Rapid screening of antibiotics in foods by HPTLC-FLD/EDA/MS

Nowadays, the usage and partly abuse of veterinary antibiotics resulted in a very pressing need to control residues in foods of animal origin. Particularly, the increasingly demanding MRL issues and the huge number of samples to be monitored raised great challenges in this field. Microbial growth inhibition assays are traditionally employed for screening purposes, while sophisticated HPLC-MS methods are alternatively used or only used for confirmation purposes. To substitute the time consuming growth inhibition assays, HPTLC as a platform hyphenated to multi detection modes was employed in this study for the development of a high throughput, sensitive and cost-efficient screening-oriented methodology for antibiotics residues. The first step was focused on tetracyclines and fluoroquinolones, which are the most problematic antibiotics in the European Union and account for the most of the used veterinary antibiotics. To prevent strong tailing effects, the separation was optimized on normal-phase silica gel plates modified with ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Besides, selective and sensitive fluorescence densitometry was optimized to achieve best signal/noise ratios. Under these conditions, limits of detection (LODs) and quantitation (LOQs) were in the range 12–25 and 45–95 µg/kg, respectively. Recoveries from milk samples, spiked at 50, 100 and 150 µg/kg and extracted by a modified QuEChERS procedure, ranged from 76 to 105%. To circumvent the ion suppressions due to EDTA, HPTLC-mass spectrometry (HPTLC-MS) was optimized, allowing the selective confirmation of positive findings, also offering high sensitivity of 25 µg/kg, and meeting Commission Regulation (EU) No. 37/2010. In the second step, sulfonamides were targeted, which are the secondly most administered veterinary antibiotics in the European Union. Separation of twelve most important sulfonamides was achieved on HPTLC silica gel plates, followed by fluram derivatization and sensitive and selective quantitation by fluorescent densitometry. LODs and LOQs were determined to 15–40 and 35–70 µg/kg, respectively. Samples of bovine milk, porcine liver and kidney were extracted according to the “QuEChERS” strategy. Additionally, a confirmative detection by HPTLC-MS was optimized, offering straightforward identification of target zones. The method was validated to meet the enforced Commission Regulation (EU) No. 37/2010. Finally, a more universal screening method based on HPTLC-bioautography was developed for most of the first-line veterinary antibiotics. A comprehensive HPTLC plate test revealed that the bio-compatibility of different plate layer materials to the applied bioluminescent bacteria (A. fischeri DSM No. 7151) was surprisingly different. It was then discovered that both bright bioluminescent background and significant inhibition zones of antibiotics can only be achieved on HPTLC amino F254S plates. In this case, HPTLC was not used for the chromatographic separation of individual antibiotics extracted with acetonitrile, but in terms of planar solid phase extraction to separate bioactive matrix compounds and to focus the analytes within two distinct target zones of different polarity. Together with HPTLC-MS for identification and confirmation purposes, the developed procedure enabled the rapid, sensitive and efficient multi-class screening of antibiotic residues (16 species of 5 groups, except sulfonamides and penicillins, which only affect Gram positive bacteria). The multi-sample plate images provided the results within a few hours. Thanks to the high sensitivity and the great matrix tolerance, the established method was successfully applied to bovine milk and porcine kidney samples, each spiked at the EU MLRs. Der enorme Einsatz und partielle