Régulation des principaux transporteurs de glucose et leurs effets sur l’expression des gènes de virulence chez Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes est une bacterie a Gram+, ubiquiste, pathogene intracellulaire d’origine alimentaire, responsable chez l’homme, de nombreuses infections telles que les infections foeto-maternelles, des meningo-encephalites et des septicemies. La bacterie utilise preferentiellement le glucose qui est transporte via le systeme phosphoenolpyruvate:sucre phsosphotransferase (PTS) et des permeases non-PTS. Les deux principaux transporteurs de glucose chez L. monocytogenes seraient des PTS de la classe mannose. Le premier est code par l’operon manLMN (man) et le deuxieme, par l’operon mpoABCD (mpo). Nous avons, dans un premier temps, mis en evidence le transport de glucose par ces PTS chez L. monocytogenes et aussi identifier d’autres transporteurs non-PTS de glucose. Des tests de croissance en milieu minimum (MM) additionne de glucose et des tests de consommation de glucose ont permis de montrer que les mutants ΔmanL (manL code pour l’EIIABMan) et ΔmanM (manM code pour l’EIICMan) utilisent moins vite le glucose que la souche sauvage AML73 ou EGDe (3 a 4 fois moins vite). Le mutant ΔmpoA (mpoA code pour l’EIIAMpo) montre un phenotype similaire a la souche sauvage tandis que le mutant ΔmpoB (mpoB code pour l’EIIBMpo) utilise 4 a 5 fois moins vite le glucose que la souche sauvage. Des tests de qRT-PCR ont par ailleurs permis de montrer que la deletion du gene mpoA permet une expression constitutive de l’operon man tandis que la deletion du gene mpoB entraine une inhibition de l’expression de cet operon. Nous avons aussi montre que l’operon man est induit par le glucose et l’operon mpo est exprime constitutivement. Le PTSMan est le principal systeme de transport de glucose chez L. monocytogenes et le PTSMpo pourrait fonctionner comme un senseur de glucose qui en presence de ce sucre stimule l’expression de l’operon man en regulant l’activite de ManR. Le mutant ΔptsI (ptsI code pour la proteine generale EI du PTS) utilise 8 a 10 fois moins vite le glucose que la souche sauvage et presente une tres faible expression de l’operon man. L’utilisation du glucose (bien que faible) par le mutant ΔptsI permet d’affirmer qu’il existerait des transporteurs non-PTS qui permettraient a ce mutant d’utiliser le glucose. Des tests de complementation heterologue dans la souche E. coli LJ140 (incapable de transporter le glucose) ont permis de montrer que les trois proteines GlcU (GlcU1, GlcU2 et GlcU3, identifiees par homologie de sequences aux GlcU d’autres firmicutes) permettent le transport de glucose chez L. monocytogenes mais avec une tres faible affinite. Un role potentiel du PTS et des transporteurs non-PTS dans la regulation de PrfA a egalement ete mis en evidence par des tests de dosage β-D-glucuronidase a partir de cultures bacteriennes realisees en milieux liquides ou sur geloses et aussi par des tests de qRT-PCR (pour l’expression des genes actA et hly). Ces tests ont ete realises a partir de la souche L. monocytogenes AML73 (portant la fusion Phly-gus) et des mutants ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI et glcU (construits dans cette souche). Les mutations manL, manM, mpoB, ptsI entrainent une augmentation de l’activite de PrfA (de 2 a 14 fois) et une augmentation de l’expression des genes de virulence PrfA-dependants (hly et actA) est egalement observee dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations glcU et mpoA ne montrent aucun effet sur l’activite de PrfA. Les mutants montrant une forte activite de PrfA contiennent peu ou pas de proteine EIIABMan qui est supposee jouer un role dans la regulation de l’activite de PrfA par le glucose. L’effet des mutations PTS observe sur l’expression des genes de virulence depend de PrfA car cet effet disparait quand le gene prfA est delete dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations montrant un effet sur l’activite de PrfA ont egalement ete etudiees in vitro par des infections des cellules epitheliales (Caco-2 et Jeg-3) avec les differents mutants et egalement in vivo dans la souris. La deletion du gene ptsI montre un effet dans l’infection plus particulierement dans l’entree des bacteries dans les cellules