The bacterial membrane insertase YidC : in vivo studies of substrate binding and membrane insertion

YidC of Escherichia coli belongs to the evolutionarily conserved proteins of the Oxa1/YidC/Alb3 insertase family. The transmembrane regions of the core domain, comprising of TM2-6, are the most conserved parts among the homologs and are crucial for the function as a membrane insertase. This is particularly true for the TM2, TM3 and TM5 (KUHN et al., 2003; KIEFER & KUHN, 2007). In bacteria, YidC acts as an independently working membrane insertase and, as well, in cooperation with the Sec translocon for the biogenesis of various membrane proteins. YidC is required for the biogenesis of respiratory complexes, ATP synthase and for example the mechanosensitive channel protein MscL. Also, the coat proteins of filamentous phage Pf3 and M13 require YidC for membrane insertion. The best studied substrate is the Pf3 coat protein of phage Pf3 infecting Pseudomonas aeruginosa – i.e. a small protein of 44 amino acids in length. In the context of this thesis, the YidC-dependent biogenesis of Pf3 coat was analyzed to gain better insight into the entire insertion process. In doing so, a set of more than 100 single cysteine mutants in distinct domains of YidC and Pf3 coat were generated. To study the insertion of Pf3 coat under physiological conditions, an in vivo cross-linking assay was established for capturing YidC-Pf3 interactions within a short period of time after the onset of synthesis (1 minute) using 35S-Met pulse-labelling methods. YidC binds inserting Pf3 coat protein in distinct regions of the highly conserved TM domains involving four of the six TM helices. It was verified that TM3 is indispensable for the function of YidC since four contacting residues were found in this TM helix. A helical wheel projection of substrate binding helices reveals the localization of the contacting residues of each TM segment on one helical face. This implies a helix arrangement of the transmembrane core domain which enables binding of inserting substrate proteins and interactions with transmembrane domains over the entire membrane-spanning part of YidC. The serial mutation of nine from twelve contacting residues, which are strongly hydrophobic in most cases, to serines impaired the function of YidC, whereas the single mutations had no effect. Additionally, the insertion process of translocation deficient Pf3 coat mutants was analyzed for intermediate states of the insertion process. It has been shown that the insertion deficient Pf3 coat mutants are inhibited at a late step of membrane insertion, i.e. forming the YidC contacts in the periplasmic leaflet. Based on this work, further studies confirmed that the identified substrate contacting regions of YidC play a key role in YidC-mediated insertion. The mechanosensitive channel protein MscL, M13 procoat, nascent Foc and the polytopic membrane protein LacY contact YidC at exactly the same positions (NEUGEBAUER et al., 2012; SPANN & KUHN, unpublished results; WICKLES et al., 2014; ZHU et al., 2013b). YidC von Escherichia coli gehort zu den evolutionar konservierten Proteine der Oxa1/ YidC/Alb3 Insertase Familie. Die Transmembranbereiche (TM) der Kerndomane, die die TM2-6 umfasst, sind die konserviertesten Bereiche unter den Homologen und sind entscheidend fur ihre Funktion als Membraninsertase. Dies gilt insbesondere fur die TM2, TM3 und TM5 (KUHN et al., 2003; KIEFER & KUHN, 2007). In Prokaryonten wirkt YidC als unabhangig arbeitende Membraninsertase und in Zusammenarbeit mit dem Sec-Translokon in Prozessen der Biogenese von Membranproteinen. YidC wird fur die Assemblierung von Komplexen der Atmungskette, der ATP-Synthase und beispielsweise fur die Biogenese des mechanosensitiven Kanalproteins MscL benotigt. Auserdem benotigen die Hullproteine der fadenformigen Phagen Pf3 und M13 YidC fur die Membraninsertion. Das am besten untersuchte Substrat ist das Hullprotein des Phagen Pf3, der Pseudomonas aeruginosa infiziert – es ist ein kleines Protein mit einer Lange von 44 Aminosauren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die YidC-abhangige Biogenese des Pf3 coat Proteins untersucht, um einen besseren Einblick in den Mechanismus des gesamten Insertionsprozesses zu gewinnen. Dabei wurden mehr als 100 Einzelcysteinmutanten in verschiedenen Domanen des YidC und Pf3 coat Proteins erzeugt. Fur die Untersuchung der Pf3 coat Insertion unter physiologischen Bedingungen wurde eine in vivo Quervernetzungsmethode etabliert, die es ermoglichte YidC-Pf3 Interaktionen inner-halb der Dauer von einer Minute nach Synthesebeginn in „35S-Met-Pulse-labelling“ Experimenten zu untersuchen. YidC bindet inserierendes Pf3 coat Protein in unterschiedlichen Bereichen der hoch-konservierten Transmembrandomanen. Die Bindung erfolgt an vier der sechs Transmembrandomanen. Die Wichtigkeit der TM3 fur die Funktion von YidC wurde bestatigt. In dieser TM wurden vier substratbindende Aminosauren identifiziert. Die „helical-wheel projection“ der substratbindenden Helices zeigte, dass die kontaktie-renden Aminosauren jeder Transmembrandomane auf einer Seite der jeweiligen Helix lokalisieren. Dies impliziert eine Anordnung der membranstandigen Kerndomane, die eine Bindung des inserierenden Substratproteins und Wechselwirkungen zwischen Transmembrandomanen uber den gesamten membranspannenden Teil von YidC ermoglicht. Die gleichzeitige Mutation von neun der zwolf kontaktierenden, meist stark hydrophoben Aminosauren zu der leicht polaren Aminosaure Serin beeintrachtigte die Funktion von YidC, wahrend die Einzelmutationen keinen Effekt zeigten. Zusatzlich wurde der Insertionsprozess von translokationsinhibierten Pf3 coat Mutanten untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von insertionsdefizienten Pf3 coat Proteinen an YidC in einem spateren Schritt der Membraninsertion gehemmt ist. Auf der Grundlage dieser Arbeit, konnten weitere unabhangige Studien bestatigen, dass die identifizierten substratbindenden Bereiche von YidC eine universelle Funktion in der YidC-abhangigen Insertion besitzen. Es wurde gezeigt, dass das mechanosensitive Protein MscL, M13 procoat, naszierendes Foc Protein und das polytope Membranprotein LacY YidC an genau den gleichen Positionen kontaktiert (NEUGEBAUER et al. 2012; SPANN & KUHN, unveroffentlichte Ergebnisse; WICKLES et al., 2014; ZHU et al., 2013).