Caracterització del gen GAS6 i associació amb malalties humanes

El producte de "growth arrest-specific gene6" ("GAS6") es un lligand per als receptors tirosina quinasa TYRO3, AXL i MERTK (TAM). Aquesta proteina dependent de la vitamina K, esta estructuralment relacionada amb la Proteina S anticoagulant i ha estat implicada en diferents mecanismes de supervivencia, proliferacio i adhesio cellulars i la inhibicio de lapoptosi. El fet que el ratoli deficient en Gas6 estigues protegit en front depisodis trombotics demostra la importancia del paper daquesta proteina en el sistema cardiovascular. Lestructura genetica i proteica de "GAS6" es altament homologa amb la de la Proteina S. La present tesi tenia com a objectiu determinar lestructura dexons i dintrons del gen GAS6 per tal danalitzar posteriorment la presencia de variants al gen que puguessin estar associades a malalties humanes. Lanalisi bioinformatic ens va permetre localitzar 15 exons de GAS6, determinar-ne les sequencies daquests i de les seves regions introniques flanquejants en una regio que ocupa 43,5 Kb al brac llarg del cromosoma 13. Un cop obtinguda aquesta estructura es procedi a identificar la presencia de variants alleliques mitjancant lanalisi amb SSCP de productes amplificats de PCR (de mostres de DNA dun grup dindividus control) que contenien les sequencies exoniques amb les seves regions introniques flanquejants. Aquestes analisis revelaren la presencia de diferents variants alleliques que varen ser confirmades com a polimorfismes de cadena senzilla (SNP). Un primer estudi dassociacio daquests SNP identificats mostra que un daquests polimorfismes (c.834+7G>A a lintro 8 de "GAS6") presentava una diferencia estadisticament significativa en la distribucio allelica i genotipica en el grup de pacients respecte a la poblacio control en una poblacio amb malaltia aterotrombotica, sobretot en el subgrup de malaltia cerebrovascular. Posteriorment, es va realitzar la confirmacio daquests resultats en una poblacio amb malatia cerebrovascular molt mes gran i independent de lanterior utilitzant estudis de genotips i haplotips, i es confirma lassociacio del genotip c.834+7 AA amb la reduccio del risc per a la malaltia cerebrovascular. Lanalisi dalguns polimorfismes coneguts dels gens "PROZ" i "F5" i "F7" de la coagulacio (situats a la mateixa regio cromosomica que "GAS6") que han estat implicats en malaltia cerebrovasculat tampoc indiquen cap associacio entre aquest i la malaltia ni estan en desequilibri de lligament amb cap dels polimorfismes identificats a GAS6. Lanalisi dhaplotips indica que aquesta associacio era encara mes forta quan es combinava amb altres SNP, en un haplotip especific (CACA), per a 4 polimorfismes de GAS6 (rs8191973, rs7331124, rs7323932 (c.834+7G>A), rs8191974). Duna banda, aquests resultats suggereixen un paper protector que disminueix en mes de dues vegades el risc a patir un accident cerebrovascular dorigen aterosclerotic o el que afecta a la microvasculatura de lallel c.834+7A i mes concretament de lhaplotip CACA de "GAS6" Daltra banda, els estudis funcionals realitzats per a determinar el possible paper del polimorfisme de lintro 8 de "GAS6" no mostraren diferencies en plaques aterosclerosades darteries coronaries respecte a arteries sense placa. Aixi, lefecte observat a nivell poblacional daquest polimorfisme identificat podria indicar lefecte no conegut fins ara daquest o dun altre polimorfisme en desequilibri de lligament amb aquest que estaria afectant la via de GAS6 i els seus receptors tirosina quinasa. " SUMMARY: The product of the growth arrest-specific gene 6 (GAS6), a ligand for the TYRO3,AXL, and MERTK tyrosine kinase receptors, is a vitamin K-dependent protein, structurally related to anticoagulant protein S. Gas6-deficient mice are protected against thrombosis, demonstrating the importance of this protein in the cardiovascular system. The present thesis was aimed at determining the human GAS6 intronexon structure and analyzing the gene for the presence of allelic variants that could be associated with human diseases. Online analyses allowed us to localize 15 GAS6 exons and to determine the sequence of their intron-flanking regions, in a chromosome 13 region spanning 43.5 kb of DNA. SSCP analysis of PCR-amplified GAS6 exons with their intron-flanking regions from control DNA samples, revealed the presence of different variants, which were confirmed to be single nucleotide polymorphisms (SNPs). A preliminary analysis of these SNPs in a group of patients with atherothrombotic disease revealed statistically significant differences between controls and stroke patients in the allelic distributions of one of these variants (c.834+7G>A in intron 8). We confirmed these results in a larger and independent stroke population using genotype and haplotype studies: the GAS6 c.834+7AA genotype was found associated with decreased risk for stroke (OR:0.59; 95%CI:0.37-0.93). Furthermore, haplotype analysis revealed that association was even stronger (OR:0.48;95%CI:0.28-0.83, for ischemic stroke) when the c.834+7 A allele was present in a specific haplotype (CACA) of four GAS6 polymorphisms (rs8191973, rs7331124, rs7323932, rs8191974). These results suggest a protective role for stroke of this haplotype. "