Formation et caractérisation physico-chimique des complexes ADN/chitosane pour la thérapie génique

RESUME La therapie genique est un secteur biomedical en plein essor et de nombreux vecteurs nonviraux a partir de polymeres cationiques ont ete etudies pour la livraison de genes. Le systeme de livraison de genes doit condenser l’ADN, le proteger contre la degradation par les nucleases, faciliter son entree dans les cellules et transporter l’ADN jusqu’au noyau pour permettre l’expression des genes. Ce projet consiste a approfondir notre comprehension d’un systeme prometteur pour la livraison de genes: les complexes ADN/chitosane. Les objectifs principaux de cette these etaient de determiner les interactions qui regissent la formation des complexes ADN/chitosane, de caracteriser leurs proprietes physico-chimiques et d’etudier leur stabilite afin d’etablir une correlation avec leur efficacite de transfection. Dans un premier temps, l’association entre le chitosane et un ADN plasmide en fonction du pH, du degre de desacetylation (DDA) et de la masse molaire (Mn) du chitosane a ete etudiee par microcalorimetrie de titrage isotherme (ITC). Cette etude nous a permis de determiner la constante d’interaction, l’enthalpie d’interaction et la stoechiometrie des complexes. Nous avons trouve que l’interaction chitosane-ADN est couplee avec un transfert de protons du systeme tampon au chitosane. Le transfert de proton est occasionne par la nature fortement anionique de l’ADN qui facilite l’ionisation des amines du chitosane lors de la complexation. De plus, nous avons demontre que l’enthalpie d’interaction mesuree etait entierement due aux changements d’ionisation du chitosane et du tampon. Nous avons trouve une constante d’interaction chitosane-ADN de l’ordre de 109-1010 M-1 et qui augmente avec la diminution du pH. Ceci est attribue aux interactions electrostatiques plus intenses lorsque le degre d’ionisation du chitosane est plus eleve. Nous avons egalement mesure une augmentation par dix de la constante d’affinite pour une augmentation de la masse molaire du chitosane de 7 a 153 kDa. Cette constante varie peu pour un DDA compris entre 72% et 80% (~80 kDa). En revanche, un DDA variant de 80 a 93% augmente la constante d’affinite pour atteindre une valeur proche du chitosane avec un Mn de 153 kDa et un DDA de 80%. Ces resultats montrent qu’il est possible de controler l’affinite chitosane-ADN par le pH et les caracteristiques moleculaires du chitosane. Cette etude a demontre que la formation des complexes ADN/chitosane est gouvernee par des interactions electrostatiques. ----------ABSTRACT In the first part of this thesis, the interaction of chitosan with plasmid DNA was investigated as a function of pH, buffer composition, degree of deacetylation (DDA) and molecular weight of chitosan, using isothermal titration microcalorimetry (ITC). The chitosan- DNA interaction was shown to be coupled with proton transfer from the buffer to chitosan. This proton transfer is induced by the strong polyanionic nature of DNA which facilitates the ionization of glucosamines of chitosan upon binding. The measured enthalpy of binding was almost entirely due to the ionization changes of the buffer and of chitosan. The chitosan-DNA binding constant was found in the range of 109-1010 M-1. The binding constant was pHdependent and was greater at lower pH due to increased electrostatic attraction to DNA when chitosan is highly charged. The binding constant between chitosan and plasmid DNA was significantly influenced by molecular weight and by DDA. The electrostatic effects were found to dictate the binding of chitosan to DNA. The results of this study provide insights into previously measured dependence of transfection efficiencies of DNA/chitosan complexes on chitosan DDA and molecular weight, where a balance between complex stability and chitosan-DNA binding strength was suggested to play a critical role. In the second study, we report a new approach to characterize DNA/polycation complexes using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) coupled online with UV/Vis spectroscopy, multi-angle light scattering (MALS), and dynamic light scattering (DLS). We demonstrated that this AF4 combined system can provide in a single measurement, three important physicochemical parameters of the complexes: the amount of unbound polycation, the hydrodynamic size of the complexes, and their size distribution. The accuracy of the particles sizes was confirmed by comparison with data from batch-mode DLS and scanning electron microscopy. Accurate quantification of unbound polycation can provide insight into the contribution of the free polycation in the process of gene delivery.