RNA silencing suppression, a novel function for P1 serine proteases of viruses of the family Potyviridae

Silenciamiento de RNA, defensa frente a infecciones virales y supresores de silenciamiento. El termino silenciamiento de RNA, de manera colectiva, hace referencia a diversas vias que controlan, mediante regulacion de la expresion genica, una gran variedad de procesos fisiologicos, tales como patrones de desarrollo, respuestas a condiciones de estres, mantenimiento de la estabilidad genica y defensa frente a acidos nucleicos invasores, en animales, plantas y hongos. Estos sistemas de regulacion se activan por moleculas de RNA de banda doble, total o parcialmente complementarias, que son procesadas por enzimas de tipo RNAsa III pertenecientes a la familia Dicer para producir pequenos (aproximadamente 21-24 nt) RNAs bicatenarios con 2 nt colgantes en sus extremos 3? Estas pequenas moleculas se asocian luego con complejos efectores que contienen una proteina de la familia Argonaute, para guiarlos, por complementariedad de bases, hacia los genes diana (Baulcombe, 2005). Estos complejos ribonucleoproteicos pueden producir silenciamiento post-transcripcional, mediado por un corte especifico, desestabilizacion o represion de la traduccion de los RNAs diana, o inducir cambios epigeneticos y remodelacion de la cromatina inhibiendo asi la transcripcion (Ghildiyal & Zamore, 2009; Vaucheret, 2008; Verdel et al., 2004). Existen varios tipos de RNAs pequenos, los cuales se clasifican segun su biogenesis. En plantas, por ejemplo, existen principalmente dos clases: microRNAs y RNAs pequenos interferentes [small interfering (si)RNAs](Chen, 2009). Nuestro conocimiento acerca del silenciamiento de RNA en plantas deriva ampliamente de los analisis realizados en la planta modelo A. thaliana. En este organismo, la maquinaria de silenciamiento esta formada por: i) cuatro proteinas de tipo Dicer, ii) diez proteinas de la familia Argonaute y iii) seis RNA polimerasas dependientes de RNA, que estan implicadas en la amplifican del sistema. Trabajos realizados con este organismo muestran como las diversas vias de silenciamiento de RNA estan formadas por diferentes combinaciones de modulos que incluyen un numero limitado de componentes que actuan de manera parcialmente redundante constituyendo redes complejas altamente reguladas que actuan sobre el mRNA o la cromatina. Esta bien establecido que el silenciamiento de RNA actua en plantas como respuesta inmune frente a infecciones virales (Mlotshwa et al., 2008b). Tanto en la infeccion de virus con genoma de DNA como en la de aquellos con genoma de RNA la maquinaria de silenciamiento del huesped produce siRNAs virales que dirige a los complejos efectores para degradar a los acidos nucleicos invasores. Por su parte, los virus han tenido que evolucionar para poder escapar de esta barrera defensiva y ser capaces de establecer una infeccion. En el ano 1998 tres grupos de manera independiente descubrieron que la proteina potyviral HCPro suprimia el silenciamiento de RNA (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau & Carrington, 1998). Diferentes aproximaciones se han utilizado desde ese momento para identificar un gran numero de factores virales con la misma capacidad que HCPro, indicando que la expresion de proteinas con actividad supresora de silenciamiento es una estrategia comun empleada por los virus para evadir esta respuesta inmune de las plantas. Los supresores de silenciamiento no tienen secuencias de aminoacidos conservadas ni evidentes similitudes estructurales. Esta clara divergencia sugiere que han surgido en eventos evolutivos recientes e independientes. Solo se han llevado a cabo estudios detallados de los mecanismos moleculares de supresion de silenciamiento para unas pocas proteinas supresoras, pero todo apunta a que estos factores virales tienen mecanismos de accion muy especificos. La familia Potyviridae de virus de plantas: La familia Potyviridae es probablemente el grupo mas grande de virus de plantas (Berger et al., 2005). Incluye al genero Potyvirus con sus mas de cien miembros definidos (y con el mismo numero de miembros tentativos), caracterizados por ser transmitidos por pulgones. Los otros virus con genoma monopartido de la familia estan distribuidos en los generos Macluravirus, tambien transmitidos por pulgones, Ipomovirus, transmitidos por mosca blanca, y Rymovirus y Tritimovirus, transmitidos por acaros. Los miembros del genero Bymovirus, el restante genero de la familia, tienen genoma bipartito y se transmiten por plasmodioforos. Virtualmente, cualquier cultivo de uso agronomico puede sufrir perdidas causadas por uno o mas miembros de esta gran grupo viral, rasgo que le da a la familia Potyviridae un gran interes socioeconomico. Los virus de la familia Potyviridae tienen un genoma de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva con un tamano que va, para los miembros monopartidos, desde 8.2 hasta 11 kb. El RNA genomico tiene una cola de poli A en su extremo 3? , y a diferencia de los mRNAs celulares, presenta una proteina viral unida covalentemente a su extremo 5? (VPg) en lugar de una estructura ? cap? (Riechmann et al., 1992). El genoma de los potyvirus se encapsida en viriones helicoidales flexibles de una longitud de entre 680 y 900 nm y una anchura entre 11 y 15 nm, que estan formados por unas 2.000 unidades de un unico tipo de proteina estructural (CP) (Shukla et al., 1994). El RNA genomico de los potyvirus tiene un marco de lectura abierto que se traduce en una poliproteina de gran tamano, que se procesa proteoliticamente por proteasas virales. Asi pues, los potyvirus son similares en cuanto a estructura genomica y estrategia de expresion al resto de miembros del super grupo de virus tipo Picorna. En la mayoria de los miembros monopartidos de la familia, los siguientes productos forman la poliproteina viral (desde el N- hasta el C-terminal): P1, HCPro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa(VPg+Pro), NIb y CP. Adicionalmente, un producto viral llamado P3+PIPO, embebido en la region de P3 y generado por un cambio en el marco de lectura, es producido. De manera sorpresiva, se han hallado recientemente excepciones en la estructura genomica de algunos virus aun incluidos en el genero Ipomovirus, los cuales carecen en su genoma de la region que codifica a la proteina HCPro (Janssen et al., 2005; Li et al., 2008; Mbanzibwa et al., 2009). Inicialmente, HCPro fue considerada la unica proteina de los virus de la familia Potyviridae con actividad supresora del silenciamiento, por lo que se asumio que era esencial para todos ellos. La primera evidencia de la existencia de la divergencia genetica marcada por la ausencia de HCPro se descubrio al analizar la secuencia del genoma de CVYV, en donde ademas se observo la existencia de un cistron extremadamente largo para la proteina P1 (Janssen et al., 2005). Con estos antecedentes, el objetivo general de este trabajo de tesis doctoral fue identificar y caracterizar las proteinas virales codificadas en el extremo 5? de los genomas virales de diferentes potyvirus, y determinar sus contribuciones a la supresion de la respuesta defensiva de la planta basada en silenciamiento de RNA. Yo estaba especialmente interesado en entender como diferentes virus tan intimamente relacionados dependian de proteinas tan diversas para contraatacar a la planta.