Different Modes of Synaptic Vesicle Recycling un Synaptophysin-pHluorin Transgenic Mouse Motor Nerve Terminals

Raquel 12.00 In the present work, a new tool for studying synaptic vesicle exo- and endocytosis in real time has been developed (the SypHy mouse). By combining live imaging, electrophysiological recordings and immunostaining in SypHy mice we have investigated the functional and structural organization of a vertebrate model synapse, the neuromuscular junction (NMJ). The adult vertebrate NMJ is a highly reliable synapse that must exocytose a large number of vesicles with each stimulus to guarantee effective excitation of the postsynaptic muscle fiber. To maintain effective synaptic transmission, the motor nerve terminal must be able to reuse vesicles by subsequent endocytosis. Diverse modes of endocytosis seem to coexist in the same motor terminal although their relative contribution and regulation mechanisms are not completely clear yet. In the first part of this work, we used dynasore, a blocker of the GTPase activity of dynamin 1/2, to investigate the contribution of dynamin in endocytosis at the presynaptic terminal, during and following high frequency stimulation trains. If endocytosis during stimulation is dynamin 1/2-dependent, SypHy would remain in the plasma membrane and the fluorescence would be larger in the presence of the drug. On the other hand, if dynamin 1/2 is activated after the stimulus, slowness of the signal is expected. Our experiments suggest that dynamin 1/2 only modestly, and in a time-dependent manner, participates in endocytosis during repetitive stimulation. After stimulation, however, dynamin 1/2 is rapidly activated. In addition, we demonstrated by immunolabeling that dynamin 1 and dynamin 3 are co-expressed in the motor nerve terminals, suggesting that dynamin 1/2-independent mechanisms also exist in this synapse. In the second part of this work, the role of calcineurin on exo-/endocytosis was investigated. We found that calcineurin is essential for both exo- and endocytosis in a subset of motor nerve terminals. In the presence of FK506 or CsA, two calcineurin specific inhibitors, end-plate potentials and fluorescence signals were affected in a dose-dependent manner. Finally, in the third part of this work, we studied the structural organization of active zones (AZs) at the mouse motor nerve terminal in adult and during the postnatal maturation period. We used quantitative confocal microscopy of AZs immunostained with fluorescently tagged antibodies to bassoon and piccolo, two scaffolding proteins of the AZ. We found that the number of AZs increases exponentially from postnatal day two to adulthood but the density of AZs remains almost constant during the maturation process. En el presente trabajo, se ha generado una nueva herramienta para el estudio de la exo- y endocitosis en tiempo real (el raton SypHy) con el objetivo de estudiar la organizacion funcional y estructural en un modelo de sinapsis de vertebrados, la union neuromuscular del raton transgenico SypHy. Para ello se han combinado tecnicas de imagen de fluorescencia, registros electrofisiologicos e inmunofluorescencia La union neuromuscular es una sinapsis que debe exocitar un gran numero de vesiculas sinapticas para garantizar la efectiva excitacion de las fibras musculares postsinapticas. Para ello, el terminal nervioso motor debe ser capaz de reutilizar las vesiculas previamente exocitadas mediante endocitosis. En el mismo terminal motor es posible que coexistan diferentes modos de endocitosis, sin embargo, la contribucion relativa de cada uno de estos modos y sus mecanismos de regulacion no estan completamente claros. En la primera parte de este trabajo, se ha usado dynasore, un bloqueante de la actividad GTPasa de dinamina 1/2, para investigar la contribucion de dinamina en la endocitosis durante y despues de trenes de estimulos a alta frecuencia. Si la endocitosis durante el estimulo depende de dinamina 1/2, SypHy permaneceria en la membrana plasmatica y la fluorescencia seria mayor en presencia de la droga. Por otro lado, si la dinamina 1/2 es activada despues del estimulo la respuesta de fluorescencia se enlenteceria. Los experimentos realizados sugieren que la dinamina 1/2 solo participa modestamente en la endocitosis durante el estimulo con una activacion tiempo dependiente. Despues del estimulo, sin embargo, la dinamina 1/2 se activa rapidamente. Ademas se ha demostrado que tanto dimanina 1 como dinamina 3 se expresan en los terminales motores adultos. En la segunda parte de este trabajo, se ha estudiado el rol de calcineurina en la exo- y endocitosis. Se ha encontrado que calcineurina es esencial tanto para la exo- como la endocitosis en una poblacion de terminales motores. En presencia de FK506 o CsA, dos inhibidores especificos de calcineurina, tanto los potenciales de placa evocados como la senal de fluorescencia se afectaron de manera concentracion dependiente. Por ultimo, en la tercera parte de este trabajo, se ha estudiado la organizacion de las zonas activas en los terminales motores de ratones adultos y durante el desarrollo postnatal. Con este objetivo, se cuantificaron las zonas activas marcadas inmunofluorescentemente con anticuerpos anti basson y anti piccolo, dos proteinas de andamiaje de las zonas activas. Se ha encontrado que el numero de zonas activas aumenta exponencialmente desde el dia postnatal 2 hasta la edad adulta, sin embargo, la densidad de las zonas activas permanece contante durante el proceso de maduracion. 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