Métabolisme du glucose et du glycérol dans la cellule pancréatique β et les hépatocytes et identification des voies de détoxification du glucose

Un apport excessif en nutriments calorigéniques et une diminution des niveaux d’activité physique contribuent à l’augmentation fulgurante de l’obésité et des maladies métaboliques associées telles le syndrome métabolique et le diabète de type 2 (DT2).  L’insuline sécrétée par les cellules β de l’ilots de Langerhans, est une hormone clé dans la régulation énergétique de l’organisme.  Le glucose plasmatique est le principal stimulateur de la sécrétion d'insuline via la production de facteurs de couplage métabolique (FCM), des molécules clés qui établissent des liens entre le métabolisme du glucose par la cellule β et l’exocytose de l’insuline. D’autres nutriments calorigéniques comme les acides gras et certains acides aminés amplifient la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG), en partie via leur métabolisme intracellulaire. Néanmoins les mécanismes et FCM impliqués dans la SIIG restent en partie méconnus. Notre laboratoire a mis en évidence la contribution importante du cycle glycérolipides /acides gras libres (GL/FFA) dans la sécrétion d’insuline induite par le glucose et son amplification par les acides gras.  Le cycle GL/FFA est en effet au carrefour du métabolisme du glucose et des lipides et permet la production de molécules signalétiques lipidiques via les voies de la lipogénèse et lipolyse. Il joue un rôle important dans la régulation de la SIIG via la production de FCM tel le monoacylglycérol et dans la disponibilité intracellulaire des nutriments et de leurs dérivés. Des défauts de fonctionnement du cycle GL/FFA contribuent à la pathogenèse du DT2 en raison de son rôle dans la signalisation lipidique et dans la détoxification des nutriments calorigéniques. En effet, l’exposition chronique à des niveaux élevés de glucose et d’acides gras induit un dysfonctionnement et éventuellement l’apoptose des cellules β. Néanmoins les cellules β doivent continuellement capter le glucose pour promouvoir la sécrétion d’insuline.  Afin de faire face à la toxicité cellulaire causée par un apport excessif de nutriments calorigéniques, les cellules utilisent des voies métaboliques de détoxification pour transformer les nutriments calorigéniques en molécules plus inertes et éventuellement les exporter dans le milieu extracellulaire. Les cellules, en général, possèdent des mécanismes pour éliminer les molécules « étrangères » comme les toxines, médicaments et autres xénobiotiques. En revanche les mécanismes impliqués dans la détoxification des nutriments en excès et de leurs dérivés sont dans l’ensemble méconnus quelles que soient les cellules.  Dans une première partie de cette thèse, nous avons émis l’hypothèse de l’existence de voies métaboliques de détoxification des nutriments calorigéniques. Pour mettre en lumière ces voies, nous avons évalué la destination des carbones du glucose vers différents métabolites candidats. Plus précisément, un moyen d'identifier les voies de détoxification du glucose en excès est de mesurer les activités des voies métaboliques et les niveaux de métabolites à diverses concentrations de glucose et d'identifier ceux qui augmentent encore au-delà des concentrations maximales de glucose pour la SIIG. De plus, contrairement à la plupart des études portant sur la SIIG, nous avons utilisé un milieu d'incubation plus enrichi en nutriments avec un niveau basal de 4 mmol/l glucose supplémenté en glutamine (2 mmol/l) et en carnitine (50 µmol/l) pour les îlots de Langerhans ex vivo.  En effet, nous avons réalisé que dans les études effectuées habituellement avec un niveau basal de glucose de 2-3 mmol/l, les cellules β sont appauvries en énergie. Les résultats indiquent que les  processus possibles de détoxification pourraient impliquer différentes formes de stockage d’énergie (TG, glycogène et les esters du cholestérol) et la libération extracellulaire de métabolites dérivés du glucose (glycérol, cholestérol et FFA). En outre, les données indiquent qu’une destination majeure des carbones du glucose est le glycérol relâché dans le milieu.  Dans une deuxième partie de cette thèse, nous avons cherché à savoir quelles sont les voies métaboliques et FCM candidats qui corrèlent le mieux avec la sécrétion d’insuline à diverses concentrations de glucose. Ceci a été effectué dans les ilots de Langerhans de rat et aussi en utilisant une approche de métabolomique ciblée dans les cellules INS 832/13. Plusieurs métabolites corrèlent bien avec la SIIG, en particulier certains intermédiaires du cycle Krebs, le malonyl-CoA et aussi la baisse des niveaux d’ADP. Prises dans leur ensemble, ces données mettent en lumière le rôle de différents mécanismes dans la signalisation métabolique des cellules β en réponse au glucose, tels que le métabolisme oxydatif mitochondrial, l’anaplérose et la voie malonyl-CoA/ molécules signalétiques lipidiques et suggèrent qu’une diminution des niveaux d’ADP joue un rôle important dans la sécrétion d’insuline. Dans une troisième partie de la thèse, sachant que les niveaux de glycérol-3 phosphate (Gro3P) augmentent considérablement en réponse au glucose et que le glycérol est produit en grande quantité par la cellule β, nous avons cherché à déterminer sa provenance.  