Analyse der Funktion von A-Ephrinen in der Entwicklung des Nervensystems an einem neu etablierten transgenen Mausmodell

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die Ephrine, sind die groste Gruppe von axonalen Zielfuhrungsmolekulen. Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht ausschlieslich fur die Etablierung neuronaler Konnektivitat, sondern auch fur Entwicklungsvorgange auserhalb des Nervensystems wie die Ausbildung des Blutgefassystems und die Steuerung von Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser Molekulfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out Experimente liefern daher nur ein unvollstandiges Bild von der Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von Einzelmolekulen zumindest partiell von anderen Vertretern der Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten Nervensystem ein sezerniertes, Antikorper-ahnliches Fusionsprotein, einen sog. Rezeptorkorper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte der Rezeptorkorper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der A-Ephrine uberwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der Rezeptorkorper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich seiner Funktionalitat charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des Rezeptorkorpers ersetzt (sog. knock-in), und nach Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch Ruckkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkorper mit dem raumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in Mauslinie charakterisiert. Die vollstandige Deletion des Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkorpers wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise fur eine erhohte pra- oder postnatale Letalitat, und das ausere Erscheinungsbild der Mause war weitgehend unauffallig. Eine erste Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer Farbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche morphologische Veranderungen. Mit einem Immunassay wurde die Gewebekonzentration des Rezeptorkorpers zu verschiedenen embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf subzellularer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Farbungen dissoziierter Neuronen demonstriert, das der Rezeptorkorper nicht auf das Soma der Zellen beschrankt, sondern auch in Nervenfortsatzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf spezifische Veranderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Ruckenmark, sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und Blutgefase. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen Veranderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien in das Ruckenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung von Extremitaten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgepragt war. Die Untersuchung der Blutgefase im zentralen Nervensystem adulter Mause mit Hilfe von Korrosionsausgussen lies in der Mutante keine offensichtlichen Veranderungen erkennen. Mit Hilfe der in Anwendung auf Mause neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical Imaging“ wurde die Reprasentation der Retina im Primaren Visuellen Cortex juveniler und adulter Mause untersucht. Zentraler Befund dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem knock-in, die in jungen Mausen erheblich starker war als in adulten Tieren.