Charakterisierung der porcinen Zona pellucida und ihrer Veränderungen während der In-vitro-Maturation

Ziel dieser Arbeit war es, die porcine Zona pellucida (ZP) naher zu charakterisieren, mit besonderem Blick auf mogliche biochemische und funktionelle Veranderungen wahrend der In-vitro-Maturation. Als Untersuchungsmaterial standen Ovarien zahlreicher frisch geschlachteter Jungsauen zur Verfugung. Nach der Gewinnung der Oozyten wurde entweder die ZP direkt isoliert oder die Oozyten wurden zunachst einer In-vitro-Maturation unterzogen. Die drei Glykoproteine der porcinen Zona pellucida wurden mittels ein- und zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophrose (1D- u. 2D-PAGE) aufgetrennt. Es folgte eine immunologische und lektinologische Analyse der durch die PAGE separierten Glykoproteine der ZP. Diese Studien wurden sowohl mit ZP ungereifter als auch gereifter Oozyten durchgefuhrt. Weiterhin wurde ebenfalls mittels Lektinen die Verteilung der Kohlenhydratketten uber die Oberflache der ZP in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von intakten Oozyten untersucht. Zur Klarung funktioneller Aspekte innerhalb der Veranderungen der ZP wahrend der In-vitro-Maturation wurde ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem konnte die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion vergleichend von ZP ungereifter und gereifter Oozyten untersucht werden. Der akrosomale Status der Spermien wurde mit dem Lektin PNA, das an einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt war, ermittelt. Fur die Bindungstests wurden Frischejakulate eines institutseigenen Ebers und kryokonservierte Nebenhodenspermien einer Charge verwendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: In der 2D-PAGE wurde bei der ZP von gereiften Oozyten im Vergleich zur Auftrennung von ungereiften ein pI-Shift von ca. einer pI-Einheit festgestellt. Diese Zunahme der Aciditat stellt sich mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten innerhalb der lektinologischen Analyse noch deutlicher dar. Im Lektinblot konnte gezeigt werden, dass mannosehaltige Strukturen innerhalb von diantennaren Seitenketten ausgepragt im Glykoprotein ZPA vorliegen und bei ZPB/ZPC durch Con A nicht erkannt werden. Mit SNA, MAA II und ACA wurde unterschiedlich verknupfte Sialsaure nachgewiesen. Durch das Lektin AAA konnte der fur das Schwein typische hohe Fukosylierungsgrad der ZP nachvollzogen werden. Ein negatives Ergebnis in der lektinologischen Untersuchung erhielt man nur fur den Nachweis von terminaler Galaktose (PNA u. GS I). Das ermittelte Lektinbindungsverhalten wies keine Unterschiede bei ungereifter und gereifter ZP auf. Innerhalb der rasterelektronenmikroskopischen Analysen konnte das Mengenverhaltnis von Con A und AAA positiven Strukturen aus dem Lektinblot bestatigt werden. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die ZP wahrend der In-vitro-Maturation Prozessen unterliegt, die eine Funktionsanderung hervorrufen. Die In-vitro-Reifung bewirkte statistisch signifikant eine beschleunigte Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP. Dies wurde fur die ersten zehn Minuten nach der Bindung der Spermien an die ZP gezeigt. Nach weiteren zehn Minuten erfolgte eine Angleichung an die Verhaltnisse bei der ungereiften ZP. Diese Ergebnisse zeigen, dass die ZP schon wahrend der Maturation und nicht erst nach der Fertilisation nachweisbaren Veranderungen unterliegt. Bezuglich des pI-Shifts konnten keine Hinweise erhoben werden, dass dieser durch veranderte Kohlenhydratstrukturen oder eine vermehrte Sialylierung bewirkt wird. Die erhohte Aciditat der ZP Glykoproteine von gereiften Oozyten konnte durch eine gesteigerte Sulfatierung hervorgerufen werden. Dies ist in weiterfuhrenden Untersuchungen abzuklaren. Weiterhin muss uberpruft werden, inwiefern sich diese Ergebnisse vom In-vitro-Modell auf die Verhaltnisse in vivo ubertragen lassen und ob dort noch umfangreichere Veranderungen auftreten.