Molecular‐based identification and phylogeny of Armillaria species from Serbia and Montenegro

Summary Armillaria causes problems of root rot, kill trees and decay wood in the forests of Serbia and Montenegro, but the species involved have not hitherto been identified. The aim of this study was to identify field isolates collected on 25 localities. Identification was based on restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of intergenic spacer 1 (IGS1) region and comparisons of IGS1 sequence with those available on NCBI database. Phylogenetic analysis was performed on sequence information from selected isolates to determine possible interrelationships between isolates with different banding patterns and previously identified tester isolates of five European Armillaria species. Five Armillaria species were identified in 90 isolates obtained from forests in Serbia and Montenegro. Armillaria gallica was most frequently isolated, followed by A. cepistipes, A. mellea, A. ostoyae and A. tabescens; two isolates remained unidentified. Restriction digestion of IGS1 amplification products with AluI produced 10 RFLP patterns. Patterns G4 (400, 250, 180) for A. gallica and pattern X (400, 180, 140) for isolates 74 and 79 are reported for the first time in European isolates. Eight RFLP patterns were observed after restriction with TaqI. Two patterns each were observed for A. ostoyae and A. gallica, and one each for A. cepistipes, A. mellea, A. tabescens and isolates 74 and 79. Parsimony analyses based on the IGS1 region placed the isolates into four clades: one including A. mellea, the second containing A. gallica–A. cepistipes isolates, while isolates of A. ostoyae and A. borealis were in the third clade. Armillaria tabescens differed from all annulate species. Phylogenetic analysis supported the conclusion that European Armillaria species are closely related and separated from a common ancestor in the near past. According to this survey five European Armillaria species are present in the forests of Serbia and Montenegro, while A. borealis is not present in the studied ecosystems. Resume L'Armillaire cause des degâts de pourriture racinaire, de mortalite et de degradation du bois dans les forets de Serbie et Montenegro, mais les especes imliquees n'ont pas encore ete indentifiees. L'objectif de cette etude est d'identifier les isolates recoltes dans 25 localities. L'identification est basee sur l'analyse RFLP de la region IGS1 et sur la comparaison des sequences IGS1 avec celles disponibles dans la base de donnees NCBI. Une analyse phylogenetique a ete realisee a partir des donnees de sequences de certains isolates pour determiner les relations entre isolates presentant des profiles differents et des isolates testeurs precedemment identifies de cinq especes europeennes d’Armillaria. Cinq especes d’Armillaria ont ete identifiees parmi les 90 isolats provenant des forets de Serbie et Montenegro. Armillaria gallica a ete la plus frequemment isolee, suivie de A. cepistipes, A. mellea, A. ostoyae et A. tabascens; deux isolats n'ont pu etre identifies. La digestion-restriction des produits d'amplification de l'IGS1 avec AluI a produit dix profils RFLP differents. Le profil G4 (400, 250, 180) pour A. gallica et le profil X (400, 180, 140) pour les isolats 74 et 79 sont mentionnes pour la premiere fois pour des isolats europeens. Huit profils RFLP ont ete observes apres restriction avec TaqI. Deux profiles ont ete observes pour chacune des especes A. ostoyae et A. gallica, et un seul profil par espece pour A. cepistipes, A. mellea, A. tabascens et par isolate 74 et 79. Les analyses de parsimonie basees sur la region IGS1 ont place les isolats dans quatre clades: un contenant A. mellea, un second contenant les isolates de A. gallica et A. cepistipes, tandis que les isolates de A. ostoyae et A. borealis sont groupes dans un troisieme clade. A. tabescens differe de toutes les autres especes a anneau. L’ analyse phylogenetique conforte l'hypothese que les especes europeennes d'Armillaria sont proches et se seraient separees d'un ancetre commun relativement recemment. D'apres cette etude, cinq especes europeennes d'Armillaria sont presentes dans les forets de Serbie et Montenegro, mais A. borealis n'est pas presente dans les ecosystemes etudies. Zusammenfassung Armillaria verursacht Wurzelfaule, totet Baume und zersetzt Holz in den Waldern Serbiens und Montenegros, ohne dass die beteiligten Arten bisher bekannt waren. In der vorliegenden Untersuchung wurden Isolate von 25 Standorten bestimmt. Die Bestimmung basierte auf RFLP-Analysen der IGS1–Region und Vergleichen der IGS1–Sequenzen mit den in der NCBI- Datenbank vorhandenen Sequenzen. Mit Sequenzen ausgewahlter Isolate wurde eine phylogenetische Analyse durchgefuhrt, um mogliche Beziehungen zwischen Isolaten mit unterschiedlichen Bandenmustern und zuvor bestimmten Vergleichsisolaten von funf europaischen Armillaria-Arten zu erkennen. Insgesamt 90 Isolate aus Waldern in Serbien und Montenegro wurden funf Armillaria-Arten zugeordnet. Armillaria gallica war am haufigsten, gefolgt von A. cepistipes, A. mellea, A. ostoyae und A. tabescens. Zwei Isolate konnten nicht identifiziert werden. Die Verdauung der IGS1-Amplifikationsprodukte mit dem Restriktionsenzym AluI ergab zehn verschiedene RFLP-Muster. Die Muster G4 (400, 250, 180) fur A. gallica und X (400, 180, 140) fur die Isolate 74 und 79 wurden erstmals bei europaischen Isolaten nachgewiesen. Mit TaqI wurden acht RFLP-Muster erhalten, je zwei Muster fur A. ostoyae und A. gallica und je eines fur A. cepistipes, A. mellea, A. tabescens und die Isolate 74 und 79. Auf der IGS1-Region basierende Parsimonie-Analysen ordneten die Isolate vier Gruppen zu: eine enthielt A. mellea, die zweite A. gallica und A. cepistipes, eine dritte A. ostoyae und A. borealis. A. tabescens unterschied sich von allen beringten Arten. Die phylogenetische Analyse unterstutzt die Hypothese, dass die europaischen Armillaria-Arten nah verwandt sind und sich in jungerer Zeit aus einer gemeinsamen Vorganger-Art separierten. In Serbien und Montenegro sind nach der vorliegenden Studie funf Armillaria-Arten vorhanden, A. borealis wurde in den untersuchten Okosystemen nicht gefunden.