Der Einfluss der Chromatinfaltung auf die Remodeling-Aktivität der ATPase ISWI

2 1 EINLEITUNG . 3 1.1 AUFBAU UND STRUKTUR VON CHROMATIN . 3 1.1.1 Stufen der Chromatin-Kondensation . 4 1.1.2 Euchromatin und Heterochromatin . 8 1.2 PRINZIPIEN DER STRUKTURREGULATION IN CHROMATIN . 8 1.3 ATP-ABHÄNGIGE CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE . 8 1.4 ISWI-FAMILIE DER CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE . 10 1.4. 1 Aufbau und Funktionsmechanismus der ATPase ISWI . 10 1.4. 2 Einflüsse des H4-Schwanz auf die Remodeling-Aktivität von ISWI . 12 1.5 ZIELE . 12 2 MATERIALIEN UND METHODEN . 14 2.1 MATERIALIEN . 14 2.1.1 Technische Geräte . 14 2.1.2 Chemikalien . 14 2.1.3 Materialien für die Filtration, Dialyse und Proteinreinigung . 15 2.1.4 E.coli Stämme . 16 2.1.5 Enzyme, Kits, DNA-Marker, Protein-Marker und Enzympuffer . 16 2.1. 6 Oligonukleotide (Primer) . 17 2.1. 7 Plasmide . 18 2.1. 8 PCR-Amplifikate . 19 2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN . 20 2.2.1 Färbung von Proteingelen . 20 2.2.2 Puffer für Agaroseund Proteingele . 20 2.2.3 Puffer zur Proteinreinigung von Histonen . 21 2.2.4 Puffer zur Rekonstitution von Oktameren . 21 2.2.5 Puffer zur Proteinreinigung von ISWIFL . 21 2.2.6 Puffer zur Proteinreinigung der Taq-Polymerase . 21 2.2.7 Puffer zur Herstellung von Nukleosomen-Arrays . 22 2.2.8 Puffer der Chromatin-Remodeling-Assays . 22 2.2.9 Sonstige Puffer und Lösungen . 22 2.3 METHODEN ZUR VERMEHRUNG, QUANTIFIZIERUNG UND ANALYSE VON DNA . 23 2.3.1 Transformation kompetenter E. coli . 23 2.3. 2 Anzüchtung von Bakterienkulturen . 23 2.3. 3 Aufreinigung von DNA-Plasmiden . 23 2.3. 4 Gelelektrophorese von Agarosegelen . 24 2.3. 5 Ethanolfällung von DNA . 24 2.3. 6 DNA-Gelextrahierung . 24 2.3. 7 Konzentrationsbestimmung von DNA . 25 2.4 ENTWURF UND SYNTHESE DER PLASMIDE PFMP 226 UND PFMP 227 . 25 2.4. 1 Entwurf von 13-mer Sequenzen mit individuellen Restriktionsschnittstellen . 25 2.4. 2 Synthese der Plasmide pFMP 226 und pFMP 227 . 26 2.5 HERSTELLUNG DER PLASMIDE PFMP 232 UND PFMP 233 . 26 2.5. 1 Isolierung der 12-mer WT 601 Sequenz . 27 2.5. 2 Klonierung der 13-mer Inserts der Plasmide pFMP 226 bzw. 227 in pUC18 . 27 2.5. 3 Klonierung der Plasmide pFMP 232 und pFMP 233 . 27 2.6 HERSTELLUNG VON DNA-FRAGMENTEN FÜR NUKLEOSOMEN-ARRAYS . 28 2.6. 1 Herstellung der DNA-Fragmente für 13-mer Nukleosomen-Arrays . 29 2.6. 2 Herstellung der DNA-Fragmente für 25-mer Nukleosomen-Arrays . 29 2.7 METHODEN ZUR ANALYSE UND HERSTELLUNG VON PROTEINEN. 30 2.7. 1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) . 30 2.7. 2 Expression rekombinanter Histone in chemisch kompetenten E. coli . 30 2.7. 3 Proteinaufreinigung der Histone H2A, H2B und gH4 . 30 2.7. 4 Expression von ISWIFL in chemisch kompetenten E.coli . 32 2.7. 5 Proteinaufreinigung von ISWIFL (His6 -TEV, full length) . 32 2.8 REKONSTITUTION VON HISTONOKTAMEREN . 33 2.9 REKONSTITUTION VON 13-MER UND 25-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS . 34 2.9. 1 Assemblierung von DNA und Oktameren zu Nukleosomen-Arrays . 34 2.9. 2 Magnesiumfällung der Nukleosomen-Arrays . 35 2.9. 3 Qualitätskontrollen der 13-mer und 25-mer Nukleosomen-Arrays . 36 2.10 ANALYTISCHE MAGNESIUMFÄLLUNG VON NUKLEOSOMEN-ARRAYS . 37 2.11 RESTRICTION-ENZYME-ACCESSIBILITY-ASSAYS . 37 2.11.1 Variation der MgCl2 Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays . 38 2.11.2 Variation der ISWI-Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays . 38 2.11.3 Quantifizierung der Chromatin-Remodeling-Assays . 38 2.12 METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON MONOUND DINUKLEOSOMEN . 39 2.12.1 Herstellung der Monomer-DNA-Sequenzen . 39 2.12.2 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 213 . 39 2.12.3 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 217 . 40 2.12.4 DraIII Verdau und Aufreinigung der PCR-Amplifikate . 40 2.12.5 Ligation der PCR-Amplifikate PCRA 213 und 217 . 41 2.12.6 Herstellung von Dimer-DNA-Sequenzen . 41 2.12.7 Rekonstitution von Monound Dinukleosomen . 42 2.12.8 Qualitätskontrollen der Mononukleosomen . 42 2.12.9 Qualitätskontrollen der Dinukleosomen . 43 2.12.10 Dinukleosomen-Ligationsversuch . 43 2.13 EXPRESSION UND PROTEINAUFREINIGUNG DER TAQ-POLYMERASE . 43 2.13.1 Transformation und Expression der Taq-Polymerase . 43 2.13. 2 Induktionskontrollen der Taq-Polymerase pFMP 222 . 44 2.13. 3 Chromatographische Proteinaufreinigung der Taq-Polymerase . 45 3 ERGEBNISSE . 47 3.1 ASSEMBLIERUNG VON 13-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS MIT STÖCHIOMETRISCHEN MENGEN AN HISTONOKTAMEREN . 47 3.1.1 Qualitätskontrollen der 13-mer Arrays . 50