Optophysiologie SERS : analyse in vitro d’environnement cellulaire en Raman exalté par les surfaces

Afin d’assurer la communication et la régulation de leur métabolisme, les cellules vivantes sécrètent une panoplie de petites et grandes molécules agissant comme messagers chimiques. Ces messagers sont généralement libérés dans l’environnement extracellulaire et diffusent jusqu’à l’atteinte d’une cible moléculaire bien précise. Cet évènement de reconnaissance biologique induit une cascade de réactions biochimiques qui sont le fondement des fonctions biologiques des cellules. Un dysfonctionnement associé à la sécrétion de messagers chimiques est associé à plusieurs conséquences cliniques. Par exemple, un changement de composition des neurotransmetteurs lors de la libération synaptique dans le cerveau est associé à la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression, les dépendances et la schizophrénie. L’analyse des messagers chimiques est donc d’une grande importance dans le domaine clinique. Néanmoins, les méthodes analytiques contemporaines ne sont pas aptes à mesurer les changements rapides et hétérogènes des messagers chimiques lors d’évènements de sécrétion cellulaire. De nouvelles techniques permettant une analyse hautement sensible de plusieurs messagers chimiques simultanément et de manière localisée sont nécessaires. Les matériaux plasmoniques permettent l’utilisation de spectroscopies exaltée par les métaux comme la diffusion Raman exaltée par les effets de surfaces (SERS). Grâce à la spécificité moléculaire du SERS et à sa haute sensibilité, pouvant atteindre la détection d’une seule molécule, les capteurs SERS offrent divers avantages permettant le développement de nouvelles technologies dédiées aux mesures des sécrétions cellulaires.  L’objectif principal de la thèse est la mise au point de nouveaux capteurs SERS permettant l’analyse des sécrétions cellulaires avec une haute sensibilité et une haute sélectivité. Pour y arriver, des nanoparticules d’or furent adsorbées sur des capillaires de verres nanométriques de type patch clamp. L’immobilisation des nanoparticules sur ces patch clamp génère un nanocapteur plasmonique pouvant être positionné dans l’espace, tout en conservant un état d’agrégation constant, facteur clé en SERS. Ces nanocapteurs furent donc positionnés près de cellules in vitro, puis des spectres SERS furent acquis dans le temps. Afin d’analyser cette réponse optique complexe, de nouvelles méthodes chimiométriques ont été développées. Comme première approche, un code-barres unique fut extrait à partir de chaque parton vibrationnel expérimental mesuré par SERS dans le temps, puis comparés à ceux d’une librairie extraient à partir de standards. Cette comparaison permet : (1) l’identification de la molécule selon son code-barres et (2) une analyse semi-quantitative en dénombrant le nombre de fois qu’un code-barres fut identifié sur une période de temps précise. Cette méthode chimiométrique, définie comme l’optophysiologie SERS, fut employée pour sonder les métabolites extracellulaires sécrétés par des cellules MDCKII au niveau basal et post-stimulation. Par sa nouveauté, l’optophysiologie requiert une optimisation des paramètres d’analyse, limitant sa capacité de multiplexage et son adaptation pour la détection de nouvelles cibles moléculaires. Afin d’en améliorer la sensibilité et la sélectivité, un nouvel algorithme d’évaluation des codes-barres fut implémenté à l’optophysiologie. Ce nouvel algorithme fut employé pour sonder les neurotransmetteurs sécrétés par des neurones dopaminergiques originaires du mésencéphale de souris. De plus, afin de visualiser les neurones et positionner correctement les nanocapteurs près des varicosités axonales, sites de libération majeure des neurotransmetteurs, un microscope combiné permettant l’imagerie de fluorescence et la spectroscopie Raman fut construit. À l’aide de ces outils, il fut possible de mesurer les changements relatifs de concentration in vitro de cinq neurotransmetteurs dans des conditions basales et durant plusieurs cycles de stimulation.  Les performances analytiques de l’optophysiologie SERS dépendent, majoritairement, des codes-barres utilisés pour l’analyse, nécessitant donc une optimisation laborieuse de ces derniers. Cette optimisation constitue un obstacle majeur pour la translation de l’optophysiologie SERS vers le domaine clinique. Pour pallier à ce problème, plusieurs codes barre furent attribués par molécule et analyser, de manière analogue à de la reconnaissance faciale, par un réseau neuronal artificiel. L’optophysiologie SERS couplée à de l’intelligence artificielle a permis la détection de plus de sept métabolites extracellulaires associés au métabolisme de carbone, de l’azote et de l’énergie dans des cellules cancéreuses et contrôles. Les expériences présentées dans la thèse montrent le potentiel d’application de l’optophysiologie SERS pour la détection de métabolites sécrétés par