Études de perturbations de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli : mécanismes de vulnérabilités ou de résistances

L’augmentation de l’incidence des infections bactériennes par des souches résistantes, multirésistantes, voire même ultrarésistantes, aux antibiotiques, combinés à la crise de découverte de nouvelles molécules depuis les années 1960 et du sous-investissement chronique de certains états dans la recherche publique, pourrait coûter la vie à 10 millions d’êtres humains par an d’ici 2050. L’écrasante majorité des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont des bactéries à Gram négatif. Ceci est notamment dû à la composition intrinsèque de leur enveloppe, leur permettant d’être insensibles à de nombreuses molécules pourtant létales pour d’autres types de bactéries. L’étude des composants et des mécanismes de biosynthèse de l’enveloppe, qui sont essentiels au maintien de l'intégrité des bactéries et peuvent être impliqués dans leur virulence, devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le premier chapitre, nous allons tout d’abord faire un tour d’horizon des éléments composant l’enveloppe des bactéries à Gram négatif, des mécanismes de résistance aux antibiotiques et du danger que représentent les bactéries à Gram négatif. Mes résultats de recherches, présentés sous forme de quatre articles aux chapitres deux à cinq, sont précédés d’une mise en contexte des recherches propres aux deux laboratoires, portant d’une part sur les biofilms et la mobilité de Vibrio cholerae et d’autre part sur l’enveloppe de Escherichia coli. Dans le premier article, nous avons déterminé par quel mécanisme la polymyxine B en concentration sous-inhibitrice affecte la formation de biofilm chez Vibrio cholerae. Nous avons observé que la polymyxine B affecte principalement le flagelle par une action mécanique. La formation de biofilm nécessitant le flagelle dans ses premières étapes de formation, nous avons conclu que l’action de la polymyxine B prévenait ce changement d’état. Dans le second article, nous avons conçu un protocole d’évolution expérimentale qui nous a permis d’identifier des mutations dans différents gènes permettant à Vibrio cholerae de se déplacer plus rapidement en présence de concentration sous-inhibitrice de polymyxine B. Nous avons alors identifié chez plusieurs souches différentes mutations ayant probablement réduit ou anéanti la fonction des protéines IhfA, DacB, VacJ (MlaA) et MlaF. En nous basant sur la littérature, nous proposons que la perte de fonction de ces   5 protéines induisant l’augmentation de la mobilité en présence de polymyxine B puisse s’expliquer selon trois mécanismes, impliquant la stabilité de l’enveloppe, la sécrétion de vésicules de membrane ou une altération de l’expression de différents gènes. Dans le troisième article, nous avons étudié l’implication du stress oxydatif dans l’arrêt de la synthèse de la paroi qui est fatal au mutant ∆elyC de Escherichia coli. Nous avons alors démontré que la lyse du mutant ∆elyC est causée par la surproduction de radicaux hydroxyles dans son enveloppe. Cette molécule cause des dommages dans l’enveloppe suffisamment importants pour provoquer l’arrêt de synthèse de la paroi. Le mécanisme provoquant cette surproduction de radicaux toxiques reste encore à déterminer. Par le biais de l’étude de la fonction du facteur ElyC, nous avons découvert une nouvelle vulnérabilité dans l’homéostasie de l’enveloppe qu’il nous tarde de pouvoir exploiter. Dans le dernier article, nous avons étudié l’importance de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries dans le processus létal apparaissant en l’absence du facteur ElyC. Nous avons découvert que le mutant ∆elyC accumule un élément commun aux voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries, l’undécaprényl pyrophosphate. Nous avons également découvert que l’augmentation du recyclage de cette dernière via la surexpression du gène codant pour la protéine PgpB permettait de prévenir la lyse du mutant. Notre hypothèse est que l’absence de ElyC induit une mauvaise répartition de l’undécaprényl phosphate entre les voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries. La suractivité de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries induirait l’accumulation d’undécaprényl pyrophosphate provoquant l’inhibition de Pbp1b, empêchant l’ajout de nouvelles sous-unités à la paroi conduisant ainsi à la lyse du mutant ∆elyC. Ainsi l’ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre et