Funciones morfogenéticas de los genes anu1, anu4, anu9, anu12, sca1, sca5, icu11 y cp2 de arabidopsis

En esta tesis hemos sometido a analisis genetico y molecular a varios mutantes foliares previamente aislados en el laboratorio de jose luis micol, en el que habian sido asignados a las clases fenotipicas angulata (anu), scabra (sca) e incurvata (icu). Los mutantes anu presentan hojas de tamano inferior al silvestre, parcialmente despigmentadas e indentadas. Las hojas de los mutantes sca son variegadas e indentadas y su haz y enves son irregulares. El limbo foliar de los mutantes icu se recurva hacia al haz. Hemos contribuido a la caracterizacion de los mutantes anu1-1, anu4, anu9-1, anu12, sca1, sca5 e icu11-1. La despigmentacion parcial y la indentacion de las hojas de los mutantes anu y sca nos condujo a considerarlos candidatos a padecer alguna disfuncion del cloroplasto y potencialmente informativos sobre la relacion entre la biogenesis de este organulo y el desarrollo foliar. La curvatura de las hojas de los mutantes icu indico una alteracion de la dorsoventralidad y sugirio su utilidad para el estudio del crecimiento de los tejidos dorsales (adaxiales) y ventrales (abaxiales) y/o su coordinacion. Todos los mutantes mencionados habian sido sometidos previamente a analisis del ligamiento a marcadores moleculares, que delimito intervalos de 30-750 kb, candidatos a contener los genes causantes del fenotipo a estudio. Hemos caracterizado las mutaciones de dichos intervalos mediante secuenciacion masiva, estrategia que nos ha permitido identificar los genes anu1, anu4, anu9, anu12, sca1 y sca5. Hemos confirmado la identidad de estos genes mediante ensayos de alelismo y de complementacion fenotipica mediada por transgenes portadores de los correspondientes alelos silvestres. Anu1 es at1g21650, al que autores anteriores denominaron secretiona2 (seca2), que codifica una proteina con actividad atpasa localizada en el estroma de los cloroplastos; Participa en el sistema sec de importacion de proteinas a los tilacoides. Anu4 es at1g02280, que codifica translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts 33 (toc33), uno de los componentes del sistema toc de la envoltura de los cloroplastos, que importa proteinas del citoplasma. Anu9 es at5g14100, que codifica non-intrinsic abc protein 14 (nap14), otro transportador de la envoltura del cloroplasto. Anu12 es at1g49970, que codifica la subunidad caseinolytic protease ring 1 (clpr1) del complejo clp de degradacion de proteinas del cloroplasto. Hemos empleado los mutantes anu1, anu4, anu9 y anu12 para contrastar la validez de la secuenciacion masiva para identificar genes causantes de fenotipos de interes. No hemos considerado conveniente continuar su estudio, dado que los correspondientes cuatro genes habian sido caracterizados en mayor o menor medida por autores anteriores. El ribosoma citoplasmico contribuye a la polaridad dorsoventral de las hojas de arabidopsis. Son prueba de ello los alelos hipomorfos y nulos de varios genes que codifican proteinas ribosomicas, que incrementan la severidad de la ventralizacion causada por la insuficiencia de funcion de asymmetric leaves1 (as1) y as2; El complejo represor as1-as2 es esencial para la especificacion de la identidad de los tejidos dorsales de la hoja. Los dobles mutantes sca1 as2 manifiestan un fenotipo sinergico. Hemos establecido que sca1 es at2g33800, cuyo producto es rps5, un componente de la subunidad menor del ribosoma del cloroplasto. Se demuestra asi que el ribosoma del cloroplasto participa, como el citoplasmico, en la formacion del patron adaxial-abaxial. Por su parte, sca5 es at5g20040, que codifica la trna isopentenyl transferase 9 (ipt9), que participa en la sintesis de la cis-zeatina, una citoquinina. Los mutantes foliares no solo son utiles para identificar genes especificamente implicados en la organogenesis de la hoja: Tambien sirven para desentranar los mecanismos de desarrollo que la hoja comparte con otros organos de las plantas. Este ha sido el caso de icu11-1. En el laboratorio de j.L. Micol se concluyo antes del comienzo de esta tesis que icu11-1 (a) interacciona con alelos mutantes de genes que codifican componentes de la maquinaria epigenetica, como icu1 (mas conocido como curly leaf; Clf) e icu2, (b) causa la desrepresion ectopica y heterocronica de genes de identidad floral en sus hojas, y (c) es un alelo de at1g22950, que codifica una presunta dioxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato y fe2+ (2ogd). Hemos establecido que icu11 pertenece a una familia de cinco genes de la superfamilia de las 2ogd, a la que hemos llamado cupuliformis (cp). Icu11 y cp2, su paralogo mas proximo, son funcionalmente redundantes: Los dobles mutantes icu11 cp2 carecen de desarrollo vegetativo y florecen inmediatamente despues de la germinacion. Este fenotipo letal es muy similar al de los alelos de insuficiencia de funcion de embryonic flower 1 (emf1) y emf2, que codifican proteinas del grupo polycomb con funciones epigeneticas conocidas. La secuenciacion masiva del arn de icu11-1 ha revelado la desregulacion de cientos de genes, algunos de los cuales modulan el desarrollo floral, como los de la familia mads-box. La desrepresion de uno de estos ultimos, sepallata3 (sep3), causa la curvatura foliar de icu11-1. Hemos demostrado mediante secuenciacion masiva del genoma de icu11-1 tras su tratamiento con bisulfito e inmunoprecipitacion de su cromatina que icu11 y cp2 participan en la modificacion quimica de las histonas, pero no en la metilacion del adn. El resultado mas importante de esta tesis es la identificacion de una familia de componentes de la maquinaria epigenetica cuya actividad parece distinta de las previamente descritas.