Bindungsstudien mit humanen Zellrezeptoren für das SARS-Coronavirus

Das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS) ist eine Erkrankung der Atemwege, die durch das SARS-assoziierte Coronavirus (SARS-CoV) ausgelost wird. Die virale Infektion von humanen Zellen findet uber eine Interaktion des viralen spike-Proteins (S-Proteins) mit dem funktionalen Rezeptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) statt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsstudien mit humanen Rezeptoren des SARS-CoV durchgefuhrt. Dazu wurde zunachst die Wechselwirkung mit dem Rezeptor ACE2 analysiert. Von M. Axmann wurde das Hexapeptid YKYRYL (Peptid 1), welches den Aminosauren Y438 bis L443 der Rezeptorbindungsdomane des SARS-CoV entspricht, als Leitstruktur fur das Design eines entry-Inhibitors, der spezifisch an den ACE2-Rezeptor bindet, vorgeschlagen. Um den Bindungsmodus von Peptid 1 an das Glycoprotein ACE2 zu analysieren, wurden molecular-dynamic (MD)-Simulationen durchgefuhrt. Dabei konnte durch die Analyse einer 3000 ps langen MD-Simulation gezeigt werden, dass die Aminosauren K439, Y440 und R441 der Leitstruktur 1 YKYRYL einen Kontakt zur Oberflache des humanen Zellrezeptors ACE2 aufweisen. Das K439 und das R441 gehen mit ihren positiv geladenen Seitenketten ionische Wechselwirkungen mit den Carboxylgruppen des E23 und des D30 des Rezeptors ein. Das Y440 zeigt Interaktionen mit einem N-Glycan auf der Rezeptoroberflache. Durch ein SPR-screening der Peptide eines Alaninscans des Hexapeptids 1 YKYRYL sollte die Rolle der einzelnen Aminosauren an der Bindung zum ACE2 geklart werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das Tripeptidmotiv 439KYR441 einen grosen Einfluss auf die Bindung an den ACE2-Rezeptor besitzt. Wenn eine der Aminosauren dieses Tripeptidmotivs sukzessiv gegen die Aminosaure Alanin substituiert wird, nimmt die Bindung zum ACE2 ab. Ein screening von weiteren punktmutierten Peptiden bestatigt den wichtigen Beitrag der positiv geladenen Aminosauren K439 und R441. Das Peptid 17 RYYYLK, welches die Aminosauren der Leitstruktur in einer anderen Reihenfolge wiedergibt, zeigt in SPR-Messungen nur unspezifische Wechselwirkung mit dem humanen Wirtsrezeptor, was die Spezifitat der Bindung fur die Leitstruktur bestatigt. Die Bindung der Leitstruktur an das Zellrezeptorprotein ACE2 wurde auch mittels STD-NMR-Spektroskopie analysiert, wobei sowohl die thermodynamische Dissoziationskonstante KD als auch das Bindungsepitop bestimmt werden konnten. Der KD-Wert liegt im niedrigen mikromolaren Bereich und bestatigt den per SPR bestimmten KD-Wert von 41 µM. Im Rahmen einer Kooperation mit dem Bernhard-Nocht-Institut fur Tropenmedizin wurde der inhibitorische Effekt der Leitstruktur 1 auf Coronaviren getestet. Dabei zeigte sich, dass sowohl beim SARS-Coronavirus als auch beim humanen Coronavirus NL63 eine Inhibition auf die Vermehrung der viralen RNA detektiert werden kann. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte der Bindungsmodus des Hexapeptids 1 an den ACE2-Rezeptor aufgeklart werden und ein inhibitorischer Effekt gegen humane Coronaviren gezeigt werden. Das Peptid 1 eignet sich also zum Design von peptidomimetischen entry Inhibitoren gegen das SARS-CoV und andere Coronaviren. