Desarrollo de marcadores funcionales y evaluación de la diversidad genética en Eucalyptus globulus con énfasis en genes potencialmente involucrados en características de calidad de la madera

Eucalyptus globulus es la especie forestal con mejor aptitud papelera y para la obtencion de bioenergia a partir de celulosa, mayormente plantada en regiones templadas del mundo. Los proyectos genomicos en Eucalyptus han incrementado el numero de secuencias disponibles en los bancos de datos publicos. Los marcadores funcionales publicos, si bien son frecuentes en diferentes cultivos, son aun escasos en especies forestales. De alli la importancia de la busqueda y validacion de regiones SSRs en genes de interes, para ser utilizados en futuros proyectos de mejoramiento asistido por marcadores (marker assisted breeding). En este estudio, se identificaron secuencias no redundantes de ADN de Eucalyptus (genomicas y ESTs) depositadas en bancos de datos publicos para revelar secuencias microsatelites y predecir, in silico, su funcion putativa. Estas fueron luego validadas en laboratorio para predecir su potencial uso en analisis de diversidad genetica. A partir de 12.690 ESTs de Eucalyptus globulus publicados en NCBI se identificaron 4.924 secuencias no redundantes. De estas, 952 unigenes (19,3%) contenian 1.140 regiones SSR. Luego del analisis bioinformatico de estos EST-SSRs, se disenaron 979 oligonucleotidos novedosos y se predijo su funcion putativa, incluyendo categorias Gene Ontology (GO) segun su proceso biologico, funcion molecular y componente celular. Se identificaron asi 29 SSRs en 24 genes candidatos (estructurales y reguladores) para calidad de madera. Los SSRs se encontraron en promotores, intrones y exones de genes candidatos (GC) de distintas rutas metabolicas (biosintesis del fenilpropanoico, biosintesis de celulosa, metabolismo de hemicelulosas, ruta metabolica del shikimato, metabolismo de la metionina y genes de tubulinas y el factor de transcripcion LIM1). Un total de 85 SSRs (56 EST-SSRs y 29 SSRs incluidos en GC) hallados en este trabajo fueron analizados para su validacion en 8 genotipos de E. globulus, resultando positivos un 65%. A partir de esta validacion se obtuvieron 17 EST-SSRs y 12 GC-SSRs polimorficos. Con estos se estimaron los valores de diversidad en una muestra de 60 individuos no emparentados de E. globulus representantes de seis razas que cubren el rango de distribucion natural de la especie. Los valores de PIC, Ho y UHe variaron ampliamente entre aproximadamente 0,02 y 0,9, mientras que el numero de alelos vario entre 2 y 16, con un promedio de 7,55. Al realizar el test de Equilibrio de Hardy Weinberg (EHW) para los 29 loci, se encontro que 14 de ellos mostraron un significante deficit de heterocigotas (P<0,01). Este desvio del EHW podria explicarse por la presencia de subestructura poblacional y a la presencia de alelos nulos que sesgo las estimaciones de las frecuencias alelicas. Se realizo el estudio de transferibilidad de 49 loci (37 EST-SSRs validados (polimorficos y monomorficos) y los 12 GC-SSRs polimorficos) a otras seis especies de Eucalyptus (E. camaldulensis, E. dunnii, E. grandis, E. saligna, E. tereticornis y E. viminalis). Se encontro que 33 marcadores amplificaron en las seis especies estudiadas y seis en al menos cinco, mostrando la alta transferiblidad de los mismos. Finalmente, el estudio del polimorfismo y transferibilidad de los marcadores funcionales, permitio la seleccion de un conjunto de 13 (7 EST-SSRs y 6 GC-SSRs) altamente informativos y transferibles a otras seis especies de Eucalyptus. El conjunto de marcadores desarrollados son altamente informativos tendran un uso potencial en estudios de diversidad genetica, taxonomia, mapeo de QTL y en facilitar, en un futuro, la seleccion asistida en el mejoramiento de Eucalyptus.