Movilidad de factores de virulencia del patógeno E. Coli O157:H7 y otros serotipos

Los elementos geneticos moviles (EGMs) tienen la capacidad de transportar el ADN bacteriano y hacer que practicamente cualquier gen presente en una bacteria pueda ser movilizado a otra. Los bacteriofagos son un tipo de EGM que permiten la movilizacion de genes de una cepa bacteriana a otra, pudiendo generar nuevas cepas patogenas si el gen que transfieren codifica para una proteina que provoca virulencia. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de los bacteriofagos portadores de genes de virulencia como EGMs. Para ello se estudio, en primera instancia, la presencia de bacteriofagos Stx2 en heces de individuos sanos, dado que se ha demostrado su presencia y capacidad de infeccion en alimentos aptos para el consumo humano y en aguas residuales. La presencia de fagos Stx en heces humanas aparece como la conexion entre su prevalencia en los alimentos, los cuales al ser ingeridos incorporan los fagos Stx, y su deteccion en agua residual, como resultado de su excrecion. Se detecto la presencia de fagos Stx en las heces de individuos sanos y se evaluo su capacidad infectiva. La evolucion de las cepas Shiga toxin Escherichia coli (STEC) se determino a partir de ancestros stx-negativos y que inicialmente no poseian el resto de genes necesarios para producir la enfermedad. Por ello se estudiaron los genes de virulencia en cepas STEC ambientales, permitiendo observar los diferentes estadios intermedios en las evoluciones de las cepas STEC. Las variantes de stx encontradas fueron stx2a y stx2c, que corresponden a las variantes asociadas a mayor virulencia. El estudio de la distribucion de los genes de virulencia segun su origen revelo claramente que las cepas que contenian un mayor numero de factores de virulencia eran cepas de origen vacuno, seguidas de las de origen humano, siendo el serotipo O157:H7 el que contenia mayor numero de genes de virulencia. En general, los genes de virulencia que se detectaron con mayor frecuencia fueron aquellos que no estaban codificados en el denominado locus for enterocyte effacement (LEE). El gen mas predominante fue hlyA que codifica para una enterohemolisina seguido por el gen nleC y el gen saa El desarrollo de una matriz para visualizar la distribucion de los genes entre si permitio la deteccion de dos agrupaciones: el grupo formado por genes codificados en LEE y otros genes como espJ, espM, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleA, nleH1 y tccP; y los genes saa, hlya, stx1, cdt y cif que raramente se encontraban en combinacion con otros genes, y probablemente se movilicen independientemente mediante algun tipo de EGM. A continuacion, nos centramos en el estudio de los genes no descritos en fagos que parecia que se movilizaban de forma independiente y, mas en concreto, en el gen saa. El gen saa codifica para una adhesina que se encuentra en las cepas STEC que no codifican para LEE. Se analizaron las diferentes variantes del gen en las cepas STEC saa+ aisladas y se observo y cuantifico la adherencia a celulas Hep2. En contacto con un agente inductor como la Mitomicina C, el numero de copias del gen saa aumentaba hasta 4 unidades logaritmicas y se observo hibridacion positiva con una sonda saa en calvas de lisis. Estos resultados sugieren que saa puede ser un gen movilizado por un bacteriofago o, al menos, movilizado mediante una capside proteica. La banda de CsCl en la que se detectaba el gen saa se observo por microscopia electronica revelando una morfologia tipo Podoviridae. Se confirmo por proteomica la presencia de proteinas fagicas en la fraccion de CsCl donde se detectaba saa, siendo una de ellas homologa a proteinas tipo gene transfer agents (GTA). A si mismo, se detecto la presencia de saa en la fraccion viral de diferentes muestras de origen animal y humano. Finalmente, dado que el primer paso para que una cepa llegue a ser infectada por un fago es la union de este a los receptores de membrana de la bacteria provocando la activacion de las respuestas de estres de membrana, se estudiaron la influencia de los sistemas de estres de membrana en la conversion lisogenica de la bacteria. Los resultados obtenidos indican que la via BaeSR esta implicada en la formacion de lisogenos. A pesar de que los fagos Stx son un grupo muy heterogeneo, este resultado se observo con distintos fagos Stx y se determino que este efecto se debia a los receptores de membrana BamA.