Molekulare Analyse der mRNA-Expression von Plasma-Prokallikrein

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch auserhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schliesen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebestandigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklaren, sollte in dieser Arbeit zunachst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der ubrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen fur eine ubiquitare, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man auserhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, wahrend FXII-mRNA nahezu ausschlieslich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am starksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was fur eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzundungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilitat der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhangt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch standige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewahrleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Wahrend in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkurzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazellulare Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse fur die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Auserdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwarts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazitat. Durch die Generierung von neun Verkurzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitar exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazitat besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivitat. Somit konnen innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermoglicht wird.