Produção, purificação e caracterização de xilanase termoestável produzida por Cryptococcus flavescens e expressão em Pichia pastoris

Xilanases sao enzimas que hidrolisam as ligacoes glicosidicas entre as unidades de xilose que compoem a xilana, o principal constituinte hemicelulosico. Devido a grande disponibilidade desse tipo de material na natureza, as xilanases podem ser empregadas em diversos ramos, como nas industrias textil, de alimentos e de racoes, na bioconversao de residuos lignocelulosicos, no clareamento de papel e polpa, e no tratamento de residuos. Visando descrever novas enzimas para futuras aplicacoes, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar a xilanase produzida pelo basidiomiceto Cryptococcus sp. LEB-AY10, uma levedura previamente isolada da Mata Atlântica e selecionada pela producao de enzima termoestavel. Para tanto, o micro-organismo foi inicialmente identificado em nivel de especie e depositado como C. flavescens LEB-AY10 (CCT 7725); em sequencia, foi estudada a producao da enzima utilizando, como substrato, bagaco de cana-de-acucar, pre-tratado por explosao a vapor em tres diferentes condicoes, bem como suas respectivas fracoes soluveis, e suplementados com melaco ou componentes sinteticos. Tendo sido definida a metodologia de tratamento do bagaco, tecnicas de planejamento experimental foram utilizadas para estudar a influencia das variaveis de cultivo e aumentar a atividade da xilanase produzida. Nas condicoes otimizadas, obteve-se aumento de 5,6 vezes na atividade em relacao aos testes iniciais, atingindo 4,67 U/mL (a 50°C) ou 8,33 U/mL (a 80°C) em 96 h de incubacao. Posteriormente, realizou-se a purificacao da xilanase em duas etapas cromatograficas (troca ionica e permeacao em gel), sendo possivel recuperar 45% da atividade inicial. A massa molecular media foi estimada em 48 kDa. A enzima apresentou atividade otima a 77,5°C e maior estabilidade em pH proximo a 5,3. Neste pH, as meias-vidas desta enzima foram estimadas em 9,2 minutos a 77,5°C e 33,74 h a 67°C. Os parâmetros cineticos Km e vmax utilizando xilana de betula (birchwood) como substrato foram 4,13 g/L e 2,32 U/mL, respectivamente. A xilanase purificada apresentou baixas atividades de ? -xilosidase em 4-nitrofenil-? -D-xilopiranosideo (0,02 U/mg) e de celulase em carboximetilcelulose (0,99 U/mg). Os produtos de hidrolise da xilana de faia (beechwood) pela xilanase de C. flavescens LEB-AY10 foram, principalmente, xilobiose e xilotriose. Para identificacao do gene responsavel pela producao da xilanase, foram utilizadas tres estrategias: amplificacao com primers degenerados, identificacao de peptideos por espectrometria de massas e sequenciamento do genoma da levedura. Um unico gene (1265 pb) denominado Xyn10Cf foi identificado e o correspondente cDNA (1035 pb) foi clonado em Escherichia coli DH10B. O gene e interrompido por 6 introns, codifica um peptideo sinal composto por 13 aminoacidos e a proteina madura e formada por 331 aminoacidos, tendo sua massa molecular estimada em 37,1 kDa (podendo conter cerca de 11 kDa de glicosilacao). Com base na sequencia de nucleotideos e na caracterizacao da enzima purificada, a proteina foi classificada como membro da familia GH10. Por fim, para comprovar a funcionalidade do gene identificado Xyn10Cf foi realizada a expressao na linhagem de Pichia pastoris GS115 sob o controle dos promotores alcool oxidase 1 (AOX1) ou gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), atingindo 5,66 U/mL e 7,67 U/mL, respectivamente, para 84 h de inducao em frascos agitados Abstract