Towards a unifying model of symmetry breakage in Xenopus laevis : serotonin signaling and the cilia-driven leftward flow

Orientation of the three vertebrate body axes anterior-posterior (AP), dorso-ventral (DV) and left-right (LR) is specified during early embryogenesis. Whereas the formation of the AP and DV axes is well understood, it is not finally resolved how and when the left and right sides get molecularly distinct. All deuterostomes analyzed so far, however, display an asymmetric left-sided expression of the TGF-β factor Nodal during embryonic development which precedes asymmetric organogenesis. In zebrafish, medaka, mouse and rabbit embryos a cilia-driven extracellular leftward fluid flow was shown to be causal for the left asymmetric induction of the Nodal gene cascade during early neurulation. In X. laevis, leftward flow was also shown to be driven by a mono-ciliated epithelium in the posterior part of the archenteron roof (gastrocoel roof plate, GRP). Mechanical blockage of this current resulted in laterality defects. Despite the apparent evolutionary conservation of flow, an earlier mechanism to specify the LR axis during early cleavage stages has been reported in X. laevis. Based on mostly inhibitor experiments, the so-called 'ion-flux' hypothesis was put forward which proposes an electrogenic transport and asymmetric accumulation of determinants as early as at the 32-64 cell stage. The monoamine serotonin is the core-effector of this hypothesis and was reported to asymmetrically accumulate at the ventral right blastomeres of early cleavage stage embryos. The aim of this study was to investigate putative interactions of the two apparently opposing mechanisms for breaking the initial LR symmetry of the Xenopus zygote. Reinvestigation of serotonin localization could not confirm the initial report. Further, serotonin signaling was shown to be necessary for LR axis formation on the dorsal but not ventral side, more specifically as a competence factor for the canonical Wnt-pathway. Detailed analyses of specimens impaired for serotonin signaling revealed requirement of serotonin signaling for specification of the superficial mesoderm (SM) which gives rise to the GRP and, consequently, to leftward flow. Leftward flow thus indirectly depends on dorsal serotonin signaling. In a further part of the present thesis, a re-examination of laterality in Siamese twins was performed. It has been known since the earliest experimental investigations of laterality that in induced and naturally occurring Siamese twins the left twin consistently displays wildtype orientation of the visceral organs whereas the orientation in the right twin is randomized. In experimentally induced conjoined twins, this observation holds true regardless of which twin is the induced. A model of symmetry breakage, in order to be plausible, thus should also be able to account for this phenomenon. When experimentally induced twins were analyzed for leftward flow, in the majority of cases a continuous leftward flow was observed, i.e. both twins shared one GRP. Thus, laterality cue(s) get translocated towards the far left side, i.e. only the left embryo receives the wildtype asymmetric information, regardless if it is the induced or endogenous twin. In rare case X. laevis conjoined axes developed far apart from one another such that two separate GRPs and individual leftward flows were observed, a condition that enabled both axes to exhibit a left-sided Nodal cascade. These experiments strongly suggest that Spemann's organizer itself is necessary and sufficient to establish all three body axes. In conclusion, the present analysis of laterality determination in the frog Xenopus supports evolutionary conservation of leftward flow as symmetry breaking event, as previously reported for mouse, rabbit and bony fish. Die Orientierung der drei Korperachsen anterior-posterior (AP), dorso-ventral (DV) und links-rechts (LR) wird fur Vertebraten wahrend der Embryogenese festgelegt. Obwohl die molekularen Mechanismen, die die AP und DV Achse festlegen gut bekannt sind, ist bisher nicht genau