Effect of stress on cellular properties of probiotic microorganisms

Verschiedenste Praparate enthalten heutzutage probiotische Mikroorganismen. Eine Herausforderung bleibt dabei noch immer die moglichst schonende Verarbeitung. Die klassischen Methoden, auf die oft zuruckgegriffen wird, sind Lyophilisation und Spruhtrocknung. Beide Varianten verursachen Stress fur die Bakterien, sichtbar anhand koloniebildender Einheiten und zellularer Eigenschaften. Das Wirbelschichtverfahren bietet eine moderate Methode fur Granulierung und Trocknung. Anhand Enterococcus faecium M-74 sollte in dieser Arbeit festgestellt werden, ob das Wirbelschichtverfahren fur die Trocknung von Bakterien geeignet ist. Fur diesen Zweck wurde E. faecium M-74 in einer Wirbelschichtanlage auf kristalline Mikrozellulose-Pellets aufgespruht. Der Zustand der Bakterien wurde einerseits durch die Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf Agarplatten uberpruft, andererseits wurden verschiedene fluoreszierende Farbstoffe verwendet. Der Grad der Zerstorung der Zellmembran wurde mit Propidiumiodid detektiert, mit Dihydrorhodamin 123 wurde die Wasserstoffperoxidproduktion nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Microplate Reader durchgefuhrt. Verschiedene Substanzen wie Saccharose, „Skim milk“ (Magermilchpulver), Glukose und Dextrin wurden in unterschiedlichen Konzentrationen (10%, 50% und 100% bezogen auf die Feuchtmasse an Bakterien) hinzugefugt, um die Mikroorganismen vor allzu groser Zerstorung und Stress zu schutzen. Bei dieser Versuchsreihe stellte sich heraus, dass 100% Saccharose bezogen auf die Bakterien-Feuchtmasse die besten Ergebnisse bezuglich der Lebensfahigkeit, des Zustands der Zellmembranen und der Wasserstoffperoxidproduktion zeigten. 100% Saccharose wurde auch ausgewahlt, um Enterococcus faecium M-74 in der folgenden Versuchsanordnung zu schutzen. Der Einfluss der einzustellenden Parameter auf die Mikroorganismen - Prozesstemperatur, Prozesszeit resultierend aus der Spruhrate und der verwendete Spruhdruck wahrend des Wirbelschichtprozesses - wurde ebenfalls uberpruft. Die Temperatur schwankte zwischen 40 und 60°C, die Prozesszeiten variierten zwischen 7 und 45 Minuten, der verwendete Spruhdruck zwischen 1 und 3 bar. Die gleichen Methoden wie oben erwahnt wurden verwendet, um die Lebensfahigkeit, Zustand der Zellmembran und die Wasserstoffperoxidproduktion zu eruieren. Die Prozesstemperatur zeigte den grosten Effekt auf die Viabilitat der Bakterien. Zusammenfassend lasst sich zu dieser Versuchsreihe sagen, dass mit 40 °C, 15 Minuten und 1.5 bar die besten Ergebnisse bezogen auf die Lebensfahigkeit, den Zustand der Zellmembran und die Wasserstoffperoxidproduktion wahrend des Wirbelschichtprozesses fur Enterococcus faecium M-74 erreicht wurden. Das Wirbelschichtverfahren bietet eine gute Moglichkeit, E. faecium M-74 unter Zuhilfenahme geeigneter Protektantien und Prozesseinstellungen zu stabilisieren. Neben den Auswirkungen des Wirbelschichtverfahrens auf die Mikroorganismen wurde auch der Effekt von Kaltestress untersucht. In einer neuen Versuchsanordnung wurden die Effekte von -20 °C, -80 °C und -200 °C in flussigem Stickstoff auf E. faecium M-74 ermittelt. Bei -80 °C wurden auch verschiedene Arten des Einfrierens untersucht. Einerseits wurden die Bakterien schonungslos im Tiefkuhler bei -80 °C gekuhlt, andererseits wurden sie langsam auf diese Temperatur mit einer Rate von -1 °C pro Minute gebracht. Bei diesem Teil der Arbeit sind weitere fluoreszierende Farbstoffe zum Einsatz gekommen. Neben den schon erwahnten wurden der Hyperpolarisationsgrad der Membran mit Dihexyl-oxacarbocyaniniodid und der intrazellulare pH-Wert mit Carboxyfluorescindiacetatsuccinimidylester mit dem Microplate Reader und dem Durchflusszytometer gemessen. Bei -200 °C zeigten die Bakterien das geringste Mas an Schaden, sie bildeten die meisten kolonieformenden Einheiten aus. Das stufenweise Einfrieren auf -80 °C brachte ebenfalls gute Ergebnisse, als schlechteste Methode entpuppte sich das Einfrieren auf -20 °C. In einem weiteren Versuch wurde die Eignung von Saccharose und Glucose mit 50% und 100% bezogen auf die Feuchtmasse an Bakterien als Protektantien wahrend des Einfrierens getestet. Die Bakterien wurden in flussigem Stickstoff und bei -80 °C eingefroren. In diesem Fall zeigten interessanterweise sowohl 50% Saccharose als auch 50% Glucose die besseren Ergebnisse.