Investigating the mechanism of host translation shut off by human rhinovirus 2A proteinases

Der Begriff Picornaviren stammt von dem Wort “pico” (bedeutet geringe Menge in Spanisch) und RNA. Diese sehr kleinen Viren sind verantwortlich fur Schnupfen und Erkaltung, und besitzen keine Hulle. Sie weisen eine Ikosahedrale Symmetrie auf und genomische RNA auf. Humane Rhinoviren (HRV) gehoren zu der Familie der Picornaviridae innerhalb der Gattung Enteroviren. Die einzelstrangige RNA ist vom Ikosahedralen Kapsid umhullt, um die viralen Gene zu stutzen. Es gibt nur einen offenen Leserahmen, von dem ein einzelnes Polyprotein abgelesen wird. Das Polyprotein wird danach prozessiert, um erwachsene virale Proteine zu erhalten. Zunachst spaltet sich wahrend der Translation HRV 2Apro vom Polyprotein ab. Diese Prozessierung wird zwischen dem N-Terminus der Proteinase und dem C-Terminus des davorliegenden Proteins VP1 durchgefuhrt. Die restlichen Schritte der Prozessierung werden bei den anderen Proteinasen 3Cpro und 3CDpro durchgefuhrt, daher liegen schlussendlich elf fertig prozessierte virale Proteine vor. Es gibt drei Arten von humanen Rhinoviren (genetische Gruppen A, B, C), die nach Krankheitssymptomen, der genetischen Divergenz und dem Ort der Replikation klassifiziert werden. In dieser Arbeit wird der Unterschied zwischen 2Apro aus unterschiedlichen genetischen Gruppen (A und B) vergleichen. Deswegen haben wir in vitro biochemische und biophysikalische Experimente durchgefuhrt mit 2Apro von HRV1A und HRV4 durchgefuhrt, um die strukturelle Homologie zu verstehen. Zunachst haben wir rekombinante 2Apro des HRV1A Subtyps durch Uberexpression erzeugt. Die Aktivitat der Proteinase wurde mit den eukaryotischen Initiationsfaktoren getestet (eIF4E und eIF4GII51-745: Aminosaurereste zwischen 551-745 besitzen den Bindungsort der eIF4E und die Prozessierungsstelle der 2Apro). Wir konnten bestatigen, dass die 2Apro bei den Subtypen HRV1A und HRV2 gleich effizient ist. Die inaktivierte (C106A) HRV1A 2Apro wurde fur die Bindungsstudien benutzt. Hier fanden wir heraus, dass die Fahigkeit der Bindungsinteraktion fur beide Proteinasen der genetischen Gruppe A gleichartig ist. Die Proteinasen von HRV1A und HRV2 sind in ihrer Aminosaurensequenz zu 86.3 % ident. Eine Folge davon ist die Bildung eines ternaren Komplexes mit HRV1A 2Apri/eIF4E/eIF4GII551-745, wie es auch fur die HRV2 2Apro bestatigt wurde (Aumayr et al., 2015). eIF4E bildet einen binaren Komplex mit der Proteinase, eIF4GII551-745 allerdings nicht. Die Ergebnisse stimmen mit jenen der HRV2 2Apro uberein (Aumayr et al., 2015). Wir fanden mittels statischer Lichtstreuung heraus, dass HRV1A 2Apro aus zwei Monomeren besteht und 32 kDa wiegt. Die Dimerisierung der HRV2 2Apro wurde auch von Aumayr et al. publiziert. Der dreifache Komplex aus HRV1A 2Apro/eIF4E/eIF4GII551-745 lies auf einen hoheren oligomeren Zustand mit 133 kDa molekularer Masse schliesen. Diese Masse Liese sich durch einen doppelten ternaren Komplex erklaren. Wir haben die Thermodynamik der Wechselwirkung mit Isothermer Titrationskalorimetrie gemessen. Einerseits wurde eine Dissoziationskonstante von 1 µM fur den ternaren Komplex gemessen, andererseits fanden wir 7 µM fur die HRV1A 2Apro/eIF4E Komplexe. Auserdem haben wir die Uberexpression der rekombinanten HRV4 2Apro versucht. Dafur wurde eine Verlangerung am N-Terminus der HRV4 2Apro eingefugt, weil wir nicht genugenden Proteine vom Wildtyp erhalten konnten. Ein Hexahistidin-Tag gefolgt von acht Aminosauren von VP1 am N-Terminus der Proteinase, verbesserte das Level der Expression. Die aktive HRV4 His6VP18 2Apro wurde zusammen mit Initiationsfaktoren auf enzymatische Aktivitat getestet. Wir konnten zeigen, dass eIF4GII551-745 von der aktiven Proteinase innerhalb von zwei Stunden nicht prozessiert wird, auch wenn HRV4 His6VP18 2Apro zehnfach konzentrierte als HRV1A 2Apro war. Die Bindungsstudien zeigten auch, dass eIF4E und eIF4GII551-745 von der 2Apro der genetischen Gruppe B schlecht erkannt werden. Es wird kein ternaren Komplex zwischen der inaktiven (C110S) HRV4 His6VP18 2Apro und den Initiationsfaktoren aufgebaut. Weder eIF4E, noch eIF4GII551-745 bilden Komplexe mit der Proteinase. Trotzdem haben wir eine mogliche Selbstprozessierungsreaktion bei der C110S Mutante von HRV4 His6VP18 2Apro an der VP1-2Apro-Region beobachtet. Die Substitution des aktiven Cysteins durch Serin konserviert vermutlich die schwache nucleophile Natur, die fur die Selbstprozessierungsreaktion verantwortlich ist. SDS-PAGE Analysen zeigten eine moglicherweise selbstprozessierte zweite 2Apro-Bande mit Masse des Wildtyps. Ein wichtiges Ergebnis ist die monomere Natur der 2Apro von HRV4 His6VP18 im Unterschied zu den dimeren HRV1A 2Apro und HRV2 2Apro (Aumayr et al., 2015). Die nur 39 % der Aminosaurensequenz zwischen beiden 2Apro von HRV4 und HRV1A ident sind, erwarteten wir keine gleiche Struktur. Allerdings besteht die (CV) B4 2Apro des Coxsackie-Virus, welcher zu der Gattung Enteroviren gehort, aus einem Monomer (Baxter et al., 2006) und ist auch 39 % identisch zur 2Apro von HRV4 His6VP18. Dennoch kann die CVB4 2Apro einen ternaren Komplex, allerdings keinen binaren Komplex mit den Initiationsfaktoren bilden (Aumayr et al., 2015). Zusammenfassend gibt es bemerkenswerte strukturelle und Verhaltensunterschiede zwischen dem 2Apro aus der genetischen Gruppe A und B, die die Abschaltung der Host-Translation beeintrachtigen.