Identification and characterization of intracellular binding partners of the CHL1 (close homologue of L1) neural cell recognition molecule

In der vorliegenden Arbeit wurden Bindungsanalysen des neuronalen Zelladhasionsmolekuls CHL1 (close homologue of L1) durchgefuhrt, die Interaktionspartner dieses kurzlich beschriebenen neuen Mitgliedes der L1-verwandten Unterfamilie isolieren sollten. Die extra- und intrazellularen Domanen von CHL1 wurden als rekombinante Fusionsproteine in verschiedenen biochemischen Interaktionsanalysen eingesetzt. Ein einzelnes Protein, das an die losliche intrazellulare Domane von CHL1 in einem overlay Ansatz gebunden hat, konnte in der detergenzfreien loslichen Fraktion eines Maushirns nachgewiesen werden. Der mogliche Bindungspartner von CHL1 wurde mittels MALDI-MS als murines Hitzeschockprotein hsc70 identifiziert. Die immunzytochemische Lokalisation der beiden moglichen Bindungspartner in primaren Hippokampus-Neuronen zeigte eine charakteristische distinkte Ko-Verteilung, die auf eine verstarkte Interaktion in membranosen Subdomanen hinweist. Die Ko-Lokalisation in Subdomanen zeigte sich starker in Zellen, die von alteren Tieren prapariert wurden als in Zellen von neugeborenen Tieren. CHL1 und hsc70 zeigten eine ubereinstimmende Verteilung in detergenz-unloslichen Subfraktionen angereicherter synaptosomaler Membranen. Eine Ko-Immunprazipitation von CHL1 aus kruden Homogenaten 5 Tage alter und 3 Wochen alter Mause zeigte, dass die Interaktion in alten Tieren verstarkt war und die Prazipitation aus der detergenz-unloslichen Fraktion nur bei 3 Wochen alten Tieren moglich war. Hsc70 ko-prazipitierte allerdings nur, wenn ADP als Ko-Faktor der Bindung anwesend war, nicht aber in der Gegenwart von ATP. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse eine ADP-abhangige Interaktion von CHL1 und hsc70. Diese konnte auf zellulare Subdomanen beschrankt werden, in denen die Interaktion moglicherweise durch eine bestimmte Konformation der Bindungspartner erleichtert wurde. Die Translokalisation der Bindung in detergenz-unloslichen Fraktionen hangt von dem Entwicklungsstand der Tiere ab. Ein mogliches Bindungsmotiv fur hsc70 in der intrazellularen Domane von CHL1 konnte identifiziert werden: Ein HPD-Tripeptid, das ursprunglich als hsc70-Bindestelle in der J-Domane von molekularen Faltungsproteinen beschrieben wurde. Eine gerichtete Mutagenese, die zum Aminosaureaustausch des Histidin- beziehungsweise Aspartatrestes fuhrte, konnte zeigen, dass das HPD-Tripeptid essentiell fur die Bindung von hsc70 ist. Hinweise, dass die Bindung von CHL1 und hsc70 an strukturellen Reorganisationen des Zytoskeletts beteiligt ist, konnen nicht ausgeschlossen werden. Weil aber die Transfektion die Morphologie und Vitalitat der Neurone dramatisch beeinflusste, war eine funktionelle Analyse der CHL1 - hsc70 Interaktion nicht moglich. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine Interaktion zwischen einem Zelladhasionsmolekul und einem Hitzeschockprotein demonstriert werden, die generiert wird uber ein HPD-Tripeptid in der intrazellularen Domane von CHL1. Diese Interaktion ist abhangig von dem Ko-Faktor ADP. Die Bindung konnte in zellularen Subdomanen lokalisiert werden und die Translokalisation der Interaktion war zeitlich abhangig vom Entwicklungsstand des Tieres. Eine Beteiligung der CHL1 - hsc70 Bindung an strukturellen Veranderungen des Zytoskeletts konnte nicht ausgeschlossen werden, wodurch sich interessante Moglichkeiten zur weiteren funktionellen Erforschung dieser Interaktion bieten.