Establishment of a fluorescence assay for characterization of protein-mediated vesicle fusion and acidification

Membranproteine vermitteln eine Vielzahl von essentiellen Transportprozessen uber die Lipidmembran von Zellen und Organellen und stellen wichtige Angriffspunkte fur Medikamente dar. Um die Funktion dieser Proteine in einem in vitro System untersuchen zu konnen, mussen zwei getrennte wassrige Volumina vorliegen. Porenuberspannende Lipidmembranen bestehen aus einer Anordnung von definierten Poren in einem festen Tragermaterial, welche von einer losungsmittelfreien Lipiddoppelschicht verschlossen werden und stellen somit ein potentielles Modellmembran-System fur die Beobachtung des Protein-vermittelten aktiven Transports dar. Derzeit erfolgt die Praparation von porenuberspannenden Lipidmembranen unter nicht physiologischen Bedingungen, welche aber fur den Erhalt der Funktionalitat der meisten Membranproteine essentiell sind. SNARE-Protein vermittelte Membranfusion konnte als physiologische Rekonstitutionsmethode fur andere Membranproteine in die porenuberspannenden Lipidmembranen dienen. Daher wurde in dieser Arbeit die Realisierbarkeit von Membranfusion als physiologische Rekonstitutionsmethode fur die FoF1-ATPase (ATP Synthase), stellvertretend fur andere Membranproteine, untersucht. Dazu wurde zunachst die FoF1-ATPase eines thermophilen Bakteriums rekombinant aus Escherichia coli isoliert und die Rekonstitutionseffizienz in Lipidvesikel charakterisiert. Die aus der Protonenpumpen Aktivitat resultierende Acidifikation der Vesikel Lumina wurde zunachst mit Hilfe eines membranpermeablen, pH-sensitiven Fluorophors nachgewiesen und anschliesend mittels des lipidgebundenen Fluorophors Oregon Green 488 quantifiziert (ΔpH = −0.45, pH 7.3 → pH 6.85). Nach erfolgreicher Detergenz-vermittelter Rekonstitution der FoF1-ATPase wurde ein kombinierter Fusions- und Acidifikations-Assay auf Basis des lipidgebundenen Oregon Green 488 etabliert. Zuerst lasst sich damit die Membranfusion zwischen zwei Vesikel Populationen – SNARE-ATPase-Vesikel und SNARE-Oregon Green 488-Vesikel – uber ein Dequenching des Fluorophors beobachten. Dieser Effekt resultiert aus der Verdunnung des Fluorophors durch die Fusion und ermoglichte es, die Lipidvermischungseffizienz auf 59 % zu quantifizieren. Durch eine erfolgreiche Fusion hatte die FoF1-ATPase mit dem Oregon Green 488 in Verbindung kommen sollen, um somit eine Detektion von ATPase-verursachter Acidifikation in den Fusionsprodukten zu ermoglichen. Die Acidifikation der Fusionsprodukte lies sich in keinem Experiment detektieren, jedoch konnte mit Hilfe des membran-permeablen Fluorophors eine generelle ATPase Aktivitat nach dem Fusionsprozess nachgewiesen werden. Um zu untersuchen, ob eine heterogene Proteinverteilung in den fusionierenden Vesikel Populationen, eine Ursache fur die nicht messbare ATPase Aktivitat sein konnte, wurde ein Mikroskopie basierter Single vesicle assay entwickelt. Hierfur wurde nur die FoF1-ATPase in biotinylierte, Oregon Green 488 haltige Vesikel rekonstituiert, welche mittels NeutrAvidin auf einer Glasoberflache immobilisiert wurden. Von allen immobilisierten ATPase-Vesikeln zeigten nur 5 % eine eindeutige Acidifikation (ΔpH = −0.5 bis −2.0, Durchschnitt: ΔpH ≈ −1). Eine Mittelung der pH-Werte aller einzelnen Vesikel resultierte in ΔpH = −0.47, was gut mit der durchschnittlichen Acidifikation (ΔpH = −0.45) aus den Kuvetten Messungen uberein-stimmt. Bevor also eine Proteinrekonstitution mittels Membranfusion weiterverfolgt wird, muss zunachst die direkte FOF1-ATPase Rekonstitution hinsichtlich einer homogenen Verteilung aktiven Proteins verbessert werden. Dafur stellt der etablierte single vesicle assay eine wertvolle Methode dar.