Développement d'une sonde fluorescente bioactivable pour l'étude du rôle in vitro et in vivo des protéases dégradant l’apolipoprotéine A-I

Les effets bénéfiques des lipoprotéines de haute densité (HDL) contre l'athérosclérose ont été attribués, en grande partie, à leur composante protéique majeure, l'apolipoprotéine A-I (apoA-I). Cependant, il y a des indications que l'apoA-I peut être dégradée par des protéases localisées dans les plaques athérosclérotiques humaines, ce qui pourrait réduire l'efficacité des thérapies basées sur les HDL sous certaines conditions. Nous décrivons ici le développement et l'utilisation d'une nouvelle sonde bioactivatable fluorescente dans le proche infrarouge, apoA-I-Cy5.5, pour l'évaluation des activités protéolytiques spécifiques qui dégradent l'apoA-I in vitro, in vivo et ex vivo. La fluorescence basale de la sonde est inhibée par la saturation du fluorophore Cy5.5 sur la protéine apoA-I, et la fluorescence émise par le Cy5.5 (proche infrarouge) est révélée après clivage de la sonde. La protéolyse in vitro de l'apoA-I par des protéases a montré une augmentation de la fluorescence allant jusqu'à 11 fois (n=5, P ≤ 0.05). En utilisant notre nouvelle sonde apoA-I-Cy5.5 nous avons pu quantifier les activités protéolytiques d'une grande variété de protéases, incluant des sérines (chymase), des cystéines (cathepsine S), et des métalloprotéases (MMP-12). En outre, nous avons pu détecter l'activation de la sonde apoA-I-Cy5.5 sur des sections d'aorte de souris athérosclérotiques par zymographie in situ et avons observé qu'en présence d'inhibiteurs de protéases à large spectre, la sonde pourrait être protégée des activités protéolytiques des protéases (-54%, n=6, P ≤ 0,001). L'infusion in vivo de la sonde apoA-I-Cy5.5 dans les souris athérosclérotiques (Ldlr -/--Tg (apoB humaine)) a résulté en utilisant un système d'imagerie moléculaire combinant la fluorescence moléculaire tomographique et la résonance magnétique,en un signal de fluorescence dans l'aorte plus important que celui dans les aortes des souris de type sauvage C57Bl/6J  (CTL). Les mesures in vivo ont été confirmées par l'imagerie ex vivo de l'aorte qui a indiqué une augmentation de 5 fois du signal fluorescent dans l'aorte des souris ATX  (n=5) par rapport à l'aorte des souris (n=3) CTL (P ≤ 0,05). L'utilisation de cette sonde pourrait conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement et la progression de l'athérosclérose et l'amélioration des stratégies thérapeutiques à base de HDL. The beneficial effects of high-density lipoprotein (HDL) against atherosclerosis have been largely attributed to its major protein component, the apolipoprotein A-I (apoA-I). However, there are indications that apoA-I can be degraded by proteases localized in human atherosclerotic plaques, which could reduce the effectiveness of HDL-based therapies under certain conditions. Here we describe the development and use of a new bioactivatable full-length near-infrared apoA-I-Cy5.5 fluorescent probe for specific assessment of proteolytic activities that degrade apoA-I in vitro, in vivo and ex vivo. The probe is quenched by saturation of Cy5.5 fluorophore on the protein, and fluorescence emitted by Cy5.5 (near-infrared) is revealed after its apoA-I cleavage. In vitro proteolysis of the apoA-I probe showed up to 11-fold increase of near-infrared fluorescence (n=5, P ≤ 0.05). We were able to quantify proteolytic activities from a wide range of proteases such as serine (chymase) and cysteine (cathepsin S) proteases and metalloproteases (MMP-12). Also, we detected activation of the apoA-I-Cy5.5 probe on aortic cryosections from Ldlr-/-;Tg(human apoB) atherosclerotic (ATX) mice using an in situ zymography assay and observed that broad-spectrum protease inhibitors protected the probe from protease activities, as shown by decreased fluorescence compared to conditions without protease inhibitors (-54%, n= 6 per group, P ≤ 0.001).  In vivo, using a combined fluorescence molecular tomography-magnetic resonance imaging system, the injected probe exhibited a trend for increased fluorescence in the aorta when infused in ATX mice compared to C57BL/6J wild-type mice. Ex vivo imaging of these aortas showed a 10-fold increase of fluorescence in ATX (n=5) mice compared to CTL (n=3) mice (P ≤ 0.05). The use of this probe could lead to improved understanding of the molecular mechanisms underlying the development and progression of atherosclerosis and improved HDL-based therapeutic strategies. Keywords : Atherosclerosis, HDL, apoA-I, bioactivatable fluorescent probe, NIRF imaging, FMT, MRI, Proteases, apoA-I proteolysis.

Keyphrases: Athérosclérose, HDL, apoA-I, imagerie NIRF, IRM, protéases, apoA-I protéolyse, HDL, apoA-I, sonde fluorescente bioactivable, FMT, Atherosclerosis, bioactivatable fluorescent probe, NIRF imaging, MRI, Proteases, apoA-I proteolysis