Validation et conditionnement d'un test PAMPA amélioré pour l'évaluation de la perméabilité membranaire de médicaments

Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de l’évaluation de la perméabilité intestinale des médicaments. Ils sont réalisés lors de la phase de découverte du médicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement représentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coûteux. Les tests Caco-2 nécessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spécifiques sont requises. Ils sont constitués d’une monocouche d’entérocytes à confluence et donc plus biologiquement représentatifs. Il y a un besoin pour le développement d’un essai qui est biologiquement représentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coûteux. Le premier but de ce projet était de développer une méthode analytique qui permettrait l’évaluation simultanée de huit médicaments témoins utilisés pour la validation de l’essai de perméabilité. Le deuxième but de ce projet était donc d’améliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le néoPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constituée de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit à titre de support, (2) un coussin polydopamine chargé négativement qui sert d’ancrage et qui assure la fluidité de la bicouche et (3) une bicouche lipidique formée par fusion de vésicules. Une méthode analytique HPLC-MS/MS a été validée selon les spécifications de la FDA et de la EMA. Cette méthode a permis de quantifier simultanément les huit médicaments standards utilisés pour le test néoPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a été mis en place à titre d’essai control. Les coefficients de perméabilité mesurés pour les huit médicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux résultats de la littérature. Les composantes de la membrane néoPAMPA ont été optimisées. Les conditions optimales retenues étaient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de perméabilité, une bicouche lipidique composée de 70 % DOPC et de 30 % cholestérol cationique ainsi qu’une déposition des liposomes en présence de 150 mM NaCl suivi d’un équilibre d’1 h en présence d’une solution saturée en DOPC. Les stabilités de la cassette de médicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes néoPAMPA. Les différentes optimisations réalisées ont permis d’améliorer la membrane néoPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane néoPAMPA n’est toujours pas en mesure de discriminer des molécules en fonction de leur perméabilité attendue. PAMPA tests and Caco-2 tests are in vitro assays used in the evaluation of the intestinal permeability of drugs. They are performed during the discovery phase of a drug. PAMPA tests are not biologically representative of the intestinal membrane, but they can be done quickly and are low cost. On the other hand, Caco-2 tests require a cell culture time of 21 days and specific installations. They are composed of a confluent enterocyte monolayer and, therefore, more biologically representative. There is a need to develop a hightroughput biologically representative assay of the human intestinal membrane at low cost. The first goal of this project is to develop an analytical method for the simultaneous quantification of eight control drugs used in the assay validation. The second goal of this project is to optimize an improved PAMPA membrane, the neoPAMPA. This new membrane is constituted of three components: (1) a porous filter that acts as a support, (2) a negatively charged polydopamine cushion that serves as an anchor and ensures the bilayer fluidity (3) a lipid bilayer formed by the fusion of vesicles. An HPLC-MS/MS analytical method was validated according to FDA and EMA specifications. This method allowed to simultaneously quantify eight standard drugs used in the neoPAMPA test. A PAMPA test was also performed as a control assay. The permeability coefficients measured through the PAMPA membrane for the eight drugs compared favorably to literature results. The components of the neoPAMPA membrane were optimised. The optimal conditions were polycarbonate hydrophilic filters having pores of 15 nm, Costar 12 wells plates used as the device for the permeability assays, a lipid bilayer composed of 70 % DOPC and of 30 % cationic cholesterol and a deposition of liposomes in presence of 150 mM NaCl followed by an equilibration time of 1 h in presence of a saturated DOPC solution. The stability of the eight drug cassette and the liposomes was insufficient for the conditioning of commercial neoPAMPA membranes. Different optimisation parameters improved the neoPAMPA membrane, although without making it functional. The neoPAMPA membrane was not sufficiently able to discriminate molecules as a function of their expected permeability.

Keyphrases: PAMPA, Perméabilité, Polydopamine, Bicouche lipidique, hplc-ms/ms, PAMPA, Polydopamine, Permeability, Lipid bilayer, hplc-ms/ms