The role of the stem region of the fusion protein E in flavivirus membrane fusion

Zum Genus der Flaviviren zahlen eine Reihe von humanpathogenen Krankheitserregern wie Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, West Nil Virus, Japanische Enzephalitis Virus und Fruhsommer-Meningoenzephalitis (FSME) Virus. Flaviviren gelangen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose in die Zelle und der saure pH im Endosom induziert die Fusion von viraler und endosomaler Membran. Dieser Fusionsprozess wird von dem viralen Hullprotein E, einem Klasse II Fusionsprotein vermittelt, das eine Dimer-Trimer-Umwandlung durchlauft und dabei Energie fur die Fusion zur Verfugung stellt. Der externe Teil des E Proteins, der aus 3 Domanen (DI, DII, DIII) zusammengesetzt ist, wird durch eine sogenannte Stamm-Region mit einem Doppel-Transmembrananker verbunden. In derzeitigen Modellen wird vermutet, dass spezifische Interaktionen des Stammes mit der DII des Trimers die treibende Kraft fur die spaten Phasen der Fusion (also das Verschmelzen der beiden Lipid Bilayer) darstellen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, einen eindeutigen Nachweis fur die Bedeutung der Stamm-Trimer-Interaktion zu finden und die Rolle der Stamm-Region in der Membranfusion von Flaviviren zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde diese Fragestellung durch Mutagenese von Rekombinanten Subviralen Partikeln (RSP) des FSME Virus behandelt. Wir mutierten konservierte Reste im Stamm und in moglichen Interaktionsregionen und analysierten den Einfluss der Mutationen auf verschiedene Schritte des Fusionsprozesses. Am Beispiel mehrerer Stamm-Mutanten konnten wir nachweisen, dass die Stamm-Region fur die spaten Stadien der Fusion bedeutend ist. Desweiteren war es uns moglich, eine spezifische Interaktion zwischen Stamm und Trimer-Ektodomane zu identifizieren. Die Mutation (L223I) in DII beeintrachtigte stark die Thermostabilitat des Trimers und zugleich die Fusogenitat der RSP-Mutante. Dieser negative Effekt konnte durch eine zusatzliche Mutation im Stamm zumindest teilweise kompensiert werden. Im Vergleich zur Einzelmutante wies die Doppelmutante (L223IF403I) verbesserte Trimerstabilitat und Fusionsaktivitat auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir diese Interaktion im infektiosen System und fuhrten die im RSP-System charakterisierten Mutationen in den infektiosen FSME Virus-Klon ein. Uberraschenderweise waren beide Virusmutanten (L223I und L223I-F403I) infektios, obgleich sie eine Reduktion in ihrer spezifischen Infektiositat im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen. Offensichtlich konnen Fusionsaktivitaten von RSP-Mutanten nicht direkt auf das infektiose System ubertragen werden, was in zukunftigen Studien genauer untersucht werden muss. Eine mogliche Erklarung fur diese Diskrepanz konnte die unterschiedliche Geometrie von RSP und Virionen sein. Wahrend an der Oberflache von RSP 30 E Proteindimere in einer T=1 Symmetrie organisiert sind, sind an der Oberflache von Virionen 90 E Proteindimere dicht in einer Fischgraten-ahnlichen Anordnung gepackt. Diese spezielle E Proteinanordnung auf Virionen konnte zusatzliche kooperative Effekte ermoglichen, welche Auswirkungen von Mutationen auf die Virusfusion abschwachen. Daruberhinaus stellten wir fest, dass Mutationen, welche die Sekretion von Partikeln im RSP System verhindern, die Produktion von infektiosen Viren erlauben. Wir konnten mit dieser Arbeit mechanistische Details uber die Rolle der Stamm-Region in der Membranfusion von Flaviviren aufdecken. Wir identifizierten eine spezifische intramolekulare Interaktion zwischen Stamm und DII, welche fur die Stabilitat der Postfusionsstruktur von groser Bedeutung ist und Membranfusion begunstigt. Das unterschiedliche Ausmas der Auswirkungen von Mutationen auf RSP und Viren muss in weiterfuhrenden Studien genauer untersucht werden.