Identification of the substrates of the protease MT1-MMP in TNFalpha-stimulated endothelial cells by quantitative proteomics: analysis of their potential use as biomarkers in inflammatory bowel disease

Entender los mecanismos moleculares que regulan la angiogenesis es un aspecto esencial en la patologia de numerosas enfermedades. La metaloproteasa de matriz extracelular de membrana tipo 1 (MT1-MMP) es una potente enzima pericelular expresada por las celulas vasculares. Este trabajo ha explorado la contribucion de MT1-MMP en la angiogenesis, formacion de nuevos vasos a partir de vasculatura pre-existente, en el contexto inflamatorio. Para ello, se ha aplicado la tecnica de proteomica cuantitativa denominada SILAC en celulas endoteliales derivadas de ratones de genotipo silvestre o deficientes en MT1-MMP; estas celulas endoteliales se han activado con la citoquina inflamatoria TNF? con objeto de identificar el repertorio de sustratos de MT1-MMP e identificar candidatos que podrian afectar la respuesta angiogenica en inflamacion. Hemos demostrado que TNF? activaba las celulas endoteliales e inducia la expresion de varios marcadores caracteristicos de celulas endoteliales lider (tip). El tratamiento con TNF? tambien aumentaba la expresion de la proteasa MT1-MMP en las celulas endoteliales lo que correlacionaba con diferencias en el glicoproteoma del sobrenadante de cultivo de celulas endoteliales de genotipo silvestre versus deficientes en MT1-MMP. Las glicoproteinas identificadas como sustratos potenciales de MT1-MMP incluyen proteinas de la matriz extracelular, proteinas matricelulares y proteinas secretadas como TSP1, CYR61, NID1, SEM3C o SLIT2 asi como citoquinas y factores de crecimiento como EGFR y CSF1. El analisis bioinformatico de los datos proteomicos ha desvelado un programa proteolitico combinatorial, en el cual el procesamiento combinado de varios sustratos por MT1-MMP en vez del procesamiento de sustratos individuales es el que determina las decisiones biologicas de las celulas endoteliales activadas tales como quimiotaxis, motilidad y adhesion celular, y desarrollo vascular. Hemos confirmado que el procesamiento de TSP1, CYR61, NID1 y SEM3C esta disminuido tanto en celulas como en ratones deficientes en MT1-MMP lo que correlaciona con una reduccion de la respuesta angiogenica. Por ultimo, hemos investigado la importancia de este programa proteolitico mediado por MT1-MMP en patologias que cursan con angiogenesis inflamatoria, en concreto en enfermedad inflamatoria intestinal. Utilizando un modelo de colitis experimental en raton hemos observado que los niveles solubles en suero de los sustratos TSP1 y NID1 aumentan en correlacion con la expresion de MT1-MMP a lo largo de la severidad de la colitis. Ademas, en muestras de suero procedentes de pacientes con colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn con actividad baja/moderada tambien se observa un aumento en los niveles de TSP1 y NID1. En conclusion, nuestros datos demuestran la importancia de MT1-MMP como proteasa reguladora de la angiogenesis inflamatoria en celulas endoteliales e indican que sustratos procesados por MT1-MMP como TSP1 o NID1 pueden servir como biomarcadores para el diagnostico o pronostico de enfermedades inflamatorias cronicas.