Analisi mutazionale dei geni del mismatch repair (MMR) mediante tecniche innovative in pazienti affetti da cancro ereditario non poliposico del colon-retto (HNPCC)

Il cancro ereditario non poliposico del colon-retto (HNPCC) e una sindrome autosomica dominante, che include circa il 6% delle forme di cancro colo-rettale (CRC) ereditarie ed e associato alla presenza di una mutazione germinale in uno dei geni del “MisMatch Repair” (MMR), MSH2, MLH1, PMS2, MSH6 e MLH3. I geni MMR piu frequentemente mutati sono MLH1 e MSH2, che risultano mutati rispettivamente nel 49% e 38% dei casi HNPCC. L’alterazione di uno di questi geni nella linea germinale si riflette in un’aumentata velocita di accumulo di errori di replicazione, che si traduce nel fenotipo RER (Replication Errors), particolarmente evidente a livello dei microsatelliti. Tuttavia, essendo il tumore sporadico del colon-retto molto frequente, e necessaria un'attenta e corretta anamnesi clinica per l'identificazione di famiglie HNPCC. Nel nostro studio sono stati analizzati 77 soggetti di 54 famiglie con diagnosi clinica di HNPCC nei quali e stata condotta un’indagine genetico-molecolare dei 2 geni MMR maggiormente coinvolti, MLH1 e MSH2. Mediante DHPLC e successiva analisi di sequenza e stato possibile identificare 17 mutazioni responsabili della malattia (8 in MLH1, 2 in MSH2 e 7 in MSH6) in 16 delle 54 famiglie HNPCC. Otto di queste sono nuove mutazioni non ancora descritte in letteratura. Per valutare il grado di instabilita dei microsatelliti e stato analizzato il cosiddetto “pannello di Bethesda” che comprende 3 ripetizioni dinucleotidiche e 2 ripetizioni mononucleotidiche. In piu sono state analizzate tre nuove ripetizioni mononucleotidiche quasimonomorfiche NR21, NR22 e NR24, apparse piu instabili in linee cellulari del colon con mutazioni in MSH6. I tessuti tumorali dei pazienti portatori di mutazioni in MSH6 hanno presentato un fenotipo MSI-L con maggiore instabilita a livello delle sequenze mononucleotidiche: in particolare, NR21 e NR22. Questo indica che tali ripetizioni potrebbero essere analizzate per individuare i pazienti portatori di mutazioni nel gene MSH6. Allo scopo di verificare se l’alterazione fosse dovuta ad ampie delezioni o duplicazioni e stata messa a punto una nuova metodica la Multiplex Ligation-Probe Dependent Amplification (MLPA). Mediante tale metodica sono state identificate 2 delezioni nel gene MSH2 e una nel gene MLH1 e la duplicazione di 2 esoni nel gene MSH2. Questo studio conferma l’estrema eterogeneita genotipo-fenotipo che caratterizza l’HNPCC e l’estrema variabilita fenotipica tra i familiari affetti. Inoltre, l’MLPA e risultato un metodo sensibile e specifico per l’identificazione di ampi riarrangiamenti nei geni MLH1 e MSH2 e dunque, potrebbe essere considerato una tappa fondamentale nel protocollo da seguire per la diagnosi di cancro ereditario non poliposico del colon. / [ENGLISH] Hereditary non polyposis colorectal cancer (HNPCC) is an autosomal dominantly inherited predisposition for early onset colorectal cancer; it accounts for at least 6% of all colorectal malignancies and it is associated with germline mutations in mismatch repair (MMR) genes: MSH2, MLH1, PMS2, MSH6 and MLH3. Until now 477 point mutations predisposing to HNPCC have been characterized; so far, few large genomic rearrangements within MMR genes have been described. In this work we present 8 novel mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 genes and 4 large rearrangements in MLH1 and MSH2 genes. The identification of mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 genes have been performed by a combination of denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and DNA sequencing techniques. Moreover, we set up a novel tecnique, the multipex ligation dependent probe amplification (MLPA), for detection of genomic deletions in MLH1 and MSH2 genes, notoriously undetectable using conventional diagnostic techniques. We have analysed the DNA of seventy-seven patients of 54 families with clinical diagnosis of HNPCC and identified the specific mutation in 27/54 families: eight mutations are located in MLH1 gene, 3 in MSH2 and 7 in MSH6; of these, eight are novel germline mutations. The microsatellite instability (MSI) phenotype is a characteristic of the HNPCC (95%). To evaluate MSI, a reference panel was proposed at an international consensus meeting, comprised of 2 mononucleotide and 3 dinucleotide repeats. Moreover we have analysed 3 new mononucleotide repeats that are quasimonomorphic and that appear unstable in colon cell lines that show mutations in MSH6. The patients carriers of MSH6 mutations presented MSI-Low, with more instability at the mononucleotide markers. This indicates that the mononucleotide quasimonomorphic repeats might also be used for the detection of tumors mutated in MSH6. Finally, using the MLPA technique, we have identified a deletion of exon 19 in MLH1 gene and two deletions in MSH2 gene: a deletion exons 4 and 5 in one case and of exon six in another; moreover we identified a duplication of exon 1-2 in MSH2 gene. This study reinforces the notion of the remarkable heterogeneity of the mutational spectrum in HNPCC that gives rise to an extreme variability of the clinical expression between affected familiars. Moreover, MLPA appears to be a sensitive, specific and simple method for the detection of genomic deletion in MLH1 and MSH2 and might be considered as a part of the mutation detection protocols in the molecular diagnosis of hereditary non polyposis colorectal cancer.