Genetic and genomic variability of Legionella pneumophila: applications to molecular epidemiology and public health.

Legionella pneumophila es un patogeno oportunista estrictamente ambiental capaz de causar neumonia debido a la inhalacion de aerosoles con suficiente carga bacteriana. Los brotes y casos esporadicos suelen producirse en ambientes templados y los reservorios encontrarse en zonas con agua donde pueden crearse biopeliculas microbianas. La existencia de formas no cultivables de la bacteria aumenta el riesgo para la salud publica, ya que los metodos estandar basados en cultivo microbiologico no pueden detectarlas, complicando las investigaciones ambientales. La clasificacion genetica basada en el metodo Sequence-Based Typing (SBT) permite un mayor poder de discriminacion entre cepas de L. pneumophila en comparacion con metodos previos. Los datos derivados del SBT pueden utilizarse para estudios de variabilidad genetica y estructura poblacional. Sin embargo, puede llevarse a cabo un analisis mas exhaustivo mediante tecnicas de secuenciacion genomica de alto rendimiento. Esta tesis describe la utilizacion tanto de SBT como de secuenciacion genomica para evaluar e incluso proponer soluciones a diferentes necesidades en salud publica relacionadas con la epidemiologia de L. pneumophila. Nos centramos en la Comunidad Valenciana (CV), la segunda region en Espana con mayor incidencia de legionelosis, con especial interes en la localidad de Alcoy, donde ocurren brotes de forma recurrente. En primer lugar, utilizamos datos derivados de SBT para conocer mejor la variabilidad y la distribucion de los perfiles geneticos (Sequence Types, ST) en el area de la CV. Mostramos que el nivel de variabilidad en solo esta region es comparable a la de otros paises, con perfiles extendidos local y globalmente. Aproximadamente la mitad de la diversidad genetica observada se estima que procede de estructuracion geografica y temporal. En segundo lugar, la deteccion de L. pneumophila a partir de fuentes ambientales sigue suponiendo un reto para la salud publica. En esta tesis realizamos una comparacion entre la deteccion mediante touchdown PCR (TD-PCR) a partir de muestras de agua y biopeliculas microbianas y mostramos que estas ultimas proporcionan un aumento del 10 veces en la tasa de deteccion de la bacteria. Este metodo permitio evaluar la diversidad no cultivable de L. pneumophila en la localidad de Alcoy y la investigacion a tiempo real de un brote en un hotel en Calpe (Sudeste de Espana) en 2012. A continuacion, aplicamos la secuenciacion genomica a 69 cepas aisladas durante 13 brotes ocurridos en Alcoy en el periodo 1999-2010, principalmente el recurrente ST578. Se observo mayor variabilidad entre cepas de un mismo brote que la esperada, lo cual apunta a la existencia potencial de multiples fuentes en esta area, o alta diversidad ambiental. Ademas, se observo que mas del 98% de la variabilidad genomica fue introducida por procesos de recombinacion y no de mutacion puntual. Finalmente, se realizo un analisis metagenomico de biopeliculas ambientales recogidas en Alcoy. Se encontro que la comunidad esta dominada por Proteobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria y Bacteroidetes. A pesar del conocido endemismo de Legionella en el area, este genero solo se encontro en una abundancia relativa entre 0.01-0.07%, lo cual explica su baja tasa de recuperacion a partir de muestras ambientales. En resumen, los resultados de esta tesis pueden ser de utilidad para los programas de control de este patogeno llevados a cabo por las autoridades de salud publica, ya que proporcionan una nueva percepcion de su epidemiologia molecular, con aplicacion inmediata a la vigilancia e investigacion de brotes.