Development of In Situ Hybridization with Tyramide Signal Amplification (ISH with TSA) for Human Papillomavirus (HPV) Detection Using Biotin Labeled Universal Oligonucleotide Probe (BLOP)

To detect HPV DNA and evaluate the HPV infected cells, In situ Hybridization with Tyramide signal amplification using a universal oligonucleotide probe was developed. The probe was designed by bioinformatics analysis and labeled with biotin by Biotin Universal Linkage System . The biotin labeled oligonucleotide probe was evaluated by dot blot hybridization using plasmid DNA templates extracted from 11 specific HPV clones. In situ Hybridization with Tyramide signal amplification was performed on Caski cell line. 3,3. -Diaminobenzidine tetrahydrochloide and Aminoethyl carbazole were used as chromogenic substrates in detection system. The results showed that the designed universal oligonucleotide probe contained 50 bps of late gene and had ? 90% specific homology to all high risk HPV. Biotin labeled oligonucleotide probe could specifically identify all HPV DNA extracted from specific HPV clones by dot blot hybridization. For HPV DNA detection and evaluation of HPV infected cells, biotin labeled oligonucleotide probe was used in In situ Hybridization with Tyramide signal amplification that performed in HPV positive cell lines. HPV DNA was detected in the nuclei of Caski cells which demonstrated single dots or punctuate signal representing integration at multiple sites. The background decreased when Aminoethyl carbazole was used as a substrate. These results suggest that biotin labeled oligonucleotide probe can be used to identify HPV DNA and evaluate the physical status of HPV in the infected cells by In situ Hybridization with Tyramide signal amplification. This biotin labeled oligonucleotide probe will be a universal probe that further applied to identify several HPV physical status in infected cells. การศกษานทำการพฒนาวธการตรวจหา HPV DNA ในเซลลตดเชอ HPV โดยสรางโพรบหรอสายนวคลโอไทดขนาด 50 นวคลโอไทดเพอใชในการตรวจหาเชอฮวแมนแพบพวโลมาไวรสกวา 40 ชนดทกอใหเกดการตดเชอทบรเวณอวยวะสบพนธโดยวธ In situ Hybridization with Tyramide signal amplification โพรบจะถกตดฉลากดวยสาร Biotinโดยวธ Universal Linkage System หรอเรยก biotin labeled oligonucleotide probe และเพมความไวในการตรวจโดยใชสาร tyramide ในการทดลองครงนไดทำการเปรยบเทยบ substrate 2 ชนดเพอใชเปนสารกอเกดสญญาณซงทำใหเกดตะกอนสทละลายนำเพอใหตรวจพบได คอ substrate 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide ซงใหตะกอนสนำตาลและ substrate Aminoethyl carbazole ซงใหตะกอนสแดง และสามารถอานผลไดโดยใชกลองจลทรรศนแบบ standard bright field microscope จากการทดสอบความจำเพาะของโพรบกบพลาสมดของเชอ HPV 11 ชนดพบวาโพรบสามารถทำปฏกรยากบพลาสมดทง 11 ชนดโดยวธ dot blot hybridization และเมอนำโพรบมาทำการตรวจหา HPV DNA โดยวธ In situ Hybridization with Tyramide signal amplification บนเซลลเพาะเลยงมะเรงปากมดลก Caski ทมการตดเชอ HPV type 16 พบวาเกดจดขนในนวเคลยสโดยพบจดเดยวๆหลายจด โดยจะเกดเปนตะกอนสแดงเมอใช Aminoethyl carbazole และนำตาลเมอใช 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide ใหเหนบนเซลลทศกษาซงจดทเกดขนเปนลกษณะทแสดงวาเชอมการแทรกจโนมของเชอเขาสจโนมของคนคอม physical status แบบ integrated form การใช Aminoethyl carbazole เปน substrate จะม background นอยกวาการใช 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloide จากผลการทดลองนแสดงวาโพรบขนาด 50 นวคลโอไทดทถกสรางขนมาสามารถตรวจพบ HPV DNA ในเซลลตดเชอและวนจฉยภาวะหรอ physical status ของเชอไดโดยใชวธ In situ Hybridization with Tyramide signal amplification ได ในการศกษานจงสรปวา biotin labeled oligonucleotide probe นาจะเปน universal probe ทสามารถนำไปตรวจหา HPV DNA อยางไมจำเพาะชนด รวมทงภาวะการตดเชอในเซลลตดเชอได