Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung des Cannulae-bildenden Proteins von Pyrodictium abyssi

Diese Arbeit beschaftigt sich mit dem aus Pyrodictium abyssi isolierten Protein CanA, welches in der Lage ist, ein hitzebestandiges, nicht denaturierbares, organisches Hohlfasernetzwerk zu bilden. Die industriellen Einsatzmoglichkeiten wie z.B. als sich selbst polymerisierende Membranen, stereospezifisch durchlassige Hohlfaserkanale, Stoff fixierende Nanorohren oder sogar als organische Leiter sind nahezu grenzenlos. Fur den spezifischen Einsatz eines solchen Proteins sind jedoch Modifikationen, sowie genaue Kenntnisse uber das Polymerisationsverhalten, die Proteinstruktur und die Interaktionsstellen des Proteins von Noten. Das Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe unterschiedlicher analytischer und spektroskopischer Methoden detaillierte strukturelle und biochemische Informationen uber das Protein CanA und sein Polymerisationsverhalten zu erhalten. Das Protein CanA unterliegt nicht nur einer induzierten Polymerisation, sondern auch einer voranschreitenden Eigenpolymerisation. Daher war es fur die Strukturaufklarung von groster Wichtigkeit, ein Konstrukt dieses Proteins zu entwickeln, welches bis auf die Polymerisierungsfahigkeit samtliche strukturellen und physikalischen Eigenschaften von CanA beibehielt. Dieser Durchbruch gelang mit einem nur um 10 Aminosauren verkurzten Protein Konstrukt namens K1-CanA. Desweiteren konnte die in-vitro Expression von unmarkiertem CanA bzw. K1-CanA in Hinsicht auf die Ausbeute und den Reinheitsgrad des isolierten Proteins durch einen veranderten Zellaufschluss und optimierte Reinigungsschritte enorm gesteigert werden. Zur Erreichung der gesetzten Ziele musste bewiesen werden, dass sowohl K1-CanA, CanA, wie auch dessen Polymere eine nahezu identische Struktur besitzen. Die strukturelle Gleichheit des Polymers mit dem Monomer CanA wurde mittels Fourier-Transformations-Infrarotmessungen bewiesen. Durch Circulardichroismus-Spektroskopie-Experimente konnte gezeigt werden, dass CanA und K1-CanA eine identische Sekundarstruktur (5% α-Helix, 41% β-Faltblatt, 53% coil) besitzen. Ein Vergleich der 15N Signale durch 2D NMR Messungen zeigte eine nahezu identische chemische Umgebung aller vorkommenden Aminosauren der Proteine CanA und K1 CanA. Diesbezuglich konnte sowohl fur K1-CanA, CanA und dessen Polymer eine einheitliche Sekundarstruktur bewiesen werden. Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung konnte die Partikelgrose von monomeren CanA mit 3.38 nm bzw. 3.48 nm bestimmt werden. Diese Partikelgrosenverhaltnisse bestatigten auch die durchgefuhrten NMR-Diffusionsmessungen, bei denen CanA als Monomer im nativen Zustand mit einem hydrodynamische Radius Rh von 1.68 nm klassifiziert wurde. Die Eigenpolymerisation, sowie die Polymerisierungseigenschaften von CanA zu Cannulae bzw. die nicht vorhandenen Polymerisationsfahigkeiten von K1-CanA, wurden durch Transmissions-Elektronenmikroskopie Messungen dokumentiert. Die synthetisierten Cannulae entsprachen in ihrer Form und den Dimensionen (Durchmesser ca. 30 nm) in etwa den naturlichen Cannulae im Netzwerk von Pyrodictium abyssi. Trotz der fur die NMR kritischen Grose von 18.7 kDa des Proteins K1-CanA, wurden nahezu samtliche chemischen Verschiebungen uber verschiedenste 2D und 3D NMR Messungen identifiziert. Hierdurch konnten definitive Aussagen uber die Sekundarstruktur des Proteins getroffen werden. Die uber TALOS+ bestimmte Abfolge der Sekundarstrukturelemente von K1 CanA lautet βββαββββαββββββ (6% α Helix, 44% β-Faltblatt und 50% coil). Der groste Teil der β-Faltblatter von K1-CanA ist in 2 grosen, miteinander verbundenen Faltblattebenen zu 3 bzw. 5 antiparallelen β Faltblattstrangen koordiniert. Diese Faltblattebenen stehen sich gegenuber und bilden ein β-Faltblatt-Barrel. Anhand von (1H-15N-) sofast-HMQC-Spektroskopie-Messungen konnten die zur induzierten Polymerisation benotigten Ca2+ / Mg2+ Bindungsstellen identifiziert und die Bindungskonstanten bestimmt werden. Die Bindungsstellen befinden sich jeweils an den flexiblen Enden des β-Faltblatt-Barrels. Sowohl bei K1-CanA als auch bei CanA ist die Bindungsstelle 1 mit KD (K1-CanA) = 0.774 +/- 0.046 mM bzw. KD (CanA) = 1.00 +/ 0.06 mM im Vergleich zur Bindungsstelle 2 mit KD (K1-CanA) = 10.7 +/ 2.2 mM bzw. KD (CanA) = 15.1 +/ 1.8 mM deutlich Calcium affiner. Im Bezug auf Magnesium besitzen beide Bindungszentren die gleiche Affinitat - Bindungsstelle 1: KD (K1-CanA) = 3.19 +/- 0.35 mM bzw. KD (CanA) = 3.90 +/- 0.11 mM; Bindungsstelle 2: KD (K1-CanA) = 3.18 +/ 0.62 mM und KD (CanA) = 3.85 +/ 0.24 mM. Die gewonnenen NMR Daten wurden anschliesend in einer Strukturrechnung uber CNS verwendet und ermoglichten eine erste Strukturrechnung des Proteins K1-CanA. Anhand dieser Struktur konnte gezeigt werden, dass jede CanA Untereinheit in einem Cannulae an 5 seiner 6 seitigen Oberflache Kontaktpunkte zu weiteren CanA Untereinheiten aufweist. Der flexible, zur Polymerisation benotigte N Terminus von CanA ist hierbei auf der Seite ohne weitere Kontaktflachen lokalisiert. Die Sekundarstrukturinformation aller in dieser Arbeit verwendeten Messmethoden stimmten mit der durchgefuhrten Berechnung der Struktur uberein.