PC7 : une protéase sécrétoire énigmatique ayant une fonction de sheddase et un ciblage cellulaire unique

De nombreuses protéines issues de la voie sécrétoire sont synthétisées sous la forme de précurseurs clivés à un site de reconnaissance spécifique afin d’être activés. Ces clivages sont, entre autres, effectués le long de la voie sécrétoire et/ou à la surface cellulaire par les proprotéines convertases (PCs). Ces dernières sont tout d’abord synthétisées sous forme de zymogène (pro) et par la suite clivées auto-catalytiquement dans le réticulum endoplasmique (RE). Cependant, le prodomaine reste attaché à la PC jusqu’à atteindre la destination intracellulaire adéquate où les PCs se séparent (PC7) ou bien subissent un second clivage pour se libérer du pro-segment (Furine). PC7 est le plus ancien et hautement conservé membre de la famille des PCs. Récemment, des tests sur le comportement de souris dépourvues de PC7 (KO PC7) ont montré que ces souris étaient en santé. Cependant, elles présentent un phénotype anxiolytique puisqu’elles sont moins stressées que les souris de type sauvage (WT). Au contraire des souris, la perte du gène PCSK7 chez le xénope et le poisson zèbre est létale. Finalement, l’action de protéase de PC7 sur les substrats est redondante avec d’autres PCs, à l’exception du récepteur humain de la transferrine 1 (hTfR1) qui est uniquement clivé par PC7 en une forme soluble (shTfR1). Afin de comprendre la biologie cellulaire de PC7, nous nous sommes concentrés sur son trafic cellulaire. Pour commencer nous avons délété son domaine transmembranaire (TM) et la queue cytosolique (CT) résultant d’une drastique réduction de l’activité de clivage de PC7 sur hTfR1 et appuyant ainsi l’importance de la localisation membranaire de PC7 via son activité TMCT. Les CT chez l’humain et le xénope ne montrent que 35 % d’homologie mais, ces deux espèces clivent hTfR1. Nous nous sommes donc concentrés sur le rôle des acides aminés (aa) conservés entre ces espèces en utilisant des mutagénèses dirigées contre ces aa. Les analyses de localisation subcellulaire par immunofluorescence ainsi que des résultats d’immuno-buvardage de type Western blot de PC7 et de ses mutants E719,721 et L725 de la CT ont mis en évidence l’importance de ces résidus pour l’activité de clivage de PC7 sur hTfR1. Une perte de L725 engendre une relocalisation majeure de PC7 à la surface cellulaire et résulte d’une perte drastique de son activité clivage tout comme la perte de charge de E719,721. Ainsi, nous avons démontré qu’un motif ExExxxL725 présent dans la CT régulait l’efficacité de clivage de PC7 sur hTfR1 dans les endosomes en affectant le transport subcellulaire de PC7 et/ou son recyclage au Trans-Golgi (TGN). Des études de résonance ii magnétique nucléaire (NMR) sur une séquence peptidique de 14 aa reproduisant la séquence composée du motif ExExxxL ou de son mutant ont révélé que les trois résidus étaient exposés sur un même plan. Le mutant montre, quant à lui, une courbure au niveau de ce motif. L’analyse de possibles partenaires au motif ExExxxL nous a permis d’identifier la protéine adaptatrice 2 (AP-2) comme nouveau régulateur de transport et conséquemment d’activité de clivage de PC7. De récentes données en immunocytochimie montrèrent que PC7 mature semble se séparer de son pro-segment à la surface cellulaire. Cependant, aucune activité de clivage de PC7 n’a été montré à la surface. Il est possible que la forme mature et/ou le pro-segment soient liés en surface à des facteurs de régulation. Une éventualité est que la protéine Cab45 se liant au calcium et connue pour transporter les protéines du TGN à la surface, puisse intervenir dans l’activation/régulation de PC7. Plus précisément, Cab45 pourrait réguler le transport et/ou l’activité de PC7 en prévenant la séparation de PC7 de son pro-segment. Nos résultats préliminaires montrent qu’une surexpression de Cab45 réduit de près de 50% l’activité de PC7 sur hTfR1 sans affecter la localisation de hTfR1. Many secretory proteins are synthesized as precursors that are cleaved at specific sites to become activated. Most of these cleavages are achieved along the secretory pathway and/or at the cell surface by the proprotein convertases (PCs). The latter are first synthesized as zymogens (pro) that are subsequently auto-catalytically cleaved in the endoplasmic reticulum (ER). However, the prodomain and PC remain non-covalently associated until they reach specific intracellular organelles where they either separate (e.g., PC7) or undergo a second cleavage before separation (e.g., Furin). PC7 is the most ancient and highly conserved PC-family member. Recent behavioral tests show that PC7 KO mice are healthy and have a normal lifespan but exhibit an anxiolytic and novelty-seeking behaviors. In contrast, PC7 knockdown is lethal in lower species such as xenopus and zebrafish. PC7 uniquely sheds human transferrin receptor 1 (hTfR1) into soluble shTfR1. To elucidate the link between biological activities and physiological roles of PC7, we first concentrated on the cellular trafficking of PC7. Thus, we deleted the PC7 transmembrane domain (TM) and cytosolic tail (CT), resulting in a drastic reduction in the activity of PC7 on hTfR1, emphasizing the importance of the membrane localization of PC7 via its TMCT for activity. Since human and xenopus CTs are 35% identical and yet both proteins can shed hTfR1, we focused on the role of the conserved amino acids in the CT of human PC7 using deletions and site-directed mutagenesis. Immunocytochemical analysis of the subcellular localization of wild type (WT) and CT mutants, and Western blot analyses of L725 and E719,721 mutants, were used to assess the importance of these residues on the activity of PC7 on hTfR1. The data show that lack of the L725 motif leads to a major re-localization of PC7 to the cell surface, resulting in a drastic loss of activity. The loss of the negative charge of E719,721 influences the subcellular endosomal localization of PC7, both mutants results in a reduction in the activity of PC7. Finally, we demonstrate that an ExExxxL motif in the CT significantly regulates the efficacy of PC7 cleavage activity on hTfR1 in endosomes, likely by affecting the subcellular trafficking of active PC7 and/or its recycling to the TGN. Current NMR studies of a 14 aa peptide encompassing this sequence and its mutants point to a specific structural element in this motif. Analyses of possible partners to the ExExxxL motif led to the identification of AP-2as a new regulator of PC7 trafficking and hence cleavage activity. iv Our recent immunocytochemical data revealed that mature PC7 seems to separate from its inhibitory prodomain at the cell surface. However, PC7 activity is not present at the cell surface. A possibility is that mature PC7 and/or its prosegment are bound to a cell surface to regulating factor. This led us to test the possibility that the calcium-dependant Cab45 known to release soluble cargo proteins from the TGN to the cell surface. No report appeared on a possible role of Cab45 on membrane-bound cargo proteins. Cab45 could regulate the traffic and/or activity of PC7 by preventing the separation of PC7 from its prosegment. Our recent data suggests that Cab45 overexpression reduces by ~50% the activity of PC7 on hTfR1, without affecting the hTfR1 trafficking.

Keyphrases: proprotéine convertase type 7 (PC7), proprotéine convertase subtilisine/kéxine type 7 (PCSK7), transferrine récepteur 1 (TfR1), queue cytosolique, protéine adaptatrice 2 (AP-2), clivage, trafic, calcium-binding protein 45 (Cab45), proprotein convertase type 7 (PC7), proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 (PCSK7), transferrin receptor 1 (TfR1), cytosolic tail (CT), adaptor protein 2 (AP-2), cleavage, traffic