Isolation, oxidative folding and ion-channel modulation of plant cyclotides

Cyclotide sind cyclische Pflanzenpeptide welche im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sind. Sie besitzen eine charakteristische 3D Struktur welche durch drei hoch konservierte disulfid Brucken hervorgerufen wird. Diese drei disulfid Brucken werden auch „cyclic cystine – knot (CCK)“ genannt und verleihen den Cyclotiden besondere Stabilitat. Im Vergleich zu linearen Peptiden sind Sie zum Beispiel stabil gegen hohe Temperaturen und proteolytischen Verdau welche in einer guten oralen Bioverfugbarkeit resultieren. Typischer weise bestehen Sie aus 28 – 31 Aminosauren und haben ein Molekulargewicht zwischen 2500 – 4000 Da. Weiters sind Sie eher hydrophob wodurch sie an einer RP-HPLC Saule relativ spat eluieren. Grundsatzlich unterscheidet man Cyclotide in 2 Untergruppen, Bracelets Cyclotide und Mobius Cyclotide. Rund 2/3 der bekannten Cyclotide gehoren zur Untergruppe der Bracelets. Entdeckt wurden Cyclotide vor ca. 40 Jahren durch ethnobotanische Untersuchungen an der Pflanze Oldenlandia affinis, welche im Kongo von Eingeborenen benutzt wurde um Wehen einzuleiten. Als Wirkstoff in dieser Pflanze wurde das cyclische Peptid kalata B1 identifiziert, welches das Erste und bis heute am Meisten untersuchte Cyclotid ist. Bis jetzt wurden Cyclotide in 36 Spezies in den Violaceae, Rubiaceae, Apocynaceae, Cucurbitaceae und Fabaceae entdeckt. Viele dieser Peptide zeichnen sich durch ihre Bioaktivitat aus, wie z.B. : anti-HIV, anticancer, insektizid, antimikrobiell, haemolytisch und immunsuppressive. Die Gewinnung dieser Peptide ist bis jetzt durch die Zeit und arbeitsintensive Isolierung und Aufreinigung aus den entsprechenden Pflanzen limitiert. Obwohl es auch moglich ist, Cyclotide chemisch zu synthetisieren, ist diese Synthese durch die anschliesende Faltung in die native Struktur limitiert. Wahrend die oxidative Faltung von Mobius Cyclotiden schon sehr fortgeschritten ist und man eine sehr hohe Ausbeute (>90%) an nativem Peptide erreicht, ist die Faltung von Bracelet Cyclotiden sehr komplex und schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Faltungsbedingungen fur die beiden Bracelet Cyclotide cycloviolacin O2 und vigno 10 sowie fur das Mobius Cyclotide kalata B1 Mutante [T20K]kalata B1 zu optimieren. Obwohl verschiedene Faltungsbedingungen analysiert wurden, ist es nicht gelungen cO2 und vigno 10 mit zufriedenstellenden Ausbeuten zu falten. Die hochste erzielte Ausbeute fur cO2 betrug ~27% natives Peptide und fur vigno 10 ~4%. Das Mobius Cyclotide [T20K]kalata B1 konnte allerdings mit einer Ausbeute von 95% erfolgreich gefalten werden. Die kalata B1 Mutante [T20K]kalata B1 zeigte in vorangegangenen Studien eine immunsuppressive Wirkung, der genaue Mechanismus der dieser Wirkung zu Grunde liegt ist bis heute unbekannt (Grundemann et al., 2013). Eine weitere Studie fand heraus, dass ein strukturell ahnliches Peptid, welches auch eine immunsuppressive Wirkung aufweist, den Spannungs-regulierten Kaliumkanal Kv1.3 blockiert (Gurrola et al., 2012). Dieser spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung und dadurch der Proliferation von T – Lymphozyten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen ob das immunsuppressive Cyclotide [T20K]kalata B1 den Kaliumkanal Kv1.3 inhibieren kann und dadurch die Proliferation der T – Lymphozyten inhibiert. Mehrere Messungen haben aber leider ergeben, dass dieses Peptid nicht mit dem Kv1.3 interagiert. Viel mehr hat sich gezeigt, dass es ab einer Konzentration von 4µM zelltoxisch wirkt und zu einer langsamen Auflosung der Zellmembran fuhrt.