Caracterização do estímulo da produção mitocondrial de H2O2 por inibição parcial do Complexo I da cadeia respiratória = : Stimulatory effects of a partial respiratory Complex I inhibition on mitochondrial H2O2 generation

A inibicao parcial do Complexo I da cadeia respiratoria mitocondrial em ratos tratados cronicamente com rotenona esta associada com o desenvolvimento de caracteristicas neuroquimicas, comportamentais e neuropatologicas da doenca de Parkinson. Os objetivos deste trabalho foram (i) caracterizar os efeitos de uma inibicao parcial do Complexo I por rotenona na producao de peroxido de hidrogenio (H2O2) por mitocondrias de cerebro de ratos (MCR) em diferentes estados respiratorios e (ii) avaliar a suscetibilidade de MCR velhos (24 meses) a inibicao do consumo de oxigenio (O2) e ao estimulo da producao de H2O2 por rotenona em comparacao a MCR adultos (3-4 meses). A analise do potencial de membrana por citometria de fluxo em mitocondrias isoladas indicou que a adicao de rotenona promoveu uma inibicao uniforme da respiracao mitocondrial nestas organelas. Quando mitocondrias foram incubadas na presenca de uma baixa concentracao de rotenona (10 nM) e de substratos geradores de NADH, o consumo de O2 foi reduzido de 45,9±1,0 para 26,4±2,6 nmol O2.mg-1.min-1 e de 7,8±0,3 para 6,3±0,3 nmol O2.mg-1.min-1 nos estados respiratorios 3 (respiracao estimulada por ADP) e 4 (respiracao de repouso), respectivamente. Nessas condicoes, a producao mitocondrial de H2O2 foi estimulada de 12,2±1,1 para 21,0±1,2 pmol H2O2.mg-1.min-1 e de 56,5±4,7 para 95,0±11,1 pmol H2O2.mg-1.min-1 nos estados respiratorios 3 e 4, respectivamente. Resultados similares foram observados ao comparar preparacoes mitocondriais enriquecidas com organelas sinapticas e nao-sinapticas ou quando o ion 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+) foi utilizado como inibidor de Complexo I mitocondrial. O estimulo da producao de H2O2 por rotenona nos estados respiratorios 3 e 4 foi associado a um aumento do estado reduzido de nucleotideos de nicotinamida endogenos. Na respiracao mitocondrial com succinato, onde a maior parte da producao de H2O2 se origina do fluxo reverso de eletrons do Complexo II para o I, baixas concentracoes de rotenona inibiram a producao de H2O2. Rotenona nao exerceu efeito sobre a eliminacao mitocondrial de concentracoes micromolares de H2O2. Em sinaptossomas intactos, observamos que rotenona 10 nM estimulou a liberacao de H2O2 em 20,2±3,3% no estado respiratorio basal. Ao compararmos MCR adultos e velhos, verificamos que o consumo de O2 no estado respiratorio 3 e a atividade da citrato sintase foram 21,0±3,3% e 17,0±5,4% mais baixos em MCR velhos. Experimentos conduzidos na presenca de diferentes concentracoes de rotenona (5, 10 e 100 nM) demonstraram sensibilidade similar a inibicao do consumo de O2 por rotenona no estado respiratorio 3, com IC50 de 7,8±0,4 e 6,5±0,5 nM para MCR adultos e velhos, respectivamente. De acordo com esses resultados, o estimulo da producao de H2O2 observado foi similar em MCR adultos e velhos, tratadas com diferentes concentracoes de rotenona. Concluimos que, uma inibicao parcial do Complexo I pode resultar em uma crise energetica e/ou estresse oxidativo mitocondrial, enquanto o primeiro evento predominaria numa situacao de alta demanda de fosforilacao oxidativa, o segundo ocorreria em condicoes de respiracao de repouso. Em adicao, os experimentos com ratos velhos indicaram que rotenona exerce efeitos similares no consumo de O2 e na producao de H2O2 em MCR adultos e velhos. Abstract