Folding of repeat proteins : designed ankyrin repeat and cysteine-rich repeat protein from Helicobacter pylori

Repeat Proteine haben eine nicht-globuläre Struktur und wirken als Gerüste für ProteinProtein Wechselwirkungen. Um die Faltung von Repeat Proteinen zu erforschen, haben wir ein Ankyrin Repeat Protein und ein Cystein-reiches Repeat Protein aus Helicobacter pylori untersucht. Das Ankyrinmotiv besteht aus 33 Resten, die in einer -Schleife gefolgt von zwei über einen Loop verbundene -Helices angeordnet sind. Das Motiv des Cystein-reichen Repeats hat 36 Reste und besteht aus zwei Disulfidverknüpften ? Helices. Das gewählte Ankyrin Repeat Protein faltet bei 5 °C nach einem einfachen 2Zustandsmechanismus. Oberhalb 25 °C werden Faltungsintermediate beobachtet. Die Faltung des Cystein-reichen Repeat Proteins HcpB wurde in vivo und in vitro untersucht. Unter beiden Bedingungen beobachtet man nur native Disulfidintermediate, was darauf hindeutet, dass die einzelnen Repeats voneinander unabhängig falten und nicht-native Disulfide vermieden werden. Im letzten Kapitel wird sodann das Problem der unterschiedlichen Stabilität von Proteinen in Harnstoff und Guanidiniumchlorid (GdmCl) am Beispiel eines Leuzin-Zippers (ABss) untersucht. Wir haben früher gezeigt, dass Denaturierung mit GdmCl eine höhere freie Denaturierungsenergie bei pH 2 ergibt als Harnstoff. Aus der Faltungskinetik von ABSS in Harnstoff und GdmCl folgt, dass die Denaturierungsgeschwindigkeit in GdmCl etwa tausend mal kleiner ist. Das Resultat weist auf eine starke Ladungsabstossung in GdmCl, aber nicht in Harnstoff hin. Repeat proteins have a non-globular modular architecture acting as a scaffold for protein-protein interactions. To explore the folding properties of repeat proteins, we selected an ankyrin repeat protein and a cysteine-rich repeat protein from Helicobacter pylori. The ankyrin motif has 33 residues arranged in a -turn followed by two ? helices connected by a loop. The cysteine-rich motif has 36 residues arranged in two ? helices connected by a disulfide bridge. The folding of the designed ankyrin repeat obeys a two-state model at 5°C, while equilibrium intermediates populate at higher temperatures. Regarding the cysteine-rich repeat protein (HcpB), disulfide folding was monitored both in vivo and in vitro. Under both conditions the major disulfide folding pathway of HcpB involves only native disulfide intermediates. This result suggests that repeats fold in an independent way before disulfide formation, avoiding non-native disulfide formation. In the last chapter we address the problem of different stabilities deduced from the effect of urea and guanidinium chloride (GdmCl) on the folding stability of a leucine zipper (ABss) designed in our laboratory. Previously, we showed that GdmCl unfolding led to a higher free energy of unfolding of the zipper at pH 2 than unfolding with urea. We now performed the kinetics of folding of ABSS in urea and GdmCl at pH 2 and 7. ABss exhibits a thousand-fold slower rate of unfolding in GdmCl, indicating strong charge screening of unfavorable charge-charge repulsions at pH 2 by GdmCl, but not by urea. Posted at the Zurich Open Repository and Archive, University of Zurich ZORA URL: https://doi.org/10.5167/uzh-163307 Dissertation Published Version Originally published at: Venkataramani, Sathya Devi. Folding of repeat proteins : designed ankyrin repeat and cysteine-rich repeat protein from Helicobacter pylori. 2005, University of Zurich, Faculty of Science.