Relevanz der Ubiquitinierung für die Resektionsregulation in G1-Phase-Zellen an schwerioneninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen

Infolge endogener und exogener Einflusse kommt es jeden Tag zu Schaden an der DNA, dem Trager der gesamten genetischen Information. Der DNA-Doppelstrangbruch (DSB) gilt hierbei als schwerwiegendster DNA-Schaden, infolgedessen von der Zelle Signalkaskaden eingeleitet werden, um die entstandenen Schaden uber verschiedene Reparaturmechanismen zu beheben. Ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der DNA-Schadensantwort (DNA damage response = DDR) ist die posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen durch Ubiquitinierung. Neben den beiden Haupt-DSB-Reparaturmechanismen, der spezifisch fur S/G2 resektionsabhangigen Homologen Rekombination (HR) und der stetig verfugbaren klassischen Variante der Nicht-homologen Endverknupfung (classical non-homologous end joining = c-NHEJ), besitzt die Zelle zudem die Moglichkeit DSBs wahrend des gesamten Zellzyklus resektionsabhangig uber alternative Wege der Endverknupfung (alt-EJ) oder den resektionsabhangigen Weg des c-NHEJ zu reparieren. Wahrend sich die HR einer homologen Matrize als Vorlage zur Reparatur bedient und daher fehlerfrei vonstattengeht, kommt es sowohl beim klassischen NHEJ (c-NHEJ) als auch bei alternativen Wegen der Endverknupfung (alt-EJ) haufig zu kleineren Insertionen oder Deletionen, wodurch die Wahrscheinlichkeit fur chromosomale Aberrationen deutlich erhoht ist. Die Wahl des Reparaturwegs wird durch den Schritt der DNA-End-Prozessierung durch Resektion entscheidend beeiflusst. Veroffentlichungen zeigten, dass mit steigendem linearen Energietransfer (linear energy transfer = LET) und damit steigender DNA-Schadenskomplexitat die DSB-Reparatur nicht nur in S/G2, sondern auch in G1 vermehrt resektionsabhangig verlauft. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Regulation der DNA-End-Resektion in G1-Phase-Zellen nach Induktion komplexer DSBs genauer zu untersuchen. Da veroffentlichte Studien belegten, dass fur die DDR und auch Resektion essentielle Proteine in der S/G2-Phase durch Ubiquitinierung reguliert werden, wurde bei den durchgefuhrten Untersuchungen ein besonderes Augenmerk auf die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung als moglichen Resektionsregulator gelegt. Die Relevanz dieser Form der Modifikation fur die DDR nach Induktion von DNA-Schaden durch Bestrahlung bestatigten Ubiquitin-Pulldown-Analysen, in denen deutlich zu erkennen war, dass nach Bestrahlung mit Rontgen und vor allem hoch-LET Eisenionenbestrahlung Proteine vermehrt ubiquitiniert wurden. Fur S/G2 war bekannt, dass die E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 Resektion fordert, indem einerseits der Resektionsantagonist Ku80 infolge dessen Ubiquitinierung durch RNF138 vom Schaden entfernt und exzessivere Resektion ermoglicht wurde. Andererseits wurde beschrieben, dass die Rekrutierung des Resektionsfaktor CtIP durch dessen Ubiquitinierung ebenfalls durch RNF138 erleichtert wird. Eine siRNA-basierte Herunterregulation sowie der komplette Knockout der Ubiquitin-Ligase RNF138 demonstrierte die Wichtigkeit von RNF138 fur die Resektion in beiden Zellzyklusphasen, G1 und S/G2, da die Anzahl an Resektions- (RPA-) positiven Zellen nach Induktion komplexer Schaden in RNF138-depletierten Zellen deutlich verringert war. Untersuchungen zum RNF138-Zielprotein Ku80 offenbarten, dass der Resektionsantagonist Ku80 nach Induktion komplexer DSBs ungeachtet der Verfugbarkeit von RNF138 und der Zellzyklusphase von der Schadensstelle entfernt wird. Resektions- und Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF8-depletierten Zellen deuteten in diesem Zusammenhang vielmehr auf eine Beteiligung von RNF8 bei der Resektionsregulation in G1 durch Ubiquitinierung von Ku80 hin. Studien zum RNF138-Target CtIP zeigten nach Induktion komplexer Schaden durch Ionen- sowie Laserbestrahlung eine deutlich verringerte Rekrutierung des Resektionsfaktors an DSBs nicht nur in RNF138-depeltierten S/G2-, sondern auch in G1-Phase-Zellen. Zudem war mittels Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF138-KO-Zellen kein CtIP in seiner ubiquitinieten Form nachzuweisen. Dies belegte, dass CtIP auch in G1-Phase-Zellen ein Zielprotein von RNF138 ist. Somit spielt die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung auch bei der Regulation der Resektion in G1-Zellen eine wichtige Rolle. Abschliesende DSB-Reparatur- sowie Zelluberlebensstudien belegten eine Relevanz der E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 fur die DSB-Reparatur und das klonogene Zelluberleben nach niedrig-energetischer hoch-LET Kohlenstoffionenbestrahlung (Primarenergie 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm). Der Vergleich von DSB-Reparaturanalysen durch Bestrahlung mit anderen Strahlenqualitaten induzierter DSBs stellte eine Bedeutung von RNF138 fur die DSB-Reparatur sowie das klonogene Zelluberleben mit steigender Komplexitat der induzierten Schaden heraus. Zusammenfassend kann demnach festgehalten werden, dass die Ubiquitin-Ligase RNF138 fur die Ubiquitinierung des Resektionsfaktors CtIP auch in G1 nach Induktion komplexer Schaden wichtig ist, dass sich Auswirkungen einer RNF138-Defizienz auf die DSB-Reparatur und das klonogene Zelluberleben jedoch erst nach Induktion sehr komplexer Schaden wie durch Kohlenstoffionenbestrahlung (Primarenergie: 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm) erkennen lassen. Wissend, dass ioneninduzierte, komplexe DSBs unabhangig von der Zellzyklusphase vermehrt resektionsabhangig repariert werden und die Ubiquitin-Ligase RNF138 in beiden Zellzyklusphasen fur die DNA-End-Resektion in seiner Funktion CtIP zu ubiquitinieren von entscheidender Bedeutung ist, konnte die Inhibition der Ubiquitin-Ligase ein aussichtsreicher Ansatzpunkt fur die Radiotumortherpaie mit Schwerionen darstellen. Wahrend durch Bestrahlung mit Schwerionen im Bereich des Normalgewebes wenig Dosis freigesetzt und Schaden geringer Komplexitat hervorgerufen werden, wird der Hauptteil der Dosis im sog. Bragg-Peak im Zielgewebe, dem Tumor, appliziert. Folglich entstehen im Tumorgewebe komplexe Schaden an der DNA, die im Gegensatz zu den weniger komplexen Schaden im umliegenden Normalgewebe resektionsabhangig uber CtIP repariert werden mussen, was wiederum die Verfugbarkeit der Ubiquitin-Ligase RNF138 erfordert. Die RNF138-Inhibition konnte somit gezielt das Uberleben der Tumorzellen negativ beeinflussen und als Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Systems in der Tumortherapie in Kombination mit Schwerionenbestrahlung Anwendung finden.