Dynamique de la chromatine et la régulation du changement du type sexuel chez la levure

La recombinaison homologue (RH) est un mecanisme de reparation des cassures d'ADN double brin (CDB) essentiel pour le maintien de l'integrite du genome. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'etude du "changement de type sexuel", comme modele de recombinaison, a contribue a la comprehension des notions fondamentales de cette voie de reparation. Le changement de type sexuel implique la conversion allelique du locus MAT d'une forme "MATa" a "MATα". Ce mecanisme est initie par l'apparition d'une CDB unique induite par l'endonuclease HO au niveau du locus MAT. Les sequences homologues HMLα et HMRa, presentes sur le chromosome III, sont utilisees comme donneur lors de la reparation. L'alternance du type sexuel s'explique par le choix recurant du donneur de type sexuel oppose, assurant le changement allelique du locus MAT a chaque generation cellulaire. L'etude du choix du donneur a conduit a l'identification d'une sequence appelee le "recombination enhancer" (RE), situee proche du locus HMLα sur le bras gauche du chromosome III. Dans les cellules MATa, le RE "active" permettrait la formation d'une boucle entre la region RE et le locus MAT favorisant la recombinaison avec la sequence HMLα proche. Cependant, la formation de cette boucle sur le chromosome III et les facteurs impliques sont encore mal caracterises. Au cours de mes travaux de these, j'ai etudie l'organisation du chromosome III selon le type sexuel de la levure S. cerevisiae avant l'induction de l'endonuclease HO et des evenements de RH. Mon hypothese de travail suggere que le RE jouerait un role sur l'organisation du chromosome III avant l'apparition de la CDB par HO, contribuant a l'augmentation de l'efficacite du choix du donneur lors du changement de type sexuel. Ainsi, j'ai pu mettre en evidence deux roles distincts pour la partie gauche et droite du RE. La partie gauche du RE est impliquee dans le choix du donneur lors des evenements de RH, mais presente un effet modere sur le repliement du chromosome III lors de sa suppression. La partie droite du RE semble indispensable pour l'organisation du chromosome III dans les deux types sexuels MATa et MATα. Ces resultats suggerent que la modulation de l'organisation d'un chromosome via une sequence "enhancer" pourrait contribuer au choix du donneur lors de la RH. Dans un second temps, mes travaux de these se sont diriges vers la comprehension des evenements de reparation d'une CDB. J'ai utilise l'avantage du modele de changement de type sexuel permettant d'induire une CDB unique dans le genome via l'endonuclease HO. Ainsi, cette approche m'a permis de mettre en place une etude visant a identifier les facteurs recrutes au niveau du site de reparation afin de mieux comprendre la dynamique des evenements impliques dans la RH. En effet, la regulation precise de l'activite ainsi que l'adressage de facteurs cles de reparation au niveau de la cassure n'ont toujours pas ete clairement caracterises. Les principaux enjeux actuels demeurent dans l'identification de tous les acteurs presents au niveau d'un site de cassure unique a un instant donne. Dans ce contexte, j'ai etudie la dynamique de reparation d'une CDB en realisant une co-immunoprecipitation des facteurs de reparation avec l'aide du systeme ANCHOR-FLAG insere, proche du site de cassure MAT. Une cinetique de co-immunoprecipitation lors de l'induction de la CDB m'a permis d'etudier l'arrivee sequentielle des proteines impliquees dans la reparation. L'analyse des echantillons par spectrometrie de masse (MS) revele plus d'une vingtaine de proteines impliquees dans la reparation. Ces resultats preliminaires sont tres encourageants. Le developpement de cette approche permettra de mieux caracteriser la dynamique des evenements de reparation de l'ADN par RH. Le systeme ChIP-MS, via ANCHOR, permet pour la premiere fois une analyse du proteome sur un site unique de cassure.