Estudio funcional de proteínas ribosómicas durante la biogénesis de ribosomas en saccharomyces cerevisiae

En el Capitulo I de esta tesis se muestran los resultados de la caracterizacion funcional de la proteina ribosomica L35, componente esencial de la subunidad grande del ribosoma. Nuestros resultados indican que la ausencia de L35 en las celulas tiene como consecuencia un deficit en la produccion de subunidades 60S. Tal y como se demuestra por los experimentos de pulso-caza y de hibridacion Northern, este deficit se debe a una fuerte inhibicion en el procesamiento del pre-rRNA 27SB, dando lugar a niveles muy reducidos de los pre-rRNAs 7S y 25.5S y, en ultimo termino, de los rRNAS maduros 5.8S y 25S respectivamente. Ademas, se observa un claro retraso en el procesamiento temprano en los sitios A0, A1 y A2, que tiene como ultima consecuencia una reduccion en los niveles del rRNA 18S y la aparicion del precursor aberrante 23S. Estos resultados estan en consonancia con estudios sistematicos previos (1), donde L35 aparece en el grupo de las proteinas ribosomicas que intervienen en pasos intermedios del procesamiento de los pre-rRNAs. Nuestros resultados demuestran tambien que la proteina ribosomica L35 se asocia de forma estable a las particulas pre-60S tempranas y que su presencia es necesaria para el transporte optimo de las particulas pre-60S del nucleo hacia el citoplasma. En el Capitulo II se presentan los resultados de la caracterizacion funcional de la proteina ribosomica L26, otro componente estructural de la subunidad grande del ribosoma. Estos resultados nos han permitido demostrar la no esencialidad de L26 en el crecimiento celular, durante el proceso de biogenesis de ribosomas y en la funcion ribosomica. Si bien, a traves de los experimentos de pulso-caza se puede observar un ligero retraso en el procesamiento del pre-rRNA 27SB en ausencia de L26. Nuestros resultados demuestran tambien que la proteina ribosomica L26 se ensambla establemente en particulas pre-60S tempranas y su presencia es necesaria para un transporte eficiente de las particulas pre-60S desde el nucleo hacia el citoplasma. Globalmente, estos resultados establecen claras diferencias en la ruta de ensamblaje de la subunidad grande entre eucariotas y procariotas (3). Finalmente, en el Capitulo III se muestra el estudio de la dinamica de asociacion y disociacion de las particulas pre-60S del factor de actuacion en trans Rlp7 y su relacion con el ensamblaje de la proteina ribosomica L7. Rlp7 pertenece al grupo de factores de actuacion en trans que se asemejan a proteinas ribosomicas, compartiendo un 40% de homologia en sus secuencias. Se ha propuesto que el lugar de union de estos factores a las particulas pre-ribosomicas es el mismo que ocupan las proteinas ribosomicas correspondientes en la particula ribosomica madura (4, 5). Nuestros resultados confirman que Rlp7 se incorpora a particulas pre-ribosomicas 90S tempranas que contienen el pre-rRNA 35S y se libera de las particulas pre-ribosomicas tras el procesamiento del ITS2, en algun punto previo al procesamiento del extremo 3? del pre-rRNA 7S. Por su parte, la proteina ribosomica L7 se ensambla en el nucleo de forma estable a particulas pre-60S tempranas que contienen el pre-rRNA 27SA2. Ambas proteinas presentan dominios de union a RNA en su secuencia. Nuestros resultados de CRAC revelan los lugares de union de estas proteinas en el (pre-)rRNA. Rlp7 presenta tres lugares de union al pre-rRNA en la zona del ITS2. La proteina ribosomica L7 no comparte ninguno de estos sitios de union, mapeando exclusivamente en regiones del rRNA 25S. Nuestros experimentos de inmunoprecipitacion de particulas (pre-)ribosomicas que contienen la proteina ribosomica L7 indican que Rlp7 esta presente en estas particulas. A traves de los experimentos de inmunoprecipitacion de particulas pre-ribosomicas que contienen Rlp7, combinados con la tecnica SILAC, se confirma la presencia de L7 en dichas particulas. Estos ultimos resultados demuestran que ambas proteinas pueden coexistir en las mismas particulas pre-ribosomicas. En conjunto, estos resultados demuestran que el lugar de union de Rlp7 a las particulas pre-60S no es el mismo que el de la proteina ribosomica L7 en las particulas 60S maduras y que no existe ninguna interdependencia entre estas proteinas durante el proceso de ensamblaje.