geklart, wann und wie die linke und rechte Halfte des sich entwickelnden Embryos ihre asymmetrische Identitat erhalten. In allen bisher untersuchten Deuterostomiern wurde wahrend der Embryonalentwicklung eine linksseitige Expression des TGF-β Faktors Nodal nachgewiesen, die jeweils der asymmetrischen Organogenese vorausgeht. Im Zebrabarbling, Medakafisch, Maus und Kaninchen wird diese Nodal-Genkaskade durch einen extrazellularen, von Cilien angetriebenen linksgerichteten Flussigkeitsstrom induziert. Auch fur den Krallenfrosch X. laevis konnte diese im posterioren Bereich des Archenterondaches ('gastrocoel roof plate', GRP) gezeigt werden. Eine mechanische Storung dieser Stromung verursachte Lateralitatsdefekte. Neben der augenscheinlichen Konservierung der Flussigkeits-stromung wurde fur die Spezifizierung der LR Achse im X. laevis eine zeitlich sehr viel fruhere Asymmetrie wahrend der ersten Furchungsstadien berichtet. Die daraus abgeleitete, grostenteils auf Inhibitorexperimenten basierende 'Ionenfluss'-Hypothese setzt einen elektrochemischen Transport und eine daraus resultierende asymmetrische Ansammlung von Determinanten der LR Achse bereits im 32-64 Zellstadium voraus. Die zentrale Rolle in diesem Modell kommt dem Monoamin Serotonin zu, das bereits wahrend der ersten Furchungsteilungen asymmetrisch verfrachtet und in ventralen rechten Blastomeren angereichert werden soll. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine mogliche Interaktion dieser beiden offenbar unterschiedlich wirkenden Mechanismen in Bezug auf den Bruch der initialen LR Symmetrie der Xenopuszygote zu ermitteln. Eine erneute Untersuchung zur Verteilung von Serotonin konnte die bereits publizierten Ergebnisse nicht verifizieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Serotonin auf der dorsalen aber nicht ventralen Seite wichtig ist fur die Bildung der LR Achse. Im Speziellen konnte Serotonin dabei als Kompetenzfaktor fur den kanonischen Wnt-Signalweg wirken. Detaillierte Untersuchungen in Embryonen in denen die Wirkung von Serotonin unterbunden wurde ergaben, dass Serotonin die Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms (SM), welches das Vorlaufergewebe der GRP darstellt, steuert. Der linksgerichtete Flussigkeitsstrom ist somit indirekt abhangig von der dorsalen Wirkung von Serotonin. Ein weiterer Teil dieser Doktorarbeit widmet sich der Lateralitat von siamesischen Zwillingen. Seit den ersten experimentellen Untersuchungen zum Organsitus von Embryonen ist bekannt, dass in naturlich auftretenden sowie in experimentell induzierten siamesischen Zwillingen ein Phanomen bezuglich des Organsitus auftritt: die Organe des linken Zwillings sind stets wildtypisch angeordnet wohingegen der rechte Zwilling einen randomisierten Organsitus aufzeigt. In experimentellen siamesischen Zwillingen konnte gezeigt werden, dass dieses Phanomen auftritt, egal welcher der beiden Zwillinge induziert war. Daher sollte ein Mechanismus zum Bruch der bilateralen Symmetrie dieses Phanomen eindeutig erklaren konnen. In siamesischen Zwillingen konnte dabei eine linksgerichtete Flussigkeitsstromung nachgewiesen werden, die sich zumeist uber einen gemeinsamen Bereich der fusionierten GRPs der beiden Zwillinge bewegte. Daher sollte ein transportiertes oder durch die Flussigkeitsstromung generiertes Signal nur vom jeweils linken Zwilling wahrgenommen werde konnen, unabhangig davon ob dieser induziert oder endogen ist. In seltenen Fallen entwickelten sich die dorsalen Achsen der siamesischen Zwillinge weit genug von einander entfernt, so dass zwei getrennte, funktionelle GRPs entstanden, die jeweils eine linksgerichtete Flussigkeitsstromung generierten und somit beide Zwillinge eine wildtypische Nodal-Genkaskade aufzeigten. Diese Experimente deuten stark darauf hin, dass der Spemann-Organisator sowohl notwendig als auch hinreichend ist, um alle drei Korperachsen zu etablieren. Die vorliegende Doktorarbeit unterstutzt daher eindeutig die Hypothese, dass auch im Frosch Xenopus laevis der Symmetriebruch durch den linksgerichteten Flussigkeitsstrom erfolgt und daher evolutionar konserviert ist.