Conception d'espaceurs pour relever les défis de bioconjugaison

Un des problèmes majeurs avec l’administration orale ou intraveineuse de médicaments est le fait que le principe actif se distribue à travers tout le corps, avec très peu de spécificité vers le site pathologique. Dans ce projet, l’hypothèse de travail est que la conjugaison de ces principes actifs avec des agents de ciblage permettra d’orienter ces conjugués vers des cibles thérapeutiques dans le but d’améliorer leur efficacité thérapeutique ou leur perméabilité intestinale. À cet effet, une série d’espaceurs de propriétés diverses (longueur, hydrophilie, clivage) a été développée pour conjuguer un principe actif à un agent de ciblage tels qu’un peptide ou une protéine. Dans un premier temps, des principes actifs peu perméables ont été conjugués à un ligand reconnaissant le récepteur GM1, tels qu’un peptide ou la sous-unité β de la toxine du choléra (CTB), pour améliorer leur perméabilité intestinale. En effet, la CTB utilise le récepteur GM1 pour être internalisée dans les entérocytes. Grâce à une optimisation des espaceurs, l’affinité des conjugués utilisant les peptides avec le récepteur GM1 a été conservée, ce qui a été démontré par titration calorimétrique isotherme (ITC) et par thermophorèse à micro-échelle (MST). L’internalisation des conjugués a été évaluée par cytométrie en flux dans des cellules intestinales Caco-2 et T84. Les conjugués peptidiques sont internalisés dans les cellules Caco-2 et T84, mais cette internalisation est limitée et n’augmente pas en présence de GM1. En revanche, le conjugué de l’albumine avec la CTB (CTB-BSA) est beaucoup mieux internalisé dans les cellules, et dépend de la présence de GM1. Enfin, la perméabilité a été évaluée dans un modèle utilisant une monocouche cellulaire de Caco-2 ou T84. Les conjugués peptidiques ont montré une perméabilité modeste alors que le conjugués CTB-BSA possède une perméabilité supérieure au contrôle.  Cette étude montre que la conjugaison de la CTB à une macromolécule permet d’augmenter la perméabilité de protéines à travers une monocouche de cellules intestinales. Dans un second temps, un médicament immunostimulant a été conjugué avec un anticorps ciblant le récepteur HER2 du cancer du sein pour former un conjugué Anticorps-Médicament (Antibody-Drug-Conjugate, ADC). L’objectif était d’améliorer l’efficacité anticancéreuse de l’anticorps ciblant le HER2 utilisé actuellement dans le traitement du cancer du sein (Trastuzumab), en combinant les propriétés immunostimulantes du médicament. L’anticorps anti-HER2 murin a été conjugué au médicament grâce à un espaceur clivable pH-sensible. Le degré de conjugaison et la stabilité colloïdale des anticorps conjugués (ADC) ont été évaluées par chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) et chromatographie d’exclusion de taille (SEC) respectivement. Il était possible de greffer 4 ou 8 molécules de médicament sur l’anticorps en gardant une bonne stabilité colloïdale. L’ADC a conservé son affinité pour des cellules présentant le récepteur HER2 tel que les cellules TUBO et H2N100. Le médicament greffé sur l’ADC a également conservé son activité thérapeutique in vitro, ce qui a été démontré dans les mêmes cellules par l’évaluation du degré de méthylation et l’expression des gènes CXCL9 et CXCL10. Ce conjugué s’est révélé prometteur in vitro et l’évaluation de son efficacité anticancéreuse in vivo sur un modèle murin de cancer du sein, en comparaison avec l’anticorps anti-HER2, est en cours dans le laboratoire Stagg. One of the major problems of oral or intravenous administration of drugs is the fact that the active pharmaceutical ingredient will distribute itself in the whole body, without any specificity towards the diseased site. In this project, the working hypothesis is that conjugating these active pharmaceutical ingredients with targeted ligands will direct them towards therapeutic targets, to improve therapeutic efficacy or intestinal permeability. For this purpose, a series of spacers with diverse properties (length, hydrophily, cleavability) were developed to conjugate the active pharmaceutical ingredient to a targeting moiety such as a peptide or a protein.  Firstly, poorly permeable active pharmaceutical ingredients were conjugated to ligands recognizing receptor GM1 such as peptides or the β subunit of cholera toxin (CTB), in the purpose to improve intestinal permeability. Indeed, CTB is internalized in enterocytes by binding to receptor GM1. Following optimization of spacers, the affinity of the peptide conjugates with receptor GM1 was preserved as shown by isothermal titration calorimetry (ITC) and microscale thermophoresis (MST). Internalisation of conjugates was evaluated by flow cytometry in Caco-2 and T84 intestinal cells. Peptide conjugates were internalized in Caco-2 and T84 cells, but the internalization was limited and did not increase in presence of GM1 supplementation.  On the other hand, an albumin-CTB conjugate (CTB-BSA) was internalized more significantly and the mechanism depended on GM1. Finally, the permeability was evaluated on a monolayer model of Caco-2 and T84 cells. The peptide conjugates demonstrated modest permeability across the monolayer, whereas CTB-BSA had superior permeability against controls.  This study shows that conjugating CTB to a macromolecule improves its permeability across a monolayer of intestinal cells.   Secondly, an immunostimulating drug was conjugated to an antibody targeting the HER2 receptor of breast cancer to form an antibody drug conjugate (ADC). The objective of this approach was to improve the anticancer efficacy of the antibody targeting HER2 currently used in the treatment of breast cancer (Trastuzumab), by combining the immunostimulating properties of the drug. The anti-HER2 murine antibody was conjugated to the drug using a cleavable pH-sensitive spacer. The degree of conjugation and colloidal stability of the resulting ADCs were evaluated by hydrophobic interaction chromatography (HIC) and size exclusion chromatography (SEC) respectively. It was possible to graft 4 or 8 molecules of drug to the antibody while keeping an adequate colloidal stability. The ADC retained its affinity towards cells presenting HER2 receptor such as TUBO cells and H2N100 cells. The drug grafted to the ADC also conserved its therapeutic activity in vitro on these cells, as demonstrated by the evaluation of demethylation and gene expression of CXCL9 and CXCL10. These conjugates were promising in vitro et the assessment of the anticancer activity in vivo on a mouse model of breast is currently being studied in Stagg’s laboratory.

Keyphrases: Espaceur, Conjugaison, Bioconjugués, GM1, CTB, Perméabilité, Biodisponibilité orale, Anticorps conjugué à un médicament (ADC), GM1, CTB, Spacer, Conjugation, Bioconjugates, Permeability, Oral bioavailability, Antibody drug conjugate