. Dans ces tissus, l’extraction de l’ARN a été faite par la méthode TRIZOL, et l’expression génique a été évaluée par RTqPCR semi-quantitative. La morphologie tissulaire fut évaluée par colorations et par histologies. Les réflexes moteurs ont été évalués avec des stimuli du protocole standard SHIRPA et un minimum de deux observations directes quotidiennes.     Résultats : Le présent traitement à l’AR fut associé à : 1) une  baisse du poids corporel en conditions d’apports alimentaires et réflexes  moteurs semblables aux souris non traitées; 2) une baisse des  taux sériques de ROL et de RBP4, de la glycémie, de la RI et de l’intolérance au glucose et à l’insuline; 3) des changements tissu-spécifiques dans l’expression des gènes : a) du métabolisme de la vitamine A; b) du métabolisme énergétique, augmentant les UCP1 et PGC1α dans SF et VF); c) du système cardio-NP, normalisant les antiapoptotiques, antifibrotiques et les NP; 4) une normalisation des taux tissulaires de RBP4, de ROL et de RE ; 5) une réduction de la taille des adipocytes ; 6) une réduction de la fibrose et de l’apoptose des cardiomyocytes; 7) une présence accrue d’acides gras polyinsaturés (PUFA) dans les tissus adipeux traitées, documentée par cryoséparation de phases liquide et solide à -20ºC; 8) des histologies évoquant (sous toute réserve) l’angiogenèse et l’autophagie adipocytaires.    Conclusion : Notre traitement à l’AR : 1) diminue le poids corporel, le ROL et la RBP4 sériques, la glycémie, la RI et l’intolérance au glucose et à l’insuline; 2) réduit l’expression (mRNA) de l’adipokine RBP4; 3) module l’expression des gènes du métabolisme de la vitamine A, améliorant son homéostasie; 4) normalise les taux tissulaires de RBP4 et de vitamine A; 5) augmente l’expression adipocytaire des UCP1 et PGC1α, gènes associés au BAT ; 6) améliore le métabolisme énergétique, réduisant la taille des adipocytes et la masse adipeuse; 7) induit un effet cardioprotecteur, antiapoptotique et antifibrotique; 8) est associé à une présence accrue d’acides gras PUFA dans les  tissus adipeux de souris traitées à l’AR. Traditionnellement majoritaires dans les gras beiges/bruns, ces UFA suggèrent aussi que l’AR stimule la formation de BAT; 9) est associé à des structures évoquant l’angiogenèse et l’autophagie dans les tissus adipeux, ce qui suggère (sous réserve d’une vérification approfondie) une contribution à l’augmentation du métabolisme; 10) démontre que des améliorations de profils cardiométaboliques sont possibles en dehors des voies de signalisation strictement contrôlées par la leptine et/ou par les hormones sexuelles. Bien que bénéfiques pour le métabolisme énergétique, ces hormones sont diminuées chez les patients obèses, RI et diabétiques, avec l’âge et davantage après la ménopause. Ainsi, l’AR suggère des effets antidiabétiques conjugués, lorsque ces hormones restent partiellement fonctionnelles ! Abstract  Introduction: Obesity and type 2 diabetes (T2DM) are associated with the impaired metabolism of insulin, energy and vitamin A (ROL-retinol; RE-retinyl esters; RA-retinoic acid) and with cardiovascular diseases. Hepatic retinol binding protein (RBP4) is released into the serum at an equimolar ratio to ROL, and is also secreted as an adipokine. Serum RBP4 is elevated in obesity, insulin resistance (IR) and T2DM. However, limited information is available on the rate of vitamin A metabolism in diseases such as diabetes or as to whether vitamin A (ROL) transport is enhanced by the elevation of RBP4 in the serum. Reducing the serum RBP4 level decreases IR; however, it is challenging to avoid depletion in circulating ROL following an artificial reduction in RBP4. Our laboratory has demonstrated that RA treatment reduces serum ROL in normal rats, with no vitamin A depletion effects (given that RA is the most bioactive metabolite of ROL). Others have suggested that RA may have variable impacts on body weight, IR and the heart in some obese and diabetic rodents. A standardized RA treatment protocol for IR and T2DM does not yet exist, as the mechanisms, optimal doses, duration and routes of administration are still under investigation. Furthermore, the serum and tissue ROL and RBP4 concentrations were not investigated under these conditions. It is of high interest to investigate these ROL and RBP4 concentrations in a certified, yet relatively unstudied for retinoid, obese and diabetic mouse model and to determine whether and how treatment with a small dose of RA influences their metabolic rates associated with IR, T2DM and eventual post-treatment improvements in these animals.   Hypothesis: Serum concentrations of ROL and RBP4 are elevated in the ob/ob mouse, a certified severely obese and diabetic animal model. The high serum levels of ROL and RBP4 are accompanied by high tissue concentrations of ROL and reduced tissue levels of RBP4. Short-term treatment with a low dose of RA will reduce serum ROL and RBP4, will normalize tissue ROL and RBP4 levels, and will decrease body fat and weight. All of these effects will contribute to lowering IR, glucose and insulin intolerance and blood glucose. These improvements in retinoid metabolism and the diabetic state will be associated with tissue-specific expression profiles for genes involved in vitamin A metabolism, and with genomic, histological and physiological indices of improved energy metabolism. A direct cardioprotective effect of RA may also be observed.    