Mechanistic insights into the role of secondary mutations of HIV-1 reverse transcriptase in the acquisition of antiretroviral drug resistance

Summary The human immunodeficiency virus (HIV) is the causative agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Highly active antiretroviral therapy (HAART) has resulted in substantial improvements of the health of HIV-infected patients. However, the emergence of drug-resistant viral strains is still one of the major factors hampering effective response to antiretroviral therapy. HIV type 1 (HIV-1) reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme with RNA- and DNA-dependent DNA polymerase and RNase H activities. Due to its essential role in virus replication, RT is a key drug target. Thymidine analogue resistance mutations (TAMs) are frequently found in patients treated with nucleoside RT inhibitors (NRTIs). TAMs can be classified in two groups: TAM-1 (composed of mutations M41L, L210W and T215Y) and TAM-2 (including mutations D67N, K70R, K219E or Q and sometimes T215F). Combinations of those mutations confer different levels of resistance to almost all NRTIs currently used in the treatment of HIV-1 infection, although the largest effects are observed with zidovudine (AZT), stavudine (d4T) and tenofovir. Prolonged exposure to those drugs has led to emergence of resistant HIV-1 strains containing TAMs plus accessory mutations that facilitate their selection in vivo. In this Thesis project we have determined the molecular mechanisms that facilitate the selection of mutations associated with TAMs during treatment with antiretroviral drugs. Thus, in the presence of TAMs, H208Y improves rescue efficiency of primers terminated with NRTIs, particularly with AZT, by increasing the ATP-dependent excision activity of the RT. These results are consistent with molecular dynamics simulations that predict that Tyr-208 influences the conformation of Trp-212 and this effect results in altered stacking interactions between Tyr-215 and the adenine ring of ATP. Mutations in the RT thumb subdomain influence NRTI resistance of TAM-containing enzymes through different mechanisms. While polymorphisms Pro-272/Arg-277/Thr-286 increase the affinity of the RT for RNA/DNA complexes, the amino acid substitution R284K improves the ability of the RT to incorporate nucleotides and therefore to extend growing DNA primers. The RT thumb subdomain plays an important role in the interaction with the nucleic acid substrate, and amino acid substitutions associated with TAMs and studied in this work could be affecting the proper positioning of the template/primer complex. Recent studies have shown that RT connection subdomain mutations could influence resistance to non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). Studies carried out during this Thesis project demonstrate that the combination of the connection subdomain mutations N348I/T369I impairs the RNase H activity of the RT. Interestingly, these effects are particularly relevant for the release of the polypurine tract (PPT) that acts as a primer in reverse transcription during (+) strand DNA synthesis. In the presence of NNRTIs, the PPT becomes susceptible to cleavage by the RNase H activity of the wild-type RT, although the double-mutant N348I/T369I RT is unable to cleave the PPT primer, thereby protecting it from unwanted degradation. These results predict that in the presence of NNRTIs, fitness differences between virus carrying the wild-type enzyme and the double-mutant N348I/T369I should be reduced. Finally, we have also studied the interaction between the RT and HIV-1 integrase (IN) protein and its effects on the RT? s RNase H activity. Our results indicate that the viral IN facilitates the release of the PPT primer, without affecting the hydrolysis of heteropolymeric template/primer complexes. 