Effekt der Überproduktion von Enzymen des Glucosestoffwechsels auf das Wachstum und die Alkoholbildung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Die Wein-, Bier- und Backerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Hauptproduzent in der weltweiten Alkoholproduktion. Im Rahmen der Untersuchungen zur Bioethanolproduktion sollten in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen der Uberproduktion aller am Glucoseumsatz der Hefe Saccharomyces cerevisiae beteiligten Enzyme in vivo untersucht werden, um die Moglichkeit einer beschleunigten Ethanolproduktion zu eroffnen. Hierzu war von Vorteil, dass S. cerevisiae sowohl klassisch-genetisch als auch molekulargenetisch zu den bestuntersuchten eukaryontischen Organismen zahlt. So standen zwei verschiedene Hochkopienzahl-Vektoren zur Verfugung, in die im ersten Teil der Arbeit jeweils die Halfte der zu exprimierenden Gene eingesetzt werden konnten. Dies erfolgte in den ersten Schritten durch Restriktion und Ligation und im weiteren Verlauf durch eine Kombination der PCR-Technik zur Amplifikation der in Frage kommenden Genomfragmente mit der effizienten homologen Rekombination in vivo. So wurden sowohl das Gen fur einen Hexosetransporter (HXT1), als auch alle fur die Glykolyseenzyme kodierenden Gene (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1) und die fur die abschliesenden Schritte der Umwandlung von Pyruvat in Ethanol kodierenden Gene (PDC1, ADH1) kloniert. Nach Isolierung aus der Hefe wurden die entsprechenden Plasmide anschliesend in E. coli amplifiziert und Restriktionsanalysen unterzogen. Die Bestimmung der spezifischen Enzymaktivitaten in Extrakten aus entsprechenden Hefetransformanten ergab eine leichte Uberproduktion (Faktor 1,5 bis 3,0) fur alle Enzyme mit Ausnahme der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase. Fur HXT1 wurde eine deutlich erhohte Transkriptionsrate (Faktor 14 im Vergleich zum Ausgangsstamm) als Indiz fur die tatsachliche Uberproduktion gewertet. In den enzymatischen Messungen zeigte sich eine deutliche Tendenz zur Senkung der Uberproduktion mit zunehmender Zahl der plasmidkodierten Gene. Hieraus last sich eine negative Ruckkopplung in Bezug auf die Regulation des Glykolyseflusses ableiten. Untersuchungen der Wachstumsraten im zweiten Teil der Arbeit zeigten ebenfalls eine deutliche Reduktion mit Zunahme der exprimierten Gene. In Bezug auf die physiologischen Parameter fuhrte dies letztlich zu gleichbleibenden Glucoseverbrauchs- und Ethanolbildungs-Koeffizienten relativ zur Wildtyp-Kontrolle bei vergleichbaren Ausbeutekoeffizienten. Interessanterweise fuhrte die Aufhebung der ATP-Hemmbarkeit im Phosphofructokinase-Schritt durch die Expression eines Mutantenallels von PFK1 zu einem verbesserten Wachstum ansonsten isogener Transformanten. Dieses Ergebnis unterstutzt die physiologische Bedeutung der allosterischen Regulation in diesem zentralen Glykolyseschritt. Ein Verlust glykolytischer Enzymaktivitaten in Deletionsmutanten fuhrt bei S. cerevisiae in der Regel zur Wachstumshemmung. Daher wurde in einem weiteren Teil der Arbeit mit der Konstruktion eines Hefestammes begonnen, bei dem allein die Anzucht mit verschiedenen Zuckerquellen selektiv fur den Erhalt der Uberproduktionsplasmide sein sollte. Hierzu wurde ein Stamm mit einer pgi1-Deletion mit einem pyk1-Deletionsstamm gekreuzt und einer Tetradenanalyse unterzogen. Erste Versuche mit Zwischenkonstrukten deuten hier bereits auf eine deutliche Erhohung der Plasmidstabilitat nach Anzucht auf komplexen Medien hin. Aus der vorliegenden Arbeit leiten sich wertvolle Erkenntnisse uber die Regulation des Glykolyseflusses in vivo ab, die die Basis fur weitere Untersuchungen zur Steigerung der Ethanolproduktionsrate durch Hefe bilden The wine-, beer- and baker's yeast Saccharomyces cerevisiae is the major source in world wide alcohol production. Regarding the research in bioethanol production, the work presented here was aimed to examine the effect of the in vivo overproduction of all enzymes contributing to the conversion of glucose to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae with the prospect of increasing ethanol formation. S. cerevisiae is probably the best studied eucaryotic organism with respect to both classical and molecular genetics. It turned out to be of great advantage that two different multi-copy-vectors could be employed in these studies. Each of them was used in the first part of the work to insert half of the set of genes intended for overexpression. The first genes were inserted by restriction and ligation and later on a combination of the PCR-technique, with which the genomic fragments of interest were amplified, and the efficient homologous recombination in vivo was used. With these methods, the gene encoding a hexose transporter (HXT1), all the genes encoding glycolytic enzymes (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1), as well as the genes encoding enzymes needed for the conversion of pyruvate to ethanol (PDC1, ADH1), were cloned. Following the isolation from yeast, the plasmids were amplified in E. coli and characterized by restriction analysis. The measurement of specific enzyme activity in crude extract of yeast transformants with such plasmids showed a slight overproduction (factor 1,5 to 3,0) for all enzymes, except for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. For HXT1, an increased mRNA level (factor 14 in contrast to the control) was taken as evidence for overproduction. In the enzymatic determinations a clear tendency showing a lower overproduction with an increasing number of genes on the plasmids was observed. These findings suggest a negative feedback on glycolytic flux regulation. The the growth rates obtained in the second part of the work also showed a clear reduction with increasing numbers of plasmid-encoded genes. Regarding the physiological parameters, no changes in the coefficients for glucose consumption and ethanol formation could be found in comparison to a wild-type control, and the yield remained basically unchanged as well. Interestingly, abolishing the ATP-inhibition of phosphofructokinase by expression of a mutant allele of PFK1, resulted in a faster growth of transformants with an otherwise isogenic background. This result indicates the physiological relevance of the allosteric regulation at this essential glycolytic step. A lack of enzyme activity in one of the glycolytic steps in deletion mutants normally leads to growth inhibition on hexoses. On this basis, the construction of a yeast strain was initiated with the objective to obtain stable multi-copy transformants simply by growing cells on different sugars as carbon sources. In detail, this was done by crossing a strain carrying a pgi1-deletion with a strain carrying a pyk1-deletion followed by sporulation and tetrad dissection. Preliminary data with intermediate strain constructs indicate a clear increase in plasmid stability after growing cells on complex media. From the results of this thesis, valuable insights into the regulation of the glycolytic flux in vivo can be deduced, which may serve as a basis for ongoing research on the improvement of ethanol formation by yeast.