Flexible Mikromanipulation durch räumliche Lichtmodulation in der Mikroskopie

Seit ihrer Entwicklung durch Ashkin im Jahre 1986 fand die optische Pinzette Einsatz in zahlreichen Anwendungsfeldern von der Physik bis hin zur Zellbiologie. Die Fahigkeit, beruhrungslos Objekte im Bereich zwischen einigen zehn Nanometern und einigen Dutzend Mikrometern mit Hilfe von Licht zu fangen und zu bewegen, macht die optische Pinzette zu einem machtigen Werkzeug. Die Ende der 1990er Jahre am Institut fur Technische Optik [129] und an der Universitat Chicago [25] realisierte dynamisch-holografische Implementierung optischer Pinzetten erlaubte darauf aufbauend vielfaltige Einsatzmoglichkeiten und neuartige Mikromanipulationstechniken. In der vorliegenden Arbeit wird die holografische Pinzette zur Anwendung in einem neuartigen Diagnoseverfahren, basierend auf Kraftmessung weiter entwickelt und erprobt. Dabei konnen auf die ublichen zellbeeinflussenden Marker verzichtet und somit die Zellen in moglichst naturlichem Zustand analysiert werden. Insbesondere konnte demonstriert werden, dass die vorgeschlagene Diagnosemethode es ermoglicht, gesunde Zellen, Krebszellen und mit Medikamenten behandelte Krebszellen in einem fruheren Stadium zu unterscheiden, als dies mit etablierten Methoden bisher moglich ist. Um ein solches System effektiv einsetzen zu konnen, ist eine Parallelisierung und Automatisierung unabdingbar. Basis fur die Automatisierung ist eine voll- oder zumindest teilautomatisierte Probenhandhabung, eine automatisierte Objekterkennung sowie der automatisierte Einfang und die automatisierte Kraftmessung. Als ein erster Schritt in diese Richtung werden in dieser Arbeit die Aspekte der Automatisierung des optischen Einfangs beleuchtet. Hierbei konnten verschiedene Hindernisse identifiziert und Losungsansatze entwickelt werden, die das Prinzip des holografischen Ansatzes der optischen Pinzette nutzen. Es wurden verschiedene angepasste Lichtfelder untersucht, die es ermoglichen, die auf die biologischen Objekte wirkende Leistungsdichte und damit das Schadigungspotential zu reduzieren. Dies konnte zudem auch durch die Reduzierung der zum axialen Einfang benotigten numerischen Apertur mit Hilfe von holografisch generierten Doppelfallen erreicht werden, die gleichzeitig einen hohen Arbeitsabstand und ein groses Arbeitsfeld erlauben. Mit Hilfe axial ausgedehnter Lichtquellen wurde der Einfangvorgang von axial verteilten Objekten optimiert, was insbesondere bei der Automatisierung eine starke Vereinfachung darstellt. Zudem konnte mit Hilfe eines Kalibrierverfahrens gezeigt werden, dass eine automatisierte Steuerung der Fallen auf einfache Weise mit der geforderten Genauigkeit moglich ist. Desweiteren wurde ein holografisch gesteuertes System zur Mikrobearbeitung entwickelt, das neben einem automatisierten Einfang auch eine automatisierte Sortierung, basierend auf der Bereinigung von Zelllinien durch Zerstorung, realisieren kann. Neben der reinen Zerstorung von Zellen ist auch eine hochgenaue Bearbeitung von Zellen und Zellbestandteilen moglich. Im Rahmen der Arbeit konnte demnach die holografische Pinzette erfolgreich zu einem markerfreien Diagnosewerkzeug in der Krebsdiagnostik weiterentwickelt werden. Herausforderungen bei der Umsetzung des automatisierten Einfangs wurden identifiziert und Losungsvorschlage erarbeitet sowie implementiert. Somit bildet diese Arbeit den ersten Schritt in Richtung eines vollautomatisierten Werkzeugs, welches zur Diagnose und Medikamentenentwicklung eingesetzt werden kann. Optical methods are very suitable for diagnostics in biomedicine due to the potentially high speed and resolution as well as the non-contact operation. Various mainly marker-based applications to investigate certain properties of biological objects are available. Unfortunately, markers may influence the intracellular processes or even the viability of cells and, therefore, may falsify the measurement results. In this work, a novel marker-free diagnostics method based on the optical force acting on a cell has been analyzed. According to first measurement results, it is possible to differentiate between healthy cells, leukemia cells, and treated leukemia cells even in a significantly earlier state compared to well-established methods like flow cytometry. However, in order to apply such a system efficiently, automation and parallelization are essential. Therefore, it is necessary to automate cell handling, object recognition, trapping, and force measurement. This contribution as a first step towards realizing such an automated diagnostic workstation concentrates on the automation of the trapping process. Thereby the work with living objects and the application of micro-fluidics can lead to several challenges concerning the trapping process. Several solutions that are taking advantage of the holographic control have been proposed and investigated.