La régulation de l’hepcidine à travers les récepteurs Toll-like dans les macrophages

L'interaction entre le système immunitaire et le métabolisme du fer est bien illustrée par l'anémie des maladies chroniques (ACD), qui est fréquemment rencontrée dans les infections chroniques, l'inflammation et le cancer. La majorité des modifications dans les paramètres du fer observées dans l’ACD tient compte des modifications de l’homéostasie du fer, avec la délocalisation du métal de la circulation et les sites de l'érythropoïèse au compartiment de stockage dans les macrophages. Les mécanismes de la réponse hyposidérémique impliquent des cytokines, notamment TNF-alpha et IL-6, qui régulent les niveaux de plusieurs gènes du métabolisme du fer, y compris les transporteurs de fer et de l'hepcidine, un régulateur négatif de l’absorption du fer, ce qui entraîne l'inhibition de l'exportation du fer à travers la ferroportine 1 (FPN1) au niveau de l'intestin et les macrophages. Des études antérieures ont montré que l'IL-6 induit l’expression d’hepcidine dans les hépatocytes, mais il y a très peu de données concernant la façon par laquelle l'hepcidine et la FPN1 sont régulées dans les macrophages. Récemment, nous avons constaté que l'induction de l'hepcidine dans le foie par le lipopolysaccharide (LPS) dépend de la voie de signalisation médiée par le récepteur Toll-like 4 (TLR4). Le but de ce travail est d’identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages et de déterminer l’exigence des TLRs dans l’induction de l’hepcidine et le développement d’hyposidérémie. En plus, nous voulons étudier l’effet de l’inflammation causée par les ligands des TLRs sur le taux de fer sérique, la production des cytokines et l'expression de l’hepcidine et de la ferroportine. D’autre part nous voulons étudier l’effet du taux du fer sur la production d’IL-6 macrophagique en réponse à la stimulation par le TLR4. D'abord, pour identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages, nous avons traité les macrophages RAW 264.7 et les macrophages péritonéaux de souris (MPMs) avec différents ligands TLRs et on a mesuré l’expression de l'hepcidine par qRT-PCR. Nous avons observé que Pam3CSK4 (Pam), un ligand de TLR2/1; LPS, un ligand de TLR-4 et FSL1 un ligand de TLR2/6 induisent l’expression de l'hepcidine dans les cellules RAW 264.7 et les MPMs, contrairement au polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I: C), un ligand  de TLR3. De plus, LPS était capable de réprimer l’expression de la ferroportine dans les cellules RAW 264.7. Afin de mieux définir la nécessité des TLRs pour assurer cette expression, nous avons utilisé les souris TLR-2 knock-out et on a établi que l'expression de l'hepcidine dans les macrophages par LPS, Pam ou FSL1 est dépendante du TLR2. En accord avec les expériences in vitro, les études effectuées in vivo ont montré que LPS réprime l’expression de la ferroportine, ainsi que PolyI:C n’est pas capable de stimuler l'expression d'hepcidine hépatique, par contre il était efficace pour déclencher une hyposidérémie. Ensuite, on voulait déterminer la voie de signalisation utilisée dans l’induction de l’hepcidine dans les macrophages. Comme il y deux voies majeures connues pour la signalisation des TLRs : une dépendante et l’autre indépendante de la protéine MyD88, on a étudié l’expression de l’hepcidine dans les MPMs isolés des souris MyD88-/- et nous avons constaté que l'absence de signalisation MyD88 abolit l'induction de l'hepcidine déclenchée par Pam, LPS et FSL1. D’autre part, la stimulation avec du LPS induisait in vivo la production d’IL-6 et de TNF-alpha, et la stimulation d’IL-6 était renforcée in vitro par la présence du fer. Ces observations indiquent que l’expression de HAMP (Hepcidin Antimicrobial Peptide) dans les macrophages peut être régulée par différents TLRs, ce qui suggère que la production d'hepcidine macrophagique fait partie d'une réponse immunitaire activées par les TLRs. The interaction between the immune system and iron metabolism is well exemplified in the anemia of chronic disease (ACD), which is frequently encountered in chronic infections, inflammation and cancer. The major changes in iron parameters observed in ACD ultimately reflect modifications in iron trafficking, with relocation of the metal from both the circulation and sites of erythropoiesis to the storage compartment in macrophages. Mechanisms in the hypoferremic response involve cytokines, including TNF-alpha and IL-6. These pro-inflammatory cytokines regulate the levels of several iron metabolism genes, including iron transporters and hepcidin, a negative regulator of iron absorption, resulting in the inhibition of iron export by ferroportine 1 (FPN1) from the intestine and macrophages. Previous studies showed that IL-6 upregulates hepcidin in hepatocytes, but there are very few data regarding how hepcidin and FPN1 expression is regulated in macrophages. More recently, we found that hepcidin induction in the liver by lipopolysaccharide (LPS) is dependent on the signaling pathway mediated by toll-like receptor 4 (TLR4). The aim of this work is to identify TLR ligands able to induce hepcidin in macrophages and to determine the requirement for TLRs in hepcidin expression and the development of hypoferremia. In addition, we want to study the effect of inflammation induced by TLR ligands on serum iron levels, cytokine production, hepcidin and ferroportin expression. On the other hand we want to study the effect of iron levels on IL-6 production by macrophages in response to TLR4 stimulation. First, to identify TLR ligands capable of inducing hepcidin in macrophages, we treated Raw 264.7 macrophages and thioglycollate-stimulated mouse peritoneal macrophages (MPMs) with various TLR ligands and measured hepcidin and ferroportin expression by real-time RT-PCR. We observed that Pam3CSK4 (Pam), a TLR1/2 ligand; LPS, a TLR-4 ligand; and FSL1 a TLR6/2 ligand, but not polyinosinic: polycytidylic acid (poly I:C), a TLR3 ligand, upregulate hepcidin expression in both Raw 264.7 cells and MPMs. Furthermore, LPS was able to repress ferroportine expression in RAW 264.7 macrophages. To further define the requirement for the identified TLRs, we used TLR-2 knockout mice and established that upregulation of macrophage hepcidin expression by Pam or FSL1 is TLR2 dependent, respectively. In agreement with the in vitro experiments, when tested in vivo LPS repressed ferroportine expression and polyI:C failed to induce hepatic hepcidin expression but was effective in triggering hypoferremia. We next investigated whether MyD88, the predominant but not exclusive intracellular signal transduction pathway for TLR-4, is necessary for hepcidin induction in macrophages. Using MyD88 knockout mice, we found that the absence of MyD88 signaling abolishes hepcidin induction triggered by Pam, LPS and FSL1. On the other hand, stimulation with LPS induced in vivo the production of IL-6 and TNF-alpha, and IL-6 stimulation was enhanced in vitro by high amount of iron in macrophages.These observations indicate that HAMP (Hepcidin Antimicrobial Peptide) expression in macrophages can be regulated through multiple TLRs, suggesting that macrophage hepcidin production is part of an immune response activated by the TLRs.

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