Unraveling functions of the Arabidopsis histone deacetylase HDA6 in RNA-mediated silencing, DNA damage response and plant development

Der reversible Prozess der posttranslationalen Histonmodifikationen ist ein wichtiger Mechanismus in der Regulation von Genexpression und Chromatinstruktur. Die Acetylierung der Histon „Tails“ wird durch die enzymatische Aktivitat der Histonacetyltransferasen (HATs) katalysiert und korreliert mit transkriptionell aktivem Chromatin. Histondeacetylasen (HDACs) wirken der Acetylierung durch HATs reversibel entgegen und balancieren so den Acetylierungsstatus des Chromatins. Deacetylierte Histone werden mit transkriptionaler Genrepression und der Aufrechterhaltung von Heterochromatin assoziiert. In Pflanzen und anderen Eukaryoten wurde eine Vielzahl von HDACs identfiziert, welche eine wichtige Rolle im Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung haben. Genetische Screens haben die RPD3-verwandte Histondeacetylase HDA6 als einziges Enzym identifiziert, welches fur den Deacetylierungschritt wahrend der RNA-dirigierten DNA Methylierung (RdDM) verantwortlich ist. Dies legt den Schluss nahe, das HDA6 spezifische Funktionen fur den Prozess der Genrepression mittels „small interfering RNAs“ (siRNAs) erworben hat. RdDM fuhrt zur de novo Methylierung von Cytosinen in allen Sequenzkontexten innerhalb der zur siRNA homologen genomischen Sequenz. Diese Methylierung fuhrt zur transkriptionellen Repression von Transgenen und endogenen Zielregionen. In einem aktuellen Modell sind die DNA Methylierung und die Histonacetylierung jeweils dem anderen vorgeschaltet, was zu einen „Feedback Loop“ fuhrt. Hier werden beide epigentischen Modifikationen als mogliche Kontrollpunkte in der Regulation von aktivem und repressivem Chromatin gesehen. Bezugnehmend auf den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA Methylierung und Histondeacetylierung wurden in dieser Arbeit die Funktion von HDA6 in der RNA-dirigierten Genrepression und die epigenetisch korrelierenden Phenotypen in der Abwesenheit von HDA6 analysiert. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von HDA6 Mutantenallelen (rts1-3, rts1-4 und rts1-5) charakterisiert, welche jeweils enzymatisch inaktive Proteine kodieren. Alle Allele, inklusive dem bereits beschriebenen rts1-1 Nullallel, zeigten keine schwerwiegenden Entwicklungsdefekte, sondern nur einen etwas retardierten Grosenphenotyp gepaart mit einer verspateten Blutezeit. Des Weiteren zeigten alle Mutanten eine drastische Reaktivierung des getesteten Transgenes sowie einiger endogenen RdDM Zielgene. Diese transkriptionelle Reaktivierung korrelierte mit der Zunahme von euchromatischer Histonacetylierung (H3K9/14ac2) sowie mit der Abnahme von repressiven Histonmethylierungen (H3K9me2, H3K27me1). Interessanterweise wurde fur keines der getesteten Allele eine Abnahme der DNA Methylierung am soloLTR und, fur 2 der 4 getesteten Allele, am transgenen NOSpro:NPTII festgestellt. Folglich scheint bei einigen Zielgenen DNA Methylierung von transkriptioneller Repression und von Histondeacetylierung unabhangig zu sein. Die beobachteten Phenotypen (transkriptionelle Reaktivierung, induzierte Histonacetylierung und reduzierte Histon K9 und K27 Di- bzw. Monomethylierung) konnten mittels Uberexpression eines funktionalen HDA6 Alleles komplementiert werden. Daraus folgt, dass alle beobachteten Effekte auf einer Defizienz von HDA6 beruhen und dass HDA6 entweder nach der DNA Methylierung oder in einem parallelen Mechanismus agiert. Des Weiteren wurde der additive Effekt von artifiziell induzierter DNA Demethylierung auf die Reaktivierung von Zielgenen getestet. Es konnte eine bedeutsame Erhohung der Trankriptionslevel gezeigt werden. Erstaunlicherweise wurde jedoch keine signifikante Veranderung des DNA Methylierungstatus beobachtet. In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Lysinacetylierung von Proteinkomplexen eine wichtige Rolle in verschieden zellularen Prozessen hat, wie z.B. im Reparaturprozess von DNA Defekten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass alle HDA6 Mutantenallele sensitiv auf Zebularin, einer Substanz die neben DNA Demethylierung auch DNA Defekte auslost, reagieren. Daher wurde auch die Sensitivitat des rts1-1 Nullallels auf weitere Substanzen, welche einen DNA Defekt induzieren, getestet. Tatsachlich konnte eine erhohte Hypersensitivitat gegenuber genotoxischem Stress beobachtet werden. Die Uberexpression eines funktionalen HDA6 Alleles konnte diese Hypersensitivitat allerdings komplementieren. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass HDA6 eine Doppelfunktion als „Wachter“ von sowohl epigenetischer Information und der Genomstabilitat hat. Zusatzlich wurde der globale Effekt von HDA6 auf das Arabidopsis Transkriptom mittels Affymetrix ATH1 Microarrays getestet. Hier konnte gezeigt werden, dass HDA6 sowohl als transkriptioneller Aktivator wie auch als Repressor fungiert, da sowohl induzierte als auch unterdruckte Gene identifiziert wurden. Auch konnte gezeigt werden, dass HDA6 neben der Rolle als genereller transkriptioneller Regulator moglicherweise in weitere diverse Prozesse involviert ist, wie z.B. in der Antwort auf abiotische und biotische Stresse.