The roles of the small pMEKK subfamily comprising MAPKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana

Les cascades de signalisation MAPK (mitogen-activated protein kinase) sont impliquées dans un large éventail d’activités biologiques chez les eucaryotes. La diversité des combinaisons « à trois niveaux » (MAPKKK, MAPKK, MAPK) et des régulateurs associés rend possible la transduction précise d’une grande variété de signaux. En particulier, de nombreuses cascades MAPK permettant la réponse aux stress biotiques et abiotiques ont été découvertes chez les plantes.  Dans ce travail, nous présentons une nouvelle cascade MAPK complète (MKKK20, MKK3, MPK6) fonctionnant en aval du récepteur CRK21 (cysteine-rich receptor-like protein kinase 21) chez Arabidopsis. La technique du double hybride chez la levure (yeast two-hybrid, Y2H) nous a également permis d’identifier plusieurs régulateurs candidats se liant à MKKK20, incluant une protéine phosphatase 2C (PP2C), une protéine calmodulin-like (CML10) ainsi que cinq calmodulines (CaM1, 4, 6, 7 et 9).   La mutation de n’importe quel membre de cette cascade MAPK, ou de CaM7, entraîne la susceptibilité à la fois aux pathogènes bactériens (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst3000) et fongiques (Botrytis cinerea, souche B191), tandis que la mutation de la PP2C MFH8.8 confère une résistance aux pathogènes. Ceci indique que la voie de signalisation CRK21-MKKK20-MKK3-MPK6 joue un rôle important dans les défenses immunitaires de la plante, et qu’elle est régulée par la phosphatase MFH8.8 et la CaM7.  De plus, sept autres CRK (CRK12, 14, 16, 18, 24, 30 et 33) présentant un domaine kinase proche de celui de CRK21 interagissent tous avec MKKK20 en Y2H et régulent la phosphorylation de MKKK20 de différentes manières. Les résultats de RT-PCR ont notamment montré que CRK12, 14, 18, 21 et 24 sont fortement exprimés après un traitement aux pathogènes (Pst3000), mais faiblement (CRK14, 18, 21 et 24) voire plus du tout dans des conditions normales. Cela suggère que les CRK forment une grande famille agissant en amont de MKKK20 et jouant un rôle important dans la résistance des plantes aux pathogènes.  Les MKKK19, 20 et 21 forment un clade unique au sein des MEKK d’Arabidopsis. L’alignement de leurs séquences et la prédiction de leurs structures protéiques ont montré que ces trois MKKK sont très similaires en termes de structure primaire, secondaire et même tertiaire. Pour analyser en détail les relations entre les MKKK19, 20 et 21, tous les CRK interagissant avec MKKK20, ainsi que MKK3 et les régulateurs candidats ont été testés en Y2H contre MKKK19 et 21, séparément. Les résultats montrent que les trois MKKK partagent certains interactants, dont des éléments en amont (CRK12, 21 et 33) et en aval (MKK3). Les MKKK19 et 20 partagent également une interaction avec CRK18, 24 et 30 ainsi qu’avec plusieurs régulateurs candidats comme MFH8.8, CML10, CaM4, 6 et 9.  Les résultats de l’essai kinase indiquent que CRK14, CRK24 et MKKK19 sont des protéines autophosphorylées, et que l’autophosphorylation de MKKK19 est inhibée par CRK12, 16, 18, 24 et 30. Ceci montre que les CRK jouent également un rôle important dans les voies de signalisation médiées par MKKK19, et donc que MKKK19 et 20 pourraient accomplir des rôles biologiques identiques ou proches sous le contrôle des mêmes régulateurs. Par ailleurs, MKKK19 et 21 sont toutes les deux phosphorylées in vitro par le complexe CRK21-MKKK20, ce qui suggère que MKKK19 et 21 pourraient non seulement intervenir dans le même niveau hiérarchique que MKKK20, mais aussi en aval.  Enfin, le domaine de liaison de MKKK20 permettant l’arrimage de MKK3 a été identifié au moyen d’un criblage protéine-protéine approfondi par Y2H et BiFC, ce qui constitue une première pour des MAPKKK végétales. La dissection fine de la MKKK20 et de la MKK3 nous a permis de cerner la région C-terminale de la MKKK20 comme étant la section interagissant avec la MKK3. Le domaine C-terminal de MKKK20 contient deux sous-domaines courts fortement conservés entre MKKK19, 20 et 21 sans être retrouvés dans les 18 autres MEKK d’Arabidopsis, ce qui laisse penser que cette région est essentielle pour la liaison de MKKK20 à MKK3.  Dans son ensemble, ce projet aura permis de mettre au jour une nouvelle cascade de signalisation MAPK complète impliquée dans la réponse immunitaire, d’identifier plusieurs acteurs en amont des MKKK19, 20 et 21, trois protéines constituant un même clade parmi les MEKK d’Arabidopsis, et de présenter la première caractérisation du domaine de MKKK20 permettant la liaison à MKK3. Ces résultats fournissent un nouvel éclairage sur la remarquable diversité des cascades MAPK et de leurs modes d’action. