Development of quantum dot-based tools for in vitro and biosensing applications

Aquesta tesi descriu l’us de quantum dots (QDs) en el desenvolupament de noves eines per aplicacions biologiques. S’han utilitzat QDs comercials d’estructura core/shell de CdSe/ZnS amb propietats optiques i electroquimiques uniques gracies a les quals s’han desenvolupat diversos sensors optics i electroquimics per detectar proteines, cel·lules i ADN. Primerament es va descriure un protocol utilitzant QDs en immunocitoquimiques per visualitzar proteines intracel·lulars com la β-tubulina (proteina de microtubuls), la GM130 (proteina de l’aparell de Golgi o la EEA1 (proteina d’endosomes). L’us de QDs va aportar una considerable estabilitat i robustesa a la tecnica, demostrant que podien ser usats rutinariament com a marcadors optics en immunocitoquimiques. Posteriorment es van utilitzar com a marcadors duals optics/electroquimics per detectar cel·lules apoptotiques. Els QDs es van conjugar amb Annexina-V (AnnV), proteina de reconeixement de la fosfatidilserina, que es transloca a la superficie externa de la membrana cel·lular en cel·lules apoptotiques. El marcador resultant va permetre l’adquisicio d’imatges qualitatives utilitzant microscopia confocal, l’obtencio d’imatges d’alta resolucio utilitzant microscopia electronica de rastreig i la mesura quantitativa de cel·lules apoptotiques utilitzant citometria de flux. A mes, la voltametria d’ona quadrada es va aplicar per desenvolupar un innovador biosensor electroquimic que permetia detectar cel·lules apoptotiques de manera rapida, semiquantitativa i economica. Aquest treball va provar la versatilitat dels QDs, convertint-los en una eina unica per fer estudis complets d’un estat biologic especific en cel·lules vives, com ara l’apoptosi. Despres, l’enfoc es va posar cap al desenvolupament d’un dispositiu per testar farmacs basat en l’us de QDs i microfluidica utilitzant la mateixa estrategia de marcatge (QD-AnnV). Una serie de microcanals interconnectats es van dissenyar amb diferents geometries per dur a terme diverses funcions: el primer per preparar diferents concentracions de camptotecina (farmac pro-apoptotic model), el segon per conjugar els QDs amb l’AnnV i, l’ultim, per cultivar les cel·lules i detectar l’efecte de la camptotecina en aquestes. L’us de la microfluidica no nomes va fer els experiments mes robustos, donat que tots els passos eren gairebe automatitzats, sino que va fer el proces mes economic, ja que la despesa de reactius era menor. L’exitosa deteccio en chip de cel·lules apoptotiques va demostrar que la combinacio d’eines innovadores, com els QDs i la microfluidica, pot donar lloc a una nova generacio de plataformes de “punt de cura” (point of care) per testar farmacs. Finalment, els QDs es van utilitzar, conjugats amb estructures d’ADN en forma de forquilla anomenades Molecular beacons (MBs), per detectar acids nucleics. Els MBs estaven modificats amb una molecula extintora de manera que, quan els QDs es conjugaven amb els MBs, la seva fluorescencia s’apagava. Aquesta estrategia es va utilitzar per detectar sequencies d’ADN que, quan hibridaven amb els QD-MBs, feien obrir l’estructura de forquilla, fent recuperar la fluorescencia dels QDs. A mes, aquest proces es va integrar en un canal microfluidic transparent que permetia seguir en temps real tots els esdeveniments: la immobilitzacio dels QDs al canal, la conjugacio dels QDs amb els MBs i la hibridacio amb l’analit a detectar. Per tant es pot concloure que, els QDs, a mes de poder reemplacar els fluorofors organics, poden ser combinats amb metodes electroquimics i altres tecnologies com la microfluidica, generant un ventall de biosensors i dispositius versatils i alternatius.