Exploration of the potential of the hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in a micro-aqueous organic solvent system

In der Industrie besteht ein wachsender Bedarf an biokatalytischen Prozessen zur Herstellung von Bulk- und Feinchemikalien. Cyanhydrine, die durch die Hydroxynitrillyase (HNL)-katalysierte Hydrocyanierung von Aldehyden und Ketonen entstehen, sind wertvolle chirale Bausteine fur die pharmazeutische, agrochemische Industrie und die Feinchemie. In dieser Arbeit wurde das Potential einer R-selektiven HNL aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer neuen His-getaggten Variante untersucht. Die neue Variante zeigte eine fast doppelt so hohe spezifische Aktivitat im Vergleich zum Wildtyp-Enzym, bedingt durch die hohere Reinheit bei ahnlichen pH- und Temperaturoptima. Da der Expressionslevel hoher und die Reinigungsprozedur kurzer waren, verdoppelte sich auch die Ausbeute an gereinigtem Enzym. Die neue AtHNL-Variante (His6-AtHNL) wurde anschliesend hinsichtlich der Hydrocyanierung von aromatischen Ketonen evaluiert, die nicht zu den bevorzugten Substraten des Enzyms gehoren. Allgemein werden Ketone langsamer und meist auch mit geringerer Stereoselektivitat umgesetzt, was auf die grosere sterische Hinderung der Carbonylfunktion, die damit verbundene geringere Nukleophilie, sowie thermodynamische Grunde zuruckzufuhren ist. Allerdings konnte durch Verwendung eines mikro-wassrigen Reaktionssystems der Umsatz zweier beispielhaft gewahlter Ketone (Acetophenon und 2-Fluoracetophenon) relativ zu Literatur­werten auf 40 % bzw. 48 % verdoppelt werden. Das mikro-wassrige Reaktionssystem ermoglichte Produktkonzentrationen von 160-190 mM, was das Potential solcher Reaktions­systeme fur die Synthese von Ketoncyanhydrinen zeigt. Allerdings fanden sich starke Hinweise auf eine Enzym-katalysierte Produktracemisierung, was eine sorgfaltige Umsatzkontrolle erfordert, um Produkte mit hoher optischer Reinheit zu erhalten. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden auch funf 2-Hydroxyketone als Substrate fur das Enzym untersucht. Obwohl die entsprechenden Cyanhydrine nachgewiesen wurden, konnte eine spezifischen Enzym-katalysierte Hydrocyanierung dieser Substrate nicht nachgewiesen werden, da die erhaltenen Stereoselektivitaten von ca. 20 % auch in der Enzym-freien Kontrolle auftraten. Allerdings konnte eine schwache, jedoch deutliche Beschleunigung der Reaktion fur zwei der untersuchen 2-Hydroxyketone durch His6-AtHNL sowie inaktive Varianten dieses Enzyms gezeigt werden. Erganzende Untersuchungen zur Analyse des elektrostatischen Oberflachenpotentials der His6-AtHNL ergaben Hinweise auf die Natur der beobachteten Reaktionsbeschleunigung durch Interaktion der Reaktionspartner an der Proteinoberflache. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die biokatalytische Hydrocyanierung vom Batch in einen kontinuierlichen Flussmodus ubertragen. Dazu wurde eine Dreischritt-Kaskade, bestehend aus der Lipase-katalysierten Freisetzung von HCN aus Ethylcyanoformiat, der anschliesenden His6-AtHNL-katalysierten (immobilisiert auf Celite oder in ganzen Zellen) Hydrocyanierung und einem dritten chemischen Acetylierungsschritt, etabliert. Anschliesend wurde dieses Flussreaktorsystem zur Synthese von sechs verschiedenen (hetero)aromatischen O-acetylierten Cyanhydrinen mit ausgezeichnetem Umsatz und sehr guten ee-Werten erfolgreich eingesetzt.