PROTEKTIVE WIRKUNG AUSGEWÄHLTER PFLANZLICHER POLYPHENOLE GEGEN OXIDATIVEN STRESS: UNTERSUCHUNGEN AN C6 RATTENGLIOMZELLEN IN VITRO

Der in epidemiologischen Studien beobachtete Zusammenhang zwischen einem hohen Konsum von obst- und gemusereicher Ernahrung und einer erniedrigten Inzidenz von Krebs, kardiovaskularen und altersassoziierten Erkrankungen hat zur Suche nach moglichen protektiven Pflanzeninhaltsstoffen gefuhrt, in der Hoffnung diese therapeutisch nutzen zu konnen. Das wissenschaftliche Interesse gilt unter anderem Polyphenolen, die sich durch ihre antioxidativen aber auch durch ihre antiviralen, antiinflammatorischen und antimutagenen Fahigkeiten auszeichnen. Da ein Therapeutikum uber eine moglichst grose therapeutische Breite verfugen sollte, war es Ziel dieser Arbeit, ausgewahlte Polyphenole einerseits hinsichtlich ihrer Zytotoxizitat und andererseits hinsichtlich ihrer Zytoprotektivitat gegenuber oxidativem Stress zu untersuchen. Die Versuche wurden an Kulturen von C6 Rattengliomzellen durchgefuhrt. Oxidativer Stress wurde mit Hilfe von Wasserstoffperoxid (H2O2), das auf Grund seiner Hydrophilie an vielen Orten in der Zelle wirkt, sowie Cumolhydroperoxid (CHP), einem lipophilen organischen Peroxid, welches seine Wirkung hauptsachlich an der Zellmembran entfaltet, ausgelost. Zu den untersuchten Polyphenolen zahlten das Hydroxystilben Resveratrol und die Flavonoide Quercetin, Galangin, Taxifolin, (+)-Catechin sowie Genistein. Die Exposition mit Peroxiden und / oder Antioxidantien betrug 24 Stunden. Die Versuche zur Zytotoxizitat und Zytoprotektivitat der Polyphenole wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgefuhrt. Als Mas fur die Zellschadigung wurde der Verlust von Zellprotein mit der Methode nach Lowry bestimmt. Die Zytotoxiztat der Polyphenole wurde in Abwesenheit der Peroxide erfasst. Die zytoprotektive Wirkung der Antioxidantien wurde als Hemmung bzw. Verminderung der durch 500 µM H2O2 oder 100 µM CHP ausgelosten Zellschadigung aufgefasst. Zusatzlich wurden Quercetin, Galangin und Taxifolin hinsichtlich ihrer Fahigkeit untersucht, die durch 500 µM CHP induzierte Lipidperoxidation zu hemmen. Die Messung der Lipidperoxidation erfolgte durch die Bestimmung Thiobarbiturat reaktiver Substanzen (TBARS). Parallel zu den Versuchen zur Lipidperoxidation, die in 24-Well-Platten durchgefuhrt worden sind, wurde zusatzlich noch die Zellvitalitat mit Hilfe des MTT Assays ebenfalls in 24-Well-Platten bestimmt, um die Zytotoxizitat bzw. –protektivitat der drei Flavonoide bei hoheren Zellproteinkonzentrationen zu erfassen. Sowohl CHP als auch H2O2 zeigten eine konzentrationsabhangige zytotoxische Wirkung. CHP erwies sich als das potentere Peroxid moglicherweise auf Grund von Unterschieden in der intrazellularen Elimination beider Substanzen. Bereits eine Konzentration von 37,6 ± 12,5 µM CHP reduzierte den Proteingehalt in den 96-Well-Mikrotiterplatten um 50 %. Der EC50-Wert fur H2O2 betrug hingegen 146,8 ± 54,9 µM. Die durch die Peroxide verursachte Zellschadigung wurde in unterschiedlichem Ausmas durch die untersuchten Polyphenole beeinflusst. Quercetin und Galangin haben sich als die wirksamsten Flavonoide erwiesen. Bereits Konzentrationen von 10 µM schutzten die C6 Zellen vor der toxischen Schadigung sowohl durch CHP als auch H2O2. Taxifolin und Resveratrol reduzierten hingegen nur den durch CHP induzierten Zellschaden, wahrend (+)-Catechin und Genistein gar keine protektive Wirkung entfalteten. Gleichzeitig konnte beobachtet werden, dass alle Polyphenole konzentrationsabhangig zum Zellverlust fuhrten. Dabei stellte sich Genistein mit einem EC20-Wert von 8 µM als das Flavonoid mit der hochsten zytotoxischen Potenz dar, gefolgt von Quercetin, Galangin, Resveratrol und Taxifolin. (+)-Catechin hatte den geringsten zytotoxischen Effekt mit einem EC20-Wert von 358 µM. Die positive Korrelation der EC20-Werte und der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten der Polyphenole lasst auf einen Zusammenhang zwischen Lipophilie und zytotoxischer Aktivitat schliesen. Die drei Polyphenole Quercetin, Galangin und Taxifolin verminderten die durch 500 µM CHP induzierte Lipidperoxidation. Jedoch war eine signifikante Reduktion der TBARS-Produktion nur bei Quercetin (ab 5 µM) und Taxifolin (ab 20 µM) nachweisbar. Eine signifikante zytoprotektive Wirkung im parallel durchgefuhrten MTT-Test konnte nur fur Quercetin bei 10 und 20 µM belegt werden. Zwar konnte in dieser Arbeit eine Zytoprotektion vor oxidativem Stress durch bestimmte Polyphenole wie Quercetin und Galangin nachgewiesen werden, jedoch lagen die protektiven Konzentrationen nah am zytotoxischen Bereich, so dass ein therapeutischer Nutzen kritisch hinterfragt werden muss. Andererseits sind in der Literatur protektive Effekte durch Polyphenole beschrieben, die teilweise bereits im nanomolaren Konzentrationsbereich auftraten, moglicherweise auf Grund von Wirkmechanismen, die in dem in dieser Arbeit verwendeten Testsystem nicht erfasst werden konnten.