Phytochemische, pharmakologische und chemoökologische Untersuchungen zu Sesquiterpenlactonen aus Kamille, Schafgarbe und Arnika

E.1 Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen von Proazulenen aus Kamille und Schafgarbe Im Teil B dieser Arbeit konnte eine Isolierung des Proazulens Matricin aus der Kamille (Matricaria recutita L.) durch rein chromatographische Methoden entwickelt werden. Mit Hilfe von drei Flash-Chromatographieschritten an Kieselgel, Aluminiumoxid und RP-18-Kieselgel konnte Matricin einer Reinheit von (98,6%, HPLC) und einer Ausbeute von 0,016% isoliert werden. Auserdem wurde eine Methode zur Isolierung des Matricinderivats 8-Desacetyl-8-angeloyl-4-epi-matricin aus Schafgarbenkraut (Achillea millefolium agg.) etabliert. Aufgrund der relativ widerspruchlichen Datenlage bezuglich der Pharmakologie des Matricins und seines Abbauprodukts, dem Chamazulen, wurden beide Substanzen in vitro auf potentiell anti-inflammatorische Aktivitat untersucht. Dazu wurden zellbasierte Testsysteme mit humanen Endothelzellen (HMEC-1) und murinen Makrophagen (RAW 264.7) benutzt. Auserdem wurde ein zellfreier Assay zur NO-Radikalfangereigenschaft angewandt (SNP-Assay). Matricin zeigte eine dosisabhangige Inhibierung der TNF-α- und LPS-stimmulierten ICAM-1-Expression (intercellular adhesion molecule) bei HMEC-1 im nicht-toxischen Konzentrationsbereich, wohingegen sich Chamazulen als inaktiv erwies. Die Expression des Adhasionsmolekuls ICAM-1 steht in engem Zusammenhang mit dem Entzundungsgeschehen im Gewebe und wird u.a. uber den NF-κB-Weg aktiviert. Mit Hilfe von immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen von mit TNF-α-stimmulierten humanen Endothelzellen konnte eine Translokationshemmung des Transkriptionsfaktors NF-κB vom Zytoplasma in den Zellkern durch Matricin nachgewiesen werden. Chamazulen hingegen hemmte die Translokation nicht. Auch in einem Reportergen-Assay konnte die NF-κB-Promotoraktivitat dosisabhangig durch Matricin vermindert werden. Ein weiteres wichtiges Ereignis im Entzundungsgeschehen stellt die Synthese von Stickstoffmonoxid (NO)-Radikalen durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS) von Makrophagen dar. Als Reaktion auf Infektionen dient NO einerseits der unmittelbaren Bekampfung pathogener, mikrobieller Organismen, bei chronischer Uberproduktion hingegen verursacht es chronisch entzundliche Gewebeerkrankungen. NO wird in Losung in Nitrit umgewandelt, welches akkumuliert und mittels Griess-Reagenz nachgewiesen werden kann. Matricin und Chamazulen konnten bei 24-stundiger Applikation dosisabhangig die Nitrit-Akkumulation im Zelluberstand von LPS-stimmulierten RAW 264.7-Zellen (Griess-Assay) reduzieren, wobei Matricin (IC50 = 20,9 µM) effektiver war als Chamazulen (IC50 = 59,3 µM). Beide Substanzen waren in den untersuchten Konzentrationen nicht toxisch fur RAW 264.7 Zellen. Im zellfreien SNP-Assay, in dem NO durch einen metallorganischen NO-Donor generiert wird, zeigte sich, dass Chamazulen die Nitrit-Konzentration senkte, wahrend Matricin keinen Einfluss hatte. In einem modifizierten Griess-Assay wurde der zeitliche Einfluss von Matricin und Chamazulen auf die Nitrit-Konzentration im Zelluberstand von LPS-stimmulierten RAW 264.7-Zellen gemessen. Nach 24 h Inkubation zeigte sich das analoge Ergebnis zum klassischen Griess-Assay. Nach nur 1 h Inkubation zeigte das Matricin keinerlei Einfluss, wohingegen das Chamazulen die Nitrit-Konzentration bereits zu senken vermochte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die entzundungshemmende Aktivitat des Matricins schon pra-transkriptionell evtl. uber eine Translokationshemmung von NF-κB und die dadurch bedingte Verminderung der Menge inflammatorischer Proteine wie z.B. ICAM-1 oder iNOS vermittelt wird, wahrend das Chamazulen lediglich als Radikalfanger fungiert und wenig Einfluss auf die Signaltransduktion der Zelle nimmt. In einem zweiten Projekt des Teils B dieser Arbeit erwiesen sich sowohl die proazulenreichen Fraktionen eines Schafgarbenblutenextrakts (DCM) als auch der Extrakt selbst als auserst potent bezuglich ihrer anti-inflammatorischen Aktivitat, sowohl im ICAM-1-Assay als auch im Griess-Assay. So verminderte der Extrakt die ICAM-1-Expression bei HMEC-1 bei einer Konzentration von 12,5 µg/ml auf 21,1%. Im Griess-Assay senkte der Extrakt in einer Konzentration von 5 µg/ml die Nitrit-Konzentration auf 38,7% im Vergleich zur Kontrolle. Die proazulenreiche Fraktion V zeigte sich bei einer Konzentration von 5 µg/ml und einer Verminderung der Nitrit-Konzentration auf unter 30% noch aktiver als der Extrakt selbst. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Proazulene aus der Schafgarbe einen nicht unerheblichen Anteil an der entzundungshemmenden Wirkung dieser Pflanze haben. E.2 Chemookologische Untersuchungen zu Arnica montana L. Die chemookologische Untersuchung von 79 Proben von Arnica montana L. aus Maramures (Rumanien) ergab keine signifikanten Zusammenhange zwischen Umweltparametern und dem Gehalt bzw. der Zusammensetzung der Sesquiterpenlactone (SL) vom Helenalin- und Dihydrohelenalintyp. Die Variabilitat der Inhaltsstoffmuster der Arnikaindividuen war auch unter den ahnlichen Umweltbedingungen eines Standorts sehr hoch, hingegen bei untersuchten Arnikaklonen deutlich geringer. In Stressexperimenten an Arnika-Klonen konnte auserdem keine Veranderung der SL-Muster induziert werden. Diese Ergebnisse weisen auf einen geringen Einfluss von Umweltfaktoren und einen groseren Einfluss der Erbanlagen auf die Biosynthese der SL bei Arnika hin. Das Verhaltnis von Helenalin- zu Dihydrohelenalinestern der rumanischen Arnikaproben lag zwischen dem des helenalinreichen mitteleuropaischen und dem des spanischen Chemotyps. Der durchschnittliche Gesamtgehalt an SL lag mit 0,28% unter den Mindestanforderungen des Europaischen Arzneibuchs von 0,40%.