Analysis of fitness trade-offs limiting host range expansion in pepper-infecting tobamoviruses

La adquisicion de nuevos huespedes, es decir, la expansion de su gama de huespedes, proporciona a un virus mas oportunidades de transmitirse y sobrevivir, pero puede estar limitada por compromisos de eficacia entre los distintos huespedes. Una causa principal de compromisos de eficacia entre huespedes es la pleiotropia antagonista, es decir, que las mutaciones tengan efectos fenotipicos contrarios en los distintos huespedes, una interaccion Genotipo x Entorno. La epistasia, es decir una interaccion Genotipo x Genotipo, puede ser tambien causa de compromisos de eficacia entre huespedes. Como casos relevantes de la expansion de la gama de huespedes podemos citar la emergencia de virus en nuevas especies de huespedes, y la superacion de la resistencia, por la que el virus adquiere la capacidad de infectar a genotipos de huesped previamente resistentes. Se ha documentado en distintos virus que la superacion de la resistencia puede comportar efectos negativos en la multiplicacion del virus en un huesped susceptible. Sin embargo, a penas se han explorado sus efectos en otros componentes de la eficacia del virus, y entender la evolucion de los virus requiere conocer los posibles compromisos entre distintos componentes de la eficacia. En este trabajo hemos analizado si existen compromisos de adaptacion asociados a la adquisicion de nuevas especies o genotipos de huespedes, y cuales son sus causas. Para ello nos hemos centrado en los tobamovirus que infectan a los cultivos de pimiento. En primer lugar hemos analizado si existen compromisos de adaptacion del virus del mosaico verde atenuado del tabaco (Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV) a sus dos huespedes principales en el SE de Espana. Se han caracterizado molecularmente aislados de campo procedentes de los dos huespedes, pimiento y Nicotiana glauca, que se han inoculado en los huespedes homologo y heterologo. El analisis de la multiplicacion de estos aislado muestra que los aislados de N. glauca estan adaptados a su huesped, lo que no ocurre con los aislados de pimiento. Se analizo el papel en la multiplicacion diferencial en ambos huespedes de los amino acidos de dos posiciones polimorficas de la proteina de la capsida (CP) y de una duplicacion en la region 3’ no codificante (3’UTR). El analisis se realizo en la coleccion de aislados de campo y por manipulacion de clones de cDNA derivados de dos aislados de TMGMV. Los resultados muestran que el efecto de los tres dimorfismos en la multiplicacion viral depende de interacciones de orden superior que implican pleiotropia y epistasia, del tipo G x G x E. Los costes de eficacia asociados a la superacion de la resistencia se han estudiado en el virus del moteado atenuado del pimiento (Pepper mild mottle virus, PMMoV) introduciendo en un clon de cDNA activo biologicamente todas las mutaciones conocidas que determinan la superacion de la resistencia conferida por los alelos L3 y L4 del pimiento. Los genotipos parental y mutantes se ensayaron en distintos huespedes susceptibles, y se cuantifico el componente de eficacia asociado a multiplicacion viral, y la virulencia. La eficacia intrahuesped no dependia de la capacidad de virus de superar los distintos alelos de resistencia sino de la mutacion en cuestion, y del genotipo del huesped susceptible. Los resultados senalaron tambien que existen interacciones epistaticas entre las mutaciones de superacion de la resistencia, que varian segun el genotipo del huesped susceptible. Por tanto, los resultados muestran de nuevo interacciones de orden superior del tipo G x G x E entre las mutaciones. Se obtuvieron resultados similares en cuanto a la relacion de las mutaciones de superacion de la resistencia y la virulencia. Se analizo tambien si las mutaciones de superacion de la resistencia, que se localizan en la CP, afectan a la estabilidad de la particula viral y, por tanto, a su supervivencia en el medio. Las mutaciones afectaron a la estabilidad de la particula. La estabilidad de las particulas de los distintos mutantes no se correlaciono con la eficacia intrahuesped ni con la virulencia, lo que indica que no hay compromisos entre distintas componentes de la historia vital del virus que puedan comprometer su evolucion. En conjunto los resultados de esta Tesis permiten alcanzar una conclusion general importante: que la evolucion de la gama de huespedes en los tobamovirus estara limitada por interacciones de orden superior entre las mutaciones de gama de huespedes, pero no por compromisos entre los distintos componentes de la eficacia biologica. ----------ABSTRACT---------- The acquisition of new hosts, or host range expansion, provides a virus with more opportunities for transmission and survival, but may be limited by across-host fitness trade-offs. A major cause of across-host trade-offs in viruses is antagonistic pleiotropy, that is, different phenotypic effects of mutations in different host environments, a Genotype x Environment interaction. In addition, epistasis (a Genotype x Genotype interaction) also may play a role in generating across-host fitness trade-offs. Relevant cases of host range expansion are the emergence of viruses in new host species and resistance-breaking (RB), in which viruses acquire the capacity to infect otherwise resistant plant genotypes. Negative effects of resistance-breaking mutations on withinhost virus multiplication have been documented for several plant viruses. However, understanding virus evolution requires analyses of potential trade-offs between different fitness components. In this work we have analysed if there are trade-offs, and what are the causes, associated to the acquisition of new host species or genotypes in tobamoviruses that infect pepper crops. First we explored if there are trade-offs associated to the adaptation of Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) to its two major hosts in SE Spain. Field isolates of TMGMV from pepper and Nicotiana glauca were molecularly characterised and inoculated in the homologous and heterologous hosts. Results showed that TMGMV isolates from N. glauca were adapted to their host, but that pepper isolates were not adapted to pepper. The role of the amino acid at two dimorphic positions in the coat protein (CP), and of the duplication of a region of the 3’UTR, in the differential multiplication of the virus in pepper and N. glauca was analysed in the collection of field isolates and through the introduction of mutations in biologically active cDNA clones derived from two TMGMV isolates. Results showed that the effect of these dimorphisms on virus multiplication depended on higher order interactions involving pleiotropy and epistasis, of the type G x G x E. Fitness costs associated with RB were studied in Pepper mild mottle virus (PMMoV) by introducing in a biologically active cDNA clone all reported mutations in the CP determining RB of alleles L3 and L4 in pepper. The parental and mutant genotypes were assayed in different susceptible pepper genotypes, and the withinhost multiplication component of fitness, and virulence, were quantified. Within-host fitness did not depend on the virus capacity to overcome a specific resistance allele, but depended on the specific mutation and the genotype of the susceptible host. In addition there was evidence of epistatic interactions between mutations leading to RB, which again depended on the genotype of the susceptible host. Thus, results showed higher order interactions among RB mutations of the type G x G x E. Similar results were obtained relative to the effects of RB mutations in virulence. We also analysed whether coat protein mutations affect particle stability and, thus, survival in the environment. The various RB mutations had effects on particle stability and, thus, survival. The stability of the particles of the different mutants was not correlated with within-host fitness or virulence, thus indicating no trade-offs among different life history traits of the virus that might constraint its evolution. Taken together the results of this Thesis, show a major general conclusion: that host range evolution in the analysed tobamoviruses will be constrained by higher order interactions between host-range mutations on virus fitness, but not by trade-offs between different fitness components.