Die Hitzeschockantwort oberhalb des Siedepunktes von Wasser: Funktion und Struktur des neuartigen Transkriptionsregulators Phr aus Pyrococcus furiosus

Wie alle Organismen weist auch das hyperthermophile Archaeon Pyrococcus furiosus bei einer Temperaturerhohung, die uber die optimale Wachstumstemperatur hinausgeht, eine Hitzeschockantwort auf. Im Gegensatz zu den bakteriellen und eukaryotischen Systemen ist uber die Regulation der archaeellen Hitzeschockantwort bisher wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt den ersten archaeellen Hitzeschockregulator. Es handelt sich um das Protein Phr (Pyrococcus heat shock regulator), welches durch den ORF PF1790 kodiert wird. Dieses Protein ist in verschiedenen Euryarchaeota konserviert. Es existieren keine bakteriellen oder eukaryotischen Homologe. Phr hemmt spezifisch die in vitro-Transkription der beiden im Pyrococcus furiosus-Genom direkt hintereinander liegenden Hitzeschockgene aaa+atpase und hsp20. Auserdem hemmt Phr als Autoregulator die Transkription seines eigenen Gens. Durch EMSAs und DNaseI-Footprint-Analysen konnte der Mechanismus der Transkriptionshemmung aufgeklart werden. Phr bindet die Hitzeschockpromotoren direkt stromabwarts der Transkriptionsfaktoren TBP und TFB und uberlagert dabei den Transkriptionsstartpunkt. Dadurch wird die Anlagerung der RNA-Polymerase blockiert und die Initiation der Transkription verhindert. Im Bindebereich von Phr konnte in allen drei Hitzeschockpromotoren das Palindrom 5´- TTT - - T - - C - - - - - G - - A - - AAA - 3´ identifiziert werden, welches als Erkennungssequenz von Phr vorgeschlagen wird. In vivo Studien zeigten, dass die Gene aaa+atpase und phr unter Hitzeschockbedingungen verstarkt transkribiert werden. Auch beim Ubergang von der exponentiellen zur stationaren Wachstumsphase wird vermehrt aaa+atpase und phr-mRNA gebildet, was dafur spricht, dass diese Hitzeschockproteine moglicherweise auch im Stress der stationaren Wachstumsphase eine Rolle spielen konnten. Um die Phr-Bindung in vivo zu untersuchen, wurden Protein-DNA-Komplexe kovalent miteinander vernetzt. Nach Scheren der DNA und einer anschliesenden Immunprazipitation mit spezifischen Antikorpern gegen Phr wurden die an Phr gebundenen Gene identifiziert (ChIP-Technik). Auf diese Weise wurde bestatigt, dass Phr auch in vivo - bei 95°C - die Promotorsequenzen der Hitzeschockgene aaa+atpase, hsp20 und phr bindet. Bei 107°C, also unter Hitzeschockbedingungen, ist die Phr-Bindung an die Promotoren dagegen nicht mehr nachweisbar. Das konnte bedeuten, dass der Regulator Phr als direkter Thermosensor wirkt, indem er unter normalen Wachstumsbedingungen durch Promotorbindung die Transkription der Hitzeschockgene unterbindet. Bei einer Temperaturerhohung dagegen denaturiert das Regulatorprotein und die Transkription der Hitzeschockgene wird durch die Dissoziation des Repressors von der DNA ermoglicht. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Professor Ladenstein (Karolinska Institut, Schweden) wurde die Struktur von Phr mit einer Auflosung von 3 A bestimmt. Hierzu wurde ein Selenomethioninderivat von Phr hergestellt, bei dem alle funf in Phr vorhandenen Methioninreste durch Selenomethionin ersetzt wurden. Die Strukturaufklarung erfolgte mit der Methode der anomalen Dispersion bei verschiedenen Wellenlangen (MAD). Der N-terminale Teil von Phr besteht aus einem wHTH-DNA-Bindemotiv. Dem klassischen wHTH-Motiv, das aus drei Helices besteht, ist eine vierte Helix N-terminal vorgelagert. Im zentralen Teil des Phr-Dimers bilden sich ein antiparalleles Zwei-Helix-Bundel und ein heterogenes beta-Faltblatt aus. Der C-terminale Bereich wird dominiert durch eine lange, stark negativ geladene alpha-Helix. Phr stellt damit vermutlich einen neuen Typ dimerer Transkriptionsfaktoren dar. Auch der Modus der DNA-Interaktion unterscheidet sich von denen bisher beschriebener wHTH-Proteine. Wahrend die schon charakterisierten wHTH-Proteine die DNA entweder mit der Erkennungshelix 3 oder dem Flugel der DNA-Bindedomane binden, sind bei Phr Aminosauren in drei Helices sowie dem Flugel an der DNA-Bindung beteiligt. Um die Phr-DNA-Bindung auf molekularer Ebene genauer zu untersuchen, wurde eine am C-Terminus um 106 Aminosauren verkurzte Form von Phr hergestellt. Dieses hauptsachlich aus dem DNA-Bindemotiv bestehende Protein wurde zusammen mit Oligonukleotiden mit der Phr-Erkennungssequenz von Dr. Wei Liu aus der Arbeitsgruppe von Prof. Ladenstein in Cokristallisationsversuche eingesetzt. Kristalle dieser Protein-DNA-Komplexe liegen bereits vor, die Strukturberechnungen sind aber noch nicht abgeschlossen. Durch die Aufarbeitung der durch die ChIP-Methode gewonnenen Prazipitate fur Microarray-Analysen wurde der Weg bereitet, alle Phr-Bindestellen im Pyrococcus-Genom zu ermitteln. Die Microarray-Analysen werden in Kooperation mit dem Labor von Professor Michael Adams (Georgia, USA) durchgefuhrt.