Nucleotide Complementarity Features in the Design of Effective Artificial miRNAs

L'importance du miARN dans la régulation des gènes a bien été établie. Cependant, le mécanisme précis du processus de reconnaissance des cibles n'est toujours pas complètement compris. Parmi les facteurs connus, la complémentarité en nucléotides, l'accessibilité des sites cibles, la concentration en espèces d'ARN et la coopérativité des sites ont été jugées importantes. En utilisant ces règles connues, nous avons précédemment conçu des miARN artificiels qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses en réprimant l'expression de plusieurs gènes. De telles séquences guides ont été délivrées dans les cellules sous forme de shARN.  Le VIH étant un virus à ARN, nous avons conçu et testé des ARN guides qui inhibent sa réplication en ciblant directement le génome viral et les facteurs cellulaires nécessaires au virus dans le cadre de mon premier projet. En utilisant une version mise à jour du programme de conception, mirBooking, nous devenons capables de prédire l'effet de concentration des espèces à ARN avec plus de précision. Les séquences guides conçues fournissaient aux cellules une résistance efficace à l'infection virale, égale ou meilleure que celles ciblant directement le génome viral par une complémentarité quasi-parfaite. Cependant, les niveaux de répression des facteurs viraux et cellulaires ne pouvaient pas être prédits avec précision. Afin de mieux comprendre les règles de reconnaissance des cibles miARN, les règles de couplage des bases au-delà du « seed » ont été approfondies dans mon deuxième projet. En concevant des séquences guides correspondant partiellement à la cible et en analysant le schéma de répression, nous avons établi un modèle unificateur de reconnaissance de cible par miARN via la protéine Ago2. Il montre qu'une fois que le « seed » est appariée avec l'ARN cible, la formation d'un duplex d'ARN est interrompue au niveau de la partie centrale du brin guide mais reprend plus loin en aval de la partie centrale en suivant un ordre distinct. L'implémentation des règles découvertes dans un programme informatique, MicroAlign, a permis d'améliorer la conception de miARN artificiels efficaces.  Dans cette étude, nous avons non seulement confirmé la contribution des nucléotides non-germes à l'efficacité des miARN, mais également défini de manière quantitative la manière dont ils fonctionnent. Le point de vue actuellement répandu selon lequel les miARN peuvent cibler efficacement tous les gènes de manière égale, avec uniquement des correspondances de semences, peut nécessiter un réexamen The importance of miRNA in gene regulation has been well established; however, the precise mechanism of its target recognition process is still not completely understood. Among the known factors, nucleotide complementarity, accessibility of the target sites, and the concentration of the RNA species, and site cooperativity were deemed important. Using these known rules, we previously designed artificial miRNAs that inhibit cancer cell growth by repressing the expression of multiple genes. Such guide sequences were delivered into the cells in the form of shRNAs.  HIV is an RNA virus. We designed and tested guide RNAs that inhibit its replication by directly targeting the viral genome and cellular factors that the virus requires in my first project. Using an updated version of the design program, mirBooking, we become capable to predict the concentration effect of RNA species more accurately. Designed guide sequences provided cells with effective resistance against viral infection. The protection was equal or better than those that target the viral genome directly via near-perfect complementarity. However, the repression levels of the viral and cellular factors could not be precisely predicted. In order to gain further insights on the rules of miRNA target recognition, the rules of base pairing beyond the seed was further investigated in my second project. By designing guide sequences that partially match the target and analysing the repression pattern, we established a unifying model of miRNA target recognition via Ago2 protein. It shows that once the seed is base-paired with the target RNA, the formation of an RNA duplex is interrupted at the central portion of the guide strand but resumes further downstream of the central portion following a distinct order. The implementation of the discovered rules in a computer program, MicroAlign, enhanced the design of efficient artificial miRNAs.  In this study, we not only confirmed the contribution of non-seed nucleotides to the efficiency of miRNAs, but also quantitatively defined the way through which they work. The currently popular view that miRNAs can effectively target all genes equally with only seed matches may require careful re-examination.

Keyphrases: miARN, Ago2, VIH, Répression, miARN artificiel, Multi-ciblage, Reconnaissance des cibles, Complémentarité des nucléotides, Seed, miRNA, Semance, Ago2, Seed, HIV, Artificial miRNA, Multi-targeting, Target recognition, Nucleotide complementarity