Molekulare Charakterisierung des myo -Inositol Metabolismus von Salmonella enterica serovar Typhimurium: Genetik, Transport und Regulation

In der vorliegenden Arbeit wurden die Genetik, der Transport und die Regulation des myo-Inositol-Metabolismus von Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) molekular charakterisiert. Die iol-Gene von S. Typhimurium, die am myo-Inositol-Metabolismus beteiligt sind, liegen auf der genomischen Insel GEI4417/4436. Durch Deletionsanalysen wurden die Gene iolA, iolB, iolC1, iolC2, iolD2, iolE, iolG1 und STM4423 als essentiell fur das Wachstum mit myo-Inositol als einziger Kohlenstoffquelle identifiziert. Bis auf STM4423 kodieren die genannten Gene fur Enzyme, die myo-Inositol in Dihydroxyaceton-Phosphat, Acetyl-CoA und CO2 umwandeln. Laut RT-PCR Analyse bilden die Gene iolA und iolB, iolC1 und iolC2, iolD1 und iolD2, sowie iolE und iolG1 jeweils transkriptionelle Einheiten. Durch Fusion der iol-Promotoren an die Luciferase konnte gezeigt werden, dass die Promotoren von iolA/B, iolC1/C2, iolD1/D2 und iolE/G1 beim Wachstum mit myo-Inositol als Kohlenstoffquelle stark induziert werden. In LB-Medium oder Minimalmedium mit Glukose werden die iol-Promotoren mit Ausnahme des iolE/G1 Promotors durch den Regulator IolR reprimiert. In Protein-DNA Bindestudien konnte zudem gezeigt werden, dass IolR sowohl die ubrigen iol- als auch seinen eigenen Promotor bindet und sich damit autoreguliert. Die Induktion der Gene iolE/G1 wird hochstwahrscheinlich durch den Regulator STM4423 vermittelt, da deren Expression den Wachstumsdefekt der STM4423-Deletion supprimieren kann. Als myo-Inositol Haupttransporter in S. Typhimurium konnte IolT1 (STM4418) identifiziert werden. In Aufnahmeexperimenten mit radioaktiv markiertem myo-Inositol wurde ein Aktivitatsoptimum von IolT1 bei pH 5,5 und ein Km Wert zwischen 0,49 und 0,79 mM gemessen. Die stark reduzierte Aufnahme in Anwesenheit von Protonophoren deutet zudem darauf hin, dass IolT1 als myo-Inositol/H+-Symporter operiert. Als schwachen myo-Inositol-Transporter konnte IolT2 (STM4419) ausgemacht werden. Die Expression beider Transporter wird wahrend des Wachstums mit myo-Inositol stark induziert und in LB-Medium und in Minimalmedium mit Glukose durch IolR-Bindung an die Promotoren von iolT1 und iolT2 reprimiert, was durch DNA-Protein Bindestudien gezeigt wurde. Der Begriff der biologischen Bistabilitat beschreibt das unterschiedliche Verhalten isogener Organismen unter identischen Bedingungen. Ein solcher bistabiler Phanotyp zeigt sich fur das Wachstum von S. Typhimurium in Minimalmedium mit myo-Inositol als einziger Kohlenstoffquelle in der Variabilitat einzelner Zellen bezuglich des Ubergangs von der Anlauf- in die Wachstumsphase. Auf zellularer Ebene konnte der bistabile Phanotyp beispielhaft an der iolE-Promotorinduktion mit Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie qualitativ und quantitativ gemessen werden. Sowohl die Deletion des Repressors IolR als auch CO2/Hydrogencarbonat im Medium heben die Bistabilitat auf. Dabei wirkt CO2/Hydrogencarbonat nicht direkt auf IolR, sondern wahrscheinlich durch Bindung an STM4423, der dann das IolR-unabhangige Operon iolE/G1 induziert. Dieses Beispiel zeigt zum ersten Mal einen Einfluss von CO2/Hydrogencarbonat auf die Genregulation in S. Typhimurium. Die doppelte Regulation durch IolR und STM4423 ist fur den myo-Inositol-Metabolismus der bisher untersuchten Organismen einzigartig. Aus den Daten dieser Arbeit konnte ein Modell fur diese Regulation des myo-Inositol-Metabolismus in S. Typhimurium erstellt werden.