Genetic detoxification and adjuvant-activity retention of Escherichia coli enterotoxin LT

Intensive effort has been invested in the search for new effective vaccines that can be conveniently administered, with minimal handling of birds. Heat-labile enterotoxin (LT) of Escherichia coli H10407 is known as a powerful adjuvant for injection and oral administration. However, to use the toxin as an immunostimulator in animals, its toxicity must be neutralized. To this aim, we modified the LT gene by changing two amino acids (threonine 50 and valine 53) of the A subunit to proline. The modified non-toxic LT gene (nLT) was cloned and expressed in E. coli as a soluble protein. The protein was efficiently purified, reaching levels of about 20 mg active hexameric nLT per litre of induced culture. The mutated protein, nLT, and the wild-type protein (wtLT) were administered orally to chickens. Those treated with the wtLT exhibited diarrhoea, whereas chickens treated with the nLT showed no signs of disease compared with untreated birds. The new non-toxic, purified nLT stimulated antibody production in birds treated by injection or by oral administration. A field trial with layers that included a series of injections of Bovine Serum Albumin mixed with nLT showed this modified LT's ability to act as an adjuvant for the antigen mixed with it. This study demonstrates the efficient expression and purification of LT, in which toxicity was neutralized by genetic modification. Such an approach will enable the use of a non-toxic LT molecule with a modified A subunit by the poultry industry, to enhance immune responses against antigens co-vaccinated with it. Détoxification génétique et conservation de l'activité adjuvante de l'entérotoxine LT d'Escherichia coli De gros efforts ont été investis dans la recherche de nouveaux vaccins efficaces qui peuvent être administrés d'une manière commode, avec une manipulation minimale des animaux. L'entérotoxine labile à la chaleur d'Escherichia coli H10407 est connue comme étant un adjuvant puissant pour l'injection et l'administration orale. Cependant, pour utiliser la toxine comme un immunostimulant chez l'animal, sa toxicité doit être neutralisée. Dans ce but, nous avons modifié le gène LT en changeant en proline deux acides aminés (thréonine 50 et valine 53) de la sous unité A. Le gène LT modifié non toxique (nTL) a été cloné et exprimé dans E. coli comme une protéine soluble. La protéine a été efficacement purifiée, atteignant des niveaux de d'environ 20 mg de nLT héxamérique par litre de culture induite. La protéine mutée, nLT, et la protéine de type sauvage (wtLT) ont été administrées par voie orale à des poulets. Ceux traités avec la wtLT ont présenté de la diarrhée, alors que les poulets traités avec la nLT n'ont présenté aucun signe de la maladie, comparés aux poulets non traités. La nouvelle nLT purifiée non toxique a stimulé la production d'anticorps chez les poulets traités par injection ou par administration orale. Un essai terrain avec des pondeuses qui incluait des séries d'injections de BSA mélangée à la nLT a montré la capacité de cette LT modifiée à jouer le rôle d'adjuvant pour l'antigène mélangé avec elle. Cette étude montre l'efficacité de l'expression et de la purification de la LT dont la toxicité a été neutralisée par modification génétique. Une telle approche doit permettre l'utilisation, par l'industrie avicole, d'une molécule LT non toxique avec une sous unité A modifiée, pour améliorer les réponses immunitaires contre les antigènes qui entrent avec elle dans la composition des vaccins. Genetische Entgiftung des Escherichia coli-Enterotoxins LT unter Aufrechterhaltung der Adjuvansaktivität In die Suche nach neuen effektiven Vakzinen, die bequem und mit minimaler Handhabung der Vögel verabreicht werden können, wurden intensive Bemühungen gesteckt. Das hitzelabile Enterotoxin (LT) des Escherichia coli-Stamms H10407 ist als ein starkes Adjuvans der Injektion und der oralen Verabreichung bekannt. Für die Verwendung des Toxins als Immunstimulator in Tieren muss seine Toxizität jedoch neutralisiert werden. Zu diesem Zweck modifizierten wir das LT-Gen durch den Austausch von zwei Aminosäuren (Threonin 50 und Valin 53) der Untereinheit A gegen Prolin. Das veränderte nicht-toxische LT-Gen (nLT) wurde kloniert und in E. coli als lösliches Protein exprimiert. Das Protein wurde hochgereinigt, wobei in der induzierten Kultur Mengen von 20 mg des aktiven hexameren nLT pro Liter erreicht wurden. Das mutierte (nLT) und das Wildtyp-Protein (wtLT) wurden oral an Hühner verabreicht. Diejenigen, die das wtLT erhalten hatten, bekamen Diarrhoe, während die Hühner, die mit dem nLT behandelt worden waren, im Vergleich zu den unbehandelten Tieren keine Krankheitssymptome zeigten. Das neue nicht-toxische, gereinigte nLT stimulierte nach Injektion oder oraler Gabe in den Tieren eine Antikörperproduktion. In einem Feldversuch mit Legehennen konnte nach einer Serie von Injektionen von BSA gemischt mit nLT die Fähigkeit dieses modifizierten LTs nachgewiesen werden, in einer Mischung mit diesem Antigen als Adjuvans zu wirken. Diese Studie zeigt die effiziente Exprimierung und Reinigung von LT, dessen Toxizität durch genetische Modifikation neutralisiert wurde. Diese Methode ermöglicht in der Geflügelindustrie die Verwendung eines durch die Modifizierung der Untereinheit A nicht toxischen LT-Moleküls, um als Bestandteil der Vakzine die Immunantworten gegen Antigene zu verstärken. Detoxificación genética y retención de la actividad adyuvante de la enterotoxina LT de Escherichia coli Se han invertido grandes esfuerzos en la búsqueda de nuevas vacunas efectivas que puedan ser administradas convenientemente, con el mínimo manejo de las aves. La enterotoxina termolábil (LT) de Escherichia coli H10407 es conocida como un potente adyuvante para la administración oral y parenteral. Sin embargo, para usar esta toxina como inmunoestimulador en animales, su toxicidad debe ser neutralizada. Con este objetivo, modificamos el gen LT mediante la sustitución de dos aminoácidos (treonina 50 y valina 53) de la subunidad A por prolina. Se clonó el gen modificado LT no-tóxico (nLT) y se expresó en E. coli como una proteína soluble. La proteína se purificó eficientemente, llegando a niveles de 20 mg de hexámero nLT activo por litro de cultivo inducido. La proteína mutada, nlT, y la proteína de tipo salvaje se administraron oralmente a pollos. Aquéllos tratados con la wtLT mostraron diarrea, mientras que los pollos tratados con la nLT no mostraron signos de enfermedad, en comparación con las aves no tratadas. La nueva nLT no tóxica purificada estimuló la producción de anticuerpos en las aves tratadas mediante vía oral o parenteral. Un ensayo de campo en ponedoras que incluyó una serie de inyecciones de BSA en combinación con nLT mostraron esta capacidad de la LT modificada para actuar como adyuvante para el antígeno en combinación con éste. Este estudio demuestra la expresión y purificación eficientes de LT, en la cual se había neutralizado su toxicidad mediante modificación genética. Este tipo de enfoque permitirá el uso de la molécula de LT no-tóxica con la subunidad A modificada en la industria avícola, para mejorar la respuesta inmune frente a los antígenos combinados en la vacuna.