Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire.  L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires.  Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques,  leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA. Nuclear receptors (NRs) are ligand-dependent transcription factors that control a wide variety of biological processes in human physiology, which has made them preferred pharmacological targets for many diseases. One such receptor, the estrogen receptor alpha (ERα), can activate cell proliferation in some sections of the mammary epithelium while another, the retinoic acid receptor alpha (RARα), can cause growth arrest and cellular differentiation. Signalling by these receptors can be altered in breast cancer, contributing to tumorigenesis. ERα can be blocked by antiestrogens (AEs) in the clinical setting to inhibit tumor cell proliferation. However, attempts to activate the RARα pathway with retinoids have not proven beneficial in clinical trials. This may result from the lack of specificity of the tested ligands for RARa and/or from their activity only in a subset of breast tumors.  Since nuclear receptors form homo- and heterodimers, we sought to develop novel pharmacological assays to study the activity of specific receptor-dimer complexes, their dynamics and quaternary structure. We report here a new FRET technique dubbed BRET with fluorescence enhanced by combined transfers (BRETFect) that can detect the formation of ternary nuclear receptor complexes. BRETFect can monitor the activation of ERα-ERβ heterodimers and highlights an allosteric mechanism of activation that each receptor exerts on its dimer partner. Use of BRETFect in combination with PCA-BRET has allowed us to observe the formation of functional ERα multimers in live cells for the first time. The formation of multimers is favored by AEs which induce receptor degradation, and may underlie their specific properties. These assays are a net improvement over the classical luciferase-reporter experiment as they deliver real-time receptor specific information with no interference by other process such as transcription and translation. Using these BRET assays we developed a new class of NR hybrid ligands that can modulate ER or RAR activity and inhibit HDACs. This has allowed for the development of promising new bifunctional molecules such as the RAR-agonist/HDACi hybrid molecule TTNN-HA. In conclusion, the work presented here brings new insight in NR dynamics and quaternary structure and offers novel tools to study their mechanism of action or design new modulators of NR activity such as hybrid AE-HDACis and Retinoid-HDACis.

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