Virus entériques transmissibles par voie alimentaire : détection, typage, pouvoir infectieux et nouvelles technologies

Les principaux virus enteriques a l’origine de toxi-infections alimentaires collectives sont les norovirus genogroupes I et II (NoV GI, NoV GII) et le virus de l’hepatite A (VHA) responsables respectivement de gastro-enterites et d’hepatites. Ces virus sont transmissibles par la voie feco-orale directe ou via l’ingestion d’eaux ou d’aliments consommes crus ou peu cuits (coquillages, fruits et legumes). Le niveau de contamination virale des aliments souvent faible necessite d’utiliser des methodes de detection tres sensibles. La plupart des virus enteriques etant non cultivable, ces methodes reposent sur la detection / quantification des genomes viraux par RT-qPCR ce qui ne permet pas de determiner l’infectiosite des virus et limite l’appreciation du risque viral en sante publique. Les travaux de these visaient a proposer des methodes moleculaires pour la detection, la quantification et le typage des virus enteriques, a evaluer l’apport de nouvelles technologies moleculaires (comme la Digital RT-PCR (RT-dPCR) et la RT-PCR a haut debit) dans le cadre du diagnostic viral dans les aliments et enfin a developper des traitements precedant les reactions de RT-qPCR pour detecter des genomes issus de particules virales infectieuses. Une nouvelle technique d’extraction du VHA a partir de la laitue a ete developpee et evaluee equivalente a la technique de reference decrite dans les specifications techniques publiees en 2013 (ISO/TS 15216-1 et 15216-2). Pour favoriser les etudes phylogenetiques dans le domaine alimentaire, 6 modeles moleculaires de RT-qPCR specifiques des 6 sous-types humains du VHA (IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB) ont ete developpes et evalues pour le genotypage d’echantillons cliniques contamines par le VHA. Ils peuvent etre utiles pour tracer les sous-types du VHA dans des echantillons faiblement contamines comme des matrices alimentaires, mais aussi permettre l'identification de co-infection de l'homme ou de souches de VHA recombinantes. La RT-dPCR en nanofluidique a ete comparee a la RT-qPCR pour la quantification des genomes de NoV GI, NoV GII et VHA en presence de 2 controles de process (mengovirus et norovirus murin) dans des echantillons de laitues et d’eau embouteillee artificiellement contamines. Un controle externe d’amplification a permis d’evaluer et de comparer l’inhibition des reactions de RT-qPCR et RT-dPCR. Les rendements d’extraction viraux se sont reveles significativement plus eleves apres RT-dPCR qu’apres RT-qPCR pour les NoV GI et mengovirus dans l'eau et pour les NoV GII et VHA dans les echantillons de laitue. De plus, les essais de RT-dPCR se sont averes etre plus tolerants a la presence de substances inhibitrices issues de laitues. La technologie qPCR en nanofluidique a egalement ete utilisee afin de proposer une « puce » capable de detecter 20 virus enteriques. Des limites de detection similaires ont ete obtenues avec la qPCR et la dPCR. La qPCR nanofluidique a ete trouve moins sensible d’environ 1 a 3 log10 (du fait des faibles volumes (~nanolitre) d’echantillons analyses). Des pretraitements a base de monoazide +/- detergent a realiser avant la RT-qPCR pour la detection de virus infectieux (VHA, rotavirus) ont ete developpes et evalues en realisant des cinetiques d’inactivations thermiques. [. ] Suite et fin du resume dans la these.