Genotipado de las especies de Leishmania y variabilidad intraespecífica de L. infantum. Aportaciones al diagnóstico molecular y a la epidemiología de las leishmaniosis

Los trabajos presentados en esta tesis doctoral se han basado en el uso, diseno y optimizacion de herramientas moleculares para facilitar el diagnostico de las leishmaniosis humanas y de reservorios animales, asi como para favorecer el conocimiento del agente causal a nivel interespecifico e intraespecifico. Para el tipado interespecifico de Leishmania spp se ha optimizado un metodo basado en la lectura del tamano de fragmentos marcados con fluorescencia, metodologia denominada PCR-FFL (PCR-Fluorescent Fragment Length analysis). No solo se han buscado mejoras en la tecnica analitica, sino tambien en la sensibilidad evaluando la capacidad discriminatoria de la PCR-FFL sobre dos dianas distintas, las secuencias ribosomicas ITS-1 y 7SL, obteniendose mejores resultados en cuanto a sensibilidad sobre 7SL. La comparacion con la metodologia clasica de PCR-RFLP nos ha permitido observar que a nivel metodologico la PCR-FFL presenta ventajas importantes, como la simplicidad y exactitud en la lectura de los resultados, gracias a la automatizacion del analisis. El uso de la PCR-FFL con ambas dianas sobre biopsia de piel o bien utilizando papeles de filtro representa una buena metodologia para el diagnostico y tipado interespecifico por su especificidad, exactitud, objetividad, elevada sensibilidad y rapidez en la obtencion de los resultados. La aplicacion de metodologias moleculares en estudios epidemiologicos se ha dirigido a la deteccion de Leishmania en dos especies de erizos presentes en la zona de alta endemia de M’sila (Argelia): Atelerix algirus y Paraechinus aethiopicus, con el objetivo de determinar su papel como posibles nuevos reservorios del parasito. El estudio serologico ha revelado contacto pasado o reciente con el parasito. La posterior deteccion de ADN de Leishmania en estos animales mediante una qPCR de genero de alta sensibilidad nos ha permitido confirmar la infeccion activa de los erizos en el momento del estudio. El genotipado de Leishmania sobre muestra se ha determinado mediante PCR-FFL, permitiendo identificar la especie L. major en una muestra de piel de los erizos estudiados. Para aumentar la sensibilidad del analisis, se ha realizado una doble amplificacion mediante nested-PCR que ha permitido la identificacion de L. major en todas las muestras restantes. Estos resultados han senalado por primera vez la existencia de L. major en erizos, y el papel de estos como posibles reservorios de esta especie en el area estudiada. El tercer objetivo de nuestro estudio ha consistido en analizar la diversidad intraespecifica de Leishmania infantum en sucesivos aislados del parasito obtenidos de pacientes co-infectados con Leishmania/VIH que presentan recaidas clinicas despues del tratamiento, mediante el analisis de 20 microsatelites considerados polimorfos para L. infantum. El analisis de 25 aislados ha permitido detectar 18 genotipos distintos, indicando una gran diversidad a pesar de proceder de 8 pacientes co-infectados del area metropolitana de Barcelona. El bajo numero de genotipos repetidos detectado ha indicado una baja proporcion de recaidas clinicas entre los pacientes, no siendo las reinfecciones la unica hipotesis, sino considerando otras posibilidades sobre el comportamiento del parasito en el hombre y la posible seleccion en los cultivos de laboratorio. En algunos casos, el analisis filogenetico ha senalado una distancia genetica proxima entre los aislados de un mismo paciente, que puede ser relacionado con mutaciones del parasito. La posibilidad de la infeccion mediante el uso de jeringas contaminadas ha sido considerada otra posible fuente de transmision.