Analysis of diurnal gene regulation and metabolic diversity in Synechocystis sp. PCC 6803 and other phototrophic cyanobacteria

Cyanobacteria are an ancient, highly diverse phylum of prokaryotes, populating virtually all habitats on the surface of the earth. Most organisms of this group are capable of a photoautotrophic lifestyle and harvest energy by capturing photons emitted from the sun to convert atmospheric carbon dioxide into essential organic compounds. This makes them one of the prime producers for the global food chain. Due to the rhythmic alternation of day and night, cyanobacteria constantly have to cope with variations in the availability of their primary energy source. Most strains therefore harbor a circadian clock mechanism consisting of three proteins KaiA, KaiB, and KaiC, whose biochemical interactions result in a self-sustained and temperature-compensated phosphorylation cycle with a period of approximately 24 hours. Understanding circadian gene expression, facilitated by this mechanism, is a major objective of this thesis. Three time-series experiments with distinct patterns of illumination were conducted in the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. Despite its possession of kaiA and three copies each of kaiB and kaiC, I did not detect any self-sustained oscillations in this organism. However, genes were expressed in a tight diurnal schedule corresponding to the photoautotrophic lifestyle, in oscillating light-dark conditions. In addition, I observed a novel phenomenon of diurnal accumulation of ribosomal RNAs during dark periods. This finding challenges common assumptions on the amount of ribosomal RNAs and I can only speculate about the association with growth in rhythmic environments. Due to their high growth rates and undemanding nature regarding nutrients, water salinity, and temperature, cyanobacteria emerged as a viable option for sustainable production of various chemical commodities, including biofuels, biopolymers, or plain biomass. For cost-efficient production rates, however, optimization of growth conditions and genetic modification of intracellular biochemical reactions are inevitable, both requiring comprehensive knowledge of the cyanobacterial metabolism. To address this issue, I compared the genomes of multiple cyanobacterial strains through an exhaustive analysis of orthologous genes, which allowed reasonable guesses for the size of the full complement of genes as well as the set of highly conserved core genes. Examining the diversity of the central carbon and storage metabolism, I observed that parts of the network are highly conserved, while other pathways are adjusted to the organism’s modes of life. Systematic analysis of genes shared by similar subsets of organisms indicates high rates of functional relationship in such co-occurring genes. Going one step further, I designed a novel approach to identify modules of co-occurring genes, which exhibit a high degree of functional coherence and reveal known but also previously unknown functional relationships. Complementing the precomputed modules, I developed the SimilarityViewer, a graphical toolbox that facilitates further analysis of co-occurrence with respect to specific cyanobacterial genes of interest. Simulations of automatically generated metabolic reconstructions revealed the biosynthetic capacities of individual cyanobacterial strains, which will assist future research addressing metabolic engineering of cyanobacteria. Zusammenfassung Cyanobakterien bilden einen alten, weitverzweigten Stamm von Bakterien und finden sich in nahezu allen Biotopen auf der Oberfläche der Erde. Die meisten Organismen dieser Gruppe leben photoautotroph und beziehen ihre Energie aus dem Sonnenlicht, um Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre in essentielle organische Bausteine umzuwandeln. Damit gehören sie zu den wichtigsten Produzenten der weltweiten Nahrungskette. Aufgrund des regelmäßigen Wechsels von Tag und Nacht müssen sich Cyanobakterien ständig auf veränderte Lichtverhältnisse einstellen. Die meisten Unterarten besitzen dafür eine innere Uhr, welche aus den drei Proteinen KaiA, KaiB und KaiC besteht, deren biochemische Interaktionen zu einem selbsterhaltenden und temperaturunabhängigen 24-stündigen Rhythmus von Phosphorylierung und Dephosphorylierung führen. Um die von diesem Mechanismus ausgelöste circadiane Genexpression besser zu verstehen, wurden drei Zeitserienexperimente mit unterschiedlicher Beleuchtung in dem Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 durchgeführt. Obwohl dieses Bakterium neben kaiA auch jeweils drei Genkopien von kaiB und kaiC besitzt, konnte ich keine selbsterhaltenden Rhythmen entdecken. Gleichwohl werden die Gene in einer Tag-Nacht-Umgebung nach einem genauen Zeitplan aktiviert. Des Weiteren konnte ich einen starken Anstieg der ribosomalen RNA in der Dunkelheit beobachten, wobei dies dem allgemeinen Wissen über die zelluläre Konzentration von RNA widerspricht. In den letzten Jahren haben Cyanobakterien aufgrund ihrer hohen Wachstumsraten und geringen Anforderungen an Nährstoffe, Wasserqualität und Temperatur hohes Interesse für die nachhaltige Erzeugung von Biokraftstoff, Biokunststoff oder Biomasse hervorgerufen. Für einen wettbewerbsfähigen, industriellen Einsatz werden allerdings optimale Wachstumsbedingungen und genetische Optimierungen benötigt, was umfangreiches Wissen über den Metabolismus der Cyanobakterien voraussetzt. Dafür habe ich die Orthologien zwischen zahlreichen Cyanobakterien untersucht, was unter anderem eine gute Abschätzung der Anzahl aller verfügbaren sowie aller konservierten Gene ermöglicht. Zusätzlich konnte ich beobachten, dass ein Teil des zentralen Kohlenstoffmetabolismus speziesübergreifend konserviert ist, während andere Teile stark an die Lebensweise der Organismen angepasst sind. Eine systematische Analyse von Genen, die gemeinsam in denselben Arten vorkommen, zeigt, dass diese Gene oft auch eine gemeinsame Funktion haben. Ich habe daher eine Methode entworfen, um Gruppen von gemeinsam vorkommenden Genen zu identifizieren. Ich konnte zeigen, dass diese häufig an zusammengehörigen biologischen Prozessen beteiligt sind und damit bekannte, aber auch unbekannte Beziehungen aufdecken. Zusätzlich zu den in der Arbeit diskutierten Modulen habe ich den SimilarityViewer entwickelt, ein grafisches Computerprogramm für die Identifizierung von gemeinsam vorkommenden Partnern für jedes beliebige Gen. Außerdem habe ich für alle Organismen automatische Rekonstruktionen des Stoffwechsels erstellt und konnte zeigen, dass diese die Synthese von gewünschten Stoffen gut vorhersagen, was hilfreich für zukünftige Forschung am Metabolismus von Cyanobakterien sein wird.