Konnektivität molekularer Domänen bei der kraftinduzierten Entfaltung einzelner Biomoleküle

In den zellularen Stoffwechsel- und Signalnetzwerken existiert eine Vielzahl von logischen Abhangigkeiten, die auf Prozesse auf molekularer Ebene zuruckzufuhren sind. So lasst sich beispielsweise die Effizienz einer biochemischen Reaktion uber Enzyme regulieren, deren Aktivitatsgrad von auseren Parametern abhangt. Kraft stellt eine dieser Einflussgrosen dar. Diese Arbeit befasst sich damit, das Verhalten mehrerer, logisch verknupfter, molekularer Domanen unter Krafteinwirkung zu studieren und sich deren Eigenschaften fur nanotechnologische Verfahren zu Nutze zu machen. Neben der Untersuchung von in der Natur vorkommenden Proteinen mit multiplen Domanen wurden artifizielle DNA- und proteinbasierte Systeme mit verschiedener Bindungsstarke konstruiert. Dies ermoglicht den gerichteten Transport einzelner, molekularer Bausteine mit der Prazision eines Rasterkraftmikroskopes im Nanometer-Bereich. Mithilfe dieser Single-Molecule Cut-and-Paste (SMCP) Technik konnen auf der Basis gerichteter, molekularer Erkennung raumliche Arrangements funktioneller Bausteine geschaffen werden. Diese lassen sich mittels Fluoreszenzmikroskopie als isoliertes System betrachten. Die Zielsetzung bei der Untersuchung der naturlichen Systeme war es, deren Abhangigkeiten zu verstehen und herauszufinden, wie sich diese mit ihrer Funktion und den an das Protein gestellten Umgebungsbedingungen in Einklang bringen lassen. Die dabei gewonnene Erkenntnis liefert nicht nur wichtige Beitrage zur biologischen und medizinischen Grundlagenforschung, sondern kann, wie am Beispiel der SMCP-Technik ersichtlich, auch hilfreich bei der Entwicklung neuartiger Messmethoden der molekularen Bio- und Nanotechnologie sein. Mittels Einzelmolekulkraftspektroskopie im „Konstante-Kraft“ (engl. Force-Clamp) Modus wurde die Kooperativitat der funf Proteindomanen des Enzyms Titinkinase untersucht. Dieses Muskelprotein wandelt in der Skelett- und Herzmuskulatur mechanische in biochemische Signale um und regelt dadurch den Umsatz weiterer Proteine und die Expression von Genen. Es wird gezeigt, dass sich die einzelnen mechanisch induzierten Entfaltungsschritte gegenseitig bedingen und dass dies inharent durch die molekulare Faltung des Proteins vorgegeben wird. Da Kraft zum naturlichen Parameterraum dieses Molekuls gehort, muss seine Struktur an kraftinduzierte konformationelle Anderungen angepasst sein. Durch die Abhangigkeit der Energiebarrieren wahrend der Entfaltung wird gewahrleistet, dass stabilisierende und enzymatisch wirksame Domanen nicht vor regulatorischen Domanen entfalten. Myosin-Light-Chain Kinase (MLCK) ist ein weiteres Muskelenzym, bei dem es Hinweise auf eine mechanische Aktivierbarkeit gibt. Einzelmolekulexperimente dieser Dissertation zeigen, dass die Entfaltung der Kinase ebenfalls in mehreren Schritten vonstatten geht und dass einer der Zwischenzustande durch ATP-Bindung stabilisiert wird. Die absoluten Entfaltungskrafte liegen dabei unter denen der Titinkinase, was der Hypothese der mechanischen Aktivierbarkeit entgegenkommt. Als weiteres System wurde das Cellulosom des thermophilen Bakteriums Clostridium Thermocellum auf seine mechanische Stabilitat uberpruft. Cellulosome sind an der Ausenseite von Bakterien und Pilzen verankerte Proteinkomplexe, die in der Lage sind Lignozellulose zu zersetzen. Bei der Prozessierung der Cellulose konnen im Cellulosom hohe Scherkrafte auftreten, da dieses das gesamte Bakterium mit dem makromolekularen Substrat verknupft. Mittels AFM-basierter Kraftspektroskopie wurde die Wirkung von Kraft auf einen Verbund verschiedener Konstituenten eines Cellulosoms untersucht. Es wird gezeigt, dass sich der Komplex im Vergleich zu anderen Biomolekulen durch eine extrem hohe mechanische Stabilitat auszeichnet. Innerhalb der hohen Entfaltungskrafte besteht eine Hierarchie fur die verschiedenen Komponenten. Bei vergleichsweise niedrigen Kraften entfalten die enzymatischen Domanen gefolgt von mittleren Kraften fur das Entkoppeln der Enzyme mit dem Bindungspartner Cohesin. Sehr hohen Kraften halten die intramolekularen Wechselwirkungen der Cohesine und der Cellulose bindenden Domanen stand. Die Abstufung hoher Stabilitaten stellt eine sehr gute Anpassung an die naturlichen Anforderungen des Proteinkomplexes dar. Fur die durchgefuhrten Messungen wurde ein modulares Kraftmikroskop (AFM) entwickelt, das sich mit einem einzelmolekulsensitiven Fluoreszenzmikroskop kombinieren lasst. Die spezielle Konstruktion weist eine extrem hohe mechanische Stabilitat auf. Mittels einer photothermischen Regelung kann das AFM daruber hinaus fur sensitive Bildgebung weicher molekularer Oberflachen oder in einen extrem schnellen kraftspektroskopischen Messmodus mit konstanter Zugkraft verwendet werden. Die akkurate Arbeitsweise des Systems wurde in einem internationalen Vergleichsversuch bestatigt.