Complejidad de la cuasiespecie del virus de la hepatitis B en la región X/preCore: asociación con la evolución de la infección con y sin tratamiento antiviral

El Virus de la hepatitis B (VHB) tiene una tasa de mutacion de 3,2×10-5 – 7,9×10-5 nucleotidos sustituidos/ciclo replicativo, esto se debe a que este ciclo consta de un paso de retrotranscripcion llevado a cabo por una transcriptasa reversa que carece de actividad correctora de errores exonucleasa 3’-5’. Este hecho resulta en una enorme diversidad genetica en forma de genotipos, subgenotipos, cuasiespecies (QS) y variantes en diferentes regiones del genoma. Existen numerosas evidencias de la relacion entre la diversidad genetica del VHB, e incluso de la complejidad de la QS, y la tasa de seroconversion HBeAg, los niveles de ADN-VHB, el escape inmune, la patogenesis y la respuesta al tratamiento, lo que pone de manifiesto la relevancia de estudiar dicha variabilidad y complejidad. El objetivo de este proyecto de tesis fue evaluar la complejidad de la QS en la region preCore/Core y su relacion con el estatus HBeAg, y analizar los cambios en la QS durante la dinamica natural y bajo el tratamiento con analogos de nucleos(t)idos (NUCs), a traves de los parametros de complejidad (entropia de Shannon normalizada, frecuencia de mutacion y diversidad nucleotidica). El segundo objetivo fue estudiar la complejidad a nivel de genotipos mediante la evaluacion de la presencia de mezclas y sus consecuencias, en dos regiones del genoma (polimerasa/superficie y X/preCore) en pacientes con infeccion cronica, tambien durante dos periodos (dinamica natural y tratamiento con NUCs). Para ello en el primer estudio se llevo a cabo la secuenciacion masiva por UDPS (ultra-deep pyrosequencing) de la region preCore/Core en muestras secuenciales (en el momento del diagnostico, tras un tiempo sin tratamiento y despues de no responder al mismo) de 10 pacientes seleccionados y agrupados segun su estatus HBeAg. En el segundo estudio se analizaron muestras de otros 10 pacientes en la region polimerasa/superficie y X/preCore en una muestra basal, tras un tiempo sin tratamiento y durante el tratamiento, el genotipo se determino por filogenesis. Los resultados del primer estudio revelan mayor complejidad de la QS en pacientes HBeAg(-) que HBeAg(+), confirmando estudios previos. Los resultados tambien muestran que la alta complejidad en la region preCore esta asociada con una baja replicacion, en concordancia con el papel clave de esta region en la misma, y sugiere una respuesta inmune aumentada en los pacientes HBeAg(-), probablemente debido a la falta de actividad inmunomoduladora de HBeAg. La seleccion positiva de variantes core en pacientes HBeAg o fluctuante que se ha observado, puede ser entendida como un mecanismo potencial de escape del sistema inmune por cambios en la secuencia de la nucleocapside. Por ultimo, se ha encontrado una correlacion negativa de la evolucion de la QS en el periodo sin tratamiento y en el periodo con tratamiento, lo que sugiere la importancia de estudiar la complejidad de la QS antes de tratar a los pacientes como un posible factor predictivo de la evolucion del virus en el caso de no respondedores a NUCs. Los resultados del segundo estudio evidencian infecciones con mezclas de genotipos y su cambio a lo largo del tiempo y ponen de manifiesto la compleja dinamica de la QS del VHB como un mecanismo adicional para adaptarse a nuevas situaciones, como pueden ser la repuesta del sistema inmune o un determinado tratamiento antiviral. Se han encontrado discrepancias entre los genotipos obtenidos en la region polimerasa/superficie y X/preCore que sugieren un fenomeno de recombinacion intergenotipica y que senalan la necesidad de consensuar una region y tecnica para el genotipaje, que lleve a una mejor comprension del significado clinico de la clasificacion genotipica. Hepatitis B Virus (HBV) shows a high mutation rate (3.2 × 10-5 - 7.9 × 10-5 nucleotide substitutions/replicative cycle), due to its unique life cycle which requires an error-prone reverse transcriptase for replication. This fact results in a tremendous genetic variation in the form of genotypes, sub-genotypes, quasispecies (QA) and variants in different regions of the genome. There has been considerable evidence on the relationship between HBV genetic variation, or even QA complexity, and HBeAg seroconversion, HBV-DNA levels, immune scape, pathogenesis and treatment response, showing the relevance of the analysis of this variability and complexity. The aim of this thesis project was to evaluate HBV QA complexity in the preCore/Core regions in relation to HBeAg status, and explore QA changes under natural evolution and nucleoside analogue (NUCs) treatment, measuring complexity parameters (normalized Shannon entropy, mutation frequency and nucleotide diversity). The second aim was to study the complexity at genotype level by assessing the presence and outcome of genotype mixtures in the polymerase/surface and X/preCore regions in patients with chronic hepatitis B virus, also during two periods (natural evaluation and NUCs treatment). For this purpose ultra-deep pyrosequencing (UDPS) of HBV preCore/Core regions in sequential samples (baseline at moment of diagnosis, after a period treatment-free, and after a period of treatment-nonresponse) from 10 retrospectively selected patients grouped according to HBeAg status, were analyzed in the first study. In the second study, thirty samples from another ten chronic hepatitis B patients were analyzed in the polymerase/surface and X/preCore regions in the first available sample at diagnosis, a pre-treatment sample, and a sample while under treatment and the HBV genotype was determined by phylogenesis. The results of the first study provided confirmatory data for previous studies indicating greater QA variability in HBeAg(-) than HBeAg(+) patients. The results show that high complexity in the preCore region is associated with low viral replication, in keeping with the key role of this region in HBV replication, and suggest an enhanced immune response in HBeAg(-) patients, probably related to the lack of HBeAg immunomodulatory activity. In the same direction, the positive selection of Core variants in HBeAg(-) and fluctuating status patients found in this study, can be understood as a potential mechanism to escape the host immune system by nucleocapsid sequence changes. Finally, the strong negative correlation of QA evolution in the treatment-free period and under treatment shows the importance of studying the QA before treating patients, as a potential predictive factor of HBV evolution in cases of NUC nonresponse. The results of the second study provides evidence of HBV genotype mixtures that change over time and illustrates the complex dynamics of the HBV quasispecies as an additional mechanism when adapting to new situations, such as host immune response and/or antiviral treatment. Discrepancies between genotypes in the polymerase/surface and X/preCore regions suggest phenomena of intergenotype recombination and indicate the need for a consensus effort to set an HBV genotyping approach that will lead to a more comprehensive understanding of the clinical significance of HBV genotype classification.