Novel Electrokinetic Approaches To Improve Purification Processes with Monoclonal Antibodies

This work was focussed on mAb separations using cation exchange and hydrophobic interaction chromatography. Methods to accelerate long winded development strategies of purification processes with monoclonal antibodies were developed facilitated by further improvement of understanding the basic adsorption mechanisms of proteins on chromatographic resins. The new experimental electrokinetic methods introduced are zeta potential determination with proteins via laser light scattering and electro-acoustic investigations of salt solutions and biochromatographic resins. Zeta potential measurements were used as a experimental tool to characterize protein-salt-interactions. The zeta potential of proteins depends on buffer conditions of the protein solution. The isoionic point (iP) of proteins are shifted to more acid pH values with increasing salt concentration. IP is more shifted by kosmotropic salts than by chaotropic salts at comparable salt concentrations. Therefore the isoionic point can be used to describe protein-salt-interactions. Dynamic binding capacity (DBC) of cation exchange resins exhibit a pH dependent maximum. The pH position of maximum DBC decreases with higher salt concentration. Ions have to be released for protein adsorption in similar extent from protein and matrix caused by steric reasons. Thus, the pH position of iP and of maximum DBC shift to more acid pH values by increasing salt concentration in a similar extent. Based on these findings a method to determine the conditions for maximum DBC based only on zeta potential measurements was developed. Thereby time and material expensive chromatographic experiments are no longer necessary. This improves and accelerates the development of purification processes for cation exchange chromatography steps with monoclonal antibodies. An additional result of this work is a correlation of salt solution properties determined by a electro-acoustic method and dynamic binding capacity in hydrophobic interaction chromatography (HIC). Often DBC maxima in HIC exist near neutral pH values, even though the pI of the protein is acidic or basic. Considering concentration relations in HIC systems, salts have the highest concentration regarding protein and functional resin groups and should consequently be the main important parameter. Via electro-acoustic investigations, pH dependent properties of (neutral) salt solutions were found. The structural volume of salt ions exhibits a pH dependent maximum. This can be a result of an increased water shell or ion association. The pH position of maximum structural ion volume depends on salt type and concentration. With increasing salt concentration the maximum shifts to higher pH values. The pH range of detected maxima is depending on salt type and concentration between pH 4.5 to pH 8. In HIC high salt concentrations are used and ion volume maxima are between pH 6 and 8. Following the Scaled Particle theory a maximum protein stabilizing effect occurs when the cosolute volume reaches 1.8 times the volume of a water molecule. Changing the salt ion volume by altering the pH, the protein stabilizing effect can increase. Therefore pore blocking by too strong adsorption conditions can be diminished resulting in increasing DBC. Thus, the electro-acoustic investigation of salt solutions can help to find ideal conditions in hydrophobic interaction chromatography. Via electro-acoustic measurements different batches of several resin types were investigated and compared with chromatographic experiments. Thereby a correlation between unspecific protein binding properties and the colloidal vibration current (CVI), the electro-acoustic measurand, was found. Thus, using the electro-acoustic method developed in this work to characterize biochromatographic media, resin properties regarding unspecific protein binding can be described. Der Fokus dieser Arbeit wurde auf die Kationenaustausch- und Hydrophobe Interaktionschomatographie gelegt. Es wurden Methoden entwickelt, die langwierige Entwicklungsstrategien von Aufarbeitungsprozessen monoklonaler Antikorper verkurzen und durch weitere Aufklarung der grundlegenden Mechanismen verbessern. Dabei wurden elektrokinetische Methoden wie die Bestimmung von Zetapotentialen von Antikorpern mittels Laserlichtstreuung und elektroakustische