Implicación del transportador ABCI4 de Leishmania major en resistencia a fármacos e infectividad

RESUMEN La leishmaniasis es la segunda enfermedad parasitaria en importancia por detras de la malaria, tanto desde el punto de vista de la prevalencia anual de casos como de la letalidad de alguna de sus variantes, en el caso de no ser tratada. Segun los datos de la OMS, hay 350 millones de personas en el mundo en riesgo de padecer la enfermedad, dandose de forma estimada de 0,2 a 0,4 millones de casos de leishmaniasis visceral y de 0,7 a 1,2 millones de casos de leishmaniasis cutanea cada ano. Ante la ausencia de una vacuna eficaz, solo queda llevar a cabo programas de control de las poblaciones del insecto vector y tratamientos quimioterapeuticos de los afectados. Actualmente existe un muy reducido arsenal de farmacos para el tratamiento de la leishmaniasis, empleandose aun como primera linea, los antimoniales pentavalentes, cada vez mas criticados desde el punto de vista del fallo terapeutico por aparicion de resistencias en zonas endemicas. Se trata de un hecho preocupante y cada vez mas frecuente, siendo necesario el desarrollo de nuevos farmacos eficaces o el empleo de compuestos que reviertan las resistencias generadas a los farmacos ya existentes. Los transportadores ABC representan una de la familia de proteinas mas amplia presente tanto en procariotas como en eucariotas, llevando a cabo funciones muy diversas, y muchas de ellas de gran relevancia clinica. El genoma de Leishmania contiene 42 genes codificantes para transportadores ABC (Leprohon et al. 2006), clasificados a su vez en varias subfamilias desde la A hasta la H, excepto 4 genes con muy baja homologia con el resto de los transportadores ABC incluidos en un grupo denominado como ? otros? , al cual nuestro grupo ha denominado como ABCI, y que engloba a los genes ABCI1 (LmjF12.1190), ABCI2 (LmjF32.2060), ABCI3 (LmjF33.3040) y ABCI4 (LmjF33.3260), todos ellos codificantes para ABC ? half-transporters? , con una disposicion del NBD en el extremo carboxilo pero con el requerimiento comun de formar homo-/heterodimeros para ser funcionalmente activos. A lo largo del presente trabajo de tesis doctoral, se ha estudiado la implicacion del transportador ABCI4 del parasito Leishmania en la resistencia a farmacos e infectividad. El porcentaje de homologia tan bajo con otros transportadores ABC de Leishmania, y con eucariotas en general, lo convierte en un transportador interesante de estudio, ya que podria emplearse como diana terapeutica en el tratamiento de la leishmaniasis. El transportador ABCI4 pertenece a la familia ABC (ATP-binding cassette), y presenta un grado de homologia muy bajo con otros transportadores ABC de Leishmania, aunque mayor con transportadores mitocondriales de la familia ABCB, que poseen una disposicion TMD-NBD. Se demuestra en este trabajo de tesis la implicacion de ABCI4 en el eflujo de metales pesados, confiriendo asi resistencia a Pentostam®, SbIII, AsIII y CdII. La resistencia observada se explica gracias a la menor acumulacion de estos compuestos debido a un eflujo significativamente mayor. Se ha demostrado mediante ensayos de co-inmunoprecipitacion que el transportador ABCI4 forma homodimeros para realizar su funcion de transporte. A su vez, se empleo una combinacion de estudios de localizacion subcelular empleando microscopia confocal y ensayos de biotinilacion sirviendonos de parasitos que expresan ABCI4 fusionado a GFP- y a FLAG-, observando que el transportador tenia una localizacion dual en mitocondria y membrana plasmatica. Ademas, los parasitos que sobreexpresaban ABCI4 presentaron un incremento en la replicacion en el interior de macrofagos peritoneales de raton. En este trabajo de tesis determinamos tambien que algunas porfirinas son sustrato del transportador ABCI4. Consecuentemente, la sobreexpresion de ABCI4 conferia resistencia a algunas porfirinas toxicas, tales como zinc-protoporfirina, debido a la menor acumulacion resultante de un eflujo significativamente mayor. Ademas, observamos que ABCI4 tiene una significativa capacidad de exportar tioles tras la incubacion con SbIII, pudiendo considerar al transportador ABCI4 como una potencial bomba tiol-X que es capaz de reconocer metales conjugados con tioles. Por otro lado, se investigaron una serie de 15 compuestos, potenciales inhibidores de la actividad de ABCI4, derivados o analogos de flavonoides y trolox, evaluando su actividad revertidora de la resistencia a antimonio en los parasitos que sobreexpresaban ABCI4. Entre los compuestos evaluados, N-etiltroloxcarboxamida (compuesto D2), produjo la mayor actividad. Con el fin de optimizar la actividad del compuesto D2, sintetizamos una serie de 10 derivados (compuestos D3 a D12) mediante la condensacion de varias aminas con trolox. El analisis de la actividad revertidora de la resistencia a antimonio mostro que N-propiltroloxcarboxamida (compuesto D4) era el inhibidor mas potente de ABCI4. La actividad revertidora se mantuvo en amastigotes intracelulares obtenidos tras la infeccion de celulas THP-1. Ademas, los derivados de trolox revertian significativamente la resistencia a la porfirina toxica zinc-protoporfirina. El mecanismo de accion de estos derivados activos se demostro ligada a la reversion significativa de la acumulacion de SbIII y zinc-protoporfirina, debido al descenso en el eflujo del farmaco. Dado que el transportador ABCI4 puede ser considerado como una bomba tiol-X, determinamos la capacidad de los derivados de trolox de revertir el eflujo de tioles no proteicos en las lineas de L. major en presencia de SbIII. La relacion estructura-actividad estudiada en la presente tesis remarca la importancia del tamano y longitud del sustituyente alquilo de trolox. En resumen, hemos demostrado que ABCI4, un nuevo transportador ABC de Leishmania, se encuentra implicado en la resistencia a antimonio, otros metales y porfirinas mediante un incrementode su eflujo al exterior celular y que los compuestos derivados de trolox D2 y D4 podrian ser considerados como agentes revertidores especificos de la actividad de ABCI4.