Investigation des mécanismes physiologiques menant à la libération du BDNF par les plaquettes et leur susceptibilité aux médicaments antiplaquettaires

Les plaquettes sont considérées comme l'un des réservoirs les plus importants non seulement des facteurs de croissance, mais aussi des facteurs neurotrophiques qui pourraient contribuer à la réparation des lésions vasculaires et à la prévention de la détérioration neurologique. Parmi ces facteurs, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (Brain-Derived Neurotrophic Factor ou BDNF) – une protéine appartenant à la famille des neurotrophines– est largement exprimée à la fois dans l'hippocampe et au niveau des plaquettes. Les plaquettes constituent un important réservoir de BDNF; cependant, on ne sait que peu de choses sur les facteurs modulant la libération de ce dernier dans la circulation et si les médicaments antiplaquettaires affectent cette sécrétion. Dans le cadre de ce projet, nous avons émis l’hypothèse principale que les différentes voies d’activation plaquettaire peuvent mener à une libération de BDNF, où celle-ci est affectée par les antiplaquettaires.  A cette fin, les plaquettes ont été isolées à partir d’échantillons sanguins de volontaires sains (Groupe 1), de patients souffrant de maladies cardiovasculaires stables requérant la prise de médicaments antiplaquettaires [en prévention secondaire et en double thérapie à l’acide acétylsalicylique (ASA ou Aspirine) en association avec un antagoniste du récepteur P2Y12], (Groupe 2) ou en monothérapie à l’ASA (Groupe 3), versus de patients  atteints de maladies valvulaires ou de cardiomyopathies ne requérant pas la prise de médicaments antiplaquettaires (Groupe 4). L’agrégation plaquettaire a été étudiée par agrégométrie optique en réponse à des agonistes spécifiques : adénosine diphosphate (ADP), acide arachidonique (AA), épinéphrine, collagène et Thrombin-receptor activated peptide 6 (TRAP-6 amide). Les antiplaquettaires testés sont dirigés contre la cyclo-oxygénase-1 ou COX-1 (ASA), contre le récepteur de P2Y12 de l’ADP (AR-C) et contre le récepteur αIIbβ3 du fibrinogène (Abciximab). La libération du BDNF a été quantifiée par ELISA. La présence du BDNF et de son récepteur Tropomyosin-Related Kinase Receptor type B (TrKB) a été détectée par immunobuvardage.    Nous avons montré que l’activation des plaquettes par les différents agonistes testés induit une agrégation plaquettaire de l’ordre de 80% et permet de libérer jusqu’à 5 fois plus de BDNF, passant de 2500 pg / 250 x 106 plaquettes à l’état basal à approximativement 13000 pg / 250 x 106 plaquettes à l’état stimulé. Tous les antiplaquettaires testés réduisent la libération de BDNF par les plaquettes stimulées. Cependant, le niveau d’inhibition et sa significativité dépendent de la nature de l’agoniste; à savoir que l’ASA réduit significativement la sécrétion de BDNF en réponse à l’AA, à l’épinéphrine et au TRAP-6; alors que l’AR-C était plus efficace en réponse à l’ADP, l’AA et l’épinéphrine. L’Abciximab est un antagoniste qui inhibe la sécrétion de BDNF en réponse à tous les agonistes, en inhibant aussi l’agrégation plaquettaire. Notons que la libération de BDNF en réponse au collagène est inhibée par l’ASA et l’AR-C, alors que l’agrégation n’a pas été affectée.  Ainsi, aucune corrélation positive et significative entre l’agrégation plaquettaire et la libération de BDNF n’a pu être obtenue. La présence des antiplaquettaires réduits à différents degrés la libération de BDNF chez les différents groupes des patients, malgré que son expression intraplaquettaire était similaire entre les groupes. On remarque que les antiplaquettaires réduisent plus significativement la quantité du BDNF relâchée chez les patients sous mono ou double thérapie antiplaquettaire en comparaison avec les volontaires sains et les patients atteints de maladies valvulaires. Nous avons aussi démontré que le BDNF exogène active les plaquettes isolées et lavées chez les volontaires sains, en induisant une forte agrégation stable et irréversible. Par contre, le BDNF exogène n’arrive pas à agréger les plaquettes en plasma riche en plaquettes. De plus, nos résultats indiquent que la forme tronquée du récepteur BDNF, le TrKB, est exprimée au niveau des plaquettes de volontaires sains. L’inhibition de l’activité kinase du TrKB abolit l’agrégation induite par le BDNF.  Ces résultats suggèrent que l’action du BDNF dans les plaquettes lavées pourrait passer par l’intermédiaire du TrKB.   