Untersuchungen zur Etablierung CEACAM1-bindender Partikel für die bildgebende Diagnostik des Prostatakarzinoms

Prostatakrebs stellt in Deutschland und in Europa mit ca. 60000 Neuerkrankungen im Jahr die haufigste Krebserkrankung bei Mannern dar[3,4] und ist fur ca. 10 % aller krebsassoziierten Todesfalle verantwortlich. [3,5] Fur eine erfolgreiche Tumorbehandlung ist eine gesicherte Diagnose im sehr fruhen Anfangsstadium der Krebsentwicklung erforderlich. Zu Beginn der Krebsentwicklung kann der Tumor noch ohne ein eigenes Versorgungssystem wachsen. Sobald er aber eine bestimmte Grose uberschreitet muss er zum weiteren Wachstum ein eigenes Gefasbett initiieren. Deshalb ist der Nachweis einer Neubildung von Blutgefasen (Neoangiogenese) seit einiger Zeit im Fokus der Krebs-Diagnoseentwicklung. Diese Diagnostik sollte nicht-invasiv, kostengunstig und schnell durchfuhrbar sein. Diese Voraussetzungen werden zurzeit nur von der Ultraschalldiagnostik erfullt. Im Falle der Prostata-Diagnose werden Mikropartikel zur Kontrastverstarkung eingesetzt. Deren Verwendung, als molekulare Markersysteme zur zuverlassigen Darstellung des mikrovaskularen Tumorgefasbetts, ist jedoch bisher nicht uber tierbasierte in vivo Studien hinausgegangen, wie die aktuelle „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ des National Center for Biotechnology Information (US) zeigt. [153] Unsere Arbeitsgruppe identifizierte in vorangegangenen Studien CEACAM1 als Neoangiogenesemarker in Endothelzellen in neugebildeten Tumorblutgefasen. [41] Eine spezifische Markierung dieses Proteins mit ultraschallgeeigneten Partikeln stellt ein neues molekulares Markersystem zur Visualisierung des Tumorgefasbetts im Tumor-Fruhstadium mittels Ultraschall dar. Daher wurde zunachst das kommerziell erhaltliche Ultraschallkontrastmittel SonoVue [SV] der Firma Bracco mit einem in unserer Arbeitsgruppe entwickelten CEACAM1-spezifischen Antikorper beladen, um ein solches Markersystem zu generieren. Allerdings stellten sich dabei die [SV] Partikel, aufgrund ihrer geringen Stabilitat und des Fehlens einer kovalenten Bindungsmoglichkeit fur Antikorper, als ganzlich ungeeignet heraus. Die Bindung erfolgte hier lediglich uber Adsorption. Eine solch gering affine Bindung ist aber fur Anwendungen in der Angiologie, wo starke Scherkrafte auftreten, nicht ausreichend. Aus diesem Grund wurden weitere kommerziell erhaltliche Partikel mit dem CEACAM1-spezifischen Antikorper beladen und analysiert. Eine Bindung an Protein G Partikel sollte hierbei die korrekte Ausrichtung der Antikorper sicherstellen. Die Bindung uber das Biotin-Streptavidin System mit weiteren Partikeln gewahrleistete dagegen die Flexibilitat der Antikorper. Beide Systeme ermoglichten zudem kovalent ahnlichen Bindungscharakter. Fur die Untersuchung der Bindungseigenschaften dieser CEACAM1-bindenden Partikel sollte als in vitro Testsystem die Endothelzelllinie eines Angiosarkoms der Kopfhaut (AS-M.5) eingesetzt werden, da diese unter anderem CEACAM1+ sind. Bei deren Verwendung bestand jedoch keine Moglichkeit, den Grad der unspezifischen Bindung CEACAM1-bindender Partikel zu analysieren. Daher wurde zunachst in einem in vitro Testsystem mit einer humanen CEACAM1 stabil transfizierten HeLa Zelllinie gearbeitet. Als Kontrolle und zum Nachweis unspezifischer Bindung stand somit die HeLa Wildtyp Zelllinie zur Verfugung. In unserer Arbeitsgruppe stand zusatzlich eine HeLa Zelllinie mit stabil transfizierten CEACAM8 zur Verfugung, welches normalerweise ausschlieslich auf Granulocyten expremiert wird. Des Weiteren wird CEACAM8 nicht nur an Zell-Zell Kontaktstellen, sondern auch vermehrt apikal expremiert[85,86]. Zusatzlich ist es uber eine GPI-Verankerung und nicht wie CEACAM1 transmembran an der Zellmembran gebunden, wodurch CEACAM8 eine hohere laterale Beweglichkeit in der Zellmembran besitzt[87]. