Structural and functional effects of natural phenolic compounds on rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa

Dietary polyphenols represent a group of secondary metabolites which widely occur in fruits, vegetables, wine, tea, extra virgin olive oil, chocolate and other cocoa products. Previous studies have shown the interaction of certain phenolic compounds with estrogen and adenosine receptors, belonging to the G-protein coupled receptors (GPCRs) superfamily. GPCRs are the largest family of signal transduction molecules involved in most of the physiological processes. Rhodopsin is the prototypic member of GPCRs. This receptor is the major protein found in the disks membrane of the outer segments of retinal rod photoreceptor cells and the first with resolved crystal structure. Mutations in rhodopsin are associated with retinitis pigmentosa (RP), a group of inherited visual diseases causing retinal degeneration due to progressive loss of rod and cone photoreceptors cells and leading to blindness. Several studies have been carried out on rhodopsin RP mutants in order to elucidate the molecular mechanism of the disease. This is the first step before suitable therapeutic approaches can be developed. Some of the proposed treatments are based on pharmacological rescue, in which small molecules known as chemical or pharmacological chaperones bind and stabilize misfolded opsins. Polyphenols have been proposed as useful agents against retinal toxicity but no clear evidence of these compounds at the molecular level of the visual phototransduction System has been presented so far. Given the interest in finding new ligands to compensate the deleterious effects of RP mutations, the aim of this thesis was to evaluate the effect of the polyphenols on the structure and function of the visual pigment rhodopsin RP mutants and to study their preferences to bind to rhodopsin. Herein we found that polyphenols quercetin (Q), resveratrol (R) and epigallocatechin gallate decreased the expression of wild-type and mutant rhodopsins when added to eukaryotic cell cultures. However, no differences were observed in the biophysical and functional properties of immunopurified pigments regenerated with 11-cis-retinal chromophore treated with O and R al concentrations of 1 µM and 10 µM Our molecular docking complementary analysis indicated that the polyphenol compounds studied can bind to rhodopsin and could act as allosteric ligands for rhodopsin regenerated with 9-cis-retinal as a chromophore. Our results showed that Q improved the percentage and rate of regeneration of opsin with 9-cis-retinal when compared to 11-cis-retinal. Q enhances the structural compaction around the Schiff Base linkage between the retinal chromophore and opsin, preventing the chemical retinal trapping reagent hydroxylamine from easily entering in the retinal pocket. Moreover, functional experiments on wild-type and G90V mutant rhodopsin regenerated with 9-cis-retinal in presence of 1 µM Q, showed a sigmoidal kinetics clearly representative of cooperative binding. Furthermore, the presence of Q bound to rhodopsin was demonstrated by HPCL-MS analysis. In summary, it has been shown, by using complementary molecular biology and analytical methods and in silico computational studies that some polyphenol compounds, and particularly quercetin, can act as allosteric modulators of 9-cis-rhodopsin. This effect is particularly significant in the case of the G90V mutation associated with the retinal degenerative disease RP, where the deleterious properties of the mutation could be partially compensated, and opens novel possibility of using such compounds in the treatment of visual neurodegeneration such as that associated to RP. Los polifenoles de la dieta representan, un grupo de metabolitos secundarios los cuales se encuentra ampliamente en frutas y vegetales, vino, te, aceite de oliva extra virgen, chocolate y otros productos de cacao. Estudios previos han mostrado la interacción de algunos compuestos fenólicos con receptores de estrógeno y adenosina, pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Estos GPCRs son la familia más grande de moléculas de transducción de señales involucradas en la mayoría de procesos fisiológicos. Rodopsina es el miembro prototípico de GPCRs y es la proteína mayoritaria encontrada en la membrana de los discos del segmento exterior de los bastones, células fotoreceptoras de la retina, y el primer con la estructura cristalina resuelta. Mutaciones en rodopsina se han asociado con retinosis pigmentaria (RP), un grupo de enfermedades visuales hereditarias que causan degeneración retiniana la cual lleva a la pérdida progresiva de las células fotoreceptoras, bastones y conos. Causando ceguera. Numerosos estudios sobre mutantes de RP se han llevado a cabo con la finalidad de elucidar los mecanismos moleculares de la enfermedad como un primer paso necesario antes de que se puedan desarrollar enfoques terapéuticos adecuados. Algunos de los tratamientos propuestos se basan en el rescate farmacológico, en el cual moléculas pequeñas conocidas como chaperonas químicas o farmacológicas se unen y estabilizan opsinas mal plegadas. Los polifenoles se han propuesto como agentes útiles contra la toxicidad retiniana, pero hasta ahora no se ha presentado evidencia clara de los efectos de estos compuestos a nivel molecular del sistema de fototransducción visual. Dado el interés en encontrar nuevos ligandos que puedan compensar los efectos causados por mutaciones de RP, el objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de los polifenoles sobre la estructura y función la rodopsina y mutantes de RP G90V, Y102H e 1307N y estudiar las preferencias de unión a rodopsina Se encontró al adicionar quercetina (Q), resveratrol (R) y epigalocatequin galato en células eucariotas, éstos afectan la expresión de la rodopsina nativa y de mutantes estudiados. Por otro lado, no se observaron diferencias en las propiedades biofísicas y funcionales de los pigmentos inmunopurificados regenerados con el cromofóro 11-cis retinal tratados con Q y R a concentraciones de 1 µM y 10 µM. Nuestro análisis complementario de acoplamiento molecular indicaron que los compuestos fenólicos estudiados aquí pueden unirse a rodopsina y podrían actuar como ligandos alostéricos para rodopsina unidos al cromóforo 9-cis-retinal. Analizando los resultados de las propiedades espectrales y bioquímicas de rodopsinas expresadas heterólogamente en cultivos celulares mostraron que Q mejoró el porcentaje y velocidad de regeneración de la opsina regenerada con 9-cis-retinal al compararla con 11-cis retinal. Se encontró que la Q mejora la compactación estructural al entorno de la base de Schiff de unión de la opsina y el cromóforo, evitando que el reactivo hidroxilamina entre fácilmente en el sitio de unión del retinal. Los experimentos funcionales de las muestras tratadas con 1 µM Q para la rodopsina nativa y mutante G90V regenerados con 9-cis-retinal mostraron una cinética sigmoidal claramente representativa de una coperatividad de unión. Además, la presencia de Q en la muestra final después de la inmunopurificación se demostró mediante HPLC-MS. Se ha demostrado mediante el uso de técnicas de biología molecular, métodos analíticos y en estudios computacionales, que algunos compuestos fenólicos, en particular la Q, pueden actuar como moduladores alostéricos de la 9-cis-rodopsina, efecto significativo en el caso del mutante G90V asociado a RP, donde las propiedades deletéreas de la mutación podrían ser parcialmente compensadas, y abre una nueva posibilidad de utilizar dichos compuestos en el tratamiento de neurodegeneraciones visual asociados a RP.