TRAIL-based multivalent and multifunctional fusion proteins and liposomes for therapeutic applications

Der aktuelle Stand der klinischen Forschung bietet im Bereich der pro-apoptotischen Rezeptoragonisten, welche die TRAIL-Rezeptoren (TNF-related apoptosis-inducing ligand) ansteuern, fur die Krebstherapie bisher keine zufriedenstellenden Ergebnisse. In dieser Doktorarbeit wurde ein therapeutisches Konzept entwickelt, das auf der zielgerichteten und multivalenten Prasentation von ebendiesem TRAIL basiert, und welches eine effektive Induktion des Zelltods in Krebszellen durch die Aktivierung der beiden Todesrezeptoren DR4 und DR5 vorsieht, indem die membrangebundene Form des TRAIL-Molekuls nachgeahmt wird. Folgende zielgerichtete und multivalente TRAIL-Molekule wurden hergestellt: a) als Dimer angeordnete, zielgerichtete TRAIL-Fusionsproteine durch Verwendung des Homodimerisierungs-Moduls EHD2 (Domane 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgE), b) zielgerichtete und mit TRAIL-Molekulen modifizierte Liposomen. Daruber hinaus wurde MHD2 (Domane 2 der schweren Kette des Immunglobulins IgM) als ein weiteres Homodimerisierungs-Modul genauer untersucht und als Dimer-angeordnete, zielgerichtete und multivalente TNF (Tumor Nekrose Faktor)-Fusionsproteine hergestellt. Durch Fusionierung eines einzelkettigen Antikorper-Fragments (scFv), welches entweder gegen EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR1) oder gegen HER2 (EGFR2) gerichtet ist, an den N- und/oder C-Terminus des MHD2 konnten mono- oder bi-spezifische Antikorper-MHD2-Fusionsproteine hergestellt werden. Diese wiesen einen Aviditatseffekt und eine kooperative Bindung gegenuber Tumorzellen auf. Indem man das MHD2 mit einem einzelkettigen Derivat des TNF (scTNF) modifizierte, konnte ein hexavalentes TNF-Fusionsprotein generiert werden, welches die TNF-Rezeptoren 1 und 2 zu aktivieren vermag und demnach das membrangebundene TNF-Molekul nachahmen kann. Daruber hinaus, wurde durch den scFv-vermittelten Transport des zielgerichteten und multivalenten TNF-Fusionsproteins zu EGFR-positiven Zellen seine Aktivitat der TNF-Rezeptor-Aktivierung weiter gesteigert. Durch Fusionierung eines gegen EGFR gerichteten scFv-Fragments an den N-Terminus des EHD2 und eines einzelkettigen Derivats des TRAIL-Molekuls (scTRAIL) an den C-Terminus, konnte ein zielgerichtetes Fusionsprotein hergestellt werden, welches multivalente TRAIL- und scFv-Molekule prasentiert (scFv-EHD2-scTRAIL). In vitro zeigte sich eine ausgepragte tumorzellspezifische Induktion des Zelltods fur die TRAIL-Fusionsproteine im Vergleich zu den trivalenten scTRAIL-Molekulen: Das scFv-EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein wies sogar eine 8- bis 18-mal starkere Apoptoseinduktion als das nicht-zielgerichtete EHD2-scTRAIL-Fusionsprotein auf. Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in einer ausgezeichneten antitumoralen Aktivitat im xenografen Colo205 Tumormodell bei Mausen wieder. Alternativ wurden Liposomen mit TRAIL-Molekulen modifiziert, um diese multivalent prasentieren zu konnen (LipoTRAIL, LT). Auserdem wurden die TRAIL-funktionalisierten Liposomen mit an EGFR bindenden scFv-Fragmenten ausgestattet (Immuno-LipoTRAIL, ILT), um einen zielgerichteten Transport zu EGFR-positiven Zellen zu ermoglichen. Sie banden spezifisch an EGFR-positive Zellen und induzierten so einen wirksameren Zelltod verglichen mit den LTs. Diese funktionalisierten Liposomen wiesen im Vergleich zum loslichen TRAIL-Molekul eine verlangerte Serumhalbwertszeit auf. Daruber hinaus konnte eine ausgepragte antitumorale Aktivitat der ILT im xenografen Colo205 Tumormodel bei Mausen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass durch den Einsatz von Fusionsproteinen und funktionalisierten Liposomen, die durch multivalente TRAIL-Molekule und scFv-Fragmente modifiziert wurden, die Einschrankung der PARA, welche derzeit in klinischen Studien erprobt werden, uberwindet werden konnte. The current state of the clinical studies in the field of pro-apoptotic receptor agonists (PARA) targeting the receptor of the TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) has revealed disappointing results for the treatment of cancer until now. Based on the targeted and multivalent presentation of TRAIL, the therapeutic concept of this study provides an efficient induction of apoptosis in cancer cells by activating the two death receptors DR4 and DR5, thus mimicking the activity of the membrane-bound TRAIL (mTRAIL). These targeted multivalent TRAIL molecules were generated as: i) dimeric-assembled and targeted TRAIL fusion proteins utilizing the heavy chain domain 2 of IgE (EHD2) as homodimerization module, and ii) targeted TRAIL-functionalized liposomes. Furthermore, the heavy chain domain 2 of IgM (MHD2) was also tested as homodimerization module generating dimeric-assembled and targeted multivalent tumor necrosis factor (TNF) fusion proteins. Antibody-MHD2 fusion proteins possessing mono or dual specificity were generated by fusing a single-chain fragment variable (scFv) directed against epidermal growth factor receptor (EGFR, EGFR1) or EGFR2 (HER2) to the N-terminus and/or the C-terminus of the MHD2 and showed an avidity-effect and a cooperative binding to tumor cells. By modifying the MHD2 with a single-chain derivative of the TNF (scTNF) molecule, a hexavalent TNF fusion protein was generated being able to activate TNF receptor 1 and 2, thus mimicking mTNF. Furthermore, the scFv-mediated delivery of the targeted multivalent TNF fusion protein to EGFR-positive cells further increased its potency of activating TNF receptors. Fusing a scFv fragment directed against EGFR to the N-terminus and a single-chain derivative of TRAIL (scTRAIL) to the C-terminus of the EHD2, a targeted fusion protein was generated displaying multivalent TRAIL molecules (scFv-EHD2-scTRAIL). The in vitro cell death induction of the trivalent scTRAIL molecule was exceeded by the TRAIL fusion proteins, while the scFv-EHD2-scTRAIL fusion proteins exhibited an approximately 8- to 18-fold increased induction of apoptosis compared with the non-targeted EHD2-scTRAIL fusion protein. This resulted in a superior antitumoral activity in a xenograft Colo205 model in mice. As an alternative, liposomes were functionalized with TRAIL molecules for multivalent display of TRAIL (LipoTRAIL, LT). Additionally, TRAIL-functionalized liposomes were equipped with scFv fragments directed against EGFR for a targeted delivery to EGFR-positve tumor cells (Immuno-LipoTRAIL, ILT). ILT bound specifically to EGFR-positive tumor cells and induced a more potent cell death compared with the untargeted LT. The functionalized liposomes exhibited a prolonged serum half-life compared with the soluble TRAIL molecule. Furthermore, ILT revealed a potent antitumoral response in a xenograft Colo205 model in mice. In conclusion, the results of this study demonstrate that the fusion proteins and functionalized liposomes displaying multivalent TRAIL molecules and scFv fragments might overcome the limitation of the PARA currently tested in clinical studies.