Molecular characterization of the light response in Alternaria alternata

Licht ist ein wichtiger Umweltfaktoren, der die Entwicklungsprozesse und metabolischen Prozesse von fast allen Organismen der Erde beeinflust. Filamentose Pilze konnen Licht mittels verschiedener Photorezeptoren wahrnehmen. Der schwarze Sporen-produzierende Pilz Alternaria alternata ist ein weit verbreitetes pra/post-Ernte Pflanzenpathogen, der in der Lage ist mehr als 70 Sekundarmetabolite zu produzieren. A. alternata kann auch selten als Humanpathogen Allergien verursachen. Viele Prozesse in A. alternata werden durch Licht gesteuert. Rotlicht stimuliert die Sporenproduktion, aber kontinuierliche Beleuchtung mit Blauchlicht inhibiert die Sporenproduktion komplett. Interessanterweise kann der inhibierende Effekt von Blaulicht durch Rotlicht aufgehoben werden, was eine Verknupfung zwischen den Lichtsensorsystemen suggeriert. Das A. alternata Genom kodiert ein Phytochrom (FphA), ein WC-1 Ortholog (LreA), ein Opsin (NopA) und ein Cryptochrom (CryA) als putative Photorezeptoren. Neben dem White Collar-1 Ortholog LreA, das schon zum Teil untersucht wurde, waren weitere Funktionsanalysen der Gene durch Schwierigkeiten bei der Konstruktion von homologen knock-out Stammen limitiert. Jedoch wurde die CRISPR/Cas9 Technologie in A. alternata etabliert, die schnelle und prazise Veranderung von Gensequenzen und somit Studien von Genfunktion und –regulation zulasst. Mit der Verwendung dieser Technologie, haben wir die Rolle von FphA und LreA sowie das Zusammenspiel mit dem high-osmolarity glycerol (HOG) mitogen-activated protein (MAP) Kinase Signalweg durch loss-of-function Mutationen fur fphA, lreA, and hogA untersucht. Die Deletion von fphA, lreA and hogA fuhrte zu einer Reduktion der Sporulation im Dunkeln, was eine aktivierende Funktion der Photorezeptoren (FphA und LreA) und HogA suggeriert. Die Entwicklung von Konidiophoren benotigt eine transkriptionelle Kaskade, die aus brlA, abaA und wetA besteht. Nach 60 min Beleuchtung mit Weislicht wurde die Expression von abaA und wetA in fphA und lreA Mutanten aufgehoben, wodurch die wichtige Rolle von Photorezeptoren in der Sporulation und asexuellen Entwicklung bestatigt wurde. Ein BrlA Ortholog wurde nicht gefunden. Die Auskeimung von Konidien war in Rot-, Blau-, Grun- und Dunkelrotlicht verzogert. Die Deletion von Phytochrom, aber nicht von lreA, hob die Repression unter allen Bedingungen auf, was die hemmende Funktion von FphA und die Prasenz zusatzlicher Blaulicht Rezeptoren bestatigt. Weitergehend wurde die Auswirkung von Licht und die Rolle von FphA, LreA und HogA auf die Sekundarmetabolitbildung untersucht. Die Alternariolproduktion war sowohl im Licht als auch im Dunkeln strikt von hogA abhangig. Stattdessen wurde die Bildung einer gelben Substanz stimuliert. Die Blau- und Grunlicht Stimulation der Alternariolproduktion war nur von LreA abhangig und nicht von FphA. Die Resistenz gegenuber oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid und Mennadion war in dem fphA und lreA-Deletionsstamm, aber nicht im hogA Deletionsstamm erhoht. Die erhohte Resistenz war unabhangig von den Lichtbedingungen und kann durch eine Induktion von Katalasen und Superoxiddismutasen erklart werden. Zur weiteren molekularen Analyse wurde die Induktion von ccgA (clock-controlled gene in Neurospora crassa and light-induced in Aspergillus nidulans) untersucht. Das Gen wird auch in A. alternata durch Licht induziert. Die Induktion war strikt von LreA und nur leicht von FphA abhanig. Fur die weitergehende Charakterisierung der Rollen von fphA, lreA, and hogA, wurde die Regulation weiterer putativer lichtregulierter Gene untersucht. Die Expression des Katalase Gens catA and des short-chain dehydrogenases/reductases Gens (AAT_PT02522) ist von FphA, LreA and HogA abhangig. Die Lichtinduktion von ferA (ein putatives Ferrochelatasegen) and bliC (bli-3, light regulated, unbekannte Funktion) benotigen LreA und HogA, aber nicht FphA. Da vorherige Untersuchungen in A. nidulans, N. crassa and Trichoderma viridae eine Interaktion zwischen den Rot und Blaulicht Photorezeptoren mit der HOG-MAP-Kinase Kaskade suggerieren, wurde die Expression von Genen, die durch osmotischen Stress induziert werden, in den drei Mutanten untersucht. Die Transkriptmenge von hogA, atfA und ccgA war in fphA, lreA und hogA Mutanten reduziert. Wahrend die Expression von bliC von lreA und hogA abhangig war, wies der fphA Deletionsstamm eine vergleichbare Expression zum Wildtyp auf. Desweiteren wurde die Phosphorylierung von HogA unter verschiedenen Lichtbedingungen durch Immunostaining untersucht. Nach Beleuchtung mit Rot und Blaulicht wurde Fluoreszenz im Zytoplasma und angereichert im Zellkern detektiert. Die Stimulation des Signals wurde nicht im fphA oder LreA Mutantenstamm beobachtet, wodurch die Aktivierung des Hog Signalweges durch FphA und LreA suggeriert wird. Der Verlust von fphA verstarkte die Pathogenitat auf Tomaten, wahrend lreA und hogA Deletionsstamme eine abgeschwachte Virulenz im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. Zudem fanden wir, dass fphA eine Rolle in der Temperaturwahrnehmung spielt.