des neurones, ou d’autres types de cellules présentant divers phénotypes, afin d’en étudier les fonctions biologiques normales ou celles associées à une pathologie. Ces nouvelles technologies mèneront certainement à des percées importantes dans différents domaines cliniques et scientifiques. To insure the signalling and regulation of their metabolism, living cells secrete a plethora of small and large molecule referred as chemical messengers. These messengers are generally secreted into the extracellular space, and diffuse until they reached a specific molecular target. The resulting biological recognition event between a chemical messenger and its dedicated molecular receptor induces a cascade of biochemical reactions, corresponding to the fundamental function of biological cells. However, a dysfunction associated to the secretion of these chemical messengers is linked to multiple clinical diseases. As an example, a change in the composition of neurotransmitters released during synaptic transmission in the brain is associated to Alzheimer disease, Parkinson disease, depression, addiction and schizophrenia. Thus, the analysis of the chemical messenger is of great clinical interest. However, modern analytical methods are ill suited to capture the fast and heterogeneous changes in chemical messengers during secretion events. New technologies allowing a sensitive and simultaneous monitoring of chemical messengers in a local and non-destructive way is needed.  Plasmonic materials enable surface enhanced spectroscopies such as surface enhanced Raman scattering (SERS). With the molecular selectivity of SERS, and its high sensitivity, capable of detecting a single molecule, SERS sensors offer multiple advantages allowing the development of new technologies adapted for monitoring cellular secretion.  The main objective of the thesis is the development of a novel SERS sensor capable of monitoring cellular secretion with both high sensitivity and selectivity. To achieve this goal, gold nanoparticles were electrostatically adsorbed onto a nanometric sized patch clamp glass capillary. The immobilization of the nanoparticles led to the generation of plasmonic nanosensors, which can be positioned in space while keeping a constant aggregation state, a key parameter in SERS.  These nanosensors were then positioned near cells in vitro and SERS spectra were acquired in time. In order to analyze the complex optical response, novel chemometric approaches were developed.   As a starting point, a unique barcode was extracted from each experimental SERS spectrum detected in time, and then compared with a spectral database of SERS barcode extracted from various standards. This approach enabled (1) identification of the molecule according to the barcode, and (2) a semi-quantitative analysis by counting the number of times the barcode, for each standard, was detected within a defined timescale. This chemometric method, referred as SERS optophysiology, was applied to monitor abundant metabolites in the extracellular environment near MDCKII cells in both basal and stimulated conditions. As this is a new method, SERS optophysiology required optimization of its hyper-parameters prior to the analysis, thus limiting its multiplex capability and adaptation to detect novel molecular targets.  To improve the analytic performance of SERS optophysiology, we implemented a new algorithm to evaluate the barcodes. This new algorithm was applied to monitor neurotransmitters secreted by dopaminergic neurons from mice mesencephalon. Also, to visualize the neurons and correctly positioned the nanosensor near axonal varicosities, a hyphenated fluorescence-Raman microscope was built. With these tools, we successfully monitored the relative changes in concentration of five neurotransmitters in basal condition and throughout multiple stimulation cycles.  Although improved, the analytical performances of SERS optophysiology depend mostly on the barcode data processing which thus required an extensive optimization to achieve good selectivity and sensitivity, limiting the translation of these technologies to other users. To overcome this limitation, multiple barcodes were thus associated to a single standard and analyzed with an artificial neural network, analogous to facial recognition. Machine learning driven SERS optophysiology enabled the detection of more than seven metabolites associated to the metabolism of carbon, nitrogen and energy of healthy and cancerous cell lines.  The experiments presented in the thesis show the application potential of SERS optophysiology for the detection of secreted metabolites by neurons, or other type of cells exhibiting different phenotype, in order to investigate biological functions in a normal or disease state. These novel technologies thus hold a promising potential for significant discoveries in many fields of medicine and general science.

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