Aims: To evaluate the impact of our RA treatment in ob/ob mice on: A) serum and tissue levels of vitamin A and RBP4, blood glucose, IR, glucose and insulin intolerance, body weight and fat cell size; B) the expression (mRNA) of genes involved in vitamin A metabolism in subcutaneous fat (SF), visceral fat (VF), muscle (SM) and liver (LIV); the expression of the PGC1α and UCP1 genes, which are involved in the energy metabolism of beige/brown adipose tissue (BAT); the expression of  natriuretic peptide (NP) cardioprotective system genes and of those associated with the apoptosis and fibrosis of cardiomyocytes; and C) the morphology of SF and VF adipose tissue and of the cardiac muscle (HT).     Methods: Sixteen 9-week-old  B6.V-Lep/J ob/ob  mice were certified by Jackson Labs USA through the use of metabolic cages and motor protocols, to be hypometabolic, lethargic, subfertile, hyperphagic, obese, IR, glucose intolerant and severely hyperglycemic (≥ 20 mmol / L). These mice were divided into two equal groups. For 16 days, half of the mice (n=8) were treated daily by stomach intubation with 100 μg at-RA/day (2 μg/g body weight/day) in 100 μl of corn oil (vehicle), and the other half (n=8) were treated with only the vehicle, thus serving as diabetic controls. Normal and healthy-weight mice (n=5-9) were used as healthy controls. All mice received the international No.2018 standard rodent diet from Harlan Teklad-USA, which has an energy content of 13.7 kJ/g, and access to water ad libitum. Body weight and food consumption were monitored daily using a precision scale. Glycaemia was measured after 4 hours of fasting on days 9 and 16. Intraperitoneal glucose tolerance tests (IPGTTs) and insulin tolerance tests (IPITTs) were performed on days 15 and 16. The protein concentrations of RBP4 in the blood and in the SF and VF, SM and LIV, as well as protein in the cardiac NP system, were measured by Western blot (WB). Circulating and tissue vitamin A levels were quantified by HPLC. The RNA was extracted from tissue by the TRIZOL method and gene expression (mRNA) was evaluated by semi-quantitative RT-qPCR. Tissue morphologies were evaluated by staining and histology. Motor reflexes were evaluated daily with valid SHIRPA standard protocol stimuli and a minimum of two daily direct observations.    Results: Our RA treatment was associated with: 1) a decrease in body weight under similar food intake conditions and decreased motor-reflexes compared with untreated mice; 2) a decrease in serum levels of ROL and RBP4, blood glucose, and IR, as well as of glucose and insulin intolerance; 3) tissue-specific expression profiles for genes involved in: a) vitamin A metabolism, b) energy metabolism (increased UCP1 and PGC1α in SF and VF), c) the cardio-NP system (normalized anti-apoptotic, anti-fibrotic and NP); 4) a normalization of the RBP4, ROL and RE levels in tissues; 5) a reduction in adipocyte size; 6) reduced fibrosis and apoptosis of cardiomyocytes;7) increased poly unsaturated fatty acids (PUFAs) in the adipose tissue of  RA treated mice, documented by cryoseparation of liquid and solid phases at -20ºC; and 8) histology potentially suggesting adipocyte angiogenesis and autophagy.   Conclusion: Our RA treatment: 1) decreases serum ROL and RBP4 levels, glycaemia and IR; 2) reduces the expression (mRNA) of the RBP4 adipokine; 3) modulates the expression of genes involved in vitamin A metabolism, improving its homeostasis; 4) normalizes tissue RBP4 and vitamin A levels; 5) increases PGC1α and UCP1 gene expression, a signature of brown/beige fat; 6) improves energy metabolism, reducing adipocyte size, fat mass and body weight; 7) induces  cardioprotective, anti-apoptotic and anti-fibrotic effects; 8) is associated with increased PUFAs presence in the adipose tissue of RA-treated mice, suggesting that RA may stimulate BAT genesis due to typical dominance of PUFAs in beige/brown fat; 9) is associated with histologic structures indicating angiogenesis and autophagy in fat tissues, suggesting (pending further investigation) a contribution to improved metabolism in these tissues; 10) clearly demonstrates that in obesity and diabetes, cardio-metabolic improvements are possible out of the signaling pathways strictly controlled by leptin and sexual hormones, known to be beneficial for the energetic metabolism but decreased in men and women with obesity, insulin-resistance, diabetes, and with age (ex: strongly after menopause). An RA treatment conjugated effect is possible when these hormones are partially functional!

Keyphrases: Acide rétinoïque, Vitamine A, Résistance à l’insuline, Diabète, Adipocytes, Gras beige, Métabolisme énergétique, Peptides natriurétiques, Fibrose, Apoptose, Autophagie., Adipocytes, Retinol Binding Protein RBP4, Retinoic acid, Vitamin A, Retinol Binding Protein RBP4, Insulin resistance, Diabetes, Brown / Beige fat, Energy metabolism, Natriuretic peptides ANP / BNP, Fibrosis prevention, Apoptosis, Autophagy