d’identifier des vulnérabilités de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli, de préciser certains mécanismes ainsi que d’entrevoir le rôle de divers facteurs impliqués dans l’homéostasie de leur enveloppe. The increased incidence of bacterial infections by resistant, multiresistant and even extensively drug-resistant strain, combined with the crisis of new molecules discovery since the 1960s and the chronic underinvestment of certain states in public research, could cost 10 million human lives per year by 2050. The overwhelming majority of resistant bacteria are the Gram-negative one. This is mainly due to the intrinsic composition of their envelope, allowing them to be insensitive to many molecules yet lethal for other types of bacteria. The study of envelope components and biosynthetic mechanisms, which are essential for the maintenance of bacterial integrity and could be involved in their virulence, should lead to the identification of new therapeutic targets. The first chapter gave an overview of the different elements composing Gram-negative bacteria envelope, mechanisms of resistance and the threat that Gram-negative bacteria represent. The presentation of my work, divided in four articles from chapter two to chapter five, was preceded by a contextualization of the research projects specific to both laboratories, on biofilm and motility of Vibrio cholerae on one hand and on Escherichia coli envelope from the other hand. In the first paper, we determined the mechanism by which a sub-inhibitory concentration of polymyxin B affects biofilm formation in Vibrio cholerae. We observed that polymyxin B mainly affected the flagellum by a mechanical action. Since biofilm formation requires the flagellum in the early stages of its formation, we concluded that the action of polymyxin B prevented this change in Vibrio cholerae lifestyle. In the second paper, we designed an experimental evolution protocol which allowed us to identify mutations in different genes that increase Vibrio cholerae motility in the presence of sub-inhibitory concentration of polymyxin B. We then identified that different mutations had altered ihfA, dacB, vacJ (mlaA) and mlaF genes in different mutants. These mutations have probably induced reduction or loss of function of the proteins for which they respectively code. Based on literature, we hypothesize that the loss function of these proteins inducing increase in mobility in the presence of polymyxin B could be explained by three   7 mechanisms involving envelope stability, secretion of membrane vesicles or altered expression of various genes. In the third paper, we investigated the involvement of oxidative stress in the fatal peptidoglycan synthesis arrest occurring in the ∆elyC mutant of Escherichia coli. We then demonstrated that lysis of the ∆elyC mutant is caused by the overproduction of hydroxyl radicals in its envelope. This molecule causes multiple and sufficiently important damages in the envelope to stop the synthesis of the wall. The mechanism causing this overproduction of toxic radicals has yet to be determined. By studying the function of the ElyC factor, we have discovered a new weakness in envelope homeostasis that we are eager to exploit. In the last paper, based on a previously formulated hypothesis, we investigated the importance of the enterobacterial common antigen synthesis pathway in the lethal process occurring in the absence of ElyC. We found that the ∆elyC mutant accumulates common element to the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, undecaprenyl pyrophosphate. We also observed that the ∆elyC mutant lysis phenotype could be suppressed by increasing undecaprenyl pyrophosphate recycling via the overexpression of the gene coding for the phosphatase PgpB. We propose that the absence of ElyC induces a misallocation of undecaprenyl phosphate between the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, in favors the latter pathway. Overactivation of the enterobacterial common antigen pathway would induce undecaprenyl phosphate accumulation, causing inhibition of Pbp1b, thus blocking addition of new subunits to the cell wall and leading to its lysis. Ultimately, all the original data generated by my research project has led to a better understanding of envelope vulnerabilities of Vibrio cholerae and Escherichia coli, to clarify certain mechanisms but also to glimpse the role of various factors involved in the homeostasis of their envelope. L'aumento dell’incidenza delle infezioni