Régulation de l'orientation du fuseau mitotique des divisions cellulaires asymétriques pendant le développement de la rétine : rôles de SAPCD2 et LGN

La division cellulaire asymétrique est un des processus clefs pour générer la diversité cellulaire au cours du développement. La régulation de l’orientation du fuseau mitotique est essentielle pour la production de divisions asymétriques. Elle détermine l’héritage asymétrique des déterminants cellulaires entre les cellules filles. Les mécanismes qui contrôlent l’orientation du fuseau mitotique sont bien caractérisés chez le nématode C. elegans et la mouche Drosophile. Ces modèles ont permis d'identifier les protéines clefs impliquées dans ce processus et conservées chez les mammifères, comme celles du complexe d’orientation du fuseau mitotique : Gαi-LGN-NuMA, et celles du complexe de polarité apicale : PAR3-PAR6-aPKC. Chez les vertébrés, la localisation cortico-latérale de LGN-NuMA dans les progéniteurs neuraux en division est déterminante pour l'orientation planaire du fuseau mitotique, mais son mécanisme de régulation reste inconnu.   Nous utilisons la rétine de souris en développement comme modèle expérimental pour sa simplicité et son accessibilité. Des résultats antérieurs de notre laboratoire ont démontré que l'asymétrie de la division dépend de l’orientation du fuseau mitotique, et que cette orientation change au cours au développement. Les rares divisions verticales apparaissent surtout aux stades tardifs de la rétinogenèse. Le but de cette thèse est d'élucider les mécanismes régulateurs du changement d'orientation au cours de la rétinogenèse, et de déterminer le rôle des divisions asymétriques dans les phases prolifératives et neurogéniques du développement de la rétine.  Avec nos collaborateurs, le laboratoire du Dr Stéphane Angers, nous avons identifié SAPCD2 (suppressor APC domain containing 2), comme un nouvel interacteur des protéines Gαi, LGN et PAR3. Le rôle du gène Sapcd2 est peu décrit jusqu'à ce jour. Son expression protéique varie au cours du cycle cellulaire, avec un pic d'expression en mitose, et sa surexpression est observée dans plusieurs cas de cancers. Dans un premier temps, nous avons analysé l'expression de Sapcd2 et Lgn dans la rétine de souris en développement. Leur expression varie selon les phases de la mitose et du stade développemental. À P0, soit le premier jour postnatal, SAPCD2 et LGN ont une localisation cellulaire complémentaire dans les progéniteurs en division, avec un enrichissement à la membrane apicale et au cortex cellulaire latéral respectivement, dans des proportions corrélées au nombre de divisions planaires. Tandis qu'au jour embryonnaire 14.5 (E14.5), SAPCD2 et LGN sont toutes deux localisées aux pôles du fuseau mitotique, suggérant des rôles dynamiques au cours du développement rétinien. Nous avons ensuite analysé l’orientation du fuseau mitotique à E14.5 et P0, dans des souris en absence de Sapcd2 et/ou Lgn. En parallèle de l'étude de la souris mutante Sapcd2, j'ai participé à l'étude de la souris mutante Lgn à P0, menée par Dre Marine Lacomme, post-doctorante au laboratoire. En absence de Lgn à P0, les divisions horizontales augmentent, à l'inverse de l'absence de Sapcd2, où les divisions verticales augmentent. Pour savoir si ces changements d’orientation affectent le destin cellulaire, nous avons réalisé une analyse clonale des divisions terminales dans des explants rétiniens. Cette approche permet de suivre l'effet d'une délétion clonale d'un gène dans le lignage d’un seul progéniteur. Comme attendu, l'ablation clonale de Sapcd2 augmente les divisions asymétriques terminales, produisant deux cellules postmitotiques différentes, et inversement sans Lgn. En termes de mécanisme, SAPCD2 compétitionne avec NuMA pour se lier à LGN, dont elle régule négativement la localisation au cortex de la cellule.   Le phénotype rétinien des souris doubles mutantes Lgn;Sapcd2 est sévère, avec une quasi-exclusivité de divisions verticales, une augmentation de la prolifération globale, du nombre de cellules mitotiques non apicales, et une drastique expansion de la population neuronale avec une couche cellulaire supplémentaire, composée de presque tous les types cellulaires rétiniens. Cette hyperprolifération pourrait être due à l'augmentation des divisions verticales, engendrant une asymétrie de l'héritage du déterminant cellulaire NUMB, antagoniste de Notch. Nous faisons l'hypothèse que le progéniteur basal qui n'hérite pas de NUMB, a une capacité proliférative supérieure aux progéniteurs apicaux. Pour la première fois, nous suggérons que les progéniteurs rétiniens ne sont pas équipotents.  