Analysis of the Modulation of Nuclear Domains by Human Adenovirus Type 5 Oncoproteins

Human Adenovirus type 5 (HAdV5) represents a well-studied model system to analyze the transformation capabilities of DNA tumor viruses, the molecular properties of viral oncoproteins and basic principles of virus-induced tumorigenesis. Proteins of the early region 1 (E1) and 4 (E4) mediate steps in the cellular transformation process, such as initiating unscheduled cell cycle progression, inactivating antiproliferative mechanisms by tumor suppressor proteins (e.g. pRB, p53) and modulating of a complex network of protein interactions involved in transcription, apoptosis, cell cycle control, DNA repair, cell signaling, posttranslational modification and the integrity of nuclear multiprotein complexes known as PML nuclear bodies (PML-NBs)/PML oncogenic domains (PODs). The 55-kDa gene product encoded by the early region 1B (E1B-55K) is a multifunctional phosphoprotein that mediates essential functions during productive viral infection, as well as transformation of primary rodent cells. Although modulation of the cellular tumor suppressor p53 is considered to play the major role in adenoviral-mediated tumorigenesis, other p53-independent mechansisms have been suggested. Moreover, previous work illustrates that posttranslational modification of E1B-55K by the small ubiquitin-related modifier 1 (SUMO-1) is absolutely required for efficient cellular transformation. However, the biochemical consequences and functional alterations of 55K by SUMO-1 conjugation have so far remained elusive. Comprehensive biochemical analyses of functional interactions between E1B-55K and host cell factors identified a tight association between multiple adenoviral proteins and specific components of cellular PML nuclear bodies. Moreover, this study provides the first molecular evidence that the adenoviral E1A, E1B-55K and E4orf6 proteins physically interact with different isoforms of the tumor suppressor protein PML. In contrast, isoform-specific interactions of E1B-55K (with PML-IV, PML-V) involve SUMO-dependent and independent mechanisms. Interaction with PML-IV promotes localization of 55K to PML-containing subnuclear structures (PML-NBs) in virus-infected cells. This process is negatively regulated by other viral proteins, indicating that binding to PML is controlled through reversible SUMOylation in a temporally coordinated manner. Furthermore, molecular evidence is presented for E1B-55K being modified by multiple SUMO-isoforms in a phosphorylation-dependent manner, thus drastically expanding E1B-55K´s functional repertoire. These results together with previous work are consistent with the idea that SUMOylation regulates targeting of E1B-55K to PML-NBs, which are known to control transcriptional regulation, tumor suppression, DNA repair and apoptosis. Furthermore, the data suggest that SUMO-dependent modulation of p53-dependent growth suppression via E1B-55K/PML-IV interaction plays a key role in adenovirus mediated cell transformation. Bei Humanen Adenoviren (HAdV5) handelt es sich um ein gut untersuchtes Modellsystem zur Analyse des Transformationspotentials von DNA-Tumorviren, den molekularen Eigenschaften viraler Onkoproteine sowie grundlegender Prinzipien virus-induzierter Karzinogenese. Die fruhen Proteine der E1- und E4-Region vermitteln in diesem Zusammenhang den zellularen Transformationsprozess primarer Saugetierzellen durch Modulation verschiedenster Regulationsmechanismen, u.a. der Transkription, Apoptose, Zellzykluskontrolle, DNA-Reparatur, posttranslationaler Modifikationen und der Integritat von nuklearen Multiproteinkomplexen (PML-NBs). Bei dem E1B-55K Genprodukt handelt es sich um einen fruhen, viralen Regulator, der sowohl im Verlauf der produktiven Virusinfektion sowie der zellularen Transformation von primaren Nagetierzellen eine wesentliche Rolle spielt. Obwohl im Allgemeinen angenommen wird, dass die Modulation des zellularen Tumorsuppressorproteins p53 eine wesentliche Rolle im adenoviral vermittelten Transformationsprozess spielt, wurden bereits alternative, p53-unabhangige Mechanismen vorgeschlagen. Des Weiteren, konnten bereits veroffentlichte Studien eindeutig belegen, dass die posttranlationale Modifikation von E1B-55K durch das sogenannte “small ubiquitin-related modifier 1” (SUMO-1) Protein absolut notwendig fur die effiziente Transformation primarer Saugetierzellen ist. Die biochemischen Konsequenzen dieser posttranslationlen Modifikation sowie die damit einhergehenden funktionellen Veranderungen von E1B-55K verbleiben bisher allerdings ungeklart. Die detaillierten, biochemischen Untersuchungen dieser Arbeit konnten eine eindeutige Assoziation verschiedenster adenoviraler Onkoproteine mit bestimmten zellularen Kerndomanen, den sogenannten “PML-nuclear bodies” aufzeigen. Des Weiteren, belegt diese Studie erstmalig eine funktionelle Interaktion der adenoviralen Onkoproteine E1A, E1B-55K und E4orf6 mit bestimmten Isoformen des humanen Tumorsuppressorproteins PML. Dabei spielt in diesem Rahmen die posttranlationale Modifikation von E1B-55K durch SUMO-1 eine wesentliche Rolle und ermoglicht SUMO-abhangige und SUMO-unabhangige Interaktionen mit verschiedenen Isoformen von PML. Zusatzlich erarbeitete Ergebnisse erlauben des weiteren die Vermutung, dass E1B-55K auf verschiedenste Art und Weise durch die SUMO-Proteine modifiziert wird, was sich direkt auf das funktionelle Repertoire des viralen Proteins auswirkt. Basierend auf der bereits veroffentlichten Literatur sowie der hier erarbeiteten Ergebnisse, kann somit ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Interaktion der adenoviralen Onkoproteine mit PML und dem zellularen Transformationsprozess angenommen werden.