NMR studies of the leader protease of the Foot-and-Mouth Disease Virus

Die Leader Protease Lbpro des Maul-und-Klauenseuche Viruses gehort zu der Familie der Papain-Cysteinproteasen und ist ein wichtiger Virulenzfaktor des Viruses. Es ist das erste Protein das am Genom des Viruses codiert ist. Wahrend der Expression in der Wirtszelle spaltet es sich autocatalytisch vom wachsenden Polypeptid ab. Danach stoppt es die eukaryotische Translation durch die proteolytische Spaltung des eukaryotischen Translations-initiationfaktors 4GΙ and ΙΙ, wodurch unter anderem die Synthese von IFN verhindert wird. Die Proteinsynthese des viralen Genoms ist nicht beeintrachtigt, da die Translation von einer 'Internal Ribosome Entry Site' (IRES) initiiert wird. Kristallstukturen von Lbpro (1QOL.pdb), als auch von einer verkurzten Mutante, sLbpro (1QMY.pdb), der sechs C-terminale Aminosauren fehlen, existierten bereits. Diese zeigten, dass Lbpro durch die Bindung der C-terminalen Aminsauren im aktiven Zentrum eines benachbarten Lbpro Molekules und umgekehrt dimerisiert. Diese Dimerisierung konnte bei der verkurzten Mutante nicht beobachtet werden. Zusatzlich war bei dieser der C-Terminus nicht sichtbar, was daraufhin weiste, dass dieser unstrukturiert und flexible ist Untersuchungen mittels NMR von Lbpro (2JQF.pdb) und sLbpro (2JQG.pdb) bestatigten die Dimerisierung von Lbpro, zeigten aber, dass Lbpro in Losung ein symmetrisches Dimer bildet. Zusatzlich konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von sLbpro wirklich unstrukturiert und flexibel ist. Das Ziel dieser Arbeit war die NMR Strukturen von Lbpro und sLbpro zu verfeinern. Vollstandigere Zuordnung konnte durch die Verwendung von dreifach Resonanz TROSY Experimenten erzielt werden. TROSY Experimente haben ein verbessertes 15N Relaxationsverhalten. Dadurch haben die Peaks dieser Spektren eine geringere Peakbreite, wodurch diese Peaks einfacher und genauer zugeordnet werden konnen. Fur die Verfeinerung der Strukturen wurden dipolare Kopplungen gemessen. Dipolare Kopplungen erstellten Orientierungsbeschrankungen uber grose Distanzen. Im Fall fur Lbpro sind sie daher nicht nur nutzlich um die Struktur zu verfeinern, sondern auch um die genaue Orientierung der beiden Halften des Dimers relativ zueinander zu bestimmen. Fur beide Proteine, Lbpro and sLbpro wurden unterschiedliche dipolare Kopplungen gemessen. Die Proteine wurden durch den Phagen PF1 im Magnetfeld orientiert. Die Elemente des Orientierungstensors wurden durch least square fitting der gemessenen dipolaren Kopplungen unter der Zuhilfenahme der Kristallstrukturen berechnet. Die dipolaren Kopplungen wurden dann als zusatzliche Orientierungsbeschrankungen fur die Berechnung der Strukturen eingesetzt. Die erhaltenen Strukturen zeigen eine bessere Konvergenz verglichen mit den existierenden NMR Strukturen. Zusatzlich ist die Anzahl von Aminosauren, welche energetisch gunstigere dihedarale Winkel,  und , aufweisen hoher. Dies ist vor allem bei sLbpro der Fall. Die quartare Struktur, die von Lbpro erhalten wurde, zeigt verglichen mit der NMR-Struktur (2JQF.pdb), dass beide Strukturen denselben Drehungswinkel haben, jedoch unterscheidet sich ihr Beugungswinkel um ca. 20-25°.