Principes du repliement de la chromatine dévoilés par la microscopie super-résolue multi-couleurs

La relation entre le repliement du genome et les processus cellulaires majeurs, notamment la transcription, la reparation de l’ADN et la replication est une question biologique centrale. De nouvelles methodes de la genomique ont revele un niveau inconnu de l’architecture tridimensionnelle de la chromatine. A l’echelle en dessous de la megabase, certaines sequences genomiques se trouvent preferentiellement a proximite les unes des autres formant ainsi des domaines topologiques associes (TAD). Les genes situes dans le meme TAD ont des proprietes epigenetiques similaires, et leur expression au cours de la differentiation semble correlee, ce qui suggere un lien fort entre la structure de la chromatine et la transcription. Les TADs sont a leur tour separes par des regions avec peu de contacts, appelees frontieres, qui sont generalement occupees par des proteines dites isolatrices. Les determinants de cette organisation chromatinienne particuliere et ses implications fonctionnelles sont largement meconnus. Selon une hypothese recente, les TADs seraient formes par des contacts entre les sequences des frontieres, stabilises par la formation de boucles via les proteines isolatrices. Les travaux presentes ici ont pour but d’etudier le role des proteines isolatrices dans le mecanisme de formation des TADs chez la drosophile. La microscopie super-resolue a ete implementee et une serie de developpements ont ete realises en microscopie a illumination structuree (SIM) et la microscopie a localisation de molecules uniques (SMLM), avec une attention particuliere sur le marquage fluorescent. Ces developpements ont directement ete appliques a l’etude de l’organisation nucleaire de la proteine associee aux elements frontieres (BEAF), une des 11 proteines isolatrices identifiees a ce jour chez la drosophile. Le fort enrichissement aux frontieres des TADs, ainsi que son activite dans la formation de boucles d’ADN font de BEAF un candidat interessant pour tester l’hypothese de regroupement de frontieres comme mecanisme general de repliement de la chromatine. La technique SMLM multi-couleurs a systematiquement localise BEAF a la peripherie des larges domaines portant la marque epigenetique H3K27me3. L’analyse quantitative des images SMLM a revele que BEAF forme des centaines de foyers d’une taille de 45 nm, composes en moyenne de 5 molecules, ce qui est en desaccord avec la presence de boucles de chromatine a large echelle. Afin de tester le regroupement de genes directement au niveau de l’ADN, des frontieres ont ete marquees par des oligonucleotides fluorescents. Le nombre de foyers detectes par SIM s’est a nouveau revele incompatible avec le modele de contacts entre les frontieres tout le long du genome. Par ailleurs, les distances entre paires de frontieres au niveau de deux regions genomiques ont montre <5% de contacts. Ensemble, ces resultats sont en desaccord avec l’etablissement d’interactions entre barrieres chez la drosophile. Enfin, ces travaux de these ont contribue au developpement methodologique de la microscopie super-resolue, ce qui a permis d’apporter des preuves experimentales invalidant le modele de regroupement des frontieres comme mecanisme general du repliement chromatinien.