Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae

L'ATPase-Ca2+ du reticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une proteine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumiere du reticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures a resolution atomique de cette enzyme a ete un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisees en absence de calcium avaient ete obtenues en presence d'un inhibiteur fixe au domaine membranaire. Nous avons d'abord montre, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de proteolyse menagee, que l'interaction de la proteine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations presentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisees avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos resultats ont stimule la recherche de structures nouvelles, en absence ou en presence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirme nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la proteine solubilisee etait jusque la jugee utile pour proteger celle-ci de son eventuelle inactivation irreversible en presence de detergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycerol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en evidence des consequences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des detergents communement utilises pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple etude (Montigny, Arnou et al. 2008). En presence de glycerol, nous avons egalement pu etudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifies apres expression heterologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des etats particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallelement a ces etudes, nous avons elucide le mystere des proprietes de fluorescence anormales d'une forme particuliere de l'enzyme SERCA1a marquee au FITC dans son site nucleotidique. Nous avons mis en evidence une phosphorylation imprevue du FITC lie, conduisant a une tres faible fluorescence, particulierement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une reorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'etape de relargage des ions calcium vers la lumiere du reticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos etudes, il nous a fallu evidemment tenir compte de la possible chelation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnesium, .) par les anions presents. Par pH metrie et a l'aide de sondes colorees, nous avons verifie que le magnesium n'etait PAS chelate par le tampon Mops classiquement utilise, contrairement a ce qui etait rapporte dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collegues du laboratoire, nous avons egalement precise les differents complexes formes par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion reduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes etaient le plus susceptibles de se former au cours de la detoxication cellulaire du Cd2+. Abreviations : ATPase, AdenosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluoresceine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.