Structural and functional studies on the regulation of the protease-chaperone function of DegP and DegQ from Escherichia coli

Die fehlerhafte Entfernung von ungefalteten Proteinen kann zur Bildung von moglicherweise gefahrlichen Aggregaten, zur Inaktivierung von funktionellen Proteinen bis hin zum Tod einer Zelle fuhren. Um eine einwandfreie Homoostase aufrechtzuerhalten hat die Zelle ein System zur Uberwachung der Proteinqualitat entwickelt. Dieses Kontrollsystem umfasst spezielle Chaperone und Proteasen, die den Zustand von zellularen Proteinen unter physiologischen und unter Stressbedingungen uberwachen. Abhangig vom Grad der Beschadigung der nicht-nativen Proteine werden diese entweder ruckgefaltet oder aber entfernt. In Escherichia coli wird der Zustand von periplasmatischen Proteinen von zwei Reprasentanten der HtrA Proteasefamilie uberwacht: DegP und DegQ. Das Hitzeschockprotein DegP verfugt uber eine abbauende und eine ruckfaltende Aktivitat und es kann zwischen diesen beiden gegensatzlichen Funktionen in regulierter Weise umschalten. In dieser Arbeit wurden verschiedene DegP/Substrat-Komplexe charakterisiert. Es zeigte sich, dass fehlgefaltete Proteine das hexamere DegP in grose, katalytisch aktive 12- und 24-mere Partikel umwandeln, abhangig von der Grose und der Konzentration des vorliegenden Substrates. Die gleiche Art der Regulation, d.h. eine Aktivierung der Proteaseaktivitat durch eine substratinduzierte Umwandlung des Oligomers, konnte auch fur DegQ festgestellt werden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass dieser einzigartige Regulationsmechanismus ein konserviertes Merkmal der HtrA Familie darstellt. Weiterhin zeigte die strukturelle und biochemische Analyse von DegP im Komplex mit Ausenmembranproteinen (outer membrane proteins, OMPs), dass DegP Proteine in einer zentralen Kammer einschliest, die sowohl als Chaperon als auch Protease-Kompartiment dienen kann. Wahrend die Einkapselung von gefalteten OMP Protomeren schutzend wirkt und moglicherweise den sicheren Transport durch das Periplasma gewahrleistet, werden fehlgefaltete Proteine in der molekularen Reaktionskammer abgebaut. Um weitere typische Merkmale der HtrA Familie zu bestimmen, konzentrierte sich diese Studie darauf, regulatorische und mechanistische Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Protease-Chaperon Systemen, DegP und DegQ zu ermitteln. Untersuchungen der Proteaseaktivitat und des Molekulargewichtes des DegQ Oligomers mittels Gelpermeationschromatografie ergaben, dass niedrige pH-Werte (5.5) eine Umwandlung von DegQ von einem hexameren zu einem moglicherweise dodekameren Zustand induzieren. Auffalligerweise war die Veranderung des oligomeren Zustandes mit einer Veranderung der Proteaseaktivitat verbunden, die im Gegensatz zu DegP, am hochsten bei niedrigen pH-Werten war. Bei der weitergehenden Untersuchung der in vivo Relevanz dieser Beobachtung zeigte sich, dass DegQ vor allem fur das Wachstum von Escherichia coli bei niedrigen pH-Werten wichtig ist. Dies deutet darauf hin, dass die pH-abhangige Regulation von DegQ die Adaption des Bakteriums an eine Umgebung mit veranderbarem pH-Wert wiederspiegelt. Weiterhin zeigte das Wachstum eines degQ null Stammes eine verlangerte Adaptionsphase im Vergleich zum Wildtyp, was auf eine grundlegende Rolle von DegQ in der Proteinhomoostase hinweist, welche essentiell in der auserst instabilen Umgebung der bakteriellen Zellhulle ist.