Charakterisierung von TrmB und TrmBL1, zwei Transkriptionsregulatoren im Zentrum des Zuckerstoffwechsels von Pyrococcus furiosus

Die vorliegende Arbeit beschaftigt sich mit Untersuchungen zur Funktionsweise der beiden zuckerspezifischen Transkriptionsregulatoren TrmB und TrmBL1 innerhalb des Zuckerstoffwechsels des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus. Die Aufnahme von Kohlenhydraten in die Zelle wird bei P. furiosus von zwei substratspezifischen ABC–Transportern vermittelt. Der Maltose/Trehalose-Transporter ist dabei ausschlieslich fur den Transport von Maltose und Trehalose zustandig, wahrend der Maltodextrin (MD)–Transporter spezifisch fur die Aufnahme von Maltodextrinen ist. Beide Transportsysteme sind auf genetischer Ebene in Genclustern zusammengefasst, deren Expression sowohl von TrmB als auch von TrmBL1 kontrolliert wird. Mit Hilfe von in-vitro-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die beiden Regulatoren an die jeweilige Promotorregion binden und so die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren bzw. RNA–Polymerase verhindern, was zu einer Hemmung der Transkription fuhrt. Die TrmB–vermittelte Transkriptionsrepression wird am TM–Promotor durch Maltose und Trehalose wieder aufgehoben, wahrend Maltodextrine und Sucrose fur den MD–Promotor Induktoren sind. Fur TrmBL1 wirkt Maltose an beiden Promotoren als Induktor. Neben den genannten Induktoren konnten fur TrmB auch promotorspezifische Co–Repressoren identifiziert werden. Glucose wirkt am TM– und MD–Promotor als Anti–Induktor und verstarkt die Bindung des Repressors an die DNA und damit die TrmB–vermittelte Transkriptionshemmung. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass die Induktoren des MD–Systems, Maltotriose und Sucrose, als Anti–Induktoren am TM–System wirken und umgekehrt. TrmBL1 ist homolog zu TrmB und reguliert die Expression von Genen, die fur Enzyme der Glycolyse und der Gluconeogenese kodieren. Bei Bindung an die entsprechenden Promotorregionen erkennt TrmBL1 das palindromische TGM–Motiv als Zielsequenz und kann daruber hinaus sowohl als Repressor als auch als Aktivator wirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Bindung von TrmBL1 an die Promotorregion die Expression des glycolytischen Enzyms Phosphofructokinase (PFK) gehemmt wird. Als Induktoren wirken hier Maltose, Maltotriose und Fructose. Im Gegensatz dazu aktiviert TrmBL1 die Transkription des PF0613–Gens, welches fur das gluconeogenetische Enzym Fructose–1,6–Bisphosphatase (FBPase) kodiert. Damit fungiert TrmBL1 als Repressor der Glycolyse und als Aktivator der Gluconeogenese. Es wird vermutet, dass die Position des TGM–Motivs stromabwarts oder stromaufwarts der BRE/TATA–Box bestimmt, ob TrmBL1 die Transkription reprimiert oder aktiviert. DNaseI Footprinting– und in-vitro-Transkriptionsversuche bestatigten auserdem, dass auch TrmB an den PFK–Promotor binden und die Transkription dort reprimieren kann. Ferner konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass TrmBL1 auch seine eigene Synthese autoreguliert, indem es an den TrmBL1–Promotor bindet und so die Transkription reprimiert, wobei Glucose als Induktor wirkt. Da der TrmBL–Promotor kein TGM–Motiv besitzt, lieferte dies auch den Beweis, dass diese Konsensussequenz nicht essentiell fur die Promotorerkennung durch TrmBL1 ist. Die Tatsache, dass TrmB auch an der Regulation der Zielpromotoren von TrmBL1 beteiligt ist und umgekehrt, lasst auf ein weitverzweigtes Regulationsnetzwerk innerhalb des Zuckermetabolismus von P. furiosus schliesen, in dessen Zentrum die Regulatoren TrmB und TrmBL1 stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte belegt werden, dass sowohl TrmB als auch TrmBL1 einzigartige Eigenschaften besitzen, die bisher noch fur keinen prokaryotischen Regulator beschrieben wurden: Beide Regulatoren erkennen unterschiedliche Nukleotidsequenzen an verschiedenen Promotoren und besitzen eine ausgepragte, promotorabhangige Substratspezifitat. Man geht davon aus, dass diese Regulatoren bei der Bindung an verschiedene Nukleotidsequenzen unterschiedliche Konformationen einnehmen und folglich auch verschiedene Zucker als Induktoren erkennen. Eine Mutationsanalyse der DNA–Bindedomane von TrmB und TrmBL1 enthullte eine weitere einzigartige Eigenschaft dieser ausergewohnlichen Regulatorproteine. Beide besitzen mindestens zwei verschiedene HTH–Motive und erkennen ihre jeweiligen Zielpromotoren mit unterschiedlichen Helices innerhalb ihrer N–terminalen DNA–Bindedomanen. In-vitro-Experimente belegten, dass TrmB mit seiner HTH 1–Struktur (AS 33–54) an den TM–Promotor bindet, wobei das Tyrosin an Position 50 essentiell zur Promotorerkennung ist. Der MD–Promotor wird dagegen mit der HTH 2–Struktur (AS 83–104) erkannt und gebunden, wobei das Glutamat an Position 87 eine entscheidende Rolle spielt. Auch TrmBL1 besitzt zwei verschiedene Bindehelices. Die HTH 1–Struktur (AS 32–53) scheint bei der Erkennung von Promotoren mit TGM–Motiv ausschlaggebend zu sein, wahrend uber die HTH 2–Struktur (AS 80–99) Promotoren ohne TGM–Motiv gebunden werden.