Development, validation and application of mass spectrometry methods for clinical pharmacokinetics, neurotransmitter and human habitat studies

Mass spectrometry (MS) is an analytical technique, which identifies, quantifies and provides structural information about compounds in simple and complex mixtures. Herein, we have included 5 MS-based approaches. The first 4 targeted, liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) methods have been successfully validated according to the recommendations of the regulatory agencies, including tests of precision and accuracy, recovery and matrix effect, sensitivity, stability and in some cases carry-over effect. However, for the 5th untargeted metabolomics, three-dimensional (3D) surface imaging MS (3D-surface-IMS) approach, different validation strategy has been applied. The first part of the work is focused on the drug monitoring in human plasma. The first approach enables simultaneous plasma determination of albendazole and its main metabolite albendazole sulfoxide in a fast, easy and robust manner. The second one is able to monitor omeprazole plasma levels. Both methods have been applied for pharmacokinetic studies, indicating the applicability in clinical practice. These simple assays will permit to assess adherence to treatment, therapeutic efficacy and drug resistance, improving the pharmacological treatment of patients. The second part of this study focused on neurotransmitters‟ monitoring in tissue and cell cultures. First method enables the quantification of 8 neurotransmitters (monoamine and amino acids as well as some of their metabolites) in rat brain extracts. It was successfully applied in a murine depression model. The second LC-MS/MS technique is an improvement of the before-mentioned neurotransmitters approach, as it includes simultaneous determination of 14 neurotransmitters (monoamines, amino acids, nucleotides and neuropeptides) in bovine chromaffin cell cultures (BCCs). It was applied to investigate the neurosecretion profile of BCCs and also of human plasma samples, where altered neurotransmitters under stress situations such as Alzheimer‟s disease, are found. Finally, the third part of this thesis describes a LC-MS and MS/MS based untargeted metabolomics method. The chemistry associated with modern human habitat was investigated and visualized with 3D-surface-IMS. This study helps to understand how chemicals are distributed on humans and their environment and may ultimately impact the design of future human habitats. To summarize, we present 5 different MS based approaches successfully applied to different research purposes. On the whole, these results are yet another example of the great potential of a 100 years old MS technique. Resumen Espectrometria de masas (MS, del ingles “Mass spectrometry”) es una tecnica analitica, la cual identifica, cuantifica y proporciona la informacion sobre la estructura quimica de los analitos en una solucion simple y compleja. En este contexto, en esta tesis doctoral, hemos incluido 5 metodos basados en la MS. Cuatro primeros metodos del analisis dirigido, basados en la cromatografia liquida de alta eficacia acoplada a la MS en tandem (LC-MS/MS), han sido validados segun los requisitos de las agencias reguladoras, incluyendo los ensayos de la precision, exactitud, recuperacion de la extraccion, efecto matriz, sensibilidad, estabilidad y en algunos casos del efecto arrastre. Sin embargo, para el quinto metodo del analisis no-dirigido y de la MS con la imagen tridimensional de superficie (3D-surface-IMS, del ingles “Three-dimensional-surface-imaging MS”), se aplico una estrategia de validacion diferente. La primera parte de la tesis doctoral se centra en la monitorizacion de los farmacos en el plasma humano. El primer metodo facilita la determinacion simultanea del albendazol y su metabolito en el plasma, de forma rapida, simple y robusta. El segundo metodo permite la cuantificacion de los niveles plasmaticos del omeprazol. Ambas tecnicas se aplicaron en los estudios farmacocineticos, demostrando la utilidad clinica. Estos simples metodos evaluaran la adherencia, eficacia y resistencia al tratamiento, mejorando el tratamiento farmacologico de los pacientes. La segunda parte de esta tesis trata de la determinacion de los niveles endogenos de neurotransmisores en el tejido y en los cultivos celulares. El primer metodo permite el estudio de 8 neurotransmisores en el extracto del cerebro de rata y se aplico con exito en el estudio de neurotransmisores en un modelo murino de depresion. El segundo metodo, tras un par de modificaciones del anterior, nos permite monitorizar simultaneamente 14 neurotransmisores en las celulas cromafines bovinas (BCCs, del ingles “Bovine chromaffin cells”) y sirvio para la investigacion del perfil neurosecretor de las BCCs bajo condiciones de estres, asi como en la enfermedad de Alzheimer, donde los neurotransmisores tambien se encuentran alterados. La tercera parte del trabajo, esta centrada en el estudio metabolomico no-dirigido. 3D-surface-IMS permitio el estudio de las sustancias quimicas asociadas con el entorno humano moderno con el fin del entendimiento de las interacciones entre los humanos y su entorno. Asi como un diseno consciente de futuros habitos humanos. En resumen, presentamos 5 metodos basados en MS, aplicadas con exito en diferentes abordajes de investigacion. Los resultados incluidos en esta tesis doctoral, representan un ejemplo mas del gran potencial de la MS que lleva mas de 100 anos.