Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von putativen Seneszenzgenen auf Chromosom 4q und 10p in Bezug auf das HPV-induzierte Zervixkarzinom

Pradisponierend fur die Entstehung eines Zervixkarzinoms ist die persistierende Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV), insbesondere den Hochrisiko-Typen (HR) 16 und 18. Von 100 infizierten Frauen entwickeln circa 1 - 2 Frauen ein Zervixkarzinom. Dieses geht in der Regel aus einer pramalignen Neoplasie (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) hervor. Hierbei unterscheidet man leichtgradige (CIN1) und schwergradige (CIN2/3) Neoplasien, die auch unbehandelt abheilen konnen. Mit steigendem Dysplasiegrad wird jedoch die Wahrscheinlichkeit groser, ein Zervixkarzinom zu entwickeln. Bis heute werden daher die meisten CIN2 und alle CIN3 operativ entfernt. Zusatzlich zur Infektion mit einem HR-HPV-Typ sind genetische Veranderungen der befallenen Zelle fur die Tumorentstehung entscheidend. Durch vorangegangene Mikrozell-vermittelte Chromosomentransfer-Analysen wurde der Verlust der chromosomalen Regionen 4q35.1-qter und 10p14-15 kausal mit dem Prozess der Immortalisierung in Verbindung gebracht. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war darauf aufbauend die spezifische Identifikation und Validierung putativer Tumorsuppressorgene, welche gegenuber CIN im Zervixkarzinomen (CxCa) signifikant schwacher exprimiert werden. Dazu wurden Gefrierschnitte ausgewahlter CIN3 und CxCa angefertigt und dysplastische bzw. Tumorareale mikrodissektiert. Aus den Proben wurde die RNA isoliert und die Quantitat sowie die Qualitat der RNA bestimmt. Nach dem Umschreiben der RNA in cDNA und deren Markierung konnten Whole Human Genome Micorarrays hybridisiert werden. Es fanden sich 19 verringert exprimierte Gene, die mittels real-time PCR validiert wurden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neun der 19 identifizierten Gene funktionell charakterisiert. Um den Gentransfer optimal zu gewahrleisten, erfolgte die Etablierung einer Transduktionsmethode auf Basis von Lentiviren. Der lentivirale Vektor in Verbindung mit weiteren Plasmiden, die die Gene fur die Produktion von Lentiviren trugen, wurden in die Verpackungszelllinie HEK293T transfiziert. Fur die funktionellen Analysen wurden geeignete Zelllinien und primare Zellen (Fibroblasten und Keratinozyten) stabil transduziert. Im Vordergrund stand die Induktion von Seneszenz durch Genkomplementation. Um die Seneszenzinduktion einzelner Gene zu uberprufen, wurden die Zellen dem Seneszenz-assoziierten Galactosidase-Assay unterzogen. Im Ergebnis der Seneszenz-Tests zeigten die Gene SORBS2 und TLR3 nach Transduktion in Fibroblasten und Keratinozyten eine deutlich grosere Anzahl seneszenter Zellen als in der Negativ-Kontrolle (Leervektor und Mock-Transduktion). Hingegen konnte in immortalen Zelllinien Seneszenz nicht induziert werden. Moglicherweise ist die Expression mehrerer Gene notwendig, um die multiplen Aberrationen zu komplem entieren. Eine weitere funktionelle Charakteristik von Tumorsuppressorgenen ist der negative Einflus auf das Zellwachstum. In Abhangigkeit vomWachstumsverhalten der transduzierten Zellen erfolgte nach mehreren Tagen die Analyse der Proliferation mittels MTT-Assay. Der Proliferationstest brachte nach der Expression bestimmter Gene erste Hinweise auf ein verringertes Wachstum in einzelnen Zelllinien. So zeigten die Gene DIP2C, IL15RA und WDR37 einen negativen Einflus auf das Zellwachstum, SORBS2 und TLR3 verlangsamten diesen Prozess ebenfalls. Mit der Seneszenzinduktion und Proliferationsreduktion zeigten die Gene SORBS2 und TLR3 typische Eigenschaften von Tumorsuppressorgenen. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust dieser beiden in der chromosomalen Region 4q35 lokalisierten Gene mit Immortalitat in Verbindung gebracht werden kann.