Development of new formulations of EDDHA/Fe³+ chelates and methodologies for their analysis based on NMR

Para que un cultivo se desarrolle de forma optima es necesario que la concentracion de nutrientes en la disolucion del suelo sea suficiente para satisfacer las necesidades del vegetal. Sin embargo, las condiciones ambientales que envuelven a los cultivos (caracteristicas de los suelos y sustratos, estres hidrico, ataque de insectos, hongos, bacterias y virus, etc.), pueden causar deficiencias nutricionales sobre todo en lo que se refiere a micronutrientes. Uno de los problemas mas graves a los que se enfrenta la agricultura en amplias regiones del mundo es la deficiencia de hierro, que da lugar a una disminucion o inactivacion de todos los procesos fisiologicos en los que interviene el hierro y en particular, la sintesis de clorofila. La clorosis ferrica es un sintoma caracteristico de la deficiencia de hierro en las plantas que se manifiesta, en primer lugar, por una progresiva desaparicion del color verde de las zonas intervenales de las hojas jovenes. En estados mas avanzados, los nervios mas finos, tambien se vuelven amarillos, seguido de los nervios mas gruesos, hasta que finalmente toda la hoja queda totalmente clorotica (Chen y Barak, 1982; Sanz et al, 1992). Esta alteracion nutricional afecta a la produccion y la calidad de los cultivos, debido a que el hierro es un micronutriente esencial para el correcto desarrollo de las plantas (Marschner y Romheld, 1995). En terminos de impacto economico, las perdidas economicas asociadas con la disminucion de la produccion y el incremento en el consumo de fertilizantes ferricos se estima en 200-400 € · ha-1 (Rombola y Taglianini, 2006). Este desorden nutricional es un problema complejo cuyas causas, por lo general, se deben a la combinacion de varios factores: ? Baja disponibilidad de hierro en los suelos de cultivo. A pesar de que el hierro es el cuarto elemento mas abundante en la corteza terrestre, la cantidad de hierro que permanece disponible para las plantas es muy baja, por lo que la deficiencia de este elemento es muy comun. Este problema es debido a que su disponibilidad se ve fuertemente afectada por una serie de factores tales como pH, potencial redox, mineral al que esta asociado el hierro, presencia de agentes complejantes, etc., pudiendo provocar que en muchas ocasiones, la concentracion de hierro que permanece en la disolucion del suelo no sea suficiente para cubrir las necesidades del vegetal. Factores que afectan a la movilidad de hierro en la planta: la presencia de diversos iones, sobre todo, el bicarbonato pueden limitar el transporte de hierro en las plantas y la disponibilidad fisiologica del mismo en las hojas (Alhendawi et al., 1997). Las plantas toman hierro preferentemente como Fe2+ a traves de transportadores de proteinas (Hall y Guerinot, 2006). Ante la deficiencia de hierro, las plantas pueden desarrollar respuestas fisiologicas para aumentar la cantidad de hierro disponible (plantas eficientes) o pueden no desarrollar estas respuestas (plantas no eficientes). Las plantas eficientes, en funcion de los mecanismos de respuesta que desarrollen, se dividen en: plantas de Estrategia I (dicotiledoneas y monocotiledoneas especies no gramineas) y plantas de Estrategia II (gramineas) (Marschner et al, 1986; Brown y Jolley, 1988; Marschner y Romheld, 1995). El mecanismo que desarrollan las plantas de Estrategia I consiste, principalmente, en que: ? Activan la enzima reductasa oxidasa ferrica (FRO), encargada de reducir el Fe3+ del quelato ferrico a Fe2+, para incrementar la reduccion de Fe3+ en la zona radicular (Bruggemann et al., 1990; Holden et al. 1991; Kochian, 1991; Romera et al., 1998; Brumbarova et al., 2015). Inducen la AHA2 (Arabidopsis H+ ATPase 2; Santi and Schmidt, 2009), provocando una disminucion del pH de la rizosfera mediante secrecion de H+. Este efecto produce un aumento de la solubilidad de los compuestos de hierro del suelo y el incremento en la actividad de la enzima FRO. Aumentan la asimilacion del Fe3+ debido a la expulsion de reductores y/o quelantes (Bienfait et al., 1983; Romheld and Marschner, 1983; Mladenka et al., 2010; Schimdt et al., 2014). Hoy en dia, la aplicacion de quelatos ferricos es una practica agricola comun para evitar y/o aliviar la clorosis ferrica y estos productos estan regulados por la legislacion europea de fertilizantes (EC N° 2003/2003; Anon, 2003, EU Regulations N° 2076/2004; Anon, 2004 y EU Regulations N° 162/2007; Anon, 2007), siendo el o,o EDDHA/Fe3+ el mas eficaz para remediarla (Hernandez- Apaolaza et al., 1997; Cremonini et al., 2001). Su eficacia es debida a la capacidad que tiene esta molecula para mantener el hierro en disolucion bajo las condiciones existentes en los suelos calizos y para aportar hierro a la planta en un amplio intervalo de valores de pH del medio de cultivo (Lucena, 2003). La sintesis industrial de o,o EDDHA (Petree et al , 1978) produce dos regioisomeros, el p,p EDDHA y el o,p EDDHA (Hernandez Apaolaza et al, 1997; Cremonini et al., 2001). La utilizacion de este ultimo (o,p EDDHA) como fertilizantes ferrico ha sido autorizado por la legislacion europea recientemente (EU Regulations N° 162/2007; Anon, 2007). Debido a los dos carbonos quirales que posee el o,o EDDHA, dicha molecula presenta dos formas isomericas (isomeria optica), que cuando se unen al Fe3+ para formar el quelato ferrico (o,o EDDHA/Fe3+), dan lugar a una mezcla al 50%, aproximadamente, de dos isomeros geometricos, el isomero meso y la mezcla d,l racemica. Difieren en estabilidad y reactividad frente a los materiales del suelo, siendo el isomero d,l racemico (pK=-35.34) 500 veces mas estable que la forma meso (pK=-33.28) (Barak and Chen, 1987; Bannochie and Martell, 1989). El analisis de los quelatos o,o EDDHA/Fe3+ comerciales es esencial para evaluar la calidad de los mismos y el cumplimiento de la normativa que los regula. En general, los metodos de analisis autorizados para o,o EDDHA/Fe3+ (CEN/EN 13368-2, 2012) y o,p EDDHA/Fe3+ (CEN/TS 15452, 2007) se basan en la tecnica de espectroscopia atomica de absorcion y la tecnica de HPLC acoplada con espectrofotometria UV-Vis. Sin embargo, estas tecnicas necesitan patrones de los compuestos que se van a determinar para llevar a cabo el analisis. En el caso de los quelatos ferricos, algunos de estos patrones estan dificilmente disponibles en el mercado o no existen, puesto que hay compuestos que forman parte de los quelatos ferricos comerciales que, todavia, se desconocen. Por estas razones, seria interesante plantear una nueva tecnica que permita la caracterizacion completa de los quelatos ferricos comerciales.