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch, dass weder die Art der Membranverankerung noch die Lokalisation der Proteine einen Einfluss auf die Bindung antikorperbeladener Partikel hatte. Diese Zelllinie wurde daher ebenfalls zur parallelen Entwicklung einer Isotypenkontrolle zu den CEACAM1-bindenden Partikeln genutzt. Neben den [SV] Partikeln erwiesen sich auch die eingesetzten Roti-MagBeads Protein G [RPGB] Partikel der Firma Carl Roth aufgrund ihrer unspezifischen Bindung fur die geplanten Anwendungen als nicht geeignet. Diese war so stark ausgepragt, dass die Ergebnisse der Kontrollen nahezu identisch zu den Versuchsergebnissen waren. Die Targestar [TS] Partikel der Firma Targeson, die Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] der Firma Invitrogen und die Protein G MicroBeads [MPGB] der Firma Miltenyi ergaben hingegen vielversprechende positive Resultate. So zeigten diese drei Partikelarten eine eindeutige antikorpervermittelte Bindung und lediglich bei den [SDB] Partikeln einen vernachlassigbaren unspezifischen Bindungsanteil. Allerdings konnen [MPGB] Partikel fur ultraschallbasierte Diagnostik nicht verwendet werden, da Nanopartikel im Ultraschall nicht detektierbar sind. [89] Sie konnten jedoch bei Fragestellungen im Bereich von MRT-Untersuchungen eingesetzt werden. Fur weiterfuhrende Untersuchungen im in vitro Testsystem mit AS-M.5 Zellen sollten daher die vielversprechenden [TS] Partikel, welche speziell fur in vivo Ultraschalluntersuchungen entwickelt wurden, und die [SDB] Partikel verwendet werden. Hierbei wurden sich die [SDB] Partikel als Kontrollmarkersystem bei in vitro Untersuchungen anbieten. Trotz der eindeutigen Ergebnisse mussten die Partikel zur weiteren Verwendung modifiziert werden, da sie aufgrund ihrer Grose von Makrophagen erkannt und durch das Retikuloendotheliale System (RES) entfernt werden konnten. [134] Eine Maskierung zum Beispiel durch das Verwenden von Polyethylenglycolen wurde dies verhindern. [125,135,136] Des Weiteren wurden das Kopplungsprotein Streptavidin und das Fc-Fragment des gebundenen Antikorpers in humanen Anwendungen Immunogenitat hervorrufen. [126,144] Diese Immunogenitat aufgrund des Fc-Fragments konnte durch die Verwendung der F(ab)2-Fragmente umgangen werden, wobei die Beladung der Partikel uber bivalente Crosslinker erfolgen musste. Dadurch wurde eine kovalente ortsspezifische Bindung erreicht und gleichzeitig der Einsatz eines Kopplungsproteins vermieden werden. Der Einsatz von Polyethylenglycolen mit entsprechenden reaktiven Endgruppen als Crosslinker wurde zudem die Flexibilitat und damit die Antigenerkennung aufrecht halten. [125] Zusammenfassend lasst sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit den ersten Schritt bei der Etablierung CEACAM1 bindender Partikel fur die bildgebende Diagnostik des Prostatakarzinoms darstellen. Dieses System wurde sich sehr gut in die molekularen Markersysteme der „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ einfugen. [153]