Optimization of flow cytometry assays for the detection of injured foodborne pathogenic bacteria

Algunos tratamientos de elaboracion y conservacion de los alimentos lesionan las bacterias, de manera que pierden la capacidad para multiplicarse y no son detectadas por metodos de cultivo convencionales. La citometria de flujo es una tecnica de analisis independiente del cultivo de los microorganismos, usada ampliamente para evaluar de manera rapida el estado fisiologico de celulas bacterianas individuales, siendo la integridad de membrana unos de los indicadores mas habituales debido a su importancia en la supervivencia de estas. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante citometria de flujo se ven afectados por la presencia de particulas de las muestras alimentarias. En esta tesis, se evaluaron estrategias para desarrollar un ensayo por citometria de flujo basado en el uso del yoduro de propidio (YP), fluorocromo que no atraviesa las membranas intactas, combinado con un fluorocromo que penetra las membranas intactas, para detectar y cuantificar con precision bacterias patogenas lesionadas. En el primer experimento, se ajustaron las concentraciones y las ratios de combinaciones de YP con SYTO 9, SYTO 24 y SYTO BC para mejorar la resolucion de poblaciones de celulas sanas y muertas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis y Listeria monocytogenes en suspensiones control. Esto permitio detectar celulas lesionadas en suspensiones expuestas a estreses relacionados con los alimentos. En el segundo experimento, se aplicaron las tinciones optimizadas a muestras de ensalada de pasta inoculadas con E. coli O157:H7. Asimismo, se compararon ocho pre-tratamientos basados en la filtracion gruesa de las muestras homogeneizadas y en un paso de dilucion/lavado, para evaluar la reduccion de particulas interferentes y la recuperacion de E. coli O157:H7 de la ensalada. El pre-tratamiento mas favorable fue la combinacion de la bolsa de homogenizacion con filtro de 63 µm y la filtracion centrifuga a traves de un filtro de 5 µm, ya que redujo la concentracion de particulas interferentes tanto como diluir la muestra. Considerando que el objetivo principal de esta tesis fue detectar especificamente bacterias patogenas lesionadas, en el tercer experimento, la optimizacion se llevo a cabo para suspensiones control de E. coli O157:H7 en soluciones tampon comunmente usadas en inmunoensayos, y tenidas con SYBR Green I, un fluorocromo con alta afinidad por los acidos nucleicos, YP y un anticuerpo marcado con R-ficoeritrina (Ac-RFE). La adicion de Ac-RFE no afecto notablemente la resolucion de las poblaciones en comparacion con la resolucion conseguida con la tincion con SYBR Green I y YP, y permitio reconocer claramente las celulas de E. coli O157:H7. En el cuarto experimento, se evaluaron estrategias de filtracion de senal analitica para reducir la adquisicion de datos procedentes de particulas interferentes. Posteriormente, se aplico el pre-tratamiento de muestra optimizado, la tincion para evaluar la integridad de membrana y la inmunodeteccion, y la filtracion de senal analitica, para monitorizar los cambios de la integridad de membrana de E. coli O157:H7 inoculada en ensalada de pasta durante 14 dias de almacenamiento en refrigeracion (pH 4,5; 4°C). Con este protocolo optimizado, el limite de deteccion disminuyo a 5 log UFC/g. Ademas, se observo que la mayoria de celulas de E. coli O157:H7 estaban lesionadas al principio del almacenamiento, pero mostraban una membrana intacta al final, lo que sugiere que las celulas lesionadas repararon su membrana durante la exposicion a acido y refrigeracion y, por lo tanto, sobrevivieron en la ensalada de pasta. En conclusion, el ensayo por citometria de flujo para la evaluacion de la integridad de membrana y la inmunodeteccion desarrollado en esta tesis es una buena herramienta para monitorizar el efecto de tratamientos relacionados con los alimentos sobre el estado de la membrana de E. coli O157:H7, parametro fisiologico relacionado con la presencia de celulas lesionadas.