Mecanismo molecular de la activación del enhancer del locus de la cadena alfa del receptor de linfocitos T (Tcra)

El enhancer del locus de la cadena alpha del receptor para antigeno de linfocitos T (Tcra), Ea, es esencial para la activacion de la transcripcion germinal y recombinacion VaJa durante el desarrollo de los linfocitos T, y por tanto para la generacion de los linfocitos Tab. Ea se ha considerado un paradigma de los enhanceosomas, definidos como complejos multiproteicos muy compactos ensamblados en una secuencia reguladora. Ea esta formado por cuatro elementos denominados Ta1-Ta4, albergando Ta1-Ta2 las secuencias necesarias para la actividad transcripcional y recombinacional de Eaen vivo. Esta aceptado que para la actividad de Ta1-Ta2 se precisa una estructura muy rigida del enhanceosoma formado en esta secuencia, sin embargo hemos creado una version mutada del Ea, EaMC, que sorprendentemente resulto ser un enhancer mas potente que Ea, indicando que la identidad y las interacciones estereoespecificas entre las proteinas que forman Ea pudieran ser mas flexibles de lo que se supone. EaMC ha proporcionado, ademas, informacion sobre las interacciones requeridas entre los distintos factores de transcripcion de union a Ea para su correcta activacion temporal durante el desarrollo de los timocitos. La posibilidad del ensamblaje de distintos enhanceosomas en Ea podria representar una forma mas flexible para el procesamiento de informacion durante el desarrollo de los linfocitos T. La activacion de Ea ocurre durante la transicion de timocitos CD4-CD8- dobles negativos (DN)3a a CD4+CD8+ dobles positivos (DP), a traves de la senalizacion mediada por el pre-TCR, y viene acompanada de importantes cambios en la estructura de la cromatina del enhancer y de su area de influencia. Para entender el mecanismo molecular de activacion de Ea durante el desarrollo de los timocitos, hemos estudiado los requerimientos para su activacion, demostrando que se necesita una senalizacion constante a traves de la fosfolipasa Cgamma y mediada por Ca2+/calcineurina y las quinasas activadas por mitogenos (MAPKs) y de respuesta extracelular (ERK). Mediante el analisis comparativo de las secuencias de Eahumano y murino, y validacion experimental in vitro, hemos identificado una intrigante concentracion de sitios de union para factores de transcripcion inducibles en 5'Ta1-Ta2, coincidentes con sitios esenciales previamente descritos para factores de transcripcion constitutivos de timocitos. En concreto, hemos demostrado la presencia de dos sitios para NFAT en 5'Ta1, un sitio para NFAT y un sitio para AP-1 en Ta1 y un sitio para NFAT en Ta2, ademas de varios sitios de union para factores Egr en 5'Ta1-Ta2 y 3'Ta4. Estos factores son capaces de ensamblarse en vivo en un enhanceosoma Ea activo mediado por la senalizacion a traves del pre-TCR, reclutando co-activadores con actividad acetilasa de histonas. La coincidencia exacta entre sitios en Ea de union para los factores constitutivos de timocitos y factores inducibles a traves del pre-TCR apoya que el nuevo enhanceosoma se forme mediante un intercambio de factores mediado por competicion en su union al ADN. Estos datos proporcionan el mecanismo molecular de activacion de Ea y una explicacion molecular para la paradoja de su activacion en ausencia de cambios detectables en experimentos de footprinting genomico con dimetilsulfato (DMS) realizados en timocitos DN3a y DP. La induccion de los factores NFAT, AP-1 y Egr se produce de manera transitoria durante una primera fase de la senalizacion a traves del pre-TCR lo cual sugiere que estos pudieran dejar de formar parte del enhanceosoma Ea cuando su disponibilidad disminuye en el nucleo en una segunda fase de senalizacion. Por esa razon, hemos analizado la actividad de Ea durante la maduracion de los linfocitos T. Nuestros datos indican que las senalizaciones mediadas por los complejos pre-TCR o TCRa son indistinguibles en su capacidad de activar Ea en timocitos DN4/DP. Ademas, hemos analizado la funcionalidad de Ea en linfocitos T perifericos en vivo, tanto en el locus Tcra endogeno como en una localizacion ectopica, demostrando que Ea se encuentra inactivo en periferia. Estos datos estan en concordancia con el mecanismo molecular propuesto para la activacion del enhanceosoma de Ea, demostrando que su actividad es transitoria, estando Ea inactivo en timocitos DN3a, activo en timocitos DN4/DP e inactivo en linfocitos T perifericos.