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Interaktion des S-Proteins mit dem Lektin L-SIGN untersucht werden, welches als alternativer Rezeptor fur den SARS-CoV vorgeschlagen wurde. Mittels SPR sollte ein screening von Kohlenhydraten, Peptiden und Glycopeptiden durchgefuhrt werden. Dazu wurde die kohlenhydraterkennende Domane (CRD) des L-SIGN uber unterschiedliche Methoden auf einem SPR-Chip immobilisiert. Dabei gelang es lediglich Mengen <15 fmol zu immobilisieren. Trotz der geringen Mengen an immobilisierten CRD konnten Kohlenhydrate und peptidische Liganden analysiert werden. Es wurden im Rahmen dieser Arbeit also erste Ergebnisse fur die Entwicklung eines SPR-System mit der CRD des L-SIGN erhalten. The severe acute respiratory syndrome (SARS) is a respiratory disease which is caused by the SARS coronavirus (SARS-CoV). The receptor binding domain (RBD) of the spike (S) protein of SARS-CoV mediates the attachment of the virus to its functional receptor on human cells, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). In the current studies the binding events of SARS CoV to its human cell receptors, the glycoprotein ACE2 and the lectin L SIGN, were determined. Work from M. Axmann yielded the hexapeptide YKYRYL (peptide 1) that stretches from amino acid Y438 to L443 of the RBD and shows specific binding to ACE2. Peptide 1 was suggested as lead structure to design potential entry inhibitors against the attachment of the SARS-CoV to its cell receptor ACE2. Molecular dynamic (MD) simulations were performed to investigate the binding mode of peptide 1 to ACE2. In a 3000 ps MD simulation the amino acids K439, Y440 and R441 show interactions with the receptor surface. The positively charged residues of K439 and R441 form ionic interactions with the carboxyl groups of E23 and D30 of ACE2. The aromatic side chain of Y440 shows contact to an N-glycan of the glycoprotein. A peptide library corresponding to an alanine scan of the hexapeptide 1 was analyzed using SPR to evaluate the importance of individual amino acids for binding to ACE2. The alanine scan reveals that the tripeptide motif 440YRY442 is essential for the binding of peptide 1 to ACE2. This fact confirms the results of the in silico studies. A second library with point mutated peptides was screened using SPR. Here it could be shown that the positively charged side chains of the amino acids K439 and R441 are important for the receptor binding. In the SPR screening the peptide 17 RYYYLK, which reflects the amino acids of the lead structure in a different order, reveals only unspecific interaction with the human cell receptor. This result confirms the specific interaction between the lead structure peptide 1 and the human cell receptor ACE2. STD NMR spectroscopy was used to characterize the binding event and binding epitope of peptide 1 to ACE2. The NMR experiments yielded the dissociation constant KD in the low micromolar range. This KD value is consistent with the KD value 41µM determined by SPR. To test the biological activity the inhibitory effect of peptide 1 to corona viruses was assayed in cooperation with the Bernhard Nocht Institute for tropical medicine. In vitro the hexapeptide 1 reduces the virus replication of SARS-CoV and human coronavirus NL63 as shown by real time RT-PCR assays. These results clarify the binding mode of hexapeptide 1 to the receptor ACE2 and demonstrate an inhibitory potential for human corona viruses. Using this information peptide 1 can be used to design potential antiviral drugs against the attachment of the SARS CoV and related corona viruses to human cells. In the second part of this thesis the analysis of the interaction of the viral S protein to the lectin receptor L SIGN was investigated. L-SIGN was suggested as an alternative receptor for SARS-CoV. In order to develop an SPR system for the screening of carbohydrates, peptides and glycopeptides the carbohydrat recognition domain (CRD) of L-SIGN was immobilized on a SPR sensor chip in different ways. It was only possible to immobilize <15 fmol of the CRD on the chip surface. Despite of the small amount of immobilized CRD the binding of carbohydrates and peptide ligands to L-SIGN could be analyzed. The results of this screening can be used to design an SPR system for the lectin L SIGN.