Caracterización y estudios metabolómicos de compuestos fenólicos bioactivos mediante técnicas separativas acopladas a espectrometría de masas

En esta memoria se reunen los resultados obtenidos durante la realizacion de la tesis doctoral titulada ? Caracterizacion y estudios metabolomicos de compuestos fenolicos bioactivos mediante tecnicas separativas acopladas a espectrometria de masas? , donde se evalua el potencial de Lippia citriodora y las hojas de Olea europaea como fuentes de compuestos fenolicos bioactivos para el desarrollo de nutraceuticos. La memoria se ha dividido en dos secciones: introduccion y parte experimental. En la introduccion se detallan, en primer lugar, las principales caracteristicas de los nutraceuticos y las diferencias que existen entre estos y los alimentos funcionales. A continuacion, se describen las dos fuentes vegetales bajo estudio, Lippia citriodora y Olea europaea, las propiedades de los compuestos fenolicos (estructura, clasificacion, efectos saludables, absorcion y metabolismo) y el papel que juega la metabolomica en el estudio de estos compuestos. Por ultimo, se describen las diferentes etapas del procedimiento analitico para la determinacion de compuestos fenolicos que se han empleado en la parte experimental: tratamiento de muestra (tanto para muestras vegetales como biologicas), separacion (CE, HPLC y nanoLC) y deteccion (absorcion UV-Vis, IT-MS, TOF-MS y QTOF-MS). La parte experimental se divide en dos bloques que a su vez constan de tres capitulos cada uno: el primero centrado en la caracterizacion de las fuentes vegetales de compuestos fenolicos bajo estudio, es decir, Lippia citriodora y hoja de olivo, y el segundo aborda estudios de absorcion y metabolismo de los compuestos fenolicos de dichas fuentes in vitro e in vivo mediante enfoques metabolomicos. El bloque I se ha centrado en la caracterizacion exhaustiva de los extractos de las dos fuentes de compuestos fenolicos bioactivos estudiadas, Lippia citriodora y las hojas de Olea europaea. En el capitulo 1, se emplea HPLC-DAD-ESI-TOF/IT-MS para estudiar la composicion del extracto de Lippia citriodora. El uso de una columna de pequeno tamano de particula proporciona gran resolucion, permitiendo la separacion de varios isomeros. La informacion complementaria proporcionada por los distintos detectores, familia del compuesto indicada por los maximos de absorcion, masas exactas y distribucion isotopica proporcionada por el analizador TOF-MS y el patron de fragmentacion obtenido con el analizador IT-MS/MS, permiten la identificacion tentativa de compuestos fenolicos en Lippia citriodora de los que no se dispone de patrones comerciales. Como continuacion de este estudio, en el capitulo 2 se optimiza un metodo de CE-ESI-IT/TOF-MS para completar la caracterizacion del extracto de Lippia citriodora. Los principales parametros electroforeticos asi como los de la transferencia al analizador de masas se estudian de forma pormenorizada hasta conseguir la maxima resolucion y sensibilidad. De esta forma, el metodo optimizado permite la identificacion de algunos compuestos que no se habian caracterizado mediante el metodo cromatografico descrito en el capitulo 1, demostrando la complementariedad de ambas tecnicas separativas. Para finalizar el bloque, el capitulo 3, realizado en colaboracion con el Instituto de Investigacion en Ciencias de la Alimentacion del Consejo Superior de Investigaciones Cientificas de Madrid, se centra en el estudio de la composicion mediante HPLC-ESI-QTOF-MS de dos extractos de hoja de olivo obtenidos mediante PLE utilizando etanol y agua como disolventes de extraccion. La elevada exactitud de masas y distribucion isotopica tanto de los espectros de masas como de masas/masas proporcionada por el analizador QTOF-MS permite la identificacion de un gran numero de compuestos fenolicos en ambos extractos, incluyendo secoiridoides, fenoles simples, flavonoides, derivados de acidos cinamicos y acidos benzoicos. En el bloque II, llevado a cabo en colaboracion con el Instituto de Biologia Molecular y Celular (IBMC) de la Universidad Miguel Hernandez, se estudia la absorcion y metabolismo in vitro o in vivo de los compuestos fenolicos de ambos extractos mediante enfoques metabolomicos. En el capitulo 4 se evaluan diversos procedimientos de tratamiento de muestra y extraccion para el analisis de compuestos fenolicos en plasma mediante nanoLC-ESI-TOF-MS, incluyendo precipitacion de proteinas en diferentes condiciones, digestion enzimatica y SPE utilizando diferentes fases solidas y valores de pH. El procedimiento desarrollado se aplica al analisis de muestras de plasma de rata tras la administracion del extracto de Lippia citriodora. En el capitulo 5, se estudia el efecto del extracto de Lippia citriodora sobre la actividad de las enzimas antioxidantes CAT, GPx y GRed en linfocitos, eritrocitos y neutrofilos, asi como la actividad de MPO en neutrofilos (marcador inflamatorio del dano vascular) en ratas wistar tras la ingesta aguda del extracto. El efecto del mismo sobre estas actividades enzimaticas se correlaciona con los metabolitos identificados en plasma mediante HPLC-ESI-TOF-MS para intentar establecer que compuesto o compuestos son los responsables de esta actividad y por tanto, los que podrian resultar de interes para el desarrollo de nutraceuticos. Por ultimo, en el capitulo 6, se estudia la absorcion de los compuestos fenolicos de hoja de olivo por parte de la linea celular de cancer de mama SKBR3 para intentar establecer que compuestos fenolicos son los responsables de la actividad citotoxica previamente mostrada en esta linea celular. Para ello, en primer lugar, el extracto de hoja de olivo se caracteriza cuantitativamente mediante HPLC-ESI-QTOF-MS, y a continuacion se analiza mediante el mismo metodo el perfil metabolico del citoplasma de celulas SKBR3 incubadas con dicho extracto durante diferentes tiempos (15 min, 1, 2, 24 y 48 h). El trabajo experimental incluido en este capitulo se desarrollo durante una estancia de 4 meses en la sede de la empresa Bruker Daltonik en Bremen, Alemania.