Microbial analysis by microencapsulation and its application to study proliferation heterogeneity.

El interes hacia la produccion de microcapsulas ha aumentado en los ultimos anos significativamente debido a la gran cantidad de aplicaciones potenciales en diversos campos tales como la bioquimica, biomedicina, farmacia, microbiologia y ciencia medioambiental, entre otros (Martin-Banderas, Flores-Mosquera et al. 2005). Mas concretamente, la bioencapsulacion supone uno de los avances biotecnologicos mas relevantes en los ultimos veinte anos. Este termino engloba el desarrollo de tejidos o sustancias biologicamente activas en el interior de membranas semipermeables que protegen las estructuras biologicas de posibles agresiones externas. Asi, en los ultimos anos la principal aplicabilidad de esta tecnologia ha ido encaminada al tratamiento de una amplia variedad de enfermedades incluyendo la anemia, la hemofilia B, fallos en el higado o el rinon, insuficiencias del sistema nervioso central y diabetes mellitus. De manera mas reciente, las microcapsulas tambien se han usado como vehiculo biodegradable para la proliferacion de celulas madres asi como su administracion in vivo (Orive and Pedraz 2010). En este trabajo abordamos esta herramienta desde un punto de vista muy diferente . Asi, vamos a usar la microencapsulacion como herramienta para encapsular la levadura Saccharomyces cerevisiae y otros microorganismos con el fin de dar respuesta a algunas preguntas biologicas. Esta tesis se divide en tres partes: “Desarrollo de nuevas metodologias para el estudio de microorganismos”, “Analisis transcriptomico de la heterogeneidad en S. cerevisiae” y “Papel del envejecimiento replicativo en heterogeneidad de poblaciones” En la primera de ellas se describe el desarrollo de un protocolo de encapsulacion facilmente reproducible en laboratorios que permite la monitorizacion del crecimiento de microorganismos tanto por microscopia optica como por citometria de flujo, para obtener informacion a nivel de poblacion celular. Para ello hemos usado la tecnologia Flow Focusing, patentada por Ingeniatrics Tecnologias, S.L. Usando esta tecnologia se han realizado analisis geneticos y escrutinios tanto en levaduras (Gomez-Herreros, de Miguel-Jimenez et al. 2012), como en hongos filamentosos (Delgado-Ramos, Marcos et al. 2014). En la segunda parte se describen los resultados procedentes de un estudio transcriptomico de la heterogeneidad en una cepa silvestre de S.cerevisiae mediante microencapsulacion como herramienta para detectar diferentes poblaciones segun su nivel proliferativo y citometria de flujo para seleccionar las poblaciones de interes. Los resultados de este analisis transcriptomico indican que una poblacion clonal, aun siendo geneticamente homogenea, es heterogenea en el modo en que la informacion genetica es expresada y nos ha permitido proponer varios mecanismos que podrian explicar la existencia de subpoblaciones con diferentes tasas proliferativas dentro de una poblacion isogenica (Garcia-Martinez, Delgado-Ramos et al. 2016) Por ultimo, en el capitulo final de esta tesis, se describen experimentos cuyos resultados conectan el envejecimiento replicativo con la heterogeneidad proliferativa de una poblacion de celulas. En concreto, el envejecimiento apunta a ser la causa de la baja capacidad proliferativa en un pequeno porcentaje de la poblacion. A su vez, se propone una posible conexion entre un importante regulador del ciclo celular, Whi5, con el envejecimiento en levaduras. Finalmente, se discute el impacto de nuestros resultados en el campo cientifico. Asi, aunque la heterogeneidad entre celulas individuales es obvia en diferentes tejidos y organismos, vemos que tambien puede ser observada en poblaciones monoclonales de celulas que han sido cultivadas bajo identicas condiciones (Pelkmans 2012). Sin embargo, existe una falta de conocimiento sobre el origen de esta variacion . Esta heterogeneidad puede ser resultado de eventos estocasticos o puede ser mantenida de forma deliberada a traves de procesos regulatorios. En este ultimo caso, la heterogeneidad deberia conferir alguna ventaja selectiva que beneficie a la poblacion total (Yuan, Wulf et al. 2011). Nuestro trabajo ha revelado algunos de los mecanismos que provocan heterogeneidad proliferativa a nivel de poblacion y que parecen ser heredados epigeneticamente de celula madre a celula hija. Para ello hemos usado una tecnologia novedosa, que no solo ha contribuido al estudio de este campo sino al analisis microbiano en general.