Strukturbasierte Leitstruktursuche ATP-kompetitiver Inhibitoren der Gyrase Untereinheit B

Die zunehmende Resistenzentwicklung von Bakterien gegenuber Antibiotika erfordert die Suche nach innovativen Wirkstoffen mit neuen Wirkmechanismen. Ziel dieser Arbeit war die Suche nach neuen Substanzklassen fur die Hemmung der ATPase-Untereinheit der Gyrase von Escherichia coli (E. coli), die eine bekannte, aber nicht in der klinischen Anwendung befindliche Zielstruktur zur Behandlung von bakteriellen Infektionserkrankungen darstellt. Dafur wurde eine strukturbasierte Leitstruktursuche durchgefuhrt. Bei der Analyse der Zielstrukturen konnten drei Rontgenkristallstrukturen der GyrB-Untereinheit von E. coli identifiziert werden, die in der ATP-Bindestelle einzigartige Charakteristika aufwiesen. In allen Komplexen konnte ein strukturell essentielles Wassermolekul identifiziert werden. Zusatzlich wies einer der Protein-Ligand-Komplex ein weiteres, optionales Wassermolekul auf. Damit standen drei vorbereitete Zielstrukturen mit einem Wassermolekul und eine Zielstruktur mit zwei Wassermolekulen fur das virtuelle Screening zur Verfugung. Die Substanzbibliothek wurde mithilfe der ZINC-Datenbank erstellt, einer vorgefilterten Datenbank mit kommerziell erhaltlichen Substanzen. Fur diese wurden weitere physikochemische Filter erarbeitet, die den Datensatz von ursprunglich 11 Mio. Substanzen auf 3.4 Mio. reduzierten. Die Bibliothek wurde mithilfe von cRAISE , einem High-Throughput virtual Screening (HTvS)-Tool, in jedes der vier zuvor vorbereiteten Proteine gedockt. Dabei wurden zwei aufeinanderfolgenden Dockings mit steigender Komplexitat durchgefuhrt. Insgesamt konnten von den 3.4 Mio. Substanzen ca. 360,000 Substanzen erfolgreich in den verschiedenen Proteinen positioniert werden. Der Arbeitsablauf der darauf folgenden Nachprozessierung wurde zunachst mit einem Testdatensatz, der aus bekannten aktiven und automatisch generierten inaktiven Substanzen zusammengesetzt war, entworfen und evaluiert. Die endgultige Vorgehensweise bestand aus den folgenden Schritten: einem Rescoring, einem Leader-Clustering uber Fingerprints und einem erneutem Docking mit Glide. Die final erhaltenen Posen von Glide wurden einer genauen visuellen Analyse unterzogen und fuhrten zur Auswahl von 20 Substanzen, die nachfolgend erworben wurden. Fur die biologische Testung konnten zwei Assays etabliert werden: Fur das primare Screening wurde ein auf einer Fluoreszenzausloschung basierender Assay entwickelt, der fur die Gyrase noch nicht beschrieben wurde. Die Validierung der Hits erfolgte mithilfe eines literaturbekannten Supercoiling-Assays. Wahrend der Testung zeigte jedoch keine der erworbenen Substanzen eine signifikante Inhibition der Gyrase. Nach einer Evaluierung dieser Ergebnisse, der Analyse der verwendeten Bindungshypothesen und mithilfe von 3D-QSAR-Modellen wurden 23 weitere Substanzen aus dem Glide-Docking ausgewahlt und erworben. Bei einer Konzentration von 500 µM wiesen zwei Substanzen eine vollstandige und eine Substanz eine partielle Inhibition der Gyrase auf. Damit konnten drei neue kompetitive Inhibitoren der ATPase der Gyrase gefunden werden. Diese Hit-Strukturen weisen alle neue Interaktionsmuster mit der Bindetasche der ATPase auf und konnen zu Leitstrukturen fur neue Antibiotika weiterentwickelt werden. Bacteria are a growing threat to mankind because acquired resistance to all known antibiotics is increasing permanently. Therefore, it is necessary to design novel and superior antibiotics with new modes of action. The aim of this work was to develop inhibitors for the ATPase of the gyrase of Escherichia coli (E. coli), which is a well-known target, but is currently not used in antibacterial therapy. The structure-based lead discovery procedure, which is shown schematically in figure 9b.1, was utilized for this task. Analysis of the Protein Data Bank resulted in three different x-ray structures of E. coli with unique characteristics in the binding site. Within the binding pocket several conserved water molecules occurred. One water molecule could be identified as highly conserved and structurally important. Besides, there was an additional optional water molecule in one crystal structure. As a result, four different targets were chosen, which were used in the screening process: three targets with one water molecule and one additional target with two water molecules. The compound library was created from the ZINC database, a prefiltered database for commercially-available compounds. This dataset was filtered using additional physicochemical properties to reduce the initial 11 million to 3.4 million compounds. The filtered compound library was subsequently docked utilizing cRAISE , a High-Throughput virtual Screening (HTvS) tool, into all four prepared targets. For this purpose, two consecutive steps with increasing complexity to place each compound within the binding site were used. Finally, 360,000 out of the 3.4 million substances were successfully docked. The workflow for the following Postprocessing was developed and evaluated with a set of literature known actives and automatically created non-actives. The final workflow included the following steps: rescoring, leader clustering with fingerprints and redocking with Glide. Eventually, the poses from Glide were carefully visually inspected and 20 compounds were subsequently purchased. Two assays were established for biological testing: The primary screening was performed with a fluorescence quenching based assay, which has not been described for gyrase yet. A literature known supercoiling assay was additionally used to validate the initial hits. However, none of the 20 acquired compounds significantly inhibited the gyrase. After an evaluation of these results, analysis of the used binding hypotheses and with the aid of 3D-QSAR models 23 additional substances were selected from the initial Glide docking and purchased. Two of these compounds completely inhibited the gyrase and one compound showed a partial inhibition at 500 µM concentrations. Thus, three new competitive inhibitors of the ATPase of gyrase were identified. These hits all exhibit new protein-ligand interaction patterns in the binding pocket of the ATPase and may be developed into lead compounds for new antibiotics.