Development of highly efficient CYP153A-catalysed terminal hydroxylation of fatty acids

Terminally hydroxylated fatty acids (omega-OHFA) are of great interest to industry: in the area of high end polymers, in fine chemicals, in the cosmetic and fragrance industry. The activation and oxidation of C-H bonds, is however still chemically challenging. It requires rough conditions, high pressure, high temperature and the processes still suffer from poor selectivity. Alternatively, the functionalization of carbon atoms can be achieved by using versatile cytochrome P450 monooxygenases with high regio- and stereoselectivity (P450s or CYPs). These heme containing proteins can be found in many organisms, they are involved in a diverse range of reactions and they are able to catalyse the conversion of a large panel of substrates. CYP153A from Marinobacter aquaeolei (CYP153AM.aq.) constitutes a promising catalyst for the oxidation of non-activated carbon atoms due to its high regioselectivity in the hydroxylation of different small to medium chain alkanes, fatty acids and primary alcohols as well as its efficient expression in Escherichia. coli at high yields. For bacterial whole-cell applications, the enzyme was further engineered as a protein chimera by fusing the reductase domain of P450BM3, from Bacillus megaterium, to the heme domain of CYP153AM.aq. (CYP153AM.aq.-CPRBM3). The mutant G307A (position located in the binding pocket) was further identified as improved variant towards medium chain-length fatty acids regarding activity, regioselectivity and coupling efficiency. To perform efficient whole-cell biotransformations and therefore to increase the yield of bioconversion of fatty acids into omega-OHFA, the system requires the identification of present bottlenecks. The approaches to characterize and to optimise the up-scaling process involved testing different feeding strategies, evaluation of substrate/product inhibition, transport limitations estimation, cofactor availability evaluation and biocatalyst stability investigations. Such limitations often associated to the P450 biocatalysts and/or related to whole-cell biotransformations were evaluated in this study, using the fusion constructs CYP153AM.aq. -CPRBM3 towards the model substrate dodecanoic acid (C12:0) in vitro and in vivo. Strategies to overcome existing bottlenecks regarding low activity involved the generation of mutant libraries to screen and to characterize improved versions of the current chimera biocatalyst. In parallel to the mutant libraries generation, a whole-cell colorimetric assay was also established. Terminal hydroxylierte Fettsauren (omega-OHFA) sind fur die Industrie von grosem Interesse: im Bereich der high-end Polymere, in der Feinchemie, in der Kosmetik- und Duftstoffindustrie. Die Aktivierung und Oxidation von C-H Bindungen gilt noch immer als chemisch herausfordernd. Hierfur werden harsche Reaktionsbedingungen, hohe Drucke sowie hohe Temperaturen benotigt und die Verfahren sind noch immer durch niedrige Selektivitaten beeintrachtigt. Alternativ kann die Funktionalisierung von Kohlenstoffatomen durch die Verwendung von vielseitigen Cytochrom P450 Monooxygenasen mit hohen Regio- und Stereoselektivitaten erreicht werden. Diese Ham-enthaltenden Proteine konnen in vielen Organismen gefunden werden, sie sind an einer diversen Reihe von Reaktionen beteiligt und sie sind fahig, eine Vielzahl von Substraten umzusetzen. Sowohl aufgrund der hohen Regioselektivitat bei der Hydroxylierung von verschiedenen kurz- bis mittelkettigen Alkanen, Fettsauren und primaren Alkoholen, als auch der effizienten Expression in E.coli in hohen Titern, stellt CYP153A aus Marinobacter aquaeolei (CYP153AM.aq.) einen vielversprechenden Katalysator fur die Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoffatomen dar. Durch die Fusion der Reduktasedomane von P450BM3 aus Bacillus megaterium an die Hamdomane von CYP153AM.aq. (CYP153AM.aq.-CPRBM3) wurde das Enzym fur die bakterielle Ganzzell Katalyse zu einem Protein-Chimar weiterentwickelt. Bezuglich Aktivitat, Regioselektivitat und Couplingeffizienz wurde die Mutante G307A (in der Bindetasche befindlich) als verbesserte Variante gegenuber mittelkettigen Fettsauren identifiziert. Um effiziente Ganzzell Biotransformationen durchfuhren zu konnen und somit die Ausbeute der Umsetzung von Fettsauren zu omega-OHFA zu steigern, ist es notwendig vorhandene Engpasse des Systems zu identifizieren. Zu den Ansatzen, die verfolgt wurden, um den Up-Scaling Prozess zu charakterisieren und zu optimieren, gehorten verschiedene Futterungsstrategien, die Evaluation von Substrat,Produkt-Inhibitionen, die Abschatzung von Transportlimitationen, die Uberprufung der Kofaktor-Verfugbarkeit sowie die Untersuchung der Stabilitat des Biokatalysators. Einige der Strategien zur Eliminierung vorhandener Aktivitats-Engpasse beinhaltete die Erstellung von Mutantenbibliotheken, um optimierte Varianten des momentan vorhandenen chimaren Biokatalysators zu screenen und zu charakterisieren. Parallel zur Generierung der Mutantenbibliothek wurde unter der Verwendung von Galaktoseoxidase, die omega-OHC12:0 (Produkt von CYP153AM.aq.) oxidieren kann und dabei Wasserstoffperoxid bildet, ein kolorimetrischer Ganzzellassay entwickelt.