Uncovering the role of misfolded SOD1 in the pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité.  Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps. Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of motor neurons resulting in paralysis and death. Approximately 20% of familial ALS cases are caused by mutations in superoxide dismutase (SOD1), which leads to misfolding of the SOD1 protein, resulting in a toxic gain of function. Several antibodies have been generated that are specific for the misfolded form of the protein, and have been used as therapeutics in pre-clinical models. How misfolded SOD1 provokes a selective loss of motor neurons remains unresolved. Mitochondrial morphology, bioenergetics and transport are all documented is SOD1-mediated ALS models, thus mitochondrial impairment plays a key role in motor neuron degeneration. Moreover, misfolded SOD1 selectively associates with the surface of spinal cord mitochondria in ALS rodent models. We hypothesize that the accumulation of misfolded SOD1 on mitochondria could impair mitochondrial function. To this end, we developed a novel flow cytometric assay to immunolabel isolated mitochondria with misfolded SOD1 antibodies while also evaluating aspects of mitochondrial function. This method will allow for a comparison of mitochondria bearing misfolded SOD1 to those without. We utilized the B8H10 conformation specific SOD1 antibody to demonstrate that misfolded SOD1 associates with SOD1G93A rat spinal cord mitochondria in a in a time dependent manner. Mitochondria with B8H10-reactive misfolded SOD1 associated with their surface (B8H10+) have a significantly larger volume and produce excessive amounts of superoxide, but have a similar transmembrane potential compared to B8H10- mitochondria. In addition, the presence of B8H10-reactive misfolded SOD1 coincides with higher levels of the pro-apoptotic form of Bcl-2. Staining of lumbar spinal cord sections with both B8H10 and another conformation specific SOD1 antibody, AMF7-63, yielded distinct localization patterns. B8H10 was found predominantly in motor neurons and numerous puncta throughout the neuropil. Conversely, AMF7-63 marked motor neurons as well as a distinctive fibrillar network that was concentrated in the anterior horn. At the subcellular level, AMF7-63-reactive misfolded SOD1 also localized to the mitochondrial surface of spinal cord mitochondria in a time-dependent manner. AMF7-63+ mitochondria have an increased volume compared to B8H10+ mitochondria and the unlabelled subpopulation. However, they produce similar amounts of superoxide. Together, these data suggest that there are multiple species of misfolded SOD1 that converge at the mitochondria to cause damage. Moreover, different SOD1 conformations may ellicit varying toxicities towards mitochondria. Both B8H10 and AMF7-63-reactive misfolded SOD1 are present in aggregates in mitochondrial fractions and can therefore not account for any different effects produced in terms of mitochondrial volume. Conformational antibodies are invaluable tools to identify and characterize the continuum of misfolded SOD1 species with regards to biochemical characteristics and toxicity. The information presented in this thesis will be used in determining the future therapeutic potential of these antibodies.

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