Découverte de nouvelles protéines impliquées dans la spermatogenèse chez le rat

La spermatogenese chez les mammiferes est une fonction biologique complexe incluant des processus de proliferation cellulaire, de meiose et de differenciation uniques visant a la production des gametes mâles au sein du testicule. Si l’epithelium seminifere est bien decrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les processus par lesquels les cellules germinales diploides indifferenciees entrent en meiose pour donner ensuite des cellules haploides subissant par la suite de nombreuses transformations morphologiques, ne sont pas totalement decryptes. Ils reposent sur l’expression coordonnee et sequentielle de genes dont les produits specifiques de chaque stade de developpement des cellules germinales sont essentiels aux etapes cles de la spermatogenese. La transcriptomique depuis les annees 1990 et la proteomique depuis les annees 2000 ont contribue a l’amelioration de la connaissance de ces mecanismes. Une etude proteomique visant a caracteriser par des approches systematiques et differentielles les proteomes des cellules de Sertoli et de la lignee germinale, et d’autre part une etude recente, realisee dans notre unite, qui a permis de caracteriser et de quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolees de rat en utilisant le sequencage de novo des transcrits (RNA-Seq), ont ete a la base de mes travaux de these. Cette derniere etude a mis en evidence l’accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs) et de transcrits testiculaires non annotes (TUTs) aux stades meiotique et post- meiotique de la spermatogenese chez le rat. Dans ce contexte, mon travail a consiste a valider le potentiel codant de nombreux genes exprimes dans les cellules germinales par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant proteomique Shotgun et RNA-Seq. Dans ce type d’approche, les sequences proteiques deduites des transcrits des differents types cellulaires, assembles par RNA-Seq, sont integrees dans une base personnalisee de sequences proteiques utilisee pour interroger les donnees de spectrometrie de masse obtenues a partir de proteines de cellules meiotiques et post-Meiotiques. L’approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant a 44 loci) codent pour des proteines dans les cellules meiotiques et post meiotiques. L’expression post-Meiotique de deux nouveaux transcrits, l’un codant pour la proteine VAMP9, une proteine de la famille SNARE, et l’autre pour une nouvelle enolase T-ENOL a pu etre confirmee. L’expression post-Meiotique de T-ENOL a ete confirmee par immunohistochimie a l’aide d’un anticorps polyclonal produit contre la proteine recombinante. Cette approche nous a egalement permis d’identifier de nouvelles isoformes de proteines connues specifiques de chaque stade de la spermatogenese. Les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue necessaire au bon deroulement de la spermatogenese. Une autre partie de mon travail a consiste a identifier des proteines membranaires des cellules germinales et des corps residuels, susceptibles d’intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche proteomique de quantification relative ICPL. Cette approche a permis d’etablir une liste de 166 proteines differentiellement exprimees entre les spermatocytes pachytene, les spermatides rondes et les corps residuels, qui sont susceptibles de jouer un role dans la spermiogenese. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j’ai pu etablir une liste de 8 proteines ayant un role suppose dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la differenciation. Par ailleurs, j’ai pu etablir par proteomique Shotgun un premier proteome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps residuels chez le rat.