Estudi genètic integral de la regió 4p15 i identificació de PI4K2B i STIM2 com a gens alterats en càncer colorectal

DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genetiques i epigenetiques que afecten el cancer colorectal (CCR) esta lluny de ser totalment conegut. L'LOH es una de les alteracions mes recurrents en CCR aixi com en d'altres neoplasies. Acostuma a ser un bon indicador de la presencia de gens rellevants per a la carcinogenesi. L'estudi de les alteracions somatiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lelic ha estat fonamental en el passat per la identificacio d'alguns dels gens supressors tumorals mes coneguts, com es el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lelics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronostic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'analisi genetica integral per a una regio critica situada a 4p15 am la intencio de localitzar-hi els gens que mes probablement estiguin contribuint a la progressio tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjancant la utilitzacio de marcadors microsatel·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atimics. Hem identificat una regio critica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somatiques genetiques i/o epigenetiques. Tambe hem analitzat els patrons d'expressio dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjancant prediccions de regulacio transcripcional bioinformatiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 son dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Aixo ha estat confirmat mitjancant immunoprecipitacio de cromatines. Hem avaluat el valor pronostic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A mes, hem realitzat experiments de deplecio mitjancada per siRNA sobre linies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formacio de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressio dels nostres gens candidats te o no un efecte en la formacio dels tumors generats a partir de linies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastatic una acumulacio d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi genica, es a dir que les perdues d'heterozigositat no comporten una perdua de material genetic i probablement son la consequencia de processos de recombinacio mitotica i/o perdua i duplicacio associats a un escenari d'inestabilitat cromosomica. Els gens d'aquesta regio critica no son portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilacio de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metastasi hepatiques (MH) independentment de la presencia o no d'LOH, i que, a mes, la seva transcripcio estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteina com d'mRNA estan assocats a un millor pronostic i una millor resposta al tractament quimioterapic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de deplecio amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferacio cel·lular i que la sobreexpressio en linies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminucio del volum tumoral i per tant te un efecte de supressio de la proliferacio. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que son dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressio d'aquests dos gens te un efecte supressor de la proliferacio cel·lular, que alhora, te un impacte en el pronostic i el tractament dels pacients de cancer colorectal.