Clonage et modification du génome de Mycoplasma hominis dans la levure Saccharomyces cerevisiae

Mycoplasma hominis est un pathogene humain opportuniste responsable d’infections genitales et neo-natales. Modifier genetiquement cette bacterie est necessaire afin de comprendre les mecanismes de virulence et d’infection de ce pathogene. Il n’existe a ce jour aucun outil moleculaire efficace permettant de manipuler le genome de M. hominis, limitant les recherches sur sa pathogenicite et son metabolisme particulier reposant sur l’arginine. De nouvelles technologies rassemblees sous le terme de Biologie de Synthese (BS) ont recemment emerge, offrant des perspectives inedites pour l’etude des mycoplasmes en permettant de modifier leurs genomes a grande echelle et de produire des souches mutantes. Ces travaux menes au J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) ont montre que le genome de mycoplasmes apparentes pouvait etre clone et manipule dans la levure avant d’etre transplante dans une cellule receveuse. La levure sert d’hote d’accueil temporaire pour modifier le genome de la bacterie. Cette approche novatrice ouvre de nombreuses perspectives dans le cadre du developpement de la genomique fonctionnelle chez les mycoplasmes pour lesquels les outils genetiques efficaces sont peu nombreux. Le but de cette these a ete d’adapter pour la premiere fois certains outils de BS a M. hominis dans le but de creer des mutants deficients pour une fonction donnee. Pour cela, le genome de la souche type de M. hominis PG21 (665 kb) a ete clone dans la levure Saccharomyces cerevisiae par « Transformation-Associated Recombination cloning » (TAR-cloning). Deux clones (B3-2 et B3-4) de levure possedant le genome complet de M. hominis ont ete valides par analyse en PCR simplex, PCR multiplex et electrophorese en champs pulse (PFGE). Ces clones levures ont ensuite ete propages en milieu selectif durant 180 generations (30 passages), afin d’evaluer la stabilite du genome bacterien dans son hote. Cette experience a montre que (i) si la taille du genome de M. hominis ne variait pas au cours des premiers passages, elle diminuait progressivement a partir du dixieme passage (≈60 generations), et que (ii) les zones du genome enrichies en sequence repetees etaient preferentiellement perdues. En tenant compte de ces resultats, le genome de M. hominis a ete modifie chez le clone B3-4 par la technique « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 » (CRISPR/Cas9) lors de passages precoces. Des clones de S. cerevisiae possedant un genome de M. hominis PG21 complet delete du gene vaa, codant une proteine d’adhesion majeure, ont ete ainsi produits. La derniere etape de cette approche consistait a transplanter le genome modifie dans une cellule receveuse de M. hominis ou de Mycoplasma arthritidis, espece phylogenetiquement la plus proche de M. hominis. Aucun protocole de transformation de M. hominis n’etant disponible au debut de nos travaux, cette etape constituait un verrou majeur dans la mise en place des outils de BS chez cette espece. Ce verrou a ete en partie leve puisqu’une methode de transformation de M. hominis basee sur du polyethylene glycol (PEG) et mettant en jeu le plasposon pMT85 (plasmide contenant un transposon conferant la resistance a la tetracycline) a ete mise au point au laboratoire. Cette technique de transformation, developpee pour la souche de reference M. hominis M132 (745 kb) reste encore peu efficace ; elle est neanmoins reproductible et a permis d’obtenir des mutants d’interet de M. hominis. Le transformant n°28-2 a, ainsi, ete mute dans le gene Mhom132_2390, codant le precurseur de la proteine P75, une adhesine putative de M. hominis. Le sequencage des genomes complets d’autres transformants a revele l’insertion de multiples copies du transposon et la presence d’evenements de duplication et d’inversion de larges fragments d’ADN dans au moins deux genomes de M. hominis.