Développement et premières applications d'une méthode de tri de cellules bactériennes par marquage de l'ADN avec des nanoparticules magnétiques pour l'étude de la diversité bactérienne environnementale et des transferts horizontaux de gènes in situ

En depit de leur importance, la caracterisation des communautes bacteriennes dans l’environnement reste encore tres incomplete. Les principales raisons sont, d’une part, la difficulte d’apprehender la totalite de la communaute bacterienne quand plus de 99% des bacteries demeurent recalcitrantes a la culture in vitro et ne peuvent donc etre etudiees par les approches classiques de microbiologie. D’autre part, la metagenomique, censee contourner cette methode de culture en s’interessant a l’ensemble des genomes extraits des milieux d’etudes, demeure elle aussi imparfaite du fait de limitations techniques (biais d’extraction de l'ADN, de clonage, de PCR, de sequencage et d’assemblage des genomes etc.) et conceptuelles, inherentes a la complexite et l’heterogeneite des environnements. Pour compenser les limites de chacune de ces techniques, des methodes de tri cellulaire appliquees en conjonction avec les deux premieres pourraient aider a un meilleur decryptage de la diversite microbienne. Basee sur la selection specifique (taxonomique et/ou fonctionnelle) et l’isolement direct des cellules bacteriennes ciblees a partir d’un echantillon environnemental complexe, l’etude est restreinte a une population specifique, voire a une cellule isolee. Pourront alors etre appliquees les approches classiques de mise en culture ou d’extraction de l’ADN pour une etude restreinte a l’ADN ou l’ARN, leur repetition sur les differentes populations devant a terme (lointain) approcher l’exhaustivite. C’est dans ce contexte que s’est positionne ce travail de these visant dans un premier temps a mettre au point un nouvel outil de tri cellulaire base sur l’integration de micro-aimants permanents dans un canal microfluidique. A partir de ce systeme de tri magnetique miniaturise, offrant de nombreux avantages (dispositif portable, peu couteux, necessitant de faibles volumes reactionnels et potentiellement integrable en « laboratoire sur puce »), une technique d’isolement selectif de cellules bacteriennes marquees magnetiquement a alors ete developpee. Ciblees sur des criteres taxonomiques apres hybridation in situ avec des sondes d’acides nucleiques biotinyles complementaires d’une region specifique du gene 23S rRNA, des cellules bacteriennes ont ete marquees magnetiquement apres reaction de la sonde avec des nanoparticules magnetiques fonctionnalisees par des molecules de streptavidine. Les premiers resultats montrent l’etablissement d’une methode de tri suffisamment specifique et sensible pour pieger les cellules marquees diluees (0,04%) au sein d’une suspension, a des niveaux compatibles avec l’isolement futur de populations d’interet a partir de communautes d’environnements complexes. Sur un principe comparable, l’approche a ete adaptee a l’etude des transferts horizontaux de genes in situ. Les applications d’un tri cellulaire grâce au marquage par des nanoparticules magnetiques et l’emploi de micro-aimants integres dans des microsystemes fluidiques semblent donc tres prometteuses pour le developpement de la microbiologie environnementale.