Structure-function relationships in intracellular and secreted pulmonary surfactant complexes: development and implementation of cellular models

El surfactante pulmonar (SP) es un complejo lipoproteico esencial, cuya principal funcion es la disminucion de la tension superficial en la interfase aire-liquido de los alveolos, evitando su colapso al final de la espiracion. El SP esta constituido por un 90% de lipidos y un 10% de proteinas especificas y es producido y secretado por las celulas alveolares tipo II (ATII), un tipo celular especializado del epitelio alveolar. Previamente a la exocitosis del surfactante, este es almacenado en organulos especiales de las celulas ATII denominados cuerpos lamelares (Lamellar Bodies, LBs). En la presente tesis doctoral se ha estudiado la organizacion estructural micro- y nanoscopica de las membranas de SP almacenadas intracelularmente como LBs en cultivos primarios de celulas ATII, asi como recien secretadas por los mismos, en forma de LBPs (Lamellar Body-like Particles), en comparacion con el surfactante nativo (SN) purificado a partir de lavados broncoalveolares de animales, un material de referencia en estudios estructurales y funcionales. Los resultados de esta tesis han revelado que las membranas de SP, tanto en forma de LBs como de LBPs, presentan propiedades estructurales y funcionales muy diferentes a las del SN. En particular, los LBs muestran un alto grado de empaquetamiento y deshidratacion, que se mantiene cuando son secretados al medio extracelular en forma de LBPs, incluso a temperaturas suprafisiologicas. Asimismo, los resultados apuntan a la posible existencia en los LBPs de organizaciones distintas a las tipicas de fases lamelares. Desde un punto de vista funcional, los LBPs recien secretados demuestran una superior eficiencia en terminos de adsorcion, asi como una significativa resistencia a agentes inhibitorios, incluso a altas concentraciones de estos, en comparacion con los complejos de SN. En vista de estos resultados, se concluye que la particular complejidad interna que adoptan los lipidos y proteinas dentro de los LBPs podria conferirles propiedades criticas para una eficacia maxima en la formacion de peliculas interfaciales y por tanto para la funcion surfactante. Un detallado analisis del SN ha corroborado la naturaleza heterogenea de las preparaciones purificadas a partir de lavado broncoalveolar, conteniendo no solo estructuras activas sino tambien material menos eficiente y con una reducida actividad biofisica, correlacionada con una diferente ultraestructura y composicion bioquimica. El material menos activo es posible que corresponda a surfactante ya ? gastado? o ? desactivado? o con funciones alternativas mas alla de la reduccion de la tension superficial. Sin embargo, a pesar de la utilidad y fiabilidad demostradas por los cultivos primarios de celulas ATII, estas tienen la desventaja de perder su fenotipo diferenciado en cultivo y son incapaces de sintetizar surfactante de novo una vez son extraidas del pulmon, lo cual impide llevar a cabo estudios sobre la biogenesis del SP. En vista de la necesidad de un modelo bien establecido de celula ATII, en esta Tesis se ha desarrollado y caracterizado un nuevo modelo celular basado en la diferenciacion pulmonar de celulas madre humanas mesenquimales derivadas de la decidua placentaria, hasta dar lugar a unas celulas que hemos denominado ATII-LCs (Alveolar Type II-Like Cells). Estas celulas diferenciadas son capaces de expresar marcadores alveolares a nivel genico y proteico, asi como sintetizar y almacenar fosfolipidos caracteristicos del SP en organulos similares a LBs. Igualmente, tras estimulacion fisiologica, las ATII-LCs secretan al medio extracelular complejos surfactantes con una rapida capacidad de adsorcion y resistencia a inactivacion. Asimismo, el modelo de ATII-LCs es sensible a la citotoxicidad de compuestos nanoestructurados de interes biofarmaceutico, constituyendo una potencial herramienta de cribado para detectar potenciales riesgos de nanofarmacos en sus primeras etapas de desarrollo.