Screening for novel targets of the MAPK Hog1 using quantitative proteomics

Alle Zellen uberwachen (und reagieren entsprechend) auf Veranderungen in den extrazellularen Parametern, wie Osmolaritat, Temperatur, pH-Wert aber auch auf Schwankungen in der Nahrstoffsituation. Eine solche Veranderung verursacht haufig die Aktivierung spezialisierter Signaltransduktionskaskaden. Eukaryoten wie z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae haben eine breite Palette an Sensoren und Signalproteinen, die Prozesse initiieren um das zellulare Gleichgewicht in Stresssituation wieder in Ordnung zu bringen. Diese Sensoren und Signalproteine sind in typischen Signalkaskaden in einer hierarchischen Ordnung gegliedert. Sobald eine Signalkaskade aktiviert wird, fuhrt dies zu weiteren zellularen Ereignissen, wie Transkription und post-translationale Proteinmodifizierung zur Steuerung von Proteinaktivitat. Mitspieler der Kaskade sind uber Feedback-Loops miteinander verflochten. Obzwar die Veranderung der Genexpression eine wesentliche und vor allem dauerhafte Rolle in der zellularen Reaktion auf hyperosmotischen Stress spielt, konnte die Transkription per se wenig Einfluss auf das unmittelbare Uberleben der Zelle unter gestressten Bedingungen haben. Vielmehr ist es die Modulierung der Proteinaktivitat durch post-translationale Modifikationen (PTMs), die die unmittelbare Reaktion auf Stress ermoglicht. Eine besonders verbreitetete Modifizierung, die uber Proteinkinasen und Phosphatasen gesteuert wird, ist die Phosphorylierung. Die Identifizierung der post-translationalen Modifikationsstellen an moglichen Zielproteinen und auch die Erfassung der Modifikationskinetik stellt oft eine besondere Herausforderung dar. Erst die jungsten Entwicklungen in der quantitativen Massenspektrometrie (MS)-Analytik ermoglichen es tausende von Phosphorylierungen und eventuelle Site-Abhangigkeiten von modifizierenden Enzymen festzustellen. In dieser Arbeit prasentiere ich eine Vorgehensweise Proteinregulation in de Backerhefe auf Reaktion von extrazellularen hyperosmotischen Stress uber post-translationale Modifikationen (PTM) zu erfassen. Es ging vor allem darum Targetproteine zu identifizieren, die uber die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Hog1 gesteuert werden. Um diese zu spezifizieren, integrierten wir zwei MS-Datensatze: Wahrend ein Datensatz im Allgemeinen Veranderungen im Phosphorylierungsmuster in hyperosmotischen Stress aufzeigt, beinhaltet der andere Datensatz jene Veranderungen im Phosphorylierungsmuster, die duch Inhibition der MAPK Hog1 hervorgerufen werden. Fur ein sicheres Proteintarget von Hog1 erwarten wir uns ein charakteristisches Verhalten des betroffenen Phosphorylierungsmusters in beiden Datensatzen. Weiters testen wir die extrahierten Proteintargets auf Interaktion mit der MAPK uber ein Protein-Protein Interaktionsassay. Um eine moglichst vollstandige Sequenzabdeckung zu erreichen und alle regulierten Modifikationsstellen eines Proteins abzudecken, werden interessante Kandidaten im Zuge einer „Targeted Proteomics“- Strategie analysiert. So prasentiere ich in dieser Arbeit Tsl1, die grose Untereinheit der Trehalose Synthase in der Hefe: Das Protein weist drei Hog1-Motive auf, die unter hyperosmotischen Bedingungen stark phosphoryliert werden, was eventuell auf eine Rolle in der Hog1-gesteuerten zellularen Stressreaktion hinweist.