Avaliação da metaciclogênese in vitro de Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonensis

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), causada por protozoarios Leishmania, acomete a pele e/ou as mucosas nasal e orofaringea. Durante o ciclo de transmissao, as formas promastigotas prociclicas crescem no intestino do inseto vetor e diferenciam-se em formas promastigotas metaciclicas infectantes, por um processo chamado de metaciclogenese, que tambem ocorre em culturas axenicas in vitro. O objetivo deste estudo foi avaliar a metaciclogenese in vitro de isolados L. (Viannia) braziliensis e L. (L.) amazonensis, provenientes de pacientes com diferentes formas clinicas de LTA, usando diferentes metodologias, e a capacidade destes isolados em infectar macrofagos humanos. As curvas de crescimento (L. (V.) braziliensis: IMG3, PPS6m, M2903 e L. (L.) amazonensis: MAB6 e PH8) foram realizadas em meio Grace e apos 2, 6 e 10 dias de cultivo, a quantidade de formas metaciclicas foi avaliada por meio de morfometria, ensaio de selecao com a lectina de Bauhinia purpurea (BPL, para L. (V.) braziliensis) ou anticorpo 3A1-La (para L. (L.) amazonensis), citometria de fluxo e ensaio de resistencia ao Complemento. Macrofagos humanos derivados de monocitos de doadores sadios, ativados ou nao com interferon gama (IFN e lipopolissacarideo (LPS), foram infectados com os parasitos de diferentes dias de cultivo ou formas metaciclicas selecionadas com BPL/3A1-La (1:1, parasito:macrofago) por 24 ou 72 h. Os perfis das curvas de crescimento in vitro foram similares para todos os isolados. Parasitos da fase estacionaria do crescimento (6, 10 dias) apresentaram alteracoes morfologicas, como a diminuicao do tamanho do corpo celular e um aumento do comprimento do flagelo, em relacao aos parasitos do 2o dia. As formas promastigotas L. (L.) amazonensis do 6o e do 10o dia de cultura apresentaram maiores comprimentos do corpo celular e do flagelo do que os parasitos L. (V.) braziliensis. Na fase estacionaria houve um aumento significante da porcentagem de formas metaciclicas detectadas pelas quatro tecnicas (M2903: 71-86%; IMG3: 41-85%; PPS6m: 39-76%; PH8: 38-69% e MAB6: 47-84%; 6o dia, valores min e max). Apesar das quatro tecnicas mostrarem um similar perfil de metaciclogenese para todos os isolados avaliados, as densidades de formas metaciclicas variaram conforme a tecnica utilizada, dependendo do dia de cultura. A tecnica de selecao com BPL/3A1-La foi a que detectou maiores frequencias de formas metaciclicas para todos os isolados no 6o dia. A metaciclogenese dos isolados foi confirmada nos ensaios de infeccao in vitro dos macrofagos, mostrando um aumento significante no indice de infeccao com parasitos do 6o e 10o dia em relacao aqueles de 2o dia (24 ou 72 h). Nao foram atestadas diferencas entre os indices de infeccao de macrofagos incubados com parasitos totais ou formas metaciclicas selecionadas do 6o dia. Os isolados mostraram diferentes perfis de suscetibilidade aos mecanismos microbicidas dos macrofagos. As cepas M2903 e PH8 foram mais suscetiveis, enquanto o isolado MAB6, mais resistente. Como as quantidades de formas metaciclicas nas culturas, considerando a tecnica de selecao BPL/3A1-La, foram elevadas para todos os isolados, os resultados sugerem que a resistencia/suscetibilidade aos mecanismos de controle dos macrofagos seja uma caracteristica intrinseca do isolado. Avaliar a metaciclogenese de isolados clinicos, simultaneamente a capacidade dos parasitos em infectar macrofagos humanos, define as condicoes necessarias para a obtencao de parasitos eficientes em estabelecer uma infeccao, para uma adequada avaliacao da patogenia e da resposta imune natural na leishmaniose.