Ces travaux ont permis d'identifier un nouveau régulateur de l’orientation du fuseau mitotique, et d'élucider la régulation de la localisation cortico-latérale de LGN dans les progéniteurs rétiniens des vertébrés. Ils suggèrent que SAPCD2 et LGN interagissent différemment et changent de rôle au cours de la rétinogenèse. Ces découvertes contribuent à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent la taille du lignage neuronal et régulent la formation de la diversité cellulaire au cours du développement du système nerveux central des vertébrés. The control of cell division orientation is an integral processing during asymmetric cell division, a critical process ensuring cell diversity by asymmetrically distributing cell fate determinants between daughter cells. Cell fate determinants in invertebrate model organisms such as the C. elegans nematode and Drosophila fruit fly have been well characterized, and genetic analyses in these organisms has identified the evolutionarily conserved ternary protein complex Gai-LGN-NuMA as essential molecules involved in mitotic spindle orientation, as well as the polarity protein complex PAR3-PAR6-aPKC. Precisely how the Gai-LGN-NuMA complex achieves proper sub-cellular localization in vertebrate neural progenitors to induce planar cell division remains unclear.  We used the developing vertebrate retina as a model system to study the role of cell division orientation in cell fate decisions. We have previously demonstrated a link between cell division orientation and daughter cell outcome in neural retina. Specifically, vertical cell divisions have a tendency to give rise to asymmetric pairs of daughter cells, and appear in later stages of retinogenesis. We wished to elucidate the mechanism underlying the switch from planar to vertical cell divisions over time during the neurogenic vs. proliferative developmental phases of retinogenesis.   With our collaborators from the University of Toronto in the lab of Dr Stéphane Angers, we identified a novel Gai, LGN and PAR3 interacting protein, named SAPCD2 (suppressor APC domain containing 2). SAPCD2 is a poorly characterized protein, but known to be expressed in a cell cycle-dependent manner with higher expression during mitosis and elevated expression in many human cancers.  We first analyzed Sapcd2 and Lgn expression in the developing retina, and found strong expression during proliferative phases, with its subcellular localization dependent on mitotic phase and developmental stage. During mitoses at P0 (birth), SAPCD2 and LGN display complementary localization with an apical or cortico-lateral enrichment, respectively, suggestive of a role in planar cell division induction. However, at E14.5, SAPCD2 and LGN have a highly similar localization, independent of spindle orientation, suggesting different roles during retinal development.  We then analyzed mitotic spindle orientation in Sapcd2 and Sapcd2/Lgn DKO mice at E14.5 and P0, and Lgn mutant mice studied in parallel by Dre Marine Lacomme, post-doc in the Cayouette lab. In the absence of Sapcd2, vertical divisions drastically increased, whereas in the absence of Lgn, horizontal cell divisions increased.   To test if this reorientation affects cell fate outcome, we analyzed the lineage of individual progenitor cells. As expected, in absence of Sapcd2, we observed a drastic increase in terminal asymmetric cell divisions, leading to two different neurons; whereas in the absence of Lgn, we observed an increase in terminal symmetric cell divisions, leading to two photoreceptors. Mechanistically, we showed that SAPCD2 negatively regulates LGN cortical localization, by competing with NuMA for its binding.  In Lgn;Sapcd2 DKO mice, the mitotic spindle reorientation phenotype is even more drastic, containing almost exclusively vertical cell divisions, combined with an increase of proliferation and non-apical mitoses. This leads to a drastic expansion of the neuronal population, which forms an extra-layer containing many different retinal cell types. This over-proliferation could be due to the increase of vertical cell divisions, leading to an asymmetrical distribution of cell fate determinant, NUMB, an antagonist of Notch, between daughter cells. We hypothesize that the retinal basal progenitor, without NUMB, has a higher proliferative potential than the apical progenitor. Contrary to previous studies, this suggests that retinal progenitors are not equipotent.   This work identifies a new regulator of mitotic spindle orientation and clarifies the sub-cellular localization of the LGN-NuMA complex. Our results also suggest that SAPCD2 and LGN change their role and the way they interact throughout the course of retinogenesis. This research contributes to an understanding of both how neural number is regulated, and how cell diversity is generated during vertebrate central nervous system development.

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