Biocidal activity and biochemistry of Leptodactylus pentadactylus frog foam nests – an analysis with insights into N-glycosylation

Die Bildung von Schaumnestern wahrend der Paarungszeit ist eine von zahlreichen Strategien, die von tropischen Froschen zum Schutz der Nachkommenschaft vor schadlichen Umwelteinflussen genutzt werden. Leptodactylus pentadactylus – der Sudamerikanische Ochsenfrosch, welcher in Mittel- und Sudamerika beheimatet ist – legt die befruchteten Eier in Schaumnester ab, die bis zum Schlupfen der Kaulquappen in tropischen Gewassern liegen, ohne von Pilzen oder anderen Pathogenen uberwuchert zu werden. In vorliegender Arbeit sollten zunachst die chemischen Eigenschaften des Schaummaterials untersucht werden. Eines der primaren Ziele bestand darin, einen Eindruck von den spezifischen Glykanstrukturen der Glykoproteine der Nester von L. pentadactylus zu gewinnen, wobei vor allem auf die Charakterisierung der N-Glykane Wert gelegt wurde. Zusatzlich war die Untersuchung der potentiellen bioziden Aktivitat des Schaumes ein wichtiges Ziel dieser Studie. Daruber hinaus, sollten auserdem die Mikroorganismen, welche mit dem Schaum assoziiert sind sowie deren mogliche schutzende Funktion im Schaum, untersucht werden. Die Analyse der Glykane erfolgte mit Hilfe von Lektin-blots und Detektion mittels alkalischer Phosphatase. Weiters wurde eine Glykanpraparation mit anschliesender MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight) Massenspektrometrie-Analyse durchgefuhrt. Zur Untersuchung der bioziden Wirkung des Schaumes wurden Versuche an Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, L. donovani und Acanthamoeba in Mikrotiterplatten durchgefuhrt, in denen die Parasiten mit dem homogenisierten und filtrierten Schaum (in verschiedenen Konzentrationen) behandelt wurden. Die Wirkung des Schaumes gegen die Bakterien Enterococcus hirae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Mycobacterium avium, M. terrae und Staphylococcus aureus, wie auch gegen die Pilze Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae und Trichophyton mentagrophytes erfolgte in Kulturplatten, auf die das Schaumextrakt aufgetropft wurde. Zur Isolation von Bakterien aus dem Inneren des Nestes, wurden kleine Stucke des Schaumes in Flussigmedium inokuliert. Samtliche isolierte Stamme wurden auf in vitro Antagonismus gegen C. albicans, und jene die biozide Effekte zeigten auch zusatzlich gegen Mycobacterium avium, M. terrae und Trichophyton mentagrophytes getested. Die Bakterien wurden schlieslich uber ihre enzymatischen Aktivitaten und mittels Massenspektrometrie identifiziert. Insgesamt konnten etwa 60 N-Glykane strukturell differenziert werden. Daruber hinaus konnte das Vorliegen von hybriden und komplexen N-Glykanen sowie das Vorhandensein weiterer Glykane, vermutlich O-Glykane, in den Glykoproteinen des Schaumnestes nachgewiesen werden. Weiters konnte auch die antimikrobielle Wirksamkeit des Schaumnestes gezeigt werden. Fur L. infantum und L. donovani zeigte sich durch die Behandlung mit dem Schaum eine deutliche Wachstumshemmung. T. cruzi und Acanthamoeba hingegen zeigten keine Reaktion. Die meisten Bakterien und Pilzen wurden durch die Substanz nicht inhibiert, jedoch konnte eine schwache Wachstumshemmung bei M. avium und M. terrae beobachtet werden. Von den 25 Bakterienstammen, die insgesamt aus dem Nest isoliert werden konnten, zeigten drei biozide Effekte auf Candida albicans. Diese Bakterien wurden mit groser Verlasslichkeit als Vertreter der Arten Ralstonia pickettii und Pseudomonas fluorescens identifiziert. Ein P. fluorescens-Stamm zeigte eine zusatzliche biozide Aktivitat gegen M. avium, der andere gegen T. mentagrophytes. Die vorliegende Arbeit konnte zum ersten Mal die Anwesenheit von N-Glykanen im Schaummaterial von Froschen zeigen und stellt einen allgemeinen Beitrag zur Kenntnis der N-Glykane bei Amphibien dar. Der Schwerpunkt bisheriger Studien lag vor allem bei der Untersuchung von O-Glykanen. Auch die Bioziditat der Schaumnester wurde schon seit Langem diskutiert, konnte jedoch in der vorliegenden Studie zum ersten Mal tatsachlich nachgewiesen werden, auch wenn das Wachstum von Bakterien offenbar nicht vollstandig gehemmt wird. Tatsachlich wird der Schaum sogar von einer Reihe von Bakterien bevolkert, von denen einige wachstumshemmend bei bestimmten anderen Mikroorganismen wirken. P. fluorescens ist fur seine antimikrobiellen Aktivitaten bekannt, die Art konnte jedoch zum ersten Mal im Froschschaum von L. pentadactylus detektiert werden. Ein moglicher Zusammenhang zwischen der Bioziditat des Nestes und den antagonistischen Mikroorganismen wird vermutet.