Synthesis of a biotin-functionalized biguanide for the identification of the tumor growth inhibition mechanism of metformin

La metformine est largement utilisée pour réduire le taux de glycémie dans le cas des patients souffrant de diabète de type 2. Dans des études récentes, les chercheurs ont observé une association inverse entre l'utilisation de la metformine et le cancer dans différents tissus. L'inhibition du complexe I de la chaine respiratoire des mitochondries a été considéré responsable pour l'activité antinéoplasique de la metformine, mais le mécanisme par lequel la metformine conduit à inhiber le complexe I et, par conséquent, la prolifération des cellules cancéreuses, n'a jamais été entièrement démontrée ou comprise.  Dans cette thèse, nous nous somme proposé d'identifier le mécanisme d'action de la metformine et de sa cible dans les mitochondries, en fonctionnalisant la biguanide analogue de la metformine avec de la biotine. Des extraits de mitochondries ont mises en contact avec la metformine biotinylée et ont été séparés sur des colonnes d'affinité contenant de la streptavidine immobilisée. Les protéines éluées après les étapes de lavage ont été analysées par LC-MS/MS et leurs séquences analysées en utilisant l'algorithme BLAST (NCBI). Nous avons isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS) une protéine de 8 KDa qui lie spécifiquement et directement la metformine. Cette protéine a été identifiée comme étant la sous-unité de la ATP synthase. Nos résultats suggèrent que la metformine inhibe la prolifération des cellules cancéreuses par l'inhibition directe de l'ATP synthase de la chaîne respiratoire mitochondriale.  Les travaux présentés dans cette thèse ont été réalisés dans le département de chimie, en collaboration avec le département de biochimie et médecine moléculaire de l'université de Montréal. Metformin is widely used to reduce high blood sugar levels in type 2 diabetes patients. In recent studies, researchers observed an inverse association between metformin use and cancer incidence in different tissues. Inhibition of the mitochondrial respiratory complex I has been proposed to be the cause of the antineoplastic activity of metformin, but the mechanism by which metformin inhibits the complex I and consequently stops proliferation of cancer cells was not fully identified and understood.  In this thesis, we present the functionalization of a biguanide. A metformin - biotin conjugate was synthesized and used to identify the mechanism of action of metformin and its target in mitochondria. Mitochondrial extracts were put in contact with the biotinylated biguanide and were passed over affinity columns containing immobilized streptavidin. The proteins eluted after the washing steps were analyzed by LC-MS/MS and their sequences analyzed using the BLAST algorithm (NCBI). We isolated and identified by mass spectrometry (MS) an 8 KDa protein that specifically and directly binds metformin. This protein has been identified as the ATP synthase-subunit e. Our results suggest that metformin inhibits cancer cell proliferation through the direct inhibition of the ATP synthase of the mitochondrial respiratory chain. The research presented in this thesis has been performed in the Department of Chemistry, in collaboration with the Department of Biochemistry and Molecular Medicine, at the University of Montreal.

Keyphrases: Metformine, Biguanide, Biotine, Streptavidine, Chromatographie d'affinité, Anticancéreux, Complexe I, ATP synthase, Chaîne respiratoire des mitochondries, Metformin, Biotin, Streptavidin, Biguanide, ATP synthase, Metformin, Biotin, Streptavidin, Affinity chromatography, Anticancer, Complex I, Mitochondria respiratory chain