A triple entente? : interplay between alphaherpesviruses and interferon in sensory neuronal cells

Alfaherpesvirussen bezitten de gemeenschappelijke eigenschap om een levenslange latente, slapende infectie te veroorzaken, veelal in sensorische neuronen. Het wordt steeds duidelijker dat het gastheer immuunsysteem, het neuron en het virus zich gedragen als een “triple entente” om dergelijke latente infectie te bekomen en behouden. De belangrijkste doelstelling van deze thesis was dan ook om een beter inzicht te verwerven in de interactie tussen het immuunsysteem, het neuron en het virus. In eerste instantie werd, door gebruik te maken van een in vitro tweekamer systeem van primaire porciene trigeminale ganglion neuronen, interferon α (IFN) geidentificeerd als een molecule van het immuunsysteem die PRV en HSV-1 latentie kan induceren. Latentie wordt gekarakteriseerd door de afwezigheid van virale eiwitten, maar de aanwezigheid van viraal DNA dat kan reactiveren onder invloed van bepaalde stimuli (o.a. forskoline). Na voorbehandeling van de TG neuronen met IFN werd een stabiele onderdrukking van PRV en HSV-1 infectie bekomen die reactiveerbaar bleek na forskoline behandeling. De enige regio van het HSV-1 en PRV genoom die transcriptioneel actief is tijdens latentie is de LAT regio Er werd aangetoond dat tijdens IFN-geInduceerde latentie in vitro de LAT promoter actief is en LAT expressie kan worden teruggevonden. Er werd ook aangetoond dat de IFN-geinduceerde latentie correleerde met een reductie van expressie van de virale ‘immediate-early’ (IE) genen IE180 bij PRV en zijn ortholoog ICP4 bij HSV-1. Om deze IFN-gemedieerde onderdrukking van virale IE genexpressie verder te bestuderen werd gebruik gemaakt van een neuronale continue cellijn, 50B11. Er werd aangetoond dat onder invloed van IFN het ICP4 (HSV-1) eiwit gehalte significant verlaagd is vroeg in infectie, terwijl dit voor IE180 (PRV) pas later in infectie optrad. Dit suggereertdat translatie van ICP4 snel en efficient onderdrukt wordt door IFN, terwijl dit minder efficient gebeurt voor IE180. IFN-gemedieerde inhibitie van translatie gebeurt o.a. door fosforylatie en inactivatie van de translatie initiatie factor eIF2α. Er werd aangetoond dat IFN inderdaad aanleiding geeft tot substantiele fosforylatie van eIF2α in HSV-1 geinfecteerde cellen, terwijl dit niet het geval is in PRVgeinfecteerde cellen. Hieruit blijkt dat PRV in staat is om de IFN-gemedieerde fosforylatie van eIF2α efficient tegen te werken. PRV-gemedieerde inhibitie van IFNgeinduceerde fosforylatie van eIF2α was nog niet eerder beschreven, en werd dan ook meer in detail onderzocht. Om te achterhalen in welke fase van de infectie defosforylatie van eIF2α optreedt, werd een infectie-kinetiek uitgevoerd. Hieruit bleek dat defosforylatie reeds op 2h na inoculatie gebeurde. Experimenten met UV-geinactiveerd PRV, cycloheximide en fosfono-azijnzuur bevestigden de betrokkenheid van vroege virale eiwit(ten) bij de defosforylatie van eIF2α. PRV codeert slecht een IE eiwit, nl. IE180. Door het uitvoeren van een combinatie-behandeling met cycloheximide en actinomycine D die enkel IE180 expressie toelaat werd aangetoond dat expressie van IE180 voldoende is om defosfoylatie van eIF2α te veroorzaken. Transfectie van IE180 bevestigde dit. Aangezien PRV geen eigen fosfatase codeert, maakt het virus vermoedelijk gebruik van een cellulair fosfatase om de defosforylatie te bewerkstelligen. Door gebruik te maken van inhibitoren werd aangetoond dat het cellulaire PP1 fosfatase betrokken is bij defosforylatie van eIF2α. In conclusie werd dus aangetoond dat PRV IE180 leidt tot defosforylatie van eIF2α. Tijdens latere stadia van infectie bleek behandeling met IFN zowel bij HSV-1 als PRV een onderdrukking van IE mRNA te veroorzaken, vermoedelijk via inhibitie van transcriptie. Om hierop dieper in te gaan, werd nagegaan of chromatine modificaties die aanleiding geven tot open of gesloten chromatine hierbij betrokken kunnen zijn. Histone deacetylases (HDAC) zijn hierbij centrale spelers en geven over het algemeen aanleiding tot een gesloten chromatine conformatie en daardoor onderdrukte transcriptie. Er werd aangetoond dat een HDAC inhibitor, trichostatin A (TSA), in staat is om de IFNgemedieerde reductie van HSV-1 ICP4 mRNA en eiwit expressie significant tegen te werken. Dit impliceert dat TSA het effect van IFN deels teniet doet. Er werd eveneens aangetoond dat IFN behandeling zorgt voor verhoogde expressie van de cellulaire factor CoREST die deel uitmaakt van het transcriptie onderdrukkende CoREST/REST/HDAC/LSD1 complex. Dit complex werd reeds meerde keren gekoppeld aan onderdrukking van transcriptie van alfa-herpesvirussen en werd reeds gesuggereerd om betrokken te zijn bij de inductie van latentie. Gecombineerd met onze huidige bevindingen leidt dit tot de hypothese dat IFN zorgt voor onderdrukking van HSV-1 en PRV transcriptie en inductie van latentie door stimulatie van het repressieve CoREST/REST/HDACV/LSD1 complex.