COMBINING FLUORESCENCE AND ELECTROPHYSIOLOGY MEASUREMENTS TO STUDY ASIC FUNCTION

Acid-Sensing Ion Channels (ASICs) are trimeric proton-gated and sodium-conducting channels widely expressed in neurons of the central and peripheral nervous systems. They contribute as pH sensors to a number of physiological and pathological conditions, such as learning, neurodegeneration after ischemia, and pain sensation. ASICs open transiently upon a lowering of the extracellular pH, before they enter a non-conductive desensitized state. Chicken ASIC1a structures have been solved in the closed, open and desensitized states. Despite the large amount of available information on the structure and function of ASICs, the precise proton binding sites and the mechanisms by which protonation promotes channel opening are still poorly defined. The acidic pocket, a cavity in the extracellular domain containing several negatively charged amino acids, has been proposed as the primary site for proton sensing. Concerning the molecular mechanisms, it is generally thought that protonation events on extracellular residues induce conformational changes that transmit the “activation signal” to the pore to control the opening of the channel gate. In the first part of this project, we asked whether protonation in the acidic pocket and palm domain is required for channel activation. We found that combination of neutralizing mutations of a large number of titratable acidic pocket residues produced channels that retained their proton sensitivity, suggesting that the residues that are essential for proton sensing are located in other domains. Concomitant with these experiments, we employed the voltage-clamp fluorometry (VCF) technique to investigate the structural rearrangements in the acidic pocket. Our VCF analysis indicates that this region undergoes conformational changes during both activation and desensitization. In the palm, neutralizing mutations of several acidic residues impaired channel desensitization, leading, in some cases, to the disappearance of the transient ASIC component and to the appearance of a sustained current component. In the second part of the project, we elucidated the structural rearrangements occurring in key channel regions during ASIC1a activity. Our VCF experiments reveal the presence of conformational changes in the wrist and palm domain consistent with a role of these regions in channel activation and desensitization. In summary, our studies suggest that the acidic pocket is not the primary site for proton sensing in ASIC1a, but has, rather, a modulatory role. We show, in addition, that proton binding to the extracellular domain of ASIC1a induces conformational changes in the palm and in the wrist regions most likely important for transmitting the transduction signal to the channel gate. Our findings provide new insights on the basic mechanisms controlling ASIC activity and may be relevant for other members of ENaC/DEG family, to which ASICs belong. -- Les canaux sensibles aux protons (ASICs) sont des canaux sodiques actives par les protons. Ils sont largement exprimes dans les neurones du systeme nerveux central et peripherique. Ils contribuent en tant que senseurs de pH a un certain nombre de conditions physiologiques et pathologiques, telles que l'apprentissage, la neurodegenerescence apres l'ischemie et la sensation de douleur. Les ASICs s'ouvrent de maniere transitoire lors d'un abaissement du pH extracellulaire, avant d'entrer dans un etat desensibilise non conducteur. Les structures d’ASIC1a de poulet ont ete resolues dans des etats fermes, ouverts et desensibilises. Malgre la grande quantite d'informations disponible sur la structure et la fonction des ASIC, les sites precis de liaison des protons et les mecanismes par lesquels la protonation induit l'ouverture du canal ASIC sont encore tres peu definis. La poche acide, une cavite dans le domaine extracellulaire contenant plusieurs acides amines charges negativement, a ete proposee etre le site primaire pour la detection des protons. En ce qui concerne les mecanismes moleculaires de l’activation des ASICs, on pense generalement que les evenements de protonation sur les residus extracellulaires induisent des changements conformationnels qui transmettent le «signal d'activation» au pore afin de controler l'ouverture du canal. Dans la premiere partie de ce projet, nous avons investigue si la protonation dans la poche acide et dans le domaine de la paume etait necessaire pour l'activation du canal. Nous avons constate que la combinaison de mutations neutralisantes d'un grand nombre de residus titrables dans la poche acide produisait des canaux qui conservaient leur sensibilite aux protons, suggerant que les residus essentiels a la detection de protons se situaient dans d'autres domaines. Parallelement a ces experiences, nous avons utilise la technique de “voltage-clamp fluorometry” (VCF) pour etudier les rearrangements structurels dans la poche acide. Notre analyse par VCF indique que cette region subit des changements conformationnels lors de l’activation et de la desensibilisation. Dans la paume, des mutations neutralisantes de plusieurs residus acides ont altere la desensibilisation des canaux, conduisant, dans certains cas, a la disparition de la composante transitoire du courant d’ASIC et a l’apparition d’une composante soutenue. Dans la deuxieme partie du projet, nous avons elucide les rearrangements structurels intervenant dans des regions cles pendant l’activite de ASIC1a. Nos experiences de VCF revelent la presence de changements conformationnels dans les domaines du poignet et de la paume au cours de l'activation et la desensibilisation du canal. En resume, nos etudes suggerent que la poche acide n'est pas le principal site de liaison de protons dans ASIC1a, mais joue plutot un role de modulateur. Nous montrons, en outre, que la liaison de protons au domaine extracellulaire de ASIC1a induit des changements de conformation dans la paume et dans les regions du poignet, probablement importants pour la transmission du signal d’activation au pore du canal. Nos resultats fournissent de nouvelles informations sur les mecanismes de base controlant l'activite des ASICs et peuvent etre pertinents pour d'autres membres de la famille des canaux epitheliaux sodiques / degenerines, a laquelle les ASICs appartiennent.