Dévelappement de vecteurs lentiviraux non-intergratifs en vue du transfert de gènes dans le système nerveux central.

Les vecteurs lentiviraux sont parmi les plus efficaces et les plus aises a manipuler en vue du transfert de genes. Leur application est toutefois fortement compromise par le risque de mutagenese qui resulte de l'integration de leur genome dans la chromatine de la cellule cible. Plusieurs strategies peuvent etre envisagees afin de contourner ce risque, l'une d'entre elle est de bloquer l'integration du genome vecteur et d'utiliser des vecteurs lentiviraux sous forme episomale. Nous avons introduit une mutation dans la region C-terminale de l'itegrase de vecteurs derives du HIV (262RRK->AAH). Nous avons demontre que ces vecteurs permettent l'expression d'un transgene dans differentes lignees cellulaires in vitro ainsi que dans des cultures primaires de cellules en arret de division (astrocytes et neurones). L'expression du transgene est perdue par dilution des genomes non integres au cours de la division cellulaire. Elle est au contraire stable dans des cellules en arret de division. Nous avons egalement evalue l'activite residuelle d'integration des vecteurs mutants exprimant le gene de resistance au G418 (NEO), elle est reduite de 2 a 3 log par rapport au vecteur controle. Enfin, nous avons demontre la capacite de ces vecteurs lentiviraux non-integratifs a diriger l'expression d'un transgene in vivo dans le systeme nerveux central de rongeur, pendant au moins 10 semaines apres injection dans le striatum de souris et pendant au moins 5 mois apres injection sous-retinienne chez le rat. Nous avons ensuite entrepris l'amelioration de l'efficacite d'expression du transgene et la reduction de l'activite residuelle d'integration. En premier lieu, dans le but d'augmenter l'activite transcriptionnelle des formes episomales du genome lentiviral, nous avons incorpore des sequences d'attachement a la matrice nucleaire (sequence MAR de la chaine legere de l'immunoglobuline de souris et sequence MAR du lysozyme de poulet). Nous avons transduit in vitro differentes lignees cellulaires ainsi que des progeniteurs neuraux humains avec des vecteurs lentiviraux non-integratifs permettant l'expression de la Luciferase. Nous n'avons pas observe d'amelioration significative du niveau d'expression du transgene en presence des sequences MAR. Parallelement, nous avons produit des vecteurs portant differentes mutations de l'integrase (N : 262RRK↑AAH, ou LQ : 186K↑Q, 214Q↑L, 216Q↑L, ou 64D↑V) permettant l'expression de differents transgenes (GFP, LUC, GDNF). Nous avons compare in vitro l'efficacite de transduction de ces differents vecteurs. Nous avons etabli que le vecteur N est moins efficace que les vecteurs D64V et LQ. Nous avons en effet observe un phenomene de saturation de la transduction par le vecteur N. Les vecteurs D64V et LQ permettent une expression comparable du transgene. Nous avons egalement produit des vecteurs permettant l'expression du gene NEO portant ces differentes mutations d'integrase, seules ou en combinaison avec la modification des sequences d'attachement des LTR. Nous avons compare la frequence d'integration residuelle de ces differents vecteurs et observe que le vecteur D64V presente l'integration la plus elevee parmi les vecteurs mutants. La frequence d'integration est reduite de 1 a 2 log par rapport au vecteur controle integratif tandis qu'elle est reduite de 2 a 3 log pour les vecteurs N et LQ. Par ailleurs, nous n'avons pas observe de reduction significative de l'integration par la modification des LTR, qu'elle que soit l'integrase mutee consideree.