Effets de l'estradiol et du chargement mécanique sur la régulation de la POC5 et du récepteur ADGRG7 dans la scoliose idiopathique

La scoliose est une déformation complexe en 3D de la colonne vertébrale ayant une prévalence de 1.5-3% dans la population générale. La forme la plus commune est la scoliose idiopathique (SI) qui inclue la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) affectant principalement les filles au cours de la puberté. L’étiologie est largement inconnue, mais les observations cliniques révèlent un rôle de l’hérédité ainsi que d’une croissance rapide dans le développement de la SIA. Il existe une forte évidence qu’une composante génétique entre en jeu dans cette pathologie. Récemment, de nombreux gènes ont été suspectés d’être responsables ou de contribuer à la SI. Notre équipe a identifié des variantes du gène POC5, codant pour une protéine centriolaire, dans une large famille française dont plusieurs membres sont atteints de SI. Dans cette même famille, nous avons suspecté l’implication d’une mutation du gène ADGRG7 (récepteur orphelin appartenant aux récepteurs d’adhésion couplés aux protéines G) dans la pathogénicité de la SI. Au travers de nos travaux, nous nous sommes concentrés sur l’élucidation du rôle des protéines POC5 sauvages et mutantes (in vitro et in vivo) ainsi que sur la régulation de l’expression de POC5 et ADGRG7 par l’estradiol (E2), dans le but de tester si ces gènes pourraient être fonctionnellement liés à la scoliose.  Afin d’investiguer le rôle du gène POC5 dans la SI, nous avons surexprimé la protéine POC5 mutante dans des lignées cellulaires par transfection transitoire (in vitro) et nous avons induit une perte de fonction du gène POC5 dans un modèle animal, le poisson zèbre (in vivo). Le rôle de POC5 a été étudié par : 1) Analyses de spectroscopie de masse et co-immunoprécipitation afin d’identifier les différents partenaires de liaisons entre la protéine sauvage (wt POC5) et mutante (mut POC5); 2) immunolocalisation de la protéine sauvage et mutante au niveau cellulaire; 3) histologie et immunohistochimie réalisés sur des tissus issus de poissons zèbres contrôles (wt POC5) et scoliotiques (mut POC5). Notre travail a permis d’identifier plusieurs protéines partenaires  de la POC5, et nous avons trouvé des interactions fonctionnelles entre ces protéines et la POC5 reliées aux cils et  centrosome. Un certain nombre de protéines ciliaires ont été identifiées comme interagissant avec wt POC5 et non avec mut POC5 comme CEP290, RAB11, CKAP5, Annexine 2 et Septine 9. Au niveau cellulaire, la localisation et la colocalisation des protéines wt POC5 et POC5 mutée avec la tubuline alpha acétylée (marqueur ciliaire), confirme la conséquence de la mutation sur la localisation subcellulaire en relation avec la longueur et l’intensité de la coloration du cil. In vivo, nous avons identifié de nombreux défauts de la rétine et de l’oreille interne chez le poisson zèbre POC5 mutant par rapport au contrôle. Enfin, en utilisant différents marqueurs des couches rétiniennes et la tubuline acétylée, nous avons localisé ces défauts dans le segment externe et les cônes de la rétine.  Afin d’étudier le rôle possible de POC5 et ADGRG7 dans la SI, nous avons examiné comment  POC5 et ADGRG7 est régulé au niveau transcriptionnel. Nous avons utilisé des modèles cellulaires, des ostéoblastes humains dérivées de contrôles et de SIA patient, et nous avons étudié l’expression de la protéine POC5 et ADGRG7 en réponse à une stimulation par l’E2. La région promotrice du gène ADGRG7 a été clonée et analysée pour les éléments cis médiant les effets de l’E2. Les analyses de délétion du promoteur indiquent que le site SP1 dans le fragment 474bp est requis pour une activité basale ainsi que pour une activation hormone-dépendante, et des mutations dans les sites de liaison au sein de cette région résultent en la perte de transactivation. Les résultats d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont montré que le site SP1 ESRα lie le promoteur d’ADGRG7. Nos résultats suggèrent que la régulation de l’expression d’ADGRG7 par l’E2 est due à l’association des protéines ESRα et SP1 au promoteur d’ADGRG7.   La même stratégie expérimentale a été appliquée pour l'étude de la régulation de POC5 par E2. L'analyse de délétion et ChIP ont confirmé la régulation de POC5 à travers ESRα. Basé sur des études de promoteur, qPCR, Western blot et ChIP, cette étude clarifie comment  POC5 et ADGRG7 sont régulées par l’E2.  