Effects of N-terminal mutations of human androgen receptor on polyglutamine toxicity

Nine neurodegenerative diseases are caused by polyglutamine (polyQ) tract amplification in different proteins. The cytotoxicity of each of these proteins is associated with a misfolding of the mutant protein, resulting in the subsequent alteration of cellular processes and interactions as well as the interrelated formation of insoluble aggregates and other conformationally toxic species. However, the diseases differ in their pathology and tissue specificity of action, which may be due to protein context/regions neighboring the polyQ stretch. For the purpose of the studies presented in ths work, the polyQ containing human androgen receptor (AR) that causes the disorder spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) was used to model polyQ toxicity. In previous investigations, two putative phosphorylation sites of the AR were identified, and it was demonstrated that mutation of these sites appeared to cause conformational change in the protein. Therefore, these N-terminal serine residues were exchanged to alanine in the wild type AR (ARQ22/ARQ22dm) or a receptor with an amplified polyQ stretch (ARQ77/ARQ77dm). These mutants were then used to characterize variance in types of aggregates and the associated toxic profiles due to the different protein conformations that arose from the serine mutations. Evaluating changes in aggregation and toxicity in cultured cells and in a Drosophila model of SBMA, it was found that the effects of the conformational changes differed depending on the length of the polyQ stretch. Mutations in the ARQ22 resulted in a marked increase in aggregation as well as decreased survival rates and altered locomotion behavior in Drosophila. These results were similar but not as severe as the ARQ77/SBMA model. In quite the opposite manner, mutations in the ARQ77 caused a decrease in aggregation and a lessened toxic effect in Drosophila. Moreover, it was found that inhibitor compounds used to ameliorate polyQ toxicity were not as efficient in inhibiting the varied toxicities exhibited by both the ARQ22dm and ARQ77dm. Therefore, two distinct amino acid sites that profoundly modulate polyQ toxicity in the AR have been identified. These results can be further utilized to understand the conformational changes in the AR that lead to aggregation as well as the types of aggregates that lead to toxicity. Neun neurodegenerative Krankheiten sind auf die Verlangerung einer Polyglutamin (PolyQ) Sequenz in unterschiedlichen Proteinen zuruckzufuhren. Die Zytotoxizitat von jedem dieser Proteine ist mit einer Fehlfaltung des mutierten Proteins assoziiert. Dadurch kommt es zu Veranderungen in zellularen Prozessen und Interaktionen, sowie der damit verbundenen Bildung von unloslichen Aggregaten und anderen toxisch wirkenden Spezies. Die Polyglutaminerkrankungen unterscheiden sich jedoch in ihrer Pathogenese und gewebespezifischen Wirkung, was auf den jeweiligen Proteinkontext bzw. PolyQ-angrenzenden Sequenzbereich zuruckzufuhren sein konnte. Fur die Studien der hier vorliegenden Arbeit wurde der polyglutaminhaltige humane Androgenrezeptor (AR), Ausloser der spinalen und bulbaren Muskelatrophie (SBMA), als Modell verwendet, um die Toxizitat der PolyQ-Verlangerung zu analysieren. In fruheren Experimenten wurden zwei mogliche Phosphorylierungsstellen im AR identifiziert, und die Mutation dieser Stellen schien eine Konformationsanderung im Protein hervorzurufen. Ausgehend von diesen Befunden wurden nun diese N-terminalen Serin-Reste im Wildtyp AR (ARQ22) sowie in einem Rezeptor mit einer verlangerten PolyQ Sequenz (ARQ77) gegen Alanin ausgetauscht (ARQ22dm bzw. ARQ77dm). Mit Hilfe dieser Mutanten wurde dann der Effekt der durch die Serinmutation erzeugten Konformationsanderung auf die jeweiligen Aggregatformen und die damit verbundenen Toxizitatsprofile charakterisiert. Die Untersuchungen der Aggregation und Toxizitat in kultivierten Zellen und in einem SBMA Drosophila Modell ergaben, dass sich die Effekte der Konformationsanderungen in Abhangigkeit von der Lange der PolyQ Sequenz unterscheiden. Im ARQ22 verursachten die Mutationen eine deutliche Verstarkung der Aggregation, sowie eine verminderte Uberlebensrate und ein verandertes Bewegungsverhalten in Drosophila. Diese Veranderungen ahnelten dem Phanotyp des ARQ77/SBMA Modells, waren jedoch etwas schwacher ausgepragt. Im Gegensatz dazu fuhrten die Mutationen im ARQ77 zu einer Herabsetzung und Abschwachung der Aggregatbildung und Toxizitat. Daruber hinaus erwiesen sich Inhibitoren, die zur Milderung der PolyQ Toxizitat eingesetzt werden, als nicht sehr effektiv in der Hemmung der durch den ARQ22dm und AR77dm verursachten Toxizitat. Somit wurden in dieser Arbeit zwei Aminosaurestellen identifiziert, welche die PolyQ-Toxizitat des AR in gravierender Weise modulieren. Diese Ergebnisse konnen zukunftig genutzt werden, um zu klaren, welche konformationellen Veranderungen im AR zur Aggregation fuhren und welche Aggregatformen fur dessen toxische Wirkung verantwortlich sind.