Estudi de la regulació transcripcional del gen de CD69

CD69 es una lectina tipus C amb orientacio tipus II, que participa en la migracio de limfocits i la secrecio de citocines. CD69 s'expressa a la gran majoria de leucocits durant processos infecciosos, autoimmunitaris i neoplasics, i s'utilitza ampliament com a marcador de l'activacio del sistema immunitari. El seu targeting amb anticossos monoclonals ha resultat util en el tractament de malalties en diferents models animals i, per tant, per esbrinar quins son els mecanismes que controlen la seva expressio a la superficie cel•lular es molt important. L’expressio de CD69 es induible i esta fortament controlada a nivell transcripcional. Despres de processos d’activacio, els transcrits de CD69 es detecten als 30-60 minuts i la proteina a les 4-6 hores. La present tesi ha estudiat quins son els elements genetics necessaris per a una correcta expressio temporal i espaial de CD69 in vivo. L’analisi de la sequencia de l’ADN en una regio 45Kb per sobre del gen va rebel•lar una conservacio evolutiva del promotor i de quatre sequencies no codificants que van ser anomenats CNS1, CNS2, CNS3 i CNS4 (CNS, Conserved Non coding Sequence). Mitjancant experiments de digestio amb DNasa i d’immunoprecipitacio de la cromatina, es va veure que aquests CNS eren regions obertes de cromatina amb modificacions epigenetiques especifiques. A mes, en assajos de luciferasa en cel•lules T, es va veure que els elements CNS2 i CNS4 mostraven una activitat enhancer constitutiva i induible. La generacio de ratolins transgenics amb el reporter hCD2 va permetre analitzar la seva funcio in vivo. El promotor conferia una expressio regulada durant la seleccio positiva dels timocits, pero no podia donar suport a una expressio regulada en limfocits madurs. La inclusio de CNS1 i CNS2 va causar la supressio de l'expressio del reporter i l'addicio de CNS3 i CNS4 va donar lloc a una expressio regulada a les cel•lules T, pero no a les cel•lules B. Vam concloure que CNS1-4 son elements reguladors importants que interactuen tant positivament com negativament amb el promotor de CD69 i que contribueixen de manera diferent a l'expressio CD69 a les cel•lules T i B. D’altra banda, l’analisi in silico de regions intrageniques del gen de CD69 va revel.lar una estructura de la cromatina especifica entre les sequencies codificants I i II (Intro I) que estava associada a nucleosomes posicionats. A mes, en aquesta regio del locus CD69 huma es va identificar un lloc nou d’hipersensibilitat que era induible per estimulacio. Una analisi en el locus muri va rebel•lar una regio similar d’hipersensibilitat que sembla implicar almenys les primeres 2Kb de l'Intro I. Pel que fa a l’estructura de la cromatina, en timocits negatius per CD69, aquesta regio intronica mostrava nivells baixos i intermedis de l'acetilacio i dimetilacio de la lisina 4 i de la histona H3 respectivament. L’expressio de CD69 en aquest mateix tipus cel•lular durant la seleccio positiva es va associar amb una induccio clara de l'acetilacio de la histona H3 a l’Intro I. Curiosament, els limfocits T periferics presentaven alts nivells d'aquestes marques de forma independent a l’expressio CD69. Per tant, l'Intro I pot jugar un paper crucial en el control de l'expressio del gen de CD69. Amb aquesta tesi hem observat que l'epigenetica i els elements distals d’ADN son importants la regulacio de l’expressio de CD69, s'han ampliat considerablement els coneixements sobre els possibles mecanismes, que fins ara s'havia focalitzat nomes en el promotor, i proposa una nova base per a futurs estudis.