Conserved hemagglutinin peptides of influenza virus as potential multivalent vaccine candidate: characterization of immune response in different animal models

Los virus de influenza A (IAVs) son los responsables de brotes pandemicos y de la mayoria de las epidemias anuales en los seres humanos, aves y cerdos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos, basado en la naturaleza de sus glicoproteinas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA es una glicoproteina de superficie homotrimerica que media la entrada del virus de influenza a traves de la union celular y eventos de fusion de membranas. El bolsillo de union al receptor de HA esta rodeado por los sitios de union de anticuerpos antigenicamente variables. Por lo tanto, los anticuerpos limitados a estos sitios deberia, en principio, bloquear la union a las proteinas del receptor, inhibiendo la entrada del virus, lo que demuestra actividad de inhibicion de la hemaglutinina y la actividad de neutralizacion viral. Sin embargo, la subunidad 1 de HA (HA1) es altamente variable a traves de los virus de influenza y tiende a cambiar bajo presion inmune; por lo tanto, facilmente evade los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacunacion o infecciones anteriores. Las consecuencias negativas de las infecciones por virus de influenza incentivan al mundo de la ciencia para promover el desarrollo de vacunas multivalentes contra la gripe, que tengan eficaz proteccion frente a todas las cepas de influenza. Por consiguiente, el campo de la bioinformatica se ha convertido en una parte importante de la identificacion y validacion temprana de nuevas dianas terapeuticas que podrian ser un primer paso esencial en el desarrollo de una vacuna eficaz para el virus de influenza, que representa la alta variabilidad de sus determinantes antigenicos. En esta tesis se postulo que la HA1 podria representar una diana potencial para una vacuna multivalente frente a la infeccion por influenza virus. Por ende; el objetivo general de esta tesis fue seleccionar peptidos conservados de la subunidad 1 de la proteina hemaglutinina del virus de la gripe, para evaluar la eficacia de los candidatos seleccionados, para inducir la inmunidad que pueda proteger a los animales contra la infeccion. Para desarrollar este objetivo, se llevaron a cabo tres estudios experimentales: en ratones (Capitulo 1), cerdos (capitulo 2) y pollos (Capitulo 3). En el primer estudio, se evaluo el efecto protector de la mejora de peptidos HA1 contra la pandemia del virus H1N1 2009 (pH1N1) y el virus de la influenza de alta patogenicidad H7N1 en un modelo de raton (Capitulo 1). En este estudio, los ratones fueron vacunados por via intraperitoneal con la mezcla de peptido sintetico (NG34 + DC89) y desafiados ya sea con el pH1N1 o H7N1 del virus de influenza. Una mortalidad del 85% fue observada en los ratones de control, independientemente del virus utilizado para el desafio, 80% y 66% de los ratones vacunados con peptido sobrevivieron al desafio con pH1N1 y H7N1, respectivamente, sin la deteccion de virus de la influenza (IV). Los ratones vacunados supervivientes se correlacionaron con la presencia de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada en sueros antes de la exposicion. La inmunizacion con NG34+DC89 tambien indujo respuesta inmune en mucosas; demostrandose con la presencia de IgA en lavado broncoalveolar en el 50% de los animales. Nuestros resultados tambien muestran que la vacunacion de NG34+DC89 es capaz de inducir anticuerpos y la proteccion cruzada neutralizante frente a dos cepas heterologas, pH1N1 y H7N1. Por lo tanto, peptidos NG34+DC89 representan un inmunogeno atractivo, lo que podria ser aun mas optimizado para futuras formulaciones de vacunas multivalentes frente el virus de influenza. En el segundo estudio, hemos probado la inmunogenicidad de un coctel HA1-peptido en un modelo porcino para evaluar si esta nueva formulacion puede conferir inmunidad a una amplia gama de virus de influenza in vitro (Capitulo 2). En este estudio, hemos utilizado cuatro peptidos de la HA1 del subtipo H1 del virus de influenza (NG34, DC55, RA22 y SS35), evaluamos su inmunogenicidad en cerdos convencionales de granja frente a virus de influenza homologos y heterologos. Las vacunas de peptidos sinteticos indujeron anticuerpos con capacidad neutralizante y de inhibicion frente a virus homologos. Aquellos tambien cros-reaccionaron frente a los virus heterologos de origen aviar como el virus H7N1 y virus de influenza de baja patogenicidad H5N2 y ademas el virus circulante H3N2 de origen porcino. Por otra parte, se detectaron anticuerpos especificos de IgA-secretora en hisopos nasales. Los resultados muestran que los peptidos evaluados fueron inmunogenicos en cerdos. La respuesta humoral con la actividad neutralizante y de inhibicion de hemaglutinina generada despues de la inmunizacion podria ser utilizada en otros estudios de inmunidad protectora heterosubtipica. En el tercer estudio se evaluo el efecto protector de la mejora de peptidos de HA1 contra el virus altamente patogeno virus de la influenza H7N1 en pollos, un modelo huesped natural (capitulo 3). En este estudio, se utilizaron dos peptidos sinteticos NG34 y SS35 para vacunar pollos de granja. La vacunacion tanto con peptidos NG34 o SS35 indujeron anticuerpos especificos que reconocen virus heterologos, como H7N1 y H5N2 in vitro. La vacunacion con peptido NG34 provoco una respuesta de anticuerpos protectores que confirio una proteccion parcial frente un desafio letal con H7N1. Ademas, el peptido NG34 indujo una respuesta inmune de la mucosa, que correlacionaba con la diseminacion viral reducida en hisopos orofaringeos/ cloacales y la pulpa de la pluma. Por el contrario, animales vacunados con el peptido SS35 no pudieron producir una eficiente respuesta inmune protectora frente el desafio letal H7N1. Es necesario recalcar, que todos los peptidos HA1 del subtipo H1 del virus de influenza, fueron seleccionados mediante el Metodo de espectros informativo (ISM). Cuatro principales conclusiones generales pueden extraerse de estos estudios: (i) Peptidos HA1 son inmunogenicos en todos los modelos animales estudiados (ratones, cerdos y pollos) e inducen una respuesta immune humoral y de mucosa. (ii) Peptidos inmunogenicos de la subunidad 1 de la proteina hemaglutinina del virus de la influenza confieren una proteccion parcial contra diferentes subtipos virales en ratones; (iii) Los cerdos vacunados con peptidos HA1 provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes con actividad de inhibicion de la hemaglutinina frente a diferentes subtipos de Influenza A virus y (iv) Peptidos HA1 confieren una proteccion parcial contra un virus altamente patogeno/ H7N1 en modelo de pollo. En general, nuestros resultados proporcionan ideas sobre nuevos enfoques para la vacunacion de la gripe y la comprension de la respuesta inmune frente al virus de influenza en ratones, cerdos y pollos.