Molecular identification and life cycle of the giant ectosymbiont of Eubostrichus dianaea

In dieser Arbeit wurden die riesigen epibiotischen Bakterien (Eds), die auf dem marinen Nematoden E. dianaea leben, molekular identifiziert. Nach Klonierung und Sequenzierung zeigte die phylogenetische Analyse der Eds 16S rRNA-Gene, dass Eds in eine Gruppe mit anderen Schwefel-oxidierenden Bakterien (SOB) fallt. Im Besonderen gehort Eds zum MONTS Cluster, welches auch andere Eubostrichus-, Stilbonematid- und Oligochaetenassoziierte SOB beinhaltet. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte gezeigt werden, dass die gefundenen SOB 16S rRNA-Gene aus der Gen-Bibliothek zu Eds gehoren. Weiters zeigten FISH-Versuche von dissoziierten ektosymbiontischen Zellen, dass nicht nur alle uberdimensionalen filamentosen Bakterien auf der Nematodenkutikula, sondern auch die kleineren Bakterien, unabhangig von ihrer Grose und Morphologie, auch Eds sind. Die heterogene 16S rRNA Gen-Bibliothek enthielt auch Sequenzen von Schwefelreduzierenden Bakterien (SRB), die jedoch mit FISH zu keinem E. dianaea assoziierten Bakterium zugeteilt werden konnten. Die Diskrepanz zwischen der Heterogenitat unserer 16S rRNA Gen-Bibliothek und der augenscheinlichen phylogenetischen Homogenitat des bakteriellen Mantels kann (1) dadurch erklart werden, dass nicht-Eds Bakterien zu selten sind um sie mit FISH nachzuweisen und (2), dass nicht-Eds nicht unbedingt mit der Kutikula assoziiert sind, sondern auch mit anderen Korperregionen wie z.B. : dem Darm. Zusatzlich scheint Eds auf dem Nematoden zu wachsen, da auch kleine Zellen mit der Eds-Sonde ein Fluoreszenzsignal zeigten. Ein weiterer Anhaltspunkt dafur ist die Prasenz von multiplen Zellkernen (Polyploidie). In anderen Organismen wie Rhizobien wurde gezeigt, dass die Polyploidie durch Endoreduplikation entsteht. Diese wird durch den Wirt sekretierte Proteine induziert, was auch hier der Fall sein konnte. Weitere Anstrengungen zur Erforschung von Nematod-sekretierten Peptiden und anderen Molekulen sollten angestellt werden, da diese moglicherweise die Cytokinese-Inhibierung/ Endoreduplikation vermitteln konnten. Um auf die zweite Frage einzugehen, ob sich Eds teilen, wurde zuerst PCR mit FtsZspezifischen Primern mit genomische DNA von E. dianaea durchgefuhrt. Nachdem das Ftsz-Gen in der DNA nachgewiesen werden konnte, wurde die Expression dieses Gen mittels Western blot mit monoklonalen Maus Anti-Ftsz Antikorpern in Nematoden-extrakten getestet. Da das FtsZ-Gen exprimiert wird, haben wir Immunfluoreszenzuntersuchungen mit FtsZ-Antikorpern durchgefuhrt, um das Protein zu visualisieren und lokalisieren. Die Immunfluoreszenzuntersuchungen zeigten, dass sich Eds durch binare Teilung vermehrt. Es konnten vier verschiedene Stadien des FtsZ-Signals gezeigt werden: (0) nicht nachweisbares Signal; (1) gepunktet, diffus; (2) gepunktet, konzentriert und (3) ringformige Struktur in etwa in der Zellmitte. Nur ein kleiner Teil der filamentosen Bakterien scheinen sich zu teilen, in etwa 10% der Eds-Population. In nicht-teilenden Eds befanden sich multiple Nucleoide in der Mitte der Zelle. In sich teilenden Filamenten war die DNA verdichtet und teilte sich in zwei bestimmte Zonen auf. Diese DNA-Verdichtung in getrennte Nucleoide konnte die DNA Segregation vor der Positionierung des FtsZ-Rings und der binaren Teilung erleichtern. Immunfluoreszenzuntersuchungen mit MreB-Antikorpern zeigten eine diffuse und gepunktete Verteilung des MreB Proteins durchgehend in der ganzen Zellmembran der filamentosen Bakterien. Das weist daraufhin, dass die Zellwande von Eds gleichmasig entlang ihrer Langsachse, und nicht polar, wachsen. Um einen naheren Einblick in die Zellteilung von Eds und die Positionierung des Z-Rings zu erhalten, sollten noch weiter Studien an anderen bei der Zellteilung beteiligten Proteinen durchgefuhrt werden.