Identification and optimization of novel bacterial laccases

Laccasen (EC 1.10.3.2) gehoren zu den blauen Multikupferoxidasen. Sie verknupfen die Oxidation von vier Substratmolekulen durch Abstraktion jeweils eines Elektrons mit der Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff. Dabei akzeptieren Laccasen eine Vielzahl unterschiedlicher phenolischer und nicht-phenolischer Aromaten als Substrate. Als Coprodukt entsteht lediglich Wasser. Dadurch konnen Laccasen in etlichen oxidativen „grunen“ Prozessen genutzt werden. Aktuell werden ausschlieslich Laccasen aus Pilzen fur industrielle Zwecke eingesetzt, obwohl bakterielle Laccasen eine Reihe von Vorteilen bieten. Diese zeigen meist Aktivitat im neutralen bis alkalischen pH-Bereich, sind stabil bei erhohten Temperaturen und unempfindlicher gegenuber inhibierenden Substanzen. Zudem konnen sie in prokaryotischen Wirtsorganismen hergestellt werden, was hohe Ausbeuten und eine einfache genetische Manipulation verspricht. Dass sie aktuell nicht in industriellen Prozessen verwendet werden, liegt zum einen an der relativ geringen Zahl charakterisierter bakterieller Laccasen. Zum anderen weisen sie in der Regel niedrige Redoxpotentiale auf. Da die Aktivitat von der Redoxpotentialdifferenz zwischen Laccase und Substrat abhangt, sind die Anzahl moglicher Substrate und die spezifische Aktivitat bakterieller Laccasen beschrankt. Zum dritten sind heterolog exprimierte bakterielle Laccasen haufig kupferdefizient und erreichen dementsprechend nicht ihre volle Aktivitat. In der vorliegenden Arbeit sollte die Nutzbarkeit bakterieller Laccasen verbessert werden, um so in Zukunft einen Einsatz in industriellen Prozessen zu ermoglichen. Um die Anzahl verfugbarer Enzyme zu erhohen, wurde die Laccase Ssl1 aus Streptomyces sviceus kloniert und charakterisiert. Ssl1 gehort zu den sogenannten kleinen Laccasen, die sich durch eine Architektur aus zwei Domanen auszeichnen. Es besitzt mit phenolischen Substraten Aktivitatsoptima im alkalischen pH-Bereich. Die gemessenen Optima bei pH 9 fur Guaiacol und 2,6-Dimethoxyphenol gehoren zu den hochsten bekannten Optima von Laccasen. Nicht nur die Aktivitat, auch die Stabilitat im alkalischen Bereich ist bemerkenswert hoch. So waren nach sieben Tagen bei pH 11 immer noch 75 % Restaktivitat vorhanden. Die Stabilitat von Ssl1 wurde durch den Zusatz von organischen Losemitteln und Detergenzien kaum beeinflusst. Die Aktivitat von Ssl1 sank durch den Zusatz zwar ab, aber selbst bei einem Anteil von 40 % wassermischbarem organischen Losemittel konnten mindestens 20 % Aktivitat nachgewiesen werden, mit Detergenzien mindestens 60 %. Der Zusatz von 10 mM Natriumazid, einem bekannten Laccaseinhibitor, hatte keinen messbaren Effekt auf die Aktivitat oder Stabilitat von Ssl1. Auch die Thermostabilitat von Ssl1 ist beachtlich. Bei 60 °C lag die Halbwertszeit der Aktivitat bei 88 min. Ssl1 hat ein Redoxpotential von 375 mV und muss daher als Laccase mit niedrigem Redoxpotential eingeordnet werden. Um das Redoxpotential von Ssl1 gezielt zu erhohen, wurde Ssl1 kristallisiert und seine Struktur durch Rontgenkristallographie aufgeklart. Das ermoglichte die Auswahl und den Austausch von Aminosauren die das Redoxpotential beeinflussen konnten. Auf diese Weise wurden Ssl1 Varianten mit einer Erhohung des Redoxpotentials von 16 bis 81 mV erzeugt. Als entscheidende Faktoren wurden der axiale Ligand des Typ 1-Kupferzentrums und die Hydrophobizitat in dessen Umgebung identifiziert. Mutationen in unmittelbarer Umgebung des Typ 1-Kupferzentrums storten dabei offensichtlich den Elektronentransport innerhalb der Laccase, was zu geringeren spezifischen Aktivitaten in den entsprechenden Varianten fuhrte. Dagegen waren die Varianten Ssl1 M220L/T222L und Ssl1 ΔC-terminus mit Mutationen abseits des Typ 1-Kupferzentrums in der Lage, die industriellen Farbstoffe Alizarinrot S und Indigokarmin schneller umzusetzen als das Wildtypenzym. Strategien zur Erhohung der Kupferbeladung heterolog exprimierter bakterieller Laccasen wurde am Beispiel der Modelllaccase CotA aus Bacillus licheniformis untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Erhohung der intrazellularen Kupferkonzentration durch Ausschalten des aeroben Kupferdetoxifikationsmechanismus in Escherichia coli nicht ausreicht, um den Kupfergehalt von CotA zu steigern. Dagegen fuhrte die Coexpression des zuvor durch Genomscreening identifizierten Kupferchaperons CopZ zu einer Erhohung des Kupfergehalts um 20 %. Gleichzeitig stieg die spezifische Aktivitat von CotA um 26 %. Dadurch war zwar noch keine vollstandige Kupferbeladung von CotA erreicht, aber das entwickelte System ist einfach im Gebrauch und verlangt keinen grosen experimentellen Zusatzaufwand. Daher kann es in Standardexpressionen eingesetzt werden und dabei die Ausbeuten aktiver CotA-Laccase erhohen.