The structural and functional characterization of the extracellular domain of vascular endothelial growth factor receptors : their role in receptor activation and use as therapeutic targets

Abstract: The vascular endothelial growth factor (VEGF) family plays key roles in the development of the blood and lymphatic vasculature. Five members, VEGF A, B, -C, -D, and PlGF can be found in the human body. They bind in an overlapping pattern to three receptor tyrosine kinases (RTKs), which constitute the type V family of RTKs: VEGF-receptor (VEGFR)-1 (also known as Flt1), VEGFR-2 (KDR/Flk1), and VEGFR-3 (Flt4). While VEGFR-1 and VEGFR-2 are mainly involved in angiogenesis, VEGFR-3 is the key player in lymphangiogenesis. VEGFRs consist of seven immunoglobulin-homology domains constituting the extracellular domain (ECD), a single transmembrane helix, and a split tyrosine kinase domain. Ligand binding to the VEGFR ectodomain initiates receptor dimerization, followed by kinase activation and autophosphorylation. Phosphorylated tyrosine residues in the intracellular domain of VEGFRs act as docking sites for a number of different signaling molecules. In addition to physiological angiogenesis, aberrant VEGFR signaling is associated with a variety of pathological conditions such as in cancer, in ischemic, and in inflammatory disorders. Several inhibitors of VEGF-signaling have been developed most of which are at different stages in clinical trials. However, anti-angiogenic treatment of cancer is often accompanied by severe side-effects and tumor patients tend to develop resistance to the treatment. Hence, structural studies of the VEGF receptor system may further elucidate the molecular mechanism underlying receptor activation and thereby help to develop new more specific drugs complementing existing therapies. During this project, I showed that binding of individual VEGFR-1 ligands resulted in conformationally similar ligand/VEGFR-1 ECD complexes. Besides showing ligand induced dimerization, the complexes reveal homotypic receptor/receptor interactions in the membrane proximal Ig homology domains. Our study is also the first addressing the thermodynamic contributions of individual Ig homology domains of VEGFR-1 to ligand binding. I showed that VEGFR-1 D4-7 positively contribute to ligand binding as shown by the higher affinities of the ligands for VEGFR-1 D1-7 compared to binding to the minimal ligand binding domain D1-3. Surprisingly, I discovered that Ig homology domain 1 blocks PlGF-1 binding to VEGFR-1 D1-3 but not to D1-7. The exact mechanism explaining this phenomenon remains unclear. In a second project, we showed that Ig-homology domains 4 and 7 are indispensable for VEGFR-2 activation. The loop connecting β-strand E and F in Ig-homology domain 7 represents the element that are required for receptor activation by mediating contacts with Ig-homology domain 7 of the second receptor chain in the dimerized complex. We generated Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) that specifically target the low affinity receptor/receptor interactions formed upon ligand binding and identified a DARPin binding to Ig-homology domain 4 that blocks VEGFR-2 activation and phosphorylation without preventing the formation of the VEGF A/VEGFR-2 complex. This inhibitor also affected downstream signaling and inhibited sprout formation of endothelial cell spheroids. This type of inhibition displays a new inhibition mechanism for VEGFR-2 that might be applied complementarily to other therapeutic approaches to improve the efficiency of anti-angiogenic therapy. ---------- Zusammenfassung: Die Familie der VEGFs spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Blut- und Lymphgefasssystems. Im menschlichen Korper sind funf Mitglieder, VEGF A, -B, -C, -D, und PlGF anzutreffen. Sie binden in einem uberlappendem Muster zu drei Rezeptor Tyrosin Kinasen, die die Typ V Familie der RTKs bilden: VEGFR-1 (auch bekannt als Flt1), VEGFR-2 (Flk1), und VEGFR-3 (Flt4). Wahrend VEGFR-1 und VEGFR-2 hauptsachlich in der Angiogenese involviert sind, stellt VEGFR-3 eine Schlusselfigur in der Lymphangiogenese dar. VEGFRen bestehen aus 7 Immunoglobulin-ahnlichen Domanen in der extrazellularen Domane, einer einzelnen membrandurchziehenden Helix, und eine geteilten intrazellularen Kinasedomane. Ligandenbindung an die extrazellulare Domane initiiert Rezeptordimerisierung, gefolgt von Kinasenaktivierung und Autophosphorylierung. Phosphorylierte Tyrosinseitenketten in der intrazellularen Domane von VEGFRen agieren als Bindestellen fur eine Vielzahl von Signalmolekulen. Neben der physiologischen Angiogenese sind VEGFR-Signalwege auch in einer Vielzahl von pathologischen Konditionen involviert, z.B. Krebs, ischamischen und Entzundungskrankheiten. Eine Reihe an Inhibitoren wurde entwickelt, von denen die meisten sich in verschiedenen Stadien von klinischen Studien befinden. Allerdings wird die Anti-Angiogenese Behandlung von Krebs oft von starken Nebenwirkungen begleitet und Krebspatienten neigen dazu eine Resistenz gegen die Behandlung zu entwickeln. Daher konnten strukturelle Studien dieses Rezeptorsystems weiter dazu beitragen den molekularen Mechanismus, der der Rezeptoraktivierung unterliegt, aufzuklaren, als auch helfen neue Medikamente zu entwickeln die benotigt werden um bestehende Therapien zu erweitern. Wahrend dieses Projektes, habe ich gezeigt, dass die Bindung der einzelnen VEGFR-1 Liganden in ahnlichen Liganden/VEGFR-1 ECD Konformationen resultierte. Die Komplexe sind neben der Dimerisierung durch den Liganden durch weitere homotypische Rezeptor/Rezeptor Interaktionen in den membrannahen Ig-homologen Domanen gepragt. Ausserdem, ist dies die erste Studie, die die thermodynamische Beteiligung individueller Ig-homologie Domanen zum Prozess der Ligandenbindung behandelt. Dabei habe ich gezeigt, dass VEGFR-1 Domane 4-7 eine positive Beteiligung am Prozess der Ligandenbindung besitzt, was durch niedrigere Affinitaten der Liganden fur VEGFR-1 D1-7 im Vergleich zur minimalen Ligandenbinde Domane gezeigt wurde. Uberraschenderweise, habe ich entdeckt dass Ig-homologie Domane 1 die PlGF-1 Bindung an VEGFR-1 D1-3 aber nicht die Bindung an D1-7 behindert. Der genaue Mechanismus, der dieses Verhalten erklaren wurde, ist jedoch unklar. In einem zweiten Projekt, zeigen wir dass Ig-homologie Domane 4 und 7 unersetzlich fur die VEGFR-2 Aktivierung sind. Innerhalb der Ig-homologie Domane 7 ist es der Loop, der β-Strang E und F verbindet, der die wichtigen Elemente fur die Rezeptoraktivierung beinhaltet. Dieser Loop interagiert mit demselben Loop in der Ig-homologie Domane 7 der zweiten Rezeptorkette im dimerisierten Komplex. Daher haben wir DARPins generiert die spezifisch die niedrigaffinen Rezeptor/Rezeptor-Interaktionen anzielen, die sich durch die Ligandenbindung bilden. Wir beschreiben einen DARPin, der Ig-homologie Domane 4 bindet und der zu einer verringerten VEGFR-2 Phosphorylierung fuhrt ohne dabei die Ligandenbindung zu storen. Dieser Inhibitor wirkt sich auch auf Abwartssignalwege zu PLCγ1 aus und inhibiert die Bildung von neuen Trieben von Endothelzellen. Diese Art von Inhibition stellt einen neuen Inhibitionsmechanismus fur VEGFR-2 dar, der komplementar zu anderen Behandlungen benutzt werden kann um die Effizienz der Anti-Angiogenese Therapie zu verbessern.