Estudi de les funcions de la topoisomerasa II a la cromatina de Saccharomyces cerevisiae

[cat] El paper de les topoisomerases a la conformacio i la dinamica de la cromatina es de maxima actualitat. Tot i aixi, el mecanisme d'algunes conversions topologiques produides per les topoisomerases a l’ADN nu i, sobretot, a l’ADN de la cromatina son temes pendents d’exploracio. En el treball presentat ens hem centrat en la topoisomerasa II del llevat comu. A l’ADN nu, s’ha analitzat com la topoisomerasa II escull els encreuaments apropiats de l’ADN per simplificar les distribucions termodinamiques de topoisomers. A continuacio, s’ha estudiat les preferencies de la topoisomerasa II per relaxar la superhelicitat positiva i negativa de l'ADN a la cromatina eucariota. Els resultats experimentals apunten a que la reduccio de la variancia de les distribucions termodinamiques no es simetrica i que en aquestes reaccions la topoisomerasa II podria interaccionar amb tres segments d’ADN. La triple interaccio ocasionaria una reduccio de la longitud efectiva de l’ADN, condicionant la quiralitat relativa entre les llacades de l'ADN i la topoisomerasa II. Per exemple, si la llacada fa un creuament (+) el transport sera dificultat, mentre que si es (-) no. Aixo explicaria com es reduiria la variancia i per que aquesta reduccio es asimetrica. Els resultats experimentals tambe ens indiquen que la seleccio del encreuament depen del seu estres topologic. S’ha trobat que la captura d'un encreuament no es correspon sempre amb el transport i que l’eliminacio de la porta de la regio C-terminal de la topoisomerasa II evita la simplificacio de les distribucions termodinamiques. La porta C-terminal actuaria doncs com un sensor d’estres topologic. S’ha proposat que aquest fenomen tindria el sentit biologic de mantenir segregats els cromosomes, evitant fer creuaments innecessaris entre segments adjacents d'ADN per simple proximitat. Per estudiar les preferencies de la topoisomerasa II a la cromatina de llevat, primer es va determinar el limit de tensio superhelicoidal (+) i (-) que es pot assolir in vivo fent servir mutants de les topoisomerases I i II. S'ha trobat que en comparacio amb el -5% fisiologic estabilitzat per els nucleosomes, es pot arribar a graus de tensio superhelicoidal (+) del +4% o mes i en el cas de la (-) del -12% i s’ha vist que aquestes marcades deformacions de l'ADN no comporten la perdua de nucleosomes. A continuacio, es va obtenir minicromosomes circulars de llevat amb superenrotllament (+) i (-) per fer el primer analisi comparatiu de l’eficiencia relaxadora de les topoisomerases I i II a la cromatina. S'ha trobat que, en comparacio a la topoisomerasa I, la topoisomerasa II es cinc vegades mes eficient relaxant la cromatina que l’ADN nu. La topoisomerasa II es per tant la principal relaxasa cel.lular. La comparacio de la velocitat de relaxacio del superenrotllament (+) amb el (-) va descobrir que la velocitat en el primer cas es aproximadament tres vegades superior al segon. Aquest desequilibri contrasta amb l'equivalent grau de superenrotllament (+) i (-) que es genera davant i el darrera de la bombolla de transcripcio. A partir d’aquestes dades s’ha fet un model de com la tensio superhelicoidal (+) i (-) que es genera davant i darrera de la bombolla de transcripcio, altera las conformacions de la cromatina i els nucleosomes i com aquestes conformacions repercuteixen en l'activitat de les topoisomerases. Finalment, es proposa que el resultat es una persistencia de cert grau de tensio superhelicoidal (-), la qual cosa facilitaria moltes de les activitats del genoma. [eng] DNA topoisomerase II transports one segment of duplex DNA throughout another. This thesis focused on the DNA transport preferences of topoisomerase II in naked DNA and native chromatin. The experiments analyzed the interaction of topoisomerase II with DNA during the simplification of equilibrium distributions of DNA topology, and the interplay of topoisomerase II with eukaryotic chromatin under positive and negative torsional stress. The results with naked DNA revealed that topoisomerase II simplifies asymmetrically the thermal distributions of DNA linking number and that such asymmetry occurs when the enzyme interacts with three DNA segments. It is proposed that such triple interaction reduces the effective length of DNA and introduces a chiral preference for the crossing inverted by the topoisomerase. The results uncovered also that after inverting a DNA crossing, topoisomerase II does not always complete DNA transport. Some passed DNA segments can backtrack. This backtracking and the simplification of thermal DNA topology depend on the C-terminal gate of the topoisomerase. It is concluded that the C-gate is a sensor of DNA topological stress, which prevents random knotting of intracellular DNA. The experiments with chromatinized DNA revealed that native yeast chromatin holds in vivo high levels of positive (+4%) and negative (-12%) DNA supercoiling without loosing its nucleosomal organization. Comparative analysis of topoisomerases I and II in the relaxation of chromatin under positive and negative DNA torsional stress lead to discover that topoisomerase II, not topoisomerase I, is the main relaxase of nucleosomal DNA. These results revealed also that topoisomerase II is three times faster in relaxing chromatin under positive that under negative torsional stress. Since positive and negative supercoils are generated in vivo at the same rate during DNA transcription, the imbalance generated by topoisomerase II explains the persistence of negative supercoiling of DNA observed in specific chromatin regions.