Schistosoma mansoni: descoberta de novos genes e estudos de genômica funcional de uma RHO GTPase

Schistosoma mansoni e um trematodeo digenetico que causa a esquistossomose, doenca parasitaria que constitui um importante problema de saude publica no Brasil e em muitos outros paises do mundo. O Projeto Genoma de S. mansoni teve inicio em 1992 como uma iniciativa brasileira que visa a descoberta de novos genes do parasita para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas. No inicio do programa, centenas de Etiquetas de Sequencia Transcritas (ESTs) foram geradas a partir de uma biblioteca de cDNA de vermes adultos. Entretanto, S. mansoni tem um complexo ciclo de vida o que tornou necessario a expansao do programa de descoberta de novos genes para outros estagios de desenvolvimento do parasita. No presente trabalho, oito bibliotecas de diferentes estagios do desenvolvimento do parasita, todas construidas utilizando-se o sistema ZapII, foram excisadas em massa para a obtencao de moldes de cDNA de fita dupla para que fosse possivel a geracao de grandes numeros de ESTs a partir de cada uma delas. A qualidade dos transcritos das bibliotecas excisadas foi entao avaliada. Ao menos 30 colonias de cada biblioteca foram selecionadas para avaliacao do tamanho medio dos insertos por PCR. A maior parte deles tinha um tamanho medio maior do que 500 pb. Na maior parte das bibliotecas menos 20% dos clones eram de sequencias nao informativas e mais de 50% deles eram de novos genes. Quando se considera apenas os genes presentes em mais de uma biblioteca, um total de 466 genes unicos foi obtido, o que corresponde a 427 genes novos de S. mansoni. Dos genes unicos, 20,2% foram identificados com base na sua homologia com genes de outros organismos, 8,3% eram genes ja conhecidos do parasita e 71,5% do total era de genes desconhecidos. Apos estas avaliacoes iniciais, nossos esforcos foram direcionados para a cercaria, a forma larvaria do parasita que infecta o homem e outros vertebrados. Duas bibliotecas de cDNA de cercarias de S. mansoni foram examinadas e sequencias parciais foram obtidas de 957 clones selecionados ao acaso. Baseado em buscas por homologia, 551 (57,6%) das ESTs geradas nao tinham homologos nas bases de dados publicas enquanto que 308 (32,2%) foram identificadas totalizando 859 ESTs. As 98 restantes (10,2%) eram ESTs nao informativas (RNA ribossomal e sequencias mitocondriais nao codificantes). Atraves de analises de clusters, fomos capazes de identificar 453 genes diferentes. Cento e dezenove genes identificados foram agrupados em 11 categorias funcionais onde genes associados com o metabolismo de energia foram os mais abundantes (13%) e diversos. A diversidade e a abundância de genes associados com a maquinaria de transcricao e traducao e com funcoes regulatorias e de sinalizacao celular tambem foram marcantes. Um transcrito de paramiosina foi identificado indicando que este gene nao e expresso exclusivamente em vermes adultos e esporocistos (como tem sido sugerido na literatura). Dentre os novos genes de S. mansoni descobertos, identificamos um gene que codifica uma Rho-type GTP-binding protein o qual foi sequenciado inteiramente neste trabalho. A sua janela aberta de leitura e de 579 pb e codifica um polipeptideo de 193 aminoacidos cujo peso molecular estimado e de 21,8 kDa. A sequencia de aminoacidos deduzida apresenta alta homologia com Rho GTPases de varias especies e possui todos os dominios conservados caracteristicos de Rho GTPases. A superexpressao do gene de Rho GTPase de S. mansoni (SMRHO) complementa uma cepa mutante da levedura Saccharomyces cerevisiae que teve seu gene rho1 selvagem eliminado artificialmente por nocaute genico. A complementacao ocorre mesmo em condicoes de alta temperatura e de concentracao de Ca2+ que sao restritivas para o crescimento da levedura. Entretanto, algumas alteracoes fenotipicas, tais como parada do ciclo celular, aumento do tamanho da celula e brotamento ao acaso, foram observadas indicando que a Rho GTPase de S. mansoni nao e capaz de complementar perfeitamente todas as funcoes executadas pela RHO1 GTPase selvagem de S. cerevisiae. Os resultados de complementacao junto com alinhamentos de sequencias tornaram evidente que uma maior conservacao de residuos de aminoacidos especificos na regiao da helice a3 e loop 7 da Rho GTPase de S. mansoni podem explicar a complementacao observada mesmo nas condicoes de alta temperatura e de concentracao de Ca2+. Os resultados obtidos durante este trabalho demonstraram que ESTs constituem uma abordagem versatil e eficiente para a descoberta de novos genes de S. mansoni nos seus diferentes estagios do ciclo de vida e que a levedura S. cerevisiae pode ser uma ferramenta poderosa em investigacoes sobre as funcoes dos genes deste complexo parasita.