Enzymatic Synthesis and Microbial Degradation of β-Amino Acids via Transaminases

Enantiomerenreine β-Aminosauren sind von erheblicher Bedeutung als Bestandteile zahlreicher Antibiotika und andere Medikamente. Da zur chemischen Synthese von β-Aminosauren chirale Vorstufen, toxische Materialien und metallische Katalysatoren benotigt werden, werden sie industriell mit enzymatisch katalysierter kinetischer Resolution racemischer β-Aminosaureestern hergestellt. Transaminasen besitzen einige Vorteile, die sie fur die Synthese von β-Aminosauren geeignet machen, zum Beispiel besitzen sie ein breitgefachertes Substratspektrum. Diese Enzyme wurden in dieser Arbeit fur die asymmetrische Synthese zur Herstellung von enantiomerenreinen β-Aminosauren untersucht, sowie die Wiederverwendbarkeit dieser Enzyme mittels Immobilisierung erreicht werden konnte. Das Gen, einer in der Literatur beschriebenen Aminotransferase aus Variovorax paradoxus wurde synthetisiert, ein His-Tag angefugt und in einen Expressionsvektor kloniert. Die erfolgreiche heterologe Expression in Escherichia coli wurde mittels Nickelchelat-Affinitatschromatography und SDS-PAGE uberpruft und die Aktivitat des Enzyms mittels Biotransformation mit mehreren β-Aminosauren nachgewiesen. Die Immobilisierung erfolgte aus dem Zellrohextrakt an magnetische M-PVA Beads, sodass hier erstmals fur Aminotransferase eine kombinierte Reinigungs- und Immobilisierungsmethode realisiert werden konnte. Die immobilisierte Aminotransferase zeigt Langzeitstabilitat in einem Zeitraum von 38 Tagen, mit einer Restaktivitat von 50 %. Auserdem ist sie mindestens 7 Mal wiederverwendbar mit einer Restaktivitat von 90 %, ist stabil bei hoheren Temperaturen und bei hoheren pH-Werten. Durch die Immobilisierung an magnetischen Beads ist die Abtrennung des Enzyms aus der Reaktion erheblich erleichtert. Die Aktivitat wurde durch kinetische Resolution mehrerer enantiomerenreinen aromatischen β-Aminosauren bestimmt. Fur die asymmetrische Synthese von enantiomerenreinen aromatischen β-Aminosauren sollte eine Enzymkaskade verwendet werden, die aus einer Lipase und einer Aminotransferase besteht. Dies ist erforderlich, da das benotigte prochirale Edukt, die β-Ketosaure thermodynamisch instabil ist und durch Hydrolyse eines stabilen β-Ketosaureesters hergestellt wird. Die Lipasen aus Candida rugosa, aus Thermomyces lanuginosus und aus Rhizomucor miehei wurden erfolgreich fur die Hydrolyse von β-Ketosaureester eingesetzt und zeigten Aktivitat fur das Substrat Ethyl Benzoylacetat und seine am Phenylring in para-Stellung substituierten Derivate, so dass nun Enzyme fur beide Teilreaktionen der Kaskade zur Verfugung stehen. Transaminaseaktivitat wurde in einem Burkholderia phytofirmans BS115 Stamm nachgewiesen. Deshalb sollte das verantwortliche Enzym naher charakterisiert werden und die Aufnahme von β-Aminosauren in die Zelle untersucht werden, da es bisher kaum Informationen zum β-Aminosauremetabolismus in Bakterien gibt. Dazu wurde ein Fermentationsprozess etabliert. Zuerst wurden Schuttelkolbenexperimente mit verschiedenen Konzentrationen von rac-β-Phenylalanin und Glukose durchgefuhrt. Dies brachte erste Erkenntnisse zum Abbau des (R)- und (S)-β-Phenylalanins und zeigte, dass bei der Reaktion Acetophenon entsteht. Das (S)-Enantiomer wurde nach 21 h bereits vollstandig aufgebraucht, in dieser Zeit steigt die Konzentration an Acetophenon an. Nachdem das (S)-Enantiomer abgebaut wurde, sinkt die Konzentration des (R)-Enantiomers. Dieses konnte durch oxidative Desaminierung abgebaut worden sein. Da bei der Biotransformation mit Rohextrakt oder mit aufgereinigtem Enzym mit rac-β-Phenylalanine nach Zugabe von PLP und des Aminoakzeptors nur der Abbau des (S)-Enantiomers beobachtet werden konnte, kann man davon ausgehen, dass eine (S)-selektive Aminotransferase fur den Abbau verantwortlich ist. Die (S)-selektive Aminotransferase ist auch geeignet um andere aromatische β-Aminosauren, die am Phenylring in para-Stellung substituiert sind (mit F, Cl, NO2, CH3O, OH, Br) enantioselektiv abzubauen. Zur Aufreinigung des fur die Transaminaseaktivitat in Burkholderia phytofirmans BS115 verantwortlichen Enzyms wurden eine Ammoniumsulfatfallung und eine Anionenaustausch-chromatographie durchgefuhrt. Ein Aufreinigungsfaktor von insgesamt 10 konnte fur die Transaminase erzielt werden.