Identification and characterization of invasion-related proteins of the malaria parasite Plasmodium falciparum (Welch, 1892)

Malaria is a vector-borne disease, which is caused by a protist of the Plasmodium genus. Plasmodium spp. are obligate intracellular parasites with a complex life cycle that alters between a vertebrate and a mosquito host. One of the essential steps in the vertebrate host is the asexual proliferation within the erythrocytes that allows the exponential multiplication of the pathogen and is responsible for all clinical symptoms in humans. To survive and multiply the parasite invades its host cell rapidly. It relies on an orchestrated cascade of molecular interactions between parasite ligands and surface structure on the erythrocyte. The aim of this work is i) to probe into the role of putative phosphorylation sites in the cytoplasmic domain of one well established parasite ligand called “Erythrocyte Binding Antigen 175” (EBA175) and ii) to identify novel parasite proteins that are secreted and might function as ligands during the invasion process. Towards the first sub aim – I assessed six predicted phosphorylation sites within the cytoplasmic domain. To do so, I generated a transgenic parasite line with six amino acid exchanges targeting each of these putative phosphorylation sites. Using an assay that allows the quantification of EBA175 function, I could show that – in contrast to other parasite ligands – none of these putative phosphorylation sites are essential for protein function. The second sub aim of my project focused on the identification of novel secreted proteins playing a role in the invasion process. Candidates were identified using bioinformatics tools that identified genes with i) a transcriptional profile similar to known parasite ligands and other host cell invasion related proteins and ii) encompass a predicted sequence coding for a signal peptide. This resulted in a list of 289 genes fulfilling these criteria out of which 156 were not characterized. Out of these, 38 genes with unpublished function were selected for further analyses. The first step in the functional investigation was the tagging of the genes of interest at the 3´end with GFP, which resulted in 29 transgenic parasite lines with a gene specific GFP tag. Using fluorescence microscopy in live parasites expression and localization of the fusion proteins were investigated and subdivided into five categories. 15 proteins could be localized to the invasion relevant compartments surface, inner membrane or basal complex, and apical organelles. In order to analyze the function of these 15 proteins a gene knock-out approach was initiated that already reveals that 6 proteins of these are redundant and 4 appear to be likely essential. Taking together, this approach allows the rapid identification of novel candidate gene that might play an important role in erythrocyte invasion. Malaria ist eine durch einen Vektor ubertragene Infektionskrankheit, die durch einen intrazellularen Parasiten der Gattung Plasmodium ausgelost wird. Plasmodien haben einen komplexen Lebenszyklus, der zwischen Wirbeltieren und Mucken alterniert. Ein wesentlicher Schritt dieses Lebenszyklus ist die asexuelle Vermehrung, die innerhalb von Erythrozyten im Wirbeltier-Wirt stattfindet. Sie ermoglicht eine exponentielle Vermehrung des Parasiten und ist fur das Krankheitsbild der Malaria verantwortlich. Um zu uberleben, ist eine schnelle Invasion in die Wirtszelle notwendig. Der Invasionsprozess ist sehr komplex und umfasst viele streng regulierte Wechselwirkungen zwischen Liganden des Parasiten und Rezeptoren auf der Oberflache der Wirtszelle. Ein wichtiger und gut charakterisierter Invasionsligand ist „Erythrocyte Binding Antigen 175“ (EBA175). Ziel dieser Arbeit war es zum einen, die Rolle von putativen Phoshphorylierungsstellen innerhalb der zytoplasmatischen Domane von EBA175 zu untersuchen. Zum anderen sollten neue sekretierte Parasitenproteine identifiziert werden, die als Invasionsliganden in Frage kommen. Um die Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domane von EBA175 zu untersuchen, wurde eine Zelllinie generiert, in welcher sechs vorhergesagte Phosphorylierungsstellen ausgetauscht wurden, um deren Phosphorylierung zu unterbinden. Mit Hilfe eines Invasionsassays wurde gezeigt, dass – im Gegensatz zu anderen Invasionsliganden des Parasiten – keine dieser putativen Phosphorylierungsstellen einen essentiellen Einfluss auf die Funktionalitat des Liganden hat. Das zweite Projekt zielte auf die Identifikation neuer sekretierter Proteine ab, die eine Rolle im Invasionsprozess spielen. Von anderen Invasionsliganden und Proteinen, die an der Invasion beteiligt sind, ist ein spates Transkriptionsprofil bekannt. Mit Hilfe eines bioinformatischen Ansatzes wurde nach Kandidatengenen gesucht, die ein solches Profil und zusatzlich ein vorhergesagtes Signalpeptid aufweisen. Aus einer Liste von zunachst 289 Genen wurden 38 Kandidaten mit unbekannter oder nicht veroffentlichter Funktion ausgesucht, um diese weiter zu charakterisieren. Alle Kandidaten wurden zunachst C-terminal mit GFP fusioniert. Es konnten 29 transgene Zelllinien generiert werden, die fluoreszenzmikroskopisch untersucht wurden. Anhand ihrer Lokalisation und Expressionsrate wurden die Fusionsproteine in funf Gruppen eingeteilt. 15 der Proteine wurden auf der Parasitenoberfache, an dem Inneren Membran- und Basalkomplex, oder in den apikalen sekretorischen Organellen lokalisiert. All diese Kompartimente konnen mit der Invasion in Verbindung gebracht werden. Zur weiteren funktionellen Analyse wurde ein Gen-Knock-Out initiiert. Sechs der untersuchten Proteine konnten bereits als redundant eingestuft werden und vier der Kandidaten haben moglicherweise eine essentielle Funktion fur den Parasiten. Zusammenfassend ermoglicht dieser bioinformatische Ansatz die schnelle Identifizierung neuer Kandidatengene, die eine wichtige Rolle bei der Invasion des Parasiten in die Wirtszelle spielen konnten.