Wirkung immunstimulatorischer Gentherapie auf das hepatozelluläre Karzinom in der Ratte

Der Tumortherapie mit immunstimulatorischen Zytokinen liegt die Erkenntnis zugrunde, dass Tumorzellen der Erkennung durch die korpereigene Abwehr entgehen und auf diese Weise ungehindert wachsen konnen. Durch den Einsatz geeigneter Zytokine und Kostimulatoren lasst sich eine Erkennung der Tumorzellen durch das Immunsystem erreichen, was im gunstigsten Fall zu einer vollstandigen Regression des Tumors und samtlicher Metastasen fuhrt. Da die systemische Applikation von Zytokinen in zahlreichen Fallen von schweren toxischen Nebenwirkungen gefolgt war, gilt es, die verwendeten Zytokine und Kostimulatoren moglichst lokal einzusetzen, was sich im Falle des hepatozellularen Karzinoms gut mittels adenoviraler Vektoren verwirklichen lasst. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung immunstimulatorischer Gentherapie auf das hepatozellulare Karzinom (HCC) am Rattenmodell untersucht. Hierzu wurden den Ratten mittels Inokulation von MH-7777A-Zellen je zwei Tumoren in die Leber implantiert. Direkt in die Tumoren wurden zwei Wochen spater die Therapeutika (Ad-1, Ad-2 oder Ad-3) bzw. die Kontrollen (Ad-0 oder PBS) appliziert. Die Tumorgrose aller Tiere wurde wahrend des Beobachtungszeitraumes von sechs Wochen im MRT verfolgt. Um den Einfluss der Behandlung auf die Leber abschatzen zu konnen, wurden Veranderung der Serumaktivitat von GOT und GPT anhand von Blutproben ermittelt, die direkt vor und vier Wochen nach Virusapplikation gewonnen wurden. Nach Ablauf des Behandlungszeitpunktes wurden Leber- und Tumorproben fur die histologischen Untersuchungen entnommen; ebenso wurde ein Protokoll entwickelt, dass die Gewinnung von Lebendzellen fur durchfluszytometrische Analysen aus diesen Geweben gestattet. In der Untersuchung wurde deutlich, dass die eingesetzten Vektoren – insbesondere Ad1 (IL-12 exprimierend) und Ad3 (IL-12, IL-2 und 4-1BBL exprimierend) – eine deutliche Reduktion des Tumorvolumens bis hin zu einer vollstandigen Remission bewirken konnen. Die Veranderung des Tumorvolumens korreliert weitestgehend mit der Hohe der Serumaktivitaten der Leberenzyme GOT und GPT, die zunachst mit steigender Tumorgrose deutlich ansteigen, bei einsetzendem Behandlungserfolg jedoch wieder sinken. Das Gewicht im Gegensatz dazu sinkt zunachst mit steigendem Tumorvolumen, nimmt aber bei Tieren mit sinkender Tumorlast schlieslich wieder zu. Histologisch findet sich vier Wochen nach der Behandlung bei den Tieren der beiden Kontrollgruppen (PBS und Ad0) wie auch bei den mit Ad2 behandelten Tieren kaum eine Infiltration mit Immunzellen. Im Gegensatz dazu weisen die Ad1- und die Ad3-behandelten Tiere eine Infiltration mit CD4+-, CD8+- und NK-Zellen auf. Die Anfarbung auf Makrophagen wie auch auf aktivierte CD4+-, CD8+-, NK- und B-Zellen sowie Monozyten (CD80+) zeigte bei den Ad1-, Ad-2- und Ad-3-Tieren regelmasig eine Aussparung der Gewebsinfiltration der Zentralvene mit diesen Zellen; beide Kontrollgruppen wiesen eine bedeutend geringere Zahl dieser Zellen auf. Eine klare Unterscheidung der Wirksamkeit der drei Vektoren Ad1, Ad2 und Ad3 ist in dieser Studie nicht moglich, wenngleich es in diesem Fall scheint, als sei Ad2 deutlich weniger wirksam als Ad3 aber auch als Ad1. Tumor gene therapy with immunostimulatory cytokines is based on the idea that tumor cells escape the immunosystem and therefore can grow uninhibited. Using suitable cytokines it is possible to foster the immunosystem’s ability to recognize tumor cells again which can even lead to complete regression of the tumor itself and all its metastases. As systemic application of cytokines in several cases has been accompanied by severe toxic side effects it seems sensible to apply cytokines as locally as possible. In the case of hepatocellular carcinoma this can well be done by using adenoviral vectors. In this study the effect of immunostimulatory gene therapy on hepatocellular carcinoma in the rat was investigated. Two tumors consisting of MH-7777A cells were injected into the liver - one into the left, one into the right lobe. After two weeks the adenoviral vectors (Ad-1, Ad-2, Ad-3) and the control solutions (Ad-0 or PBS) were injected directly into the tumor. Tumorsize and progression was monitored using MRI. To be able to estimate the influence of treatment on the liver over the course of investigation serum activities for the liver enzymes ASAT and ALAT were checked with blood samples being taken before and four weeks after vector inoculation. After treatment liver and tumor samples were taken for histology. Furthermore, a new protocol was established to disaggregate the resected tumors and livers into single-cell suspensions, so they could be used in FACS analysis. The study showed that the adenoviral vectors – Ad1 (coding for IL-12) and Ad-3 (coding for IL-12, IL-2 and 4-1BBL) in particular – are able to induce a sufficient anti-tumor response resulting in partial regression up to complete regression of the tumor. The tumor’s change in size shows a strong correlation with ASAT- and ALAT-levels, as they steadily rose with growing tumor size and than decreased with reduction in tumor size, whereas they continued to rise in those animals showing tumor progression. The body weight of the animals changed likewise. In histology, tissues from PBS-, Ad-0 and Ad-2-treated animals showed hardly any infiltration with CD4+-, CD8+- and NK-cells. Ad-1- and Ad-3-treated animals on the contrary showed an infiltration with CD4+-, CD8+- and NK-cells. Staining for macrophages, activated CD4+-, CD8+-, NK- and B-cells and monocytes (CD80+) showed infiltration in Ad-1-, Ad2-, and Ad3-treated animals. Both control groups showed only few of these cells. As to the effectiveness, a clear differentiation between the Ad1-, Ad2- and Ad3-vectors is not possible in this study, even though the Ad2-vector seems to be less efficient than Ad1 and Ad3.