Digestibility of milk and egg white allergens. Immunological responses, peptides released and mapping of epitopes

La alergia a leche y huevo presenta una alta incidencia en continuo aumento en Europa y Estados Unidos, sobre todo en la poblacion infantil. Los principales alergenos de estos productos son glicoproteinas, y para inducir una respuesta alergica, deben ser capaces de atravesar la barrera intestinal manteniendo la suficiente integridad estructural como para interactuar con el sistema inmune. Por ello, una de las caracteristicas principales de los alergenos alimentarios es su resistencia a la digestion gastrointestinal y es importante evaluar si los fragmentos generados durante este proceso retienen epitopos de union a IgE. Dados los multiples factores que intervienen en la digestion fisiologica, la validez de la estabilidad frente a la digestion in vitro como criterio para estimar el potencial alergenico de las proteinas esta siendo muy discutida. En esta tesis doctoral, se han llevado a cabo digestiones con fluidos orales, gastricos y duodenales humanos y simulados con enzimas comerciales de tres proteinas alimentarias alergenicas, s-caseina s-CN, s-Lactoglobulina (s-LG), y Ovoalbumina (OVA). Los resultados mostraron similares patrones de hidrolisis e inmunorreactividad de los digeridos con los dos modelos de digestion, aunque la degradacion proteica fue mas rapida con fluidos humanos que con simulados. Los analisis por microarray y dot blot mostraron que algunos de los peptidos resultantes de la digestion mantienen su capacidad alergenica. Las areas inmunorreactivas mas destacadas fueron s-CN (57-68) y s-CN (82-93) en el caso de la s-CN; s-LG (43-60), s-LG (47-62), s-LG (86-99), s-LG (86-100) y s-LG (135-147) para s-LG, y OVA (370-385) en el caso de OVA. Por otro lado tambien se estudio el efecto de los residuos de carbohidratos unidos al ovomucoide (OM), alergeno inmunodominante del huevo, en su alergenicidad y digestibilidad. Se comprobo que tras la desglicosilacion enzimatica del OM, la proteina mantenia su estructura inalterada y el 80% de los pacientes estudiados mostraron una menor capacidad de union a IgE comparado con el OM glicosilado. Ademas, se demostro la presencia de epitopos reactivos frente a IgE especificos para la proteina glicosilada. El OM desglicosilado fue mas susceptible a la proteolisis durante la digestion pero el patron peptidico resultante fue muy parecido. La inmunorreactividad de los digeridos disminuyo hasta valores de entre el 1 y el 4% al final de la digestion, pero algunos de los peptidos identificados demostraron mantener su capacidad de union a IgE, entre los que destacan el peptido OM (80-89) y las regiones OM (36-61), OM (100-122) y OM (133-180) que reaccionaron en el 40-100% de los pacientes ensayados. Por ultimo, se identificaron los peptidos generados durante la digestion gastrointestinal in vitro de uno de los mayores alergenos del huevo, la lisozima (LYS). Los resultados indicaron que los digeridos gastrico y duodenal mantenian su capacidad de union a IgE y de activar basofilos. Esta actividad biologica podria ser atribuida a la presencia de LYS intacta, al fragmento (24-129) producido por la accion de la quimiotripsina o a la liberacion de peptidos inmunorreactivos unidos por puentes disulfuro que contenian los epitopos LYS (11-27), LYS (57-83) y LYS (108-122). El hecho de que importantes epitopos lineales puedan ser liberados durante la digestion de la LYS llevo a estudiar el caso de un nino alergico al huevo, que tolerando huevo despues de un tratamiento de inmunoterapia, sufrio una fuerte reaccion alergica a un medicamento que contenia LYS y papaina, por lo que se planteo la hipotesis de que la presencia de papaina, podria incrementar el potencial alergenico de la LYS. Los resultados indicaron que la LYS tratada con papaina dio lugar a fragmentos con una alta capacidad de union a IgE que fueron identificados como LYS (22-129), LYS (34-96) y LYS (62-128). Ademas estos fragmentos podrian permanecer unidos por puentes disulfuro formando grandes estructuras que podrian tener una capacidad de union a IgE aumentada.