Protein quality control in the cytoplasm of yeast cells : substrate diversity and pathway selection

Protein misfolding occurs constantly in living cells. It occurs already at the stage of protein biosynthesis when polypeptides emerge from translating ribosomes. Misfolded proteins may disturb cellular functions and cause severe neurological and other diseases in mammals. Therefore, the cell has evolved protein quality control pathways for specific recognition and degradation of misfolded proteins. Protein folding is supported by different sets of chaperones which prevent unwanted intramolecular or intermolecular protein interactions. Furthermore, specific chaperones recognize irreversibly damaged proteins for subsequent elimination from the cellular environment. For proteins of the secretory pathway the protein quality control system is rather well understood. This study concentrates on the characterization of the cytoplasmic protein quality control mechanisms and pathways by using a variety of terminally misfolded proteins as model substrates. As model organism for these studies the yeast S. cerevisiae was chosen. In previous studies, the degradation of the cytosolic model substrate ΔssCPY*Leu2myc (ΔssCL*myc) which is based on the irreversibly misfolded carboxypeptidase Y (CPY*) had been shown to be dependent on the ubiquitin ligase Ubr1 (Eisele and Wolf, 2008). The enzyme ubiquitinates the substrate leading to subsequent recognition and degradation by the proteasome. In this work, additional cytosolic chaperones acting in the protein quality control process of the misfolded substrate ΔssCL*myc were uncovered. The Hsp31 chaperone family was found to be involved in controlling the steady state level of ΔssCL*myc in the stationary growth phase of cells. It was shown via epistasis analyses that the Hsp31 chaperones act in a pathway overlapping with Ubr1-mediated protein degradation. Using truncations of the model substrate ΔssCL*myc revealed that the nuclear ubiquitin ligase San1 is also involved in the protein quality control of some of these cytosolic misfolded proteins. They are obviously directed into the nucleus prior to degradation. Experiments with the model substrates of different sizes indicate that the molecular mass is a determinant of the nuclear San1-dependency of substrate degradation. The degradation of small substrates shows an increased dependency on San1. A further set of cytosolic model substrates was generated consisting of firefly luciferase. A chemoluminescence assay for quantitative determination of corresponding substrates in yeast cells was established. This test is supposed to be very suitable for high throughput screening. Not only artificial terminally misfolded cytosolic model substrates are targets of Ubr1-dependent proteasomal degradation. Also an orphan subunit of the cytosolic fatty acid synthase (FAS) complex, Fas2, is a target of Ubr1-dependent proteasomal degradation if its binding partner Fas1 is missing (Scazzari, 2013). This study revealed that the Hsp70 chaperone Ssa1 is essential for keeping orphan Fas2 in a soluble state for subsequent ubiquitination by the ubiquitin ligase Ubr1. The Cdc48 machinery was found to act downstream of the ubiquitination process mediated by Ubr1 and it may be responsible for dissociation of ubiquitinated oligomeric orphan Fas2 complex into monomers, an essential step for subsequent proteasomal degradation. In lebenden Zellen findet standig Fehlfaltung von Proteinen statt. Dies geschieht bereits wahrend der Proteinbiosynthese, wenn Polypeptide an translatierenden Ribosomen entstehen. Fehlgefaltete Proteine konnen die Zellfunktionen massiv storen und schwere neurologische und andere Krankheiten in Saugetieren auslosen. Daher hat die Zelle Mechanismen und Wege entwickelt, den Faltungsprozess von Proteinen zu uberprufen und fehlgefaltete Proteine spezifisch zu erkennen und abzubauen. Einerseits wird die Proteinfaltung durch verschiedene Klassen von Chaperonen unterstutzt, die nicht gewollte intra- oder intermolekulare Proteininteraktionen verhindern. Andererseits werden irreversibel fehlgefaltete Proteine durch bestimmte Chaperone erkannt und anschliesend aus der zellularen Umgebung entfernt. Fur Proteine des sekretorischen Weges ist diese Proteinqualitatskontrolle bereits recht gut verstanden. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung der Mechanismen und Wege der zytoplasmatischen Proteinqualitatskontrolle im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae durch Verwendung einer Vielzahl irreversibel fehlgefalteter Proteine als Modellsubstrate. In vorangegangenen Studien wurde gefunden, dass der Abbau des zytosolischen Modellsubstrates ΔssCPY*Leu2myc (ΔssCL*myc), das auf endgultig fehlgefalteter Carboxypeptidase Y (CPY*) basiert, abhangig von der Ubiquitin-Ligase Ubr1 ist (Eisele and Wolf, 2008). Ubr1 ubiquitiniert das Substrat, so dass es vom Proteasom erkannt und abgebaut werden kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fur die Proteinqualitatskontrolle von ΔssCL*myc zusatzlich noch nicht naher charakterisierte zytosolische Chaperone benotigt werden. In der stationaren Phase ist die Hsp31 Chaperonfamilie an der Kontrolle der Proteinmenge von ΔssCL*myc beteiligt. Epistaseanalysen zeigten eine Funktion der Hsp31 Chaperone auf einem Weg parallel zum Ubr1-abhangigen Proteinabbau. Durch Untersuchung verkurzter Varianten des Modellsubstrats ΔssCL*myc wurde gefunden, dass auch die Zellkern-lokalisierte Ubiquitin-Ligase San1 an der Proteinqualitatskontrolle einiger zytosolischer Proteine beteiligt ist, die vor ihrem Abbau in den Zellkern transportiert werden. Die Verwendung zytosolischer Modellsubstrate unterschiedlicher molekularer Masse deutet darauf hin, dass die molekulare Masse ein Kriterium fur die San1-Abhangigkeit des Substratabbaus ist. Kleinere Substrate zeigten eine starkere San1-Abhangigkeit des Abbaus. Basierend auf dem in Gluhwurmchen produzierten Enzym Luciferase wurden weitere zytosolische Modellsubstrate hergestellt. Mit Hilfe der Chemolumineszenz wurde ein einfacher Test fur die quantitative Bestimmung entsprechender Substrate in Hefezellen etabliert. Dieser Test sollte fur Hochdurchsatzscreening-Experimente geeignet sein. Nicht nur kunstlich hergestellte, endgultig fehlgefaltete zytosolische Modellsubstrate sind Ziele des Ubr1-abhangigen proteasomalen Abbaus sondern auch „orphan proteins“ wie die β-Untereinheit des Fettsauresynthasekomplexes (FAS), Fas2, wenn dessen Bindungspartner Fas1 fehlt (Orphan Fas2), (Scazzari, 2013). Diese Arbeit deckte auf, dass das Hsp70 Chaperon Ssa1 essentiell fur die Loslichkeit von Orphan Fas2, sowie fur die darauffolgende Ubiquitinierung durch die Ubiquitin-Ligase Ubr1 ist. Es wurde ferner gefunden, dass die Cdc48-Maschinerie nach dem Ubiquitinierungsprozess benotigt wird. Sie bewirkt sehr wahrscheinlich die Dissoziation von ubiquitiniertem oligomeren Orphan Fas2 aus einem Komplex in Fas2 Monomere, ein Prozess, der essentiell fur den darauffolgenden proteasomalen Abbau ist.