Analytical sensitivity and specificity of a RT-PCR for the diagnosis and characterization of the spatial distribution of three Apis mellifera viral diseases in Spain

The occurrence and spatial distribution of deformed wing virus (DWV), black queen cell virus (BQCV), and Kashmir bee virus (KBV) were assessed in 294 honeybee colonies in Spain by employing a SYBR-Green based real time RT-PCR. 60% of them were positive for both DWV and BQCV, and those two viruses were detected in 84% and 68% of the samples, respectively. Conversely, KBV was detected in only 1.7% of the samples. Increments in the number of bee colonies per region, adjusted by the number of samples collected, were associated with increased risk of finding DWV, BQCV, and KBV, as estimated by mixed Bayesian regression models. The residual risk for DWV, BQCV, and KBV decreased northerly and westerly, suggesting that factors or forces that favour the presence of these viruses could be more prevalent in southern and eastern regions of Spain. Results will be useful in the design and implementation of effective honeybee viral disease control and surveillance programs in Spain.ZusammenfassungSpanien gilt als der weltweit drittgrösste Produzent für Honigbienen (Apis mellifera). Demgegenüber stehen von Viren wie dem Verkrüppeltem Flügelvirus (DWV), dem Schwarzen Königzellenvirus (BQCV) und dem Kaschmir Bienenvirus (KBV) hervorgerufene Krankheiten, die als die wichtigsten Ursachen für virale Krankheiten der Honigbiene gelten und schwerwiegende epidemiologische und wirtschaftliche Schäden in befallenen Bienenständen verursachen können. Voraussetzung für die Kontrolle dieser viralen Infektionen ist die Entwicklung hochspezifischer und hochsensitiver Diagnosemethoden und die Kenntnis der landesweiten Verbreitung dieser Krankheiten. Für Spanien gilt es insbesondere auch, vorläufige Daten über die Auswirkungen dieser Krankheiten auf die Honigbienen produzierende Industrie zu erfassen. Hauptziel dieser Arbeit war es, die analytische Sensitivität und Spezifität von RT-PCR-Methoden für die Identifizierung von DWV-, BQCV- und KBV-Infektionen in spanischen Bienenvölkern zu ermitteln. Insgesamt wurden zwischen den Jahren 2004 und 2006 Proben aus 294 Bienenvölkern der 14 von 15 Verwaltungsregionen Spaniens (ohne Inselregionen) gesammelt (Abb. 1). Für die Detektion von DWV und BQCV nutzten wir eine auf SYBR-Green-Inkorporation beruhende Einschritt-Realtime RT-PCR-Methode (Kukielka et al., 2008) und für die KBV-Detektion modifizierten wir eine konventielle RT-PCR-Methode (Stoltz et al., 1995) für Realtime-Bedingungen.Die analytische Spezifität der RT-PCR-Methoden wurde durch Sequenzanalyse der Amplifikationsprodukte überprüft. Die Sensitivität der Realtime RT-PCR-Ansätze lag bei 10−9 Viruspartikel für DWV und BQCV und bei 10]t-5 für KBV. Zur Analyse der Verbindung zwischen Virusvorkommen und Anzahl und räumlicher Verteilung der Bienenvölker nutzten wir ein auf einem Bayes’schen Verfahren beruhendes Modell. Dabei zeigte sich, dass DBV mit 84,0 % das am häufigsten vorkommende Virus in den Stockproben war, gefolgt von BQCV (68,0 %) und KBV (1,7 %). Eine Ko-Infektion durch zwei Viren, meist mit BQCV und DWV, wurde in 60,4 % der Proben gefunden. Die visuelle Begutachtung des krankheitsspezifischen Restrisikos lässt erwarten, dass hier nicht erfasste Faktoren einen Anstieg des Risko für einen DWV-, BQCV- und KBV-Befall in Spanien in östlicher und südlicher Richtung mit sich bringen können (Abb. 2). Der Anteil der in dieser Studie gefundenen positiven Probe für pathogene Bienenviren entspricht dem von Schätzwerten aus anderen Ländern. Der Anteil positiver Proben war auch assoziiert mit der Anzahl an Bienenvölkern in der jeweiligen Region. In Abwesenheit aktiver und formaler Präventions- und Überwachungsprogramme ist deshalb zu erwarten, dass Bienenviren vor allem in Regionen mit der grössten Bienendichte eingeführt werden und sich dort aufgrund der erhöhten Kontaktwahrscheinlichkeiten mit infizierten Bienen verbreiten können. Die Ergebnisse dieser Studie sollten von Nützlichkeit sein für die Entwicklung von Überwachungs- und Kontrollprogrammen für Viruskrankheiten, die die Honigbienenindustrie Spaniens treffen können.