Entwicklung von Enzymdesignalgorithmen mit flexibler Ligandenpositionierung

Enzyme sind hocheffziente Biokatalysatoren, die ein breites Spektrum chemischer Reaktionen katalysieren. Diese Effzienz und die Tatsache dass Substrate in der Regel hochspeziﬁsch umgesetzt werden, pradestiniert deren Einsatz in vielen Bereichen der Medizin und der Biotechnologie. Allerdings erfullt nur ein kleiner Teil der wildtypischen Enzyme die speziellen Anforderungen industrieller Verfahren. Es besteht daher ein groser Bedarf nach Verfahren mit denen Enzymeigenschaften masgeschneidert verandert werden konnen. Parallel zu biochemischen Ansatzen wurden hierfur in den letzten Jahren neue Methoden des computergestutzten Enzymdesigns entwickelt. Dazu gehort TransCent, das entwickelt wird um Enzymfunktionen vom nativen auf alternative Proteingeruste zu ubertragen. Der Entwurf der Strukturmodelle durch TransCent zielt darauf ab, vier Bedingungen, die von fundamentaler Bedeutung fur die Enzymkatalyse sind, bestmoglich zu erfullen. Dies sind (1) die Wahrung der Proteinstabilitat, (2) die Optimierung der Ligandenbindung, (3) das Einstellen des korrekten Protonierungszustandes der katalytischen Residuen und (4) das Ausbilden funktionsspeziﬁscher Wechselwirkungen zwischen Enzym und Ligand. TransCent ﬁndet einen Kompromiss zwischen den zum Teil widerspruchlichen Forderungen, die vier speziﬁsche Softwaremodule zur Erfullung jeweils einer Bedingung stellen. Drei der vier Module basieren auf den State-of-the-Art-Methoden Rosetta, PROPKA und DSX. Fur die Modellierung funktionsspeziﬁscher Wechselwirkungen wurde ein neues Konzept entwickelt, das auf wissensbasierten Potentialen beruht. Aufgrund dieses Ansatzes kann TransCent auch dann verwendet werden, wenn der Ubergangszustand des Substrates und der genau enzymatische Mechanismus der betrachteten Funktion unbekannt sind. Diese Eigenschaft unterscheidet TransCent von den anderen Enzymdesignverfahren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde TransCent um ein Modul erweitert, das die ﬂexible Positionierung von Liganden unterstutzt. Somit werden Limitationen der ersten Programmversion aufgehoben und neue Anwendungsmoglichkeiten erschlossen. Das Modul verwendet den neu entwickelten TransLig-Algorithmus zur Suche nach geeigneten Ligandpositionen. Hierbei wird die Lage des Liganden zusammen mit der Enzymsequenz unter Verwendung eines Simulated Annealing Verfahrens optimiert. Die Performanz des Moduls zur Ligandpositionierung und des uberarbeiteten Designalgorithmus wurde anhand von Rekapitulationsexperimenten basierend auf einem erweiterten und reprasentativen Enzymdatensatz bestimmt. Es zeigte sich, dass mithilfe des neuen Moduls zuverlassig nativ-ahnliche Ligandpositionen gefunden werden, die zu wildtyp-ahnlichen Designmodellen umgesetzt werden. Um die Qualitat der TransCent-Modelle einer experimentellen Uberprufung zuganglich zu machen, wurden funf Modelle fur die Ubertragung der Phosphoribosylanthranilat-Isomerase-Aktivitat auf das Strukturgerust zweier Enzyme aus der Histidin-Biosynthese von Thermotoga maritima berechnet. Anhand eines dieser Beispiele wurde der Designprozess ausfuhrlich beschrieben und das resultierende Strukturmodell detailliert analysiert. Im Labor von R. Sterner wurden die aus den Modellen resultierenden Proteine hergestellt, gereinigt und experimentell auf Stabilitat, Aktivitat und Bindung getestet. Alle Proteine waren stabil und drei der funf Proteine waren in der Lage den Liganden mit annahernd wildtypischer Affnitat zu binden. Allerdings besas kein Protein eine nachweisbare Enzymaktivitat. Diese experimentellen Ergebnisse belegen, dass die hier vorgestellte Version von TransCent zumindest in der Lage ist, Ligandenbindestellen korrekt zu modellieren. Damit zeigt dieses Programm einen Weg auf, ein wichtiges Teilproblem des Enzymdesigns anzugehen, welches bisher nicht zufriedenstellend gelost wurde.