Nuevos elementos reguladores y funciones celulares de la proteína fosfatasa Ppz1 en la levadura Saccharomyces cerevisiae

Las proteinas Ppz1 y Ppz2 de Saccharomyces cerevisiae son Ser/Thr fosfatasas involucradas en diferentes procesos celulares, tales como el mantenimiento de la integridad celular, la tolerancia salina y la regulacion del ciclo celular en la transicion G1/S. La mayor parte de los fenotipos asociados con la ausencia o la sobreexpresion de las fosfatasas Ppz son la consecuencia de la inhibicion que ejercen estas fosfatasas sobre los transportadores de potasio de alta afinidad Trk1/2. En las primeras fases de este trabajo, solo se habia identificado una subunidad reguladora para estas fosfatasas, la proteina Hal3, y aunque el mecanismo mediante el cual ejerce esta inhibicion se desconocia, si se habia descrito que esta proteina actua como inhibidora de Ppz1 y Ppz2 en todas las funciones conocidas de Ppz1 En este trabajo presentamos nuevas dianas biologicas de las fosfatasas Ppz, como son la via de calcio/calcineurina y el sistema de transporte de potasio de baja afinidad. En primer lugar, describimos que celulas que carecen de Ppz1 son hipertolerantes a altas concentraciones de sodio o litio debido a un incremento en la expresion del gen ENA1, que codifica el componente principal para la tolerancia salina en la levadura. Este efecto en la expresion de ENA1 es independiente de Trk1/2 pero totalmente dependiente de la via de senalizacion de la fosfatasa calcineurina, sugiriendo asi que Ppz1 inhibe, directa o indirectamente, la actividad de la calcineurina. Respecto a esta funcion, demostramos que Ppz1 actua como un regulador negativo de la entrada de calcio que tiene lugar a traves de la membrana plasmatica. Por otro lado, celulas que carecen de Ppz1/2 y Trk1/2 necesitan mas potasio para sobrevivir que celulas que carecen solo de los transportadores de potasio de alta afinidad, hecho que sugiere que las fosfatasas Ppz son reguladores positivos de la entrada de potasio de baja afinidad Trk-independiente. Tambien hemos identificado una segunda subunidad reguladora de las fosfatasas Ppz, denominada Vhs3. Vhs3 actua inhibiendo las fosfatasas Ppz de igual modo a como lo hace su homologo Hal3, aunque este ultimo parece ser mas eficiente. Ademas, demostramos que Hal3/Vhs3 participan en el proceso celular de la floculacion. Ambas regulan negativamente la via de senalizacion de la PKA que, a traves de la activacion del factor de transcripcion Flo8, induce la expresion de la floculina Flo11 causando la floculacion. Este efecto es dependiente de las fosfatasas Ppz y podria ser explicado por la regulacion negativa que ejercen estas sobre los transportadores de potasio Trk1/2. Finalmente, demostramos que Vhs3 y Hal3, que presentan homologos en plantas y mamiferos, estan involucradas en una funcion esencial que es independiente de su papel sobre Ppz1/2, ya que el doble mutante hal3 vhs3 y el cuadruple mutante hal3 vhs3 ppz1 ppz2 son letales mientras que el mutante ppz1 ppz2 no lo es. Ademas, la letalidad de la cepa hal3 vhs3 se suprime por la sobreexpresion de otros homologos de Hal3, como es el caso de AtHal3a de Arabidopsis thaliana, sugiriendo que las funciones de Hal3 y Vhs3 Ppz-independientes estan conservadas en otros eucariotas. Experimentos in vitro revelan que la proteina Hal3 de plantas (AtHal3a) cataliza uno de los pasos de la biosintesis de coenzima A y que para ello requiere de dos residuos: la His90 y la Cys175. Aunque Vhs3 y Hal3 conservan el residuo histidina, no conservan el residuo equivalente a la Cys175, por tanto, no es evidente que esta nueva funcion sea participar en la sintesis de CoA.