Determinação de endotoxina bacteriana (pirogênio) em radiofármacos pelo método de formação de gel. Validação

Before the Limulus amebocyte lysate (LAL) test, the only available means of pirogenicity testing for parenteral drugs and medical devices was the United States Pharmacopoeia (USP) rabbit pyrogen test. Especially for radiopharmaceuticals, the LAL assay is the elective way to determine bacterial endotoxin. The aim of this work was to validate the gel clot method for some radiopharmaceuticals without measurable interference. The FDA s LALTest guideline defines interference as a condition that causes a significant difference between the endpoints of a positive water control and positive product control series using a standard endotoxin. Experiments were performed in accordance to the USP bacterial endotoxins test in the Im-iodobenzylguanidine; the radioisotopes Gallium-67 and Thallium-201; the liophylized reagents DTPA, Phytate, GHA, HSA and Colloidal Tin. The Maximum Valid Dilution (MVD) was calculated for each product based upon the clinical dose of the material and a twofold serial dilution below the MVD was performed in duplicate to detect interferences. The labeled sensitivity of the used LAL reagent was 0.125 EU mL (Endotoxin Units per milliliter). For validation, a dilution series was performed, a twofold dilution of control standard endotoxin (CSE) from 0.5 to 0.03 EU mL, to confirm the labeled sensitivity of the LAL reagent being tested in sterile and non pyrogenic water, in quadruplicate. The same dilution series was performed with the CSE and the product in the 1:100 dilution factor, in three consecutive batches of each radiopharmaceutical. The products I-m-iodobenzylguanidine, Gallium-67, Thallium-201, DTPA, HSA and Colloidal Tin were found compatible with the LAL test at a 1:100 dilution factor. Phytate and GHA showed some interference in the gel clot test. Other techniques to determine endotoxins as the chromogenic (color development) and the turbidimetric test (turbidity development), were also assessed to get valuable quantitative and qualitative information about the endotoxin concentration in samples. SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO . 10 1.1 Radiofármacos . 11 1.2 Pirogênio e Endotoxina . 14 1.3 Estrutura, Função e Atividade da Endotoxina . 16 1.4 Processos de Despirogenização . 18 1.5 Ensaio de Pirogênio pelo Método in vivo . 22 1.5.1 Histórico . 23 1.6 Determinação de Endotoxinas Bacterianas pelo Método in vitro . 24 1.6. 1 Histórico . 27 1.7 Validação do Ensaio do LAL . 30 1.8 Interferências . 32 1.9 Outros Métodos para Determinação de Endotoxina . 34 1.9. 1 Método Turbidimétrico Quantitativo . 34 1.9. 2 Método Colorimétrico de Proteína . 35 1.9. 3 Método Nefelométrico . 35 1.9. 4 Método Cromogênico Quantitativo . 35 2 OBJETIVO . 37 3 REVISÃO DA LITERATURA . 38 4 MATERIAIS E MÉTODOS . 40 4.1 Materiais . 42 4.1.1 Materiais Utilizados no Método in vitro de Determinação de Endotoxina por Formação de Gel . 42 4.1.2 Materiais Utilizados no Método Cromogênico PTS de Determinação de Endotoxina Bacteriana . 42 4.1.3 Materiais Utilizados no Método Turbidimétrico de Determinação de Endotoxina Bacteriana . 44 4.2 Métodos . 44 4.2. 1 Método de Formação de Gel . 44 4.2. 1.1 Preparação das Diluições Sucessivas de Padrão de Endotoxina. 46 4.2. 1.2 Preparação das Diluições Sucessivas do Produto com Padrão de Endotoxina . 46 4.2. 1.3 Determinação da Sensibilidade do Reagente LAL . 47 4.2. 2 Método Cromogênico PTS . 48 4.2. 3 Método Turbimétrico . 49 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO . 50 5.1 Validação dos Produtos pelo Método de Formação de Gel . 50 5.1.1 Cálculo de MDV . 50 5.1.2 Inibição ou Potencialização . 51 5.1.3 Séries de Diluição do Padrão de Endotoxina . 54 5.1.3.1 Determinação da Sensibilidade do Reagente LAL . 54 5.2 Validação pelo Método Cromogênico PTS . 56 5.2. 1 Cálculo de MDV . 58 5.2. 2 Inibição ou Potencialização . 58 5.3 Validação pelo Método Turbimétrico . 66 5.3.1 Cálculo de MDV . 66 5.3. 2 Inibição ou Potencialização . 66 6 CONCLUSÕES . 73 ANEXO 1 Modelo de Ficha para Validação . 74 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . 75 LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS BCG Bacilo de Calmette e Guérin BPF Boas Práticas de Fabricação CDRH Center for Devices and Radiological Health CEP Concentração de Endotoxina no Produto CPP Controle Positivo do Produto CV Coeficiente de Variação DTPA Ácido Dietilenotriaminopentacético FDA Food and Drug Administration GHA Glucoheptonato de Cálcio HIMA Health Industry Manufacturers Association IgG Imunoglobulina G KTS Sistema Cinético Turbidimétrico LAL Lisado do Amebócito de Limulus LPS Lipopolissacarídeo MBq Megabecquerel MCV Mínima Concentração Válida MDV Máxima Diluição Válida MIBG Metaiodobenzilguanidina nm Nanômetro PE Padrão de Endotoxina PET Tomografia por Emissão de Pósitron pNA para-nitroanilina PRE Padrão de Referência de Endotoxina PTS Sistema de Teste Portátil RCCP Recuperação do Controle Positivo do Produto RDC Resolução da Diretoria Colegiada SAH Soro Albumina Humano UE Unidade de Endotoxina USP Farmacopéia Americana