Pseudomonas putida como plataforma para la producción de bioproductos

El agotamiento de los combustibles fosiles sumado en la inestabilidad de los precios hace que aumente el interes por los combustibles renovables. El butanol, puede ser un aditivo de la gasolina debido a su contenido energetico ademas de ser ampliamente empleado en la industria como precursor de pinturas, aromatizante y precursor de plasticos y polimeros. Por otra parte, los mecanismos de tolerancia y asimilacion han sido ampliamente estudiados en Pseudomonas putida. Debido a las caracteristicas naturales de P. putida, se estudio el diseno una cepa huesped para la produccion de butanol asi como explorar las posibles rutas para su produccion mediante el uso de operones sinteticos. Este trabajo se centro en los estudios de tolerancia y asimilacion de butanol en P. putida BIRD-1, una bacteria promotora del crecimiento vegetal, en la cual se estudiaron los mecanismos responsables en la asimilacion del butanol como fuente de carbono y la respuesta fisiologica frente a este disolvente. El estudio de la ruta de asimilacion seguido de la construccion de la cepa que no asimila butanol, conducen hacia el uso de este huesped tolerante a butanol de modo natural, como posible plataforma para la sintesis de butanol. En este trabajo se evaluo el uso de diferentes cepas para dicho proprosito; P. putida KT2440, DOT-T1E y BIRD-1. Ademas se identificaron los genes implicados en tolerancia y asimilacion mediante diversas tecnicas y se exploraron posibles rutas para la sintesis de butanol. Llegando a las siguientes conclusiones: I) Pseudomonas putida BIRD-1 fue capaz de soportar concentraciones de butanol mayores que KT2440 DOT-T1E. Debido a su gran versatilidad en la utilizacion de fuentes de carbono, un consumo de butanol limitado y la mayor tolerancia a butanol, se considero que BIRD-1 es un modelo de estudio adecuado para la produccion de butanol. II) Se identificaron 16 mutantes (con mutaciones en 14 genes distintos) que mostraban deficiencias en la tolerancia a butanol, su asimilacion o ambos. Tres de los mutantes eran deficientes en la asimilacion de butanol, otros tenian defectos en la tolerancia y los diez restantes eran mutantes en ambos, tolerancia y asimilacion. III) Los tres mutantes deficientes en asimilacion de butanol presentaban inserciones en diferentes posiciones dentro del gen que codifica la malato sintasa B (GlcB), una enzima clave de la ruta del glioxilato (metabolismo energetico). IV) Los mutantes sensibles a disolventes presentaban inserciones que interrumpian genes relacionados con la generacion de energia y el funcionamiento del ciclo de Krebs. Uno de los mutantes presento una insercion del transposon en el gen lpdG, que codifica el componente E3 dihidrolipoamida deshidrogenasa del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa; mientras que en los otros dos mutantes, el transposon mini-Tn5 se inserto en sucA y sucD, dos genes que codifican los componentes del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa dependiente de tiamina. V) La utilizacion de tecnicas -omicas nos permitio identificar los genes esenciales relacionados con la tolerancia y la asimilacion de butanol. Se identifico la ruta de asimilacion butanol en Pseudomonas putida BIRD-1. Un control exhaustivo del metabolismo energetico, las bombas de eflujo y la presencia de cofactores permite tolerar butanol. VI) Una segunda ronda de mutagenesis usando el mutante glcB como cepa parental permitio aislar un doble mutante incapaz consumir butanol. Este mutante presentaba una insercion en PPUBIRD1_2034, un gen que codifica el elemento sensor de una histidina quinasa. VII) El contexto genetico de este sensor histidina quinasa revelo la presencia de un conjunto de genes potencialmente implicados en la asimilacion de butanol. Por ejemplo, acil-CoA sintetasas, acil-CoA deshidrogenasas y enoil-CoA hidratasas que permiten la entrada del esqueleto carbonado del butanol en el metabolismo central cuando el ciclo del glioxilato esta interrumpido.