Multi‐seasonal field release and spermatization trials of transgenic hypovirulent strains of Cryphonectria parasitica containing cDNA copies of hypovirus CHV1‐EP713

Summary Three indigenous field strains of the chestnut blight fungus, Cryphonectria parasitica collected in 1996 from a test site in the Meshomasic State Forest, Connecticut, USA, were engineered to contain a chromosomally integrated full-length infectious cDNA copy of the severe, virulence-attenuating hypovirus CHV1-EP713. These transgenic hypovirulent strains were introduced into the test site after it had been clear-cut, as sprayed conidia in multiple applications over 4 years, beginning in 1997. Evidence was obtained for cytoplasmic transmission of cDNA-derived hypovirus RNA and for recovery of transgenic strains from canker tissue of the spray-treated trees. However, there was no indication of spread of transgenic strains or cDNA-derived viral RNA to the control plot or outside the treatment plot. A single transgenic C. parasitica isolate was identified from a total of 156 isolates recovered from 1330 insects representing five insect orders. Only 2.6% of the 1082 C. parasitica bark isolates recovered during the course of this study were vegetatively compatible with the untransformed input strains. Transgenic ascospore progeny were produced by 40% of the perithecia collected in 1999 and by only 7.3% of the perithecia collected in 2000. A concurrent field release study performed in the Monongahela National Forest in West Virginia in 1998 and 1999 with transgenic hypovirulent strains constructed with the same CHV1-EP713 cDNA-containing plasmid identified seasonal application dates and delivery methods that resulted in very high levels of transgenic ascospore production. Results of the combined field release studies are discussed in terms of requirements for improved formulations and delivery methods and the importance of balancing ecological fitness and virulence attenuation. Resume Trois souches indigenes de l'agent du chancre du châtaignier Cryphonectria parasitica collectees en 1996 dans un site experimental de la foret d'Etat de Meshomasic, Connecticut, USA, ont ete transformees en integrant au niveau chromosomique une copie cDNA infectieuse complete de l'hypovirus CHV1-EP713, qui attenue fortement la virulence du champignon. Ces souches hypovirulentes transgeniques ont ete introduites dans le site experimental apres une coupe a blanc, par plusieurs pulverisations de conidies durant 4 ans a partir de 1997. La transmission cytoplasmique de l'ARN de l'hypovirus derive du cDNA a ete mise en evidence et les souches transgeniques ont pu etre reisolees des chancres des arbres traites. Toutefois, aucune indication n'a pu etre obtenue d'une dissemination des souches transgeniques ou d'ARN de l'hypovirus derive du cDNA dans la parcelle temoin ou en dehors de la parcelle traitee. Un seul isolat transgenique de C. parasitica a ete observe sur un total de 156 isolats obtenus a partir de 1330 insectes appartenant a cinq ordres differents. Seuls 2.6% des 1082 isolats de C. parasitica obtenus a partir d’ecorce pendant toute la duree de l’etude etaient vegetativement compatibles avec les souches non transformees introduites. Des descendances d'ascospores transgeniques ont ete obtenues pour 40% des peritheces recoltes en 1999 et seulement 7.3% des peritheces collectes en 2000. Une etude parallele de traitements au champ dans la foret nationale de Monongahela, West Virginia, en 1998 et 1999 avec des souches transgeniques hypovirulentes construites avec le meme plasmide contenant le cDNA de CHV1-EP713 a permis d'identifier des dates et methodes d'application conduisant a de tres forts niveaux de production d'ascospores transgeniques. Les resultats de ces deux etudes sont discutes en terme d'amelioration des formulations et des methodes d'application et de l'importance du compromis entre fitness ecologique et attenuation de la virulence. Zusammenfassung Drei im Jahre 1996 gesammelte Isolate von Cryphonectria parasitica aus dem Meshomasic State Forest, Connecticut, USA, wurden gentechnologisch so verandert, dass sie eine chromosomal integrierte vollstandige cDNA-Kopie des die Virulenz stark abschwachenden Hypovirus CHV1-EP713 enthielten. Diese transgenen hypovirulenten Stamme wurden am Ort der Isolierung freigesetzt. Die Freisetzung erfolgte nach einem Kahlschlag im Jahr 1997 durch mehrfaches Verspruhen einer Konidiensuspension uber 4 Jahre. Die zytoplasmatische Ubertragung der von der cDNA transkribierten Hypovirus-RNA wurde nachgewiesen und transgene Stamme konnten aus Rindenkrebsen an den behandelten Baumen reisoliert werden. Es wurde jedoch keine Ausbreitung von transgenen Stammen oder transkribierter Virus-RNA auf die Kontrollflache oder die Umgebung beobachtet. Von 1330 Insekten aus 5 verschiedenen Ordnungen wurden 156 Isolate von C. parasitica gewonnen, darunter befand sich ein einziges transgenes Isolat. Nur 2,6 % der im Verlauf dieser Untersuchung von der Rinde isolierten C. parasitica - Stamme (n = 1082) waren mit den nicht transformierten Ausgangsstammen vegetativ kompatibel. Transgene Ascosporen wurden im Jahr 1999 von 40 % der Perithezien gebildet, im Jahr 2000 aber nur noch von 7,3 %. Ein gleichzeitiger Freisetzungsversuch im Monongahela National Forest in West Virginia in den Jahren 1998 und 1999 mit transgenen Stammen, die mit dem gleichen CHV1-EP713 - cDNA-haltigen Plasmid konstruiert worden waren, lieferte Daten zur Optimierung der Inokulationsmethode, so dass eine hohe Dichte transgener Ascosporen erzeugt werden konnte. Die Ergebnisse beider Experimente werden im Hinblick auf die Verbesserung der Formulierung und der Applikation sowie auf die Bedeutung des Gleichgewichts zwischen der okologischen Fitness des Pilzes und der Verminderung der Virulenz diskutiert.