Detecting novel effects of exercise or AMPK activation in human skeletal muscle

Cardiovascular and metabolic disorders are among the main causes of death today. Regular exercise can prevent and treat these chronic diseases. A molecule at the center of exercise adaptations in skeletal muscle is adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Rapid energy turnover in cells, such as during contraction in skeletal muscle, activates AMPK. The activation of AMPK leads to inhibition of anabolic processes that consume energy and upregulation of catabolic processes that generate energy. AMPK activation increases glucose uptake into peripheral tissues. Even insulin-resistant individuals, including type 2 diabetes patients, retain the blood-glucose lowering effect of AMPK activation. There is a need to better understand how exercise provides protective benefits, and how AMPK functions at the cellular level. This thesis consists of three research papers wherein exercise and AMPK activation were used as experimental models to identify novel effects of these signals in human skeletal muscle. The first paper explores how fasting between consecutive bouts of exercise from one day to the next enhances the adaptive response. Overlapping fasting with exercise increases AMPK signaling and expression of genes that regulate fat oxidation. In addition, the combination of exercise and fasting elicits changes in DNA promoter methylation. Fasting overnight between an evening and morning training session enhances the adaptive benefits of exercise. The second paper investigated if AMPK activation and insulin signaling affect the focal adhesion kinase (FAK) in a differential manner in human skeletal muscle. FAK is a necessary component for insulin and growth signaling in non-human skeletal muscle models, and cancer researchers are exploring FAK inhibitors as cancer therapeutics. The new research provided herein demonstrates that insulin does not activate FAK in human skeletal muscle. However, AMPK does inhibit FAK. Furthermore, siRNA-mediated silencing of FAK in cells increases lipid oxidation. AMPK inhibits FAK, and FAK affects substrate utilization in skeletal muscle cells. In the final paper, a bioinformatic analysis identified genes that are regulated by AMPK, including the gene for ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1). GDAP1 regulates mitochondrial function in nerve cells. Silencing GDAP1 does not alter mitochondrial function or morphology. However, silencing GDAP1 does reduce lipid oxidation, non-mitochondrial respiration, and alters the expression of circadian genes. AMPK regulates GDAP1 expression, and GDAP1 alters lipid oxidation without affecting mitochondrial function in skeletal muscle. The key findings of the thesis are; 1) combining fasting with exercise impacts the epigenetic state in muscle and induces adaptive changes that promote lipid oxidation, 2) AMPK-mediated FAK inhibition may be a therapeutic strategy to treat cells which have a reduced capacity to oxidize lipids, and 3) GDAP1 in skeletal muscle plays a role in modulating the core circadian clock and non-mitochondrial lipid oxidation. SVENSKA SAMMANFATTNING Idag dör många människor på grund av hjärteller metaboliksjukdomar. Dessa sjukdomar kan undvikas och behandlas genom regelbunden fysiskt träning. En molekyl som är viktigt för att driva adaptation av skelettmuskel av träning är adenosin monofosfat-aktiverat protein kinas (AMPK). AMPK aktiveras när energinivån i en cell är låg. När AMPK aktiveras, stängs processer som kräver energi av medan processer som tillverker energi aktiveras. En viktig roll för AMPK är att den kan leda till en minskning av blodsocker, även i personer med insulinresistans så som patienter med diabetes typ 2. Mycket forskning har genomförts om träning och hur AMPK fungerar, men det finns ett behov att bättre förstå mekinismer som ger fördelarna från träning. Denna avhandling består av tre vetenskapliga projekt där träning och AMPK aktivering användades att identifiera nya effekter av dessa signaler i mänsklig skelettmuskel. Den första artikel i avhandlingen studerar hur fasta mellan träningstillfällen kan förbättra kroppens möjlighet att svara på träningen. AMPK-signalering samt gener som stimulera fettoxidering ökade. Metylering av DNA studerades även. I den andra artikel studerades om AMPK-aktivering och insulinstimulering påverkar focal adhesion kinase (FAK) på olika sätt i mänsklig skelettmuskel. Även om insulinstimulering ökar FAK aktivering i andra celler, visar denna forskning att insulin inte aktiverar FAK i human skelettmuskel. Vi identifierar även att FAK hämmas när AMPK aktiveras. Slutligen, när FAKaktivering minskat genom siRNA transfektion, är fettoxidation höjd. I den sista artikel, identifierats nya gener som regleras av AMPK-aktivering. En gen är ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1), en gen som underhåller mitokondriell funktion i nervceller. När GDAP1 hämmas genom siRNA transfektion i humana skelettmuskelceller, påverkas inte mitokondriernas form eller funktion. Däremot identifierar vi en effekt på gener viktiga för reglering av dygnsrytm och icke-mitokondriell respiration. Sammanfattningsvis, 1) att fasta mellan träningstillfällen kommer att öka effekter av träningen och påverkar epigenetiska tillstånd i muskel samt transkription och translation av gener viktiga för fettoxidering, 2) att hämma FAK genom AMPK-aktivering kan vara en strategi att behandla celler med reducerad förmåga att förbränna fett, och 3) i human skelettmuskel spelar GDAP1 en roll i reglering av dygnsrytm och icke-mitokondriell respiration. LIST OF SCIENTIFIC PAPERS I. Lane SC, Camera DM, Lassiter DG, Areta JL, Bird SR, Yeo WK, Jeacocke NA, Krook A, Zierath JR, Burke LM, Hawley JA. Effects of sleeping with reduced carbohydrate availability on acute training responses. J Appl Physiol (1985). 2015 Sep 15; 119(6): 643-55. II. Lassiter DG, Nylén C, Sjögren RJO, Chibalin AV, Wallberg-Henriksson H, Näslund E, Krook A, Zierath JR. FAK tyrosine phosphorylation is regulated by AMPK and controls metabolism in human skeletal muscle. Diabetologia. 2018 Feb; 61(2): 424-432. III. Lassiter DG, Sjögren RJO, Gabriel BM, Krook A, Zierath JR. Lipid oxidation in skeletal muscle is impaired due to GDAP1 silencing, an AMPK-regulated gene. Manuscript submitted to Diabetes. SCIENTIFIC PAPERS NOT INCLUDED IN THIS THESIS Mudry JM, Lassiter DG, Nylén C, García-Calzón S, Näslund E, Krook A, Zierath JR. Insulin and Glucose Alter Death-Associated Protein Kinase 3 (DAPK3) DNA Methylation in Human Skeletal Muscle. Diabetes. 2017 Mar; 66(3): 651-662. Nylén C, Aoi W, Abdelmoez A, Lassiter DG, Lundell L, WallbergHenriksoon H, Näslund E, Pillon N, Krook A. IL6 and LIF mRNA expression in skeletal muscle is regulated by AMPK and the transcription factors NFYC, ZBTB14 and SP1. Am J Physiol Endocrinol Metab, accepted for publication. CONTENTS