Rôle des forces hémodynamiques sur l’expression de composants de la matrice extracellulaire au cours du développement normal et pathologique de la valve aortique

L’objectif de ce travail de these a ete de mettre en evidence l’importance des forces hemodynamiques dans le developpement normal du cœur. Ces forces, causees par les contractions du tube cardiaque des les premieres etapes de l’embryogenese, vont agir sur la vasculature primordiale et engendrer un stress mecanique constituant un signal de differenciation pour les cellules endotheliales. La transduction de ce signal, mediee par le canal ionique mecanosensible non-selectif Piezo1, va permettre un changement de profil d’expression genique au sein de l’endothelium et des tissus adjacents, et ainsi contribuer au developpement de structures cardiaques specialisees. Grâce a plusieurs techniques d’hybridation in situ couplees a des traitements pharmacologiques et de knock-down par injection de morpholinos anti-sens, nous avons pu reveler chez le poisson-zebre que l’expression cardiaque d’aggrecan a, gene codant un proteoglycane permettant la resistance tissulaire a la compression, est dependante des forces hemodynamiques. L’expression de ce gene, restreinte a la chambre d’ejection systolique (OutFlow Tract, OFT) dans le cœur, s’avere etre localisee dans les cellules qui entourent l’endothelium. Des techniques de knock-out via mutagenese CRIPSR/Cas9 et de knock-down par injection de morpholinos ont permis de reveler l’apparition d’un phenotype caracterise par un œdeme cardiaque et des defauts de developpement et de disposition des chambres cardiaques. La poursuite des experiences de knock-down du gene aggrecan a chez le poisson-zebre a permis de reveler un sous-developpement de l’OFT impactant fortement la performance cardiaque. Ces resultats experimentaux sont concordants avec les donnees obtenues par l’analyse transcriptomique de tissus valvulaires humains, revelant une forte sous-expression du gene AGGRECAN dans les valves aortiques de patients atteints de bicuspidie de type 0. Cela suggere l’association d’anomalies d’expression de ce gene avec le developpement de ce type de cardiopathies congenitales chez l’Homme. De facon similaire, nous avons pu realiser chez le poisson-zebre des experiences d’hybridation in situ chromogenes et fluorescentes afin de reveler l’expression cardiaque du gene spp1. Ce gene code une proteine de la matrice extracellulaire impliquee dans la mineralisation et la migration cellulaire, et se trouve etre exprime au niveau des sites de formation des valves aortique et atrioventriculaire. Des injections de morpholinos anti-sens nous ont permis d’inhiber l’expression du gene tnnt2, indispensable a la contraction cardiaque, et ont ainsi permis de confirmer la dependance hemodynamique de l’expression de spp1. Le knock-down du gene piezo1b a donne des resultats comparables, confirmant ainsi son role mecanotransducteur. Le knock-down de spp1 par injection de morpholino a permis de reveler lors de l’observation de larves de 6 jours en microscopie biphotonique in vivo le developpement dysmorphique des cupules de la valve aortique. Nous avons cree en parallele une lignee knock-out spp1 par mutagenese via CRISPR/Cas9, puis confirme par sequencage l’insertion d’un codon STOP precoce dans la sequence codante. Cependant, aucun phenotype n’a ete detecte chez ces individus, suggerant un phenomene de compensation par degradation des ARNm non-sens (phenomene NMD). Pour palier a ce probleme, de nouvelles experiences de knock-out sont en cours, utilisant une strategie dite « RNA-less » d’excision de la partie promotrice de spp1. Enfin, nous avons pu identifier des mutations humaines du gene orthologue SPP1 chez des patients atteints d’aortopathies congenitales, dont une deletion rare de 4 nucleotides provoquant a priori la perte de la partie C-terminale de la proteine, impliquee dans la liaison a CD44. Ces resultats montrent l’interet du modele poisson-zebre dans la validation de mutations et la determination de leur impact sur le developpement de cardiopathies congenitales chez l’Homme.