Alternative Methoden für den Nukleinsäure-basierten Nachweis genetisch veränderter Lebens- und Futtermittel

GER) In der vorliegenden Arbeit wird die Untersuchung neuer methodischer Ansätze für die Analyse genetisch veränderter Organismen (GVO) in Lebensund Futtermitteln beschrieben. Der Bedarf für die Entwicklung alternativer GVO-Nachweismethoden ergibt sich aus den Rechtsvorschriften bezüglich der Rückverfolgbarkeit von GVO in der Europäischen Union sowie der fortschreitenden Zunahme von GVO in Europa. Die durchgeführten Arbeiten hatten grundsätzlich zwei Schwerpunkte. Einerseits wurde ein Verfahren der Gesamtgenomamplifikation, die multiple displacement amplification, für die Anreicherung von Proben-DNA eingesetzt und hinsichtlich ihrer Eignung für die GVO-Analyse untersucht. Genomische DNA verschiedener genetisch veränderter Maislinien wurde mit dieser Methode amplifiziert. Die resultierende DNA wurde hinsichtlich ihrer Ausbeute und Qualität beurteilt. In Real-Time PCR (Polymerasekettenreaktion)-Analysen wurde das Verhalten der amplifizierten DNA mit dem der Ausgangs-DNA verglichen. Zudem wurde die Gleichmäßigkeit der Vervielfältigung verschiedener Genom-Abschnitte geprüft. Unabhängig von der Menge eingesetzter genomischer DNA wurde eine konstante Ausbeute hochmolekularer Mais-DNA generiert, die sich in der RealTime PCR identisch zur Ausgangs-DNA verhielt. Die Amplifikation verschiedener Genomabschnitte war weitgehend gleichmäßig. Die mittels multiple displacement amplification vervielfachte DNA ist für die qualitative GVO-Analyse geeignet und kann zur Anreicherung von Proben-DNA oder als Referenzmaterial verwendet werden. Das zweite Teilziel der Arbeit war die Entwicklung eines DNA-Nachweisverfahrens für die parallele GVO-Detektion als Alternative zur PCR. Die Methodik sollte auf den Ergebnissen des ersten Teils aufbauen, indem die Gesamtgenomamplifikation als Grundlage für die Bereitstellung von Proben-DNA genutzt werden sollte. Es wurde eine neue Strategie für die Sequenz-spezifische DNA-Detektion entwickelt, bei der eine Kombination aus direkter Hybridisierung genomischer DNA, immunologischer Detektion und Signal-Amplifikation mittels einer uniformen PCR eingesetzt wird. Die Detektion und Visualisierung basiert auf dem Prinzip der aus dem Bereich der Protein-Analytik stammenden Real-Time Immuno-PCR. Nach dem Aufbau einer geeigneten Methodik und der Optimierung einzelner Arbeitsschritte wurde die Leistungsfähigkeit der Methode für die Detektion verschiedener Zielmoleküle untersucht. Die Ergebnisse belegen erstmals den Sequenz-spezifischen, selektiven Nachweis von DNA mit der Real-Time Immuno-PCR, die bisher ausschließlich für den Nachweis von Antigenen verwendet wurde. Sowohl synthetische Oligonukleotide als auch PCR-amplifizierte Proben-DNA ließen sich mit und ohne Anwesenheit von Hintergrund-DNA mit hoher Messpräzision und Wiederholbarkeit nachweisen. Die Nachweisgrenze für ein synthetisches DNA-Oligomer unter optimierten Nachweisbedingungen lag bei 6 Attomol, während PCR-amplifizierte DNA in Mischungen mit nicht-komplementären PCRAmplika bis zu einer Menge von 60 Attomol detektiert wurde. Die hohe Signalstärke der Detektion durch die Signal-Amplifikation mittels PCR war gleichzeitig mit starken Hintergrund-Signalen verbunden, die die Sensitivität der DNA-Detektion in Anwesenheit größerer Mengen unspezifischer DNA verringerten. Versuche mit genomischer Hintergrund-DNA zeigten, dass die Sensitivität der Detektion nicht für den direkten Nachweis von Einzelkopie-Sequenzen in komplexer genomischer DNA – wie genetisch veränderter Pflanzen-DNA – ohne eine vorherige Zielsequenz-Amplifikation ausreicht. Ein Einsatz der Methode für andere Anwendungen ist denkbar, bei denen entweder kleinere Genome (beispielsweise von Bakterien oder Viren) oder mehrfach im Genom vorhandene Zielsequenzen untersucht werden.