Óxido nítrico y óxido nítrico sintasas en la apoptosis de las células cromafines bovinas. Regulación y mecanismos de señalización

El oxido nitrico (NO) es un mensajero celular con importantes funciones en los procesos fisiologicos, tales como la regulacion del tono vascular, la neurotransmision y la modulacion de las reacciones inmunes e inflamatorias. Practicamente todas las celulas nucleadas de mamiferos producen NO de manera endogena. El NO se sintetiza a partir de la L-arginina en un proceso mediado por tres isoformas de la Oxido Nitrico Sintasa (NOS). En el sistema nervioso, la produccion de grandes cantidades de NO en respuesta a estimulos como las citoquinas, o una desmesurada liberacion de glutamato, pueden producir neurotoxicidad y neurodegeneracion, ambos procesos mediados por apoptosis. El NO juega un papel fundamental en la regulacion de la apoptosis, pudiendo ser tanto pro-apoptotico como anti-apoptotico. Las celulas cromafines son un buen modelo de celulas neurosecretoras. En estudios previos de nuestro grupo de investigacion se observo que el NO es un mediador de la muerte celular de estas celulas, y demostro la presencia de la isoforma neuronal de la NOS (nNOS), asi como de receptores tanto de citoquinas como de glutamato. Por todo ello, en este trabajo hemos intentado determinar la implicacion del NO exogeno y endogeno en la muerte celular de tipo apoptotico.En la primera parte del trabajo, nos pusimos como objetivo establecer la posible implicacion de la mitocondria en la apoptosis inducida por el NO exogeno en las celulas cromafines. Utilizando cultivos primarios de celulas cromafines bovinas y diferentes donadores de NO (SNP, SNAP y GSNO) a concentraciones apoptoticas, demostramos que el NO induce un descenso, que aumenta con el tiempo, en el potencial de membrana mitocondrial, lo que se correlaciona con la aparicion de celulas hipodiploides. Tras la disminucion en el potencial de membrana mitocondrial se observa la liberacion de citocromo c en el citosol, que precede a la activacion de caspasa 3. En este mecanismo interviene la familia de proteinas Bcl-2. Los donadores de NO disminuyen la expresion de miembros anti-apoptoticos de la familia, como Bcl-2 y Bcl-xl, y aumentan la expresion de los miembro pro-apoptoticos, como Bax y Bcl-Xs, que inducen la liberacion al citosol de citocromo c. Varias vias de senalizacion parecen regular la induccion de Bax y la inhibicion de Bcl-2, pues el descenso de los niveles de Bcl-2 se detecta despues del aumento de la expresion de Bax. La expresion de la proteina supresora de tumores p53 tambien esta aumentada en las fases iniciales (30 min) de la apoptosis inducida por NO, y podria ser responsable de la induccion de la expresion de Bax. Por otra parte, la translocacion de NF-kB al nucleo parece ser otro de los eventos iniciales en la apoptosis inducida por NO, y podria regular la expresion de p53. En conclusion, estos resultados concuerdan con la participacion de mecanismos mitocondriales en la apoptosis inducida por NO en las celulas cromafines bovinas.El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en el sistema nervioso. Juega un papel fundamental en la memoria y la plasticidad sinaptica, pero tambien puede ser el precursor de danos excitotoxicos y muerte neuronal. Varias lineas de investigacion han demostrado una importante relacion funcional y fisiologica entre el NO y el glutamato. De este modo, en este trabajo intentamos caracterizar la expresion de varios receptores glutamatergicos y evaluar si el glutamato era capaz de regular la secrecion de catecolaminas. Los resultados obtenidos con agonistas y antagonistas especificos de estos receptores de glutamato demostraron la relacion del glutamato en la regulacion de la secrecion de catecolaminas, mediada por NO/cGMP.