Développement d’une plateforme de criblage par SPR pour la caractérisation d’inhibiteurs de la DHFR R67

L'objectif du projet de recherche est de développer une méthode de criblage d’inhibiteurs basée sur une technologie émergente, soit un dispositif portatif utilisant la résonance des plasmons de surface (SPR).  La cible du criblage est la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), une enzyme qui confère une résistance bactérienne à l'antibiotique triméthoprime. Ici, l'enzyme cible est immobilisée sur une surface d'or mince avec des propriétés plasmoniques (optiques) spécifiques qui varient en fonction de la masse des molécules se liant à cette surface. Cette technique permet de suivre les événements de liaison de molécules à la DHFR R67 immobilisée, et ainsi peut permettre l'identification d'inhibiteurs potentiels. Cependant, la masse molaire des inhibiteurs typiquement utilisés lors de criblages préliminaires (i.e. 500-1000 g/mol) est trop faible pour générer un signal SPR détectable. Afin de contrer cette lacune, ce mémoire a pour objet de développer un essai compétitif indirect qui mettra en jeu des molécules de masse supérieure. D’abord, une nanoparticule d'or portant un analogue de substrat se liera à la DHFR R67 immobilisée à la surface d’or, générant ainsi un signal SPR important en raison de la masse molaire élevée de la nanoparticule. Ensuite, lors du criblage d'inhibiteurs potentiels, les nanoparticules liées seront déplacées de l'enzyme cible si la molécule criblée fournit une affinité suffisante. Ainsi, il sera possible de suivre indirectement la liaison d'un inhibiteur à la cible.  Ce projet vise donc à tester et à valider l'approche de criblage SPR appliquée à la DHFR R67. The objective of the research project is to develop a method for inhibitor screening based on a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) device, an emerging technology.  The target is R67 dihydrofolate reductase (R67 DHFR), an enzyme that confers bacterial resistance to the antibiotic trimethoprim. Here, the target enzyme is linked to a thin gold surface having specific plasmonic (optical) properties that vary as a function of the mass of bound molecules. This allows monitoring binding to the surface-linked R67 DHFR, and thus permits identification of inhibitors. However, the mass of the low-affinity inhibitors typically identified in early stages of screening (i.e. 500-1000 g/mol) is too low to produce a significant SPR signal. To address this shortcoming, a competitive assay will be developed: a gold nanoparticle carrying a substrate analog will bind the surface-immobilized R67 DHFR, resulting in a strong SPR signal due to its high mass. Then, upon screening for potential inhibitors, the bound nanoparticle will be displaced from the target enzyme if a molecule provides sufficient affinity. By those means, it will be possible to indirectly monitor the binding of an inhibitor to the target.  This goal of this project is to test and validate the SPR screening approach applied to R67 DHFR.

Keyphrases: Chimie médicinale, Enzymologie, Développement de plateforme de criblage, Résonance des plasmons de surface, Dihydrofolate réductase R67, Biophysique, Medicinal chemistry, Enzymology, Screening platform development, Surface plasmon resonance, R67 dihydrofolate reductase, Biophysics