Epidemiology of peste des petits ruminants virus in Ethiopia and molecular studies on virulence

La peste des petits ruminants (PPR) est une maladie infectieuse, contagieuse des petits ruminants domestiques ou sauvages. Elle se caracterise par une hyperthermie elevee (autour de 41°C), du jetage, des ecoulements oculaires, une stomatite necrosante, de la diarrhee profuse et generalement une forte mortalite. En Afrique, elle peut avoir differentes incidences cliniques sur les moutons ou les chevres, depuis l'infection subclinique jusqu'a une infection aigue letale. En Ethiopie, la PPR clinique est rarement decrite et l'etude de la circulation virale etait jusqu'a present peu developpee. Dans ce travail, nous montrons la presence d'anticorps contre le virus de la PPR sur un grand nombre de moutons, chevres, vaches et chameaux ethiopiens et nous confirmons la transmission naturelle du virus PPR chez ces animaux sans manifestation clinique detectable. Cette absence apparente de pathogenicite peut etre liee a une resistance genetique particuliere des races de petits ruminants presentes en Ethiopie ou a une variation de la virulence des souches de virus PPR. Afin d'etudier ce dernier point, nous avons entrepris des etudes in vitro sur des souches isolees en Ethiopie et dans differents pays en comparaison avec une souche vaccinale obtenue par attenuation par passages en serie sur culture cellulaire et d'autres souches de morbillivirus. Dans un premier temps, nous avons teste la capacite du virus PPR a infecter differents systemes cellulaires. Nous etablissons que les cellules VERO (fibroblastes de rein de singe) et 293T (cellules epitheliales de rein humain) permettent la replication du virus PPR comme celle du virus de la peste bovine. En revanche, les cellules B95a (cellules lymphoblastoides B de singe) ne multiplient que le virus de la peste bovine. La capacite d'une cellule a supporter la replication du virus est de nature a influer son pouvoir pathogene et l'epidemiologie de la maladie. La difference de sensibilite des cellules au virus PPR peut etre lie a l'affinite de la glycoproteine d'enveloppe virale H pour son ou ses recepteurs cellulaires utilises notamment par le virus de la peste bovine. Pour aborder cette question, nous avons entrepris des comparaisons de sequences au niveau de la proteine H du virus PPR, en lien avec ce qui a ete deja decrit sur d'autres morbillivirus. Pour completer cette etude sur la virulence, nous avons sequence les promoteurs de plusieurs souches de virus PPR et conduit une analyse des mutations pouvant jouer un role dans l'attenuation. En effet, les promoteurs viraux des morbillivirus determinent la transcription des ARNm viraux et la replication du genome viral : la modification de leur sequence peut donc affecter leur efficacite et influer sur la virulence de la souche concernee. Nous observons 7 mutations sur les promoteurs de la souche vaccinale du virus PPR en comparaison avec les autres souches virulentes. Certaines mutations sont retrouvees sur les autres morbillivirus, d'autres sont specifiques du virus PPR. De cette approche moleculaire, nous deduisons egalement l'interet d'utiliser les sequences des promoteurs du virus, relativement tres variables par rapport au reste du genome, pour mener des etudes de phylogeographie et de comparaison entre paramyxovirus. Le document de these a ete organise en 6 chapitres. Le premier concerne l'histoire naturelle de la PPR avec la description du virus, du genome, de l'epidemiologie, de la transmission, des symptomes, de la pathologie, de l'immunologie, du diagnostic, de la lutte contre la maladie et des aspects economiques en Afrique sub-saharienne. Le deuxieme chapitre traite de la biologie comparative du virus PPR avec les autres morbillivirus. Le troisieme chapitre concerne les travaux d'epidemiologie de la PPR effectues en Ethiopie. Le quatrieme volet de ce travail reprend les etudes sur la specificite cellulaire du virus PPR et la comparaison des sequences sur la proteine H. Le cinquieme chapitre expose les analyses de sequence des promoteurs genomique et antigenomique du virus PPR. Enfin, la derniere partie comprend une discussion generale et des perspectives. ABSTRACT : Peste des petits ruminants (PPR) is an acute and highly contagious viral disease of small ruminants, which is characterised by high fever, ocular and nasal discharge, pneumonia, necrosis and ulceration of the mucuous membrane and inflammation of the gastro-intestinal tract leading to severe diarrhoea and high mortality. In Africa, goats are severely affected while sheep undergo a mild form or rarely suffer clinical disease. PPR is one of the most important economical diseases in Ethiopia. Clinical PPR is confirmed in Ethiopian goats, however, its circulation in other animals has never been described. In the present work, we showed that the antibody seroprevalence in camel, cattle, goat and sheep confirmed natural transmission in these animals without clinical disease. The apparent absence of pathogenicity in these animals may have been due to host resistance or loss of virulence of the virus strain. We have further investigated the latter point by in vitro studies on PPRV comparing strains from Ethiopia and other countries with the vaccine strain which has been attenuated after several cell culture passages. In a first approach, virulence of PPRV was monitored in cell culture system and the use of virus specific monoclonal antibodies enabled to detect differences in virulence between PPRV and RPV. Vero (primate origin) and 293T (human) cell lines supported virus replication permitting the in vitro growth of both PPRV and RPV. In contrast to RPV, B95a (marmoset B) cells infected with PPRV were non permissive. The capability of cells to support active virus replication, which may result in intercellular spread and induce damages in infected cells, has implications on the pathogenesis and epidemiology. Cellular receptors are major determinants of host range and tissue tropism of a virus. The difference in infectivity of PPRV and RPV may have depended on the H protein epitopes and their cellular receptors. Therefore, we decided to compare the amino acid epitope of H protein of PPRV with that of other morbilliviruses. As part of our investigation of virulence factors, we have sequenced and compared genome and antigenome promoters of a vaccine strain with field strains of PPRV. The promoters contain the polymerase binding sites to initiate and generate the positive-strand replication and transcription of mRNAs. Nucleotide base change differences between vaccine strain and field strains would provide molecular basis for attenuation. Alignment of the genome promoter sequences revealed seven nucleotide mutations at certain positions. Our finding on nucleotide mutation on PPRV are in agreement with the nucleotide changes in rinderpest virus and other morbillivirus promoter regions between vaccine strain and wild type virus. Certain mutations were specific to PPRV. The promoter sequences were clustered around the geographic origin of the viruses and were lineage specific. Phylogenetic analysis of PPRV promoters was used for PPR phylogeograhy, and for comparison with other paramyxoviruses. The thesis is divided in 6 chapters. The first chapter deals with the natural history of PPR including the virus, the genome, epidemiology, transmission, clinical signs, immunology, diagnosis, control and its economic cost in the low income subsistence farming systems in sub-Saharan Africa. The second chapter is about comparative biology of PPRV with regard to other groups of morbillivirus genus in the Paramyxoviridae family. The third chapter deals with field study and observations on epidemiology of PPR in Ethiopia. In chapter four, PPRV virulence was monitored in cell culture system and comparison of H protein epitopes. In chapter five, sequence analysis of genome and antigenome promoters of PPRV was described In chapter six, general discussion and recommendations were forwarded.