Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores

Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento molecular donde una biomolecula interactua en forma altamente especifica con un analito y donde el cambio quimico producido en presencia del analito se traduce en una senal electrica procesable. Una de las etapas mas importantes en el diseno de un biosensor es la de generar una estructura o superestructura, en la cual esten insertas las biomoleculas responsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependeran la actividad de la biomolecula, la sensibilidad, la especificidad y el ambito de uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de la inmovilizacion de enzimas y anticuerpos en el contexto de la construccion de electrodos enzimaticos para la deteccion de glucosa y de la construccion de sensores inmunologicos para detectar moleculas pequenas a traves de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron en forma complementaria distintas tecnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometria, la Microscopia de Fuerza Atomica (AFM)y diversas Tecnicas Electroquimicas. Como tecnicas de inmovilizacion se utilizaron la funcionalizacion covalente de superficies, el autoensamblado electrostatico, el empleo de uniones de importancia biologica como avidina-biotina o antigeno-anticuerpo en la inmovilizacion de enzimas y el uso de proteinas orientadoras como proteina A y proteina G para la inmovilizacion de anticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas de glucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente con un complejo de Os: [Os(bpy)2ClPyCOH]+, (PAH-Os), depositadas sobre superficies de oro modificadas con acido 3-mercaptopropansulfonico (MPS). Las etapas de adsorcion del polimero y la glucosa oxidasa se repitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificados hasta con 14 bicapas de polimero-enzima. El espesor elipsometrico, determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las peliculas autoensambladas, determinadas por QCM en condiciones gravimetricas, se determinaron en contacto con solucion de electrolito y en condiciones de sequedad y se estimo a partir de dichas mediciones la densidad de la pelicula en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extraccion de las propiedades viscoelasticas de peliculas autoensambladas por combinacion de QCM y elipsometria. Por combinacion del espesor y densidad estimados de la pelicula, la expresion de la impedancia mecanica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad del electrolito, se pudieron estimar los valores de los modulos de almacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una pelicula autoensamblada como funcion del espesor y el potencial de electrodo durante dos tipos de perturbaciones electroquimicas: voltametria ciclica y saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas tecnicas, QCM y elipsometria en el estudio de la construccion de peliculas autoensambladas, estas se emplearon para el estudio del crecimiento de peliculas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Os utilizando dos estrategias distintas de inmovilizacion de la enzima: la formacion de una union antigeno-anticuerpo y la formacion de una union avidina-biotina. Se estudio la cinetica de adsorcion de las biomoleculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durante la inmovilizacion de la enzima. Se estudio ademas el comportamiento biocatalitico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en las distintas estructuras autoensambladas y se llego a la conclusion de que la eficiencia de la comunicacion electrica entre las enzimas y el mediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilizacion de la enzima, como por la cantidad de centros redox del polimero de osmio por cada molecula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructuras autoensambladas no solamente tienen aplicacion en el diseno de electrodos enzimaticos, sino tambien en el desarrollo de biosensores inmunologicos. La formacion de una union antigeno-anticuerpo no genera una senal medible por lo cual se recurre al uso de sustancias marcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrollados ultimamente estan basados en el uso de enzimas oxidoreductasas como marcadoras. Ademas de los marcadores es necesario utilizar mediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitio redox de la enzima y revelar la actividad enzimatica a traves de la senal del mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tanto el transductor para la deteccion enzimatica, como el soporte inerte sobre el cual se inmovilizan los antigenos o los anticuerpos. En este contexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y un anticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensor modelo para la deteccion de moleculas pequenas (como la biotina) a traves de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimatico basado en peroxidasa de rabano, HRP-biotina. Con la tecnica de EQCM se estudio la deposicion de las multicapas, es decir la cantidad de IgG depositada en cada capa, los cambios viscoelasticos durante la adsorcion, la cinetica de adsorcion para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la tecnica de AFM se observo la estructura y orientacion de las moleculas de IgG adsorbidas sobre el polimero y finalmente con las tecnicas electroquimicas se estudio el crecimiento de las bicapas y la utilidad de la supraestructura como biosensor, a traves del estudio de la catalisis enzimatica del conjugado. Finalmente se describen resultados preliminares sobre el uso de proteinas orientadoras, proteina A y G’, utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer la reaccion entre el antigeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusion, los resultados obtenidos confirman que la inmovilizacion de biomoleculas es por cierto una de las etapas mas importantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta del mismo. Ademas se muestra la necesidad de recurrir a distintas tecnicas para su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias de cada tecnica.