Efecto del uso de codones en la velocidad de traducción de la región codificante de la cápside en poblaciones del virus de la hepatitis A

El virus de la hepatitis A (VHA) pertenece a la familia Picornaviridae y posee un genoma de ARN de polaridad positiva con una longitud de aproximadamente 7500 nucleotidos. El VHA como otros virus ARN existe in vivo como distribuciones dinamicas de variantes de genomas cercanamente relacionadas, conocidas como cuasiespecies. Dichos genomas estan sujetos a continuos procesos de variacion genetica, competicion, complementacion, interferencia y seleccion, que contribuyen al dinamismo de la poblacion y les permite adaptarse a los distintos ambientes. El VHA posee una serie de caracteristicas unicas que lo diferencian del resto de los miembros de la familia Picornaviridae. Entre ellas se encuentra el hecho de que posee un IRES de tipo III en su extremo 5’NCR, el cual es una extensa estructura secundaria altamente compleja, que posee una eficiencia muy baja en dirigir la traduccion. Otra caracteristica es que el VHA no tiene la capacidad de inducir shut-off o silenciamiento de la sintesis proteica celular. Ademas, el VHA posee un uso de codones que ha evolucionado de manera natural para ser complementario, y en algunos casos opuesto al de las celulas humanas, y se conoce como uso de codones deoptimizado. Por tanto, el VHA nunca adopta como codones abundantes aquellos que son altamente utilizados por la celula hospedadora, lo cual ha sido interpretado como una estrategia sutil para evitar en la medida de lo posible la competencia por los ARNt celulares. En el presente trabajo se estudio in vivo el efecto del uso de codones en la velocidad de traduccion, en dos regiones de la capside de cuatro poblaciones del VHA adaptadas a replicar en diferentes condiciones de silenciamiento celular, inducido artificialmente con la utilizacion de la droga Actinomicina D (AMD). Estas cuatro poblaciones se adaptaron a replicar en ausencia de silenciamiento (L0), a niveles moderados (0.05 ? g/ml de AMD, F0.05LA), a niveles altos (0.20 ? g/ml de AMD, F0.2LA), y la ultima era una poblacion de crecimiento rapido (HM175-HP) obtenida como resultado de un evento de molecular breeding y que estaba adaptada a replicar a niveles moderados de silenciamiento celular. Se obtuvieron cuasiespecies de cada una de las dos regiones estudiadas y para las cuatro poblaciones del VHA. Se estudio su velocidad de traduccion utilizando vectores bicistronicos que poseen clonado el IRES del VHA. Se observo que cambios puntuales en el uso de codones que inducian la aparicion de codones menos frecuentes, tenian como consecuencia la disminucion de la tasa de traduccion, que era en mayor o menor medida dependiendo de la significancia de la perdida de frecuencia y del contexto en el cual tenia lugar el cambio. Tambien se vio que cambios puntuales que inducian una optimizacion, es decir, presencia de codones mas abundantes, conllevaban a un aumento de la tasa de traduccion. Asimismo, se encontro que la existencia de optimizacion/deoptimizacion concomitante en un mismo individuo o haplotipo podia tener como consecuencia la recuperacion de la tasa de traduccion perdida, por efecto de codones poco frecuentes o incluso un incremento significativo de la misma, dependiendo de los cambios de codones que estaban participando. Por otra parte, se introdujeron en todos los haplotipos obtenidos para las diferentes poblaciones en estudio, 3 mutaciones en el IRES, U359C, U590C y U726C, que previamente se habia visto en nuestro laboratorio que incrementaban su actividad de forma significativa. Se concluyo que estas mutaciones del IRES modificaban el efecto del uso de codones en las tasas de traduccion. A su vez, beneficiaban de forma muy relevante a aquellos haplotipos que habian previamente evolucionado para traducir significativamente mas rapido. Tambien tenian un efecto positivo en los haplotipos que presentaban deoptimizacion del uso de codones, permitiendo recuperar la tasa de traduccion disminuida. Sin embargo, dichas mutaciones tendian a disminuir la traduccion de aquellos haplotipos que conseguian una tasa de traduccion normal por efectos compensatorios de optimizacion/deoptimizacion local de codones. En la poblacion HM175-HP, las 3 mutaciones del IRES en combinacion con un uso de codones optimizado le permitia traducir de una forma significativamente mas rapida en las regiones de la capside analizadas, contribuyendo a que HM175-HP sea una poblacion de rapido crecimiento del VHA con un gran potencial biotecnologico.