Etude du cycle des vésicules synaptiques en microscopie électronique sans fixateur

Les synapses chimiques sont des structures specialisees permettant une transmission d'information unidirectionnelle, d’un element presynaptique vers un element postsynaptique. L’organisation des terminaisons presynaptiques permet la conversion d’un potentiel d’action en signal chimique. Elles se presentent sous la forme de varicosites axonales contenant des vesicules synaptiques (VSs) qui concentrent le neurotransmetteur (NT). Une partie des VSs sont apposees (ancrees) a une region de la membrane plasmique, la zone active (ZA ; Bennett et al. 1992, Siksou et al. 2009). La ZA est situee face a l’accumulation postsynaptique des recepteurs au NT. La depolarisation d’une terminaison par un potentiel d’action active des canaux calciques dependants du voltage. L’influx de calcium qui en resulte entraine la fusion d’une fraction des VSs ancrees avec la membrane plasmique en moins d’une milliseconde, permettant la liberation de NT (Sabatini et Regehr 1996, Lisman et al. 2007). Une endocytose compensatoire permet ensuite la reformation de VSs (Rizzoli et Betz, 2005). Des questions se posent encore quant a ce trafic regule. Nous avons etudie la regulation de l’ancrage des VSs et developpe un outil pour analyser le cycle des VSs en microscopie electronique (ME). La premiere partie de mon travail de these a porte sur la regulation du nombre de VSs ancrees a la ZA. Notre objectif etait de savoir si l’ancrage etait regule specifiquement ou en coordination avec les autres parametres morphologiques du bouton, et de determiner le role de Rab3-Interacting Molecules (RIMs), proteines centrales de la ZA, dans cette regulation. La regulation de l’ancrage a ete etudiee sur un modele de cultures organotypiques de tranches d’hippocampe dont l’activite est bloquee 3 jours par l’application de tetrodotoxine. Ces tranches ont ete immobilisees par congelation sous haute pression (CHP) pour etre observees en ME sans les artefacts induits par les fixations aldehydiques. Le blocage d’activite entraine une augmentation du nombre de VSs ancrees, de la taille de la ZA, et du nombre de recepteurs postsynaptiques au glutamate de type GluA2. Le nombre de VSs total dans le bouton et la taille du bouton ne changent pas. En immunocytochimie Nous n’avons pas observe de modification de la quantite moyenne de proteines RIM1/2 dans les terminaisons presynaptiques sous l’effet du blocage d’activite. Enfin, les enregistrements electrophysiologiques ne revelent pas de modification de frequence des courants excitateurs miniatures malgre l’augmentation du nombre de VSs ancrees. Ces resultats montrent une regulation specifique de la taille de la jonction synaptique par l’activite neuronale et indiquent que le nombre de VSs ancrees n’est par regule par la quantite de RIM.La deuxieme partie de mon travail a consiste a developper un outil d’etude du cycle des VSs. En effet, la ME ne permet pas d’observer des evenements dynamiques, tandis que la resolution spatiale des microscopes optiques est insuffisante pour observer directement les VSs. Nous avons voulu associer une stimulation optogenetique de neurones avec leur immobilisation rapide par CHP, afin de pouvoir observer en ME les VSs a des temps precis apres la stimulation. Nous avons travaille sur des cultures dissociees de neurones d’hippocampe de rat. Ces neurones ont ete infectes avec un Adeno-Associated Virus exprimant une proteine, la ChannelRhodopsine2, pour les rendre activables par des stimulations lumineuses. Une collaboration avec Leica Microsystems a permis de modifier l’appareil de congelation (HPM) pour (i) stimuler les neurones dans l’HPM, et (ii) synchroniser cette stimulation avec la congelation. Ce nouvel outil devrait permettre dans le futur une analyse du trafic des VSs a tres haute resolution temporelle et spatiale.