Ensayos de producción, caracterización enzimática y obtención de expolisacáridos de hongos comestibles lignocelulolíticos patagónicos en sustratos provenientes de desechos herbáceos, agrícolas y forestales

Muchos de los hongos lignoceluloliticos de los bosques andino patagonicos poseen un alto valor culinario y, ademas de ser comestibles y nutritivos, presentan tambien propiedades medicinales; sin embargo, casi no han sido tenidos en cuenta en la Argentina debido a las dificultades para su cultivo y produccion. Los hongos causantes de pudricion blanca son los unicos organismos capaces de degradar la lignina hasta su completa mineralizacion, lo cual hace de este grupo el unico que posee todos los grupos de enzimas necesarios para degradar todos los componentes de la madera, siendo estas de interes para aplicaciones biotecnologicas. Los hongos de pudricion castana remueven selectivamente celulosa y hemicelulosa de la pared celular, sin alterar mayormente la lignina. La explotacion forestal de la region andino patagonica genera desechos de aserrios en gran proporcion, en su mayoria de forestaciones de Pinus sp. y de maderas del bosque nativo, los cuales podrian ser aprovechados por estos organismos. Esta tesis aborda diferentes objetivos de estudio centrandose en los hongos comestibles degradadores de la madera y nativos de la Patagonia andina, siendo estos Pleurotus ostreatus, Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina antarctica y Fistulina endoxantha. Los mismos fueron coleccionados durante los otonos de 2013 y 2014 en bosques de Nothofagus dombeyii (coihue), Nothofagus obliqua (Roble Pellin) y Araucaria araucana, luego aislados en medios de cultivo tradicionales y, finalmente, preservados como cultivos puros para el trabajo de laboratorio. Se realizaron ensayos de crecimiento en placa de Petri a diferentes temperaturas, resultando la temperatura optima de crecimiento miceliar para todas las cepas entre 20-23 oC. Sin embargo, las tasas de crecimiento de Grifola (0,20 – 0,30 cm/dia) y Fistulina (0,07 – 0,10 cm/dia) fueron sumamente menores respecto a Pleurotus (0,8 – 1,0 cm/dia). Grifola gargal y G. sordulenta presentaron actividad lacasa y celulasa, mientras que P. ostreatus presento actividad lacasa, MnP y celulasa. En ninguna cepa se detecto actividad LiP positiva. La decoloracion de diferentes colorantes textiles (RBBR -Azul brillante de remazol R-, Xilidina, Verde de malaquita y Azure B) fue utilizada para corroborar la actividad enzimatica. Pleurotus ostreatus decoloro todos ellos en las dos concetraciones ensayadas (10 y 50 μM), Grifola gargal y G. sordulenta mostraron degradacion efectiva de todos los colorantes a 10 μM. Fistulina spp. degradaron ligeramente RBBR, xilidina y verde de malaquita en 10 μM. A partir de medios de cultivo liquido se realizo la cuantificacion de la actividad enzimatica. Grifola gargal presento mayor actividad lacasa, con el maximo al dia 45 en medio GPY, siendo de 0,100 UE/ml. El cultivo liquido de P. ostreatus mostro el maximo de actividad entre el dia 20 y 25, alcanzando 0,150 UE/ml. Por otro lado, se evaluo cualitativamente la degradacion de diferentes especies forestales mediante tecnicas de histoquimica. Con estos datos se pudo seleccionar a la lenga como el mejor sustrato para el cultivo en el caso de las especies de Grifola y Fistulina. No se observaron diferencias respecto a los sustratos usados por P. ostreatus. Gracias a la abundancia de desechos agricola-forestales de la region, se realizaron formulaciones para la produccion de las especies comestibles. El enfoque principal se realizo con las cepas de P. ostreatus que crecen naturalmente en Araucaria con el fin de aprovechar su adaptacion a los sustratos resinosos y generar una produccion sobre residuos de las plantaciones, aserraderos y/o plantas de procesamiento de Pinus sp. , abundante por las forestaciones zonales. Se suplemento el material con residuos de las industrias vitivinicola y cervecera regionales. Las eficiencias biologicas (EB) obtenidas en virutas de pino resultaron superiores por parte de las cepas nativas respecto a la cepa comercial utilizada. Los otros sustratos ensayados fueron virutas de lenga, alamo y paja gramon, en los cuales la cepa comercial arrojo mayores EB. Para evaluar el crecimiento y la actividad lacasa frente a compuestos volatiles presentes en las resinas se cuantifico la biomasa fungica del cultivo liquido y el diametro de la colonia. El crecimiento fue menor en los tratamientos con limonelo y δ-3-careno, y practicamente nulo con 4-carvomentenol, citronelol, y ρ-cimen-8-ol respecto al control (Medio MEA). Por otro lado, la actividad ligninolitica lacasa fue inhibida en todos los tratamientos. Estos datos sustentan la baja produccion en los sustratos resinosos como las virutas de Pinus sp. Para complementar esta informacion y comprender la capacidad degradativa natural de P. ostreatus en A. araucana, se evaluo su capacidad de degradacion de los lignanos presentes en la celulas vegetales, revelando una alta degradacion de la mayoria de los compuestos, a excepcion de los dos mas complejos y recalcitrantes, como son el eudesmin y el secoisolariciresinol-4-metil eter-9´-acetato. El maximo de actividad lacasa en el medio de cultivo solido a base de A. araucana fue de 0,111 ± 0,067 U/gps y el de MnP de 0,220 ± 0,109 U/gps. Se detectaron diferentes isoenzimas de lacasa con peso molecular de entre 35-41 KDa y 75-92 KDa. Los problemas productivos modificaron el foco de la investigacion hacia el sustrato colonizado por las especies de Grifola como fuente de compuestos de interes. La colonizacion de los sustratos utilizados (lenga, sauce y pino) fue optima y estos cultivos se utilizaron para el analisis de la capacidad inmunomoduladora en la linea de macrofagos J774A.1 y de citotoxicidad con lineas celulares de cancer de mama (MCF-7), osteosarcoma (SAOS-2) y cancer de colon (HCT116). En cuanto a los esteroles obtenidos el ergosterol resulto el de mayor importancia. Los acidos grasos que se detectaron fueron acido palmitico, acido linoleico, acido oleico, acido estearico, acido araquidico y acido behenico. Los polisacaridos de G. gargal sobre madera de sauce presentaron un aumento en el nivel de especies reactivas de oxigeno (ROS) y de oxido nitrico (NO) en una concentracion de 50 μg. mL−1. Los efectos citotoxicos mas relevantes se obtuvieron con los extractos del micelio de G. gargal y del cultivo en las diferentes maderas sobre la linea de cancer de colon HCT116. Se realizaron ensayos especificos de degradacion del azure B con los hongos de pudricion castana Fistulina antarctica y F. endoxantha por lo observado en las placas con medio agarizado. Se observo mayor decoloracion por parte del micelio, obteniendose un maximo del 53,65% a las 96 horas.