Enzymatic lignocellulosic feedstock degradation and lactic acid production by Bacillus coagulans

I Abstract For an operator of a lignocellulosic biorefinery plant, simple and fast methods are needed to reproducibly define and optimise processes. For the development of enzymes, methods are required which allow for the assessment of the effectiveness of cellulase as close to the process as possible, and which guarantee quick and easy technology transfers to the industry. Currently, quality parameters and methods to rapidly implement technology transfers into lignocellulosic biorefinery processes are lacking. The first part of this work develops a method that characterizes the effectiveness and efficiency of cellulases using process-related parameters. Results of hydrolyses with the model substrate wheat straw show that, in the investigated case, the particle size distribution has a greater impact on the effectiveness of the hydrolysis than the amount of enzyme used. Using this information, a kinetic parameter was defined, which allows for the description of the effectiveness of cellulase on the substrate lignocellulose. Then, this kinetic approach is used to define an empirical-mathematical model equation. Along with the known Sauter diameter and carbohydrate composition of the substrate, as well as the amount of enzyme used, this allows one to determine the time course of hydrolysis and the expected yield. For natural scientists and operators of lignocellulosic biorefineries for biotechnological production of chemicals, certainty about the effectiveness of the microorganisms that can be used for production is desired. Which organism already covers a broad spectrum of usable sugars as wildtype, yields the best yield and quality with the highest possible resistance to inhibitors? In the second part of the thesis, fermentation processes of lignocellulose hydrolysates are considered. Isolates of Bacillus coagulans serve as model organisms. A high-throughput optical screening method has been developed to study how the microorganisms utilise lignocellulose-based sugars. Starting from this method, a mathematical approach was defined, and an additional quality parameter introduced. This parameter can be used to determine the uppermost level of lignin concentration that still allows for growth of the microorganism. Fermentations with defined media and lignocellulose hydrolysates confirmed the behaviour of the Bacillus coagulans isolates in the fermentation of different lignocellulose-based sugars and lignin concentrations. Based on the fermentation data, growth models for process characterisation and prediction were defined. Measurements showed that there was a potential decrease in dissolved lignin in the medium during fermentation. Tests have shown that the isolates of Bacillus coagulans used are capable of potentially reducing the concentration of dissolved lignin, vanillin, and ferulic acid in the medium. Robert Glaser Enzymatic Lignocellulosic Feedstock Degradation and Lactic Acid Production by Bacillus coagulans II Zusammenfassung Zusammenfassung Lignozellulose-Bioraffinerien benötigen robuste Methoden zur Prozessführung und Charakterisierung. Für den Betrieb und die Optimierung solcher Anlagen sind einfache, schnelle Methoden notwendig. Methoden für den enzymbasierten Aufschluss der Lignozellulose sollten die Einschätzung der Effektivität von Enzymen wie Zellulasen/Hemizellulasen bereits während der Prozessentwicklung möglichst prozessnah erlauben und einen Technologietransfer in die Industrie einfach und schnell gewährleisten. Derzeit fehlen Qualitätsparameter und Methoden, um den Technologietransfer in Prozesse einer Lignozellulose-Bioraffinerie schnell umzusetzen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt, die die Effektivität und Effizienz von Zellulasen anhand prozessnaher Parameter charakterisiert. Ergebnisse von Hydrolysen u.a. mit dem Modellsubstrat Weizenstroh zeigen, dass im untersuchten Fall die Partikelgrößenverteilung einen stärkeren Einfluss auf die Effektivität der Hydrolyse hat, als die eingesetzte Enzymmenge. Mittels dieser Information wird ein kinetischer Parameter definiert, der es erlaubt, die Effektivität von Zellulasen mit Lignozellulose als Substrat zu beschreiben. Weiterführend wird dieser kinetische Ansatz genutzt, um eine empirisch-mathematische Modellgleichung zu definieren. Diese erlaubt es, bei bekanntem Sauter–Durchmesser und Kohlenhydratzusammensetzung des Substrates, sowie der eingesetzten Enzymmenge, den zeitlichen Verlauf einer Hydrolyse und den zu erwartenden Ertrag zu bestimmen. Von Betreibern von Lignozellulose-Bioraffinerien zur biotechnologischen Erzeugung von Chemikalien werden sichere Informationen über die Effektivität der zur Produktion einsetzbaren Mikroorganismen benötigt. Welcher Organismus deckt bereits als Wildtyp ein breites Spektrum an verwertbaren Zuckern ab, bringt die beste Ausbeute und Qualität bei möglichst hoher Resistenz gegenüber Inhibitoren? Im zweiten Teil der Arbeit werden Fermentation-Prozesse von Lignozellulose-Hydrolysaten betrachtet. Als Modellorganismen dienen Isolate von Bacillus coagulans. Zur Charakterisierung der Mikroorganismen wird eine Methode für ein optisches Hochdurchsatzscreening entwickelt. Mit dieser kann untersucht werden ob die beschriebenen Mikroorganismen Lignozellulose-basierende Zucker verwerten. Ausgehend von dieser Methode wird ein mathematischer Ansatz definiert und ein zusätzlicher Qualitätsparameter eingeführt. Durch diesen Parameter kann bestimmt werden, bis zu welcher Lignin-Konzentration ein Wachstum der Mikroorganismen noch möglich ist. Fermentationen mit definierten Medien und Lignozellulose-Hydrolysaten bestätigten das Verhalten der B. coagulans Isolate bzgl. der Fermentation unterschiedlicher Lignozellulose basierender Zucker und Lignin-Konzentrationen. Anhand der Fermentationsdaten werden Wachstumsmodelle zur Prozesscharakterisierung und Prädiktion definiert. Die Messungen zeigen eine Abnahme des gelösten Lignins im Medium während der Fermentation. Die genutzten Bacillus coagulans Isolate scheinen in der Lage zu sein, die Mengen an gelöstem Lignin, Vanillin und Ferulasäure im Medium zu verringern. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass B. coagulans ein sicherer Stamm zur effektiven und effizienten Produktion von Milchsäure ist. Enzymatic Lignocellulosic Feedstock Degradation and Lactic Acid Production by Bacillus coagulans Robert Glaser List of