Mechanisms Controlling Luminal Identity of Breast Tumours

Le cancer du sein est une maladie hétérogène qui comprend trois types principaux de tumeurs identifiables par analyse de profils d’expression génique : les tumeurs luminales, HER2+ et basal-like. Ces sous-types pourraient résulter d’un blocage à différents stades de la différenciation épithéliale mammaire. Cependant, les mécanismes qui déterminent ces sous-types restent peu explorés. Les tumeurs luminales, qui représentent deux tiers des tumeurs mammaires, sur-expriment le récepteur des oestrogènes alpha (ERα), un facteur de transcription (FT) ligand-dépendant. De plus, elles expriment des niveaux élevés de deux autres FT luminaux, FOXA1 et GATA3, impliqués dans la régulation de l’expression et de l’activité de ERα. En clinique, l’action proliférative du récepteur peut être bloquée par des anti-oestrogènes, mais malheureusement la maladie progresse dans ~50% des cas dû à une résistance au traitement, soulignant le besoin de thérapies additionnelles. Les inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) sont une classe d’agents anti-cancer qui inhibent la proliferation des tumeurs hématologiques et solides. Dans les cellules tumorales mammaires, ils suppriment l’expression de ERα et sa signalisation et induisent la différentiation ou l’apoptose. Ces propriétés ont conduit à l’utilisation combinée d’anti-oestrogènes et HDACi pour le traitement des tumeurs du sein ER+.  Dans ce travail, nous avons effectué une analyse de corrélation dans de grands jeux de transcriptomes de tumeurs mammaires et caractérisé un groupe de gènes luminaux hautement corrélés contenant six FT du lignage luminal : ESR1 (le gène codant pour ERα), FOXA1, GATA3, SPDEF, XBP1 et AR. Nous démontrons via une déplétion par siRNA que FOXA1 régule l’expression de ces gènes de manière prépondérante, et ce malgré l’enrichissement en sites de liaisons de ChIP-Seq d’autres FT luminaux. Ce groupe peut être subdivisé en deux sous-groupes, l’un centré sur ESR1 et GATA3 et l’autre sur FOXA1, suggérant l’existence de tumeurs exprimant ces sous-groupes de manière différentielle. En effet, l’expression de FOXA1, ESR1 et GATA3 permet de ségréger les tumeurs luminales (expression élevée) et basal-like (expression faible). De plus, nous avons observé que les tumeurs de type molecular apocrine, décrites comme dépendantes de la signalisation par le récepteur des androgènes AR et fréquemment HER2+, présentent un profil FOXA1high ESR1low GATA3low. L’expression ectopique de ERα dans les cellules tumorales SK-BR-3, de type molecular apocrine, (1) induit une ouverture de la chromatine à des éléments cibles liés faiblement par FOXA1 et (2) récapitule une partie de la réponse oestrogénique des cellules luminales. Ces résultats complémentent des études précédentes décrivant FOXA1 comme un factor pionnier pour la liaison de ERα à ses éléments de réponse. L’absence d’expression de ESR1 dans les cellules SK-BR-3, en dépit de hauts niveaux d’expression de son facteur régulateur amont FOXA1, corrèle avec une liaison faible de FOXA1 et des marques de chromatine actives H3K9/K14 sur les régions régulatrices amont de ESR1.  Dans la seconde partie de notre étude, nous montrons de plus que les HDACi reprogramment la transcription des cellules de cancer du sein, entraînant une suppression des FT du lignage luminal FOXA1 and GATA3, et également de plusieurs protéines de remodelage de la chromatine, et des traits de différenciation lactogénique. La suppression de l’expression des FT luminaux par des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels implique l’acétylation de substrats protéiques restant à identifier. De manière globale, l’identification de réseaux transcriptionnels qui sous-tendent les sous-types de tumeurs mammaires et d’interrupteurs moléculaires contrôlant leur expression/fonction aidera à déterminer si leur modulation permet de reprogrammer les cellules de cancer du sein vers un phénotype moins agressif. Breast cancer is a heterogeneous disease comprising three major molecular subtypes that can be identified by gene expression profiling: luminal, HER2-positive, and basal-like. These subtypes are thought to arise from a block at different stages of breast epithelial cell differentiation. However, the mechanisms underlying subtype specification remain largely unexplored. Luminal tumours, which account for two-thirds of breast tumours, overexpress estrogen receptor alpha (ERα), a ligand-inducible transcription factor (TF). These tumours additionally express high levels of FOXA1 and GATA3, two luminal-lineage TFs, that have been reported to regulate both expression and activity of the receptor. In the clinic, the proliferative actions of the receptor can be blocked with antiestrogens, but unfortunately ~50% of patients will relapse due to resistance, highlighting the need for additional therapies. Histone deacetylase inhibitors (HDACis) are a class of anticancer agents with anti-proliferative activity in both solid and haematological tumours. In breast cancer, these drugs were shown to suppress ERα expression/signalling, and induce differentiation and apoptosis. These properties have led to the combined use of HDACis and antiestrogens in clinical trials for treatment of ERα-positive breast tumours. In the present work, we have utilized gene correlation analysis in large breast tumour transcriptome datasets and characterized a cluster of highly correlated luminal genes containing six luminal-lineage TFs: ESR1 (gene encoding ERα), FOXA1, GATA3, SPDEF, XBP1 and AR. We show using siRNA-mediated depletion that FOXA1 dominantly positively regulates expression of the cluster despite its enrichment in ChIP-Seq binding sites of other luminal TFs. Interestingly, this cluster partitions into two subclusters, one centered around FOXA1, and the other, around ESR1 and GATA3, suggesting the presence of tumours that differentially express either subcluster. Indeed, expression of ESR1, FOXA1 and GATA3 can readily segregate luminal tumour samples (high expression) from basal-like ones (low expression). Furthermore, we found that molecular apocrine tumours, previously described as frequently HER2-positive, and androgen receptor signalling-dependent, are FOXA1high ESR1low GATA3low. Ectopic expression of ERα in molecular apocrine SK-BR-3 cells could (1) recapitulate part of the estrogen response observed in luminal cells and (2) also result in chromatin opening and transcriptional regulation of target genes weakly pre-bound by FOXA1. This is complementary to previous studies describing FOXA1 as a factor that pioneers ERα binding at its target genes. Notably, lack of ERα expression in SK-BR-3 cells, despite high expression of its upstream regulatory factor FOXA1, coincided with weak FOXA1 binding and reduced recruitment of active H3K9/K14 marks at upstream ESR1 regulatory regions.  In the second part of our study, we further show that HDACis transcriptionally reprogram breast cancer cells resulting in downregulation of luminal-lineage TFs FOXA1 and GATA3, as well as many chromatin remodelling proteins, while inducing expression of lactogenic differentiation genes. Shutdown of luminal TFs occurred through both transcriptional and post-transcriptional mechanisms that involved modulated acetylation of protein substrates to be identified. Altogether, identification of transcriptional networks that demarcate breast tumour subtypes and molecular switches controlling their function/expression will help determine whether their perturbation can rewire breast cancer cells towards a less aggressive phenotype.

Keyphrases: ERα, FOXA1, GATA3, HDAC, Cancer du sein, FT luminaux, Inhibiteur d’HDAC, Reprogrammation transcriptionnelle, Acétylation, Breast cancer, ERα, FOXA1, GATA3, Luminal TFs, HDAC, HDAC inhibitors, Transcriptional reprogramming, Acetylation