Structural and functional analysis of the guidance cue molecule netrin-1 in complex with its receptor DCC unravels the molecular mechanisms of interaction

The development of the nervous system involves complex cell signalling and generations of scientists have engaged in understanding these processes. The study presented here concentrates on the investigation of the molecular binding mechanisms between human netrin-1 and its receptor DCC to contribute to a better comprehension of developing neuronal networks. Netrins belong to the laminin family and were firstly described as chemical guidance cues for migrating commissural and motor axons. Among bilaterally symmetric animals, from C. elegans to humans, they are highly conserved to play modulating roles in cell migration, proliferation and adhesion. They are involved in the organisation of neuronal connections, tissue patterning during organogenesis, angiogenesis, inflammation and cancer. Migrating nerve cells are attracted or repelled by netrin gradients respective to the receptors they are expressing, revealing them as bi-functional chemotropic factors. Netrin-1 is to date their best characterised representative. Among the receptors that have been identified to bind netrin-1 are deleted in colorectal cancer (DCC), neogenin, down-syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) and uncoordinated 5A-D (UNC5A-D). Failure of the netrin-1 signalling leads to severe developmental defects during embryogenesis and, if occurring later in life, can lead to cancer. Therefore, a more detailed determination of the molecular interactions between netrin-1 and its cell-surface binding partners is of particular interest. The domains taking part in these interactions between netrin-1 and its receptors have been the target of several studies. Using this information truncated constructs were designed for recombinant expression in human embryonic kidney cells (HEK293T). A construct comprised of the VI and V laminin-like domains, both proposed to be involved in DCC binding, was chosen for further studies according to the observed expression yields. Verification of different affinity and gel filtration chromatography techniques led to adjustment of the expression conditions and the establishment of a convenient and reproducible purification protocol. The described construct was confirmed to bind to the fifth and sixth fibronectin domain of DCC by two in-vitro binding assays. The crystal structure of a complex of netrin-1 and DCC revealed two distinct binding sites utilising different binding mechanisms and affinities. Binding site 1 involves exclusively the third EGF-domain of nertin-1 and fibronectin domain 5 of DCC. This DCC-specific binding site resembles, based on its architecture, a hydrophobic hotspot. SAXS experiments and binding studies by thermophoresis showed a preference for the occupation of this binding site in solution. Binding site 2 engages negatively charged ions in a unique way to mediate binding between positively charged surface patches on both, receptor and ligand. This generic binding site could interact with heparan sulphates to mediate the association with various other receptors to determine the fate of migrating cells, depending on the receptor composition. The effects of binding site specific mutations were tested in cell based and axon guidance assays. It was showed that the integrity of both binding sites is essential for path finding and signal transduction. Together the results of this study gave an insight into the molecular mechanisms of receptor/ligand interactions and a perspective on understanding netrin-1´s bi-functionality. Generationen von Wissenschaftlern haben sich mit dem Studium der komplexen Signalwege wahrend der Entwicklung neuronaler Netzwerke beschaftigt. Um zu einem besseren Verstandnis der Entstehung des Nervensystems beizutragen, beschaftigt sich die hier vorliegende Arbeit mit der Untersuchung der molekularen Bindungsmechanismen zwischen dem humanen Netrin-1 und seinem Rezeptor DCC. Netrine gehoren zur Familie der Laminine und wurden zunachst als chemische Leitmolekule fur kommissurale und motorische Axone beschrieben, spater zeigte sich aber auch ihre Beteiligung in der Organentwicklung, der Angiogenese, bei Entzundungsprozessen und bestimmten Krebsformen. Migrierende Nervenzellen werden von Netrin Gradienten, in Abhangigkeit von ihren Zelloberflachenrezeptoren, angezogen oder abgestosen. Dies verdeutlicht die Bi-Funktionalitat dieser chemotropen Signalmolekule. In bilateral symmetrisch organsierten Organismen, vom Wurm bis zum Menschen, sind diese Proteine in hohem Mase evolutionare konserviert. Netrin-1 stellt bis heute den bestcharakterisierten Vertreter der Netrine dar. Zu den Netrin-1 bindenden Rezeptoren zahlen Deleted in colorectal cancer (DCC), Neogenin, Down-syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) und uncoordinated 5A-D (UNC5A-D). Da verschiedene Formen schwerer neuronale Entwicklungsfehler sowie einige Krebsarten mit einer Unterbrechung des Netrin-1 Signalweges in Verbindung gebracht werden konnen, ist eine genauere Bestimmung der molekularen Mechanismen, denen die Interaktionen zwischen Rezeptor und Ligand unterworfen sind, von grosem Interesse. Die Definition der Domanen, die an den genannten Interaktionen beteiligt sind, war Gegenstand etlicher vorangegangener Studien. Mit Hilfe der dort gewonnenen Erkenntnisse wurden verschiedene Konstrukte erstellt und in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293T) rekombinant expremiert. Besonders ein Konstrukt, das die VI und die V Laminin Domanen aufwies, fiel durch seine gute Expression auf. Fur beide Domanen wurde schon fruher eine Beteiligung in der Rezeptorenbindung vermutet. Zur Erstellung eines praktikablen und reproduzierbaren Reinigungsprotokolls wurden zahlreiche chromatographische Affinitats- und Gelfiltrationstechniken untersucht und schlieslich eine Adaptation der Expressionsbedingungen vorgenommen. Durch in-vitro Studien wurde die Bindung des beschriebenen Netrin-1 Konstrukts an die funfte und sechste Fibronektin-Domane der Rezeptors DCC bestatigt. Die Kristallstruktur eines Komplexes aus Netrin-1 und DCC zeigte zwei, in Mechanismus und Affinitat unterschiedliche, Bindungsstellen. An Bindungsstelle 1 interagieren ausschlieslich die dritte EGF-Domane des Netrin-1 und die Fibronektin-Domane 5 des DCCs. Diese DCC-spezifische Bindungsstelle wurde anhand ihrer Architektur als hydrophober Hotspot identifiziert. Die Praferenz fur diese Bindungsstelle in Losung wurde durch SAXS Experimente und thermophoretische Messungen gezeigt. Bindungsstelle 2 weist in einzigartiger Weise eine Akkumulation negativer Ionen auf, welche die Bindung zwischen positiv geladener Oberflachenbereiche des Rezeptors und des Ligand ermoglichen. Diese vielseitige Bindungsstelle konnte auf eine Interaktion mit Heparansulfaten hindeuten mit deren Hilfe die Bindung zu unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt werden konnte, um so das Schicksal der migrierenden Zellen zu bestimmen. Zellbasierte Bindungsversuche und funktionale Untersuchungen an Axonen mit bindungsstellen-spezifischen Mutanten haben gezeigt, dass beide Bindungsstellen fur die Wegfindung und Signaltransduktion essentiell sind. Zusammenfassend ermoglicht die vorliegende Studie einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Rezeptor/Liganden Interaktionen die ein besseres Verstandnis der Bi-Funktionalitat von Netrin-1 ermoglicht.