Functional endothelium on tissue engineered small diameter vascular grafts

Er zijn veel mensen die beschadigde of verstopte kransslagaderen of perifere vaten hebben. Bij deze patienten is het noodzakelijk om de bloeddoorstroming te herstellen. Het uitvoeren van een bypass operatie is de voornaamste behandeling hiervoor. Een andere groep patienten die ook afhankelijk kunnen zijn van vasculaire grafts zijn patienten met een nierziekte die afhankelijk zijn van dialyse. Tegenwoordig worden voor bypass operaties vaak patient-eigen (slag)aders of synthetische grafts gebruikt. Sommige van deze grafts hebben een beperkte levensduur en functioneren niet optimaal. Wanneer bijvoorbeeld een ader uit het onderbeen wordt gebruikt om een kransslagader te vervangen zit na 10 jaar ongeveer 57% van deze bypasses dicht. Tevens is het zo dat voor vaatvervangingen grafts steeds vaker nodig zijn, aangezien een toenemend aantal patienten een heroperatie moet ondergaan en geen geschikte vaten meer over heeft. Het kweken van bloedvaten in het laboratorium (tissueengineering) zou een goed alternatief kunnen zijn om de beperkingen van de huidige grafts te verhelpen. Zulke bloedvaten bestaan uit levend patient-eigen weefsel en hebben daardoor de eigenschap om zich te herstellen en te remodelleren. Recentelijk zijn er grote vooruitgangen geboekt in de ontwikkeling van sterke humane getissue-engineerde grafts met een kleine diameter. Er is echter minder onderzoek gedaan aan de ontwikkeling van een functionele endotheelcel (EC) laag op die grafts. De EC laag is een zeer actieve cellaag die betrokken is bij weefsel homeostase en de regulering van vaatwandspanning. Verder is deze cellaag ook betrokken bij de regulering van groei van andere celtypen. Daarnaast wordt trombose, wat een belangrijke oorzaak is van het falen van grafts, actief voorkomen door de aanwezigheid van een intacte EC laag. Daarom was het doel van dit proefschrift om een functionele EC laag te creeren op humane getissue-engineerde grafts. Deze grafts zijn gebaseerd op een scaffold van polyglycolic acid met een poly-4-hydroxybutyrate coating, die gezaaid wordt met humane myofibroblasten (MF) afkomstig van de vena saphena. Om een getissue-engineerde graft te endothelialiseren is het noodzakelijk de twee celtypen (ECs en MFs) samen te kweken. Dit is niet triviaal, aangezien de twee celtypen normaal verschillende kweekomstandigheden vereisen. In dit proefschrift is een 3D co-cultuur ontwikkeld, waarin de omstandigheden om de MFs en ECs samen te kweken konden worden geoptimaliseerd. Er is aangetoond dat ECs niet overleven in standaard kweekmedium (DMEM), maar dat deze cellen een speciaal EC medium nodig hebben. Wanneer dit medium gebruikt wordt en de ECs pas na 3 of 4 weken kweken op de vasculaire constructen gezaaid worden, resulteert dit in mooie volle EC laag. Het is bekend dat ECs het fenotype van de cellen in hun omgeving kunnen beinvloeden wanneer deze cellen samen gekweekt worden. Het is in dit proefschrift aangetoond dat zowel de groei als de expressie van een gladde spiercel marker van MFs beinvloed wordt door het samen kweken met ECs. Het is ook aangetoond dat een laag ECs de weefselcompositie van de vasculaire constructen beinvloedt. Een functionele EC laag dient ook niet trombogeen te zijn. Om dit te onderzoeken zijn de vasculaire constructen blootgesteld aan een bloedstroming en hiermee is aangetoond dat ECs inderdaad de trombogeniciteit van de constructen verlaagd. Als laatste is er een bioreactor ontwikkeld om getissue-engineerde bloedvaten met een kleine diameter te kweken en waarmee ook een EC laag aangebracht kan worden. Een dag na het zaaien van de ECs is de cellaag bijna vol en hebben de cellen een ronde vorm. De gezaaide ECs worden vervolgens geconditioneerd door kweekmedium door de grafts te laten stromen, wat een afschuifspannig op de cellen veroorzaakt. De viscositeit van het kweekmedium is verhoogd tot de waarde van bloed door middel van xanthaan gom. Xanthaan gom is een stabiel verdikkingsmiddel en zorgt al bij lage concentraties voor hoge viscositeiten. Het gebruik van xanthaan gom zorgt ervoor dat, wanneer we een fysiologische stroming aanbrengen in het vat, ook een fysiologische afschuifspanning ontstaat. Het is in dit proefschrift aangetoond dat xantaan gom geen invloed heeft op de groei van ECs, hun orientatie in de richting van de vloeistofstroming en hun bloedvatverwijdende eigenschappen. De afschuifspanning op de ECs van de getissue-engineerde vaten zorgt ervoor dat de ECs wel een volle laag vormen. Tevens orienteren de ECs zich in de richting van de stroming en krijgen ze een langgerekte vorm, in tegenstelling tot de ongeconditioneerde ECs, die geen volle cellaag vormen. Samenvattend kan gesteld worden dat in dit proefschrift verschillende EC functies zijn onderzocht met behulp van verschillende modelsystemen. Er is tevens een bioreactor systeem ontwikkeld waarmee bloedvaten met een kleine diameter gekweekt zijn. Na optimalisatie van de kweekomstandigheden is op deze vaten een functionele EC laag gecreeerd, die fysiologische afschuifspanningen kan weerstaan. Deze functionele EC laag is een belangrijke stap voor de klinische toepasbaarheid van deze vaten.