Viral load estimation in asymptomatic honey bee colonies using the quantitative RT-PCR technique

Honey bee (Apis mellifera L.) colonies are subjected to many persistent viral infections that do not exhibit clinical signs. The identification of criteria that could identify persistent or latent infections in bee colonies is a challenging task for field investigators and beekeepers. With this aim in view, we developed a molecular method to estimate the viral loads for six different RNA viruses in bee and mite individuals collected from seemingly healthy colonies (360 colonies). The data showed very large viral titres in some samples (> 109 copies per bee or mite). Discrepancies between adults and pupae viral RNA loads and, in several instances, significant seasonal variations among viruses were observed. The high titres of some RNA viruses recorded in mites confirm that Varroa destructor could promote viral infections in colonies.ZusammenfassungBei den am häufigsten bei Honigbienen diagnostizierten Viren handelt es sich um 30 nm grosse positive RNA-Partikel, die als Picorna-ähnliche Viren bezeichnet werden. In diese Klasse gehören das Sackbrutvirus (SBV), das Verkrüppelte-Flügelvirus (DWV), das Kaschmir-Bienenvirus (KBV), das Akute-Bienenparalysevirus (ABPV), das Schwarze-Königinnenzellenvirus (BQCV) und das Chronische-Bienenparalysevirus (CBPV). Die Genomsequenzen dieser Viren sind jetzt in DNA-Bibliotheken verfügbar, die die Entwicklung auf PCR beruhender molekularer Diagnoseprotokolle erleichtern. In einer früheren Arbeit berichteten wir die Ergebnisse einer Jahresübersichtsstudie zur Prävalenz und zu jahreszeitlichen Schwankungen der Konzentrationen dieser Viren in augenscheinlich gesunden Bienenständen in Frankreich (Tentcheva et al., 2004). Diese Ergebnisse zeigten klar, dass viele persistente Virusinfektionen in Bienenvölkern etabliert sein können (92 % der Bienenstände waren positiv für mindestens drei verschiedene Viren), ohne dass klinische Symptome zu sehen sind. Der weltweite intensive Austausch von Völkern und Bienenmaterial und die durch die ektoparasitische Milbe Varroa destructor, einem wichtigen Vektor und Aktivator verschiedener Bienenviren, hervorgerufenen Epizootien sind vermutlich für das verstärkte Auftreten dieser Viren verantwortlich.Die Ermittlung von Kriterien, die dazu beitragen können, persistente oder latente Infektionen in Bienenvölkern zu erkennen, stellen deshalb eine Herausforderung für die Feldforschung und für Imker dar. Um einen Einblick in den Gesundheitszustand von Bienenvölkern, sowohl für Einzelvölker als auch Bienenstände zu erhalten, entwickelten wir ein Protokoll, das eine zuverlässige Quantifizierung von sechs RNA-Viren ermöglicht. Diese quantitative PCR Methode kann dazu beitragen, die Viruskonzentrationen in Bienenvölkern mit bestimmten Pathologien zu korrelieren und kritische Schwellenwerte für die Haltung von Völkern festzulegen.In der vorliegenden Arbeit stellen wir die Ergebnisse einer statistischen Untersuchung zur Verteilung der Viruskonzentrationen in Proben von Bienen und Milben (V. destructor) aus 360 augenscheinlich gesunden Völkern vor. Die Analyse der Proben von adulten Bienen wies zwei Populationen in Bezug auf Viruskonzentrationen auf. Die erste betraf Proben, die einen mittleren Befall mit AB-PV und BQCV in Konzentrationen von 1,52 × 108 RNA-Kopie-Äquivalenten pro Biene aufwiesen. Die zweite umfasste Proben, die mit DWV, KBV, SBV und CBPV infiziert waren und Viruskonzentrationen von 2,14 × 109 RNA-Kopie-Äquivalenten pro Biene aufwiesen.Die höchsten Virus-RNA-Konzentrationen fanden wir in den für DWV positiven Proben, die, im Gegensatz zu SBV positiven Proben, für Puppen höhere Werte aufwiesen als für adulte Bienen. Bei den DWV-Titern konnten wir einen Anstieg zum Jahresende hin feststellen, während die BQCV- und SBV-Konzentationen zum Herbst hin abnahmen. In Milben waren die DWV-Konzentrationen signifikant höher als die für ABPV und SBV, was darauf hinweist, dass das DWV sich vermutlich in Milben repliziert und dass Varroa der Verbreitung dieses Virus in Völkern förderlich sein kann. Zusammenfassend zeigen unsere Daten dass (i) Bienenviren sich in ihrer Biologie stark unterscheiden, dass (ii) Bienenvölker relativ hohe Viruskonzentrationen tolerieren können, ohne dass sie klinische Symptome zeigen, und dass (iii) das Konzept der Bienenpathologie in seinen Untersuchungsansätzen trennen muss zwischen einzelner Biene und Bienenvolk.