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascades participate in a wide range of biological activities in eukaryotes. Among them, variety of combinations of the “three-tiered modules” and related regulators are the key factors to ensure the diversity and accuracy of the signal transduction. To date, a great variety of different MAPK cascades involved in biotic and abiotic stresses have been discovered in plants.   Here, a complete MAPK cascade (MKKK20-MKK3-MPK6) that functions downstream of CRK21, a cysteine-rich receptor-like protein kinase (CRK) has been found in Arabidopsis. Furthermore, a number of interesting MKKK20-interacting regulator candidates, including a protein phosphatase 2C (PP2C) called MFH8.8; a calmodulin-like protein (CML10), and five calmodulins (CaM1, 4, 6, 7, and 9) have been identified by Y2H. The MFH8.8 (PP2C), and CaM7 were also identified as a negative and positive regulator of the MKKK20-cascade, respectively. Mutations in this MAPK cascade, as well as CaM7, leads to susceptibility to both bacterial and fungal pathogens (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (EV) [Pst3000] and Botrytis cinerea strain B191), while mutation of MFH8.8 (PP2C) confers resistance to the pathogens, indicating that CRK21-MKKK20-MKK3-MPK6 signaling pathway has an important role in plant immune responses under the regulation of MFH8.8 (PP2C) and CaM7. Moreover, another seven CRKs (CRK12, 14, 16, 18, 24, 30, and 33) sharing a kinase domain very similar to CRK21 are all interacting with MKKK20 in Y2H assays and regulate the phosphorylation status of MKKK20. Importantly, RT-PCR results showed that CRK12, 14, 18, 21, and 24 are highly expressed after pathogen (Pst3000) inoculation, but weakly (CRK14, 18, 21, and 24) or not expressed under normal conditions, suggesting that CRKs are a large upstream family of MKKK20 playing important roles in plant disease resistance.  MKKK19, 20, and 21 form a single clade in the Arabidopsis MEKK family. Multiple sequence alignments and protein structure predictions showed that these three MKKKs are very similar in amino acid sequence, secondary, and even tertiary structure. To dissect the relationships among MKKK19, 20, and 21, all MKKK20-interacting CRKs, MKK3, as well as the candidate regulators have been tested with MKKK19 and 21 in a Y2H system separately. The results indicated that these three MKKKs share some interaction partners, including upstream (CRK12, CRK21, CRK33) and downstream (MKK3) elements. MKKK19 and 20 also share CRK18, 24, and 30, as well as several candidate regulators including the PP2C MFH8.8 phosphatase, CML10, CaM4, 6, and 9. The results of kinase assays indicated that CRK14, 24, and MKKK19 are autophosphorylated proteins, and that the autophosphorylation of MKKK19 is inhibited by CRK12, 16, 18, 24, and 30. These results revealed that CRKs are also important in MKKK19 mediated signaling pathways, and MKKK19 and 20 may function in some similar biological activities under the control of the same regulators. Interestingly, MKKK19 and 21 are both phosphorylated by CRK21-MKKK20 in vitro, suggesting that MKKK19 and 21 can work at the same hierarchical level with MKKK20 in the cascade as well as acting downstream of MKKK20 in the signaling pathways.   Finally, the MKKK20 binding domain that anchors MKK3 was characterised through an in-depth protein-protein Y2H screen and BiFC, a first for a MAP kinase kinase kinase in plants. This C-terminal domain comprises two short subdomains with high percentage identity between the MKKK19, 20, and 21, but not with the other 18 Arabidopsis MEKKs, suggesting that this C-terminal is essential for the binding between MKKK20 and MKK3.  Taken together, this project uncovered a complete MAPK cascade signaling pathway involved in immune response, and identified numbers of upstream elements as well as regulators of MKKK19, 20, and 21. during the analyzing of the relationships of MKKK19, 20, and 21, that belong to a single clade in the Arabidopsis MEKK. Lastly, MKKK20 and MKK3 were finely dissected and used in Y2H assays to uncover potential docking domains interacting between these two kinases. Surprisingly, a short MKKK20 C-terminal sequence not only interacted with MKK3 but also harbored docking domain sites similar to MAPK substrates. Our results shed new light on the remarkably diversified working modes of MAPK signaling cascades and in the role of receptor kinases and MEKKs in plant disease resistance.

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