A study on the phylogeny and the ecology of ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene amoB

L'agricultura i la industrialitzacio han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presencia de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En consequencia, la nitrificacio s'ha convertit en un proces global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) son els responsables de l'oxidacio de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen. Els primers oxidadors d'amoni foren aillats a finals del segle XIX, pero la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assolis un coneixement complert d'aquest grup bacteria. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb sequencies corresponents a AOB. L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines utils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals. En aquest treball primer descrivim la utilitzacio de la hibridacio in situ amb fluorescencia (FISH), mitjancant l'aplicacio de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacteria; no obstant, aquest metode no permetia la deteccio de noves sequencies, pel que es necessitava una nova eina. Amb aquesta intencio vam aplicar la sequencia de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar especificament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presencia i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes sequencies pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren tambe obtingudes amb aquesta tecnica. Aixi mateix, un dels inconvenients de l'us del 16SrDNA com a marcador es la impossibilitat de detectar simultaniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris. El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores ampliament utilitzat com a marcador per a la deteccio dels AOB. En aquest treball tambe descrivim la utilitzacio d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar sequencies de AOB en la mostra, pero la necessitat de detectar amoA mitjancant clonatge fa que l'us d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilitzacio com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtencio de sequencies de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE. Amb la finalitat d'obtenir una eina rapida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucleotids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenetiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat. En aquest treball tambe presentem una analisi de RT-PCR basada en la deteccio del gen amoB per a la quantificacio del genere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucleotids dissenyat permet una enumeracio altament especifica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts. Finalment, vam realitzar un estudi poligenic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i varem construir un arbre filogenetic combinat. Com a resultat concloem que amoB es un marcador adequat per a la deteccio i identificacio dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferencies filogenetiques. Per altra banda, la sequencia sencera del gen 16S rDNA es indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonomiques i filogenetiques en treballar amb cultius purs de AOB.