Étude de la transcription par des techniques à haut-débit chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont un groupe très varié d’eucaryotes unicellulaires principalement retrouvés en milieu marin où ils ont un rôle écologique majeur dans la production primaire des océans et dans la formation des récifs coralliens. Ils sont aussi responsables de phénomènes néfastes comme les marées rouges et la production de toxines qui contaminent les crustacées et les poissons lorsque les conditions sont propices à leur multiplication rapide. Ces organismes possèdent des caractéristiques moléculaires uniques chez les eucaryotes, particulièrement en ce qui a trait au noyau. Le génome des dinoflagellés s’y retrouve condensé sous forme de cristal liquide stabilisé par des cations métalliques plutôt que sous forme de nucléosomes organisés par des histones. Cette forme condensée persiste tout au long du cycle cellulaire et limite la transcription des gènes à des boucles d’ADN qui se retrouvent à la périphérie des chromosomes. Ces caractéristiques inhabituelles, jumelées à une taille souvent imposante de leur génome, ont grandement limité l’étude des mécanismes moléculaires de base comme la régulation de la transcription. Afin de mieux caractériser ce processus chez ces organismes, le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum, qui est étudié majoritairement pour ses multiples rythmes circadiens, a été utilisé. Tout d’abord, le séquençage à haut-débit a été utilisé afin de caractériser le transcriptome complet de l’organisme à quatre temps différents au cours d’une journée. De façon surprenante, ce séquençage a montré que très peu des transcrits varient entre les temps et que ces variations sont de faible amplitude, ce qui contraste fortement avec les résultats obtenus chez d’autres groupes d’organismes. Une inhibition pharmacologique de la transcription a aussi été effectuée et montre que les rythmes de photosynthèse et de bioluminescence continuent d’osciller de façon circadienne en absence de transcription. Ces résultats suggèrent que le modèle traditionnel de génération des rythmes circadiens par des boucles de rétroaction transcription/traduction est probablement absent chez Lingulodinium. La deuxième approche consiste en la caractérisation de deux protéines à domaine cold-shock (CSD), un domaine d’origine bactérienne qui est fortement surreprésenté chez les dinoflagellés et annoté comme potentiel facteur de transcription. Ces deux protéines ont une préférence pour la liaison de l’ADN simple brin versus l’ADN double brin tout en étant ii capable de lier de l’ARN. Par ailleurs, ces liaisons aux acides nucléiques ne sont pas spécifiques à une séquence particulière. L’analyse de leur abondance après un passage prolongé en condition froide n’a pas permis de déceler une augmentation importante de l’abondance des deux protéines et celles-ci sont également incapable de complémenter un quadruple mutant des protéines cold-shock chez E. coli. Ces données suggèrent que les CSDs des dinoflagellés ne sont probablement pas des facteurs de transcription séquence-spécifique et qu’ils ont également une fonction différente des protéines bactériennes. La troisième approche consiste en la réticulation in vivo des protéines interagissant avec la chromatine. Après réticulation, la chromatine a été purifiée et les protéines associées à ceux-ci ont été extraites et identifiées par spectrométrie de masse. Parmi les protéines identifiées, il y a un nombre réduit de protéines de liaison à l’ADN en comparaison avec des données similaires chez les animaux. Des peptides provenant d’une histone H4 ont aussi été identifiés, ce qui consiste en une des premières identifications de ce type de protéine chez les dinoflagellés. Plusieurs protéines de liaison à l’ARN ont été identifiées et pourraient permettre de réguler diverses étapes de la biologie des ARNm et ainsi moduler la traduction. Quelques protéines reliées au contrôle du cycle cellulaire et à la réparation de l’ADN ont aussi été identifiées. Mises ensemble, ces trois approches permettent de suggérer que la régulation de la transcription et de l’abondance des ARNm semblent avoir une importance moindre chez les dinoflagellés que chez les autres eucaryotes. Dinoflagellates are a diverse group of unicellular eukaryotes found in marine habitat where they have a major role in the primary production of the ocean and in the formation of coral reefs. They are also responsible for some of the harmful algal blooms whose toxin production can contaminate crustacean and fish. Dinoflagellates possess unique molecular characteristics in eukaryotes, especially for their nucleus. For example, their genome is found in a permanently condensed liquid crystalline state stabilized by metallic cations instead of the nucleosome organized by histones. This condensed form persists throughout the cell cycle and limits transcription to DNA loops localized at the periphery of the chromosomes. These unusual characteristics, coupled with a generally large genome size, have greatly limited the study of basic molecular mechanisms such as transcription regulation. In order to better characterize this process for the dinoflagellates, I used Lingulodinium polyedrum, a dinoflagellate studied extensively for its circadian rhythms. As a first approach, high-throughput sequencing was used to characterize the complete transcriptome of the organism at four different times throughout the day. Surprisingly, this sequencing revealed that an extremely low number of transcripts vary in abundance between time points and that those variations are of low amplitude, a result in stark contrast with what has been observed in other organisms. A pharmacological inhibition of transcription was also done and shows that bioluminescence and photosynthesis rhythms persist in absence of transcription, suggesting that the classical transcription/translation feedback loop used to generate rhythmic timing in eukaryotes is probably absent in Lingulodinium. The second approach was the characterization of two proteins with a cold-shock domain (CSD), a type of domain strongly overrepresented in dinoflagellates and predicted to be a potential transcription factor. Those two proteins showed a preferential binding to single stranded DNA versus double stranded DNA while also being able to bind RNA, and were not specific to a particular sequence. Protein abundance analysis after a prolonged cold shock did not yield a massive increase in the abundance of those two proteins, as seen in E. coli. Furthermore, neither protein was able to complement a quadruple cold shock protein (CSP) mutant in E. coli. Data gathered here suggest that CSD proteins in dinoflagellates are probably iv not sequence-specific transcription factors and may also have a function different from bacterial CSP. The third approach consisted of the in vivo cross-linking of chromatin-interacting proteins. After cross-linking, the chromatin was purified and the proteins associated with it extracted and identified by mass spectrometry. Of the identified proteins, few DNA binding proteins were found, unlike similar studies done in animals. Peptides derived from a histone H4 were discovered, one of the first instances of histone identification in dinoflagellates. Multiple proteins able to bind RNA have been identified and could be used to regulate multiple steps of RNA biology and therefore modulate RNA translation. Some proteins related to cell cycle control and DNA repair were also identified. Taken together, these three approaches support the view that the transcriptional regulation and control over mRNAs abundance seem to have a lower importance in dinoflagellate than in other eukaryotes.

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