Caractérisation du système inductible au cumate pour la production de protéines thérapeutiques en cellules CHO

Les protéines thérapeutiques représentent une classe de médicaments pour le traitement de diverses maladies telles que différentes formes de cancer ou les maladies auto-immunes. La grande majorité de ces protéines commercialisées sont produites à partir de lignées cellulaires d’ovaire d’hamster chinois (Chinese Hamster Ovary, CHO) qui permettent notamment de réaliser les modifications post-traductionnelles nécessaires à l’obtention de protéines biologiquement actives.  Le développement de lignées cellulaires CHO hautement productrices à grande échelle est un processus long (de 6 à 18 mois) et très coûteux. Celui-ci débute par la transfection, suivie par la sélection des cellules ayant intégré aléatoirement dans leur génome le gène codant pour la protéine d’intérêt, donnant lieu à une population hétérogène en termes de production, de qualité du produit et de croissance. Depuis quelques années, l’utilisation de ces populations hétérogènes est devenue une approche très populaire pour la caractérisation biochimique des protéines et les études précliniques nécessitant la production rapide et à moindre coût de quantités suffisantes de matériel. Les autorités de régulation des médicaments exigent néanmoins que les lignées cellulaires soient issues d’une unique cellule progénitrice (ou clone). L’obtention d’une lignée cellulaire hautement productrice nécessite une étape de criblage, afin d’isoler un clone présentant à la fois un avantage de production et de croissance. Or, cette étape est considérée comme l’étape limitante du processus de développement de lignées cellulaires puisque, du fait de la très faible fréquence des clones forts producteurs, il est nécessaire de cribler des milliers de cellules. Jusqu’à date, aucun mécanisme précis n’a permis d’expliquer la faible occurrence des clones forts producteurs dans les populations hétérogènes sélectionnées. Cependant, la combinaison de mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place en réponse au stress dû à la surexpression du gène d’intérêt pourrait être mise en cause. Au sein de notre laboratoire, nous avons développé une lignée cellulaire CHOBRI/rcTA contenant le système d’expression inductible au cumate. Ce système, contrairement à la majorité des systèmes constitutifs utilisés dans l’industrie, permet de choisir le moment et le niveau d’expression de la protéine d’intérêt. En effet, l’ajout de l’inducteur cumate permet au transactivateur chimérique rcTA de se fixer au promoteur fort CR5 et d’activer la transcription. Ce projet de recherche se base sur l’hypothèse que l’utilisation d’un système d’expression inductible permettrait de limiter le stress potentiel induit par la surexpression de la protéine recombinante durant l’étape de sélection, qui pourrait affecter le taux de croissance et la survie des clones lors la dilution limite. La fréquence de clones forts producteurs dans la population sélectionnée serait alors augmentée, améliorant la productivité de la population et facilitant l’étape de criblage. Dans un premier temps, en combinant les vecteurs d’expression plasmidiques et la lignée CHOBRI/rcTA, nous avons développé et optimisé une plateforme performante pour la production rapide de protéines recombinantes via la génération de populations hétérogènes. Nous avons ainsi obtenu des populations produisant environ 0.9 g/L de la protéine de fusion hCD200Fc et environ 0.35 g/L de l’anticorps rituximab. La stabilité de la production de chacune des populations après un mois en culture et après un cycle de congélation-décongélation a également été démontrée. De plus, l’étude de la qualité du produit final n’a montré aucune différence majeure entre les protéines produites à partir d’un clone stable ou d’une population hétérogène, et ce pour les deux protéines. Enfin, nous avons montré la supériorité du promoteur inductible CR5 par rapport à deux promoteurs constitutifs couramment utilisés dans l’industrie. Dans un second temps, l’impact de l’expression de la protéine recombinante durant l’étape de sélection sur la productivité et la répartition clonale de la population hétérogène sélectionnée a été étudié. Pour cela, deux populations hétérogènes issues d’une même transfection et produisant le hCD200Fc ont été générées. Pour l’une des populations hétérogènes, l’expression de la protéine a été activée durant la phase de sélection par l’ajout de cumate. Par la suite, pour chacune des populations hétérogènes, la production en culture en mode cuvée-alimentée a été comparée et la répartition clonale via le criblage de micro-populations a été étudiée. Nous avons ainsi mis en évidence qu’une diminution de l’expression de la protéine recombinante durant l’étape de sélection mène à une augmentation significative de la productivité de la population hétérogène, due à un enrichissement de cellules présentant une productivité spécifique accrue. Enfin, lors de la sélection, nous avons observé une augmentation de la mortalité cellulaire accompagnée d’une augmentation de l’expression d’un marqueur du stress du réticulum endoplasmique dans la population exprimant de haut niveau de hCD200Fc sous induction du cumate. Ces résultats suggèrent que durant la phase de sélection, la surexpression de la protéine recombinante entraîne de la part de la cellule