Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of the adipate precursor 2-oxoadipate

Adipat ist eine C6-Dicarbonsaure und stellt als Vorstufe fur Nylon-6,6 einen der wichtigsten Bausteine in der chemischen Industrie dar. Bisher wird Adipat durch chemische Syntheseverfahren unter Verwendung von gesundheitsschadlichen und umweltbelastenden Reagenzien hergestellt. Daher ist die biotechnologische Produktion von Adipat, basierend auf erneuerbaren Kohlenstoffquellen, von grosem Interesse. Vor diesem Hintergrund war das Hauptziel dieser Arbeit die Etablierung der Produktion der Adipatvorstufe 2 Oxoadipat mittels Metabolic Engineering in Corynebacterium glutamicum. Neben der industriellen Verwendung als Produktionsorganismus fur Aminosauren, besitzt C. glutamicum ein hohes Potential fur die Produktion von organischen Sauren wie Lactat oder Succinat. Kultivierungsexperimenten ergaben, dass weder Adipat noch 2 Oxoadipat von C. glutamicum verstoffwechselt wird. Auf die Wachstumsrate von C. glutamicum hatte die Zugabe von pH-neutralisierten Adipat- (µ = 0.43 h-1) und 2-Oxoadipat-Losungen (µ = 0.43 h 1) bis zu Konzentrationen von 50 mM keinen Einfluss. Die Zugabe von 150 mM oder 250 mM Adipat fuhrte zu einer um 37% verminderten Wachstumsrate (µ=0.29 h-1). In Gegenwart von 500 mM Adipat lag hingegen eine fast vollstandige Wachstumshemmung von C. glutamicum vor. Eine mit KOH auf pH 7 eingestellte Adipatlosung steigerte die Wachstumsrate bei Zugabe von 500 mM auf µ = 0.09 h-1. Die Zugabe von 5 mM der osmotisch wirksamen Substanz Prolin fuhrte zu einer Wachstumsrate von µ = 0.16 h-1. Diese Ergebnisse sowie DNA-Chip Experimente in Anwesenheit von 50 mM und 150 mM Adipat zeigten, dass die Wachstumshemmung teilweise durch osmotischen Stress bedingt sein kann. Des Weiteren konnte anhand der Transkriptomdaten gezeigt werden, dass als Folge der Adipat-Zugabe der Transkriptionsregulator pcaR als auch dessen Zielgene pcaIJ und pcaFDO, die im β Ketoadipat Stoffwechselweg vorkommen, stark hoch-reguliert waren. Adipat fungiert in C. glutamicum somit wahrscheinlich als Aktivatormolekul des Transkriptionsregulators PcaR. Zur Etablierung der Homocitrat-Produktion ausgehend von 2-Oxoglutarat, wurden die Gene fur die Homocitrat-Synthase (HCS) aus Saccharomyces cerevisiae (lys20) und Thermus thermophilus (ttc1550) in C. glutamicum (Plasmid-basiert und chromosomal) etabliert. Die Aktivitat der heterologen HCS wurde durch die Produktion von Homocitrat in Standard-Kultivierungsexperimenten mit 222 mM (40 g l-1¬) Glukose nachgewiesen. Dabei produzierte der Stamm C. glutamicum/pEKEx2-lys20 bis zu 2,6 mM (0,54 g l-1) und der Stamm C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20 (Stamm MS-1) bis zu 4,1 mM (0,83 g l-1) Homocitrat. Zur Steigerung der Produkttiter wurden weitere genetische Modifikationen implementiert sowie die Kultivierungsbedingungen modifiziert. Die Homocitrat-Produktion mit dem Stamm MS-1 (C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20) konnte unter fed-batch Bedingungen mit anfanglich 222 mM Glukose und zusatzlicher Zugabe von 222 mM Glukose und 204 mM Acetat am Anfang der stationaren Phase auf 27,1 mM (5,5 g l-1) gesteigert werden. Die chromosomale Integration einer Pyruvat-Carboxylase (pycP458S), bei gleichzeitiger Deletion der pta-ackA Region, sowie die Expression einer weiteren Plasmid-basierten Genkopie von lys20 (C. glutamicum MS-3-pHCS) fuhrten unter fed-batch Bedingungen zur weiteren Erhohung der Produktion auf 52,1 mM (10,6 g l-1) Homocitrat. Dies entspricht einer Ausbeute von 0,21 mol CHomocitrat/ mol CGlukose+Acetat. Zur Etablierung der 2-Oxoadipat-Produktion wurden Gene, die fur die Homoaconitase (HA) aus S. cerevisiae (lys4) und die Homoisocitrat-Dehydrogenase (HICDH) aus S. cerevisiae (lys12) kodieren in C. glutamicum Plasmid-basiert und chromosomal integriert, eingefugt. Durch die Akkumulation von bis zu 2,3 mM (0,37 g l 1) 2 Oxoadipat mit dem Stamm C. glutamicum/pEKEx2-lys20/pVWEx2-lys4-lys12 und von bis zu 3,5 mM (0,56 g l-1) mit dem Stamm C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20ΔaceA::Ptuf-lys4-lys12 (MS-5) wurde die Aktivitat der heterolog exprimierten HA und HICDH bestatigt. Weiterhin waren diese Ergebnisse ein Beleg fur die Fahigkeit von C. glutamicum Homocitrat und 2-Oxoadipat zu exportieren. Die Kultivierung des Stamms C. glutamicum/pEKEx2-ttc1550/pVWEx2-lys4-lys12 fuhrte unter Stickstofflimitierung zur Steigerung der 2 Oxoadipat-Produktion auf 9,1 mM (1,5 g l-1). Mit dem aktuell besten 2 Oxoadipat-Produzenten MS-5-pHCS, welcher sich durch eine weitere Plasmid-basierte Genkopie von lys20 von dem Stamm C. glutamicum MS-5 unterscheidet, wurde 27,1 mM (4,4 g l-1) 2 Oxoadipat produziert. Das entspricht einer Ausbeute von 0,13 mol C2 Oxoadipat/mol CGlukose+Acetat. Die hier prasentierten Ergebnisse zeigen somit zum einen das Potential von C. glutamicum zur Produktion von Homocitrat und 2-Oxoadipat und sind zum anderen die Basis fur weitere Untersuchungen zur Umsetzung von 2-Oxoadipat zu Adipat.