Muscle Lim Protein in naïve and injured neurons

Neurone des adulten zentralen Nervensystems (ZNS) sind auf dem naturlichen Weg nicht in der Lage ihre durchtrennten Axone zu regenerieren. Obwohl die Neurone des peripheren Nervensystems (PNS) hingegen relativ effizient neue Axone bilden konnen, fuhrt diese Regeneration jedoch oft nicht zu einer vollstandigen Wiederherstellung der Funktion im betroffenem Gewebe. Die Entwicklung neuer Therapieoptionen, um die axonale Regeneration zu fordern, setzt ein detailliertes Verstandnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen voraus. Muscle Lim Protein (MLP) gilt bislang als ein muskelspezifisches Protein. Es ist besonders stark im Herzgewebe exprimiert. Dort ubernimmt MLP viele wichtige Funktionen. Zwei Studien haben bereits festgestellt, dass die mRNA von MLP auch in axotomierten Neuronen des PNS hochreguliert wird (Newton et al., 2000; Stam et al., 2007). Dennoch wurde noch nie untersucht, ob MLP dort tatsachlich als Protein vorliegt bzw. wie schnell, wie lange und in welchen Zellen genau es exprimiert wird. Auch uber die Funktion von MLP in Neuronen ist nichts bekannt. Daruber hinaus wurde seine Expression im intakten Nervengewebe noch nie untersucht. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Expression von MLP in Spinalganglien der Ratten nach einer Verletzung des Ischiasnervs untersucht. Dabei konnte die bereits zuvor beschriebene Induktion der Mlp-mRNA bestatigt werden und daruber hinaus wurde in ca. 10% der axotomierten Neuronen zum ersten Mal auch MLP als Protein nachgewiesen. Die meisten von ihnen konnten sieben Tage nach einer Ischiasnervverletzung nicht einer der typischen Subpopulationen der Spinalganglienneurone zugeordnet werden. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass der Grosteil der MLP-produzierenden Zellen aus der Subpopulation der Isolektin B4-positiven Nozizeptoren hervorgingen, welche in Folge der Axotomie ihre Fahigkeit das Lektin zu binden verloren haben. In dem zweiten Teil dieser Doktorarbeit sollte uberpruft werden, ob MLP auch wahrend der embryonalen oder der postnatalen Entwicklung der Neurone exprimiert wird. Hierfur wurden embryonalen und postnatalen Retinae von Ratten mittels quantitativer PCR, Western Blot-Analyse und Immunhistochemie untersucht. Tatsachlich wurde eine Hochregulation von MLP in den Retinae zwischen dem embryonalen Tag 20 (E20) und dem postnatalen Tag 14 (P14) festgestellt. Das Protein wurde ausschlieslich in cholinergen amakrinen Zellen gebildet. Dabei waren alle diese Zellen positiv fur MLP zwischen P7 und P14, regulierten die Expression des Proteins jedoch daraufhin komplett wieder herunter. Fur die zukunftige Aufklarung der Rolle und des Wirkmechanismus von MLP in der axonalen Regeneration wird unter anderem die Durchfuhrung von Zellkultur-Assays mit genetisch veranderten Neuronen notwendig sein. Bekanntermasen existiert bislang jedoch keine Methode, die ein effizientes Einschleusen vom genetischen Material in primare adulte Neurone in vitro ermoglicht. Aus diesem Grund wurde dafur im Rahmen dieser Doktorarbeit ein neuer Ansatz basierend auf der Verwendung von Baculoviren etabliert. Die eingesetzten Viren (BacMam) waren mit dem Glykoprotein VSV-G pseudotypisiert und ermoglichten die Expression von Transgenen gesteuert durch CMV-Promotoren. BacMam-Vektoren erreichten reproduzierbare Trasduktionsraten von bis zu 80% in Zellkulturen der RGZ und der Spinalganglienneuronen. Dabei wurden die eingeschleusten Gene bereits innerhalb von 24 Stunden nach der Zugabe von Viren exprimiert. Daruber hinaus haben in Fallen, in denen Zellen mit zwei verschiedenen Viren gleichzeitig behandelt wurden, alle transduzierten Neurone beide Reportergene exprimiert, was die Verwendbarkeit des BacMam-Systems fur Co-Transduktionsexperimente ermoglicht. Mit Cre- und hIL6-Bakuloviren haben wir zudem die Funktionalitat der baculoviral exprimierten Proteine bestatigen konnen, was die Einsetzbarkeit der Methode fur neuronale Assays untermauert.