Lors de notre première étude, nous avions obtenu des résultats indiquant que la production de glycérol provenait du cycle GL/FFA et aussi d’une source inconnue associée aux niveaux de glucose extracellulaire.  Nous avons émis l’hypothèse qu’une enzyme inconnue chez les mammifères pourrait directement transformer le Gro3P en glycérol. En utilisant une approche d’analyse in silico, nous avons réalisé que la phosphoglycolate phosphatase (PGP) humaine et de souris partage des séquences significativement homologues avec des enzymes d’organismes inférieurs pouvant hydrolyser le Gro3P. Ainsi nous avons étudié dans le détail le rôle de l’enzyme PGP dans le métabolisme de la cellule β et des hépatocytes. Nous avons déterminé expérimentalement que PGP a une activité Gro3P phosphatase (G3PP) importante chez les mammifères pouvant hydrolyser le Gro3P en glycérol. Nous avons émis l’hypothèse que PGP agit en fait comme une G3PP et joue un rôle central dans la régulation du métabolisme du glucose et des lipides et de la signalisation, ainsi que dans la réponse au stress métabolique. En utilisant des techniques de biologie moléculaire et de biochimie, nous avons observé que PGP/G3PP, en contrôlant les niveaux intracellulaire de Gro3P issu de la glycolyse, régule cette dernière de même que de nombreuses voies métaboliques et fonctions des cellules β et hépatiques. Ainsi, PGP/G3PP contrôle aussi la synthèse de glycérolipides, l’oxydation des acides gras, l’état redox et le métabolisme énergétique mitochondrial dans la cellule β pancréatique et les hépatocytes, ainsi que la SIIG et la réponse au stress métabolique dans la cellule β, et la gluconéogenèse dans les hépatocytes.  En résumé, nous avons obtenu des évidences en faveur de voies métaboliques et FCM impliqués dans la SIIG et possiblement dans la gluco-détoxification des cellules β et déterminé quelles voies sont quantitativement importantes et pourraient jouer un rôle en termes de détoxification des nutriments en excès. Les données indiquent que les cellules β convertissent une quantité importante de glucose en glycérol lequel est exporté par la cellule comme possible processus de gluco-détoxification et de modulations d’autres voies métaboliques. De plus, nous avons découvert une toute nouvelle voie métabolique dans les cellules β et les hépatocytes avec l’identification d’une G3PP capable de transformer directement le Gro3P en glycérol. L'identification d'une G3PP auparavant inconnue dans les cellules de mammifères est un ajout important à notre compréhension de la régulation du métabolisme intermédiaire en général, de la signalisation métabolique et de la détoxification du glucose en excès. Ainsi, la G3PP est une nouvelle cible thérapeutique intéressante pour les troubles liés aux maladies cardio-métaboliques telles le DT2 et l’obésité. Excessive intake of calorigenic nutrients and low levels of physical activity contribute to the rapid increase in obesity and related metabolic diseases such as metabolic syndrome and type 2 diabetes (T2D). Insulin secreted by the β cells of the islets of Langerhans, is a key hormone in energy regulation of the organism. Plasma glucose is the main stimulator of insulin secretion via the production of metabolic coupling factors (MCF), which are key molecules mediating the link between glucose metabolism by β cell and the exocytosis of insulin. Other calorigenic nutrients such as fatty acids and certain amino acids amplify glucose-induced insulin secretion (GSIS), partly via their intracellular metabolism. Nevertheless, the contribution of MCFs in GSIS and the related mechanisms remain partly unknown. Our laboratory has highlighted the contribution of the glycerolipids/free fatty acids (GL/FFA) cycle in insulin secretion induced by glucose and amplified by fatty acids, and this cycle, which encompasses lipogenesis and lipolysis, plays an important role in the overall regulation of glucose and lipid metabolism. In addition, it takes part in regulating the GSIS via MCF production such as monoacylglycerol and in the intracellular availability of nutrients and their derivatives. Disturbed GL/FFA cycle contributes to the pathogenesis of T2D because of its role in lipid signaling and calorigenic nutrients detoxification. Indeed, chronic exposition to elevated glucose and FFA cause pancreatic β-cell dysfunction and apoptosis as well. Nevertheless, β cells must continually take-up glucose for promoting insulin secretion. To cope with the cellular toxicity caused by excessive intake of calorigenic nutrients, cells use metabolic detoxification pathways to convert calorigenic nutrients into more inert molecules and eventually export them extracellularly.  