Analyse der Proteinqualitätskontrolle in der bakteriellen Zellhülle von E. coli

Die Vielzahl an Proteinen jeder Zelle stellt diese vor die Herausforderung, dass die Proteine im richtigen Kompartiment vorliegen und aktiv sind. Aus diesem Grund haben bakterielle Zellen effektive Mechanismen der Proteinqualitatskontrolle entwickelt, indem sie durch die Kontrolle des Proteinfaltungszustands die richtige Faltung, Reparatur oder Degradation der Proteine unterstutzen. Reguliert wird dies durch spezielle Signalsysteme, welche die Genexpression verschiedener Chaperone, Faltungskatalysatoren und Proteasen an den momentanen Bedarf anpassen. Vor allem das Periplasma ist aufgrund der Zellarchitektur den Schwankungen der Umweltbedingungen in hohem Mase ausgesetzt, wodurch der Faltungszustand und die Funktionalitat von periplasmatischen Proteinen, sowie die Integritat der Zellhulle beeinflusst wird. Auch in humanen Zellen konnen fehl- oder ungefaltene Proteine zu schwer- wiegenden Folgen fur den gesamten Organismus fuhren. So wird zum Beispiel die Aggregation von Proteinen mit Krankheiten wie Alzheimer und Mukoviszidose in Verbindung gebracht. Um ein Verstandnis der grundlegenden Mechanismen der Proteinfaltung zu erlangen, reprasentiert die Zellhulle des gramnegativen Bakteriums E. coli ein experimentelles Modelsystem. Die Faktoren der Proteinqualitatskontrolle scheinen in einem flexiblen Netzwerk organisiert zu sein, welches die Effizienz und Reaktionsfahigkeit erhoht und die Stabilitat des Systems gewahrleistet. Weski und Ehrmann sammelten erste Hinweise auf ein potentielles Netzwerk der Proteinqualitatskontrolle in der Zellhulle von E. coli. Die sieben Doppel-KO-Mutanten (degP dsbA, degP tsp, degP yfgC, degP ppiD, surA dsbA, surA ptrA und surA yfgC) zeigten in der Dissertation von Dr. Juliane Weski unter Stressbedingungen Probleme mit den Ausenmembranproteinen FhuA, OmpW und LamB auf Proteinebene. In diesen Stammen wurde entweder eine Reduktion der FhuA- oder OmpW-Menge in der Ausenmembran detektiert, ohne dass eine reduzierte Genexpression vorlag, oder die Stamme wiesen Unregelmasigkeiten im LamB-Vorkommen auf. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten die zuvor gesammelten ersten Hinweise auf ein potentielles Netzwerk der Proteinqualitatskontrolle in der Zellhulle von E. coli weitergehend untersucht werden. Da uber potentielle Interaktionen der Faltungshelfer untereinander und zu den entsprechenden Substraten bisher wenig bekannt ist, wurde zunachst in den oben genannten Deletionsstammen jeweils ein Knockout durch eine extrachromosomale Uberexpression ausgeglichen. Die dabei hergestellten Proteine wurden im Anschluss gereinigt und in Bezug auf die gebundenen Substrate massenspektrometrisch analysiert. Um eine Proteolyse der Substrate zu verhindern, wurden bei den Proteasen enzymatisch inaktive Mutanten genutzt. Es konnten fur jeden in dieser Arbeit untersuchten Faltungshelfer mittels massen- spektrometrischer Analysen gebundene potentielle Substrate detektiert werden. Die Anzahl der Substrate variierte dabei stark. Durch die Anzahl an Substraten scheinen die Proteine DegP, DegQ, DsbA/DsbAPT, SurA und Prc Schlusselspieler in dem System der Proteinqualitatskontrolle zu sein, wahrend BepA, PtrA und PpiD Enzyme mit enger Substratspezifitat zu sein scheinen. Besonders interessant sind die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse, dass Faltungshelfer durchaus gemeinsame Substrate haben. So wurden zum Beispiel bei zwei oder sogar mehreren Faltungshelfern die gleichen Substrate gefunden. Diese Schnittmengen bestatigen die Hypothese, dass die periplasmatische Proteinqualitatskontrolle als flexibles Netzwerk organisiert ist. Ein weiterer Punkt, der diese These stutzt, ist die Tatsache, dass neben potentiellen Substraten auch andere Faltungshelfer an die jeweils untersuchten Faltungshelfer gebunden haben. Um die Hypothese zu untersuchen, dass mehrere Faltungsfaktoren gleichzeitig mit einem Substrat interagieren, wurden Degradationsassays mit den Proteasen DegP, DegQ und Prc und dem denaturierten Substrat EfeB etabliert und durchgefuhrt. Durch die Zugabe der Faltungshelfer DsbAPT, PpiD und SurA wurden Unterschiede im Schnittmuster und der Anzahl der Schnitte festgestellt, was auf eine Protektion des denaturierten Substrats durch die Faltungshelfer hindeutet. Diese Ergebnisse, dass ein Faltungshelfer das denaturierte Substrat protektiert, wahrend ein zweites Enzym zeitgleich zugangliche Bereiche degradiert, bestatigen die in dieser Arbeit aufgestellte These, dass mehrere Enzyme bzw. Faltungshelfer gleichzeitig an einem Substrat binden. Die Moglichkeiten der Komplexbildung von Faltungshelfern/Enzymen und Substraten stellen dabei eine interessante Fragestellung fur weiterfuhrende Studien dar.