Développement d’un laboratoire sur puce pour la préconcentration sur support monolithique. Application à l'enrichissement et la séparation en ligne de phosphopeptides.

Les laboratoires sur puce sont des dispositifs miniaturises qui offrent la possibilite d'integrer en ligne toutes les etapes de la chaine analytique tout en reduisant les volumes d’echantillon et les temps d’analyse. Ainsi, ils constituent potentiellement un outil de diagnostic particulierement adapte pour l’analyse de biomarqueurs phosphoryles, pour lesquels une preconcentration est necessaire en raison de leur faible abondance dans les fluides biologiques. C’est pourquoi, de nouvelles methodes, dediees a l'enrichissement de phosphopeptides, ont ete developpees ces dernieres annees et en particulier celles utilisant des supports solides basees sur la chromatographie d’affinite sur des ions metalliques immobilises (IMAC). Parmi les supports solides integrables en microsysteme, les monolithes organiques constituent une option privilegiee grâce a la possibilite d’etre synthetises in situ. Le but de ce travail de these etait donc de developper un laboratoire sur puce integrant une preconcentration des phosphopeptides sur support monolithique base sur le principe de l’IMAC et leur separation electrophoretique en ligne.Dans un premier temps, nous avons developpe deux approches innovantes qui ont permis de synthetiser pour la premiere fois un monolithe a base d’ethylene glycol methacrylate phosphate (EGMP) et de bisacrylamide (BAA) par voie photochimique dans des microsystemes. La premiere strategie developpee dans des puces en verre repose sur la synthese du monolithe a l’aide d’un microscope a epifluorescence. La deuxieme approche est basee sur les proprietes photochimiques d’un nouvel amorceur qui a permis de synthetiser et d’ancrer le monolithe, en une seule etape, aux parois des puces en polydimethylsiloxane (PDMS). Une caracterisation de ce monolithe en termes de morphologie, de permeabilite, de porosite et de surface specifique a ensuite ete realisee. Ceci a permis de demontrer le potentiel de ce monolithe pour la preconcentration.Dans un deuxieme temps, une methode de separation par electrophorese couplee a une detection par fluorescence a ete developpee sur puce en verre. Celle-ci a permis de separer un melange de phosphopeptides modeles fluorescents possedant differents sites et degres de phosphorylation. Les phosphopeptides ont ete detectes en moins de 2 min avec une excellente resolution (R>3) et une bonne efficacite (plateaux theoriques compris entre 11000 et 25000). Enfin, le couplage en ligne du module de preconcentration monolithique et de separation/detection a ete realise. Sur ce dispositif miniaturise, une preconcentration basee sur l’IMAC-Zr4+ a ainsi ete developpee. L’efficacite de la capture et de l’elution des phosphopeptides a ete demontree et des facteurs de preconcentration superieurs a 340 ont ete obtenus. En conclusion, ce laboratoire sur puce ouvre des perspectives tres prometteuses dans le domaine du diagnostic de pathologies dont le processus physiopathologique implique des phosphopeptides.Mots cles : laboratoire sur puce, microsysteme, phosphopeptide, IMAC, monolithe, photopolymerisation, preconcentration, electrophorese sur puce