Motor neuron differentiation in the developing and the regenerating adult spinal cord of zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822).

Im Gegensatz zu Saugetieren besitzt der Zebrafisch die Fahigkeit zur funktionellen Ruckenmarksregeneration. Dabei sind Motorneurone ein wichtiger postsynaptischer Zelltyp fur Axone die vom Hirnstamm her regenerieren. Das Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob Motorneurone im ladierten Ruckenmark regenerieren und die Differenzierungssignale fur Motorneurone wahrend der adulten Regeneration und der Embryonalentwicklung zu erforschen. Es konnte gezeigt werden, dass grosse, differenzierte Motorneurone nach einer kompletten Ruckenmarksdurchtrennung vorubergehend verloren gehen und nach erfolgter Regeneration wieder nachweisbar sind. Um dies zu zeigen, wurden transgene Tiere mit Reportergenen fur die Motorneuronmarker HB9 bzw. islet-1 und immunhistochemische Marker zur Darstellung von Motorneuronen verwendet. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass Motorneurone durch verletzungsbedingten Zelltod verloren gehen und dann im Zuge der Regeneration ersetzt werden. Tatsachlich kann eine transiente, massive Zunahme kleiner, undifferenzierter Motorneurone beobachtet werden. Mit Hilfe des Proliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU) konnte nachgewiesen werden, dass diese undifferenzierten Motorneurone neu gebildet wurden. Eine signifikante verletzungsbedingete Prolifertation wurde nur am Ventrikel festgestellt. Ferner zeigte sich durch „lineage tracing“, dass eine olig2 exprimierende Subpopulation der ventrikularen Ependymo-Radialgliazellen die vermutlichen Stammzellen oder Progenitorzellen fur Motorneurone im Ruckenmark darstellen. Eine Ruckenmarksdurchtrennung im adulten Zebrafisch fuhrt zu einer Erhohung der Expression von sonic hedgehog (shh), einem Differenzierungssignal fur Motorneurone wahrend der Embryonalentwicklung. Intraperitoneale Injektion des shh -Antagonisten Cyclopamin wahrend der Regeneration blockiert diesen Signalweg und fuhrt zu einer signifikanten Reduktion der Proliferation von Progenitorzellen sowie der Motorneurondifferenzierung. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass shh eine zentrale Rolle fur die Regeneration von Motorneuronen im adulten Zebrafisch einnimmt. Um die axonalen Differenzierung von Motorneuronen genauer zu erforschen, wurde die Funktion des Zellerkennungsmolekuls plexinA3 bei dem Auswachsen embryonaler primarer Motoraxone untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass plexinA3 spezifisch von primaren Motorneuronen exprimiert wird. Eine experimentelle Verringerung der Expression dieses Proteins mittels Injektion von anti-sense Morpholino-Oligonukleotiden bewirkt ein ektopisches Auswachsen aus dem Ruckenmark sowie exzessives Verzweigen der Axone primarer Motorneurone. In einem “Rescue-Experiment” konnte durch Uberexpression von plexinA3 der Morpholino-Effekt neutralisiert werden. Dies belegt die Spezifitat der genetischen Manipulation und zeigt das plexinA3 auserst wichtig fur die axonale Wegfindung wahrend der Entwicklung ist. Abschliesend kann festgestellt werden, dass der adulte Zebrafisch unter Kontrolle von shh zur Regeneration von Motorneuronen fahig ist. Als Quelle fur diese neu entstehenden Motorneurone dienen endogene Progenitor- oder Stammzellen. Bei der axonalen Wegfindung von primaren Motorneuronen wahrend der Embryogenese spielt plexinA3 eine Schlusselrolle. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse uber Motorneuronendifferenzierung im Zebrafisch, konnen schlussendlich helfen, neue Strategien fur die Regeneration von Motorneuronen nach Ruckenmarksverletzungen oder Behandlungen fur Erkrankungen der Motorneuronen, wie beispielsweise der amyotrophen Lateralsklerose, zu entwickeln. Zebrafish, in contrast to mammals, are capable of functional spinal cord regeneration. Spinal motor neurons are major targets for axons regenerating from the brainstem. Using immunohistochemical markers and transgenic reporter fish for motor neuron markers (HB9, islet-1), this study demonstrates that large differentiated motor neurons are transiently lost after a spinal lesion, suggesting that these cells undergo cell death after a lesion and may be replaced by proliferation. Indeed, a massive and transient increase in the number of small, undifferentiated motor neurons, which were labelled by the proliferation marker bromodeoxyuridine, was observed. Proliferation and lineage tracing studies indicated significant proliferation only at the spinal ventricle and that a subset of olig2 expressing ependymo-radial glial cells are the likely motor neuron progenitor/stem cells in the lesioned spinal cord. A spinal lesion increased expression of sonic hedgehog (shh), an embryonic differentiation signal for motor neurons. Blocking this signal with an antagonist reduced progenitor cell proliferation and motor neuron differentiation. This suggests that shh is an important signal for motor neuron differentiation during adult motor neuron regeneration. To learn more about axonal differentiation of motor neurons, the role of the cell recognition molecule plexinA3 was investigated during the outgrowth of embryonic primary motor axons. The molecule is selectively expressed in primary motor neurons. Knockdown of expression led to ectopic exiting from the spinal cord and excessive branching of motor axons. Over-expression of full length plexinA3 rescued this effect, indicating specificity of experimental manipulations. Thus, plexinA3 expression is crucial for motor axon pathfinding during development. Overall, this study demonstrates that adult zebrafish are capable of motor neuron regeneration from endogenous progenitor/stem cells and that shh is an important regulator of motor neuron regeneration. PlexinA3 is crucial for motor axon differentiation in embryonic zebrafish. This study establishes adult spinal cord lesion as a model system for motor neuron regeneration, which may ultimately help to find ways to promote motor neuron regeneration also in human conditions, such as spinal cord injury or motor neuron disease.