Screening, biochemische Charakterisierung und Strukturaufklärung mikrobieller Threonin-Aldolasen

Aldolasen, die die C-C-Verknupfung von Benzaldehyd und Glycin unter Bildung von Phenylserin katalysieren, sind im Prinzip literaturbekannt, naturlicherweise handelt es sich dabei um Threonin-Aldolasen. Da bei dieser Synthese zwei neue Asymmetriezentren (in α- und s-Position) gebildet werden, werden allerdings hohe Anforderungen an die Enantio- und Diastereoselektivitat dieser Enzyme gestellt. Bei Auswertung der Literaturdaten zeigt sich, dass die bislang beschriebenen Enzyme Produkte bilden, die durchweg in α-Position eine hohe Enantioselektivitat (> 99% ee) zeigen, wahrend alle bislang bekannten Enzyme nur eine niedrige Diastereoselektivitat in β-Position aufweisen. Threonin-Aldolasen und verwandte Enzyme mit Threonin-Aldolase-Aktivitat (z.B. die Serinhydroxymethyltransferasen SHMTs) konnen fur die Synthese von multifunktionellen β-Hydroxy-α-aminosauren genutzt werden, da sie in der Lage sind, die stereoselektive C-C Knupfung unter Entstehung zweier neuer Chiralitatszentren in einem einzelnen Schritt zu katalysieren. Diese β-Hydroxy-α-aminosauren sind bedeutende chirale Bausteine fur die Synthese biologisch aktiver Molekule, die in den letzten Jahren fur chemisch industrielle Prozesse, insbesondere fur die Pharma-Industrie, an steigendem Interesse gewonnen haben. Jedoch gibt es einige Limitierungen der Threonin-Aldolase-Reaktion, wie die meist unzureichenden Umsatze und Ausbeuten und die geringen Diastereoselektivitaten im Vergleich zu exzellenten Enantioselektivitaten (bis zu 99% ee). Ziel dieser Arbeit war es, verbesserte Enzyme mit optimierter Diastereoselektivitat fur die Synthese der chiralen β-Hydroxy-α-aminosauren zu identifizieren und zu isolieren und somit den Limitierungen der konventionellen chemischen Synthese-Prozesse nachzukommen. Zwei literaturbekannte Enzyme (aus E. coli und Saccharomyces cerevisiae) sind fur dieses Projekt rekombinant verfugbar gemacht worden, da sie als Referenzenzyme fur methodische Ausarbeitungen gut einsetzbar sind, beispielsweise fur die Entwicklung einer Immobilisierungsmethode, fur die Etablierung einer Enantio- und Distereomeren-Analytik oder die Ausarbeitung einer Hochzelldichte-Fermentation zur Gewinnung groserer Zellmassen. Ausgehend von der Threonin-Aldolase LTAE aus E. coli wurde eine gezielte Mutagenese durchgefuhrt, um optimierte Enzyme mit verbesserter Diastereoselektivitat zu erhalten. Eine Mutante zeigte eine verbesserte Diastereoselektivitat im Vergleich zum Wildtyp-Enzym und eine sehr hohe Aktivitat fur die Spaltung von Threonin in der Retro-Aldolreaktion. Auserdem wurde die LTAE im Rahmen dieser Arbeit kristallisiert und die Struktur des Enzyms (sowohl Apo-Enzym als auch Enzym mit Substrat Glycin) aufgeklart. Mittels verschiedener Screeningansatze sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Threonin-Aldolasen mit optimierter Diastereoselektivitat fur die Synthese eines relevanten Intermediates der Thiamphenicol-Synthese, einer s-Hydroxy-α-aminosaure, zuganglich gemacht werden. Ziel war es hierbei, hoch threo-spezifische Enzyme zu identifizieren, da nur die threo-Verbindung als chirales Intermediat fur Folgesynthesen von groser Bedeutung ist. Hierbei wurde zum einen definierte Stammsammlungen nach neuen, vielversprechenden Enzymen durchsucht, zum anderen wurden verschiedene Bodenproben mit der zu verwertenden Kohlenstoff-Quelle (Phenylserin, einer s-Hydroxy-α-aminosaure) angereichert und auf Threonin-Aldolase-Aktivitat getestet. Auserdem wurde ein „in Silico“-Screening auf Basis der beiden bekannten Threonin-Aldolase-Sequenzen (E. coli und S. cerevisiae TA) durchgefuhrt. Der Zugang zu den neuen Enzymen sollte durch eine selektionsbasiertes Screening mithilfe eines speziellen Selektions-Systems in Pseudomonas putida KT2440 gewahrleistet werden. Dieser Stamm ist in der Lage auf Benzaldehyd, dem Spaltprodukt der Threonin-Aldolase-Reaktion ausgehend von Phenylserin als Substrat, zu wachsen, indem er dieses im Mandelat-Abbauweg verstoffwechselt. Jedoch verfugt der Stamm auch uber eine eigene, aktive Threonin-Aldolase (PpTA), die ebenfalls naher untersucht wurde, und kann nur nach Deletion dieses Gens als Selektions-Stamm fur die Identifizierung neuer Aldolase-Gene genutzt werden. Die Konstruktion dieser Deletionsmutante des Selektions-Stammes konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr erfolgen. Die verschiedenen Screening-Ansatze erwiesen sich als erfolgreich. Es konnten neue Enzyme mit deutlich verbesserten d.r. -Werten in der Aldolreaktion fur die s-Hydroxy-α-aminosaure Phenylserin gefunden werden. Enzyme mit sehr guten Diastereoselektivitaten fur die threo-Verbindung als Produkt wurden in in Bodenproben-Stammen, durch Anreicherung dieser Organismen mit Phenylserin, gefunden. Diese lieferten im Vergleich zu den bisher in der Literatur beschriebenen Enzymen signifikant verbesserte Resultate fur die enzymatische Aldolreaktion. Das ”in Silico-Screening” lieferte 5 neue rekombinante Enzyme mit threo-Spezifitat, wobei hier die Umsatze fur die enzymatische Aldreaktion sehr hoch waren. Die Etablierung des Selektions-Systmes in P. putida durch Deletion des Stamm-eigenen TA-Gens wurde einen Zugang zu diesen neuen Threonin-Aldolase-Genen liefern.