Determination of Laterality in the Rabbit Embryo: Studies on Ciliation and Asymmetric Signal Transfer

The midline of the vertebrate embryo plays a pivotal role in the regulation of left-right (LR) asymmetry. In mammals recent interest has focused on a structure situated at the caudal part of the notochord, the posterior notochord (PNC), which is homologous to Kupffer? s vesicle (KV) in fish and the gastrocoel roof plate (GRP) in frog. Despite highly diverging embryonic architecture, the PNC/KV/GRP is the site where motile monocilia set up a directional fluid flow, an event indispensable for the generation of LR asymmetry. Signals created at the PNC/KV/GRP need to be transferred to the periphery of the embryo, where they initiate the left-specifying program in the left lateral plate mesoderm (LPM). In this study morphogenesis and ciliogenesis of the notochordal plate as well as the signaling processes between midline and LPM were studied in the rabbit embryo. Rabbit development progresses through a flat blastodisc phase and represents the typical mode of mammalian embryogenesis. Transcription of ciliary marker genes, the first sign of beginning ciliogenesis, initiated in Hensen? s node and persisted in the nascent notochord. Cilia emerged on cells leaving Hensen? s node anteriorly to form the notochordal plate. Cilia lengthened to about 5µm and polarized from an initially central position to the posterior pole of cells. Electron microscopic analysis revealed 9+0 and 9+2 cilia and a novel 9+4 axoneme intermingled in a salt-and-pepper-like fashion. These data showed that the ciliogenic gene program essential for laterality determination is conserved at the midline of the rabbit embryo. The present study also provided evidence that initiation as well as repression of the Nodal cascade crucially depended on communication between midline and lateral plate (LP). Separation of LP tissue from the midline before, during and after the 2 somite stage demonstrated that signals from the PNC induced and maintained the competence of LPM to express Nodal. Signals from the midline were necessary after the 2 somite stage to maintain a right-sided identity, i.e. absence of Nodal expression. Gap-junction-dependent intercellular communication (GJC) was shown to play a central role in this process. Previously, GJC had been involved in LR axis determination in cleavage stage frog embryos and early blastodisc stages in chick. This study for the first time demonstrates the role of GJC in mammalian embryos. GJs regulate the signaling between midline and periphery: permeable gap junctions were required specifically at the 2 somite stage to repress Nodal induction in the right LPM, whereas closed GJs were a prerequisite for Nodal signaling on the left side. Establishment of the right-sided fate depended on FGF8, the signaling of which was regulated by the opening status of GJs. A 3-step model is proposed for symmetry breakage and induction of the LR signaling cascade in vertebrates: (1) Nodal protein synthesized at the lateral edges of the PNC diffuses bilaterally and confers competence for the induction of the Nodal cascade to the LPM, (2) at the same time the left-specific cascade is actively repressed by action of the GJC/FGF8 module, and (3) following the onset of leftward flow at the PNC repression gets released specifically on the left side at the 2 somite stage, presumably by transient inhibition of GJC. This model not only is consistent with the presented data, but also with published work in other model organisms. Im Wirbeltierembryo spielt die Mittellinie eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der links-rechts (LR) Asymmetrie der inneren Organe. Das jungste Interesse fokussiert sich insbesondere auf den caudalen Teil des Notochords im Sauger, das posteriore Notochord (PNC), eine Region die dem Kupfferschen Vesikel (KV) des Fisches und der Dachplatte des Gastrocoels (GRP, gastrocoel roof plate) der Amphibien homolog ist. Trotz der hochst unterschiedlichen Morphologie der Wirbeltierembryonen zeich-net sich die PNC/KV/GRP-Region immer dadurch aus, dass hier ein durch Mono-cilien getriebener gerichteter Flussigkeitsstrom entsteht, welcher fur die Entstehung von Asymmetrie unverzichtbar ist. Signale, die in diesem Bereich der Mittellinie entstehen, mussen in die Peripherie des Embryos gelangen, um die links-spezifische Signalkaskade im linken Seitenplattenmesoderm (SPM) in Gang zu setzen. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die Morphogenese und Ciliogenese der Notochordalplatte als auch die Signalprozesse zwischen Mittellinie und Seitenplatte im Kaninchenembryo untersucht. Die Entwicklung des Kaninchens durchlauft ein flaches Keimscheibenstadium und reprasentiert somit die grundlegende Morphologie der Saugerentwicklung. Die Transkription ciliarer Markergene, das erste Zeichen der Ciliogenese, begann im Hensenschen Knoten und setzte sich im auswachsenden Notochord fort. Die ersten Cilien entstanden auf Zellen, die den Knoten als Teil der Notochordalplatte rostralwarts verliesen. Diese Cilien wuchsen zu etwa 5µm Lange heran und nahmen sukzessive eine posteriore Position auf der Zelle ein. Die Analyse der Cilien im Elektronen-mikroskop zeigte, dass 9+0 und 9+2 Cilien sowie ein neu entdecktes 9+4 Axonem auf der Notochordalplatte vermischt vorkamen. Diese Daten bestatigten, dass das genetische Programm, welches die Ciliogenese steuert und fur die Ausbildung der Organasymmetrie verantwortlich ist, in den Strukturen der Mittellinie des Kaninchens konserviert ist. Die vorliegende Arbeit zeigte zudem, dass sowohl Induktion als auch Repression der Nodal-Signalkaskade auf einem Austausch zwischen Mittellinie und Seitenplatte (SP) beruhen. Die Isolierung von SP-Gewebe vor, wahrend und nach dem 2-Somiten-Stadium bewies, dass Signale aus dem PNC die Kompetenz zur Expression von Nodal im SPM induzierten und aufrecht erhielten. Nach dem 2-Somiten-Stadium waren Signale aus der Mittellinie notwendig, um die Identitat der rechten Seite, d.h. fehlende Nodal-Expression, aufrecht zu erhalten. Es stellte sich heraus, dass gap-junction-vermittelte interzellulare Kommunikation (GJK) eine zentrale Rolle in diesem Prozess spielt. Es ist bereits bekannt, dass GJK in Furchungsstadien von Froschembryonen sowie in der fruhen Keimscheibe des Huhnchens an der Ausbildung der LR Asymmetrie beteiligt sind. Nun zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass GJK auch im Sauger eine Rolle spielt. Gap junctions (GJs) regulieren den Signalaustausch zwischen Mittellinie und Peri-pherie: permeable GJs waren speziell im 2-Somiten-Stadium zur rechtsseitigen Repression von Nodal im SPM benotigt, wahrend geschlossene GJs eine Vorauss-etzung fur die Induktion von Nodal auf der linken Seite bildeten. Die Identitat der rechten Seite war zudem von FGF8 abhangig, dessen Funktion durch den Offnungs-status der GJs reguliert wurde. Ein dreistufiges Modell fur den Symmetriebruch und die Induktion der LR Signalkaskade in Wirbeltieren wird vorgeschlagen: (1) Nodal-Protein breitet sich beiderseits des PNC aus und ubertragt die Kompetenz fur die Nodal-Kaskade auf das SPM. (2) Die links-spezifische Kaskade wird durch das Zusammenspiel von GJK und FGF8 beidseitig aktiv unterdruckt bis (3) die linksgerichtete Flussigkeitsbewegung diese Repression auf der linken Seite aufhebt, wahrscheinlich durch eine vorubergehende Inhibition von GJK. Das vorgeschlagene Modell stimmt nicht nur mit den hier prasentierten Daten, sondern auch mit bereits veroffentlichten Arbeiten an anderen Modellorganismen uberein.