The unfolded protein response in Mybpc3-targeted mice with hypertrophic cardiomyopathy

59 5 Abstract Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a common (1:500) inherited cardiac disorder. It is mainly characterized by left ventricular hypertrophy and increased interstitial fibrosis. The individual patient’s clinical course varies from sudden cardiac death during adolescence to chronic heart failure in old age. In approximately one third of all cases, HCM is caused by mutations in the Mybpc3 gene encoding cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C). Recently, interference of mutant cMyBP-C with the ubiquitin-proteasome system, which is responsible for the degradation of the majority of cellular proteins, was demonstrated. Disturbances within the cellular protein homeostasis are major triggers of the unfolded protein response (UPR), a key feature of cellular protein accumulation reactions. The UPR consists of a set of three pathways (IRE1, ATF6 and PERK), each monitoring the conditions within the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). In case of ER stress these pathways initiate different counter measures of which are most important: (1) Increase of chaperone expression (mostly IRE1); (2) Decrease of protein synthesis (mostly PERK) and (3) apoptosis (ATF6) in case of failure of (1) and (2). This investigation focused on an expected activation of the UPR in models of HCM due to mutations in Mybpc3. The first HCM mouse model (KI) carries a point mutation and exhibits low levels of mutant cMyBP-C, while the second model is a homozygous Mybpc3-knock-out (KO) and serves as a model of cMyBP-C insufficiency. Both models were crossed to the Ub-GFP mice, which report the activity of the proteasome. Furthermore, investigations were performed in KI-neonatal mouse cardiomyocytes (KI-NMCM) which are receptive to drug treatment. Fundamental parameters were determined on mRNA and/or protein levels to evaluate overall and single pathway activities of the UPR. Higher protein levels of Ub-GFP in 1 year-old KI, but not KO than in WT suggest impairment of the ubiquitinproteasome system. Interestingly lower or unaffected mRNA levels of multiple UPR parameters (IRE1, GRP78, XBP-1) suggest decreased activity of the UPR in KI model in contrast to our hypothesis. In comparison, the analysis of the KO model revealed increased expression within the IRE1 pathway, suggesting at least partial activation of the UPR. The decreased UPR activity and hereby a potential defect, could not be reproduced in NMCM in basal condition. However treatment with high concentration of the UPR inducing drug thapsigargin revealed an attenuated response in KIcompared to WT-NMCM. These data suggest a decreased activity of the UPR in the KI mouse model, which should be investigated further. Disturbances of the UPR have been identified as causes of pathology in neurodegenerative and diabetic diseases. Therefore this approach might have promising relevance to the investigation of the pathogenesis of HCM. Deutsche Zusammenfassung 60 6 Deutsche Zusammenfassung Familiare hypertrophe Cardiomyopathie (HCM) ist eine haufige (1:500) erbliche Herzkrankheit. Sie ist gekennzeichnet durch linksventrikulare und interstitielle Fibrose. Der individuelle Krankheitsverlauf reicht vom plotzlichen Herztod in der Jugend bis zur chronischen Herzinsuffizienz in hohem Alter. In ca. einem Drittel der Falle wird HCM verursacht durch Mutationen im Mybpc3 Gen, welches das cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C) kodiert. Kurzlich wurde die Interferenz von mutiertem cMyBP-C mit dem Ubiquitin-Proteasom-System nachgewiesen. Dieses ist fur den Abbau des Grosteils zellularer Proteine verantwortlich. Storungen dieses Abbaus sind ein Hauptausloser der unfolded protein response (UPR), ein wichtiger Abwehrmechanismus zellularer Proteinakkumulation. Die UPR besteht aus drei Signalwegen (IRE1, ATF6 und PERK), welche das Innere des Endoplasmatischen Retikulums uberwachen. Im Falle einer Storung leiten die Signalwege unterschiedliche Gegenmasnahmen ein, von denen die wichtigsten sind: (1) Steigerung der Chaperon Expression (v.a. IRE1); (2) Reduzierung der Proteinsynthese (v.a. PERK) und (3) Apoptose, falls (1) und (2) fehlschlagen. Auf dieser Grundlage uberprufft diese Arbeit eine erwartete Aktivierung der UPR in Modellen der HCM auf der Basis von Mutationen in Mybpc3. Das erste dieser Modelle tragt eine Punktmutation und zeigt geringe Konzentrationen mutierten C-Proteins. Das zweite dient als homozygoter Mybpc3 knock-out (KO) als Model der cMyBP-C-Insuffizienz. Desweiteren wurden neonatale Rattencardiomyocyten zum Vergleich und zur pharmakologischen Intervention genutzt. Fundmentale Parameter wurden dann auf mRNAund/oder Proteinebene bestimmt, um die Aktivitat der UPR zu analysieren. Erhohte Proteinwerte von Ub-GFP in ein Jahr alten KI, aber nicht in KO deuten auf eine Beeintrachtigung des ubiquitin-proteasome systems hin. Entgegen unserer Erwartungen zeigte sich jedoch eine erniedrigte oder unveranderte Expression wichtiger UPR Parameter (IRE1, GRP78, XBP-1), die auf eine abgeschwachte Aktivitat der UPR im KI Model hindeutet. Im Vergleich ergab die Analyse des KO Modells Hinweise auf eine teilweise Aktivierung der UPR im IRE1 Signalweg. Die eingeschrankte UPR-Aktivitat des KI Modells, die auf einen etwaigen Defekt hinweisen konnte, konnte jedoch nicht im unbehandelten NMCM Modell reproduziert werden. Interessanterweise zeigte sich jedoch wahrend der Behandlung mit dem UPR Induktor Thapsigargin eine abgeschwachte UPR der KIim Vergleich zu WT-NMCM. Die geschilderten Ergebnisse geben Hinweise auf eine eingeschrankte Aktivitat der UPR im KI Mausmodell. Storungen der UPR Aktivitat konnten bereits als Ursache neurodegenerativer und diabetischer Erkrankungen identifiziert werden. Vor diesem Hintergrund konnten die Erkenntnisse dieser Arbeit vielversprechende Bedeutung fur die Entwicklung der HCM haben.