Sampling of tissues using picosencond infrared laser (PIRL) for redox proteomics

Oxidative post-translational modifications (Ox-PTMs) including protein oxidation are associated with regulation of different cellular functions as well as disease mechanisms such as cancer, diabetes and neurodegenerative diseases. Recent studies showed that methionine oxidation plays a crucial role in various physiological and pathophysiological contexts. Therefore, new advances in redox proteomics tools will provide a better understanding of different disease mechanisms such as cancer. Here, we present a novel, ultrafast and soft technology for cold vaporization of cell and tissue through desorption by impulsive vibrational excitation (DIVE) of intramolecular vibrational states of intracellular water molecules within picoseconds range using a picosecond-infrared-laser (PIRL), for the investigation of redox proteome involved in either physiological or pathophysiological processes. For the comparison of the PIRL-DIVE and the classical homogenization method, three different rat pancreases as well as three different human tonsils were cut in two comparable pieces each and then underwent mechanical and PIRL-DIVE homogenization. After tryptic digestion, the samples were analyzed by LC-MS/MS. In order to compare the influence of the homogenization method (classical and PIRL homogenization) on the extent of protein oxidation, rat pancreas and human tonsil tissues were homogenized by both methods and the degree of methionine oxidation determined for pairs of methionine-containing peptides identified in both data sets. After the comparison of pairs of peptides in each tissue and classifying them in two groups (1 - methionine oxidation higher in the classically homogenized sample and 2 - methionine oxidation higher in the PIRL homogenized sample), it was shown that in rat pancreas 1, 2 and 3, the percentage of methionine-containing peptides in group 1 was 92.83%, 57.85% and 52.41% respectively. In human tonsil 1, 2 and 3, the percentage of methionine containing peptides in group 1 was 80.80%, 42.41% and 50.63% respectively. By comparing pairs in different tissues and different biological replicates, it was shown that by using PIRL-DIVE there was a case in each tissue model gives less oxidation compared to conventional approaches in the field of redox proteomics. This can suggest that PIRL mechanism itself does not generate oxidation. This technology can also be adapted to detect other oxidative PTMs such as cysteine oxidation, protein carbonylation. Oxidative post-translationale Modifikationen (Ox-PTMs) von Proteinen spielen eine Rolle bei der Regulation unterschiedlicher zellularer Funktionen ebenso wie bei der Entstehung von Krankheiten wie Krebs, Diabetes und neurodegenerativen Erkrankungen. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass dabei die Oxidation des Methionins in verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Zusammenhangen eine Schlusselrolle spielt. Daher sollte die Entwicklung neuer Techniken fur die Untersuchung des Redox-Proteoms zu einem besseren Verstandnis von Krankheitsursachen, etwa bei Krebserkrankungen, fuhren. In der vorliegenden Arbeit wird die Anwendung einer neuen, ultraschnellen und schonenden Technik fur die Untersuchung von Redox-Proteomen vorgestellt, die an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt sind. Dabei wird durch „desorption by impulsive vibrational excitation“ (DIVE), bei der Schwingungen des intrazellularen Wassers innerhalb von Picosekunden durch einen Picosekunden-Infrarot-Laser angeregt werden, eine kalte Verdampfung von Zellen und Gewebe erreicht. Fur den Vergleich der PIRL-DIVE- mit der klassischen Homogenisierungsmethode wurden drei Ratten-Bauchspeicheldrusen und drei menschliche Tonsillen jeweils in gleiche Teile geschnitten und einer mechanischen bzw. einer PIRL-DIVE-Homogenisierung unterzogen. Nach Trypsin-Verdau wurden die Proben durch LC-MS/MS analysiert. Um den Einfluss der Homogenisierungs-Methode (klassische bzw. PIRL-Homogenisierung) auf die Protein-Oxidation zu vergleichen, wurden das Ratten-Bauchspeicheldrusen- und das menschliche Tonsillen-Gewebe mit beiden Methoden homogenisiert und das Ausmas der Methionin-Oxidation fur Paare von methionin-enthaltenden Peptiden bestimmt, die jeweils in beiden Datensatzen identifiziert worden waren. Nach dem Vergleich von Paaren von Peptiden in den jeweiligen Geweben und ihrer Klassifizierung in zwei Gruppen (1 - Methionin-Oxidation hoher in der klassisch homogenisierten Probe und 2 - Methionin-Oxidation hoher in der durch PIRL homogenisierten Probe) zeigten die Ergebnisse, dass in den Ratten-Bauchspeicheldrusen 1, 2 und 3 der Prozentsatz der methionin-enthaltenden Peptide in Gruppe 1 92.83%, 57.85% und 52.41% betrug. In den menschlichen Tonsillen 1, 2 und 3 betrug der Prozentsatz der methionin-enthaltenden Peptide in Gruppe 1 80.80%, 42.41% und 50.63%. Durch den Vergleich von Peptid-Paaren in verschiedenen Geweben und biologischen Replikaten konnte gezeigt werden, dass mit PIRL-DIVE in jeweils einem der Replikate der betrachteten Gewebe weniger oxidationen beobachtet wurden als mit konventionelle Methoden, die in der Redox-Proteomanalyse verwendet werden. Daraus lasst sich schliesen, dass die PIRL-DIVE Methode selbst keine Oxidationen erzeugt. Somit kann diese Methode auch fur die Identifikation anderer oxidativer PTMs wie der Cystein-Oxidation und der Protein-Carbonylierung genutzt werden.