1 Resumen El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La terapia antirretroviral de gran actividad (HAART) ha producido una mejora sustancial en la salud de los pacientes infectados por el VIH. No obstante, la aparicion de cepas resistentes del virus sigue siendo uno de los mayores inconvenientes que dificultan la adecuada respuesta a la terapia antirretroviral. La retrotranscriptasa (RT) del VIH de tipo 1 (VIH-1) es una enzima multifuncional con actividad ADN polimerasa dependiente de ARN y ADN y actividad RNasa H. Debido a que juega un papel fundamental durante la replicacion del virus, la RT es una diana terapeutica de gran importancia. Las mutaciones de resistencia a analogos a timidina (TAMs) aparecen frecuentemente en pacientes tratados con inhibidores de la RT analogos a nucleosido (NRTIs). Las TAMs se clasifican en dos grupos: TAM-1 (formado por las mutaciones M41L, L210W y T215Y) y TAM-2 (que engloba las mutaciones D67N, K70R, K219E o Q y en ocasiones T215F). Combinaciones de estas mutaciones confieren distintos niveles de resistencia a casi todos los NRTIs usados actualmente en el tratamiento de la infeccion por VIH-1, aunque los niveles de resistencia mas altos se han observado con zidovudina (AZT), estavudina (d4T) y tenofovir. La exposicion prolongada a estos farmacos ha provocado la aparicion de cepas resistentes del virus portadoras de TAMs junto con mutaciones accesorias que facilitan su seleccion in vivo. En este proyecto de Tesis hemos determinado los mecanismos moleculares que facilitan la seleccion de mutaciones asociadas a TAMs durante el tratamiento con farmacos antirretrovirales. De esta manera, en presencia de TAMs, H208Y mejora la eficacia de rescate de iniciadores terminados con NRTIs, en especial con AZT, aumentando la actividad de escision dependiente de ATP de la RT. Estos resultados son apoyados por simulaciones de dinamica molecular, las cuales predicen que la Tyr-208 afecta a la conformacion del Trp-212 y como resultado de ello se produce una alteracion en las interacciones de apilamiento entre la Tyr-215 y el anillo de adenina del ATP. Las mutaciones en el subdominio ? thumb? de la RT afectan a la resistencia de RTs portadoras de TAMs mediante distintos mecanismos. Mientras que los polimorfismos Pro-272/Arg-277/Thr-286 aumentan la afinidad de la RT por complejos ARN/ADN, el cambio de aminoacido R284K mejora la capacidad de la RT para incorporar nucleotidos y por tanto para extender cadenas de ADN. El subdominio ? thumb? de la RT juega un importante papel en la interaccion con el acido nucleico y las sustituciones de aminoacido asociadas con TAMs y que se estudian en este trabajo podrian estar afectando al posicionamiento correcto del complejo molde/iniciador. Estudios recientes han puesto de manifiesto que mutaciones del subdominio ? connection? de la RT podrian afectar a la resistencia de la RT a inhibidores no analogos a nucleosido (NNRTIs). Los estudios desarrollados durante este proyecto de Tesis demuestran que la combinacion de mutaciones del subdominio ? connection? N348I/T369I disminuye la actividad RNasa H de la RT. Estos efectos son especialmente relevantes durante la eliminacion de la secuencia de purinas (PPT) que actua como iniciadora durante la sintesis de la cadena de ADN de polaridad positiva en el proceso de retrotranscripcion. En presencia de NNRTIs, el PPT es susceptible al corte por la RNasa H de la RT de genotipo silvestre, mientras que la RT N348I/T369I es incapaz de cortar el iniciador PPT, protegiendolo asi de una degradacion no deseada. Estos resultados predicen que en presencia de NNRTIs las diferencias de capacidad replicativa entre los virus portadores de las enzimas de genotipo silvestre y del mutante N348I/T369I deberian ser menores que las observadas en ausencia de farmacos. Por ultimo, tambien hemos estudiado la interaccion entre la RT y la integrasa (IN) del VIH-1 y su efecto sobre la actividad RNasa H de la RT. Nuestros resultados indican que la IN facilita la liberacion del iniciador PPT, sin afectar a la hidrolisis de complejos molde/iniciador heteropolimericos. 3 Las palabras claves de busqueda son las que siguen: HIV-1 (VIH-1), reverse transcriptase (transcriptasa inversa), integrase (integrasa), resistance (resistencia), nucleoside analogues (analogos a nucleosido), non-nucleoside analogues (no analogos a nucleosido), excision (escision) y thymidine analogue resistance mutations (mutaciones de resistencia a analogos de timidina).