Influence of point mutations on the electrophysiological properties of a bacterial porin and its interaction with a β-lactam antibiotic

Die hohe auf multiresistente Keime zuruckzufuhrende Komplikations- und Sterblichkeitsrate in Krankenhausern verdeutlicht die Dringlichkeit, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verste-hen. Eine haufige Ursache von Multiresistenzen sind Mutationen von Porinen, welche fur den Transport von Antibiotika in die Zellen von gram-negativen Bakterien verantwortlich sind. Porine sind β-Fasser mit einem peripasmischen und einem extrazellularen Zugang, welche durch die soge-nannte Konstriktionszone (constriction region, CR) in der Mitte der Pore getrennt sind. Die CR ist die engste Stelle der Pore und spielt eine entscheidende Rolle in Bezug auf Anbindung und Trans-port von Antibiotika. Durch Mutationen in dieser Region kann die Wechselwirkung zwischen An-tibiotikum und Pore in einem Mas verandert werden, welches den Transport beeintrachtigt und somit die Resistenz des Bakteriums erhoht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von Mutationen des Porins PorB aus Neisseria menin-gitidis auf die Wechselwirkung mit dem β-lactam Antibiotikum Ampicillin mittels planarer Patch-Clamp Technik untersucht und durch Molekulardynamik (MD) Simulationen unterstutzt. In elekt-rophysiologischen Messungen kann die Wechselwirkung zwischen Kanal und Substrat durch kurze Blockaden des Kanalstroms, verursacht durch ein angebundenes Substrat, detektiert werden. Mit-tels der Mutanten G103K und G103D konnte der Effekt eines grosen Restes und einer zusatzlichen positiven (G->K) oder negativen (G->D) Ladung in der CR auf die elektrophysiologischen Eigen-schaften der Pore und die Interaktion mit Ampicillin untersucht werden. Zunachst wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von PorB Wildtyp (wt) und den Mu-tanten ohne Ampicillin charakterisiert. Infolge der Mutation G->K wurde eine starke Verringerung der Kanalleitfahigkeit gefunden, wohingegen die Mutation G->D nur einen geringen Einfluss hat. Eine Modifikation des inneren elektrischen Feldes der Pore aufgrund der Mutation G >K ist die wahrscheinlichste Ursache. Ein erhohtes Rauschen des offenen Kanals wurde hingegen nur bei der Mutante G103D detektiert und wird auf eine zusatzliche Abstosung negativer Ladungen in der CR zuruckgefuhrt. Die elektrophysiologischen Messungen mit Ampicillin zeigten nur im Falle von PorB wt und G103K eine Blockade der Kanalleitfahigkeit, jedoch nicht fur PorB G103D. Dies kann durch eine Destabili-sierung der Bindungsstelle aufgrund der zusatzlichen Abstosung der negativen Ladungen in der CR begrundet werden. Entsprechend wurde die Wechselwirkung mit Ampicillin nur zwischen PorB wt und G103K verglichen. Ampicillin blockiert den PorB Kanal nur, wenn es auf der extrazellularen Seite des Porins zugege-ben wird. In Kombination mit der mittels MD Simulationen nachgewiesenen asymmetrischen Lage der Ampicillin-Bindungsstelle auf der extrazellularen Seite, spricht dies fur eine hohe Energiebarri-ere fur von der periplasmischen Seite eintretendes Ampicillin. In der Mutante ist Ampicillin langer gebunden und wird haufiger zuruck zum extrazellularen Lumen entlassen. Dies lasst auf eine hohe-re Energiebarriere fur die Permeation von Ampicillin durch G103K als durch PorB wt schliesen und wird den unterschiedlichen Orientierungen, die Ampicillin beim Eintritt in die Konstriktions-zone der beiden Porine einnimmt, zugeschrieben. Folglich beeinflusst die Mutation G >K die Wechselwirkung zwischen PorB und Ampicillin und vermindert vermutlich dessen Permeation durch das Porin.