Relation entre CaMKII et les dynamiques calciques endothéliales : impact de l'hypertension arterielle

L’endothélium vasculaire joue un rôle prépondérant dans la régulation du tonus vasculaire en générant l’oxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mécanismes requièrent le calcium (Ca2+) à divers niveaux, démontrant l’importance des dynamiques calciques endothéliales. Une perturbation de l’homéostasie calcique est observée dans une dysfonction endothéliale liée à l’hypertension artérielle. Il est impératif d’approfondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothéliales impliquées dans le contrôle du tonus vasculaire.  Des études récentes ont montré qu’une variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour générer une réponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractérisés par une augmentation de [Ca2+]i spontanée et transitoire spécifiquement localisée au niveau des projections myoendothéliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilégiés entre les cellules endothéliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqués dans le mécanisme de l’EDHF via l’activation des canaux potassiques Ca2+-dépendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thèse visent à améliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractérisant une nouvelle voie de signalisation pouvant être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu d’informations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une première étude a permis d’identifier la protéine kinase II dépendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes α, β et δ dans les CEs d’artères natives de souris comme une cible pouvant être modulée par les pulsars calciques. Des études en immunofluorescence ont permis d’observer la localisation particulière de CaMKII endothéliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spécifique des pulsars calciques par la phényléphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active l’oxyde nitrique synthase endothéliale (NOS3), nous avons évalué l’impact d’une stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en présence d’un inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons démontré que la production de NO est en partie dépendante de l’activation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modèle d’hypertension induite par l’infusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en évidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde étude nous avons établi deux modèles (normo- et hypertendus) d’infusion chronique à l’angiotensine II (AngII) afin évaluer l’impact des ROS et de l’hypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos résultats ont montré une augmentation des pulsars calciques accompagnée d’un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue à l’AngII suggère que les ROS modulent les dynamiques calciques et que l’AngII stimule la production de NO. Cette étude propose que ces voies de signalisations impliquent les récepteurs de type 1 et 2 à l’AngII (AT1 et AT2).  L’étude des pulsars calciques dépend fortement de la structure native des artères qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernière étude présentée dans cette thèse a permis d’établir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artères mésentériques, pulmonaires et coronariennes). Nos résultats ont montré que les paramètres cinétiques des pulsars calciques sont fortement conservés entre les différents lits vasculaires. Toutefois, la fréquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffèrent avec une proportion plus élevée dans les artères mésentériques et coronariennes comparativement aux artères pulmonaires. Ces résultats corrèlent avec le nombre plus élevé de PMEs retrouvé dans les artères mésentériques et coronariennes. Ces travaux suggèrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artères de résistance. Les études de cette thèse ont mené à l’identification d’une nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothéliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent être fortement conservés entre les différentes artères de résistances et ce malgré la disparité dans les PMEs, suggérant un rôle prépondérant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le développement de potentielles cibles thérapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothéliale associée à l’hypertension artérielle. In humans and in various animal models, the pathology of hypertension is often associated with an endothelial dysfunction characterized by a loss of balance between vasodilator and vasoconstrictor factors derived from the endothelium. The vascular endothelium plays a crucial role in the regulation of vascular tone by synthesizing and releasing NO, PGI2 and EDHF as potent vasodilators. These mechanisms require Ca2+ at different levels, showing the importance of endothelial calcium dynamics and their signaling pathways in endothelial function. Moreover, an alteration in Ca2+ homeostasis is observed in endothelial dysfunction associated with hypertension. Therefore, it is imperative to increase our knowledge on the various endothelial Ca2+ signaling involved in the control of vascular tone.  Recent studies show that local change in [Ca2+]i is sufficient to generate a significant physiological response. Ca2+ pulsars are characterized by a spontaneous and transient increase in [Ca2+]i specifically localized within myoendothelial projections (MEPs). Those MEPs are privileged communication sites between endothelial cells (ECs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). Ca2+ pulsars are involved in the EDHF mechanism through activation of Ca2+-dependent potassium channels KCa3.1, suggesting a role in modulation of VSMCs contractility. This thesis aims to improve our knowledge on local Ca2+ signaling by characterizing a new signaling pathway that might be involved in the regulation of vascular tone in physiopathology. So far, besides KCa3.1 channels, little information is known on targets sensitive to Ca2+ pulsars. Thus, a first study identified the CaMKII as an attractive target that can be modulated by Ca2+ pulsars in native ECs from mesenteric arteries. CaMKII has the ability to decode Ca2+ oscillations similar to Ca2+ pulsars. This study first demonstrated that CaMKII is expressed in its isoforms α, β and δ in mice mesenteric arteries. Then, immunofluorescence studies have showed the particular localization of endothelial CaMKII within MEPs (Ca2+ pulsars sites).  In addition, specific stimulation of Ca2+ pulsars with PE generates a recruitment of CaMKII within MEPs. Data from the literature suggest that CaMKII activates the NOS3, we evaluated the impact of Ca2+ pulsars stimulation on NO production in the presence of a CaMKII inhibitor, the KN-93. We have demonstrated that production of NO is partly dependent on the activation of CaMKII by Ca2+ pulsars. Finally, we have established a hypertension model induced by chronic infusion of PE, which showed an alteration in the relationship between Ca2+ pulsars and CaMKII. However, this particular model generates few ROS which is an important component involved in endothelial dysfunction associated with hypertension. In a second study, we established two chronic infused (normo- and hypertensive) AngII mice models to evaluate the impact of ROS and hypertension on Ca2+ pulsars/CaMKII/NO signaling pathway. Our results showed an increase in Ca2+ pulsars frequency along with a recruitment of CaMKII within MEPs. Acute AngII stimulation experiments supports data from the literature suggesting that ROS modulate Ca2+ dynamics and that AngII stimulated NO production. This study proposes that these signaling pathways involve AngII AT1 and AT2 receptors.  Ca2+ pulsars study strongly depends on the native structure of the artery maintaining MEPs. Evidence shows that MEPs appear to vary between vascular beds, species and pathophysiological conditions. The latest study presented in this thesis has established a relationship between MEPs and Ca2+ pulsars in three distinct vascular beds (mesenteric, pulmonary and coronary arteries). Our results first showed that Ca2+ pulsars kinetic parameters are highly conserved among different vascular beds. However, Ca2+ pulsars frequency and number of active sites differ with a greater proportion in mesenteric and coronary arteries compared to pulmonary arteries. These results correlate with the highest number of MEPs found in mesenteric and coronary arteries. This study suggests that MEPs are essential to Ca2+ pulsars, which are fundamental for resistance arteries.  Studies of this thesis led to the identification of a novel signaling pathway involving Ca2+ pulsars and endothelial CaMKII in stimulating NO production. This new signaling pathway may be involved in the regulation of vascular tone in pathophysiological conditions. Moreover, Ca2+ pulsars appear to be highly conserved among different resistance arteries despite the disparity in MEPs suggesting a key role in vascular function. This work opens an avenue for development of potential therapeutic targets that can counter endothelial dysfunction associated with arterial hypertension.

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