Identification and characterization of candidate genes for peach fruit shape

El fruto del melocoton deriva del ovario maduro, que se convierte en drupa. Su forma puede variar entre redonda y plana, adquiriendo algunas formas intermedias como la forma achatada. En el melocoton, el fruto plano (llamado paraguayo) es causado por un alelo parcialmente dominante que debe estar en heterocigosis (Ss), mientras que los frutos de arboles homocigotos (SS) abortan pocas semanas despues del cuajado del fruto. Investigaciones anteriores han identificado un marcador SSR (UDP98-412) altamente asociado al caracter y que es adecuado para su utilizacion en seleccion asistida por marcadores (SAM). Posteriormente, un analisis de asociacion revelo la posible implicacion de una quinasa del tipo Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinacion de la forma del fruto. En concreto, una delecion de ~ 10Kb que afecta al promotor y parte de la region codificante de ese gen co-segrega con la forma plana. Aqui, nuestro objetivo era clonar y estudiar en detalle ese gen (Prupe.6G281100) para dilucidar su funcion en la determinacion de la forma del fruto. Este gen es ortologo al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Un analisis de alineamiento (BLAST) entre proteinas identifico homologia significativa con genes involucrados en diferentes procesos biologicos. El mejor alineamiento se produjo con el gen AtRLP12, que puede complementar funcionalmente CLAVATA2, un regulador clave que controla el tamano de la poblacion de celulas del meristemo. El analisis por RT-PCR revelo la ausencia de transcripcion del alelo parcialmente delecionado, asociado con el fenotipo plano. Los datos respaldan a Prupe.6G281100 como un gen candidato para la forma plana en melocoton. El genotipo posterior de un panel mayor de variedades ha identificado tres variedades que escapan a la asociacion entre el genotipo en Prupe.6G281100 y el fenotipo. Las secuencias genomicas completas de estas tres variedades revelaron variabilidad adicional en otros dos de genes LRR-RLK situados en cluster, junto con Prupe.6G281100, en el locus S. Gran fraccion de esta variabilidad estaba acumulada en uno de estos dos genes (Prupe.6G281500 localizado a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Esta variabilidad, en fase con la delecion de 10 kb, se observo en todas las variedades planas. El segundo gen con variabilidad adicional fue Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G28110) con una secuencia de 6.1 Kb eliminada en fase con el alelo S y unica para las variedades con fenotipo discordante. De acuerdo con la prediccion funcional, los dos genes LRR-RLK tienen la mejor homologia con NUMERO DE ORGANO FLORAL1 (FON1) y con DWARF1 DE GRUESA TASCA (TD1). En la bibliografia se describe que estos genes estan involucrados en el desarrollo de los meristemos florales y el crecimiento de los organos durante la inflorescencia y el desarrollo de las flores, incluida la organizacion estructural, la alteracion de la forma y la regulacion del tamano en diversas especies. A partir de nuestros datos, formulamos aqui una hipotesis de modelo de tres alelos basada en la conformacion de alelos en los tres genes, que pueden estar involucrados, con diferentes niveles de dominancia, en la determinacion de la forma del fruto. En esta tesis tambien hemos analizado un mutante somatico con fruto redondo "UFO-4Mut" derivado de la variedad plana "UFO-4". Los datos genotipicos revelaron que esta mutacion se produjo en celulas de la capa meristematica LII. Iniciamos el estudio de estos dos cultivares con el objetivo principal de validar el papel de Prupe.6G28000 en la determinacion de la forma del fruto. Sin embargo, la resecuenciacion de los dos genomas revelo una gran region (6.5Mb) con perdida de heterocigosidad (LOH) en la muestra mutante. Nuestra hipotesis es que la LOH puede haber sido producida por la reparacion de una rotura de doble cadena (DSB) ocurrida en el cromosoma que porta el alelo que causa el fenotipo plano, con el cromosoma homologo (que lleva el alelo para el fruto redondo). Por lo tanto, el alelo que produce una forma plana se ha eliminado en el mutante y reemplazado por el que produce la forma redonda, lo que explica completamente la reversion del fenotipo. En esta tesis tambien iniciamos la puesta a punto de protocolos para dos tecnicas diferentes. Una de ellas tiene como objetivo la visualizacion de reordenamientos del genoma en cromosomas de celulas somaticas por FISH. El otro consiste en el uso de vectores virales para inducir la expresion de genes en melocoton. Hemos establecido los primeros pasos de estos protocolos se han establecido, los cuales se discuten en este manuscrito de tesis.