Effets des champs électriques pulsés milli et nanosecondes sur cellules et tissus

L'electropermeabilisation est une technique permettant, entre autre, l'entree de molecules cytotoxiques dans les tumeurs. Elle consiste en la permeabilisation transitoire de la membrane plasmique suite a l'application de champs electriques pulses. Certaines conditions electriques permettent le transfert de gene, ouvrant le champ d'application de la technique a la therapie genique. Cette these s'est interessee a etudier les effets des champs electriques sur cellules et tissus, dans le cas de l'electro-transfert de gene. En effet, la comprehension mecanistique de ce transfert est indispensable a l'optimisation de la technique pour les futures applications cliniques. Dans ce contexte, nous nous sommes attaches a etudier les 3 barrieres rencontrees par le gene lors de son transfert, a savoir la complexite de l'environnement multicellulaire au niveau du tissu, la membrane plasmique et l'enveloppe nucleaire au niveau de la cellule. i) L'efficacite de l'electrotransfer de gene a ete etudie sur le modele de tumeur in vitro/ex vivo dit spheroide. Dans un premier temps ce modele a ete valide pour l'etude de l'electrotransfection et dans un deuxieme temps les raisons de l'absence d'efficacite en structure tissulaire ont ete mises en evidence et l'optimisation de la technique a ete amorcee. ii) Une deuxieme partie a ete dediee a l'etude nano-mecanique des cellules a l'echelle de la membrane plasmique par microscopie a force atomique. La microscopie a force atomique a ete utilisee afin d'imager et mesurer par spectroscopie de force l'effet de l'electropermeabilisation sur la membrane plasmique. Nous avons image la perturbation membranaire et mesure une diminution d'elasticite membranaire suivant l'application des champs electriques. Ce phenomene a ete relie aux effets secondaires de l'electropermeabilisation affectant l'actine corticale. iii) Une derniere partie s'est interessee aux effets des nanopulses. Ces impulsions tres courtes (ns) et intenses (plusieurs kV/cm) representent la nouvelle generation d'impulsions, dont les effets sont encore peu decrits, mais pourraient permettre une destabilisation specifique de l'enveloppe des organelles. L'impact de ses impulsions nanosecondes sur la membrane ont ete analysee par Patch-Clamp pour determiner l'implication du cytosquelette d'actine dans la forme des nanopores crees. Dans un deuxieme temps leur impact sur l'enveloppe nucleaire a ete etudie, dans le but de determiner d'eventuels effets nefastes sur le fonctionnement cellulaire, et la potentielle augmentation de transfection resultant d'une destabilisation de la deuxieme barriere rencontre par le gene lors de son transfert. Il est montre que l'actine ne joue pas de role dans la formation des nanopores, et que les impulsions nanosecondes ne permettent pas d'augmenter l'efficacite de transfection. En conclusion ces travaux ont apporte de nouveaux elements dans la comprehension du mecanisme d'electroporation et des barrieres au transfert de gene. Des protocoles, modeles, et outils ont ete mis en place et sont aujourd'hui valides et disponibles pour une investigation poussee des effets des champs electriques sur le vivant