Cistatinas de cebada: proteínas de defensa contra artrópodos

Las cistatinas son un grupo de proteinas identificadas en animales, plantas y algunos microorganismos que inhiben cistein proteasas C1A, de la familia de la papaina. Las cistatinas de plantas o fitocistatinas tienen un papel endogeno relacionado con el intercambio proteico y la muerte celular programada y se ha demostrado que actuan como proteinas de defensa frente a plagas y patogenos. En cebada, Hordeum vulgare L. , se ha identificado la familia completa de cistatinas compuesta por trece miembros, HvCPI-1 a 13. Siete de ellos habian sido previamente caracterizados. En este trabajo se ha completado la caracterizacion de todos los miembros de esta familia de cistatinas y se ha evaluado su actividad frente a artropodos plaga. Todas las cistatinas de cebada mantienen conservados el motivo LARFAV, exclusivo de vegetales, y los tres motivos implicados en la union enzima-inhibidor, aunque en algunos casos con pequenas variaciones. Ademas, se ha determinado que la cistatina HvCPI-4 posee una extension carboxilo terminal con un motivo conservado implicado en la inhibicion de cistein proteasas C13 de la familia de legumainas. Las estructuras tridimensionales de las cistatinas, se han modelizado a partir de la estructura cristalizada de la orizacistatina I de arroz. Los patrones de expresion obtenidos mediante RT-qPCR han indicado que las cistatinas se expresan principalmente en semilla aunque sus mensajeros tambien se acumulan en hojas y raices. Ademas, se ha determinado la localizacion subcelular de las trece cistatinas, basicamente detectada en el reticulo endoplasmico y el aparato de Golgi, aunque la cistatina HvCPI-4 aparece tambien en el nucleo y la HvCPI-1 en el nucleo y el citoplasma. Ensayos de inhibicion in vitro frente a cistein proteasas comerciales tipo catepsina B, H, L y legumaina han mostrado una capacidad inhibitoria diferencial y especifica dentro de la familia de cistatinas de cebada. En relacion con su funcion de defensa, se han estudiado los efectos de las 13 cistatinas sobre diferentes especies de artropodos cuyos enzimas digestivos mas abundantes son de tipo cistein proteasa, dianas potenciales de las cistatinas. Concretamente, se han seleccionado: el escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata (Say) y su depredador natural, Podisus maculiventris (Say), la crisomela del maiz, Diabrotica virgifera (LeConte), el acaro, Tetranychus urticae Koch y dos pulgones, Myzus persicae (Sulzer) y Acyrthosiphon pisum (Harris). Las proteasas digestivas del acaro y de los pulgones no se conocian de forma detallada, por lo que se ha realizado una caracterizacion enzimatica de estas especies. En todas ellas se ha detectado la presencia de catepsinas L y B y leucin aminopeptidasa pero ademas, en el caso del acaro y del pulgon M. persicae se ha detectado tambien actividad catepsina D y en el caso del pulgon A. pisum se ha detectado actividad carboxipeptidasa. En ninguno de los casos se ha detectado actividad serin proteasa. Se ha determinado la capacidad inhibitoria in vitro de las 13 cistatinas frente a la actividad catepsina L y catepsina B presente en extractos proteicos de estos seis artropodos, utilizando substratos especificos. Las cistatinas han mostrado diferente especificidad por la actividad de los artropodos aunque, en general, todas son mejores inhibidores de su actividad tipo catepsina L. La cistatina HvCPI-6 ha resultado ser el inhibidor mas potente y ha sido seleccionado para realizar ensayos in vivo con 3 de los artropodos anteriormente mencionados: T. urticae, M. persicae y A. pisum. Para estudiar la toxicidad en pulgones, se han preparado dietas artificiales suplementadas con cistatina HvCPI-6 y se han analizado la mortalidad y las alteraciones en sus proteasas digestivas. En el caso de A. pisum la ingestion de la cistatina en altas concentraciones provoca la muerte del insecto, muerte que esta asociada a la inhibicion de cistein proteasas digestivas. Por el contrario, en M. persicae no se observa mortalidad a ninguna de las dosis ensayadas, lo que parece estar relacionada con la sobreproduccion de proteasas digestivas. Ademas, se han generado plantas transgenicas de Arabidopsis thaliana (L.) Heyn, que expresan la cistatina HvCPI-6, para estudiar el efecto que produce sobre M. persicae. Pulgones alimentados con las plantas transgenicas han mostrado un retraso en el desarrollo aunque no se han observado alteraciones en la descendencia. Dado que A. pisum no se alimenta de plantas de arabidopsis, se han realizado bioensayos combinados dieta/plantas de haba para estudiar los efectos de la cistatina sobre el desarrollo y la descendencia de este pulgon. Igual que en el caso de M. persicae se ha observado un retraso en el desarrollo, pero no hay modificaciones en la descendencia. El objetivo final de la utilizacion de la cistatina como transgen es la obtencion de variedades agricolas mas protegidas frente al ataque de plagas y enfermedades. Con este proposito se han generado plantas transgenicas de maiz, Zea mays L. , que expresan la cistatina HvCPI-6. Mediante bioensayos se ha podido determinar que la expresion de la cistatina en plantas provoca un retraso en el desarrollo de los acaros que se han alimentado de las plantas transgenicas, que se correlaciona con una disminucion de la actividad tipo catepsina B. Los resultados anteriores, indican que las cistatinas de cebada y en particular la cistatina HvCPI-6, suponen una via alternativa para el control de plagas y que un estudio exhaustivo de las mismas permitiria considerar la expresion piramidal (gene pyramiding) de los genes que codifican estos inhibidores junto con otros genes con caracter insecticida, para aumentar la resistencia de las plantas al ataque de artropodos y evitar la adaptacion de los mismos.