l’activation des voies de réponse au stress du réticulum endoplasmique, pouvant alors limiter son amplification ou induire le phénomène d’apoptose. Ce projet a contribué au développement d’une plateforme performante pour la production rapide de protéines recombinantes via la génération de populations hétérogènes stables. De plus, la caractérisation du système inductible au cumate dans ce contexte a permis de démontrer le réel avantage de l’utilisation d’un système inductible pour réduire le temps et les coûts de développement de lignées cellulaires stables à haut potentiel de production. Therapeutic proteins represent a class of therapeutics for the treatment of various diseases such as cancer or autoimmune diseases. Due to their ability to perform post-translational modifications, necessary to obtain biologically active proteins, most of these marketed proteins are produced in Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines. The development of large-scale highly productive CHO cell lines is a long (6 to 18 months) and very expensive and labor-intensive process. This starts with the transfection followed by the selection of cells having randomly integrated the gene coding for the protein of interest into their genome, resulting in a heterogeneous population (pool) in terms of production, product quality and growth. In recent years, the use of these pools has become a very popular approach for protein biochemical characterization and preclinical studies, requiring the rapid and cost-effective production of sufficient quantities of material. However, drug regulatory authorities require that cell lines be derived from a single progenitor cell (or clone). Obtaining a highly productive cell line requires a screening step to isolate a clone with both high  productivity and growth rate. This step is considered as the limiting step of the cell line development process because the very low frequency of high-producer clones requires the screening of thousands of cells. So far, no specific mechanism has explained the low occurrence of high-producer clones in selected pools. However, the combination of molecular and cellular mechanisms in response to stress due to overexpression of the gene of interest could be involved. In our laboratory, we have developed a CHOBRI/rcTA cell line containing the cumate gene switch inducible expression system. This system, unlike most of constitutive systems used in the industry, allows defining the time and the expression level of the protein of interest. Indeed, by the addition of the cumate inducer, the chimeric rcTA transactivator binds to the strong CR5 promoter and triggers transcription. In this research project, we hypothesised that the use of an inducible expression system could limit the potential stress induced by the overexpression of the recombinant protein during the selection process. The frequency of high-producer clones in the selected population would then be increased, improving the population productivity and facilitating the screening step. We first developed and optimized an efficient platform for the rapid production of recombinant proteins via the generation of pools, by combining plasmid expression vectors and the CHOBRI/rcTA cell line. We thus obtained populations which produced about 0.9 g/L of the fusion protein hCD200Fc and about 0.35 g/L of the antibody rituximab. For each population, the production stability after a one-month culture and after a freeze-thaw cycle was also demonstrated. Furthermore, for both proteins, the final product quality analysis showed no major differences between proteins produced either from a stable clone or from a stable pool. Finally, we showed the superiority of the CR5 inducible promoter compared to two constitutive promoters commonly used in the industry. We then studied the impact of recombinant protein expression on the productivity and clonal distribution of the selected pool. For this, two stable pools resulting from the same transfection and producing hCD200Fc were generated. For one of them, protein expression was triggered during the selection process by addition of cumate. Subsequently, for each pool, fed-batch production was compared and clonal distribution via micro-population screening was studied. We have thus demonstrated that a decrease in recombinant protein expression during the selection process leads to a significant increase in pool productivity, due to an enrichment of cells with increased specific productivity. Finally, during selection process, we observed an increase in cell mortality together with an increase in the expression of an endoplasmic reticulum stress marker in the population expressing high levels of hCD200Fc. These results suggest that during the selection process, overexpression of the recombinant protein results in activation of the endoplasmic reticulum stress response pathways by the cell, which could then limit its growth or induce apoptosis. This project contributed to the development of an efficient platform for the rapid production of recombinant proteins via the generation of stable pools. In addition, the cumate inducible system characterization in this context has demonstrated the real advantage of using an inducible system to reduce the development time and costs of stable cell lines with high production potential.

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