Les mécanismes d’initiation de la traduction de la polyprotéine Gag du Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH-1)

L'ARN genomique du Virus de l'Immunodeficience Humaine-1 (VIH-1) est multifonctionnel. Il constitue le genome encapside dans les virions et sert d'ARN messager pour la traduction des proteines virales Gag et Gag-Pol. La traduction de ces proteines depend exclusivement de la machinerie traductionnelle cellulaire et est initiee par deux mecanismes differents : l'initiation canonique dependante de la coiffe et l'initiation par entree interne des ribosomes (IRES). Le VIH-1 presente deux IRES, l'un dans la region 5' non traduite (5'-UTR) qui est stimule en phase G2/M du cycle cellulaire et l'autre dans la region codante de Gag. Ce dernier permet l'initiation de la traduction sur deux AUG en phase et conduit a la production de la proteine Gag pleine longueur mais egalement a la production d'une isoforme alternative de Gag, tronquee en region N-terminale. Le role de cette isoforme reste mal connu. Toutefois la mutation du second AUG chez VIH-1 et donc la suppression de la seconde isoforme de Gag provoque une diminution importante du taux de la replication virale. La conservation structurelle et fonctionnelle de l'IRES Gag parmi les lentivirus suggere un role important de cette isoforme et de l'IRES gag dans le cycle viral. Nos travaux visent a comprendre a un niveau moleculaire les relations hotes-pathogenes lors de la traduction des messagers viraux. Je me suis particulierement interessee aux roles de la sous unite ribosomale 40S et de l'helicase cellulaire DDX3 dans l'initiation de la traduction de la polyproteine Gag du VIH-1. La premiere partie de ma these est consacree a l'etude de l'interaction entre la sous unite ribosomale 40S et l'IRES gag du VIH-1. Par l'utilisation d'approches complementaires, nous avons pu demontrer la presence de deux sites distincts de liaison au ribosome qui sont presents a proximite des deux codons d'initiation. Nous avons ensuite evalue a la fois in vitro et in cellulo (en collaboration avec l'equipe de T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon) l'effet de la deletion de chacun des sites de liaison au 40S sur l'efficacite de traduction de la polyproteine Gag. Nos resultats valident l'importance fonctionnelle des sites de liaison au ribosome pour une production optimale des deux isoformes de la polyproteine Gag. La seconde partie de mon travail a consiste a definir le role de DDX3 dans l'initiation « coiffe-dependante » de la traduction de la polyproteine Gag. DDX3 est une helicase a ARN a boite DEAD impliquee dans de nombreux processus cellulaires tels que la regulation du cycle cellulaire et la reponse immunitaire innee mais egalement dans tous les aspects du metabolisme de l'ARN comme la transcription, l'epissage, l'export nucleaire ou encore la traduction. Plus recemment, il a ete montre que DDX3 est necessaire a la traduction de l'ARN genomique du VIH-1, cependant son role exact n'a pas encore ete defini. Nous avons purifie une forme recombinante de la proteine en fusion avec la MBP (Maltose Binding Protein) et effectue des cinetiques enzymatiques afin de caracteriser ses proprietes biochimiques. Contrairement a ce qui a ete precedemment decrit, nos resultats montrent que DDX3 possede une activite ATPase strictement ARN-dependante avec des constantes cinetiques similaires a celles de son homologue chez la levure, Ded1p. Nous avons egalement evalue l'activite helicase de la proteine en presence de substrats de longueur et de nature variables (duplex ARN/ARN ou des heteroduplex ADN/ARN). D'un point de vue fonctionnel, nous avons realise une premiere serie d'experiences qui confirme la stimulation exercee par DDX3 sur la traduction de Gag in vitro. Ces resultats permettent d'envisager la caracterisation biochimique fine des interactions DDX3-ARN viral ainsi que de dissequer le role de DDX3 dans l'expression du genome viral.