Uncovering novel pathogenicity-associated loci among Yersinia enterocolitica species by subtractive hybridization

In dieser Arbeit wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung angewandt, um neue Virulenzfaktoren zu finden, die spezifisch fur hochpathogene Yersinia enterocolitica Stamme sind. Hierfur wurde die DNA eines nicht pathogenen „Treiber”-Stammes (Y. enterocolitica NF-O, Biotyp 1A) gegen die DNA eines hochpathogenen „Tester”-Stammes (Y. enterocolitica WA-314, Biotyp 1B) subtrahiert. Mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung konnten verschiedene Tester-spezifische Sequenzen ermittelt werden, die sowohl fur bereits bekannte als auch neue potentielle Virulenzmarker kodieren. In dieser Arbeit konnte ein neues TypII-Sekretionscluster, genannt yts1 (Yersinia TypII Sekretion 1), ermittelt werden. Das yts1-Gencluster umfasst ein 13 kb groses Operon-ahnliches Modul, welches die Gene yts1C-S enthalt. Mittels reverser Transkription/PCR konnte eine bevorzugte Transkription bei 37 °C gezeigt werden. Southern Blot-Analysen sowie PCR haben gezeigt, dass das yts1-Gencluster nur in den hochpathogenen Y. enterocolitica Stammen vorkommt. Dagegen sind yts1-Gene weder in schwachpathogenen sowie apathogenen Y. enterocolitica Stammen noch in Y. pseudotuberculosis- und Y. pestis-Isolaten zu finden. Durch Inaktivierung des yts1E-Gens in Y. enterocolitica wurde eine Mutante hergestellt und hinsichtlich Mauspathogenitat mit dem Mutterstamm verglichen. Bei oraler Infektion der Mause erwies sich die yts1E-Mutante als attenuiert (geringere Keimzahlen) in Leber und Milz im Vergleich zum Mutterstamm. Im Gegensatz dazu konnte bei intravenoser Infektion der Mause kein Unterschied zwischen Mutante und Mutterstamm festgestellt werden. Dies konnte ein Hinweis darauf sein, dass das TypII-Sekretionssystem die Erregerdissemination von den Peyer-Plaques in Milz and Leber fordert. Das yts1-Sekretionscluster grenzt stromabwarts an ein Gen, welches fur ein potentielles Chitin-Bindungsprotein (ChiY) kodiert. ChiY ist ein mogliches Substrat des Yts1-Sekretons. Sequenzanalysen sagen voraus, dass ChiY ein 55-kDa Protein mit zwei definierten Chitin-Bindungsdomanen ist, von denen sich die eine Domane am N- und die andere am C-Terminus des Proteins befindet. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes ChiY Chitin bindet. Sequenzanalysen des zuganglichen fast kompletten Genoms von Y. enterocolitica 8081 (Biotyp 1B) fuhrten zum Nachweis eines moglichen zweiten TypII-Sekretionscluster, das in dieser Arbeit als yts2 bezeichnet wird. Wie mittels PCR gezeigt werden konnte, kommt yts2 - im Gegensatz zu Y. pseudotuberculosis und Y. pestis - in allen getesteten pathogenen und apathogenen Y. enterocolitica-Stammen vor. Reverse Transkriptionsanalysen/PCR zeigten, dass die yts2 - Gene bevorzugt bei 27 °C abgelesen werden. Mittels subtraktiver Technik konnte auch ein neues Insertionselement (IS1330) charakterisiert werden. Durch Southern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass IS1330 nur in pathogenen Y. enterocolitica Serotypen vorkommt und somit fur die epidemiologische Typisierung dieser Spezies eingesetzt werden kann. Diese Arbeit reprasentiert einen neuen Ansatz zur Aufklarung von unterschiedlichen intraspezifischen Genomsequenzen von Y. enterocolitica mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung, um unser Verstandnis der genetischen Vielfalt und Heterogenitat dieser bakteriellen Spezies zu erweitern. Das zum ersten Mal hier beschriebene yts1-Cluster reprasentiert einen neuen Lokus, der eine wichtige Rolle fur die Pathogenese der hochpathogenen Y. enterocolitica Stamme spielt.