Effects of H2O2 signalling originated in chloroplasts and peroxisomes

H2O2 ist ein Signalmolekul in Eukaryoten, jedoch ist die spezifische Wirksamkeit der Signalwirkung bisher weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit haben wir analysiert, ob eine moderate Produktion von H2O2 in verschiedenen pflanzlichen Zellorganellen divergente Effekte auf das Transkriptom ausubt. A. thaliana Pflanzen, welche die Glycolat Oxidase1 in den Chloroplasten uberexprimieren (GO-Pflanzen) und Pflanzen, die einen Funktionsverlust der peroxisomalen catalase2 (cat2 Pflanzen) aufweisen, wuchsen unter nicht-photorespiratorischen Bedingungen an und wurden dann in photorespiratorische Bedingungen transferiert, um die H2O2 Produktion in den Chloroplasten und den Peroxisomen zu induzieren. Durch die Verwendung von existierenden quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) Plattformen haben wir zunachst die Antwort von 187 ROS-antwortenden Genen und 1880 Transkriptionsfaktoren (TF) in GO-Pflanzen untersucht. Die Daten legen eine koordinierte Expressionsanderung von Genen eines spezifischen funktionellen Netzwerks, innerhalb von 0,5 Stunden nach Induktion der H2O2 Produktion in den Chloroplasten und Peroxisomen inklusive der Induktion von Indol Glukosinolat und Camalexin Biosynthese Gene, nahe. Die Analyse der TF zeigte eine Hochregulierung der Expression von speziellen entwicklungsbeeinflussenden Genen. Durch die Verwendung von Microarray Analysen, konnten wir zeigen, dass in spezifischen Organellen produziertes H2O2, zwei verschiedene Arten von Antworten induziert: Antworten, die unabhangig vom subzellularen Ort der Produktion agieren und Antworten, welche abhangig vom Ort der Produktion von H2O2 agieren. Wahrend in Peroxisomen produziertes H2O2 Antworten der Protein Reparatur induziert, induziert in den Chloroplasten produziertes H2O2 fruhe Signalantworten durch die Kontrolle der Gen Transkription und sekundare Signal Molekule. Der Vergleich zwischen cat2 und GO-Pflanzen zeigt, dass H2O2, welches in den Chloroplasten produziert wurde, speziell Gene, welche in der Antwort auf Verwundung und Pathogen Befall involviert sind, wie Camalexin, Indol Glukosinolat und Stigmasterol Biosynthese Gene, induziert. So konnte auch gezeigt werden, dass chloroplastidar produziertes H2O2 die Akkumulation von 4MO-I3M (Glukosinolat) und Stigmasterol induziert. Des Weiteren haben wir die Substratspezifitat der peroxisomalen H2O2 produzierenden (L)-2 Hydroxyacid Oxidasen analysiert. Es wurden die Enzymkinetiken von GO1, GO2 und GO3 bestimmt. Die Daten zeigen, dass GO1 und GO2 Glycolat und GO3 Glycolat und L-Laktat als Substrate verwenden konnen. Um das in vivo Substrat von GO3 bestimmen zu konnen, wurden Funktionsverlustmutanten der GO3 (go3) isoliert und GO3 Uberexpressionslinien generiert. Die Wurzelentwicklung auf MS-Medium, welches Glycolat enthalt, zeigte in allen analysierten Genotypen eine negative Beeinflussung. Im Gegensatz dazu, zeigten nur die go3 Linien, auf MS-Medium, welches mit L-Laktat versetzt war, im Vergleich zum Wild Typ kurzere Wurzeln, wahrend die Uberexpressionslinien der GO3 im Vergleich zum Wild Typ langere Wurzeln aufwiesen. Als nachstes wurde ein Komplementationsassay in Hefen mit einem Defekt in CYB2, ein L-Laktat metabolisierendes Protein, durchgefuhrt. Diese Hefen sind nicht in der Lage auf Medium mit L-Laktat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Die Uberexpression von GO3 aus A. thaliana komplementiert diesen Phanotyp, was darauf hinweist, dass L-Laktat das in vivo Substrat von GO3 darstellt.