Regulació del promotor de "Sp3"

Sp1 i Sp3 pertanyen a la familia de factors de transcripcio Sp que controla la transcripcio de gens implicats en gairebe tots els processos cel.lulars. Estudis previs al nostre grup van estudiar la regulacio del promotor del gen Sp1 i van demostrar que la transcripcio de Sp1 estava regulada principalment de forma positiva per Sp1 i NF-Y, i que Sp3 era capac de contrarrestar l'activacio produida per Sp1 sobre el seu propi promotor. Donat que la relacio Sp1/Sp3 a la cel·lula es important per a la regulacio dels gens diana, en aquest treball ens vam proposar estudiar la regulacio del promotor de Sp3.Vam clonar una regio de 546 bp que corresponia al promotor de Sp3 i vam procedir a la seva caracteritzacio. Sp3 presenta multiples inicis de transcripcio localitzats entre les posicions -132 i -70 respecte de l'inici de traduccio i la seva maxima activitat promotora es localitza a la regio fins a -281bp respecte de l'inici de traduccio. Mitjancant les tecniques de retardament de la movilitat electroforetica (EMSA) i Immunoprecipitacio de la Cromatina (ChIP) hem demostrat la unio dels factors Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb i c-Jun al promotor de Sp3. D'altra banda hem estudiat l'efecte de la sobreexpressio i la inhibicio d'aquestes proteines sobre l'activitat d'aquest promotor utilitzant assajos d'activitat luciferasa, i sobre els nivells endogens de mRNA utilitzant RT-Real Time-PCR. Sp3 activa la transcripcio del seu propi promotor. El promotor de Sp3 tambe es activat de forma mes potent per Sp1, Sp3 i NF-Y; tot i que NF-1, c-Myb, B-Myb, c-Jun i c-Fos tambe poden activar aquest promotor. Un altre fet remarcable es que E2F1 es comporta com a repressor del promotor de Sp3. Tots els resultats observats a nivell de l'activitat del promotor es van confirmar amb la mesura dels nivells endogens de mRNA per Sp3.Addicionalment, s'ha estudiat la interaccio de Sp1 amb diferents proteines implicades en la regulacio del cicle cel·lular i s'ha caracteritzat l'efecte de la seva sobreexpressio sobre l'activitat del promotor de Sp1, ja que esta regulat per Sp1. Utilitzant un array d'anticossos, es va fer un cribatge de proteines que poguessin interaccionar amb Sp1, i algunes d'elles es van confirmar per co-immunoprecipitacio. Aixo ens va permetre demostrar que Sp1 es capac d'interaccionar amb CDK4, p21, SKP2 i BRCA2. Posteriorment, vam analitzar l'efecte d'aquestes i altres proteines que interaccionen amb Sp1 sobre el promotor de Sp1, i vam observar que el promotor de Sp1 es regulat de forma positiva per la sobreexpressio de CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 i Stat3; mentre que es reprimit per la sobreexpressio de p53 i NFB. Per tal d'analitzar si hi havia una correlacio entre els efectes sobre el promotor de Sp1 i una alteracio dels nivells endogens de Sp1, vam confirmar tots els efectes observats a nivell de l'activitat del promotor tot emprant la tecnica de RT-Real Time-PCR. A mes, els efectes sobre el promotor de Sp1 es produeixen mentre aquestes proteines estan unides, directa o indirectament, al promotor tal com van demostrar els assajos de ChIP. Tambe vam estudiar l'efecte de la sobreexpressio d'aquestes proteines sobre un promotor que nomes contenia caixes Sp1 i, en general, vam observar efectes equivalents als observats per al promotor de Sp1. La interaccio entre Sp1-p21 va ser objecte d'estudi en mes detall i vam determinar que l'expressio de p21 en cel·lules de fibrosarcoma indueix el promotor de Sp1 aixi com els nivells de mRNA, pero, al mateix temps, indueix la degradacio de Sp1.Com a conclusio final, hem vist que el proces de transcripcio es un mecanisme molt complex que involucra un gran numero de factors de transcripcio, aixi com d'altres proteines que puguin interaccionar amb aquests factors.