Faculteit Industriële ingenieurswetenschappen master in de industriële wetenschappen : biochemie Masterthesis Optimization and Validation of ddPCR Assays for the Detection of PIK 3 CA Hotspot Mutations in Liquid Biopsies of Patients With Invasive Breast Carcinoma 2018 • 2019

The detection of PIK3CA mutations in invasive breast carcinoma is important to determine the treatment strategy of the patient. In combination with fulvestrant, Alpelisib, a PI3Kα-specific inhibitor, shows an average extension of 5.3 months progression-free survival in clinical trials compared to fulvestrant alone in metastatic setting. Taking a new biopsy is often not possible in this setting, whereas the use of liquid biopsies is indicated. The aim of this work is to optimize and validate singular droplet digital PCR assays to detect four PIK3CA hotspot mutations in plasma. The ddPCR assays were optimized and validated based on positive/negative controls. The intraand inter-run precision, robustness and correctness were demonstrated. Subsequently, plasma of 20 patients with known mutation status on tumor tissue (n=12 PIK3CA negative, n=8 PIK3CA positive) were tested. For 18 of 20 samples, concordant results were observed between tissue and plasma. One sample, with only a His1047Arg mutation on tissue, showed Glu542Lys, Glu545Lys and His1047Arg mutations in plasma. In the other sample, Glu545Lys was detected on tissue and Glu542Lys in plasma. The sensitivity and specificity were 87.5% and 95.8% respectively. A good correlation was observed between the detection of PIK3CA mutations in tissue and plasma. The validated test will be included in the routine diagnostics and provides an opportunity for the follow-up of the mutation status and for the support of the treatment strategy. ABSTRACT IN HET NEDERLANDSIN HET NEDERLANDS Het opsporen van PIK3CA hotspot mutaties in invasief borstcarcinoom is belangrijk om de behandelingsstrategie te bepalen. Alpelisib, een PI3Kα-specifieke inhibitor, toont in combinatie met fulvestrant een gemiddelde verlenging van progressievrije overleving van 5,3 maanden t.o. v. fulvestrant monotherapie in uitgezaaide setting. Hierbij is een nieuwe biopsie vaak niet mogelijk en is een liquid biopsie aangewezen. Het opzet van dit werk is het optimaliseren en valideren van singuliere droplet digital PCR testen om vier PIK3CA hotspot mutaties te detecteren in plasma. Aan de hand van positieve/negatieve controles werden de PIK3CA ddPCR testen geoptimaliseerd en gevalideerd. De intraen inter-run precisie, robuustheid en juistheid werden aangetoond. Vervolgens werd het plasma van 20 patiënten met gekende weefsel mutatiestatus (n=12 PIK3CA negatief, n=8 PIK3CA positief) getest. Dit resulteerde voor 18 van 20 stalen in een concordant resultaat tussen weefsel en plasma. Eén staal, met enkel een His1047Arg mutatie op weefsel, toonde Glu542Lys, Glu545Lys en His1047Arg mutaties in plasma. In het andere staal werd de Glu545Lys gedetecteerd op weefsel en de Glu542Lys in plasma. De sensitiviteit en specificiteit bedroegen respectievelijk 87,5% en 95,8%. Een goede concordantie werd geobserveerd tussen detectie van PIK3CA mutaties in weefsel en plasma. De gevalideerde test zal in de routine diagnostiek worden opgenomen en biedt een mogelijkheid voor de opvolging van de mutatiestatus en ondersteuning van het behandelingsbeleid.