NMR-spektroskopische Charakterisierung der nicht stabil faltenden Villin-Headpiece36-Mutante mut8

Villin Headpiece 36 (HP36) stellt als Teil des Villin eine autonom faltende kleine Untereinheit aus 36 Aminosauren dar, dessen Tertiarstruktur 1997 von McKnight et al. uber NMR-Spektroskopie gelost wurde. Aufgrund der geringen Grose und der sowohl strukturell als auch funktionell guten Charakterisierung, ist HP36 ein beliebtes Modellpeptid in der Bioinformtik. Diese nutzt HP36 in ausgestreckter Konformation, um die Faltung des Peptids zu dessen stabiler Tertiarstruktur uber Zeitraume um 200 ns zu simulieren. Nach HP36 wurden auch Mutanten und Verwandte des Peptids auf deren Stabilitat und Faltungseigenschaften untersucht. So wurde deutlich, dass einzelne Mutationen wie F18K oder P62A drastische Auswirkungen auf die Struktur des Peptids haben und dazu fuhren, dass HP36 nicht mehr nativ falten kann. Andere Austausche von Aminosauren dagegen beeinflussen die Faltung kaum, so weicht die Tertiarstruktur der G34L-Mutante kaum von der des Wildtyps ab. Neben den Faltungssimulationen fur HP36, ist die Bioinformatik auch daran interessiert, Peptide auf verschiedene Kriterien ihn zu optimieren. Fur die medizinische Forschung werden als Medikamente eingesetzte Peptide (z. B. Insulin) immer interessanter. So ware es ein goser Fortschritt, wenn uber bioinformatische Simulationen Peptide so designed werden konnten, dass sie z. B. resistent gegenuber Proteasen, gut loslich in wassriger Umgebung und nicht toxisch fur den Menschen sind und zudem noch ihren medizinischen Zweck erfullen. Solche bioinformatisch verfolgbaren Ziele wurden dazu beitragen, wesentlich schneller, praziser und kostengunstiger Therapeutika auf Peptid-Basis herzustellen. Um diese Idee umsetzen zu konnen, werden hochkomplizierte Algorithmen benotigt, die mehrere Kriterien gleichzeitig optimieren konnen. Zu den bekannten Optimierungsverfahren in der Bioinformatik zahlen evolutionare Algorithmen, welche die naturlich Evolution mit Mutation und Selektion als Vorbild nehmen. Der von der Bioinformatik-Gruppe um Prof. Dr. D. Hoffmann (ZMB, Universitat Duisburg-Essen) entwickelte EMOS (Evolutionary Multiobjective Optimization System) ist ein evolutionarer Algorithmus, der auf mehrere Kriterien hin Peptide optimiert. Dieser Algorithmus wurde erfolgreich auf das Kriterium Stabilitat hin getestet. Dafur wurde die instabile F18K-HP36-Mutante uber EMOS wieder strukturell stabilisiert. Es ergab sich ein Ensemble an Strukturen, in dem u. a. auch die G34L-Mutante auftrat. Diese erwies sich nachweislich sogar als stabiler gegenuber dem Wildtyp, das von der Bioinformatik postulierte Ergebnis wurde uber NMR-Spektroskopie verifiziert. Eine andere Sequenz aus dem vorhergesagten Ensmble, r1g11i1, fiel dabei durch die hohe Anzahl an acht Mutationen auf. Fur diese Mutante wurde von EMOS ebenfalls eine hohe strukturelle Stabilitat vorhergesagt. Fur r1g11i1 wurde uber eine MDSimulation die Struktur new2 vorhergesagt. In dieser Arbeit wurde das chemisch synthetisierte r1g11i1, bezeichnet als mut8, uber NMR-Spektroskopie charakterisiert und mit der EMOS-Vorhersage verglichen. Dafur wurden homonukleare 2D-Spektren (COSY, TOCSY, NOESY) aufgenommen und zugeordnet. Die Informationen aus den Signalen des NOESY-Spektrums dienten dazu, sowohl eine