Biosíntesis de carotenoides en "Escherichia coli" y en tejidos no fotosintéticos de "Arabidopsis thaliana"

Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todo tipo de organismos fotosinteticos y en algunos no fotosinteticos. En plantas, los carotenoides se sintetizan en todo tipo de plastos y se encuentran en grandes cantidades en cloroplastos (donde desempenan una funcion esencial para la planta de fotoproteccion) y cromoplastos de flores y frutos. Por el contrario, en los plastos de tejidos no fotosinteticos como aquellos de plantas crecidas en la oscuridad (etioplastos) y leucoplastos (raices y petalos de Arabidopsis) las cantidades de pigmentos son mucho menores y se desconoce parcialmente la funcion que desempenan.Los carotenoides han sido ampliamente utilizados en la industria farmaceutica y alimenticia por sus propiedades colorantes y antioxidantes. Hasta el momento los carotenoides se obtienen mediante sintesis quimica o extraccion a partir de microorganismos y plantas. No obstante, recientemente se ha desarrollado un creciente interes por la produccion biotecnologica de estos compuestos. Pese a los numerosos avances realizados en este campo, diversos factores limitantes han de resolverse: i) la capacidad de almacenamiento ii) la disponibilidad limitada de precursores de naturaleza isoprenoide y iii) el escaso conocimiento de los mecanismos que regulan su biosintesis. En este marco, el principal objetivo de este trabajo de tesis ha sido profundizar en nuestro conocimiento de la carotenogenesis en bacterias y plantas.1. Estudio de la influencia de la capacidad de almacenamiento y el aporte de precursores en la produccion de carotenoides en "Escherichia coli". La primera aproximacion llevada a cabo fue la expresion de genes procedentes de la cianobacteria carotenogenica "Synechocystis" en celulas de "Escherichia coli" transformadas geneticamente para la produccion de licopeno. Aunque "Escherichia coli" no es una bacteria carotenogenica, la transformacion de estas celulas con los enzimas apropiados para la biosintesis de carotenoides procedentes de bacterias carotenogenicas permite la produccion de diversos pigmentos en "E. coli". Este estudio revelo que la produccion de licopeno no mejoraba al sobreexpresar una proteina de union a carotenoides, la orange carotenoid protein (OCP). Es mas, celulas transformadas con una genoteca de "Synechocystis" demostraron que la produccion de licopeno mejoraba unicamente al aumentar la disponibilidad de precursores de naturaleza isoprenoide como resultado de interferir con el metabolismo celular. Los carotenoides se sintetizan mayoritariamente a partir de precursores isoprenoides generados por la via del metilertitritol 5-fosfato (MEP), sirviendo de precursores tambien para multitud de metabolitos generados en la planta. Por ello nuestro siguiente objetivo consistio en intentar incrementar la disponibilidad de precursores y ver su influencia en la produccion de carotenoides en "E. coli". Esto se realizo mediante la activacion de la via endogena de las celulas (la via del MEP) y mediante la introduccion de una via foranea (la via del mevalonato, MVA). En ambos casos se observo que el incremento de la disponibilidad de precursores mejoraba la produccion de licopeno en celulas de "E. coli". 2. Estudio de la carotenogenesis y la funcion fisiologica de los carotenoides en tejidos no fotosinteticos de "Arabidopsis thaliana". En "Arabidopsis thaliana", la biosintesis de carotenoides esta fuertemente activada cuando las plantas pasan de germinar en la oscuridad (escotomorfogenesis) a un metabolismo con luz (fotomorfogenesis). En concreto observamos que la desrepresion de la fotomorfogenesis producia un aumento de la sintesis de carotenoides lo cual parece facilitar la adaptacion de las plantas a un metabolismo fotosintetico ya que ayuda a incrementar la produccion de clorofilas. El aumento de la produccion de carotenoides que conlleva la desrepresion de la fotomorfogenesis se debe mayoritariamente a un aumento de la expresion y consecuentemente de la actividad del principal enzima carotenogenico, la fitoeno sintasa (PSY). Esta, ademas de controlar la produccion de carotenoides en etioplastos puede regular el aporte de precursores de naturaleza isoprenoide procedentes de la via del MEP. En concreto observamos que un aumento de la actividad de PSY provoca una acumulacion post-transcripcional del enzima clave en la regulacion de la via del MEP, el enzima desoxixilulosa 5-fosfato sintasa (DXS). En otros tejidos no fotosinteticos de Arabidopsis como petalos y raices observamos que la expresion de PSY se localizaba en los haces vasculares. En leucoplastos de raices, los carotenoides se requieren para la produccion de los precursores de importantes hormonas como acido abscisico (ABA, que controla diversas respuestas de la planta frente a condiciones de estres abiotico) y estrigolactonas. En concreto se observo que en plantulas sometidas a estres salino, PSY se induce unicamente en la raiz para producir ABA y estrigolactonas, que a su vez controlan la expresion de dicho gen. En conclusion podriamos decir que la regulacion de la expresion de PSY en Arabdiopsis permite a la planta incrementar los niveles de carotenoides en respuesta a estimulos externos como luz o estres abiotico.