Detección rápida de Mycobacterium tuberculosis complex y de la resistencia a los fármacos antituberculosos mediante métodos de amplificación genética e hibridación

El diagnostico de la tuberculosis (TB) se basa en gran medida en metodos microbiologicos convencionales: a) un cribado mediante microscopia de bacilos acido-alcohol resistentes que permite de forma rapida, sencilla y economica una primera orientacion hacia el diagnostico de TB en caso de que la baciloscopia sea positiva; y b) el cultivo de las muestras clinicas en medios especificos para micobacterias. El cultivo micobacteriano es el metodo considerado gold standard en el diagnostico microbiologico de la TB, y ademas, permite obtener el aislamiento clinico con el que posteriormente se puede estudiar la sensibilidad a los farmacos antituberculosos o realizar analisis epidemiologicos. Sin embargo, estos metodos fenotipicos convencionales son insuficientes para un control eficaz de la tuberculosis, debido sobre todo a la baja sensibilidad de la microscopia y a la lentitud del cultivo micobacteriano. En este sentido se han desarrollado tecnicas basadas en la amplificacion genomica por PCR (polymerase chain reaction) y posterior estudio post-amplificacion, fundamentalmente mediante hibridacion en fase liquida o solida, con sondas complementarias a los genes de interes, tanto para la deteccion del microorganismo como de su resistencia a los farmacos. En esta tesis se trata de evaluar, en un primer bloque, dos de los sistemas comerciales mas recientes para el diagnostico rapido de la TB. Uno de ellos es el sistema integrado de PCR a tiempo real, Xpert MTB/RIF (Cepheid, EEUU). Asi se propuso determinar la eficacia de este sistema en casos de alta sospecha de tuberculosis y baciloscopia negativa, en nuestra area. En terminos de sensibilidad se detecto un 78,2% de los casos de tuberculosis pulmonar y un 58,3% en los casos de tuberculosis extrapulmonar. Ademas, se determino, en un estudio de rentabilidad potencial del uso en rutina de esta tecnica, que el uso del Xpert MTB/RIF puede adelantar en una media de una semana el inicio del tratamiento antituberculoso, ademas de ahorrar recursos economicos en el diagnostico (hasta 2000 euros). Por otro lado, la evaluacion el sistema GenoQuick MTB (Hain LIfescience, Alemania) de PCR convencional y posterior hibridacion rapida en fase solida (lateral-flow dipstick), mostro a esta tecnica como una alternativa a la previamente descrita al comprobarse que la sensibilidad obtenida en muestras con baciloscopia negativa fue de 78,1%, con una discreta mayor complejidad tecnica pero tambien con un menor coste economico. Estos sistemas de PCR e hibridacion se revelan como metodos muy utiles para la deteccion directa en muestra clinica de M. tuberculosis complex. Otro aspecto muy relevante, sobre el que tambien se ha investigado en los ultimos anos, es el de la deteccion de mutaciones geneticas implicadas en la resistencia a los principales farmacos antituberculosos. De esta forma se planteo, en un segundo bloque de la tesis, el diseno y desarrollo de un sistema propio de microarrays (sistemas miniaturizados de amplificacion e hibridacion con oligonucleotidos fijados en una matriz organica) para la deteccion rapida de la resistencia de algunos de los farmacos antituberculosos mas importantes. Tras caracterizar las mutaciones presentes en los aislamientos resistentes de nuestra area y basandose tambien en las mutaciones mas frecuentemente descritas en la literatura, se disenaron dos microarrays de baja densidad y bajo coste, 1) para la deteccion de mutaciones relacionadas con la resistencia a la estreptomicina y las fluoroquinolonas (obteniendose una sensibilidad del 92,5% y el 87,5%, respectivamente; y 2) al etambutol (con una sensibilidad y especificidad del 100%). Este sistema de microarrays se plantea como una buena alternativa a los sistemas comercialmente disponibles, al tener un coste economico menor y ofrecer la flexibilidad de anadir mas o diferentes dianas de resistencia, en funcion del perfil de mutaciones de cada area geografica.