Exploring the therapeutic potential of recombinant AAV vectors in stem cell and transplantation model systems for the treatment of heart diseases

Herzerkrankungen sind weltweit die Hauptursache fur einen vorzeitigen Tod. Sowohl Gentransfer als auch zellulare Therapien werden derzeit als neue Behandlungsmoglichkeiten fur diese Erkrankungen entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte der AAV-vermittelte Gentransfer von Transgenen ins Herzgewebe von Donororganen, die anschliesend transplantiert wurden, etabliert werden. Als Tiermodelle fur die heterotopen Herztransplantationen wurden Sprague Dawley Ratten und Deutsche Landrasseschweine gewahlt. rAAV2, welcher fur diesen Zweck als geeignet beschrieben wurde, wurde intracoronar entweder in das normotherme oder hypotherme Herz appliziert, welches anschliesend in eine Empfangerratte transplantiert wurde. Der Gentransfer erfolgte mit einer besseren Effizienz in normotherme Herzen. Trotz des erfolgreichen Transfers und der Nachweisbarkeit von Vektor-DNA in Gewebeproben 28 Tage nach Transplantation konnte jedoch weder Transgen-spezifische mRNA noch Proteinexpression detektiert werden. Zur Bestimmung potentieller Barrieren, welche die rAAV2-vermittelte Transgenexpression in unserem Rattenmodell beeintrachtigen, wurden in vitro Analysen in Rattenaortenendothelzellen durchgefuhrt. Wir konnten Zelleintritt und intrazellulares trafficking der viralen Partikel ebenso als inhibierende Faktoren ausschliesen wie die Expression vom gewahlten CMV Promotor. Die signifikante Erhohung der Transgenexpression fur AAV1 (der effizienteste Serotyp) und AAV2 nach Applikation des Proteasomeninhibitors MG132 deutet auf eine Blockierung in der Vektordegradation hin. Daruberhinaus sind auch indirekte Effekte wie eine erhohte Ubiquitinierung des Vektorkapsids denkbar, von der man annimmt, dass sie das sogenannte vector uncoating oder die Translokation in den Nucleus erleichtert. Des Weiteren konnte eine geringfugig eingeschrankte Fahigkeit zur Zweitstrangsynthese beobachtet werden. Diese wird benotigt, um das einzelstrangige DNA-Genom herkommlich verwendeter AAV-Vektoren in einen transkribierbaren Doppelstrang zu verwandeln. Zusammenfassend muss man feststellen, dass sich die analysierten rAAV Serotypen als ungeeignete Gentransfervektoren fur Rattenendothelzellen erwiesen haben. Im Gegensatz dazu wurde in primaren Rattencardiomyocyten in vitro eine deutlich hohere Transduktionseffizienz erzielt. Um in vivo sowohl Endothelzellen als auch Cardiomyocyten zu transduzieren verwendeten wir die vasoaktive Substanz Histamin in unserem porcinen Transplantationsmodell. Der durch in vitro Versuche als geeignet ermittelte Serotyp 2 wurde unter Verwendung des neuentwickelten in situ Langendorff Reperfusionssystems zusammen mit Histamin in das normotherme Herz appliziert. In beiden Tieren konnte der Nachweis eines erfolgreichen Gentransfers anhand deutlich messbarer Transgen-DNA-Mengen erbracht werden. In einem der beiden Tiere wurde zudem funktionales Protein nachgewiesen. Dieses Schwein hatte zehnmal hohere Vektormengen erhalten. Dieser Vektor kodierte zudem fur das Transgen Luciferase und wies eine self-complementary (Pseudo-Doppelstrang) Vektorgenom-Konformation auf. Im Gegensatz dazu wurde das Schwein, das keine Expression zeigte, mit einem Vektor behandelt, der fur beta-Galaktosidase in einer Einzelstrang-Vektorgenom-Konformation kodierte. Obwohl weitere Experimente zur Bestimmung des Einflusses der drei Parameter (Vektormenge, Vektorgenom-Konformation und Wahl des Transgens), einzeln oder in Kombination, benotigt werden, konnten wir zeigen, dass ein rAAV2-vermittelter Gentransfer in porcines Herzgewebe im Rahmen eines (Xeno-) Transplantationsansatzes im Prinzip moglich ist. Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde ein Protokoll zur effizienten Transduktion humaner CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut etabliert. Derartige Protokolle ermoglichen eine Kombination von Zell- und Gentherapie, welche fur ein breites Spektrum an Anwendungen vorteilhaft ist. Vergleiche der Serotypen 2, 3 und 5 ermittelten rAAV2 als den effizientesten Serotyp in Zelleintritt und Transgenexpression. Der Zelleintritt von rAAV2 in CD34+ Zellen war abhangig von Heparansulfatproteoglycan und von alpha-5-beta-1 Integrin. Daruberhinaus ist die Synthese des Zweitstrangs in CD34+ Zellen beeintrachtigt, da nur die Zugabe von Vektoren mit Genomen in der self-complementary Konformation in erfolgreichen Transduktionen resultierte. Die ohnehin schon sehr effiziente Transduktion vorexpandierter Zellen mit rAAV2 mit self-complementary Genomen konnte signifikant durch die Zugabe von all-trans Retinsaure und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A erhoht werden. Daruberhinaus weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass Transduktionen mit rAAV nicht mit der Fahigkeit der CD34+ Zellen zur endothelialen Differenzierung interferieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass unter Verwendung des etablierten Protokolls CD34+ Zellen effizient mit rAAV2 transduziert werden konnen und sich rAAV2 somit als geeignetes Vektorsystem zur transienten Modifikation dieser Zellen anbietet.