Desarrollo y validación de técnicas de diagnóstico de infección fúngica invasora

La infeccion fungica grave causa la muerte a 1,3 millones de personas anualmente. Se ha descrito que el diagnostico temprano de la infeccion reduce la mortalidad asociada. Sin embargo, muchas de las tecnicas actuales no permiten una respuesta rapida y varian en cuanto a sensibilidad y especificidad. Por ello, se necesitan nuevas aproximaciones que den respuesta en tiempos mas cortos y que permitan realizar un diagnostico diferencial cuando varios microorganismos causan el mismo cuadro clinico. En esta tesis, se han desarrollado herramientas basadas en PCR en tiempo real (RT-PCR) facilmente transferibles al Sistema Nacional de Salud para el diagnostico e identificacion de especies de hongos de gran importancia medica.En el primer objetivo, se han disenado herramientas para el diagnostico diferencial de la neumonia fungica oportunista en pacientes con SIDA (neumocistosis, histoplasmosisy coccidioidomicosis) y la coccidioidomicosis. Se desarrollaron dos ensayos, uno de ellos en formato multiple para la deteccion simultanea de Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans; y el otro para la deteccion de ADN de Coccidioides. Los cebadores y sondas especificas de tipo molecular beacon se dirigieron a la region ITS del ADN ribosomico de cada una de las especies. Ambas tecnicas presentaron valores de sensibilidad y especificidad in vitro del 100% y coeficientes de variacion del 3%. La validacionde las tecnicas en muestras clinicas de pacientes con infeccion probada presento valores de sensibilidad y especificidad superiores al 90%. En el caso de la coccidioidomicosis, se comparo la utilidad de la RT-PCR con el cultivo microbiologico en un modelo murino de infeccion durante 14 dias. Las tecnicas mostraron una concordancia muy buena y evaluaron la progresion de la infeccion en el mismo sentido en higado, bazo y pulmon. Sin embargo, la RT-PCR detecto una carga fungica entre 10-1000 veces mayor que el cultivo microbiologico.En el segundo objetivo, se ha evaluado la utilidad de la RT-PCR y el analisis de curvas de fusion de alta resolucion (HRM) para la identificacion de hongos patogenos humanos. Lasherramientas de identificacion molecular han ayudado a descubrir que muchas especiesclasificadas por los metodos morfologicos como una sola, son en realidad complejos deespecies. Ademas, algunas de estas especies presentan diferencias en cuanto a epidemiologia, virulencia o sensibilidad a los antifungicos. Por ello, se han desarrollado dos metodos de HRM para la identificacion de especies del genero Cryptococcus y el complejo Candida parapsilosis. Los procedimientos desarrollados permitieron la amplificacion especifica de regiones del ADN ribosomico, 100 pb de la region ITS de Cryptococcus y 70 pb de la region IGS-1 del complejo C. parapsilosis. La concordancia entre HRM y la identificacion mediante secuenciacion de las mismas dianas fue del 100%. Este metodo es sencillo, rapido y no requiere de una base de datos de secuencias fiable para su aplicacion, lo que facilita su transferencia a los laboratorios clinicos.Finalmente, y dentro de este segundo objetivo, se analizaron regiones de microsatelites en tres genes (CDC3, HIS3 y EF3) de varias cepas de Candida albicans, responsables de infeccion recurrente, mediante HRM y electroforesis capilar. Ambas tecnicas demostraron que las cepas responsables de los episodios de infeccion tenian un origen clonal a pesar de sus diferencias en la susceptibilidad a los azoles. Aunque el poder de discriminacion mediante HRM (0,77) fue menor que mediante electroforesis capilar (0,92), el HRM permite un cribado de las cepas relacionadas de forma rapida y economica. Ademas, esta metodologia permitiria el estudio de brotes y evita el uso de metodos de tipado complejos y de dificil implantacion en los laboratorios asistenciales.