Genetic and molecular analysis of the tomato root-knot nematode resistance locus Mi-1.

Het doel van het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt, was de isolatie en karakterisering van het tomaat locus Mi-1, dat resistentie verleent tegen plantpathogene wortelknobbelaaltjes van het geslacht Meloidogyne, die schade veroorzaken bij een groot aantal gewassen. Resistentie van een plant tegen een ziekteverwekker houdt in dat de plant reageert op infectie met een afweerreactie, die verdere aantasting voorkomt. Bij het tot stand komen van de afweerreactie spelen de resistentiegenen een sleutelrol. Het leek zeer interessant om het Mi-1 locus te isoleren en te onderzoeken welk product door dit gen gecodeerd wordt. Op die manier kan inzicht verkregen worden in het mechanisme van de resistentie en de specificiteit van de interactie van wortelknobbelaaltjes en de gastheerplant. Bovendien zou dan onderzocht kunnen worden of overdracht van het Mi-1 gen naar gevoelige planten in die planten ook resistentie tegen wortelknobbellaaltjes bewerkstelligt. De isolatie van een gen vereist een goed gedefinieerde genetische kaart met een groot aantal moleculaire merkers zoals RFLP's, die nauw gekoppeld zijn aan het fenotype van het gen dat geisoleerd moet worden. Voorts zijn genomische banken nodig met grote inserties, b.v. een YAC (Yeast Artificial Chromosome) bank, terwijl voor de functionele identificatie van gekloneerde genen via complementatie analyse, een efficiente methode om planten te transformeren beschikbaar moet zijn. Aan het begin van het onderzoek waren de benodigde technieken voor de tomaat in principe beschikbaar en leek de weg geeffend te zijn om de isolatie van een resistentie gen zoals Mi-1 te ondernemen via positionele klonering. Het Mi-1 resistentie locus is afkomstig van de wilde tomatensoort Lycopersicon peruvianum en is in de cultuurtomaat L. esculentum ingekruist. Het komt nu voor als een introgressie in verschillende nematode resistente lijnen van L. esculentum. In hoofdstuk 1 wordt beschreven welke fenotypische eigenschappen het Mi-1 locus aan tomatenplanten geef[ en wordt het voorkomen van andere genen voor resistentie tegen wortelknobbelaaltjes in Lycopersicon soorten besproken. In dit hoofdstuk wordt ook kort weergegeven wat, bij het begin van het onderzoek, de stand van zaken was van de moleculaire genetica van het Mi-1 locus, die de basis moet vormen voor de positionele klonering van Mi-1. Het Mi-1 locus ligt op de korte arm van chromosoom 6 van de tomaat. Om kloneren mogelijk te maken is het noodzakelijk om een zo klein mogelijk gebied van het chromosoom af te bakenen waarop het Mi-1 locus ligt en zoveel mogelijk fenotypische en moleculaire merkers in dit gebied in kaart te brengen. Daartoe werden een groot aantal recombinanten geanalyseerd. Het bleek dat de recombinatie van L. esculentum in het introgressiegebied met het Mi- locus sterk onderdrukt was. Die onderdrukking bleek het gevolg te zijn van de soortvreemde afkomst van het chromosomale DNA met het Mi- locus. Het Mi- locus ligt bovendien dichtbij het centromeer van chromosoom 6 en die positie kan extra bijdragen aan de onderdrukking van de recombinatie in het gebied dat in kaart gebracht moest worden. Daardoor was het niet mogelijk om het gebied waarin Mi ligt nauwkeurig af te bakenen (hoofdstuk 2). Als een alternatieve methode om recombinanten in kaart te brengen zijn straling-geinduceerde deletiemutanten gebruikt om te proberen met behulp daarvan een verfijnde kaart van moleculaire merkers van het Mi -gebied te verkrijgen (hoofdstuk 3). Hoewel de verkregen deletiemutanten bruikbaar waren om het niet-recombineerbare gebied rond het centromeer van chromosoom 6 in kaart te brengen, verschafte deze aanpak toch niet de verwachte en vereiste precisering van de genetische kaart. Dit werd veroorzaakt door de niet-willekeurige distributie van de deletiebreekpunten en het feit dat vooral grote terminale deleties werden verkregen. In hoofdstuk 4 wordt vervolgens beschreven hoe twee elkaar aanvullende strategieen zijn gebruikt om meer recombinanten in het Mi-gebied te identificeren en in kaart te brengen. Die aanpak bestond aan de ene kant uit een uitbreiding van het onderzoek naar recombinanten, waarvan in hoofdstuk 2 verslag is gedaan, met op PCR gebaseerde merkers en AFLP merkers rond de Mi- locus in L. esculentum. De andere strategie bestond uit het genereren en analyseren van een segregerende populatie van de wilde tomaat L. peruvianum , waaruit het Mi -locus afkomstig is. Met PCR-merkers lukte het om in die populatie recombinanten te identificeren met kruisingen dicht bij Mi. Op die manier kon het Mi-1 locus begrensd worden tot een gebied van het genoom van minder dan 65 kb. Daarmee was de weg vrijgemaakt om Mi-1 te identificeren in klonen van YAC banken en in cosmid klonen. Vervolgens werd het tomatengenotype L.esculentum 0T745 bestudeerd dat spontaan het Mi-1 locus had verloren en tegelijkertijd ook resistentie tegen aardappelluizen (Macrosiphum euphorbiae) was kwijtgeraakt (hoofdstuk 5). De genetische en moleculaire gegevens wezen op de aanwezigheid van een mutatie (lmml) in het 0T745 genotype, gelocaliseerd binnen de introgressie met Mi-1, die gepaard gaat met een hypergemethyleerde Clal herkenningsequentie buiten de gebieden van de Mi-1 en Meul genen. In hoofdstuk 6 wordt besproken welke vooruitgang is geboekt met de gebruikte genetische aanpak bij het bestuderen van het Mi-1 locus en welke betekenis dit onderzoek is geweest voor de recente vorderingen met de klonering van Mi-I. Het onderzoek weerspiegelt de snelle ontwikkeling van de moleculaire genetische technologie voor de identificatie en karakterisering van genen in planten.