Actividad citocromo P450 aromatasa en la lubina ("Dicentrarchus Labrax" L.)

La finalidad de este estudio fue entender la funcion de la actividad aromatasa (AA) en el eje cerebro-gonada de los peces, empleando la lubina ("Dicentrachus labrax" L.) como modelo. Se utilizo el ensayo del agua tritiada para medir la AA utilizando 1s-3H-androstenediona como sustrato. Este metodo fue optimizado para temperatura y tiempo de incubacion, fuerza ionica y pH del tampon, cantidad de sustrato, tejido y cofactores. Se usaron diferentes tipos de controles, incluyendo muestras sin sustrato o cofactor, con exceso de producto, desnaturalizadas, asi como inhibidores especificos de la aromatasa (Fadrozole y 4-hidroxiandrostenediona; 4-OH-delta-[4]), y tambien agua tritiada autentica para calcular recuperaciones. Las incubaciones se llevaron a cabo con 10 mg de tejido fresco en un volumen final de 0.4 ml. Las condiciones optimas para medir la AA fueron: tampon fosfato a 50 mM, pH 7.4 y temperatura de incubacion de 30°C. Al emplear homogenados, se requirio la presencia de cofactores en las incubaciones. Por ello, se incorporo un sistema generador de NADPH, con una concentracion de NADP de 1 mM. La concentracion de sustrato fue normalmente 150 nM, despues de determinar que concentraciones de 100 nM y superiores eran saturantes. Para completar la validacion el metodo del agua tritiada se utilizo el metodo directo de medida de estrona, con 7-[3]H-androstenediona como sustrato. Los metabolitos formados se identificaron por cromatografia de capa fina (TLC). Con incubaciones hasta 30 min ambos metodos dieron identicos resultados. Por ello, 30 min fue el tiempo de incubacion en las subsiguientes determinaciones. Se uso el metodo descrito para determinar si existia AA diferentes en cerebro vs ovario. Se encontro que la aromatasa en homogenados de cerebro de lubina posee una K[sub m] de 7,3 ± 0,6 nM y una V[sub max] de 7,9 ± 0,1 pmol/mg proteina/h, mientras que la del ovario posee una K[sub m]de 4,6 ± 1,3 nM y una V[sub max] de 2,1 ± 0,6 pmol/mg proteina/h. Tambien se estudio la distribucion de la mencionada actividad en diferentes organos y encontro que la mayoria de la AA por unidad de proteina se localizaba en el cerebro, como era de esperar, seguida del ovario, la grasa visceral, el higado y el rinon anterior, mientras que era despreciable en el resto de tejidos analizados, incluyendo los testiculos. En el cerebro, la AA estaba concentrada en la parte anterior (hipotalamo, bulbo olfatorio y telencefalo), asi como en la hipofisis, pero se detecto muy poca AA en el bulbo optico, cerebelo y medula. Para investigar la relacion entre la aromatasa y el ciclo reproductor, la AA se analizo durante un ano entero y se correlaciono con la actividad gonadal, indicada por los cambios en el indice gonadosomatico (GSI) por los niveles circulantes de esteroides sexuales (testosterona y estradiol). Los resultados mostraron que la maxima AA del cerebro coincidia con la epoca de puesta, precedida por niveles maximos de testosterona, observados dos meses antes. En lubinas juveniles que estaban completando la diferenciacion sexual, la AA en el cerebro era ya detectable, aunque a niveles significativamente menores que los observados en adultos. Por ello, se decidio medir la AA a lo largo del primer ano de vida encontrando un maximo a 200 DPH y otro a 300 DPH en el cerebro de ambos sexos, sin embargo en gonadas el maximo se observo a 250 DPH en ambos sexos con mayores valores en hembras que en machos y una brusca caida en machos a 300 DPH. Esto sugiere un requerimiento de estrogenos para el desarrollo de las gonadas independientemente del sexo fenotipico final seguido de una sintesis continuada de estrogeno durante mas tiempo para el desarrollo especifico del ovario. El metodo directo de medida de estrona mostro que la mayoria de la androstenediona (38%) permanecia sin transformar y que los principales metabolitos identificados (testosterona>>estradiol>estrona), juntos sumaban un 40% de la actividad inicial. Aprovechando que esta actividad es excepcionalmente alta en el cerebro de la lubina, igual que sucede en otros peces se planteo entonces la hipotesis de que la actividad de la 11s-hidroxilasa podia estar transformando el 22% de sustrato restante en 11-s-hidroxiandrostenediona. Experimentos disenados para tal fin mostraron que la 11s-hidroxiandrostenediona (11s-OH-delta [4]), y no la estrechamente relacionada 11s-hidroxitestosterona (11s-OHT), actuaba como un inhibidor de la AA de forma dosis-dependiente, reversible, competitiva, y total con una IC[sub 50] (30 microM) solo de uno y dos ordenes de magnitud mas que los de los potentes inhibidores de la aromatasa 4-OH y Fadrozole, respectivamente. Se demuestra por primera vez en vertebrados inferiores o anamniotas que un neuroandrogeno, el 11s-OH-delta [4], actua como regulador de la sintesis de neuroestrogeno.