The Role of the MAPKKK Raf36 in MKK2 mediated stress signalling in Arabidopsis thaliana

Ziel des Projekts war die Aufklarung der Funktion der MAPK (mitogen activated protein kinase) Kinase Kinase Raf36 in MKK2-vermitteltem MAPK signalling in Arabidopsis thaliana. Raf36 gehort zu den 60 RAf-ahnlichen Kinasen in A.thaliana und wurde in einem Yeast-two-Hybrid (YTH) Screen als MKK2 Interaktor isoliert. MKK2, eine der 10 A.thaliana MAPKK’s, hat Funktionen in Stress Signalwegen aktiviert durch Salz und Kalte Stress (Teige, 2004) sowie durch die Pathogene Pseudomonas syringae und Alternaria brassicicola (Brader, 2007). Die Interaktion zwischen Raf36 und MKK2 konnte im Hefesystem sowie durch in vitro pulldown verifiziert werden. In in vitro Kinase-Assays konnte die Kinase Aktivitat von Raf36 nachgewiesen werden. Das rekombinante Protein zeigte schwache Autophosphorylierung. Diese war in einer mutierten, Kinase-inaktiven Form des Proteins nicht mehr detektierbar. Da MKK2 von Raf36 in vitro nicht phosphoryliert wurde, lag die Existenz einer autoinhibitorische Domane am Amino-Terminus des Proteins nahe. In diesem Fall ware ein spezifischer Stimulus erforderlich um Raf36 zu aktivieren. Um die Autoinhibierung zu umgehen wurden mehrere Raf36-Versionen mit verkurztem Amino-Terminus generiert. Diese verkurzten Proteine waren in der Lage, rekombinantes MKK2 in vitro zu phosphorylieren. Zwei knockout-Linien, unabhangige raf36-Allele aus der SALK T-DNA Insertions Kollektion, wurden charakterisiert zur Untersuchung der Raf36 Funktionen in planta verwendet. Transgene Raf36-uberexprimierende Linien konnten nicht generiert werden, deshalb beschrankten sich die in planta Versuche auf knockout Pflanzen. Keimungsversuche zeigten, dass die raf36-1 Linie, wie mkk2 Pflanzen auch, in der Keimung auf Salz-haltigem Medium inhibiert sind, genauso auf Sorbitol und Methylviologen, einem oxidativen Stress Agens. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Rolle von Raf36 zusammen mit MKK2 in osmotischem /oxidativem Stress Signalling hin. Da die zweite raf36 Linie keine signifikante Keimungsinhibierung auf Salz-haltigem Medium zeigte, ist die Identifikation und Untersuchung einer weiteren raf36 knockout Linie erforderlich. , um Aussagen uber die Salz- Sensitivitat treffen zu konnen. Im Gegensatz zu mkk2-Pflanzen (Teige, 2004) wurde in raf36 Pflanzen keine verminderte MPK4- und MPK6-Aktivierung nach Kalte Behandlung gefunden. Somit scheint Raf36 nicht in MKK2-vermittelte Signalwege involviert zu sein, die durch Kalte induziert werden. raf36-Pflanzen stellten sich als hypersensitiv gegenuber Alternaria brassicicola Infektion heraus, genau wie MKK2EE Linien, die eine konstitutiv aktive Form von MKK2 (MKK2EE) uberexprimieren (Brader, 2007). Jasmonsaure-Level waren nach A.brassicicola Infektion in raf36- and MKK2EE-Linien vermindert. Eine Transkriptom-Analyse nach A.brassicicola Infektion enthullte deutliche Uberlappungen in der Gruppe differentiell regulierter Gene in beiden Linien. Diese Ergebnisse legen eine Rolle von Raf36 zusammen mit MKK2 in A.brassicicola induzierten Stress Signalwegen nahe. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf eine Regulation von MKK2 durch Raf36 nach A.brassicicola Infektion hin. Raf36 scheint in diesem Kontext die Aktivitat von MKK2 zu inhibieren. Der Mechanismus dieser Inhibition bleibt zu klaren, genau wie die Rolle von Raf36 MKK2-vermittelten abiotischen Stress Signalwegen.