Embriogénesis somática en la vid: control de la maduración de los embriones somáticos y generación de nueva variabilidad in vitro

En esta tesis se establece un protocolo eficiente de regeneracion de plantas mediante embriogenesis somatica a partir de filamentos de estambres de vid (cv. Mencia) empleando TDZ y 2,4-D como inductores de la respuesta embriogenica. Se estudio el efecto del tamano de inoculo en la maduracion y la germinacion precoz de los embriones somaticos, y se encontro que es posible controlar ambos a partir de la manipulacion del tamano de los inoculo en el medio de maduracion. El analisis de los niveles de ploidia y el contenido de ADN nuclear mediante citometria de flujo de las plantas regeneradas a partir de este protocolo revelo que el mismo induce bajas tasas de variacion somaclonal que se manifiesta fundamentalmente mediante la poliploidizacion espontanea y la reduccion del material genetico durante la embriogenesis somatica. Se estudio detalladamente la maduracion de los embriones somaticos de vid en medio de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa y sobre una membrana semipermeable. Los analisis del contenido de agua, la expresion de VvNCED1 y el contenido de ABA y ABA-GE demostraron que la maduracion de los embriones somaticos de vid esta fuertemente regulada por la disponibilidad de agua en el medio de cultivo. Se detectaron dos picos de acumulacion de ABA durante la maduracion de los embriones somaticos sobre la membrana. El primero se manifiesta al comienzo de la maduracion y esta relacionado con la sobreexpresion del gen VvNCED1 inducida por cambios en el contenido de agua de los embriones. Una vez estabilizado el contenido de agua, los expresion de VvNCED1 se reduce hasta su nivel basal y el contenido de ABA cae bruscamente. Un segundo pico de acumulacion de ABA al final de la maduracion no se relaciona con la expresion de VvNCED1, ni con cambios en el contenido de agua de los embriones, por lo que es probable que se haya reclutado otro gen de la familia NCED1 para la regulacion de la biosintesis de ABA. La aplicacion de ABA exogeno en los cultivos sobre la membrana produjo una supresion de la expresion de VvNCED1, lo que sugiere que en alguna medida la regulacion de la expresion de este gen podria estar mediada por ABA. Se establecio un protocolo de mutagenesis in vitro inducida por EMS a partir de una suspension celular embriogenica y se empleo por primera vez el analisis de las curvas de disociacion de alta resolucion (HRM) para la deteccion de mutaciones puntuales en plantas lenosas. El EMS afecto tanto la supervivencia como la capacidad de regeneracion de plantas de las suspensiones celulares a dosis mayores de 3 mM. El analisis de las curvas de disociacion de un fragmento de 1000 pb del gen VvNCED1 permitio la deteccion de una mutacion en de masas embriogenicas derivadas de las suspensiones tratadas con EMS. Esta mutacion fue posteriormente confirmada mediante secuenciacion, demostrando la efectividad del EMS en la obtencion de poblaciones mutagenizadas de vid. La mutagenesis inducida por EMS podria ser de gran interes para la genomica funcional en la vid, pero hasta hoy todavia no ha sido empleada para este fin. Por ultimo, en este trabajo se establecio un protocolo eficiente para la regeneracion de plantas poliploides de vid a partir del tratamiento de una suspension embriogenica con colchicina. El interes en la obtencion de poliploides en la vid se basa en su utilidad para el mejoramiento genetico, debido a que las plantas poliploides podrian tener un crecimiento mas vigoroso y podrian dar frutos mas grandes o sin semillas. Los trabajos sobre poliploidizacion in vitro en la vid son muy escasos y estan limitados a unas pocos cultivares. El protocolo descrito en este trabajo permitio la obtencion eficiente de plantas poliploides y con una gran variabilidad en el contenido de ADN nuclear.