Sekundarstrukturanalyse des Peptids durchzufuhren als auch ein Ensemble an moglichen Tertiarstrukturen zu berechnen. Dabei wurde deutlich, dass mut8 gut definierte α-Helices am N- und C-Terminus besitzt (Aminosauren 5 bis 10 und 30 bis 34 [Mittelung der NMR-Daten]), wohingegen eine mittlere Helix (AS 23 bis 26) weniger gut bestimmt werden konnte. Entgegen der prazise bestimmbaren Sekundarstrukturen von mut8, konnte keine eindeutige Tertiarstruktur berechnet werden. mut8 aggregierte nicht in Losung, einige NOEs waren nicht miteinander kombinierbar und trotzdem waren gut definierbare α-Helices bestimmar. Aufgrund dessen wurde vermutet, dass es sich bei der HP36-Mutante um ein dynamisches Peptid handelt, dessen Konformationen so schnell ineinander ubergehen, dass sie nicht mehr uber ein NOESY-Spektrum auflosbar sind. Um dieser Annahme nachkommen zu konnen, sollte ein heteronukleares HSQCNOE-Spektrum aufgenommen werden, wofur wiederum mut8 15N-markiert vorliegen musste. Dafur wurde mut8 erfolgreich kloniert, 15N-markiert exprimiert und gereinigt. Der N-terminale Abbau von mut8 wahrend der Expression wurde zwar nicht gestoppt, jedoch minimiert. Es wurde ein HSQCNOESpektrum aufgenommen, dessen Signale mit Hilfe eines SOFAST-HMQC-Spektrums der chemisch synthetisierten mut8-Probe eindeutig zugeordnet werden konnten. Durch die Aufnahme des HSQCNOE-Spektrums und der Berechnung des hetNOE (η) wurden die dynamischen Eigenschaften von mut8 bestatigt. So erwies sich mut8 als insgesamt dynamisch, besonders grose Flexibilitat konnte an den Termini sowie im mittleren Schleifen-Bereich des Peptids festgestellt werden. Diesen Informationen zufolge hat EMOS das Ziel, mit r1g11i1 eine stabile Mutante vorherzusagen, nicht erreicht. Somit muss der Algorithmus weiterhin optimiert werden. Da r1g11i1 jedoch erstens eine stabile Sekundarstruktur aufweist und zweitens aus einem Cluster von Sequenzen stammt, fur dessen G34L-Mutante eine erhohte Stabilitat nachgewiesen wurde, ist das Potential zur korrekten Vorhersage von struktureller Stabilitat gegeben. Die vorhergesagte Struktur new2 sollte abschliesend darauf uberpruft werden, ob sie sich genauso verhalt wie mut8, d. h. ob dieselben Sekundarstrukturelemente zu finden und ob die dynamischen Eigenschaften ebenfalls gleich sind. Dafur wurden von Manuel Prinz (Bioinformatik, AG Hoffmann) uber Bestimmung von NOEs und DSSP-Rechnungen gezeigt, dass in new2 die α-Helices etwa von Aminosauren 4 bis 10 und 23 bis 32 auftreten (eine mittlere Helix war auch hier nur masig gut definiert), diese Ergebnisse somit mit den ermittelten Werten fur mut8 ubereinstimmen. Ebenfalls durchgefuhrt wurden von Manuel Prinz RMSF-Kalkulationen, uber welche die Danymik von new2 bestatigt wurde. Auch hier stimmten die Daten mit denen fur mut8 uberein. Interessanterweise zeigte eine zusatzliche RMSF-Rechnung des HP36-Wildtyps (1vii), dass new2 bzw. mut8 sich insgesamt dynamischer verhalt als der Wildtyp. Die Rechenleistung, die hinter EMOS steckt, ist auserst komplex. So wird es auch weiterhin notig sein – nach erfolgter Optimierung des Algorithmus – uber EMOS getroffene Vorhersagen zu uberprufen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse konnen dazu dienen, zuerst EMOS zu verbessern und Resultate aus neuen Vorhersagen fur HP36-Mutanten schnell und effizient zu uberprufen.