Untersuchungen zur B-Zell-Rekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation

Die allogene Stammzelltransplantation ist ein etabliertes Verfahren zur Behandlung von malignen und einigen nicht-malignen Erkrankungen der Hamatopoese. Zur Minimierung immunologischer Komplikationen wird in der Regel zwischen HLA (Human leucocyte antigen)-identischen Spendern und Empfangern transplantiert, da mit steigender HLA-Disparitat das Risiko fur das Auftreten einer Spender-gegen-Empfangerreaktion (graft-versus-host disease, GVHD) steigt. Trotzdem kommt es auch nach HLA-identischer Transplantation haufig zur GVHD, die in dieser Konstellation durch Minor-Histokompatibilitatsantigene ausgelost wird. Klinisch wird nach allogener Stammzelltransplantation eine verzogerte Rekonstitution des adaptiven Immunsystems beobachtet, wofur hauptsachlich die zur GVHD-Prophylaxe eingesetzte Immunsuppression verantwortlich gemacht wird. Diese prolongierte Immundefizienz erhoht das Risiko fur opportunistische Infektionen, die oftmals zum Tod der Patienten fuhren. Zentrales Ziel der aktuellen Transplantationsforschung ist es deshalb, Strategien zu identifizieren, die zur Verbesserung der Immunrekonstitution fuhren ohne das Risiko fur die Auslosung einer GVHD zu erhohen. Die dieser Arbeit zugrundeliegende Hypothese war, dass nicht nur die pharmakologische Immunsuppression zur verzogerten Immunrekonstitution beitragt, sondern insbesondere die schwere GVH-Reaktion. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein MHC (Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitatskomplex) -differentes Mausmodell ohne pharmakologische Immunsuppression eingesetzt und die B-Zell-Rekonstitution nach allogener KMT (Knochenmarktransplantation) in Tieren mit und ohne GVHD untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es in Tieren mit schwerer GVHD (nach Transplantation von Knochenmark (KM) und T-Zellen) zu keiner Rekonstitution des B-Zell-Kompartiments kam, wahrend Tiere ohne GVHD (Transplantation von KM ohne T-Zellen) eine rasche und vollstandige Rekonstitution der Spender-B-Zellen zeigten. Histologisch und mittels durchflusszytometrischer Messmethode wurde nachgewiesen, dass die GVHD zur Zerstorung peripherer Lymphorgane fuhrte. Diese schien aber nicht alleine fur die B-Zell-Defizienz verantwortlich zu sein, da sich in Knochenmarkanalysen herausstellte, dass die B-Zell-Rekonstitution bei GVHD bereits auf der Stufe von B-Vorlauferzellen im KM gestort war. Daruber hinaus zeigte sich auch ein Einfluss auf Vorlauferzellen der T-Zell-Reihe, so dass zu vermuten war, dass vor allem gemeinsame Vorlauferzellen (common lymphoid precursor, CLP) beeintrachtigt wurden, wahrend die Myelopoese nur unwesentlich betroffen war. Diese Storungen in der B- und T-Zell-Entwicklung in GVHD-Tieren konnte bereits zu sehr fruhen Zeitpunkten (innerhalb von 7 Tagen) nach Transplantation detektiert werden. Um zu beweisen, dass inflammatorische Prozesse im Rahmen der GVHD die B-Lymphopoese inhibierten und nicht lediglich das Anwachsen von Vorlauferzellen beeintrachtigt wurde, wurde die Erkrankung in separaten Experimenten erst nach Rekonstitution der Spenderlymphopoese an Tag 21 nach KMT durch die nachtragliche Infusion von Spender-T-Zellen induziert. Auch in diesem Modell kam es dosisabhangig zu einer Suppression der B-Zellen, so dass bestatigt wurde, dass GVHD-induzierende T-Zellen zu inflammatorischen Reaktionen fuhrten, die selbst bereits rekonstituierte B-Zellen (HLA-identisch zu den GVHD-induzierenden T-Zellen) eliminierten. In fruheren Publikationen der Arbeitsgruppe wurde nachgewiesen, dass der