Propriétés de surface des nanoparticules et interactions avec les cellules endothéliales vasculaires

Les traitements et l’imagerie des tumeurs cérébrales malignes se sont avérés jusqu’à présent très peu efficaces, en raison de la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui freine le passage des molécules thérapeutiques mais aussi diagnostiques vers les tissus du système nerveux central (SNC). Le développement de vecteurs nanométriques chargés en agents thérapeutiques et capables de traverser la BHE pourrait être une alternative pour améliorer la bio-distribution de principes actifs et d’agent d’imagerie au cerveau. Parmi les différents types de vecteurs proposés, les nanoparticules polymériques (NP) constituées de polymères dibloc comportant un bloc de poly (éthylène glycol) (PEG) pourrait présenter une solution prometteuse pour transporter des actifs à travers la BHE. La PEGylation de la surface des NPs améliore la stabilité colloïdale des NPs. De plus, elle diminue l'adsorption non spécifique des protéines à la surface de NPs (appelée aussi opsonisation). La vitesse de clairance des NPs est ainsi ralentie et les NPs circulent plus longtemps dans le sang. Malgré l’effet bénéfique de la couche de PEG à la surface des NPs, le rôle exact des propriétés de surface liées à la longueur de la chaîne PEG sur l'interaction des NPs avec les cellules endothéliales vasculaires est mal compris. Dans une première partie de ce travail, le rôle de la longueur de PEG sur l'endocytose et la transcytose des NPs a été étudié sur des monocouches de cellules bEnd.3, un modèle in vitro de BHE. Les mécanismes de transport des NPs ont été évalués en utilisant différents inhibiteurs de l'endocytose. La quantification du taux d'endocytose et de transcytose a révélé que l'endocytose et la transcytose des NPs augmentaient avec la longueur de la chaîne de PEG. Les taux d'endocytose et de transcytose les plus élevés ont été observés pour les NPs de PLA-PEG5000 et de PLA-PEG10000. Les résultats de l’étude mécanistique démontrent que la longueur de la chaîne de PEG influence la voie d'endocytose empruntée par les NPs PEGylées à travers un modèle in vitro de BHE. Dans une seconde partie de ce travail, l'effet de la longueur du PEG sur la toxicité des NPs et les processus inflammatoires a été étudié sur deux modèles de monocouche de cellules endothéliales vasculaires, soit les cellules bEnd.3 et HUVEC. L'effet de la longueur des chaînes de PEG sur l'expression des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire aux NPs PEGylées a été évalué par qPCR. De plus, le potentiel de génération de dérivés réactifs de l'oxygène (DRO ou ROS) par les NPs a été évalué en utilisant le test cellulaire basé sur l'oxydation de la DCFH-DA. Les résultats démontrent que les NPs PEGylées induisent une augmentation légère et transitoire de l’expression des gènes des cytokines et des chimiokines inflammatoires. Cependant, la longueur des chaînes de PEG ne présente pas un effet significatif sur l'expression des gènes des cytokines et des chimiokines. De plus, nos résultats ne montrent pas l’induction de la génération de ROS par les NPs PEGylées. En résumé, la longueur de chaine de PEG influence le taux d’endocytose et de transcytose. La voie d’endocytose impliquée dans l’internalisation et la transcytose est influencée par la longueur des chaines de PEG. En revanche, les différences de longueur des chaines de PEG ne modulent pas significativement l’expression des cytokines et de chimiokines inflammatoires.  Ces résultats devraient contribuer à développer des nanoformulations qui traversent plus efficacement la BHE, tout en minimisant les effets toxiques, notamment inflammatoires sur les cellules endothéliales vasculaires de la BHE. Ces perspectives devront toutefois être confirmées sur des modèles in vivo. To date, imaging and treatment of brain tumors are proved to be very inefficient due to the presence of the blood-brain barrier (BBB). The (BBB) is a semipermeable barrier which prevents or restrains most therapeutic and diagnostic molecules reach the central nervous system (CNS). Polymeric nanoparticles (NPs) loaded by therapeutics molecules and diagnostic agents could represent a promising solution to help active ingredients to cross the BBB and as a consequence, their biodistribution to the brain could be improved.  Polymeric NPs composed of di-block copolymers, such as poly (ethylene glycol) blocks (PEG) that bind to polyester hydrophobic chains, are considered one of the most versatile nanocarriers for transporting therapeutic molecules across the BBB. PEG on the surface of NPs improves the NPs colloidal stability. Furthermore, PEG surface coating decreases the non-specific adsorption of proteins on the surface of NPs (also called opsonization); therefore, the clearance rate of the NPs is slowed down and NPs circulation times in blood is extended. Despite the beneficial effect of the PEG coating on the surface of NPs, the exact role of the surface properties related to the PEG chain length on NPs interactions with the vascular endothelial cells is poorly understood.  In first article, the role of PEG chain length on brain vascular endothelial cells endocytosis and transcytosis is investigated on monolayers of bend.3 cells as an in vitro BBB model. The NPs transport mechanisms were then investigated by using different endocytosis inhibitory processes. Our results revealed that NPs endocytosis and transcytosis rates increased with PEG chain length. Higher endocytosis and transcytosis rates were observed for PLA-PEG5000 and PLA-PEG10000 NPs. Moreover, the mechanistic studies demonstrated that the PEG chain length influenced the endocytosis pathway taken by PEGylated NPs through an in vitro model of BBB. In second article, the effect of PEG length on NPs cytotoxicity and inflammatory processes has been investigated in two vascular endothelial cell lines (bEnd.3 and HUVEC). The effect of PEG chain length coating on gene expression that are involved in the inflammation response was investigated by qPCR. Moreover, the potential Reactive Oxygen Species (ROS) generation was evaluated with DCFH-DA probe. The results showed that PEGylated NPs induce a mild and transient activation of inflammatory cytokine and chemokine genes. However, the length of the PEG chains did not modulate significantly gene expression of inflammatory cytokines and chemokines. Furthermore, our results showed that PEGylated NPs did not induce ROS generation.   In summary, the chain length of PEG influences the endocytosis and transcytosis rate. The pathway of endocytosis involved in internalization and transcytosis is influenced by the length of PEG chains. In contrast, differences in the length of PEG chains did not significantly modulate the expression of cytokines and inflammatory chemokines. These results contribute to develop nanoformulations that cross the BBB more efficiently while keeping the toxic and inflammatory effects minimal, particularly on the vascular endothelial cells of the BBB. Nevertheless, these perspectives have to be confirmed on in vivo models.

Keyphrases: Nanoparticules, dibloc PLA-b-PEG,, Endocytose, Transcytose, Dérivés réactifs de l'oxygène, Cytokines, Chimiokines, barrière hémato-encéphalique, Cytokines, Cytokines, blood-brain barrier, Nanoparticles, diblock PLA-b-PEG, Endocytosis, Transcytosis, Reactive Oxygen Species, Cytokines, Chemokines