Investigation of ultra high pressure size exclusion columns and chromatographic parameters for polymer characterization

Size exclusion chromatography (SEC) is a liquid chromatographic technique for separation of biomolecules and polymers, based on hydrodynamic volume or size. The growing demand of shorter analysis time and maintained resolution in SEC has developed ultra-high-pressure size exclusion chromatography (UHPSEC). The aim of this thesis work is to evaluate UHPSEC columns with a refractive index (RI) detector for development of methods for low amounts of polymer excipients with reduced analysis time. In addition, the aim is to investigate, in a screening design, what factors influence the chromatographic behavior of hydroxypropyl cellulose (HPC) in a selected UHPSEC column. Six different SEC columns were evaluated, one conventional SEC column and five UHPSEC columns. The conventional SEC column was TSKgel GMPWXL and the UHPSEC columns were Acquity APC AQ 200, Acquity APC XT 200, Acquity UPLC BEH 125 SEC, and Acquity UPLC BEH 200 SEC. Hydroxypropyl cellulose (HPC), Pluronic F108, polyethylene glycol (PEG) 6000 and PEG 20.000 were used as model polymers, whereas pullulan and polystyrene were used as standards. Evaluation of Acquity APC AQ 200 showed that only pullulan standards eluted from the column, the other model polymers adsorbed to the column material. The Acquity APC XT 200 column with tetrahydrofuran (THF) as mobile phase and the conventional TSKgel GMPWXL column with phosphate buffer saline (PBS) as mobile phase had comparable limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) for Pluronic F108. However, for HPC LOQ was higher on the UHPSEC column. Of the tested columns, Acquity UPLC BEH 200 SEC had the lowest LOQ and LOD for HPC. Evaluation of the columns also showed that the analysis time was reduced with an UHPSEC column compared to the conventional column. The screening design on Acquity UPLC BEH 200 SEC for analysis of HPC revealed that column temperature and injection volume were predominant factors influencing peak height, peak area, the ratio of tailing and fronting, and back pressure. Sammanfattning SEC (size exclusion chromatography) är en vanlig kromatografisk teknik för separation av biomolekyler och polymerer, baserad på hydrodynamisk volym eller storlek. En ökande efterfråga på SEC metoder som har kortare analystid har lett till att UHPSEC (ultra high pressure SEC) har utvecklats. Syftet med detta examensarbete är att utvärdera UHPSEC kolonner med en brytningsindex (RI) detektor för utveckling av metoder för små mängder av polymera hjälpämnen. Dessutom är syftet att undersöka, med designade experiment, vilka faktorer som påverkar det kromatografiska beteendet av hydroxipropylcellulosa (HPC) i en UHPSEC kolonn. Sex olika SEC kolonner utvärderades, en konventionell SEC kolonn och fem UHPSEC kolonner. Den konventionella kolonnen var TSKgel GMPWXL och UHPSEC kolonnerna var Acquity APC AQ 200, Acquity APC XT 200, Acquity UPLC BEH 125 SEC, och Acquity UPLC BEH 200 SEC. Hydroxipropylcellulosa (HPC), Pluronic F108, polyetylenglykol (PEG) 6000 och PEG 20,000 användes som modellpolymerer, medan pullulan och polystyren användes som standarder. Utvärdering av Acquity APC AQ 200 visade att endast pullulanstandarder eluerade från kolonnen, de andra modellpolymererna adsorberade till kolonnmaterialet. Acquity APC XT 200 kolonnen med tetrahydrofuran som mobilfas och den konventionella TSKgel GMPWXL kolonnen med fosfatbuffrad saltlösning som mobilfas hade jämförbar kvantifieringsgräns och detektionsgräns för Pluronic F108. För HPC däremot var kvantifieringsgränsen högre för UHPSEC kolonnen. Av de testade kolonnerna hade Acquity UPLC BEH 200 SEC den lägsta kvantifieringsgränsen och detektionsgränsen för HPC. Utvärdering av kolonnerna visade också att analystiden reducerades med UHPSEC kolonnerna jämfört med den konventionella SEC kolonnen. De designade experimenten på Acquity UPLC BEH 200 SEC för analys av HPC visade att kolonntemperatur och injektionsvolym var dominerande faktorer som påverkade topphöjd, topparea, toppform, och mottryck.