Development of model system to study NC cell hyporesponsiveness

Natural Killer (NK) cells are cytotoxic lymphocytes important in immune responses to cancer and multiple pathogens because of their ability to kill pathogen infected and tumour cells, and to regulate the function of other immune cells by the secretion of soluble factors. It has been described that chronic activation of NK cells can induce a hyporesponsive state. This situation has been described as one evasion strategy used by tumours or viruses to escape immune system surveillance. The molecular basis of the mechanisms that allows the generation and maintenance of this hyporesponsive state on NK cells are unknown, and the main objective of this thesis was to establish and in vitro system to induce hyporesponsiveness on healthy human NK cells to study the molecular basis of NK cell hyporesponsiveness. IL-2 activated human NK cells treated with ionomycin lose their ability to degranulate when cocultured with diff erent target cells, and to secrete IFN-? even after IL-12 and IL-18 sti mulation. However, they are able to degranulate when stimulated through CD16. Cytotoxic and secretory functions were restored by IL-2 stimulation. The expression of activating and inhibitory receptors was normal in ionomycin treated NK cells, however, we observed lower expression of the ? L, ? M and s2 integrins. Study of diff erent NK killing steps demonstrated that ionomycin treated NK cells are less able to form conjugates with target cells. Transcriptomic analysis of activated NK cells treated with ionomycin revealed differential expression of multiple genes; however this transcriptio onal signature was diff erent to those previously defi ned for other hyporesponsive lymphocytes. Treatment of freshly isolated NK cells from healthy donors with ionomycin induces a hyporesponsive state similar to that observed after the treatment of activated NK cells. However, these cells did not recover their ability to degranulate and produce IFN-? entirely in the presence of IL-2, and are unable to exert degranulation as effi ciently as control cells when stimulated through CD16. Ionomycin treatment has shown to be an useful tool to understand the NK cell unresponsiveness induced afterer chronic activaton. NK cells. The molecular basis of the lack of response has not been fully elucidated. However the integration of the data described in this thesis provides a conceptual framework that will be useful to understand NK cell biology and NK cell hyporesponsiveness. Las celulas ? Natural Killer? (NK), son linfocitos citotoxicos capaces de inducir la lisis de celulas tumorales o infectadas por diferentes patogenos. Tambien pueden regular la funcion de otras celulas inmunes mediante la secrecion de distintos factores solubles. Sin embargo, una acti vacion cronica de las celulas NK, puede dar lugar a un descenso de su capacidad efectora. Este fenomeno ha sido descrito como una posible estrategia usada por tumores o diferentes virus para escapar de la vigilancia mediada por el sistema inmune. Actualmente se desconocen las bases moleculares de esta perdida de actividad mantenida en las celulas NK, asi, el objetivo principal de este trabajo fue establecer un sistema experimental para poder inducir y estudiar en celulas NK humanas de donantes sanos las bases moleculares de esta perdida de funcion. El tratamiento de las celulas NK humanas activadas con IL-2 con ionomicina provoca una perdida de su capacidad de ejecutar un ataque citotoxico frente a diferentes celulas diana, y la de secretar de IFN-? incluso tras su estimulacion con las citoquinas IL-12 e IL-18. Sin embargo, si conservan capacidad de degranular cuando fueron estimuladas a traves del receptor CD16. Las funciones citotoxica y secretora pudieron ser recuperadas en estas celulas cultivandolas en presencia de IL-2. Esta perdida de funcion no fue debida a cambios en la expresion de receptores activadores o inhibidores, sin embargo, si que se observo menor expresion de las integrinas ? L, ? M y s2. El estudio detallado de los distintos pasos del ataque citotoxico, mostro que las celulas NK desensibilizadas, eran incapaces de formar conjugados con celulas diana con la misma efi ciencia que las celulas control. Analisis de la expresion genica de las celulas NK tratadas con ionomicina, permitio identifi car diferencias en la expresion de multiples genes, siendo este perfi l genico distinto a los descritos en otras celulas inmunes que han perdido su funcionalidad. El tratamiento de celulas NK recien purifi cadas de donantes sanos con ionomicina, les induce un estado de perdida de respuesta similar al observado en celulas activadas. No obstante, estas celulas no recuperan totalmente su capacidad de degranular y de secretar IFN-? en presencia de IL- 2; ni son capaces de responder a la estimulacion por CD16 de manera tan eficiente como las celulas recien aisladas control. El analisis de las celulas NK tratadas con ionomicina, muestra que esta estrategia puede ser un metodo efi caz para el estudio de la perdida de funcion descrita en las celulas NK tras su estimulacion cronica. Aunque mas experimentos seran necesarios para lograr entender completamente