Identification et caracterisation des Glutaredoxines de la cyanobacterie Synechocystis

Le maintien de l'homeostasie redox des thiols, dependant du pouvoir reducteur du NADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposees distinctes : 1) thioredoxine reductase/thioredoxines et 2) glutathion reductase/glutathion/glutaredoxines. En depit de leur importance, on connait mal la specificite des glutaredoxines et des thioredoxines [1]. C'est particulierement vrai chez les organismes photosynthetiques, dont le metabolisme redox, dependant de la photosynthese, est essentiel a la biosphere (production d'oxygene, assimilation du carbone et de l'azote inorganiques necessaires a la production de biomasse pour la chaine alimentaire). La photosynthese, comme la respiration, produit des molecules oxydantes (les especes activees de l'oxygene) qui perturbent, entre autres, l'homeostasie redox des thiols. Dans le cas des glutaredoxines, il a ete montre, chez les organismes heterotrophes, que ces enzymes utilisent le pouvoir reducteur du glutathion (re-reduit par le NADPH via la glutathion reductase) pour controler l'etat redox des thiols des residus cysteines (Cys) des proteines (reduire les ponts disulfure inter- ou intra-moleculaires). Les glutaredoxines se repartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre redox actif : les glutaredoxines a dithiol (possedant un site actif de type CysXXCys) et les glutaredoxines a monothiol (avec un site actif de type CysXXSer). Au cours de ma these, j'ai analyse, in vitro et in vivo, les glutaredoxines avec un organisme photosynthetique modele: la cyanobacterie unicellulaire Synechocystis PCC6803 (Synechocystis), qui possede un petit genome (3,57 Mb) entierement sequence et genetiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques developpes au laboratoire. Synechocystis possede 3 glutaredoxines (Grx): deux a dithiol (Grx1 et Grx2) et une a monothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactive les 3 genes correspondants, independamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles et triple) sont parfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolerance aux stress differe de celle de la souche sauvage. Le mutant Dgrx1 est sensible au mercure (HgCl2) et a l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant Dgrx2 est sensible au peroxyde d'hydrogene (H2O2), au cadmium (CdSO4) et au selenate (NaSeO4). Le mutant Dgrx3 est sensible au bleu de methylene. Le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 est sensible a chacun des toxiques precedemment cites, et aussi, de facon specifique par rapport aux autres mutants, a un exces (x25) de zinc (ZnCl2). Ces resultats indiquent que les Grx possedent une certaine selectivite, qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions specifiques. 11 Pour rechercher des partenaires proteiques des Grx, j'ai utilise un systeme bacterien de "double hybride", base sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, independamment, les genes codant pour les proteines "appâts" (chacun des trois genes grx) et les proteines "proies" (les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernieres, nous avons clone, independamment, une cinquantaine des genes impliques dans metabolisme redox, sans se limiter au controle de l'homeostasie redox des thiols. Les 1000 tests d'interaction realises nous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite, j'ai analyse les interactions (1) Grx1-MerA (MerA est la reductase du mercure) et (2) thioredoxine reductase-Grx1-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutageneses dirigees, tests double hybride et etudes in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et (iii) tests d'activite in vitro. J'ai montre que l'activite de reduction du mercure de MerA est inhibee, de facon reversible, par la glutathionylation (fixation d'une molecule de glutathion) d'une cysteine (Cys78) de son site actif. Grx1 reactive MerA en catalysant la reaction de deglutathionylation du site actif de MerA. Outre la tolerance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montre que Grx1 et MerA interviennent egalement dans la resistance a l'uranium (CH3COO)2UO2. Parallelement, j'ai analyse les interactions thioredoxine reductase-Grx1-Grx2. J'ai montre que la thioredoxine reductase est capable de reduire Grx1, qui peut a son tour reduire Grx2. Cette voie redox originale compense l'absence de glutathion reductase chez Synechocystis. J'ai egalement montre que cette "nouvelle" voie redox est capable de reduire le selenate. Ces resultats in vitro sont confortes par certains de mes resultats qui suggerent que Synechocystis repond au selenate par la formation d'un heterodimere Grx1-Grx2. Les deux "nouvelles" voies redox caracterisees au cours de ma these sont particulierement interessantes car elles permettent de relier deux processus redox, homeostasie redox des thiols et detoxication des metaux lourds par reduction, qui n'etaient jusqu'ici pas consideres comme etant etroitement imbriques.