Identification of Cis- and Trans-Regulatory Factors Controlling the Expression of the C4 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene of the C4 Dicot Flaveria trinervia

Zusammenfassung C4-Pflanzen haben sich mehrmals unabhangig voneinander aus C3-Pflanzen entwickelt. Im Verlaufe dieser Evolution zur C4-Photosynthese wurden unter anderem die Expressionsmuster der involvierten Gene verandert. Die Phosphoenolpyruvat Carboxylase (PEPC) ist in Blattern von C4-Pflanzen deutlich hoher exprimiert als in Blattern von C3-Pflanzen. Die C4-Photosynthese zeichnet sich durch eine arbeitsteilige Organisation zwischen Mesophyll- und Bundelscheidenzellen aus. Die Expression des C4 Enzyms ist auf Mesophyllzellen beschrankt wahrend das orthologe C3 Enzym aus F. pringlei keine zellspezifische Expression aufweist. Cis-regulatorische Determinanten, die eine mesophyll-spezifische Expression des PEPC Gens bewirken, konnten einem 41 bp langen Segment im distalen ppcA-Promotor zugeordnet werden. Dieses Element wurde MEM1 fur „mesophyll expression module 1“ benannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist das Interesse auf die beteiligten cis- und trans-regulatorischen Faktoren gerichtet, die die differentielle Expression des PEPC-Gens (ppcA) in der Gattung Flaveria steuern. Da in dieser Gattung neben C3-, C4- auch C3-C4 intermediare Pflanzen existieren, war eine vergleichende Analyse von orthologen Genen moglich. Das im distalen Promotor des ppcA-Gens aus F. trinervia identifizierte MEM1 Element, welches in Fusion mit dem proximalen Bereich fur eine mesophyll-spezifische Expression ausreicht, wurde mittels Promotor-GUS-Reportergen-Experimenten eingehend untersucht. Eine vergleichende Sequenzanalyse der MEM1 Elemente aus F. trinervia (C4) und aus F. pringlei (C3) zeigte, dass sich die beiden orthologen Elemente in drei wesentlichen Punkten unterscheiden. Erstens, das A- und B-Submodul des C4 MEM1 Elementes grenzen einander, wahrend beim C3 MEM1 Element beide Submodule durch eine Insertion von etwa 100 bp getrennt sind. Zweitens, die erste Base im A-Submodul zeichnet sich durch ein Adenin (C3) zu Guanin (C4) Austausch aus und drittens, im B-Submodul unterscheidet sich das C4 vom C3 MEM1 Element durch eine Insertion von vier Basenpaaren. Fur die mesophyll-spezifische Expression mussen beide MEM1-Submodule im C4-Status vorhanden sein, und wird durch eine Trennung beider MEM1-Submodule nicht beeinflusst. Das MEM1 Element des ppcA Gens aus F. trinervia hat eine duale Funktion, es erhoht die Expression in Mesophyllzellen und verhalt sich wie ein Repressor-Element das eine Expression in den Bundelscheidenzellen und im vaskularen Gefassystem verhindert. Bei der Suche nach trans-regulatorischen Faktoren, die spezifisch an das MEM1 Element des ppcA-Gens aus F. trinervia binden, wurden drei verschiedene bZIP Proteine, FtbZIP18, 29 und 51, identifiziert die eine grose Ahnlichkeit zu den bZIP Proteinen der Gruppe I aus A. thaliana aufweisen. In vivo Bindungsstudien im Hefesystem zeigten, dass die FtbZIP Proteine mit dem C4 MEM1 Element jedoch nicht mit dem orthologen C3 MEM1 Element interagieren. Folgende in vitro Protein-DNA Interaktionsstudien offenbarten jedoch, dass die FtbZIP Proteine in der Lage sind mit vergleichbarer Affinitat an ein MEM1 Element des C4- und C3-Typs zu binden. Diese Interaktion der FtbZIP Proteine mit C4 und C3 MEM1 Elementen in vitro, die im Widerspruch mit der in vivo-Situation steht, deutet darauf hin, dass mindestens ein weiterer unbekannter Faktor involviert sein muss. Es wird angenommen, dass dieser unbekannte, von der Hefe stammende, Faktor fur die unterschiedliche Interaktion von FtbZIP Proteinen an C4 und C3 MEM1 Elementen im Hefe Ein-Hybrid System verantwortlich ist.