Investigations on an Innovative Antibiotic Approach : Structure-Function-Analysis of Essential Enzymes Routing the Vitamin B1 de novo Biosynthesis and Vitamin B6 Salvage Pathway of Staphylococcus aureus

Just 72 years after the mass production of the first broad spectrum antibiotic penicillin started Staphylococcus aureus represents a dismaying global threat again. In the golden era of the antibiotic development the drug pipeline fighting this and other human pathogenic bacteria was filled repeatedly to combat the ongoing bacterial resistant development and spread. However, in the late 1980’s an ongoing discovery void in antibiotic development began, missing innovative novel targets, and the risk of entering a post-antibiotic era is evident these days. In this study a promising new strategy is presented, which uses the bacterial vitamin B1 de novo biosynthesis, that is entirely absent in humans. In the course of this approach substrate analogs, also termed ‘suicide drugs’ are channeled into the bacterial metabolism and will finally, after a set of metabolization steps, block a specific variety of cofactor dependent enzymes inside the bacterium as an inactive cofactor. This uncouples the site of drug infiltration and target action and entails multiple downstream effects. The structure of S. aureus ThiM in complex with two of these substrate analogs was solved via X-ray crystallography. Furthermore ThiM was successfully evaluated for its binding of NPE-caged ATP via STD-NMR, which could serve, in combination with an initially controlled rational crystallization conducted in the XtalController900, as a serial X-ray crystallographic pump-probe approach in future. Additionally, the mode of action of a former identified inhibitor of ThiM was elucidated. Moreover, the structure of TPK in complex with its natural ligand thiamine was solved. This allowed the analysis of possible thiamine analogs, build up out of the two promising substrate analogs studied for ThiM, incorporation. Furthermore, the structures of S. aureus and the monocellular eukaryotic protozoan Trypanosoma cruzi vitamin B6 kinase – PdxK were solved to high resolution via X-ray crystallography and S. aureus PdxK structure was analyzed in solution via small angle X-ray scattering. The structural analysis allowed the differentiation of PdxK, which also shows promiscuous activity towards the first substrate of the kinase ThiD, which is an essential kinase for the HMP feeding into the vitamin B1 metabolism in S. aureus. Based on these results the interplay of the metabolisms and the structural delimitation can now be further studied and will highlight the evolutionary relations. Beyond that, a pepdimometic approach targeting PdxK could be followed on basis of the crystallization result of S. aureus PdxK and could reveal an innovative possibility of inhibiting these kinases. Furthermore, an additional expression system using insect cells was tested and all proteins of the vitamin B1 and B6 pathways were successfully produced. In summary this work provides valuable information for the development of innovative antibiotic substances based on proteins’ structural data to specifically target MRSA. Nur 72 Jahre nach Beginn der Massenproduktion des ersten Breitbandantibiotikums Penicillin stellt Staphylococcus aureus wieder eine kritische globale Bedrohung dar. Im goldenen Zeitalter der Antibiotikaentwicklung wurde die Medikamenten-Pipeline zur Behandlung dieses und anderer humanpathogener Bakterien regelmasig gefullt, um der Entwicklung und Verbreitung bakterieller Resistenzen begegnen zu konnen. Seit Ende der 1980er Jahre hingegen ist die Entwicklung in der Antibiotikaforschung defizitar und innovative Targets fehlen, sodass heute das Risiko einer post-antibiotischen Ara evident ist. Diese Arbeit prasentiert eine neue, aussichtsreiche Strategie, die auf die bakterielle Vitamin B1 (Thiamin) de novo Biosynthese, welche beim Menschen nicht vorkommt, abzielt. Hierzu werden Substrat-Analoga - „Suicide Drugs“ - in den bakteriellen Metabolismus eingeschleust und fuhren letztlich, nach mehreren Metabolisierungsschritten als inaktive Co-Faktoren zur Blockade multipler Co-Faktor-abhangiger Enzyme im Bakterium. Auf diese Weise werden der Wirkstoff-Eintrittsort und der Wirkort voneinander entkoppelt. Die Struktur von S. aureus ThiM im Komplex mit zweien dieser Substrat-Analoga konnte via Protein-Kristallographie bestimmt werden. Auserdem konnte ThiM erfolgreich auf sein Potenzial, NPE-caged ATP via STD-NMR zu binden, untersucht werden. Dieses konnte zukunftig - in Kombination mit dem evaluierten, kontrollierten Kristallisierungs-Setup mittels XtalController900 - fur serielle rontgenkristallographische Pump-Probe-Experimente genutzt werden. Zusatzlich konnte die Wirkungsweise eines bereits zuvor identifizierten Inhibitors von ThiM naher analysiert werden. Des Weiteren wurde die Struktur von TPK im Komplex mit seinem naturlichen Liganden mittels Protein-Kristallographie gelost. Auf dieser Basis konnte die Akzeptanz moglicher Thiamin-Analoga, hergestellt aus den zwei fur ThiM untersuchten Substrat-Analoga, strukturell untersucht werden. Weiterhin wurde die Struktur der Vitamin B6 Kinase (PdxK) aus S. aureus und des eukaryotischen Protozoen Trypanosoma cruzi mittels Protein-Kristallographie gelost und zusatzlich die S. aureus PdxK Struktur in Losung mittels SAXS uberpruft. Die strukturelle Analyse erlaubt nun die Untersuchung der Substratspezifitat von PdxK, welche gegenuber dem ersten Substrat (HMP) der Kinase ThiD, das die HMP-Zufuhr im Vitamin B1 Metabolismus in S. aureus sicher stellt, ebenfalls Aktivitat zeigt. Auf Basis dieser Ergebnisse kann nun das Zusammenspiel des B1 und B6 Metabolismus sowie die strukturelle Differenzierung weiter untersucht und die evolutionaren Verbindungen analysiert werden. Daruber hinaus kann auf Basis der Kristallisationsergebnisse von S. aureus PdxK ein auf PdxK zielender pepdimometischer Ansatz verfolgt werden und innovative Moglichkeiten der Blockade dieser spezifischen Kinasen bieten. Ferner wurde zusatzlich ein Expressionssystem unter Nutzung von Insektenzellen getestet, bei welchem samtliche S. aureus Proteine des Vitamin B1 Metabolismus und PdxK erfolgreich produziert werden konnten. Zusammenfassend bietet diese Arbeit wertvolle Informationen fur die rationale Entwicklung innovativer antibiotischer Substanzen basierend auf strukturellen Daten, um MRSA spezifisch zu targetieren.