A study of Kv channel dynamics using a fluorescent unnatural amino acid

Les protéines sont les nanomachines moléculaires de la nature et leurs diverses fonctions sont essentielles au fonctionnement de tous les mécanismes cellulaires. Une grande partie de la recherche fondamentale en physiologie se concentre présentement sur l’étude de la structure et de la fonction des protéines. L'objectif général de cette thèse est d'élargir la compréhension des canaux potassiques voltage-dépendants (KV), un groupe de protéines gouvernant la signalisation "électrique de divers aspects physiologiques, en particulier la propagation de potentiels d'action dans le système nerveux central et dans les cellules musculaires.  Dans le but d'obtenir des indices quant à la dynamique des canaux KV, la thèse met l´enphase sur l'utilisation d'un acide aminé non naturel et fluorescent (Anap) comme outil moléculaire pour étudier les changements de conformation protéique avec la fluorimétrie en voltage imposé (FVI). L'avantage de la technique Anap-FVI par rapport aux techniques traditionnelles de marquage fluorescent, tient au fait qu'il n'y a pas de restriction sur le site d'intérêt. Ainsi, Anap est incorporé génétiquement dans des régions clés du canal Shaker KV en utilisant la technique de substitution du "codon-stop amber", en utilisant une paire orthogonale d'ARNt/synthétase avec les ovocytes de Xenopus laevis comme modèle d’expression protéique.  Tout d'abord, la comparaison directe des deux extrémités du senseur de voltage (SV) est rendue possible par FVI bicolore dans lequel une cystéine externe est marquée avec TMR (tetramethylrhodamine), tandis que l'acide aminé (Anap) est incorporé du côté intracellulaire. On constate que la partie intracellulaire du SV s'active de façon similaire à la partie externe (chapitre 3). En outre, on constate que les portes S6 intracellulaires s'ouvrent essentiellement en deux étapes. Ensuite, Anap a été inséré aux deux extrémités de la boucle cytoplasmique S4-S5 afin d'en étudier le mouvement pendant le couplage électromécanique (chapitre 4). Les expériences FVI bicolores démontrent que la partie N-terminale de la boucle se déplace avec le senseur de voltage alors que le mouvement de la partie C-terminale est retardé. Les résultats supportent un modèle de couplage électromécanique dans lequel l'énergie est stockée au centre du de la jonction S4-S5. En outre, il est à noter que la boucle qui relie S4 et S5 subit des mouvements indépendants et coopératifs - une découverte qui s'aligne avec un rôle central de la boucle dans le transfert d'énergie du senseur de voltage vers le pore.  Dans un troisième projet, Anap a été inséré dans diverses positions de l'extrémité N-terminale cytosolique afin d'en sonder le mouvement pendant l'inactivation de type N (chapitre 5). Les données FVI montrent que la région hydrophile de la balle d'inactivation (BI) subit un mouvement qui est étroitement lié à l'inactivation mais qui ne joue pas un rôle dans l'obstruction finale du pore. Par contre, la pointe hydrophobe de la BI, subit un mouvement supplémentaire qui est sensible à l'état du pore, suggérant qu'il subit un mouvement qui impacte l'obstruction du pore. Les résultats supportent un modèle d'inactivation sous la forme de mécanisme d'étapes séquentielles d'au moins deux transitions.  Enfin, un quatrième projet se distingue de l'objectif général de la thèse. Il est démontré que les canaux avec un codon-stop N-terminal s’expriment malgré l'absence d'Anap (chapitre 6). Cette expression de fuite est causée par la réinitiation de la traduction de l’ARN messager, à des codons d’initiations non-canoniques en aval, et peut être réduite en supprimant ces codons. Les résultats mettent en évidence l'importance des expériences de contrôles lors d'utilisation d'acides aminés non naturels. Proteins are the nature’s molecular nanomachines and their diverse set of functions are crucial to the workings of all cellular mechanisms. A great part of fundamental research today is therefore focusing on the elucidation of protein structure and function. The general objective of this thesis is to expand the understanding of voltage-gated potassium (KV) channels, a group of proteins which governs electrical signalling in various physiological aspects, in particular the propagation of action potentials in the central nervous system and in muscle cells.  In the pursuit of obtaining dynamic information of KV channels, the focus in this thesis has been on exploring the applicability of a fluorescent unnatural amino acid (Anap) as a molecular tool to study protein conformational changes using voltage clamp fluorometry (VCF). The advantage of the Anap-VCF technique over traditional post-translational fluorescence labeling techniques is that there are no restrictions regarding the choice on the site of interest. Anap is genetically incorporated into key regions in the Shaker KV channel by using the amber stop codon suppression technique using an orthogonal tRNA/synthetase pair, and Xenopus laevis oocytes are used as expression system. The first project involves direct comparison of both ends of the voltage sensor (VS) and is made possible by two-color VCF, in which an external cysteine is labeled with TMR (tetramethylrhodamine) while Anap is incorporated on the intracellular side (chapter 3). We found that the intracellular part of VS activates together with the external part. Moreover, it is found that the intracellular S6 gates open in a sequential two-step transition. Next, to investigate electromechanical coupling, Anap was inserted into both ends of the S4-S5 linker (S4-S5L, chapter 4). Two-color VCF experiments demonstrates that the N-terminal part of S4-S5L moves with the VS. On the other hand, the movement of the C-terminal part of the linker is delayed with respect to the VS. The findings support a model for electromechanical coupling in which energy is stored in the middle of the S4-S5L, and not in the C- or N-termini. Moreover, it is found that the S4-S5L undergoes both independent and cooperative movements – a finding which agrees with a pivotal role of the S4-S5 linker in energy transfer from the VS to the pore. In a third project, Anap was inserted into various positions on the flexible and cytosolic N-terminus to probe the movement during N-type inactivation (chapter 5). VCF data show that the hydrophilic chain region of the inactivation particle (IP) undergoes a motion which is closely related to inactivation but is not involved in the final step of pore block. The hydrophobic tip of the IP, on the other hand, undergoes an additional motion which is sensitive to the state of the pore, suggesting that it causes pore block. The findings support a model for inactivation as a sequential step mechanism of at least two transitions. Finally, a fourth project stands out from the general objective of the thesis. It is demonstrated that channels with N-terminal stop codons still express despite the absence of Anap (chapter 6). This leak expression is caused by translation reinitiation at downstream non-canonical start codons and can be reduced by removing the start codons. The findings highlight the importance of control experiments when using unnatural amino acids.

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