Missbrauch von Antibiotika in der Tiermedizin fuhrte zu dringend notwendigen Masnahmen, um Ruckstande in tierischen Lebensmitteln zu kontrollieren. Insbesondere die steigend anspruchsvollen Ruckstandshochstgehalte sowie die geforderten zunehmenden Probenzahlen stellen eine grose Herausforderung dar. Mikrobielle Hemmhof-Assays werden traditionell zum Proben-Screening eingesetzt, wahrend anspruchsvolle HPLC-MS Methoden haufig alternativ oder nur zur Absicherung positiver Befunde verwendet werden. Um die zeitintensiven Hemmhof-Assays zu ersetzen, wurde in dieser Arbeit die HPTLC gekoppelt mit Multi-Detektionsmethoden eingesetzt, um eine schnelle und kostengunstige Screening-orientierte Methodik fur Antibiotika-Ruckstande zu entwickeln. Der erste Teil der Arbeit konzentrierte sich auf zwei Gruppen von "schwierigen" Antibiotika, Tetracycline und Fluorchinolone, die zu den haufigst eingesetzten veterinarmedizinischen Antibiotika gehoren. Unter Vermeidung von Tailing-Effekten wurde die HPTLC-Trennung auf Normalphasen-Kieselgelplatten, modifiziert mit Ethylendiamintetraessigsaure (EDTA), optimiert. Auserdem wurde eine selektive und empfindliche Fluoreszenz-Densitometrie genutzt, um beste Signal/Rausch-Verhaltnisse zu erreichen. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen lagen im Bereich von 12-25 und 45-95 µg/kg. Wiederfindungen aus Milchproben, dotiert auf 50, 100 und 150 µg/kg und extrahiert mit einer modifizierten QuEChERS-Methode, ergaben sich zu 76-105%. Zur Absicherung positiver Befunde wurde die Massenspektrometrie (HPTLC-MS) bezuglich Ionensuppressionen durch EDTA dahingehend optimiert, dass eine empfindliche Detektion von 25 µg/kg moglich war und die Vorgaben der Verordnung (EU) Nr. 37/2010 erfullt wurden. Im zweiten Schritt galt das Interesse den Sulfonamiden, den zweithaufigst eingesetzten veterinarmedizinischen Antibiotika. Die Trennung erfolgte auf HPTLC-Kieselgelschichten und nachfolgender Fluram-Derivatisierung. Dies erlaubte eine selektive und sehr sensitive Quantifizierung der zwolf bedeutendsten Sulfonamide durch Fluoreszenz-Densitometrie. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ergaben sich zu 15-40 und 35-70 µg/kg. Die Extraktion von Milch-, Leber- und Nierenproben erfolgte mit Acetonitril (analog "QuEChERS"). Zur Bestatigung positiver Proben wurde erneut die HPTLC-MS Kopplung zur einfachen Identifizierung der Zielzonen optimiert. Die Methode wurde hinsichtlich der Vorgaben der Verordnung (EU) Nr. 37/2010 fur Milch sowie Schweine-Leber und -Nieren validiert. Schlieslich wurde eine universelle Screening-Methode mittels HPTLC-Bioautographie fur die meisten der First-Line Tier-Antibiotika entwickelt. Ein umfangreicher HPTLC-Plattentest zeigte, dass die Bio-Kompatibilitat der verschiedenen Schichtmaterialien mit den eingesetzten Leuchtbakterien (Aliivibrio fischeri DSM-Nr. 7151) uberraschend unterschiedlich war. Nur auf HPTLC-Amino F254S Platten zeigten die Bakterien die optimale Biolumineszenz und damit signifikante Hemmzonen fur Antibiotika. Nach Extraktion mit Acetonitril wurde die HPTLC hier nicht zur Auftrennung der einzelnen Antibiotika optimiert, sondern im Sinne einer planaren Festphasenextraktion zur Abtrennung ebenfalls bioaktiver Matrixkomponenten und zur Fokussierung der Antibiotika in zwei unterschiedlich polare Zielzonen. Zusammen mit der HPTLC-MS Kopplung lieferte diese Methode ein schnelles, empfindliches und effizientes Multi-Class-Screening von Antibiotika-Ruckstanden (16 Wirkstoffe aus 5 Gruppen, auser Sulfonamide und Penicilline, welche nur Gram-positive Bakterien hemmen). Ein Plattenbild lieferte innerhalb weniger Stunden das Ergebnis fur viele Proben. Dank hoher Empfindlichkeit und groser Matrixtoleranz wurde die Methode erfolgreich auf Milch- und Schweinenieren-Proben angewendet, dotiert auf die EU-Ruckstandshochstgehalte.