Identification des partenaires neuronaux des protéines STOP

Les neurones contiennent une abondante population de microtubules stables resistant a la depolymerisation induite par le froid. Cette stabilite est induite par l’association des microtubules avec deux effecteurs majeurs regules par le complexe Ca2+/calmoduline et la CaM Kinase II : les isoformes E- et N-STOP (Early et adult Neuronal Stable Tubule Only Polypeptide). La phosphorylation de la proteine STOP par la CaMKII, enzyme cle de la plasticite synaptique, inhibe notamment sa capacite a lier les microtubules. L’invalidation du gene stop chez la souris entraine une deregulation des synapses glutamatergiques de l’hippocampe, avec diminution massive de la densite des vesicules pre-synaptiques et une alteration des mecanismes de plasticite synaptique a court et a long terme. Ces defauts synaptiques sont associes a des troubles severes du comportement chez les souris STOP-/-. Dans un premier temps, afin de poursuivre les travaux concernant la presence de la proteine STOP a la synapse et sa regulation par phosphorylation, nous avons etudie la localisation cellulaire de la STOP phosphorylee dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe : elle se trouve enrichie specifiquement au niveau des spicules dendritiques et des points de branchements axonaux et co-localise avec le reseau d’actine cortical sousmembranaire. Nous avons egalement montre que la STOP co-sedimente avec l’actine F polymerisee in vitro, quelle que soit sa regulation par la CaMKII. STOP phosphorylee colocalise partiellement avec des marqueurs pre- et post-synaptiques. La phosphorylation de STOP par la CaMKII permet donc sa dissociation du reseau microtubulaire et sa relocalisation vers des structures synaptiques comme le cytosquelette cortical d’actine. Dans la deuxieme partie de ce travail, afin de recueillir des informations susceptibles de caracteriser la fonctionnalite de la STOP a la synapse, nous avons identifie des partenaires neuronaux in vivo par la technique du double-hybride chez la levure. Trois de ces partenaires potentiels ont ete confirmes : la proteine Tctex1, a la fois chaine legere du moteur moleculaire dyneine assurant le choix des cargos lors du transport retrograde le long des microtubules mais egalement impliquee dans la croissance neuritique et l’adressage au bouton synaptique de canaux calciques sensibles au voltage, la proteine Arc, element cle de l’element post-synaptique implique dans des mecanismes de plasticite synaptique, et la proteine Nsg2 localisee specifiquement a l’appareil de Golgi des cellules neuronales et de fonction indeterminee pour le moment. Nous nous sommes ensuite focalises plus particulierement sur le partenaire Tctex1 en confirmant l’interaction avec la STOP par des experiences de co-localisation par immunofluorescence dans des cellules de mammiferes, de co-immunoprecipitation a partir de lysats de cellules transfectees, de transfert d’energie par resonance de bioluminescence (BRET). Par l’emploi de mutants deletes, le site d’interaction de STOP avec Tctex1 a ete cible au niveau de sa partie carboxy-terminale, et plus precisement dans un module de liaison aux microtubules. Si Tctex1 est indispensable a l’acheminement de canaux calciques necessaires a l’exocytose de neurotransmetteurs et donc a la transmission synaptique, nous avons egalement montre que l’absence de son partenaire STOP entrainait une reduction de la densite de courants calciques transitant a travers des canaux specifiques de la neurotransmission, couplee a une diminution du nombre total des canaux dans les prolongements neuritiques. L’absence de STOP est egalement responsable d’un defaut du transport retrograde neuronal, ce qui permet de relier la STOP a la fonctionnalite motrice de la dyneine cytoplasmique. En interagissant avec une multitude de partenaires differents aux fonctionnalites bien distinctes, les proteines STOP exerceraient tres probablement un role integrateur dans l’organisation fonctionnelle de la synapse.