da batteri resistenti, multi-resistenti e anche estremamente resistenti agli antibiotici, combinata con la rarefazione della scoperta di nuove molecole fra gli anni 1960 e il sotto investimento cronico di certe nazioni nella ricerca pubblica, potrebbe costare la vita a 10 milioni di essere umano all'anno nel 2050. La stragrande maggioranza delle specie resistenti agli antibiotici sono batteri Gram- negativi. Questo è dovuto principalmente alla composizione intrinseca dei loro involucri che permette loro di essere insensibili a molte molecole che sono letali per altri tipi di batteri. Lo studio delle componenti e i meccanismi di sintesi dell’incurvo, che sono essenziali nell’integrità dei batteri e che possono essere coinvolti nella loro virulenza, dovrebbe permettere l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Nel primo capitolo, avremo una panoramica dei diversi elementi che compongono l'involucro dei batteri Gram-negativi, dei meccanismi di resistenza e della minaccia che i batteri Gram-negativi rappresentano. La presentazione del mio lavoro, diviso in quattro articoli dal capitolo due a cinque, sarà preceduta da una contestualizzazione dei progetti di ricerca specifici di ciascuno dei due laboratori, sul biofilm e la motilità di Vibrio cholerae da un lato e sull'involucro di Escherichia coli dall'altro. Nel primo articolo, abbiamo determinato il meccanismo con cui la polimixina B in concentrazione sub-inibitoria influenza la formazione de biofilm in Vibrio cholerae. Abbiamo osservato che la polimixina B danneggia principalmente il flagello attraverso un'azione meccanica. Poiché la formazione del biofilm richiede il flagello nelle prime fasi della sua formazione, abbiamo concluso che l'azione della polimixina B ha impedito questo cambiamento nello stile di vita di Vibrio cholerae. Nel secondo articolo, abbiamo messo a punto un protocollo di evoluzione sperimentale che ci ha permesso di identificare diversi geni che aumentano la motilità di Vibrio cholerae in presenza di una concentrazione sub-inibitoria di polimixina B. Abbiamo quindi identificato vari mutazioni in diversi varianti che hanno probabilmente provocato la riduzione o il soppresso della funzione delle proteine IhfA, DacB, VacJ (MlaA) e MlaF. Sulla base della letteratura, proponiamo che la perdita di funzione di queste proteine inducendo un aumento della   9 mobilità in presenza di polimixina B può essere spiegato attraverso tre meccanismi coinvolgendo la stabilità dell'involucro, la secrezione di vescicole di membrana o l’alterazione dell’espressione di diversi geni. Nel terzo articolo, abbiamo studiato il coinvolgimento dello stress ossidativo nell'arresto della sintesi del peptidoglicano che è fatale al mutante ∆elyC di Escherichia coli. Abbiamo poi dimostrato con numerosi esperimenti che la lisi del mutante ∆elyC è causata dalla sovrapproduzione di radicali idrossilici nel suo involucro. Questa molecola causa importanti danni nell’involucro provocando l’inibendo della sintesi del peptidoglicano. Il meccanismo che causa questa sovrapproduzione di radicali tossici deve ancora essere determinato. Studiando la funzione del fattore ElyC, abbiamo scoperto una nuova vulnerabilità nell'omeostasi dell’involucro che siamo in fretta di sfruttare. Nel nostro ultimo articolo, basandoci su un'ipotesi precedentemente formulata, abbiamo studiato l'importanza della via di sintesi dell'antigene comune agli enterobatteri nel processo letale che si svolge in assenza di ElyC. Abbiamo scoperto che il mutante ∆elyC accumula un elemento comune alle vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri, l'undecaprenil pirofosfato. Abbiamo anche scoperto che l'aumento del riciclaggio di quest'ultimo attraverso la sovraespressione del gene pgpB previene la lisi del mutante. Proponiamo che l'assenza di ElyC induce una allocazione diffetosa del undecaprenil fosfato tra le vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri. L'iperattivazione della via dell'antigene comune agli enterobatteri provoca l'accumulo di undecaprenil pirofosfato, causando l'inibizione di Pbp1b e dunque dell’aggiunta di nuove unità al peptidoglicano, provocandone quindi la lisi. Quindi, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione o identificazione delle vulnerabilità dell'involucro di Vibrio cholerae ed Escherichia coli, a chiarire certi meccanismi essenziali ma anche a intravedere il ruolo di vari fattori coinvolti nell'omeostasi del loro involucro.

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