Whole-embryo culture of mouse embryos to study vascular development

Entstehung funktioneller Blutgefase ist eine Grundvoraussetzung fur das Uberleben aller hoherer Organismen, da Blutzirkulation fur den Transport von Nahrstoffen, Atemgasen und Stoffwechselsignalen zu den Geweben, so wie fur den Abtransport von Abfallstoffen und Kohlendioxid unentbehrlich ist. Blutgefase sind auserdem in die Entstehung von Krankheiten wie Krebs und Schlaganfall verwickelt. Deshalb ist es von essentieller Bedeutung, die Entstehung der Blutgefase zu verstehen und zu manipulieren, um neue Ziele fur therapeutische Masnahmen zu finden. Die zwei wichtigsten Formen der Gefasentstehung, Vasculogenese und Angiogenese, beinhalten beide die Polarisierung von Endothelzellen, vor der eigentlichen Lumenbildung. Bis vor kurzem dachte man, dass die Verschmelzung intrazellularer Vakuolen der wichtigste Mechanismus der Lumenbildung sei. Nun jedoch, richtet sich die Aufmerksamkeit mehr auf die extrazellulare Lumenbildung. Der Umbau vaskularer Verknupfungspunkte, das Entstehen einer apikalen Membran, so wie die Trennung gegenuberliegender Endothelzellmembranen sind entscheidende Schritte dieses Prozesses. Die Aufklarung der zu Grunde liegenden Mechanismen und Molekule erfordert eine prazise und reproduzierbare Technik zur Manipulation und Darstellung. Bisherige Studien wurden zumeist in Embryonen der Fischgattung Danio rerio durchgefuhrt, da diese billig, leicht zu handhaben und zu manipulieren sind, da sie in der Embryonalentwicklung transparent sind. Zebrabarblinge (Danio rerio) zeigen jedoch auffallige Unterschiede zu Mausen und Menschen bei der Herzentstehung, der Sprossung der intersomitischen Gefase, der Bildung der Aorta, sowie dem Ort der Blutbildung. Deshalb sind Studien der embryonalen Mausentwicklung auf molekularer Ebene dringend notwendig und hervorragend geeignet um Studien am Zebrabarbling zu erganzen. Um die Anforderungen zu erfullen, die an diese neuen Studien der Blutgefasentwicklung in der Maus gestellt werden, habe ich die Methode der ex vivo-Kultivierung ganzer Mausembryonen verbessert. Mausembryonen konnen jetzt nach Manipulation der Gefasentwicklung fur bis zu 24 Stunden weiter kultiviert werden. Nach der Kultur konnen sie im Ganzen oder in Schnitten gefarbt oder mit anderen Methoden untersucht werden. Die Manipulation erreicht man durch die Injektion pharmakologischer Substanzen oder Antikorper, die spezifisch Signalwege blockieren oder aktivieren. Diese Behandlung erfordert nur kleinste Mengen an Substanz und grenzt die Effekte lokal, auf die Injektionsregion, ein, wodurch interne Kontrollen verwendet werden konnen. Die neu entwickelten Medien zur Kultur kommen ganzlich ohne oder nur mit Kalberserum aus, so dass der Preis der Kultur um bis zu 90% sinkt und primare Antikorper jeder verbreiteten Spezies verwendet werden konnen. Unter Anwendung dieser Technik konnen Vasculogenese und Angiogenese jetzt im vollstandigen Mausembryo mittels Konfokalmikroskopie untersucht werden. Zusatzlich zur Gefasentwicklung konnen beliebige weitere Entwicklungsprozesse, die im selben Zeitrahmen ablaufen, untersucht werden. Wir haben fruhe Versionen dieser Technik dazu verwendet, um den Einfluss der negativ geladenen Sialomucine, insbesondere von Podocalyxin, auf die Lumenbildung zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Sialinsaurereste, bzw. ihre negativen Ladungen notwendig und entscheidend fur die Bildung des ersten Spalts zwischen zwei aneinander liegenden Endothelzellen sind. Das Entfernen oder Verdecken der negative Ladungen hatte einen Ruckgang der Lumenbildung zur Folge, ein Effekt der durch die kunstliche Zugabe von negativen Ladungen verhindert werden konnte. Die Bildung eines Spalts zwischen Endothelzellen, die durch negative Ladungen hervorgerufen wird, wurde dabei nach der Polarisierung als initialer Schritt in der Lumenbildung der Aorta identifiziert.