Cette étude nous permet de conclure que le BDNF est présent dans les plaquettes et est libéré suite à l’activation plaquettaire et que cette libération est réduite par les antiplaquettaires. Cependant, l’agrégation plaquettaire ne semble pas être associée directement à la sécrétion du BDNF, ce qui suggère que d’autres mécanismes sous-jacents pourraient intervenir dans le contrôle de cette sécrétion. Les antiplaquettaires réduisent la libération de BDNF et il semble que l’action pro-agrégante du BDNF sur les plaquettes lavées passe par l’intermédiaire du TrKB, sans exclure la possibilité que d’autres types de récepteurs plaquettaires soient impliqués dans le signal déclenché par le BDNF. L’implication physiopathologique du BDNF libéré suite à l’activation plaquettaire ou sa biodisponibilité en présence des antiplaquettaires au niveau cardiovasculaire reste à être élucidée afin de révéler son potentiel diagnostique ou thérapeutique. Platelets are considered one of the most important reservoirs not only of growth factors but also of neurotrophic factors that may contribute to the repair of vascular lesions and prevention of neurological deterioration. Among these factors, the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), a protein belonging to the neurotrophin family, is largely expressed in both the hippocampus and platelets. In fact, platelets constitute an important reservoir of BDNF; however, little is known about the factors controlling its release into the circulation and whether antiplatelet drugs affect this secretion. Henceforth, the main hypothesis of this project is that platelet activation pathways lead to BDNF release which is affected by antiplatelet agents.  For this purpose, platelets were isolated from the blood of four groups of human subjects following their consent. Group 1 consisted of healthy volunteers; Group 2 and Group 3 consisted of  patients with stable cardiovascular disease on, respectively, dual antiplatelet therapy (aspirin + P2Y12 receptor antagonist) or monotherapy (aspirin) as secondary prevention; and Group 4 consisted of patients with valvular disease or cardiomyopathy who are not on antiplatelet therapy. Platelet aggregation was studied by optical aggregometry in response to the following agonists: adenosine diphosphate (ADP), arachidonic acid (AA), epinephrine, collagen, and thrombin-receptor activated peptide 6 (TRAP-6 amide). The antiplatelet agents that were tested antagonize cyclooxygenase-1 (COX-1) (acetylsalicylic acid (ASA) or aspirin), ADP P2Y12 receptor (AR-C), and fibrinogen receptor αIIbβ3 (Abciximab). BDNF release was quantified by ELISA. BDNF protein and its Tropomyosin-Related Kinase Receptor Type B (TrKB) receptor were detected by immunoblotting.  Our results show that platelet activation in response to several agonists tested induced 80% platelet aggregation and augmented BDNF release by 5 folds, from 2500 pg / 250 x 106 platelets at baseline to approximately 13000 pg / 250 x 106 after stimulation. Moreover, all the tested antiplatelet agents reduced the release of BDNF by stimulated platelets. However, the level of reduction varied differentially between platelet antagonists depending on the platelet agonist used. Indeed, ASA significantly reduced BDNF secretion in response to AA, epinephrine, and TRAP-6, whereas AR-C was more effective in response to ADP, AA, and epinephrine. Abciximab inhibited BDNF secretion as well as platelet aggregation in response to all agonists. Noteworthy, the release of BDNF in response to collagen was inhibited by ASA and AR-C, while platelet aggregation was not affected. Accordingly, no significant correlation between platelet aggregation and BDNF release could be obtained. Although intra-platelet expression was similar in the different groups, the presence of antiplatelet agents reduced the release of BDNF to varying degrees between groups. As such, antiplatelet agents reduced BDNF release more significantly in patients on dual or mono antiplatelet therapy (Groups 2 and 3) as compared to healthy volunteers (Group 1) and valvular disease patients (Group 4). We have also shown that exogenous BDNF activated isolated/washed platelets from healthy volunteers, inducing strong, stable, and irreversible aggregation. In contrast, exogenous BDNF could not induce aggregation of platelets in platelet-rich plasma. In addition, our results indicate that the truncated form of the BDNF receptor, TrKB, is expressed in platelets of healthy volunteers. Hence, the inhibition of TrKB kinase activity abolished BDNF-induced aggregation. These results suggest that the action of BDNF in washed platelets might ensue through TrKB.  We conclude from this study that BDNF is present in platelets and released following platelet activation, and its release is reduced by antiplatelet agents. However, platelet aggregation does not appear to be directly associated with BDNF secretion, suggesting that other underlying mechanisms may be involved in controlling its secretion. Antiplatelet agents reduce the release of BDNF, and it appears that the pro-aggregating action of BDNF on washed platelets ensues, non-exclusively, through TrKB, which means that other types of platelet receptors may also be involved in BDNF signaling. The pathophysiological implication of BDNF released following platelet activation or its bioavailability in the presence of antiplatelet agents in the cardiovascular system thus remain to be elucidated in order to reveal its diagnostic or therapeutic potential.

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