Das Cd-induzierbare crp-Gen aus dem terrestrischen Oligochaeten Enchytraeus: Genomische Organisation und Bedeutung für die Cd-Detoxifizierung

Die anthropogene Belastung der Umwelt mit Cd birgt zunehmend Gefahren fur Menschen, Tiere und Pflanzen. Der terrestrische Oligochaet Enchytraeus buchholzi ist in der Lage, auch in stark Cd-belasteten Boden zu uberleben. Als spezifische Antwort auf eine Cd-Belastung exprimiert Enchytraeus eine mRNA, die fur das cysteinreiche 25 kDa CRP-Protein kodiert. Der hohe Cystein-Gehalt und die charakteristische Anordnung der Cysteinreste in Cys-X-Cys- bzw. Cys-Cys-Segmenten entsprechen den Eigenschaften Schwermetall-bindender Proteine wie den ubiquitar auftretenden Metallothioneinen (MT). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Aufklarung der genomischen Organisation des crp-Gens und der Nachweis der Funktionalitat des CRP-Proteins bei der Detoxifizierung von Cd. Das crp-Gen ist aus zehn Exons und neun Introns aufgebaut. Mit seinen von sehr langen Introns unterbro-chenen kleinen Exons weist das Gen eine fur Invertebraten-Gene untypische Exon/Intron-Struktur auf. Bei der Exonverteilung findet sich eine auffallige repetitive Struktur im Kernbereich des Gens, in dem die ko-dierenden Exons drei bis acht wie die repetitiven Einheiten der CRP-cDNA aus jeweils 93 bp aufgebaut sind. In Ubereinstimmung mit der Struktur der cDNA und der Exons finden sich auch in den Introns des crp-Gens repetitive Elemente. Neben vier direkten und einem invertierten Repeat in jeweils verschiedenen Introns wurden in den Introns sieben und neun DNA-Abschnitte mit mehreren direkt aufeinanderfolgenden kurzen Sequenzwiederholungen detektiert. Fur das Fragment im Intron sieben mit seiner Anhaufung von Metall-responsiven Elementen (MRE) wurde bereits eine Enhancer-Funktion nachgewiesen. Zusatzlich sind in den Introns des crp-Gens funf Konsensus-Sequenzen fur transposable DNA-Fragmente aus Sau-gern und Invertebraten enthalten. Durch Restriktionsanalysen konnte eine teilweise Methylierung des Genoms von Enchytraeus buchholzi nachgewiesen werden. Das crp-Gen und der zugehorige Promotor liegen dabei in einem der relativ kurzen methylierten Abschnitte des Genoms. Aufgrund des uneinheitlichen Methylierungsmusters in den untersuchten Bereichen wird eine gewebsspezifische Methylierung des crp-Gens vermutet, die moglicherweise Einfluss auf die Expression des Gens in verschiedenen Geweben nimmt. Anhand der repetitiven Strukturen des Gens und den Ahnlichkeiten einiger Abschnitte des crp zu Exon- und Intron-Bereichen von MT-Genen aus Lumbricus rubellus ist ein gemeinsamer Ursprung der Gene ableitbar. Das crp-Gen konnte so aus Gen-Duplikationen entstanden sein, wie sie unter anderem bei MT-Genen in Drosophila gefunden werden. Das CRP-Protein vermittelt in dem Cd-hypersensitiven Hefestamm DTY167 eine sehr effektive Cd-Resistenz, welche besonders bei hohen Cd-Konzentrationen die Resistenz des zugehorigen Wildtypstammes DTY165 weit ubersteigt. Der erzielte Effekt der Resistenzvermittlung nimmt dabei proportional mit der Anzahl der exprimierten repetitiven Einheiten des CRP-Proteins zu. So zeigen Zellen, die das gesamte 25 kDa Protein exprimieren sowohl bei subletalen als auch bei toxischen Cd-Konzentrationen die grosste Resistenz. Das mit etwa 3 kDa kleinste Fragment, welches das vierte Repeat des Proteins umfasst, weist dagegen den geringsten Effekt aller CRP-Deletionsklone auf. Durch die Expression von Frag-menten gleicher Grosse aus verschiedenen Bereichen des Proteins konnte nachgewiesen werden, dass alle Repeats in gleichem Umfang an der Resistenzvermittlung beteiligt sind. Als Mechanismus der Resi-stenzvermittlung wird eine Komplexierung der freien Cd2+-Ionen durch das CRP-Protein im Cytosol der Zellen angenommen, wobei die Sulfhydrylgruppen der Cysteinreste als Liganden bei der Bildung von Cd-Thiolat-Clustern dienen. Dies entspricht dem Entgiftungsmechanismus von MT. Bestatigt wird diese Annahme durch den gezielten Austausch der Cysteinreste in dem 3 kDa Fragment des vierten CRP-Repeats gegen die Aminosaure Serin. Die Mutationen wirken sich in unterschiedlich starkem Umfang auf die Fahigkeit zur Resistenzvermittlung des CRP-R4 aus. Alle Klone zeigen jedoch ein eingeschranktes Wachstum im Vergleich zum Wildtyp. Demnach zieht das Fehlen jeder einzelnen Sulfhydrylgrupppe im Gegensatz zu den MT eine Verminderung der Cd-Bindungsfahigkeit des CRP-R4 Fragmentes nach sich, was sich auf die Detoxifizierungseigenschaften der Mutationsklone auswirkt. In der vorliegenden Arbeit konnte mit dem crp-Gen erstmals ein Gen fur ein Schwermetall-bindendes Nicht-Metallothionein Protein charakterisiert werden. Zudem konnte erstmals die Funktionalitat des CRP-Proteins bei der Detoxifizierung von Cd nachgewiesen werden.