Cells have various mechanisms and strategies to eliminate "foreign" molecules such as toxins, drugs and other xenobiotics. However, the mechanisms involved in the detoxification of excess nutrients and their derivatives are mostly unknown whatever the cell type.  In the first part of the thesis, we hypothesized the existence of metabolic pathways for calorigenic nutrients detoxification. To highlight these pathways, we evaluated the destination of glucose carbon towards different metabolite candidates. More specifically, one way to identify pathways possibly involved in glucose excess detoxification is to measure metabolic pathway activities and metabolite levels at various concentrations of glucose, and identify those that increase further beyond the maximum glucose concentrations for GSIS. Furthermore, in contrast to most GSIS studies, we used a nutrient enriched incubation medium with a basal level of 4 mmol/l glucose supplemented with glutamine (2 mmol/l) and carnitine (50 µmol/l) when using isolated Langerhans islets. In fact, we realized that the basal level of 2-3 mmol/l glucose alone used in most studies, results in cellular energy depletion.  Overall results indicate that detoxification processes could involve different forms of energy storage (TG, glycogen and cholesterol esters) and the extracellular release of metabolites derived from glucose (glycerol, cholesterol and FFA). Furthermore, data indicate that a major fate of glucose carbons is their transformation and released into the medium in the form of glycerol.  In the second part of the thesis, we sought to identify metabolic pathways and MCF candidates that correlate best with insulin secretion at various concentrations of glucose. This was done in isolated rat Langerhans islets and also using a targeted metabolomic approach in INS 832/13 cells. Several metabolites correlate well with GSIS, particularly several Krebs cycle intermediates, malonyl-CoA and also a lowering in the levels of ADP. Taken together, these data highlight the role of different mechanisms in β-cell metabolic signaling in response to glucose, such as oxidative mitochondrial metabolism, anaplerosis, malonyl-CoA/lipid signaling, and suggest that a lowering in ADP levels may play an important role in GSIS. In the third part of the thesis, given that glycerol 3-phosphate (Gro3P) and glycerol levels increase dramatically in response to glucose in β cells, we sought to determine the process at the source of this glycerol production. In the first study, results suggested that the glycerol production could originate from the GL/FFA cycle but also from an unknown source also associated with extracellular glucose levels. We hypothesized that an unknown enzyme in mammals could directly transform Gro3P into glycerol. Using an in silico analysis approach, we realized that human and mouse phosphoglycolate phosphatase (PGP) share significant amino acid sequence homologies with lower organism enzymes, which hydrolyze Gro3P into glycerol. Thus, we studied in detail the role of PGP in the metabolism of the β cell and hepatocytes. We have determined that PGP has an important Gro3P phosphatase (G3PP) activity in mammals that can hydrolyze Gro3P into glycerol. We hypothesized that PGP effectively acts as a G3PP and plays a central role in the regulation of glucose and lipid metabolism and signaling, as well as in response to metabolic stress. Using molecular biology and biochemistry approaches, we observed that PGP/G3PP, by controlling glycolysis-derived Gro3P intracellular levels, regulates glycolysis flux as well as many metabolic pathways and cellular functions in β cells and hepatocytes. PGP/G3PP also controls the synthesis of glycerolipids, fatty acids oxidation, redox state and mitochondrial energy metabolism in the pancreatic β cell and hepatocytes, the GSIS and the response to metabolic stress in the β cell, and gluconeogenesis in hepatocytes. In summary, we have obtained evidences on the role of various metabolic pathways and MCF in β cell metabolic signaling of GSIS and gluco-detoxification processes. More specifically, we have shed light on metabolic pathways that may be quantitatively important and could play a key role in the detoxification of nutrient excess. The data indicate that β cells convert a significant amount of glucose into glycerol, which is exported out of the cell.  This transformation of the glucose carbons acts probably as a gluco-detoxification process and also could serve to modulate metabolic pathways such as glycolysis. In addition, we discovered a new metabolic pathway in β cells and hepatocytes with the identification of a G3PP that is able to directly transform Gro3P into glycerol. The identification of a previously unknown G3PP in mammalian cells is an important addition to our understanding of the regulation of intermediary metabolism at large, metabolic signaling and glucose excess detoxification. Thus, G3PP is an interesting new therapeutic targets for cardio-metabolic diseases-related disorders such as T2D and obesity.

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