Untersuchungen von Salzlosungen und Biochromatographiematerialien eingesetzt. Mit Hilfe von Zetapotentialmessungen wurde eine Methode zur Beschreibung von Protein - Salz - Interaktionen etabliert. Das Zetapotential von Proteinen ist abhangig von den Pufferbedingungen der Proteinlosung. Der isoionische Punkt (iP) eines Proteins verschiebt sich mit steigender Salzkonzentration zu sauren pH – Werten. Die Verschiebung des isoionischen Punktes hangt auch vom Salztyp ab, starker kosmotrope Salze verschieben bei vergleichbarer Konzentration den iP weiter in den sauren Bereich. Der iP kann also fur die Beschreibung von Protein - Salz - Wechselwirkungen herangezogen werden. Fur die Adsorption von Proteinen an Chromatographiematerialien mussen sowohl an das Protein wie auch an das Gel angelagerte Ionen entfernt werden, da diese sowohl sterisch als auch durch elektrostatische Krafte die Adsorption behindern konnen. Die dynamische Bindekapazitat von Kationenaustausch - Chromatographiegelen zeigt ein pH abhangiges Maximum. Die pH-Lage des Kapazitatsmaximums hangt von der Salzstarke und vom Salztyp ab. Bei erhohter Salzkonzentration schirmt das Salz die Ladung der Proteine zunehmend ab, behindert aber auch die Proteinadsorption durch die hohere Gegenionenkonzentration. Dadurch verschiebt sich das Kapazitatsmaximum mit steigender Salzkonzentration ins Saure. Da Ionen durch sterische Grunde in ahnlichem Ausmas vom Protein und vom Gel zur Adsorption entfernt werden mussen, verhalten sich die pH-Verschiebungen des iP und des Kapaziatsamaximums ahnlich. Aus diesen Erkenntnissen wurde eine Methode zur Bestimmung der Bedingungen fur eine maximale dynamische Bindungskapazitat basierend auf Zetapotentialmessungen entwickelt. Dabei werden keine zeit- und materialintensive chromatographische Experimente mehr benotigt, was die Entwicklung von Reinigungsprozessen mit Kationenaustauscherschritten beschleunigt und verbessert. Uber die Untersuchung der Eigenschaften von Salzen mittels Elektroakustik wurden bisher ungeklarte chromatographische Phanomene beleuchtet. Die dynamische Bindekapazitat von HIC Gelen hangt ebenfalls vom pH – Wert ab. Meistens liegen Kapazitatsmaxima in HIC Systemen im neutralen pH-Bereich. Bedenkt man die Konzentrationsverhaltnisse in solchen Systemen, sollten die Eigenschaften der Salze am starksten ins Gewicht fallen, da diese in hochster Konzentration im Vergleich zu Proteinen und funktionellen Gruppen der HIC-Gele vorliegen. Durch elektroakustische Untersuchungen wurden pH-abhangige Eigenschaften von (Neutral-)Salzlosungen gefunden. Dabei wurden Maxima in Bezug auf das strukturelle Volumen der Salzionen detektiert. Die pH-Lage der maximalen strukturellen Volumen der Ionen hangen von der Salzkonzentration und dem Salztyp ab. Mit steigender Salzkonzentration verschieben sich die Maxima zu basischeren pH-Werten. Sie bewegen sich je nach Salz und Konzentration im Bereich von pH 4,5 - pH 8. Da in HIC-Systemen mit hohen Salzkonzentrationen gearbeitet wird, liegen hier die maximalen strukturellen Ionenvolumen im pH-Bereich von 6 - 8. In diesem Bereich werdeb auch die Kapazitatsmaxima in der HIC gefunden. Der Scaled Particle Theory folgend tritt ein maximaler Protein stabilisierender Effekt auf, wenn geloste Stoffe (Salzionen) ein Volumen vom 1,8-fachen des Volumens eines Wassermolekuls einnehmen. Andert sich also das Volumen der Salzionen mit dem pH-Wert, kann der Protein stabilisierende Effekt zunehmen. Dadurch kann eine Porenblockade in der HIC durch Proteinaggregation an den Poreneingangen von Gelpartikeln vermindert werden, was wiederum zu einer Erhohung der dynamischen Bindekapazitat fuhrt. Die elektroakustische Untersuchung von Salzlosungen kann somit bei der Suche nach den idealen Bedingungen fur die Hydrophobe Interaktionschromatographie genutzt werden. Mit Hilfe elektroakustischer Untersuchungen wurden verschiedene Chargen mehrerer Chromatographiematerialien untersucht und mit chromatographischen Eigenschaften verglichen. Dabei wurde eine Korrelation zwischen unspezifischen Proteinbindungseigenschaften der Gele und dem kolloidalen Vibrationsstrom (CVI), der Messgrose in der Elektroakustik, gefunden. Somit konnen durch die Anwendug der hier entwickelten elektroakustischen Methode zur Charakterisierung von Biochromatographiematerialien die Eigenschaften der Gele bezuglich unspezifischer Proteinbindung schnell beschrieben werden.