Fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe II : aspects structural et dynamique dans le mécanisme réactionnel

La D-fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBPA) catalyse la réaction réversible d'aldolisation dans la voie métabolique du glucose, c'est-à-dire  l'interconversion du dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et du D-glyceraldéhyde 3-phosphate (G3P) en D-fructose 1,6-bisphosphate (FBP). Les aldolases sont regroupées en deux classes selon le mécanisme réactionnel : la classe I, dont fait partie l'enzyme humaine, catalyse la réaction en passant par la formation d'un   intermédiaire covalent (base de Schiff), alors que les aldolases de  classe II sont des métalloenzymes - un cation métallique divalent est requis pour son activité catalytique.  L'aldolase de classe II, absente des mammifères, se retrouve notamment chez des agents pathogènes, par exemples Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), Giardia lamblia (giardiase), Escherichia coli (infections diverses) et Helicobacter pylori (ulcère et cancer gastrique). Cette distribution en fait une cible potentielle dans la découverte de médicaments. La conception d'inhibiteurs spécifiques pour l'aldolase de classe II requiert une fine connaissance de sa catalyse enzymatique et de sa structure tridimensionnelle. Cette connaissance demeure incomplète, alors que l'ensemble des structures de complexes enzyme-inhibiteur ou enzyme-intermédiaire ne supporte pas une partie du mécanisme publié dans la littérature.  Nous étudions le rôle catalytique de deux résidus situés chacun sur une boucle de surface mobile de l'aldolase de classe II de  H. pylori et impliqués dans des étapes d'échange de proton. Les mutants simples H180Q et E142A ont été caractérisés cinétiquement  et cristallisés pour la détermination de structure sur la base de la diffraction aux rayons X. Les structures cristallines des mutants complexés à des intermédiaires réactionnels ont été résolues. La déprotonation du groupe hydroxyle en C4 du FBP initie le clivage de la liaison en C3-C4 du cétohexose, première étape du mécanisme catalytique de rétro-aldolisation. Nos résultats identifient His180, sur la boucle beta6-alpha8, comme responsable de cet échange de proton. Ce résidu est un ligand de l'ion de zinc dans la structure native; le changement conformationnel observé suite à l'amarrage du phosphate en C1 de FBP libère His180   pour permettre le clivage. L'ion de zinc migre par la suite vers le site actif afin de faciliter la liaison du substrat et la stabilisation de l'intermédiaire énediolate. Nos résultats  vont  à l'encontre de l'hypothèse publiée précédemment sur le rôle catalytique de Asp82 dans cet échange de proton du groupe hydroxyle en C4, le rôle de ce dernier résidu se limitant plutôt au maintien de l'intégrité structurale du site actif. La libération du G3P nouvellement produit est suivie de la protonation stéréospécifique de l'intermédiaire énediolate générant le DHAP. La libération du DHAP complète ainsi le cycle catalytique. La protonation de l'intermédiaire énediolate est effectuée par l'intermédiaire du résidu Glu142, situé sur la boucle beta5-alpha7, ce qui concorde avec des études cinétiques publiées  sur d'autres FBPA de classe II. Ces études ont attribué le même rôle à ce résidu conservé entre homologues. Nous avons par la suite établi un protocole de simulation de dynamique moléculaire pour évaluer le repliement de ladite boucle et ainsi comprendre le mode d'action du résidu Glu142. Des détails mécanistiques de l'étape de clivage s'ajoutent à nos connaissances actuelles; des questions subsistent quant à leur implication au reste de la catalyse. En attribuant un rôle crucial à la boucle beta6-alpha8 dans la catalyse et non limité à la liaison de substrats, cette boucle des aldolases de classe II peut devenir une cible dans le développement d'inhibiteurs. De plus, la migration de l'ion de zinc non dépendante de ligand suggère la possibilité de chélater et restreindre l'ion loin du site actif. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase catalyzes the reversible aldol reaction in glucose metabolism interconverting dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) into D-fructose 1,6-bisphosphate (FBP). Aldolases are furthermore classified based on their reaction mechanism: class I aldolase (e. g. human aldolase) forms a covalent Schiff base intermediate with substrate, whereas class II aldolase utilizes a divalent metal cation in catalysis.  Class II aldolase is commonly found in pathogenic organisms such as Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis), Giardia lamblia (giardiasis), Escherichia coli (diverse infections) and  Helicobacter pylori (ulcer and gastric cancer) but not in mammals. This distribution makes class II aldolase a potential target for drug discovery. Structure driven drug design depends on an explicit knowledge of the reaction mechanism of class II aldolase and its three-dimensional structure. Our current knowledge is lacking; existing aldolase crystal structures with reaction intermediates and with competitive inhibitors are not coherent with proposed mechanisms in literature.   The present study focuses on the catalytic role of two residues, each located on a mobile loop of  H. pylori class II aldolase and each implicated in a critical proton transfer step. Single mutants H180Q and E142A were characterized enzymatically and crystallized for X-ray structure determination. Crystal structures of reaction intermediates formed with substrate were determined. The catalytic mechanism requires proton abstraction at the FBP C4 hydroxyl group to initiate C3-C4 bond cleavage, first step of the retroaldol reaction. Our data supports His180 situated on the mobile loop beta6-alpha8, as the residue responsible for this proton transfer. Notably, His180 chelates the zinc ion in the native structure. The structural change induced due to C1 phosphate binding of FBP releases His180 to promote cleavage. Displacement of the catalytic zinc ion ensues, facilitating substrate binding and subsequent stabilization of the enediolate intermediate. Our results do not support the previous hypothesis of a catalytic role for Asp82 in C4 hydroxyl group proton abstraction; it rather plays an important role in maintaining structural integrity for active site binding. Displacement of the nascent aldehyde G3P and concomitant stereospecific protonation of the enediolate species generates the obligate triose phosphate, DHAP. Dissociation of DHAP from the active site completes the catalytic cycle. The residue responsible for initiating enediolate protonation was identified as residue Glu142, situated on mobile loop beta5-alpha7, and this is in agreement with previous kinetic studies of enediolate protonation in other class II aldolases, attributing the same role to this conserved residue. We devised a molecular dynamic simulation method to follow the catalytic loop folding event, further investigating details of the role of Glu142 in catalysis. We gained further knowledge of the cleavage event, although work remains to elucidate missing details of the catalysis and integrate our findings. By attributing a role in catalysis to loop beta6-alpha8 not limited to substrate binding, this loop of class II aldolases becomes a potential target in drug design. In addition, ligand independent zinc ion migration suggest it is possible to chelate the metal and restrain it far from the active site.

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