Regulación transcripcional del receptor P2X7 en células neuronales

Los receptores purinergicos P2X7 estan implicados tanto en procesos fisiologicos como es el crecimiento y ramificacion axonal o neuroproteccion. Pero ademas esta implicado en procesos patologicos como epilepsia, Huntington o Alzheimer. Sin embargo se conoce muy poco sobre su regulacion transcripcional. En esta tesis se describe por primera vez la implicacion del factor de transcripcion Sp1 en la regulacion de la expresion del receptor P2X7. Para ello se ha delimitado una region minima en el promotor del gen P2rx7 de raton que contiene cuatro sitios SP1, dos de ellos conservados en mamiferos. La funcionalidad de estos sitios SP1 se confirmo por mutagenesis dirigida y sobreexpresion e interferencia de Sp1 en celulas de neuroblastoma de raton Neuro2a. Ademas, el tratamiento farmacologico con mitramicina A, redujo los niveles endogenos de expresion del receptor en cultivos primarios de neuronas y astrocitos de corteza de raton. El uso del raton transgenico P2xr7-EGFP que expresa la proteina verde fluorescente bajo el promotor de P2xr7 nos permitio observar una elevada correlacion entre celulas que expresaban Sp1 y GFP en el cerebro, demostrando que Sp1 es un elemento clave en la regulacion transcripcional del receptor P2X7 en el sistema nervioso. Trabajos previos indicaban que la ausencia de suero puede activar el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) al alterarse la estructura de la bicapa lipidica. La inhibicion farmacologica del EGFR nos permitio identificar su implicacion en la regulacion de la transcripcion del receptor P2X7. Ademas, la activacion del EGFR inicia una cascada de senalizacion a traves de PI3K y Akt capaz de potenciar la actividad de Sp1, facilitando su entrada a nucleo y favoreciendo la transcripcion de P2rx7. Por otra parte, la retirada de suero provoca la activacion de PKCζ, una PKC atipica que parece estar regulando negativamente la expresion de P2X7. P2X7 receptors are involved not only in physiological as axonal branching and neuroprotection but also in pathological brain processes such as epilepsy, Alzheimer disease or Huntington. However little is known about its transcriptional regulation. In my PhD studies we reported the first molecular and functional evidence that Specificity protein 1 (Sp1) transcription factor plays a pivotal role in the transcriptional regulation of P2X7 receptor. We delimited a minimal region in the murine P2rx7 promoter containing four SP1 sites, two of them being highly conserved in mammals. The functionality of these SP1 sites was confirmed by site-directed mutagenesis and Sp1 overexpression/ down-regulation in the neuroblastoma cell line Neuro2a. Inhibition of Sp1-mediated transcriptional activation by mithramycin A reduced endogenous P2X7 receptor levels in primary cultures of cortical neurons and astrocytes. Using P2rx7-EGFP transgenic mice that express enhanced green fluorescent protein under the control of P2rx7 promoter, we found a high correlation between GFP and Sp1 levels in the brain, demonstrating that Sp1 is a key element in the transcriptional regulation of P2X7 receptor in the nervous system. Previous works reported that serum starvation could activate epidermal growth factor receptor (EGFR) due to the disruption of the lipid bilayer. The pharmacological inhibition of the EGFR, showed its involvement in P2X7 transcriptional regulation. Besides, EGFR activation initiates a signaling pathway through PI3K and Akt able to enhance Sp1 activity favoring P2xr7 transcription. On the other hand, serum withdrawal evokes PKCζ activation, which seems to be negatively regulating P2X7 expression.