Investigation of protein and DNA interactions of Pax5 in B-cell lineage commitment

Der Determinierungsprozess einer Zelle zu einer bestimmten Zelllinie wird durch das Zusammenspiel von Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Regulatoren und Signal-Transduktionswegen reguliert. Der Transkriptionsfaktor Pax5 ist der B-Zell-spezifische Determinierungstionsfaktor. In seiner dualen Funktion reprimiert Pax5 die Expression von Genen anderer Zelllinien einerseits und aktiviert B-Zell-spezifische Gene andererseits. Dabei interagiert Pax5 mit Proteinkomplexen, die eine aktivierende oder reprimierende Funktion haben. In fruheren Studien konnten einige Interaktionspartner von Pax5 identifiziert werden wie z.B. TBP, eine Komponente des basalen Transkriptionsfaktors TFIID oder aber Brg1, eine Untereinheit des BAF-Chromatin Remodeliungskomplexes sowie verschiedene Groucho Corepressoren. Bisher wurden diese Interaktionsstudien in transient transfizierten Zelllinen untersucht. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin unter physiologischen Bedingungen in einem pro-B Zell System mit endogener Pax5 Expression einerseits die bisher bekannten Pax5 Interaktionspartner zu bestatigen und andererseits neue Interaktionspartner zu identifizieren. Hierzu wurde die Pax5Bio/Bio knock-in Maus verwendet, die ein Pax5 Protein mit einer Biotinylierungssequenz (Pax5-Bio) generiert, das bei Coexpression der E.coli Biotin Ligase BirA biotinyliert wird. Das biotinylierte Pax5 konnte in Streptavidin-Pulldown Experimenten erfolgreich aufgereinigt werden. Interaktionspartner wurden durch Massenspektrometrie und Western Blot Experimente analysiert. Im Zuge dessen konnte gezeigt werden,dass Pax5 in pro-B Zellen den BAF-Chromatin Remodeliungskomplex rekrutiert, sowie TFIID und Proteine mit Histon-Acetyltransferase Aktivitat (CBP). Weiterhin konnten Komponenten (PTIP, RbBP5) des Histon-Methyltransferase Komplexes MLL mit aufgereinigt werden. Der MLL Komplex fuhrt zur Methylierung von H3K4 - einer Markierung aktiven Chromatins. Der NCoR Komplex, welcher hingegen eine Histon-Deacetylase Funktion besitzt, interagierte ebenfalls mit Pax5. Zudem konnte gezeigt werden, dass dementsprechende Anderungen der Chromatinmodifikationen an Pax5 regulierten Genen nach Rekrutierung dieser Komplexe stattfinden und von diesen abhangig sind. Daher lasst sich zusammenfassen, dass Pax5 in der fruhen B-Zell Entwicklung Genexpression auf epigenetischer und transkriptioneller Ebene reguliert. Eine wichtige Eigenschaft von B-Zellen ist die Produktion eines vielfaltigen Antigenrezeptor Repertoires, das das Uberleben von Saugetieren in einer Pathogen-reichen Umwelt ermoglicht. Diese Vielfalt wird durch den Prozess der sog. V(D)J Rekombination erreicht. Dabei werden diskontinuierliche variable (V), diversity (D) und joining (J) Segmente der Immunoglobulin (Ig) Gene wahrend der B-Zell Entwicklung rearrangiert. Um eine gleichmasige Reprasentation aller Gensegmente zu gewahrleisten, kontrahiert der Immunoglobulinschwerekette (Igh) Gen Locus im pro-B Zell Stadium. Dadurch werden die 3Mb voneinander entfernte VH Gene und DH Segmente nah zusammen gebracht. Diese Kontraktion ist abhangig von Pax5. PAIR Elemente der distalen VH Regionen des Igh Lokus enthalten Pax5- CTCF- sowie E2A Bindestellen und zeigen eine Pax5 abhangige Expression von antisense Transkripten wahrend des pro-B Zellstadiums. Es ist bekannt, dass CTCF wahrend bestimmter Entwicklungsstadien zusammen mit anderen spezifischen Transkriptionsfaktoren zum Schleifenbildung komplexer Regionen im Genom fuhren kann. Daher sollte untersucht werden, ob PAIR Elemente die Kontraktion des Igh Lokus regulieren. Diese Hypothese konnte durch die circular chromosom conformation capture (4C) Methode in Kombination mit deep sequencing bestatigt werden. Obgleich 2.5 Mb voneinander entfernt, interagieren PAIR Elemente mit Enhancern am 3’-Ende des Igh Lokus. Diese Interaktion konnte nur in Pax5 expremierenden pro-B Zellen festgestellt werden. Dieser Ansatz tragt einen weiteren Teil zu dem Verstandnis des Mechanismus bei, wie Pax5 die Kontraktion des Igh Lokus und sowie die V(D)J Rekombination reguliert