Diagnosis of ferlaviruses in snakes and characterization of isolates based on gene sequences

PMV are important pathogens for reptiles especially snakes and have been isolated from wild and private collections. During a period (2009-2011), a total of 495 clinical samples originating from 251 snakes of several families including Boidae, Pythonidae, and Colubridae were screened for the presence of PMV by RT-PCR described by Ahne et al. (1999) targeting a partial sequence of the L gene and virus isolation on the reptilian cell line viper heart cells (VH2). Samples with positive amplicons (566 bp, L gene) were subjected to RT-PCR targeting partial sequence of HN as described by Ahne et al. (1999) and Marschang et al. (2009) and U gene as described by Marschang et al. (2009). All RT-PCR positive amplicons were subjected to sequencing in order to exclude false positive results. Phylogenetic analyses using several programs (Phylip 3.36 and Mega 5.05) were carried out to explore the associations between the viruses detected and to broaden our understanding of their taxonomic relationships. Unspecific size products and specific size products with non specific amplicons were repeatedly obtained using the previously published protocol. Several trials were therefore carried out in an attempt to increase the specificity of the original RT-PCR protocol (Ahne et al., 1999) including optimization and sensitivity tests. Several concentrations of MgCl2 (1, 1.5, 2, 2.5) mM and different annealing temperatures (45, 48 and 51) Co were used in order to eliminate the unspecific size products. Sensitivity tests using several ferlavirus isolates were conducted using new degenerate primers targeting the conserved L gene. Changes in annealing temperature and MgCl2 concentration did not decrease the number of unspecific reactions detected. Sensitivity tests showed that the RT-PCR protocol described by Ahne et al. (1999) has the highest sensitivity. However, this protocol has been shown to be highly unspecific. Sequencing of RT-PCR products is therefore necessary to ensure specific results. Ferlaviruses were detected in 5.97% of the snakes tested (15 of the 251 snakes screened). All ferlavirus positive snakes were from the families Colubridae and Pythonidae. The low infection rate might indicate a fluctuation in the infection rate. A total of six different partial L gene sequences were obtained from 19 RT-PCR products using RT-PCR (L gene) and verified by sequencing. Three of these products clustered within subgroup B isolates. The one detected in an Indian python was 97% similar to FDLV (AY141760.2) (Subgroup A). Two (Pangut GER09 and Hobuc HUN09) were not assigned to subgroup A or B. However, they clustered together forming the first two representatives of the novel subgroup C within the Ferlavirus genus extending its classification into three squamate subgroups; A, B and C. Concurrent viral infections (PMV, reo and AdV) were detected in a group of corn snakes in Germany which highlight the significance for testing for different pathogens and different organs and tissues. In order to assess the degree of genetic diversity within this group of viruses, complete CDS regions of the F and HN genes from nine ferlaviruses were sequenced and compared (on both nt and deduced aa sequence levels) with each other and with the corresponding sequences of other genera of the Paramyxovirinae. Phylogenetic analyses were conducted for each gene separately and for the concatenated sequences of F, HN and the extended portion (1544 nts) of L gene. On a genomic level, squamate ferlaviruses are closely related; however they are distributed into three different genogroups (A, B and C). Deduced animo acid sequences of both F and HN genes of all ferlavirus isolates revealed conserved domains corresponding to those described for other members of the Paramyxovirinae. However, the chelonid ferlavirus showed for both genes and for some motifs some differences to the squamate (snake and lizard) group. PMV sind bedeutende Krankheitserreger bei