Développement de substrats actifs et d'une méthode d'analyse de FRET quantitative pour décoder la mécanotransduction

Les cellules vivantes sont capables de reagir aux signaux mecaniques tels que la rigidite de la surface sur laquelle elles adherent, les forces de tractions ou compressions auxquelles elles sont soumises, le flux de liquide a la surface de leur membrane ou encore la geometrie de leurs adhesions ou de leur forme globale. Ces signaux influent sur des processus cellulaires tels que la proliferation, la differenciation, la migration et la mort cellulaire. Ces processus sont finement regules par des reactions biochimiques qui forment un reseau de signalisation. La mecanotransduction est la traduction du signal mecanique en signal biochimique.C’est dans le but d’etudier la mecanotransduction que nous avons etudie l’utilisation d’ultrasons pour stimuler mecaniquement les cellules a des frequences temporelles et spatiales relativement elevees. De nombreux montages experimentaux et de nombreuses voies ont ete considerees dans cette partie tres exploratoire. Nous en retenons finalement des pistes prometteuses pour la continuation future de ce projet.Nous avons developpe ce que nous nommons des substrats actifs, qui nous permettent de controler a la fois spatialement et temporellement la stimulation mecanique appliquee a des cellules vivantes. Ces substrats actifs consistent en des micropiliers de fer incrustes dans un elastomere peu rigide (PDMS) et manipules par deux electroaimants. Nous pouvons controler dynamiquement le deplacement des piliers qui vont deformer localement et de maniere continue la surface. Cette deformation va ensuite deformer en traction ou en compression les cellules vivantes etalees sur la surface a proximite. En employant des marqueurs fluorescents nous pouvons realiser de la Microscopie de Forces de Traction et surveiller la contrainte appliquee par les piliers aux cellules a travers la surface de PDMS, et nous pouvons etudier la reponse mecanique des cellules. De plus, ces substrats sont compatibles avec la microscopie de fluorescence en cellule vivante, ce qui rend possible l’observation de la reponse cellulaire au niveau morphologique (forme des adhesions focales, activite protrusive, …) et surtout biochimique.En effet, pour etudier la reponse biochimique des cellules apres une stimulation mecanique, nous observons par microscopie de fluorescence des biosenseurs portant des paires de fluorophores donneur/accepteur. Ces biosenseurs nous permettent d’observer l’activite de proteines impliquees dans la signalisation cellulaire en calculant l’efficacite de Transfert d’Energie Resonnant de Forster (FRET) de ces biosenseurs. Pour ce faire, les echantillons sont illumines alternativement aux longueurs d’ondes d’excitation des fluorophores donneurs puis accepteurs. Le signal de fluorescence est collecte simultanement dans un canal d’emission du donneur et un canal d’emission de l’accepteur. Une grande partie de ma these a ete consacree a la mise au point d’une methode quantitative pour analyser les images de fluorescence afin de mesurer une efficacite de FRET qui ne depende pas de facteurs experimentaux ni de la quantite de biosenseurs presents dans les cellules. Nous evaluons alors les differentes methodes pour determiner les facteurs de correction repandus corrigeant le debordement de spectre du donneur dans le canal accepteur et l’excitation directe de l’accepteur a la longueur d’onde d’excitation du donneur. Pour obtenir des mesures plus quantitatives, nous avons mis au point une nouvelles methode pour determiner 2 facteurs de correction supplementaires. Nous comparons cette methode a la seule preexistante et evaluons l’influence des parametres de traitement des images sur les valeurs d’efficacite de FRET mesurees.