adoptive Transfer von CD4+CD25+FoxP3+ (Forkhead box P3, Transkriptionsfaktor) naturlichen regulatorischen T-Zellen (Treg Zellen) des Spenders im Mausmodell vor akuter GVHD schutzt. Deshalb wurde zusatzlich untersucht, wie sich der Transfer dieser immunsuppressiven T-Zell-Population auf die B-Zell-Rekonstitution auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Art der immunologischen Immunsuppression nicht zur Paralyse des Immunsystems fuhrte, sondern dass die GVHD-induzierte Zerstorung der Lymphorgane verhindert und die Rekonstitution der lymphatischen Vorlauferzellen im Knochenmark gefordert wurde. In der Summe ergab sich hierdurch nicht eine schlechtere, sondern im Gegenteil, eine verbesserte Immunrekonstitution nach allogener KMT. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, die Mechanismen der gestorten Immunrekonstitution bei GVHD aufzuklaren. Aus publizierten Arbeiten war bekannt, dass die Zytokine IFN-gamma (Interferon-gamma) und TNF (Tumor necrosis factor, Tumornekrosefaktor) die B-Lymphopoese beeintrachtigen konnen und dass diese Zytokine bei akuter GVHD vermehrt sezerniert werden. Es wurde deshalb untersucht, ob sie bei GVHD direkt auf lymphatische Vorlauferzellen im KM einwirken. Hierfur wurde KM von Wildtyptieren und von IFN-gamma- bzw. TNF-Rezeptor-defizienten Spendern ko-transplantiert und anschliesend untersucht, ob die B-Lymphopoese in GVHD-Tieren selektiv aus dem Rezeptor-defizienten Mark regeneriert. Eine selektive Regeneration der B-Zellen wurde jedoch weder aus IFN-gamma- noch aus TNF-Rezeptor-defizientem KM beobachtet, so dass keines dieser Zytokine alleine fur die B-Zell-Defizienz bei GVHD verantwortlich zu sein schien. Da Zytokine nicht nur direkt auf die Vorlauferzellen im KM wirken konnten sondern auch indirekt uber die Zerstorung der B-Zell-Nische (bzw. CLP-Nische), wurden anschliesend Retransplantationsstudien durchgefuhrt. Hierfur wurde KM aus Tieren mit GVHD isoliert, T-Zell-depletiert und erneut in letal bestrahlte Empfanger transplantiert. Es zeigte sich in diesen Tieren, dass Stammzellen aus GVHD-Tieren in GVHD-freien Empfangern der 2. Generation die B-Lymphopoese prinzipiell rekonstituieren konnten. Die leicht verzogerte Immunrekonstitution in diesen Empfangern im Vergleich zu Empfangern von KM aus unbehandelten Spendern wies darauf hin, dass das KM von GVHD-Tieren geringere Mengen an determinierten Vorlauferzellen enthielt. Durch Verwendung von Stromazellkulturen, die eine Entwicklung von B-Zell-Kolonien unterstutzen, konnte die Defizienz von CLP im Knochenmark von Tieren mit GVHD in vitro bestatigt werden. Auf diesen Ergebnissen aufbauend sollen in zukunftigen Experimenten mittels Vielfarben-Durchflusszytometrie die derzeit bekannten Stadien der lymphatischen Vorlauferzellen im KM von GVHD-Tieren exakt quantifiziert werden, um die Stufe des Entwicklungsblocks genau zu definieren. Da auch ein Defekt in der T-Zell-Rekonstitution von GVHD Tieren gezeigt werden konnte, wird erwartet, dass primar die CLP betroffen sind. Daruber hinaus sollte in Folgeversuchen untersucht werden, wie ko-transplantierte Spender-Treg-Zellen die fruhe Rekonstitution der lymphatischen Vorlaufer im KM fordern. Vor allem sollte aber untersucht werden, ob die Graft-versus-Leukamiewirkung bei B-Zell-Malignomen nicht zumindest teilweise auf solche B-Zell-toxischen Wirkungen der GVHD-induzierten Inflammation zuruckzufuhren ist, da bisher angenommen wird, dass Transplantat-gegen-Leukamie-Effekte (Graft-versus-leukemia, GVL) ausschlieslich auf der Erkennung von Alloantigenen durch Spender-T-Zellen auf hamatopoetischen Empfangerzellen beruhen.