Mise en place d'un modèle cellulaire d'étude des granulomatoses septiques chroniques autosomales récessives

La granulomatose septique chronique (CGD) est une maladie orpheline caracterisee par un defaut de fonctionnement de la NADPH oxydase des phagocytes professionnels. Cette enzyme est constituee d'un element membranaire, le cytochrome b558, et de facteurs cytosoliques, p47phox, p67phox et p40phox. Le cytochrome b558 est forme de deux sous-unites, la glycoproteine gp91phox et p22phox. Deux petites proteines G Rac1/2 et Rap1 sont egalement impliquees dans la regulation du fonctionnement de la NADPH oxydase. Au cours de son activation, l'assemblage des elements cytosoliques et membranaires de l'enzyme permet la formation d'un complexe actif produisant des ions superoxyde. On distingue deux types de transmission de la CGD : la forme liee a l'X et les formes autosomales recessives (CGD AR) dues a des mutations dans les genes codant p22phox ou les deux facteurs cytosoliques (p47phox et p67phox). Ces dernieres sont rares et les mutations geniques impliquees, tres heterogenes. Actuellement, il n'existe pas de modeles cellulaires qui permettent l'etude approfondie des CGD autosomales recessives et plus particulierement les CGD AR+ dans lesquelles la proteine mutee est exprimee en quantite normale mais est non fonctionnelle. L'objectif de ce travail a ete de mettre en place un modele cellulaire permettant de reproduire les mutations geniques a l'origine des CGD AR ou d'en creer de novo, afin d'etudier l'impact de ces mutations sur le fonctionnement du complexe oxydase. Ce modele a ete realise dans les cellules fibroblastiques de rein de singe (cellules COS7). Dans un premier temps le contenu en ARNm et en proteines du complexe oxydase a ete evalue dans ces cellules. La RT-PCR et le sequencage ont permis de mettre en evidence la presence des ARN messagers (ARNm) de p22phox, p67phox, p40phox et Rac1 dans les cellules COS7. Les resultats obtenus par western blot et cytometrie en flux ont montre que les proteines p22phox, p40phox et Rac etaient exprimees dans les cellules COS7. La seconde etape a ete l'obtention de cellules COS7 exprimant le cytochrome b558. L'ADNc de gp91phox prealablement clone dans un vecteur d'expression eucaryotique, a ete transfecte de facon stable dans ces cellules. La fonctionnalite du cytochrome b558 recombinant exprime dans les membranes plasmiques des cellules COS7 transfectees, a ete evaluee en presence de cytosol de neutrophiles, afin de reconstituer une activite NADPH oxydase in vitro. A partir de ces cellules transgeniques, d'autres modeles exprimant le cytochrome b558 et un ou plusieurs facteurs cytosoliques ont ete obtenus. Les ADNc de p47phox, p67phox et p40phox ont ete clones dans des vecteurs d'expression eucaryotique possedant des cassettes de resistance a un antibiotique differentes. Les modeles COS7-cytochrome b558 exprimant un ou plusieurs facteurs cytosoliques sont en cours d'evaluation et de caracterisation. Ces modeles cellulaires de CGD AR seront des outils interessants pour etudier l'impact de certaines mutations des ADNc de p47phox ou p67phox sur le fonctionnement du complexe oxydase et les mecanismes moleculaires de son assemblage.