Reptilien und konnten sowohl aus wildlebenden als auch in Gefangenschaft gehaltenen Populationen isoliert werden. Uber einen Zeitraum von drei Jahren (2009-2011) wurden insgesamt 495 klinische Proben von 251 Schlangen verschiedener Familien wie Boidae, Phytonidae und Colubridae auf PMV untersucht, dabei wurde das Virus mittels RT-PCR nach Ahne et al. (1999), die auf das L-Gen des Virus abzielt nachgewiesen und Virusisolation durch Vermehrung in VH2 (Viper Herz Zellen) durchgefuhrt. Proben mit positivem PCR-Ergebnis (566 bp, L-Gen) wurden weiterhin in RT-PCRs, welche auf die Gene HN und U abzielen, getestet. Alle positiven PCR-Ergebnisse wurden sequenziert um falsch-positive Resultate auszuschliesen. Die erhaltenen Sequenzen wurden des Weiteren phylogenetische Analysen mit unterschiedlichen Programmen (Phylip 3.36 und Mega 5.05) unterzogen um die genetischen Relationen zwischen den Subtypen weiter zu erforschen und das Verstandnis der taxonomischen Zusammenhange zu erweitern. Produkte mit unspezifischer Lange und Produkte mit spezifischer Lange aber unspezifischen Amplicons Sequencen wurden wiederholt getestet. Dafur wurden verschiedene Anpassungen des ursprunglichen Protokolls (Ahne et al, 1999) vorgenommen. Auserdem wurden Sensitivitatstests anhand neuer Primer, welche auf das konservierte L-Gen abzielten, durchgefuhrt. Veranderungen der Annealing Temperatur und der MgCl2 Konzentration hatten keinen Effekt auf die Anzahl unspezifischer Reaktionen. Sensitivitatstests zeigten, dass das RT-PCR Protokoll nach Ahne et al. (1999) die hochste Sensitivitat aufweist. Da die PCR nach diesem Protokoll jedoch einen hohen Anteil falsch positiver Resultate aufweist, sollten, um spezifische Ergebnisse zu erhalten, die Produkte stets sequenziert werden. Insgesamt wurden in 5.97% der getesteten Schlangen (15 von 251 Tieren) Ferlaviren nachgewiesen, dabei gehorten alle positiv getesteten Tiere den Familien Colubridae und Phytonidae an. Die in der Studie gemessene geringe Infektionsrate konnte durch eine Schwankung in der Gesamtinfektionsrate zustande gekommen sein. Aus den 19 RT-PCR Produkten wurden sechs unterschiedliche partielle L-Gen Sequenzen nachgewiesen. Drei dieser Produkte liesen sich dem Subtyp B zuordenen, eines aus einer indischen Phyton wies 97% Homologie zum FDLV (AY141760.2), (Subgruppe A), auf. Zwei Isolate (Pangut GER09 and Hobuc HUN09) konnten in keines der bestehenden Cluster der Subtypen A oder B eingeordnet werden. Sie bildeten zusammen eine eigene Gruppe und sind damit die ersten Mitglieder des neuen Subtyps C innerhalb des Genus Ferlavirus, welches nun erweitert und in die drei squamaten Subgrupen A, B und C unterteilt werden kann. Es wurden multiple Virusinfektionen (PMV, reo und AdV) in einer Gruppe von Kornnattern/Kornschlangen in Deutschland entdeckt, was die Bedeutung des Testens verschiedener Pathogene und unterschiedliche Organe und Geweben hervorhebt. Um den Grad der genetischen Diversitat innerhalb dieser neuen Virusgruppe einzuschatzen, wurden die kompletten CDS Regionen der Gene F und HN von neun Ferlaviren sequenziert und untereinander und mit entsprechenden Sequenzen anderer Mitglieder der Paramyxovirinae verglichen (sowohl auf der Ebene der Nukleotidsequenzen als auch der abgeleiteten Aminosaure-sequenz). Die phylogenetischen Analysen wurden dabei zum einen fur jedes Gen separat und des weiteren anhand der aneinandergereiten Sequenzen der Gene F, HN und einem erweiterten Anteil des L-Gens (1544 Nuckleotide) durchgefuhrt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die squamaten Ferlaviren auf genomischer Ebene eng miteinander verwandt sind, sich jedoch in drei verschiedene Genogruppen (A, B und C) aufspalten. Hergeleitete Aminosauresequenzen der F und HN Gene aller Ferlavirusisolate in dieser Studie zeigten konservierten Domanen ubereinstimmend mit denen anderer Mitglieder der Paramyxovirinae, allerdings konnten in beiden Genen und einigen Motiven Unterschiede zwischen dem cheloniden Ferlavirus und den squamaten Isolaten (Schlangen und Echsen) nachgewiesen warden.