Mesure du métabolisme de la levure par flux osmotiques entre gouttes d'émulsion

Les travaux accomplis au cours de cette these au Laboratoire de Colloides et Materiaux Divises resultent d'une volonte de developper et d'utiliser des outils physico-chimiques pour la comprehension de problematiques biologiques. Nous avons choisi comme objet d'etude ce champignon unicellulaire extraordinaire qu'est la levure Saccharomyces cerevisiae. En particulier nous nous sommes interesses a la fermentation alcoolique a travers la mesure d'un des parametres du metabolisme : l'energie de maintenance. Les resultats obtenus s'articulent autour de deux realisations principales. *** Developpement d'un outil de mesure original : Nous avons mis au point un systeme physico-chimique qui permet de mesurer la polymerisation ou la depolymerisation au sein de microreservoirs de quelques dizaines de picolitres . Le principe repose sur l'osmose, c'est-a-dire la di usion, a travers une membrane semi-permeable, de solvant entre des reservoirs qui possedent des potentiels chimiques di erents. Pour realiser ce systeme nous avons fabrique un reseau de gouttes d'emulsion inverse qui constituent des microreservoirs dans lesquels nous avons encapsule les levures. Les gouttes ont ete organisees en un reseau bi-dimensionnel qui nous a permis de suivre des cinetiques de croissance sur un grand nombre d'echantillons (haut debit). Nous avons alors elabore une nouvelle formulation de l'emulsion afin de rendre les gouttes adhesives entre elles. Ceci nous a permis d'imposer les dimensions et les proprietes de transport a l'interieur des membranes semi-permeables ainsi formees entre les gouttes en contact. Nous avons alors demontre qu'en imposant des potentiels chimiques constants dans le reseau de gouttes, nous pouvions suivre, a travers l'evolution de leur volumes, la cinetique de processus de polymerisation (creation de biomasse dans le cas de la levure) et de depolymerisation (dans le cas de la lyse enzymatique) qui ont lieu dans des reservoirs. *** Mesure directe de l'energie de maintenance : Nous avons utilise notre outil pour mesurer la consommation du glucose par S. cerevisiae lors de la fermentation alcoolique en milieu anaerobie. Nous avons ainsi distingue deux comportements suivant que les cellules se divisent ou qu'elles sont en phase stationnaire. Nous avons developpe un modele qui nous a permis d'expliquer les comportements observes en fonction des parametres experimentaux (concentration en sucre, transport) et du metabolisme de la levure. Nous nous sommes alors rendu compte qu'en imposant le reactif limitant nous pouvions mesurer l'energie de maintenance, c'est-a-dire l'energie qui n'est pas utilisee pour la division cellulaire. Nous avons enfin mesure le taux de consommation de glucose pour trois souches differentes. Nous avons ainsi montrer qu'il etait possible d'identifier des souches selon leur capacite a metaboliser le glucose. Nous nous sommes alors interroges sur la possibilite de cribler a haut debit des souches capables de metaboliser des sucres differents. Aussi, nous pouvons envisager, pour augmenter la taille de la librairie a trier, une approche 3D. Les gouttes sont collectees dans une seringue dans laquelle le murissement entre les gouttes se produit. Elles sont alors reinjectees dans un microsysteme contenant une centaine de zones de tri. Avec un debit d'injection des gouttes de 10kHz, sachant qu'une goutte sur 10 contient une levure, on peut alors cribler une librairie de 108 individus differents en moins de 30 minutes. *** Au total : Le principe de murissement des gouttes developpe dans cette these peut s'appliquer a tout processus qui se traduit par une modification du nombre d'especes osmotiquement actives. On peut donc envisager de l'utiliser pour un champ vaste d'applications telle que la recherche de nouvelles enzymes de proteolyse. Enfin, nous aimerions attirer l'attention du lecteur sur l'aspect statistique de cette methode. Elle offre la possibilite d'etudier des processus de secretion ou d'assimilation de plusieurs milliers d'individus isoles. Ainsi, des questions telles que la variabilite entre individus vont pouvoir etre abordees.