Analysis of lrrk2 towards understanding the pathogenic mechanisms underlying parkinson's disease: deregulated autophagy and endocytosis

La Enfermedad de Parkinson (EP) se presenta de forma esporadica (idiopatica) en la mayoria de los pacientes. Sin embargo, en los pocos casos en que la enfermedad esta determinada geneticamente, la identificacion y el estudio de las mutaciones responsables proporciona una valiosa informacion sobre los mecanismos moleculares implicados en la muerte neuronal. Se ha descrito la asociacion de EP, tanto familiar como esporadica, con mutaciones en LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2). LRRK2 es una proteina que contiene varios dominios, entre los que se encuentran los dominios quinasa y GTPasa, donde suelen aparecer mutaciones patogenicas. Existe una clara correlacion entre el grado de actividad catalitica de LRRK2 y citotoxicidad; sin embargo, los efectos de LRRK2 sobre los procesos celulares tempranos que en ultima instancia causan la muerte celular aun no han sido analizados en profundidad. Aunque se ha descrito tanto in vitro como in vivo que LRRK2 esta involucrado en el trafico endosomal y autofagico, los mecanismos exactos en los que participa aun no se conocen. Esta tesis analiza los mecanismos patogenicos de la EP en los que esta implicado LRRK2, haciendo especial enfasis en los procesos de endocitosis y autofagia. En primer lugar, hemos descrito que mutaciones patogenicas de LRRK2 causan un bloqueo del flujo autofagico a traves de una ruta que implica canales sensibles a NAADP localizados sobre estructuras endosomales tardias y lisosomas. Observamos que LRRK2 patogenica provoca un incremento parcial del pH lisosomal, asi como una disminucion de la supervivencia celular en la presencia de estres debido a agregacion proteica. Puesto que el lisosoma es la estructura final para las rutas de autofagia y endocitosis, se estudio el efecto de mutaciones patogenicas de LRRK2 sobre la endocitosis. En este trabajo demostramos que LRRK2 patogenica es responsable de un deficit, tanto en eventos tempranos como tardios, de la endocitosis mediada por receptor. Este deficit provoca un retraso en el trafico del receptor a nivel del endosoma tardio y, como consecuencia, su acumulacion en estructuras anormalmente alargadas. Estos defectos en el trafico del receptor pudieron ser revertidos por la sobreexpresion de algunas proteinas relacionadas con eventos tardios del trafico endocitico, como rab7L1 o la forma constitutivamente activa de rab7, asi como por proteinas que interaccionan con rab7 como dynamin2/CIN85. Estas proteinas se localizan en endosomas tardios y son cruciales en la regulacion de la degradacion de receptores de membrana. Nuestros resultados demuestran que la expresion de LRRK2 patogenica esta asociada a un descenso de la actividad de rab7, una pequena GTPasa implicada en varios eventos del trafico endosomal, tales como el trafico endosoma tardio-lisosoma y el trafico retromero entre endosoma tardio y trans-Golgi network. BIBLIOGRAFIA Alegre-Abarrategui, J., et al., LRRK2 regulates autophagic activity and localizes to specific membrane microdomains in a novel human genomic reporter cellular model. Hum Mol Genet, 2009. 18(21): p. 4022-34. Biskup, S. , et al., Localization of LRRK2 to membranous and vesicular structures in mammalian brain. Ann Neurol, 2006. 60(5): p. 557-69. Bravo-San Pedro, J.M. , et al., The LRRK2 G2019S mutant exacerbates basal autophagy through activation of the MEK/ERK pathway. Cell Mol Life Sci, 2013. 70(1): p. 121-36 Civiero, L. , et al., Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One, 2012. 7(8): p. e43472. Dauer, W. and S. Przedborski, Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron, 2003. 39(6): p. 889-909 Dodson, M.W. , et al., Roles of the Drosophila LRRK2 homolog in Rab7-dependent lysosomal positioning. Hum Mol Genet. 21(6): p. 1350-63 Gasser, T. , J. Hardy, and Y. Mizuno, Milestones in PD genetics. Mov Disord. 26(6): p.1042-8. Giasson, B.I. , et al., Biochemical and pathological characterization of Lrrk2. Ann Neurol, 2006. 59(2): p. 315-22. Hatano, T. , et al., Leucine-rich repeat kinase 2 associates with lipid rafts. Hum Mol Genet, 2007. 16(6): p. 678-90. Higashi, S. , et al., Abnormal localization of leucine-rich repeat kinase 2 to the endosomal-lysosomal compartment in lewy body disease. J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(9): p. 994-1005. Kett, L.R. and W.T. Dauer, Leucine-rich repeat kinase 2 for beginners: six key questions. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012. 2(3): p. a009407. Macleod, D.A. , et al., RAB7L1 Interacts with LRRK2 to Modify Intraneuronal Protein Sorting and Parkinson's Disease Risk. Neuron, 2013. 77(3): p. 425-39. McMahon, Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem, 2009. 78: p. 857-902. Patel, S. , G.C. Churchill, and A. Galione, Coordination of Ca2+ signalling by NAADP. Trends Biochem Sci, 2001. 26(8): p. 482-9. Paisan-Ruiz, C. , et al., Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron, 2004. 44(4): p. 595-600. Piccoli, G. , et al., LRRK2 controls synaptic vesicle storage and mobilization within the recycling pool. J Neurosci, 2011. 31(6): p. 2225-37. Plowey, E.D. , et al., Role of autophagy in G2019S-LRRK2-associated neurite shortening in differentiated SH-SY5Y cells. J Neurochem, 2008. 105(3): p. 1048-56. Ramonet, D. , et al., Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One, 2011. 6(4): p. e18568. Rojas, R. , et al., Regulation of retromer recruitment to endosomes by sequential action of Rab5 and Rab7. J Cell Biol, 2008. 183(3): p. 513-26. Seaman, M.N. , The retromer complex - endosomal protein recycling and beyond. J Cell Sci, 2012. 125(Pt 20): p. 4693-702. Shin, N. , et al., LRRK2 regulates synaptic vesicle endocytosis. Exp Cell Res, 2008. 314(10): p. 2055-65. Tong, Y. , et al., Loss of leucine-rich repeat kinase 2 causes age-dependent bi-phasic alterations of the autophagy pathway. Mol Neurodegener, 2012. 7: p. 2. Wang, T. , et al., Rab7: role of its protein interaction cascades in endo-lysosomal traffic. Cell Signal, 2011. 23(3): p. 516-21. West, A.B. , et al., Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(46): p. 16842-7.