Das BEM46 Protein in Neurospora crassa : Eisosomale Lokalisation und Verknüpfung mit der Tryptophan-abhängigen Auxin-Biosynthese

In allen Genomen von eukaryotischen Organismen wird mindestens ein BEM46-Homolog kodiert, jedoch ist die genaue Funktion des Proteins bisher weitgehend unklar. Die geringe uber das BEM46 Protein publizierte Datenmenge lasst vermuten, dass BEM46 eine Rolle im polaren Wachstum spielt. Da Ascomyceten als Modellsystem fur polares Wachstum fungie-ren, konzentrieren sich die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit auf das BEM46 Protein in Neurospora crassa. In fruheren Studien wurden zwei bem46-transformante N. crassa-Stamme (RNAi-vermittelte knock-down- und Uberexpressions-Transformante) hergestellt und zum Teil phanotypisch untersucht. Die Transformanten zeigten eine auf 0% reduzierte Ascosporen-Keimungsrate mit einzelnen so genannten survival Meiosporen, die ihre Fahigkeit zum polaren Wachstum verloren haben. Nach erfolgreicher Herstellung einer knock-out-Mutante wurden die phano-typischen Analysen aller transformanten und mutanten Stamme wiederholt und ausgeweitet. Die Ascosporen-Keimungsrate der knock-out-Linie ist um 50% reduziert. Das vegetative My-zelium der Transformanten und der Mutante zeigt normales Hyphenwachstum und Konidio-phor-Bildung, jedoch sind die Konidienkeimung und das Wachstum der jungen Hyphen von der bem46-Expression beeinflusst. Die Anthranylat-Synthase Komponent II (trp-1), die als Enzym einen Schritt der Tryptophan-Biosynthese katalysiert, wurde als Interaktionspartner des BEM46 Proteins in N. crassa identifiziert. Die Interaktion wurde durch bimolekulare Fluo-reszenzkomplementation (split-YFP) in vivo bestatigt. Tryptophan dient als Vorlaufer diverser Botenstoffe darunter Auxin. Da die Publikationen zur Auxin-Produktion in N. crassa nicht uber die herkommlichen Datenbanken erhaltlich sind, waren die Ergebnisse in der gegen-wartigen Forschung nicht bekannt. Folglich wurde im ersten Schritt die Fahigkeit des N. crassa Wildtyp-Stammes zur Auxin-Biosynthese untersucht und mit Hilfe von indirektem (mit Hilfe von DR5::GUS A. thaliana Pflanzen) und direktem (mit Hilfe von Dunnschichtchromato-graphie) Verfahren nachgewiesen. Durch bioinformatische Analysen wurde ein putativer Au-xin-Biosyntheseweg in N. crassa identifiziert. Die relative Indolproduktion der Δtrp-1- (erhalten uber FGSC) und Δbem46-Mutante sowie der bem46-Transformanten wurde in diversen Entwicklungsstadien ermittelt. Wahrend der Keimungsphase der Asco- und Konidiosporen produzieren die mutanten und transformanten Stamme Auxin in signifikant unterschiedlichen Mengen. Die Expression der fur die Enzyme des putativen Biosyntheseweges kodierenden Gene ist auch signifikant abweichend (Bonniger 2013). Die Untersuchungen fuhren zu dem Ergebnis, dass das BEM46 Protein mit der Auxin-Biosynthese von N. crassa verknupft ist. Obwohl die Ergebnisse eine Verbindung zwischen BEM46 und der Auxin-Biosynthese in N. crassa postulieren, scheint die Interaktion komplex und der Wirkungsmechanismus bleibt unbekannt. Mit Hilfe von PCR und einer anschliesenden Sequenzierung wurden Hinweise auf alternati-ves Spleisen des bem46-Transkripts in N. crassa gewonnen. Die Wirkung der alternativen Fragmente wurde untersucht und es wurde gezeigt, dass sie fur die Reduktion der Ascospo-renkeimung in den Transformanten und in der Mutante verantwortlich sind. Der Einfluss der kleinen Transkripte auf die Indolproduktion wurde auch beobachtet. Es wurde gezeigt, dass das BEM46 Protein von N. crassa in dem endoplasmatischen Reti-kulum sowie in den Eisosomen lokalisiert ist. Auch der neutrale Aminosauren-Transporter MTR wurde in den Eisosomen von N. crassa nachgewiesen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass das BEM46 Protein von N. crassa an dem Kreuzungspunkt von Tryptophan-Aufnahme und intrazellularer Tryptophan-abhangiger Auxin-Biosynthese agiert und uber die Auxin-Produktion das polare Wachstum des Pilzes abhangig von den Entwicklungsstadien beeinflusst.