Characterisation of selected neuropeptide systems in the marine model organism Platynereis dumerilii

Neuropeptide stellen eine wichtige Klasse aus Signalmolekulen dar, die im Gehirn hergestellt werden und wichtige Funktionen in Physiologie, Entwicklung und im Verhalten steuern. Etliche Neuropeptidfamilien sind schon fruh in der Evolution von Tieren entstanden und lassen sich sowohl bei Protostomen als auch bei Deuterostomen (inklusive Wirbeltiere) finden, weswegen sie vermutlich relevant fur fundamentale Prozesse sind. In meiner Arbeit wurden zwei dieser Neuropeptidfamilien untersucht: die GnRH-ahnliche und die Oxytocin/Vasopressin (OT/AVP) Familie. Beide Familien spielen eine wichtige Rolle in der Fortpflanzung von Wirbeltieren, wobei ihre ursprungliche Funktion noch unklar ist (Gruber, 2014)(Roch et al., 2014a). In Platynereis dumerilii findet man noch beide Peptidhormonfamilien (Tessmar-Raible et al., 2007; unpublished). Wie in vielen anderen marinen Arten findet man auch bei dieser Spezies einen streng regulierten Reproduktionszyklus, welcher mit den Mondphasen korreliert und unter der Kontrolle der molekularen circa-lunaren Uhr steht (Zantke et al., 2013). Die zeitliche Abstimmung der Fortpflanzung ist auserdem von anderen schwer messbaren metabolischen und hormonellen Faktoren abhangig. Mithilfe von qPCR konnte ich nachweisen, dass diese ausgewahlten Neuropeptid-Vorlaufermolekule eine Rolle in der Reproduktion von Platynereis spielen, da ihre Transkriptionslevel wahrend der Reifung signifikant erhoht sind. In meiner Arbeit konzentrierte ich mich auch auf die Charakterisierung des OT/AVP Signalsystems, indem ich versuchte die Role von Vasotocin, das Peptidkorrelat in Platynereis, zu entschlusseln. Ich konnte die Bindung von VTN an zwei orthologe Rezeptoren, namlich VtnR1 und VtnR2 nachweisen und somit bestatigen, dass der VTN Ligand zu dieser orthologen Gruppe von Peptiden gehort. Die Transkriptionslevel der Vtn und VtnR Gene, welche im Kopf nachweisbar hoher waren als im Rest des Korpers, waren zwar zu niedrig um ihre Lokalisierung durch In-Situ-Hybridisierung zu ermitteln, aber mithilfe von anti-VTN Antikorpern konnte ich die aktiven VTN Neuropeptide im ventralen Bereich des Gehirnes von erwachsenen Tieren nachweisen. Im Rahmen dieses Projektes, habe ich zur Etablierung des ersten Werkzeuges fur Gen-Knockouts in Platynereis beigetragen, indem TALEN-Konstrukte fur das OT/AVP-ahnliche Gen Vasotocin-Neurophysin (Vtn) hergestellt wurden(Bannister et al., 2014). Diese Entdeckungen lassen schliesen, dass Pdu-Vasotocin eine neuromodulatorische Funktion hat und moglicherweise eine Rolle im reproduktiven Verhalten spielt. Diese Hypothese kann nun mithilfe homozygoter Tiere aus der von mir hergestellten Mutantenlinie verifiziert werden. “ Den neuesten phylogenetischen Studien zufolge sind die GnRH-ahnlichen Peptide und ihre Rezeptoren Teil einer groseren AKH/CRZ/ACP/GnRH Superfamilie, die gleichen evolutionaren Ursprungs sind, welcher bis zur Aufteilung der Proto- und Deuterostomia zuruckgeht. In den Protostomia wurden diese Genfamilien aufgespalten, wobei jede Gruppe ihre Subfunktion erhielt. Im zweiten Teil meiner Arbeit, habe ich diese Hypothese in Platynereis in unterschiedlichen Ansatzen getestet. Ich habe dabei gezeigt, dass im Transkriptom des Platynereis vier orthologe Peptide kodiert werden, die den AKH- und CRZ/invGnRH-Untergruppen zugeordnet werden konnen, obwohl evolutionsbiologische Schlusse auf solche kurze Sequenzen schwer zu ziehen sind. Phylogenetische Analysen des G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) zeigten, dass Platynereis zwei Arten von AKHR-Typ Rezeptoren und einen CRZ/invGnRHR-TypRezeptor besitzt. Diese phylogenetische Bestimmung wurde unabhangig in einem Zell-basierten Validierungsassay von anderen Studenten und Kollaborateuren bestatigt. Die Entdeckung, dass invGnRHR3 an beide Rezeptoren bindet, deutet auf eine Interaktion dieser Faktoren hin und zeigt, dass dieses System viel komplexer ist als gedacht. Durch In-Situ-Hybridisierungen konnte ich die Platynereis crz/gnrh1, akh1 und akh2 Vorlaufermolekule in verschiedenen Bereichen des Gehirns in Platynereis lokalisieren. Dies deutet darauf hin, dass die Peptide zwar unterschiedliche Funktionen haben, aber dennoch die gleichen Zellen ansprechen. Um die Rolle der invGnRHs naher bestimmen zu konnen, testete ich die Funktion des Platynereis crz/gnrh1 Gens im Mutantenstamm. Meine Analysen zeigten, dassrein homozygote Weibchen sich wahrend ihrer Reifezeit im Vergleich zum WT und Mannchen signifikant fruher vermehren. Mannchen zeigten keinen Unterschied zum WT. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass invGnRHs eine Rolle in der Stoffwechselumstellung und in der Reifung spielen und somit auch die zeitliche Abstimmung der Fortpflanzung beeinflussen. Der Phenotyp kann dabei noch immer durch andere Liganden, welche an den selben Rezeptor binden, kompensiert und damit konnen andere Funktionen durch den Knock-out des Pdu-GnRHR3 Rezeptorgens demaskiert warden.