Funktionelle Charakterisierung der drei DAHP-Synthase Isoformen aus Arabidopsis thaliana

In Arabidopsis wurden aufgrund von Sequenzhomologien drei Gene identifiziert, die putativ fur Isoformen des Eingangsenzyms des Shikimatwegs, die 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat 7-phosphat-Synthase (DAHPS) kodieren. In einer Reihe von Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass diese Gene transkribiert und sehr unterschiedlich reguliert werden. In dieser Arbeit wurde nun erstmals durch heterologe Expression nachgewiesen, dass alle drei fur funktionelle DAHPS kodieren. Die Expressionsdaten weisen darauf hin, dass die drei DAHPS unterschiedliche Funktionen erfullen. So werden die DAHP-Synthasen 1 und 3 durch Stressfaktoren wie Pathogenbefall, UV-Licht, Ozon oder Verwundung in ihrer Expression induziert, die Expression der DAHP-Synthase 2 hingegen bleibt meist fast unverandert. Ob diese Regulation der drei Gene jedoch nur zu unterschiedlichen Mengen an DAHPS-Enzym fuhrt, oder ob sich die drei Enzyme auch biochemisch unterscheiden, war bisher unbekannt. Bei der Analyse der biochemischen Eigenschaften der heterolog in E. coli exprimierten Enzyme weisen die drei Isoenzyme sehr viele Ahnlichkeiten auf. Alle drei Isoformen werden durch reduziertes Thioredoxin aktiviert, so dass ihre Aktivitat vermutlich auch in vivo einer Redoxregulation unterliegt. Sie werden alle deutlich durch Manganionen aktiviert und durch hohere Konzentrationen von Magnesiumionen in schwacherem Mase. Alle drei Enzyme finden in einem Temperaturbereich zwischen 40 und 45°C sowie bei pH 7,0 optimale Bedingungen und sie verwenden alle ausschlieslich E4P neben PEP als Substrat. Trotz dieser Gemeinsamkeiten deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass der DAHP-Synthase 3 eine zentrale Rolle unter den drei Isoformen zukommt. Ihr pH-Optimum ist breiter als das der anderen beiden Isoformen und sie zeigt auch noch bei pH 6,0 optimale Aktivitat wahrend die anderen beiden Enzyme bei diesem pH-Wert in ihrer Aktivitat schon stark abfallen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit der DHS3 liegt signifikant hoher als die der DAHP-Synthasen 1 und 2. Wahrend die Isoformen 1 und 2 in ihrer Aktivitat durch Phenylalanin oder Tryptophan aktiviert werden, zeigt sich die Isoform 3 unbeeinflusst durch die aromatischen Aminosauren. Daruber hinaus zeigen die Expressionsstudien in Blatt- und Wurzelmaterial, dass die DAHP-Synthase 3 in beiden Geweben deutlich starker exprimiert ist als die anderen beiden Isoenzyme. Diese Ergebnisse unterstreichen die Befunde der Transkriptionsanalysen, in denen sich dieses Enzym als stressinduziert erwies. Als Reaktion auf Stress werden diverse Sekundarmetabolite synthetisiert fur die unter Stresseinwirkung innerhalb kurzer Zeit grose Mengen an Chorismat bereitgestellt werden mussen. Diese Aufgabe kann die DAHP-Synthase 3 mit ihrer hohen maximalen Aktivitat und ihrer erhohten Unabhangigkeit gegenuber den umgebenden pH-Bedingungen, sowie ihrer hohen Expression in Wurzel und Spross gut erfullen. Eine Co-Expressionsanalyse zeigt ebenfalls die starke Verknupfung der Expression dieser Isoform mit Enzymen des Phenylpropanoidweges, in dem eine Vielzahl von Sekundarmetaboliten synthetisiert wird. Die Co-Expressionsanalyse fur die DAHP-Synthase 1 weist eher auf eine Verbindung zur Tryptophan- und Auxin-Biosynthese hin, so dass diese Isoform moglicherweise uber den Tryptophan- und Auxinbedarf reguliert wird. Eine vergleichende Analyse von Wildtyp-Pflanzen (Col-0) und Knockout-Mutanten zur weiterfuhrenden Klarung der unterschiedlichen Funktionen fur die verschiedenen DAHP-Synthasen ergab bei der Anzucht unter Standardbedingungen phanotypisch keine Unterschiede. Nur die Knockout-Mutante fur die DAHP-Synthase 2 weist auf Metabolitenebene einen signifikant deutlich erhohten Gehalt an Phenylalanin und einen leicht erhohten Gehalt an Tryptophan im Vergleich zum Wildtyp und den anderen Knockout-Mutanten auf. Unter veranderten Anzuchtbedingungen werden jedoch phanotypische Unterschiede zwischen dem Wildtyp und einigen Knockout-Pflanzen sichtbar. Sowohl bei einem Wechsel der Tag/Nacht-Rhythmik zu einer Dauerbelichtung sowie beim Transfer in eine kalte Umgebungstemperatur von 10°C wiesen Knockout- und Wildtyp-Pflanzen deutliche Unterschiede auf. Unter Dauerbelichtung zeigen die Wildtyp-Pflanzen im Gegensatz zu den Mutanten eine signifikant hohere Zunahme des Frischgewichts. Bei Kalte zeigt die Doppelmutante die hochste Zunahme an Frischgewicht im Vergleich zu den Wildtyp- und anderen Knockout-Pflanzen. Die in dieser Arbeit ermittelten Parameter, wie Ammonium- und Phenolgehalte sowie Aminosaurekonzentrationen erklaren die deutlich veranderten Wachstumsreaktionen auf die veranderten Umweltbedingungen nicht und verweisen auf eine komplexere Funktion der DAHPS Isoformen als bisher angenommen.