Rôle de la protéine PB1 dans la fidélité du complexe polymérase des virus influenza

Les virus influenza de type A (IAV) appartiennent a la famille des Orthomyxoviridae. Ces virus enveloppes presentent un genome compose de 8 segments d’ARN simple brin, de polarite negative. Chaque segment est encapside par les nucleoproteines (NP) et associe au complexe polymerase viral, heterotrimere compose des sous-unites PB1, PB2 et PA, pour former la ribonucleoproteine virale (RNPv). La proteine PB1 est la sous-unite catalytique responsable de l’activite ARN polymerase ARN-dependante du complexe viral. La RNPv represente ainsi l’unite minimale de transcription et replication du genome viral. En raison de la faible fidelite de la polymerase virale et l’absence d’activite de relecture, les IAV presentent un taux de mutation eleve, responsable du developpement rapide de populations virales d’une grande diversite genetique, appelees quasi-especes. Des etudes recentes ont permis d’identifier des mutants presentant une fidelite de replication augmentee, due a des mutations uniques dans la sous-unite PB1. Comme decrit pour d’autres virus a ARN, differentes mutations peuvent avoir un effet similaire sur l’activite de la polymerase virale. Afin d’approfondir la caracterisation de la proteine PB1 nous avons recherche d’autres positions pouvant avoir un role dans la fidelite de la polymerase, la selectivite des nucleotides ou la processivite du complexe. Pour cela, des banques de sequences PB1 mutees ont ete generees par mutagenese aleatoire pour deux sous-types de virus influenza A, H3N2 et H1N1pdm09, circulant actuellement chez l’homme. A partir de ces banques, des experiences de reconstitution transitoire de RNPv fonctionnelles (minigenome) en presence de ribavirine, un analogue nucleosidique mutagene, ont permis d’evaluer l’activite de la polymerase et de selectionner, apres subdivisions successives des banques, des mutations conferant une resistance au compose mutagene superieure a celle de la polymerase sauvage. Les mutations ainsi identifiees dans differentes regions du segment PB1 ont ensuite ete reintroduites de maniere specifique, par mutagenese dirigee, dans la sequence du gene PB1. L’impact de ces mutations sur l’activite de la polymerase a ete evalue par des experiences de minigenome en presence et absence de ribavirine. Les mutations pour lesquelles la resistance a la ribavirine a ete confirmee ont alors ete introduites par genetique inverse dans le contexte du genome viral complet. La majorite des mutations s’est averee viable et a permis l’obtention de virus mutants infectieux. La capacite de multiplication des virus mutants a ete evaluee en cellules MDCK et comparee a celle des virus sauvages correspondants, en absence et en presence de ribavirine. Ainsi, deux mutants porteurs de deux mutations differentes, localisees dans des regions distinctes de la proteine PB1, presentent une capacite a resister a la ribavirine superieure a celle du virus sauvage. L’analyse de la diversite des populations virales, evaluee par sequencage a haut-debit, en utilisant la technologie Illumina, permettra de confirmer si cette resistance a la ribavirine est bien liee a une augmentation de la fidelite de la polymerase virale. Cette etude a ainsi permis de preciser les elements de la proteine PB1 impliques dans l’activite et potentiellement la fidelite de la replication virale pour deux sous-types de virus influenza A