Aplicação de protocolos e métodos em bioinformática para análise de sequenciamento de exomas humanos = : Application of bioinformatics protocols and methods for human exome sequencing analysis

Os avancos tecnicos em sequenciamento alcancados em menos de uma decada, atrelados ao desenvolvimento e barateamento do sequenciamento de alto desempenho, oferecem-nos a possibilidade de aplicacao dessas tecnologias na medicina genomica. Nesse contexto, surge o sequenciamento do exoma humano, constituido das regioes codificantes do genoma, menor que 2% de sua totalidade. O sequenciamento do exoma (WES) se estabelece hoje como uma ferramenta custo-efetiva com a finalidade de identificar variantes de sequencia relacionadas a varias doencas humanas. A analise atraves da bioinformatica e essencial para lidar com o alto volume de dados gerados e realizar a ligacao entre o experimento biologico e os dados obtidos. Objetivo: Aplicar e avaliar protocolos e aplicacoes disponiveis na analise dos dados gerados pelo sequenciamento de exomas humanos, bem como aplicar e aperfeicoar protocolos e aplicacoes disponiveis para predizer variantes como potencialmente patologicas a partir de dados gerados pelo sequenciamento de exomas humanos. Materiais e metodos: Foram utilizadas as seguintes ferramentas: FastQC, Rqc, BWA, Picard, GATK e VEP. Estas foram entao aplicadas as sequencias do exoma humano possibilitando a identificacao de variacoes nos perfis de qualidade das sequencias, realinhamento local ao redor de insercoes e delecoes, recalibracao da qualidade e posterior chamada das variantes potencialmente envolvidas nos fenotipos em estudo. No intuito de avaliar se a cobertura no exoma sofre variacoes mediante diferencas tecnicas e etnicas, selecionamos amostras do Projeto 1000 Genomas. Resultados: A aplicacao de nosso protocolo em 27 amostras WES resultou em graficos de controle de qualidade pre e pos-alinhamento, que nos permitiram avaliar de modo global os perfis de qualidade destas sequencias; realinhamento ao redor de insercoes e delecoes que ocorreu em mais de 15% da definicao do exoma, realinhando mais de 79% das sequencias; recalibracao da qualidade que nos permitiu minimizar sua variacao por ciclo da reacao. Das sequencias empregadas, 72% foram pareadas ao genoma, contudo 46% se estendem para fora da definicao do exoma, com uma cobertura media de 59x para o exoma estendido e 66x para o exoma restrito. Temos que a cobertura para WES possui uma tendencia a variar de acordo com a metodologia de captura empregada e ao grupo etnico de onde as amostras foram obtidas. Conclusao: A aplicacao de um workflow para interrogacao de variantes que considera a qualidade das sequencias fornecidas pelo sequenciador, o alinhamento contra o genoma, realinhamento ao redor de regioes sabidamente conhecidas como portadoras de variacoes, recalibracao da qualidade e anotacao permitiu identificar variantes de sequencia. Alem disso, atraves da cobertura obtida pelo sequenciamento do exoma foi possivel perceber diferencas tecnicas e populacionais, refletindo que a complexidade do genoma pode interferir na reacao de captura das sequencias, influenciando na efetividade da tecnica empregada. Abstract