Transgenic resistance against Citrus tristeza virus (CTV) and analysis of the viral p23 protein as pathogenicity determinant in citrus

El virus de la tristeza de los citricos (Citrus tristeza virus; CTV) es el agente causal de unas de las enfermedades virales de los arboles citricos mas devastadoras en el mundo. CTV esta restringido al floema en su huesped citrico natural, y ha desarrollado tres proteinas supresoras de silenciamiento que actuan a nivel intra-(p23 y p20) e intercelular (p20 y p25) para superar la fuerte defensa antiviral del huesped. La interferencia de RNA, una aproximacion basada en el uso de dsRNA para desencadenar el silenciamiento de RNA, ha sido utilizada ampliamente para generar plantas transgenicas resistentes a virus. Considerando el importante papel de p23, p20 y p25 en la patogenesis de CTV, hemos transformado plantas de lima Mexicana con un vector intron-horquilla que porta la secuencia completa en version no traducible de los genes p25, p20, p23 y el extremo 3? -UTR de la cepa T36 de CTV, para intentar silenciar su expresion en celulas infectadas. Se ha observado resistencia completa a la infeccion viral en tres lineas transgenicas, manteniendose todas sus propagaciones asintomaticas y libres de virus tras ser inoculadas mediante injerto con CTV-T36, tanto en el portainjertos no transgenico como directamente sobre la variedad transgenica. La acumulacion de siRNA derivados del transgen fue necesaria pero no suficiente para lograr resistencia frente a CTV en las plantas. Al inocular propagaciones de las lineas transgenicas inmunes con una cepa de CTV divergente, la resistencia fue parcialmente superada, destacando la importancia de la identidad de secuencia en el mecanismo subyacente a la interferencia de RNA. Este trabajo es el primero en que se consigue resistencia completa a CTV en un huesped citrico muy sensible, actuando simultaneamente sobre los tres supresores virales de silenciamiento mediante interferencia de RNA. La proteina p23 codificada por el virus es ademas un importante factor de patogenicidad. La expresion ectopica de p23 en plantas de citricos induce aberraciones fenologicas semejantes a sintomas de CTV. Para estudiar en mas detalle el papel de p23 en la patogenesis de CTV, se ha sobre-expresado en lima Mexicana el gen p23 de CTV T36 y tres versiones truncadas del mismo bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus). Solo la version truncada, que expresa los aminoacidos del 1 al 157 (p23-? 157) indujo sintomas similares a los producidos por CTV, aunque mas suaves que los inducidos por la expresion de la proteina p23 entera (209 aminoacidos), permitiendo delimitar la region responsable de la patogenesis de p23 en citricos a un fragmento de 157 aminoacidos que incluye el dedo de zinc y los motivos basicos flanqueantes de la proteina. La actividad de p23 como supresor de silenciamiento de RNA en N. benthamiana se perdia en todos los mutantes de p23 probados, lo cual indica que la supresion de silenciamiento implica a la mayoria de las regiones de la proteina. Para profundizar mas en el papel de p23 en la patogenesis, en un siguiente paso hemos restringido la expresion de transgenes derivados de p23 a celulas asociadas al floema de lima Mexicana mediante el uso del promotor especifico de floema del virus del moteado amarillo de la comelina (Commelina yellow mottle virus, CoYMV). Se transformo lima Mexicana con construcciones que portaban el gen p23 completo, ya sea de la cepa agresiva de CTV T36 o de la suave T317, o con un fragmento que comprende el dedo de zinc y los motivos basicos flanqueantes de la primera, todas ellas bajo el control bien del promotor de CoYMV o bien del promotor constitutivo 35S. La expresion de estas construcciones en el floema dio lugar a aberraciones semejantes a los sintomas especificos de CTV, pero no a los sintomas inespecificos observados cuando se expresaba p23 de forma constitutiva. Por otra parte, la apariencia e intensidad de las aberraciones fenotipicas mas notorias similares a sintomas inducidos por CTV generadas por la expresion especifica en floema del gen p23 se relaciono positivamente con la agresividad de la cepa origen utilizada. Ademas, la expresion en tejidos floematicos del fragmento de p23 que comprende el dominio de dedo de zinc y los motivos basicos flanqueantes fue suficiente para inducir sintomas semejantes a los producidos por la infeccion con CTV, confirmando asi que la region N-terminal delimitada por los aminoacidos 1 y 157 podria determinar, al menos en parte, la patogenesis de CTV en lima Mexicana.