Role of MG491 protein in the motile machinery of Mycoplasma genitalium

Mycoplasma genitalium es un patogen de transmissio sexual emergent. Aquest bacteri sense paret cel·lular causa uretritis, a mes d'altres malalties inflamatories genitals. Aquest microorganisme utilitza adhesines especialitzades i localitzades a l'organela terminal per adherir-se a cel·lules hoste i altres superficies. L'organela terminal, que tambe es troba involucrada en la motilitat cel·lular, es una estructura polar sostinguda internament per un citosquelet. Al primer capitol, s'ha dissenyat una soca mutant de M. genitalium deficient per a la proteina MG491 que mostra una desestabilitzacio general de les proteines involucrades en l'organitzacio de l'organela terminal. Aquest mutant exhibeix sorprenents similituds amb el mutant defectiu per a la proteina MG218, aillat previament. Despres de la introduccio d'una copia extra d'MG_318 a les dues soques, la quantitat d'adhesines va augmentar considerablement. Aquestes soques es van caracteritzar per microcinematografia, microscopia de fluorescencia i criomicroscopia electronica, revelant la presencia de cel·lules i filaments motils en absencia de diverses proteines que s'havien considerat essencials per a l'adhesio i el moviment. Aquests resultats indiquen que els complexes d'adhesines juguen un paper important en la maquinaria motil de M. genitalium i demostren que el fragment central del citosquelet no es el motor molecular que propulsa les cel·lules de micoplasma. Aquestes soques contenen una versio minimitzada de la maquinaria motil aportant un valuos model per investigar les caracteristiques d'adhesio i motilitat d'aquest patogen huma. L'estructura cristal·lina de la proteina MG491 ha sigut recentment determinada. La molecula de MG491 es un tetramer que presenta una organitzacio unica com a dimer d'heterodimers estructurals. Aquest ordenament asimetric resulta en dos interfases molt diferents, aspecte que explica la formacio de nomes el 50% dels ponts disulfur entre els residus Cys87 de les diferents subunitats. A mes, s'ha caracteritzat in vitro la interaccio entre el C-terminal de MG491 i el domini EAGR de la proteina MG200. Al segon capitol, s'han dissenyat soques de M. genitalium amb mutacions en residus clau en l'organitzacio de MG491. Aquestes soques mutants preserven nivells normals de totes les proteines de l'organela terminal, pero mostren greus alteracions en la motilitat. Els resultats d'aquest treball indiquen que la proteina MG491 esta involucrada en l'estabilitat i ancoratge de l'organela terminal de M. genitalium i juga un paper important en la motilitat cel·lular. Al tercer capitol, s'ha desenvolupat un nou metode per quantificar la capacitat d'hemadsorcio de soques de micoplasma. Aquesta capacitat tradicionalment s'ha investigat determinant la capacitat d'unio d'aquestes cel·lules a eritrocits i es un tret distintiu ampliament examinat quan s'estudien soques de micoplasma. Tot i que els protocols per determinar qualitativament l'hemadsorcio o hemaglutinacio de micoplasmes son molt directes, els metodes actuals per mesurar de forma quantitativa l'hemadsorcio son cars i poc reproduibles. Utilitzant citometria de flux, s'ha desenvolupat un procediment per quantificar rapidament i de forma acurada l'activitat d'hemadsorcio de soques de micoplasma en presencia de SYBR Green I, un fluorocrom vital que tenyeix els acids nucleics, permetent resoldre els eritrocits i els micoplasmes per mida i fluorescencia. Aquest metode es reproduible, permet l'analisi cinetica de les dades obtingudes i la quantificacio precisa de l'hemadsorcio basada en parametres d'unio estandards com la constant de dissociacio Kd. Aquest procediment pot ser implementat facilment en un assaig estandard per testar l'activitat d'hemadsorcio del creixent numero d'aillats clinics i soques mutants de diferents especies de micoplasma, proporcionant dades valuoses sobre la virulencia d'aquests microorganismes