Functional analysis of ZapA: keeping the one ring together

De voortplanting van E. coli is een ingewikkeld proces dat nauwkeurige samenwerking van verschillende grote eiwitcomplexen, zoals het elangosoom, vereist. Het eigenlijke celdelings proces wordt uitgevoerd door een eiwit complex dat het divisoom wordt genoemd en dat uit tenminste 14 eiwitten bestaat. De functie van de meeste van deze divisomale eiwitten is nog steeds onbekend, maar in dit proefschrift staan de pogingen beschreven die gedaan zijn om enige aanwijzingen te verzamelen wat betreft de functie van ZapA, een Z-ring stabilisator. Zo is gevonden dat, in E. coli, de localisatie van ZapA alleen afhankelijk is van FtsZ. Verder is door het bepalen van het tijdstip van de localisatie van ZapA gevonden dat ZapA tegelijkertijd, maar onafhankelijk van, FtsA en ZipA localiseert (Hoofdstuk 2). Verrassend genoeg is tijdens het onderzoek gebleken dat ZapA en FtsZ ook localiseren als zogenoemde ‘spots’ die zich op willekeurige plekken in de cel bevinden (Hoofdstuk 3). De FtsZ en ZapA spots co-localiseren niet, werden alleen in jonge cellen gevonden en (dis)assembleerden na verloop van tijd. Aangezien FtsZ kan polymeriseren, is het aannemelijk dat de FtsZ spots simpelweg FtsZ protofilamenten zijn die (dis)assembleren (Hoofdstuk 3). In het geval van ZapA is er echter geen simpele verklaring voor de spots aangezien uit in vitro experimenten is gebleken dat ZapA geen grotere oligomeren kan vormen dan tetrameren (Hoofdstuk 4). Uit een schatting van het aantal ZapA moleculen per spot blijkt dat er tenminste tientallen moleculen in een spot aanwezig zijn (Hoofdstuk 3) en daarom is het aannemelijk dat een onbekend eiwit met ZapA een groot complex vormt. Het nut van ergelijk complex vorming is nog onduidelijk. Om meer inzicht te verwerven in het effect dat ZapA heeft op FtsZ protofilamenten, zijn er verschillende in vitro experimenten uitgevoerd (Hoofdstuk 4), waaruit is gebeleken dat ZapA de polymerisatie van FtsZ bevordert en dat het FtsZ polymeren stabiliseert, maar alleen onder omstandigheden waaronder FtsZ protofilamenten al worden gestabiliseert, zoals in de aanwezigheid van 10 mM MgCl2. De mate van stabilisatie bleek daarbij af te hangen van de pH, in de zin dat, bij een pH van 7.5 de stabiliteit van de FtsZ protofilamenten groter was in vergelijking met experimenten zonder ZapA, maar lager dan in experimenten uitgevoerd bij een pH van 6.5. Hoe ZapA de FtsZ polymeren stabiliseert is nog steeds niet duidelijk, vooral gezien het feit dat ZapA geen effect heeft op de GTPase activiteit van FtsZ onder biologisch relevante omstandigheden. Alleen in aanwezigheid van ZapA en 10 mM MgCl2 werden arrays van FtsZ polymeren waargenomen. Deze arrays bestonden uit parallel gerangschikte protofilamenten met voldoende ruimte voor de ZapA tetrameer ertussen. Verder zijn dubbele FtsZ filamenten waargenomen die een dikte hadden die overeenkomt met de lengte van de ZapA tetrameer. Door middel van analytische ultracentrifugatie is vastgesteld dat ZapA als een tetrameer aanwezig is onder alle geteste experimentele condities, wat overeenkomt met eerder gepubliceerde resultaten, waaronder een dissociatie constante van 320 nM voor de ZapA tetrameer. Deze data vormen een sterke indicatie dat ZapA ook in vivo als een tetrameer aanwezig is. Verrassend genoeg bleek dat een zapA deletie mutant een milde morfologie had wanneer deze snel groeide, maar niet wanneer deze langzaam groeide (Hoofdstuk 5). Snel groeiende cellen van de ZapA deletie stam waren deels filamenteus en hadden geen Z-ring op elke mogelijke delings plek, hoewel geen vertraging in de localisatie van FtsZ werd gevonden. Echter, de laat localiserende divisomale eiwitten localiseerden wel vertraagd, hetgeen een aanwijzing is dat er een probleem is met de assemblage van het divisoom. Aangezien algemeen wordt aangenomen dat de vroeg localiserende divisomale eiwitten betrokken zijn bij de stabilisatie van de Z-ring, is het waarschijnlijk dat het Min systeem en het nucleoid occlusion systeem, die beide de FtsZ protofilamenten destabiliseren, niet gemakkelijk overwonnen kunnen worden in de afwezigheid van ZapA (Hoofdstuk 5). Wanneer de Z-ring volledig gevormd was, werden er geen afwijkingen in de dynamiek van de ring waargenomen met behulp van FRAP experimenten (Hoofdstuk 5). Bij het bestuderen van het effect van aztreonam op de remming van FtsI werd duidelijk dat de vroeg localiserende eiwitten zich in het midden van de cel ophoopten en dat gedurende de eerste twee massa verdubbelingen geen nieuwe ringen gevormd konden worden. Deze blokkade in de formatie van nieuwe ringen kon alleen door overproductie van FtsZ en FtsA overwonnen worden. Echter, de laat localiserende eiwitten localiseerden normaal en alleen in het midden van de cel, maar hoopten zich daar niet op (Hoofdstuk 6). Het gebrek aan disassemblage van het divisoom kan, direct of indirect, het gevolg zijn van een gebrek aan transpeptidase activiteit van FtsI waardoor een conformationele verandering in de peptidoglycan laag niet plaats vond, welke benodigd is voor het destabiliseren van het divisoom zodat het zich kan aanpassen aan de veranderende omgeving van de constricterende cel. Een tweede model gaat ook uit van een conformationele verandering, maar nu in FtsI zelf. Als gevolg van deze verandering vindt er geen dissociatie van de divisomale eiwitten plaats waardoor de reorganisatie van het divisoom ook niet plaats vindt. Op basis van de data die in dit proefschrift beschreven staan, kan geconcludeerd worden dat ZapA tetrameren de FtsZ protofilamenten, die al enigszins gestabiliseerd zijn en zich dicht bij elkaar bevinden, cross-linkt zodat een Z-ring gevormd kan worden. Om vroegtijdige Z-ring formatie te voorkomen, crosslinkt ZapA geen protofilamenten die niet gestabiliseert zijn en zich niet in de buurt van een ander FtsZ polymeer bevinden. Wanneer het divisoom zich assembleert, localiseren ZapA en de andere vroeg localiserende celdelings eiwitten aan de Z-ring zodat deze gestabiliseert wordt. Deze stabilisaite vindt vermoedelijk alleen gedurende de formatie van de Z-ring plaats.