Développement d’un couplage de chromatographie en phase supercritique et spectrométrie de masse pour l’analyse de substances naturelles

L’objectif de ce projet doctoral a ete de coupler la chromatographie en phase supercritique (SFC) avec un spectrometre de masse haute resolution pour l’analyse de substances naturelles apolaires. La SFC est une technique dite « verte » contrairement a la chromatographie liquide en phase normale (NPLC), tres consommatrice de solvants organiques toxiques pour l’environnement, puisque la phase mobile est principalement constituee de CO2. Le CO2 ayant une faible viscosite, cela implique une diffusivite, des debits eleves et des temps d’analyse courts. Notre attention a ete focalisee sur des molecules apolaires : les lipides. Le but etait de mettre au point des dosages dans des matrices alimentaires et biologiques et de debuter une approche lipidomique d’etude de la maladie de Parkinson. La premiere partie a ete dediee au developpement du systeme SFC avec une detection UV, prete par le constructeur Agilent Technologies. La premiere etude s’est portee sur 6 composes de la famille des vitamines A. Une phase d’optimisation a ete realisee afin d’obtenir une separation satisfaisante des composes, en testant differents parametres chromatographiques comme le type de phase stationnaire ou encore la composition de la phase mobile, afin d’obtenir une resolution optimale. Ensuite, des etudes de linearite et de repetabilite ont ete realisees et des limites de detection et de quantification ont ete determinees afin d’obtenir une methode fiable et robuste. Une deuxieme partie a concerne la mise en place du couplage entre la SFC et un spectrometre de masse de type quadripole-temps de vol (Q-TOF), afin d’ameliorer la specificite et la sensibilite des analyses. Differentes sources d’ionisation ont ete utilisees : ESI, APCI et APPI. Chacune des sources presente des modes d’ionisation differents, qui permettent de pouvoir balayer une large gamme de polarite des analytes. Nous avons choisi 8 derives de la vitamine E, composes apolaires pour lesquels la SFC parait etre la technique d’analyse ideale. La separation de ces composes a ete optimisee de facon a obtenir une bonne resolution chromatographique et un temps d’analyse minimal. L’ionisation des composes est realisee avec les 3 sources disponibles en faisant varier les parametres de sources ou encore le solvant « make-up », de facon a obtenir une sensibilite optimale. La source APPI a ete finalement choisie apres une etude sur les performances de la methode. Cette source presente une bonne repetabilite, linearite et des limites de detection de l’ordre de celles retrouvees dans la litterature par HPLC-MS. Nous avons ensuite realise la quantification des ces composes dans 2 types de matrices alimentaire et biologique : l’huile de soja et le plasma de rat. Une troisieme partie a ete debutee sur le profilage de lipides a polarites variees par SFC-MS. Cette technique se revele ideale de par la faible polarite de ces composes et leur absence d’absorbance dans le domaine UV. En effet, l’integrite des lipides peut etre alteree suite aux dommages causes par les radicaux libres, qui sont potentiellement impliques dans de nombreuses maladies neurodegeneratives. Il parait primordial de developper des outils analytiques presentant une haute sensibilite et resolution et la possibilite d’acceder aux informations structurales. La source d’ionisation ESI nous a permis de detecter 12 lipides sur les 20 sous-classes analysees en mode positif et 8 lipides en mode negatif. Une application a ete realisee sur un echantillon de plasma humain. Il serait interessant a l’avenir d’effectuer cette etude en utilisant la source APPI, source propice a l’analyse structurale de lipides et presentant une bonne sensibilite et repetabilite. Ce couplage SFC-MS, presentant une bonne sensibilite et repetabilite, sera par la suite etendu a l’analyse de lipides dans diverses matrices biologiques et pourra a l’avenir etre applique a l’etude de nouveaux biomarqueurs et au screening rapide d’un grand nombre d’echantillons