Enzyme-Benzalkonium chloride combined strategies to remove Listeria monocytogenes mixed-species biofilms

Listeria monocytogenes esta considerada una de las bacterias patogenas transmitidas por alimentos de mayor relevancia en Europa. En la naturaleza, se encuentra formando biopeliculas multiespecie, estructuras de resistencia constituidas por una matriz extracelular que actua de barrera protectora frente a agentes externos, dificulta su accion y genera concentraciones subletales en el interior de la biopelicula. En el ambito industrial, es habitual que las biopeliculas esten expuestas a concentraciones subletales de biocidas, bien debido a que estas se encuentran en ubicaciones de dificil acceso, bien como consecuencia de una aplicacion ineficiente. Ello favorece la aparicion de bacterias resistentes y persistentes en plantas industriales, lo que ha llevado a un exceso en el uso de biocidas y al consecuente incremento del impacto ambiental. Es necesario, pues, proponer sistemas de limpieza y desinfeccion mas efectivos y eficientes, que aseguren el control de patogenos, generen menor resistencia y mantengan los canones de impacto ambiental. En la presente tesis se propone el diseno de un sistema de limpieza y desinfeccion especifico frente a biopeliculas mixtas de L. monocytogenes presentes en la industria alimentaria basado en la aplicacion combinada de enzimas y cloruro de benzalconio (CB). La hipotesis de partida se basa en que la aplicacion de las enzimas podria suponer la disrupcion de la matriz de la biopelicula que actua como barrera frente a antimicrobianos facilitando la accion posterior del desinfectante. La especificidad se consigue a partir de la caracterizacion previa de las biopeliculas portadoras de L. monocytogenes presentes en la industria, que permite la seleccion de las enzimas, el ajuste de las dosis y el estudio del posible desarrollo de tolerancia. El trabajo se desarrollo en las siguientes etapas: • Caracterizacion de las comunidades portadoras de L. monocytogenes presentes en superficies de industrias pesquera, carnica y lactica. Esto permitio detectar la presencia y subtipos de L. monocytogenes, caracterizar la microbiota acompanante y estudiar las dinamicas de adhesion de los aislados de L. monocytogenes sobre acero inoxidable (AI) asi como la capacidad de su asociacion y formacion de biopeliculas en cultivo mixto con las especies acompanantes. • Efectividad de la combinacion de enzimas-CB sobre la eliminacion de biopeliculas tempranas portadoras de L. monocytogenes. Se estudiaron los efectos de diferentes enzimas solas y combinadas con CB sobre biopeliculas tempranas mixtas de L. monocytogenes formadas en AI. Los resultados obtenidos demostraron la efectividad de la aplicacion combinada enzima-CB sobre la eliminacion de biopeliculas mixtas portadoras de L. monocytogenes y pusieron de manifiesto que dicha efectividad varia con la composicion y edad de la biopelicula, senalando la importancia de disenar sistemas especificos de limpieza y desinfeccion. • Cuantificacion de los efectos de la aplicacion combinada de pronasa-CB sobre la eliminacion de biopeliculas tardias de L. monocytogenes-E. coli. Se cuantificaron los efectos individuales y combinados de la aplicacion de pronasa y CB sobre la superficie ocupada por las biopeliculas tardias mixtas y el numero de celulas viables adheridas y desprendidas despues de la aplicacion de los tratamientos. Los resultados demostraron un efecto sinergico de pronasa-CB sobre la eliminacion de biopeliculas de L. monocytogenes-E. coli, una mayor efectividad frente a L. monocytogenes y la necesidad de dosificar elevadas concentraciones de BAC para asegurar la ausencia de celulas viables adheridas y liberadas. • Desarrollo de tolerancia a tratamientos combinados de pronasa-CB en biopeliculas mixtas de L. monocytogenes-E. coli. Se evaluo el efecto de la frecuencia y duracion de exposiciones subletales consecutivas de pronasa-CB sobre el desarrollo de tolerancia en biopeliculas mixtas de L. monocytogenes-E. coli. Los resultados demostraron que unicamente cuando las exposiciones subletales se acompanan de un periodo de recuperacion se produce el desarrollo de tolerancia a la aplicacion de los tratamientos combinados pronasa-CB. Listeria monocytogenes is considered one of the major foodborne pathogenic bacteria in Europe. In nature, it is found forming part of multispecies biofilms, resistance structures constituted by an extracellular matrix acting as a protective barrier against external agents, hindering their action and generating sublethal concentrations inside the biofilm. In industrial environments, biofilms are usually exposed to sublethal concentrations of biocides, due to the fact that the biofilm is located in inaccessible locations or because of inefficient application. This can favour the appearance of resistant and persistent bacteria in industrial plants, which lead to an excessive biocide deployment with a subsequent higher environmental impact. Is hence necessary, to propose more effective and efficient cleaning and disinfection systems, able to ensure pathogen control, generate less resistance while maintaining the main environmental impact standards. In the present dissertation, the design of a specific cleaning and disinfection system based on the combined application of enzymes and benzalkonium chloride (BAC) against L. monocytogenes mixed biofilms present in the food industry is proposed. The initial hypothesis is that the application of enzymes might produce the disruption of the biofilm matrix that acts as a barrier to antimicrobials, facilitating the subsequent effect of the disinfectant. The specificity is achieved based on the previous characterisation of the L. monocytogenes-carrying biofilms present in industry that permits the enzyme selection, the dose adjustment and the study of the possible tolerance development. The experimental work was development in the following stages: • Characterisation of the L. monocytogenes-carrying communities present in fish, meat and dairy industry. This allowed detecting the presence and subtypes of L. monocytogenes, to characterise the accompanying microbiota and to study the adhesion dynamics of L. monocytogenes isolates on stainless steel (SS) as well as the association capacity and biofilm formation in mixed culture with the accompanying species. • Effectiveness of the enzyme-BAC combination to remove early-stage L. monocytogenes-carrying biofilms. The effects of different enzymes alone and combined with BAC against early-stage L. monocytogenes mixed biofilms grown on SS was assessed. Results obtained demonstrated the efficacy of the enzyme-BAC combined application to remove L. monocytogenes mixed biofilms and highlighted that this efficacy varies with the composition and age of the biofilm, pointing out the importance of designing strain-specific cleaning and disinfection strategies. • Quantification of the effects of pronase-BAC combined application against L. monocytogenes-E. coli late-stage dual-species biofilms. The individual and combined effects on the occupied surface, and the number of viable adhered and released cells after the application of pronase and BAC against late-stage L. monocytogenes-E. coli dual-species biofilms were assessed. Results demonstrated a synergistic effect of pronase-BAC application against L. monocytogenes-E. coli dual-species biofilms, a higher efficacy against L. monocytogenes, and the need to use high BAC doses to ensure the absence of adhered and released viable cells. • Tolerance development to pronase-BAC combined treatments in L. monocytogenes-E. coli mixed biofilms. The effects of the frequency and duration of consecutive sublethal exposures to pronase-BAC on the development of tolerance in L. monocytogenes-E. coli mixed biofilms was assessed. Results showed that only when sublethal exposures are alternated with recovery periods, a tolerance development to the application of pronase-BAC combined treatments takes place.