Characterisation of non-symbiotic rhizobial and serratia populations from soil

El suelo representa unos de los ambientes mas complejos a nivel microbiano y un gran reservorio de estos. En este trabajo se han estudiado dos grupos diferentes de bacterias gram-negativas, los Rizobios y Serratia. Los Rizobios establecen endosimbiosis con plantas, fundamentalmente del grupo de las Fabaceae (leguminosas). En esta simbiosis, las leguminosas se alimentan del nitrogeno atmosferico fijado a amonio por los Rizobios. Como consecuencia las leguminosas se independizan de la necesidad de un suministro externo de nitrogeno fijado. Serratia es un genero de bacterias de la familia Enterobacteriaceae que destaca por su metabolismo secundario, y algunos compuestos derivados de este metabolismo, como la prodigiosina o los carbapenemas, han sido extensamente estudiados. La utilizacion de medios semi-selectivos de crecimiento, junto con un cribado por PCR utilizando marcadores de genero desarrollados en este trabajo o de especie, resulto en el aislamiento de rizobios de crecimiento rapido y lento de los generos Neorhizobium, Ensifer y Bradyrhizobium, asi como de enterobacterias del genero Serratia, a partir de suelos donde nunca se habian cultivado leguminosas. Esta metodologia, permitio el aislamiento y caracterizacion de Rizobios, en particular, de Rizobios que no contienen ni genes de nodulacion ni de fijacion de nitrogeno, denominados no simbioticos, que hasta este trabajo no habian sido descritos detalladamente, tambien de Serratia, cuyas poblaciones tampoco habian sido bien estudiadas, en ambos casos debido a la falta de metodologia apropiada. La presencia y abundancia de Rizobios vario en los diferentes suelos estudiados. Las poblaciones de Rizobios no simbioticos fueron en todos los casos, mayores y mas diversas que las de los simbioticos obtenidos por el metodo de planta trampa. Como resultado, se identificaron nuevas poblaciones de Rizobios no-simbioticos y se describio la primera especie de Neorhizobium no simbiotico. La comparacion a nivel genomico de dos aislados de Ensifer de un mismo suelo, uno de ellos simbiotico y otro no simbiotico, muy parecidos filogeneticamente, puso de manifiesto la reorganizacion de los plasmidos simbioticos (pSyms), particularmente del pSymA que contiene los genes de nodulacion y fijacion. Tambien se aislaron Rizobios del genero de crecimiento lento Bradyrhizobium; esta poblacion resulto ser muy diversa, conteniendo aislados tanto simbioticos, como no simbioticos o solamente fijadores de nitrogeno. Por otro lado, los aislamientos de Serratia obtenidos reproducen la diversidad de la totalidad del genero Serratia. El cribado fenotipico de compuestos relacionados con el metabolismo secundario mostro un rango de produccion muy interesante de compuestos, como por ejemplo antibioticos y antifungicos. ----------ABSTRACT---------- Soil represents one of the most complex environments and a large bacterial reservoir. In this work, two groups of Gram-negative soil bacteria were studied, Rhizobia and Serratia. Rhizobia establish endosymbioses mainly with plants belonging to the Fabaceae (legumes) group. During this symbiosis, legume plants are able to feed from the atmospheric nitrogen fixed to ammonia by the Rhizobia, which makes them independent from any external fixed nitrogen supply. Serratia belong to a genus within the Enterobacteriaceae family; characteristic of these bacteria is their secondary metabolism, producing compounds such as prodigiosin or carbapenem that have been extensively studied. Semi-selective enrichment, followed by PCR screening with genus-specific markers developed in this work and species markers, resulted in the successful direct isolation of fast and slow-growing Rhizobia of the genera Neorhizobium, Ensifer and Bradyrhizobium, and of the enterobacterium Serratia, from different soils where no legumes had been cultivated. This methodology allowed the isolation and characterisation of Rhizobia, particularly of those lacking either nodulation or fixation genes, which, before these work, had never studied at this level and of Serratia, whose populations have also been poorly studied, in both cases due to the lack of appropriate methodology. Abundance and presence of Rhizobia varied among soils, but the rhizobial non-symbiotic populations were, in all cases, larger and more diverse than the symbiotic ones that were obtained using the trap plant method. This led to the identification of novel non-symbiotic Rhizobia populations and to the first non-symbiotic Neorhizobium species description. It also allowed the genomic comparison of two Ensifer isolates from the same soil, highly-related phylogenetically, one containing symbiotic genes and another one missing them altogether. Whole genome analyses and alignment showed pSyms reorganisation –particularly of pSymA that harbours the nodulation and fixation genes– between these strains. Slow-growing Bradyrhizobium were also isolated; our methodology uncovered a very diverse population consisting of symbiotic, non-symbiotic and nitrogenfixing isolates. Our Serratia soil isolates reproduced the diversity of the whole genus. Phenotypic screening of secondary metabolism related compounds, showed production of a full range of potentially interesting compounds, among them some with antibiotic or antifungal activities.