Funcionalidad de los relojes biológicos en el carpín: la hora de la alimentación como sincronizador y caracterización de ritmos de salida

La presente Tesis Doctoral aborda el estudio de interacciones entre la ingesta de alimento y el sistema circadiano de un teleosteo, el carpin dorado (Carassius auratus). El objetivo general ha sido investigar el papel del tracto gastrointestinal del carpin como un oscilador del sistema circadiano, y su capacidad para integrar senales externas (fotoperiodo y horario de alimentacion) e internas (hormonas orexigenicas). Ademas, se ha estudiado la posible participacion de dicho tracto en la produccion de melatonina, hormona clave en el funcionamiento del sistema circadiano, mediante el analisis funcional de las enzimas limitantes de su ruta biosintetica. 1. Ciclo luz/oscuridad y horario de alimentacion como sincronizadores. En la primera parte de la Tesis se ha analizado el papel de factores ambientales en la sincronizacion de la ritmicidad diaria de los genes reloj pertenecientes al bucle negativo (Per1a, Per2a, Per3 y Cry3) en el intestino del carpin. Los resultados obtenidos indican que: (1) el intestino del carpin puede sincronizarse in vivo tanto por el horario de alimentacion como por el fotociclo; (2) el alimento es una senal potente que sincroniza este oscilador periferico; y (3) ambos factores ambientales parecen actuar sobre diferentes elementos del reloj molecular. 2. Hormonas orexigenicas como sincronizadores endogenos. Se ha investigado el papel de dos hormonas orexigenicas, orexina y ghrelina, en el funcionamiento del sistema circadiano del carpin. Se estudio el efecto agudo de estas hormonas (administradas intracerebroventricularmente o intraperitonealmente) sobre la expresion de genes reloj y hormonas reguladoras de la ingesta. Los resultados obtenidos muestran por primera vez en los peces la existencia de una interaccion entre hormonas orexigenicas y la maquinaria molecular de osciladores circadianos centrales y perifericos, sugiriendo una posible funcionalidad de estas hormonas como senales de entrada al sistema circadiano del carpin. Ademas se ha encontrado una implicacion de ambas hormonas en la ritmicidad de la actividad locomotora diaria y la actividad anticipatoria a la alimentacion. 3. Funcionalidad de enzimas de la ruta biosintetica de melatonina en el tracto gastrointestinal. Se ha analizado la actividad funcional in vitro de las dos ultimas enzimas de la ruta biosintetica de melatonina, la arilalquilamina N- acetiltransferasa (AANAT) y la hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT), en el higado y el intestino del carpin a lo largo de un ciclo diario completo, encontrando la existencia de oscilaciones diarias en la actividad funcional AANAT en todos los tejidos analizados. Sin embargo, la actividad funcional HIOMT solo se detecto en la retina (tejido utilizado como control positivo), descartando por tanto, la hipotetica sintesis de melatonina en el tracto gastrointestinal del carpin. Ademas, los resultados obtenidos en ensayos de competicion de sustratos en retina, intestino e higado nos sugieren que muy posiblemente sea la isoforma AANAT1 la presente en el tracto digestivo, donde puede desempenar un papel clave en la regulacion del contenido de dopamina. 4. Dopamina y motilidad del intestino anterior en peces. Se ha investigado el posible papel fisiologico de la dopamina como candidato a regulador de la motilidad intestinal en el carpin. Observamos un efecto dual de la dopamina in vitro, que induce una respuesta contractil a concentraciones bajas y una relajacion a concentraciones altas. Los ensayos farmacologicos realizados revelan que la relajacion intestinal inducida por dopamina esta mediada por receptores de la familia D1-like presentes en las celulas musculares, a traves de un mecanismo independiente de nucleotidos ciclicos, del oxido nitrico y de la inervacion colinergica, y que interactua con la regulacion serotoninergica intestinal.