Study of genetic factors and temperature influence on sex determination and differentiation in turbot

espanolEl sexo, aunque parezca un concepto intuitivo y simple, presenta algunas de las cuestiones biologicas mas interesantes y complejas. El sexo es una caracteristica intrinseca de la mayoria de eukariotas que eventualmente condujo a la aparicion de dos fenotipos adultos diferenciados conocidos como sexos, machos y hembras. Esta distincion gobierna buena parte de nuestras vidas y es el origen de importantes procesos evolutivos basados en la competicion entre individuos del mismo sexo o en el conflicto entre sexos debido a fenomenos de antagonismo sexual. El sexo es un caracter importante para diversas actividades humanas. Por ejemplo, muchos peces cultivados presentan dimirfismo sexual en el que uno de los sexos crece mas rapido que el otro, y por lo tanto es interesante conocer como es determinado el sexo en cada especie. Tradicionalmente, la determinacion sexual ha sido considerada un proceso en cascada con un gen maestro en la cima, pero a partir de descubrimientos recientes se ha sugerido que este proceso puede responder a un modeloen red en el que diferentes factores geneticos y ambientales interaccionan para determinar el destino de la gonada. , lo cual estaria conectado con el gran numero de mecanismos de determinacion sexual en vertebrados, sobre todo en organismos poikilotermos. En este nuevo escenario, los diferentes factores involucrados en la diferenciacion gonadal cobran importancia y su estudio puede ayudar a entender como se decide el destino de la gonada. En este trabajo hemos estudiado la diferenciacion sexual en el rodaballo, un pez plano con un marcado dimorfismo sexual en el que las hembras crecen mas rapido que los machos. Esta especie presenta determinacion sexual genetica, pero tambien se han detectado efectados de la temperatura sobre las proporciones sexuales en ciertas familias. Nuestro objetivo era estudiar la diferenciacion sexul del rodaballo para conocer como se establece el sexo en esta especie y , en un sentido amplio, en peces en general. Este trabajo consiste en estudios de expresion en gonada de rodaballo utilizando dos tecnicas distintas: PCR en tiempo real y microarrays. Primero, se puso a punto la tecnica de PCR en tiempo real para estudios de desarrollo gonadal en rodaballo. Los distintos metodos para determinar los genes de referencia y el calculo de la eficiencia fueronanalizados. Despues, utilizando esta informacion se desarrollo un amplio estudio de la diferenciacion sexual en rodaballo, utilizando gonadas desde undiferenciadas hasta diferenciadas tomadas a tres temperaturas diferentes. Los primeros signos de diferenciacion sexual fueron encontrados a 90 dias post fertilizacion y tres genes, cyp19a1a, amh y vasa, pueden utilizarse para establecer el sexo de los rodaballos en este estadio. Ademas, la expresion de genes relacionados con las celulas germinales apunta a que deben tener un papel en la diferenciacion sexual y posiblemente tambien en la determinacion. Tambien se estudiaron los efectos de la temperatura, encontrandose una mayor proporcion de hembras a bajas temperatura y efectos en al expresion de varios genes. Finalmente, para completar nuestro estudio, se analizaron muestras de gonada de rodaballo desde estadios indiferenciados hasta machos y hembras juveniles mediante microarrays. Se encontro que la gonada femenina se diferencia mas de la gonada indiferenciada que la masculina, requiriendo la regulacion de un mayor numero de genes y la accion de diferentes procesos incluyendo mecanismos epigeneticos. Este estudio ha ampliado nuestro conocimiento sobre la diferenciacion sexual en el rodaballo en particular y en peces en general, ayudandonos a entender el papel de muchos genes involucrados en la diferenciacion sexual en los vertebrados y apuntando a otros genes conectados con el sexo por primera vez. Nuestros datos sugieren que un modelo de red seria mas preciso para explicar la determinacion sexual en el rodaballo, donde el ambiente puede interactuar con factores geneticos y modificar el destino de la gonada. EnglishSex, as intuitive and simple as it may seem to us, poses some of the most interesting and complex questions when studying life. Sex is an intrinsic characteristic of most eukaryote species which eventually has led to the appearance of two differentiated adult phenotypes or sexes, males and females. This distinction rules a huge part of our lives and is the origin of important evolutionary processes based on intra-sex competition or inter-sex conflict due to sexual antagonism. Furthermore, sex is an important character for a plethora of species involved in human activities, for example in aquaculture many fish species present sex size dimorphisms where one sex grows faster than the other, and so knowing how sex is determined in each species is of the outmost interest. Traditionally, sex determination has been considered a cascade process with a master gene at the top, but recent findings have suggested that, instead, it might be a network process where different genetic and environmental factors can alter gonad fate, which in turn would be connected with a huge number of different sex determination mechanisms in vertebrates, especially in poikiloterms. In this new view of sex, the different players involved in sex differentiation gain relevance and their study may help us understanding how the fate of the gonad is determined. In this work, we have studied sex differentiation in turbot, a flatfish with a marked sex dimorphism where females grow faster than males. This species presents genetic sex determination, but also temperature effects on sex ratios have been reported, which seem to be family-dependant. Our aim was to study sex differentiation in turbot to gain knowledge about how sex is determined in this species and also in a broader sense in fish. This work consists of expression studies in turbot gonads using two different techniques: real-time PCR and microarrays. First of all, the real time PCR technique was setup for gonad development studies in turbot. The different methods available for reference gene stability calculation and efficiency determination were assessed. Then, using this information we performed an extensive expression study on turbot sex differentiation ranging from undifferentiated to differentiated gonads at three different temperatures. We found that the first molecular signs of sex differentiation are observed at 90 days post fertilization and that three genes, cyp19a1a, amh and vasa, can be used to sex turbot at this stage. Furthermore, the expression of genes involved in germ cell development pointed towards their involvement in early sex differentiation and possibly sex determination. Temperature effects on sex differentiation were also assessed in this study. A higher proportion of females was obtained at cold temperatures and several genes showed temperature dependant expression changes. Finally, to complete our study, we also performed a microarray analysis in turbot gonad samples from undifferentiated individuals to male and female juveniles. Female gonads were found to be more different from undifferentiated gonads than those of males, requiring the regulation of a large number of genes and the involvement of different processes including epigenetic mechanisms. Furthermore, the involvement of known sex differentiation genes and previously unrelated genes in sex differentiation was observed. This study has widened our knowledge on sex differentiation in turbot in particular and in fish in general, helping to understand the role of many genes involved in sex differentiation across the whole vertebrate taxa and pointing towards other genes which have been connected with sex for the first time. Our data suggest that a network model might be more accurate to explain sex determination in turbot, where the environment can interact with genetic factors and modify gonad fate.