Microbial communities in drinking water systems analysed by lipid biomarkers

Microbial growth in drinking water systems evokes quality, health, aesthetic, and technical problems. The conventional analyses of microbes in drinking water systems include determination of microbial biomass, activity or specific microbes. Unfortunately, culturing techniques reveal only 0.01-10% of the microbes actually present in drinking water systems. Lipid biomarkers e.g. phospholipid fatty acids (PLFAs) and lipopolysaccharide hydroxy fatty acids (LPS OH-FAs) provide quantitative insight to the complex microbial communities and their amounts in environmental samples without the need for microbial culturing. PLFAs can also be used to monitor differences in the physiological state of microbes, such as the stationary growth phase of microbes. Microbes change their fatty acid composition with changing environmental conditions. However, thus far only limited use of lipid biomarkers for microbial community studies in drinking water systems has been made. In this work, the applicability of lipid biomarkers to characterise microbial communities in drinking water systems was studied both with water and biofilms samples. Soil and sediment samples were used as environmental reference material. In the analyses, lipids were first extracted, fractionated, PLFAs were methyl esterfied, and analysed by gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) using selected ion monitoring. 2and 3-hydroxy fatty acid methyl esters were prepared by mild acid hydrolysis directly from the extraction residue of lipids without further purification or derivatisation, and analysed by GC-MS using selected ion monitoring. The ions monitored were m/z 90 and M-59 for 2-OH-FAs and m/z 103 for 3-OH-FAs. Water and biofilm samples revealed a wide range of (from 21 to 26) PLFAs. Most of the PLFAs were typical for microbial biomass or gram-negative bacteria (16:0, 18:0, 16:1ω7, 18:1ω7). In the biofilms, 3 or 16 LPS 3-OH-FAs were found, whereas in drinking and warm waters 3 LPS 3-OH-FAs were detected. The most abundant 3-OH-FAs were typical of those present in gram-negative bacteria (i.e. 3-OH-10:0, -12:0, -14:0, -16:0, -18:0). Any LPS 2-OH-FAs were never detected in either biofilms or water samples. There were differences in the microbial community structures between biofilms and waters, and drinking water and warm water. In the laboratory experiment, addition of 1, 2 or 5 μg l phosphate phosphorus to water increased the proportion of gram-negative bacteria and changed their community structure as judged by the PLFAs and 3-OH-FAs, respectively. There also were differences in microbial communities between two full-scale distribution systems. The microbial community was more complex in those biofilms which had a development time of 6 weeks compared to those growing for 23 or 40 weeks in the full-scale distribution system A. In full-scale distribution systems, microbial biomass, as assessed by the quantitative amount of PLFAs, increased with increasing water residence time. These laboratory and full-scale studies demonstrated that lipid biomarkers are a sensitive method to analyse microbial communities and viable biomass in drinking water systems. Keinanen Minna M. Microbial communities in drinking water systems analysed by lipid biomarkers. Kansanterveyslaitoksen julkaisuja A16/2003. 64 s. ISBN 951-740-382-8, ISSN 0359-3584, ISBN 951-740-383-6 (pdf-versio), ISSN 1458-6290 (pdf-versio) TIIVISTELMA (ABSTRACT IN FINNISH) Mikrobien kasvu talousvesijarjestelmissa aiheuttaa laatu-, terveys-, esteettisia ja teknisia ongelmia. Perinteisesti talousvesijarjestelmien mikrobeja on analysoitu maarittamalla mikrobibiomassaa, aktiivisuutta tai jotain tiettya mikrobia. Viljelymenetelmilla saadaan esiin vain 0.01-10% mikrobeista, jotka todellisuudessa esiintyvat talousvesijarjestelmissa. Lipidibiomarkkereilla, kuten fosfolipidien rasvahapoilla (PLFAs) ja lipopolysakkaridien hydroksihapoilla (LPS OH-FAs) saadaan kvantitatiivista tietoa monimutkaisista mikrobiyhteisoista ja niiden biomassasta ymparistonaytteissa ilman mikrobien viljelemista. PLFA:ta voidaan kayttaa myos mikrobien fysiologisen tilan erojen havaitsemiseen, kuten mikrobien stationaarikasvuvaihe. Mikrobit muuttavat rasvahappokoostumustaan muuttuvissa ymparistoolosuhteissa. Tahan asti lipidibiomarkkereita on kuitenkin kaytetty rajoitetusti mikrobiyhteisojen tutkimiseen talousvesijarjestelmissa. Tassa tyossa lipidibiomarkkerien kayttokelpoisuutta talousvesijarjestelmien mikrobiyhteisojen kuvaajina tutkittiin seka vesietta biofilminaytteilla. Maaja sedimenttinaytteita kaytettiin ymparistovertailunaytteina. Analyysissa lipidit ensin uutettiin, fraktioitiin, PLFA:t metyyliesteroitiin ja analysoitiin kaasukromatografia-massaspektometrialla kayttaen selektiivista ionien monitorointia. 2ja 3hydroksirasvahappojen metyyliesterit valmistettiin miedolla happamalla hydrolyysilla suoraan lipidien uuttojaanteesta ilman jatkopuhdistuksia tai kemiallisten johdosten valmistusta ja analysoitiin kaasukromatografia-massaspektometrialla kayttaen selektiivista ionien monitorointia. 2-hydroksirasvahappojen analyysissa seurattiin ioneja m/z 90 ja M-59 ja 3-hydroksirasvahappojen ionia m/z 103. Vesija biofilminaytteista loydettiin laaja maara (21-26 kpl) fosfolipidien rasvahappoja. Suurin osa PLFA:sta oli tyypillisia mikrobibiomassalle tai gram-negatiiviselle bakteereille (16:0, 18:0, 16:1ω7, 18:1ω7). Biofilmeissa havaittiin 3 tai 16 LPS 3-OH-rasvahappoa, kun taas kylmasta talousvedesta ja lampimasta vedesta havaittiin kolme LPS 3-hydroksirasvahappoa. Suurin osa 3-OH-rasvahapoista oli tyypillisia gram-negatiivisille bakteereille (3-OH-10:0, -12:0, -14:0, -16:0, -18:0). LPS 2-OH-rasvahappoja ei havaittu biofilmieika vesinaytteissa. Biofilmien ja vesien valilla seka kylman ja lampiman talousveden mikrobiyhteisoissa havaittiin eroja. Laboratoriokokeessa 1, 2 tai 5 μg l fosfaattifosforin lisays lisasi gram-negatiivisten bakteerien osuutta ja muutti niiden sisaista yhteisorakennetta PLFA:n ja LPS 3-OHrasvahappojen perusteella. Myos kahden tayden mittakaavan talousvesiverkostojen mikrobiyhteisot erosivat. Mikrobiyhteiso oli monimuotoisempi biofilmeissa, jotka olivat kehittyneet 6 viikkoa verrattuna 23 tai 40 viikkoa kehittyneisiin biofilmeihin tayden mittakaavan talousvesiverkostossa A. Tayden mittakaavan talousvesiverkostoissa mikrobibiomassa arvioituna PLFA:n kvantitatiivisesta maarasta lisaantyi, kun veden ika kasvoi. Laboratorioja tayden mittakaavan tutkimukset osoittivat, etta lipidibiomarkkerit ovat herkka menetelma mikrobiyhteisojen ja elavan biomassan maarittamiseen talousvesijarjestelmissa.