Optimierung der Zuordnung mehrdeutiger NOESY-NMR-Signale unter Anwendung einer Datenbank nichtredundanter Proteinstrukturen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung des Softwarepakets AUREMOL fortgesetzt. Zentrales Ziel des Programms ist die automatische Strukturbestimmung unter Verwendung von moglichst wenigen experimentellen Daten. Kernziel der Arbeit war die Optimierung der automatischen Zuordnung von NOESY-NMR-Spektren durch Anwendung atomspezifischer Abstandsinformation, welche aus einer grosen Datenbank nichtredundanter Proteinstrukturen gewonnen wurde. Unter Anwendung der NMR-Spektroskopie zur Strukturbestimmung, wird der Grosteil der Information uber interatomare Abstande im Protein aus NOESY-NMR-Spektren gewonnen. Sie stellen somit eine Schlusselrolle bei der Strukturbestimmung dar. Ihre Auswertung gehort allerdings zu den zeitaufwendigsten und zugleich fehleranfalligsten Arbeitsschritten. Die Auswertung bzw. die Zuordnung der Spektren kann im Softwarepaket AUREMOL uber das Programm KNOWNOE automatisch durchgefuhrt werden. Das Kernziel der Arbeit war in erster Linie die Zuordnung mehrdeutiger NOESY-Signale, die das Hauptproblem bei der Auswertung darstellen, zu verbessern. Mehrdeutige NOESY-Signale sind Signale, die aufgrund bekannter chemischer Verschiebungen nicht eindeutig einem bestimmten Atompaar zugeordnet werden konnten. Das im Programm KNOWNOE angewandte statistische Verfahren ist in der Lage, im Falle von zwei- oder drei unterschiedlichen Atompaaren als Zuordnungsmoglichkeit, die wahrscheinlichste Moglichkeit zu berechnen. Hierbei greift das Programm auf eine Datenbank aus Wahrscheinlichkeitsverteilungen zuruck, die auf der Kenntnis interatomarer Atomabstande innerhalb bekannten Proteinstrukturen beruhen. Ziel war es, durch Ersatz der fruheren Datenbank aus Verteilungen durch eine qualitativ hochwertigere und wesentlich umfangreichere Datenbank, die Anzahl so wie die Sicherheit der Zuordnungen zu erhohen. Die neue Datenbank wurde im Gegensatz zur fruheren Datenbank aus einem Satz strukturell nichtredundanter Strukturen erzeugt. Zusatzlich unterscheidet sie sich von der fruheren Datenbank durch die grosere Anzahl zu Verfugung stehender Verteilungen (uber 200 000 anstatt 1577) fur Abstande unterschiedlicher Atompaare, durch die hohere Datenauflosung (10 000 Datenpunkte anstatt 100) der einzelnen Verteilungen, durch die grosere verwendete Strukturdatenbasis (1107 Strukturen anstatt 326) bei der Generierung und durch ein akkurateres mathematische Verfahren zur Berechnung einer bestimmten Verteilungskurve (Kurvenglattung uber Summierung von Gauskurven). Anhand der simulierten 2D-NOESY-NMR Spektren der Proteine TmCSP und HPr konnte gezeigt werden, das unter Anwendung der neuen Verteilungen die Gesamtanzahl der erstellten Zuordnungen so wie deren Sicherheit bzw. Richtigkeit stark erhoht werden konnte. Insgesamt konnten bei vergleichbaren Versuchsbedingungen die Anteile der jeweils vorhandenen zwei- und dreideutigen NOESY-Signale, denen jeweils ein bestimmtes Atompaar mit einer hohen Wahrscheinlichkeit (z.B. 80-99%) zugewiesen wurde, in etwa verdoppelt werden. So konnten, unter Einsatz der neuen Datenbank, anstatt wie vorher etwa 20-25%, nun 40-55% der jeweils vorhandenen zwei- und dreideutigen NOESY-Signale ein bestimmtes Atompaar mit beispielsweise einer Wahrscheinlichkeit von mindestens 98% zugewiesen werden. Zugleich konnte der Anteil falsch zugewiesener Zuordnungen in der Regel um die Halfte verringert werden. Dies ist besonders wichtig, da falsche Zuordnungen zu falschen Abstandsberechnungen fuhren, und dadurch zu einer Verzerrung des Strukturmodells bezuglich der wirklichen Konformation der fraglichen Proteinstruktur wahrend der Strukturrechnung fuhren konnen. Die erreichte Minimierung falscher Zuordnungen zeigte sich besonders bei kleinen eingestellten Suchradien (<1.0 nm) im Programm KNOWNOE deutlich, da hierbei im Allgemeinen besonders viele falsche Zuordnungen auftreten. Der Suchradius ist ein Parameter im Programm KNOWNOE, der iterativ reduziert wird. Er gibt den maximalen Abstand an, den ein bestimmtes Atompaar innerhalb der bereits vorhandenen Modellstruktur haben darf, um als Zuordnungsmoglichkeit fur ein bestimmtes NOESY-Signal in Frage zu kommen. So konnte der Anteil falsch zugeordneter zwei- und dreideutiger NOESY-Signale, unter dem relativ kleinen eingestellten Suchradius von beispielsweise 0,6 nm und einer eingestellten Wahrscheinlichkeitsgrenze von P=0,98 beim simulierten 2D-NOESY-Spektrum vom Protein CSP von 28,4 % auf 16,3% und beim Protein HPr von 24,5% auf 10,5% reduziert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass sich das hier angewandte statistische Zuordnungsverfahren bei Benutzung der neuen Verteilungen gegenuber Abstandsfehlern wesentlich toleranter verhalt. So fuhrten kunstlich erzeugte Abstandfehler von beispielweise 30 % bei Anwendung der fruheren Verteilungen zu erheblichen Schwankungen so wie Steigerungen der Anteile falscher Zuordnungen. Bei Benutzung der neuen Verteilungen blieben die Fehlerquoten hingegen weitgehend konstant. Dieses Ergebnis ist besonderes wichtig, da man in experimentellen NOESY-NMR-Spektren generell mit groseren Fehlern bei der Abstandbestimmung aus NOESY-NMR-Signalen rechnen mus. Es hat sich gezeigt, das die ereichte Steigerung der Zuordnungsanzahl vor allem auf der grosen Anzahl von erzeugten Verteilungen (uber 200 000) beruht. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die stark erhohte Datenauflosung von 10000 Datenpunkten. Die Verbesserung der Zuordnungssicherheit konnte hingegen im wesentlichem auf die grosere benutzte Strukturdatenbasis, der geringen sequentiellen Ahnlichkeit (<25%) der benutzten Proteine und dem angewandten Kurvenglattungsverfahren zuruckgefuhrt werden. Mit den erzeugten Datenbanken wurde in weiterem eine wertvolle Quelle struktureller Information bezuglich interatomarer Abstande zu Verfugung gestellt. Neben der Zuordnung von NOESY-NMR-Signalen, ist ihre Anwendung auch bei anderen wichtigen Arbeitschritten bei der Strukturbestimmung wie z.B. der Strukturrechnung oder der Strukturvalidierung denkbar.