The role of posttranslational modifications in the endocytosis of muscle-specific kinase

Die Rezeptor-Tyrosin-Kinase MuSK (muscle-specific kinase) ist ein Muskel-spezifisches Transmembranprotein und essentiell fur die Bildung der Neuromuskularen Synapse an der Kontaktstelle von Motorneuron und Muskel. MuSK wird durch das Proteoglykan Agrin aktiviert, ein Protein, das an Nervenendigungen sekretiert wird. Aktiviertes MuSK auto-phosphoryliert and stimuliert die Aggregation von Acetylcholin-Rezeptoren (AChRs) in dem der Nervenendigung gegenuberliegenden Bereich der Muskelzell-Membran. Dies fuhrt zur Ausbildung eines postsynaptischen Apparates. Um diese Prozesse zu koordinieren sind komplexe Signalmechanismen erforderlich, welche in den vergangenen Jahrzehnten intensiv studiert wurden. Zahlreiche weitere Proteine, die an der Bildung der Neuromuskularen Synapse beteiligt sind, wie LRP4, Dok7 und Tid1, wurden mittlerweile identifiziert und ihre Interaktion mit MuSK wurde erforscht. Dennoch sind die Kenntnisse uber die Agrin-MuSK-Signalkaskade unvollstandig. Es wurde berichtet, das Aktivierungs-abhangige Endozytose von MuSK fur die Aggregation von AChR erforderlich ist. Darauffolgende Modifikation von MuSK durch Ubiquitinylierung konnte den intrazellularen Transport der Kinase regulieren. Diese Diplomarbeit konzentrierte sich auf darauf, nicht-Muskel Zellsysteme zu etablieren, in welchen die beiden Prozesse, MuSK Endozytose und MuSK Ubiquitinylierung, untersucht werden konnen. Heterologe Zellsysteme sind einfacher zu handhaben als Muskelzellsysteme und erlauben es, bestimmte Komponenten der Agrin-MuSK Signalkaskade unabhangig von anderen Muskel-spezifischen Proteinen zu exprimieren und zu untersuchen. Ein Ziel dieser Arbeit war, ein Modellsystem zu erschaffen, in welchem heterolog-exprimiertes MuSK zu einem definierten Zeitpunkt aktiviert werden kann. Es wurde getestet, ob die Kinase durch Dimerisierung mittels Antikorpern zu stimulieren ist. Ebenso wurde versucht, MuSK mit dem Agrin-Rezeptor LRP4 zu ko-exprimieren und mit Agrin zu aktivieren. Leider erzielten beide beschriebenen Methoden keine detektierbare Aktivierung. Daher wurde eine konstitutiv inaktive, unphosphorylierte und eine konstitutiv aktive, phosphorylierte MuSK-Mutante entsprechend der experimentellen Anforderungen modifiziert. Internalisierungsstudien mit diesen zwei Mutanten legten nahe, dass der Phosphorylierungszustand von MuSK keine Auswirkung auf deren Endozytose und den intrazellularen Transport hat. Um den Effekt von MuSK-Ubiquitinierung auf die Internalisierung der Kinase zu untersuchen, wurden HA-markierte MuSK-Ubiquitin Chimaren HA-MuSK-Ubwt und HA-MuSK-Ubmut kloniert. Es wurde gezeigt, dass HA-MuSK-Ubwt, welches die extrazellulare und die Transmembrandomane fusioniert an Wildtyp-Ubiquitin enthalt, in COS-7 Zellen polyubiquitinyliert wird. HA-MuSK-Ubmut, welches zwei Mutationen im Ubiquitin-Teil enthalt, wird grosteils mittels Anhangen eines einzelnen Ubiquitin-Molekuls modifiziert oder bleibt unmodifiziert. Es wurde festgestellt, dass MuSK-Ubiquitinylierung, ahnlich wie der Phosphorylierungszustand, keinen signifikanten Einfluss auf seine Internalisierung und den Transport innerhalb der Zelle hat.