Un autre aspect de ce projet était d’étudier les différents effets du chargement mécanique sur des cellules, incluant des ostéoblastes humains, exprimant POC5 sauvage ou mutée. Les cellules ont été soumises à un stress mécanique à différents temps, et différentes voies de signalisations (incluant ERK, p38, NFκB) ont été testées. Nos résultats montrent une différence dans la réponse des cellules surexprimant POC5 mutée par rapport aux cellules contrôles. Les effets du chargement comprenant les différentes voies de signalisations ont été montrés comme étant initiés via TRPV4, un canal calcique perméable activé par l’étirement localisé dans le cil primaire et la membrane plasmique. Scoliosis is a complex three-dimensional deformity of the spine, with 1.5–3% prevalence in the general population. The most commonly known type of scoliosis is idiopathic scoliosis (IS), including adolescent idiopathic scoliosis (AIS) affecting principally girls during puberty. The etiology is largely unknown, but clinical observations revealed the role of hereditary and rapid growth in the development of this condition. There exists strong evidence that there is a genetic component to the disease. More recently, several genes were suspected to cause or contribute to IS. Our group identified gene variants of POC5 centriolar protein in a large French family with multiple members affected with IS. In the same family, we suspected the involvement of ADGRG7 (an orphan receptor that belongs to the Adhesion G protein-coupled receptors) gene mutation in the pathogenicity of IS.  In the present work, we focused on elucidating the role of wild type (wt) and mutant (mut) POC5 proteins (in vitro and in vivo) as well as the regulation of POC5 and ADGRG7 by estradiol (E2), with the goal to test whether these genes could be functionally connected with scoliosis.  To investigate the role of POC5 gene in IS, we overexpressed mutant POC5 in cell lines by transient transfection (in vitro study) and created a loss-of-function model in zebrafish (in vivo study). The role of POC5 was investigated by: 1) mass spectroscopy analysis and co-immunoprecipitation to identify differences in binding partners between the wt POC5 and mut POC5 proteins; 2) immunolocalization of wt and mut POC5 proteins at the cellular level; 3) histology and immunohistochemistry performed on tissues from wt (control) and scoliotic (poc5 mut) zebrafish. Our work identified several interacting partners with POC5, and documented functional connections with respect to cilia and centrosome dysfunction. A number of ciliary proteins were identified to be interacting with wt POC5 but not mut POC5 like CEP290, RAB11, CKAP5, Annexin 2 and Septin 9. At the cellular level, localization and co-localisation of wt POC5 and mut POC5 protein with alpha acetylated tubulin (cilia marker), confirmed the consequence of the mutation on subcellular location with respect to cilium length and staining intensity. In vivo, several defects in the retina of zebrafish and inner ear were identified in mutpoc5 zebrafish compared to wt zebrafish. Finally, using different markers for retinal layers and alpha acetylated tubulin, the defects were localized in the outer segment layer and cones of the retina.   To further investigate the possible roles of POC5 and ADGRG7 in IS, we examined how  POC5 and ADGRG7 are regulated at the transcriptional level. Human osteoblasts derived from control and AIS patients were used as a cell model, and the expression of POC5 and ADGRG7 protein was monitored upon E2 stimulation. The promoter region of the human POC5 and ADGRG7 gene was then cloned and analyzed for functional cis-elements mediating effects of E2. Deletion analysis of the ADGRG7 promoter indicates that the SP1 site in the 474bp fragment is required for both basal activity and hormone-induced activation, and mutations of the binding sites within this region result in the loss of transactivation. Further results from chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay showed that SP1 and ESRα bind to ADGRG7 promoter. Our results suggest that the regulation of ADGRG7 expression by E2 is due to the association of ESRα and SP1 proteins to ADGRG7 promoter. The same experimental strategy was applied for studying the POC5 regulation by E2. Deletion analysis and ChIP confirmed the regulation of POC5 through ESRα. Through promoter studies, qPCR, and western blot and (ChIP) assay, this study clarifies how POC5 and ADGRG7 are regulated by E2.  Another aspect of this project was to study the differential effects of mechanical stress on wt and mut POC5 expressing cells, including human osteoblasts. Cells were exposed to mechanical stress for different time points and then different signalling pathways (including ERK, p38, NFκB) were tested. Our results show that there is difference in the response of control normal cells and cells overexpressing the mut POC5. The effects of loading including the signalling pathways were found to be initiated through TRPV4 which is a stretch-activated Ca2+- permeable channel and localizes to the primary cilium and plasma membrane.  The importance of this work is that it covers several factors that contribute to the pathogenesis of AIS. Based on our findings, AIS is a complex multifactorial disease where POC5, cilia, E2 and mechanical load intreplay in the pathogenesis of the disease. The significance of this work is that it puts the basics for understanding the molecular mechanisms that are implicated in AIS.

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