Proteomanalyse des bovinen Endometriums und zweier Oozytenstadien

Der Erfolg einer Graviditat hangt von einem komplexen Zusammenspiel molekularer Faktoren von Gameten, Embryonen und Feten mit ihrer maternalen Umgebung ab. Eine intakte embryo-maternale Kommunikation ist die Voraussetzung fur die Entstehung und Aufrechterhaltung der Trachtigkeit. Von den molekularen Signalen, die an dieser Interaktion beteiligt sind, sind bis heute nur wenige bekannt. Fur ein besseres Verstandnis dieser molekularen Faktoren beim Rind wurden auf maternaler Seite embryo-induzierte Veranderungen des Endometriums am 18. Tag der Trachtigkeit auf Proteomebene untersucht. Diese so genannte Periimplantationsphase wurde anhand monozygoter Zwillinge analysiert. Jeweils einer der beiden Zwillinge erhielt einen Transfer zweier in vitro produzierter Blastozysten, der korrespondierende Zwilling bekam einen Scheintransfer und diente als nicht trachtige Kontrolle. Endometriumproben dreier Zwillingspaare wurden mit der zweidimensionalen Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) in Kombination mit der Minimalmarkierung untersucht. Um als biologisch relevant angesehen zu werden, mussten die Protein-Spots die folgenden strengen Kriterien erfullen: Abundanzfaktor ≥ 2; Spots in allen Gelen vorhanden; Student’s t-Test p ≤ 0,01. Vier abundanzveranderte Protein-Spots konnten detektiert und mittels PMF und MALDI-TOF/TOF Analyse identifiziert werden: Die Isocitrate Dehydrogenase 1 (NADP+, soluble) spielt eine Rolle bei der Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation. Acyl-CoA-binding Protein ist ein wichtiges Element des Steroidmetabolismus. Rho GDP Dissociation Inhibitor beta interagiert mit Proteinen der Rho-Familie, wobei Rho A an der Implantation beteiligt ist. 20 α Hydroxysteroid-Dehydrogenase ist am Progesteron-Metabolismus beteiligt. Die vier trachtigkeitsrelevanten Proteine lieferten interessante Kandidaten fur weiterfuhrende Untersuchungen. Die erfolgreiche Entstehung der Trachtigkeit basiert jedoch nicht nur auf der Vorbereitung der maternalen Umgebung, ebenso essentiell ist die prazise Entwicklung mannlicher und weiblicher Gameten. Eine korrekte Eizellreifung stellt die Grundlage fur eine erfolgreiche Befruchtung und die darauf folgende Embryonalentwicklung dar. Da in vivo eine Analyse der Oozytenmaturation nicht durchfuhrbar ist, wurde auf der embryonalen Seite die In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten auf Proteomebene untersucht. Die IVM ist beim Rind eine routinemasig durchgefuhrte Prozedur und der erste und limitierende Schritt fur assistierte Reproduktionstechniken (ART) wie die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen. Die Eizellreifung ist definiert als die Phase von der Vollendung der ersten Reifeteilung bis zur Metaphase der Meiose II. Oozyten wurden aus Ovarien prapariert und in vitro maturiert. Auf Proteomebene wurden ungereifte mit in vitro gereiften bovinen Oozyten verglichen. Aufgrund der Limitierung der Probenmenge (10 – 20 Oozyten pro Ovar = 0,9 – 1,8 µg Protein) wurde eine 2D-DIGE-basierte Analyse mit der ultra-sensitiven Sattigungsmarkierung durchgefuhrt. So konnten die quantitativen Analysen mit nur 0,5 µg Gesamtprotein pro 2D-Gel durchgefuhrt werden. Sechs unabhangige biologische Replikate von ungereiften bzw. gereiften Oozyten wurden analysiert. Die Auswertung der Analyse nach den oben genannten Kriterien ergab die Detektion von 38 abundanzveranderten Proteinen, von denen zehn mittels nano-LC-MS/MS Analyse eindeutig identifiziert werden konnten: Dihydrolipoamide S-Succinyltransferase und 6-Phosphogluconolactonase sind Enzyme des Energiemetabolismus. Translationally-controlled Tumor Protein konnte bei der Wiederaufnahme der Meiose eine Rolle spielen. Clusterin interagiert mit Komponenten des Komplementsystems und konnte eine Schutzfunktion vor Komplement-vermittelten Abbauprozessen haben. Peroxiredoxin-3 und Glutathion S-Transferase Mu5 sind in das Redox-System involviert. Durch den 2D-Gel-basierten Ansatz war es moglich, drei Formen der Glutathion S-Transferase zu detektieren. Elongation Factor 1 gamma und das Protein 14-3-3 e sind in den Regulationsmechanismus des Maturation Promoting Factor (MPF) involviert. MPF ist ein Schlusselenzym der Zellzykluskontrolle. Einige dieser abundanzveranderten Proteine, die wahrend der IVM boviner Oozyten detektiert wurden, konnten wichtige Hinweise zur Optimierung bestehender in vitro Kultursysteme geben. Die abundanzveranderten Proteine, die in den hier durchgefuhrten 2D-basierten Analysen detektierten werden konnten, sind interessante Kandidaten fur weitere, tiefer gehende Analysen im Zusammenhang mit der embryo-maternalen Kommunikation.