Understanding human mitotic protein complex organisation and phospho-regulation using a combined proteomics and chemical biology approach

Wahrend der mitotischen Phase des Zellzyklus’ verteilen Zellen ihre Chromsomen auf die zwei neu entstehenden Zellen. Dieser Prozess ist begleitet von immensen morphologischen Veranderungen wie zum Beispiel dem Abbau der Kernhulle, der Verdichtung der Chromosomen, dem Aufbau der mitotischen Spindel, der Chromosomenaufteilung und schlieslich der Zytokinese. Die biochemischen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen und diese regulieren sind bisher erst wenig verstanden. Einige Proteinkomplexe wurden als die wichtigsten Regulatoren der Mitose identifiziert. Die Aktivitat der Cyclin-dependent Kinase 1 im Komplex mit Cyclin B 1 (CDK1/CCNB1) ist essentiell fur den Eintritt in die Mitose und fruhe mitotische Vorgange, wahrend der Anaphase-promoting Complex (APC/C) die Anaphase und das Ende der Mitose einleitet. Einige andere mitotische Proteinkomplexe wurden identifiziert, doch fur die meisten Proteine, die wichtig fur den Verlauf der Mitose sind, sind nur wenige oder gar keine Interaktionspartner bekannt. Um die biochemischen Mechanismen der Mitose besser zu verstehen, ist es notig, ein umfassenderes Bild der Proteinkomplexe, die fur die Regulation der Mitose wichtig sind, zu bekommen. Die kurzlich etablierte BAC TransgeneOmics pipeline ermoglichte die Herstellung einer grosen Anzahl von menschlichen Zellen, die „localisation and affinity purification“ (LAP) getaggte Mausgene von ihrem endogenen Promoter exprimieren. Aus diesen Zellen konnten wir erfolgreich 175 mitotische Proteine aufreinigen und 787 spezifisch-interagierende Proteine mittels Massenspektrometrie identifizieren. Die weitere Analyse dieser Daten mit Hilfe bioinformatischer Methoden ergab 130 potentielle Proteinkomplexe, von denen bis dahin 71 unbekannt waren. Eine weitergehende Untersuchung einiger dieser Komplexe bestatigte einen neuen Komplex, der moglicherweise bei der Funktion des Zentrosoms eine Rolle spielt, sowie zwei neue Interaktionspartner des gamma-tubulin ring complex (gamma-TuRC) und eine neue APC/C Untereinheit. Unsere Ergebnisse sind der erste Schritt, um die Organisation der mitotischen Proteinkomplexe grundlicher zu verstehen. Weitergehende Untersuchungen dieser identifizierten Proteinkomplexe werden unser Verstandnis der molekularen Basis der mitotischen Regulation weiter voranbringen. Einige der wichtigsten Regulatoren, die den Eintritt und den Verlauf der Mitose kontrollieren sind mitotische Proteinkinasen. Die Phosphorylierung einer unbekannten Anzahl von Substraten wirkt wahrscheinlich wie ein Schalter, der die Aktivitat, Stabilitat und Lokalisierung dieser Substrate verandert. Dies lost die drastischen morphologischen Veranderungen aus, die notig sind, damit Zellen zuverlassig durch die Mitose gehen und die mitotische Teilung vollziehen. CDK1/CCNB1 war das erste Mitglied der Familie der mitotischen Kinasen von der einige weitere identifiziert worden sind. Die Polo-like kinase 1 (PLK1) ist essentiell fur die Mitose und ist an der Regulation vieler mitotischer Ereignisse beteiligt. Der Kontakt von PLK1 mit Substraten wird wahrscheinlich durch die Substratphosphorylierung von CDK1, aber vielleicht auch von PLK1 selbst kontrolliert. Aurora kinase B (AURKB) ist eine weitere essentielle mitotische Kinase, die, abgesehen von anderen Funktionen, essentiell fur den „spindle assembly checkpoint“ ist, indem sie inkorrekte Mikrotubuli-Kinetochore Verbindungen korrigiert. PLK1 und AURKB sind nur in der Mitose aktiv und ihre Lokalisierung ist streng reguliert. Das lasst vermuten, dass PLK1 und AURKB Substrate nur zu einer bestimmten Zeit und an einem bestimmten Ort phosphoryliert werden durfen um ihre Funktion zu erfullen. Versuche zum Detektieren von Kinase Substraten sind bisher allerdings meist in vitro durchgefuhrt worden, also in der Abwesenheit jeglicher zellularer Kontrollmechanismen. Wir haben deshalb eine Zell-basierte Methode entwickelt, um neue PLK1 und AURKB Substrate zu finden. Mit Inhibitoren aus kleinen Molekulen gegen PLK1 und AURKB in Kombination mit LAP-Aufreinigung und Massenspektrometrie konnten wir Kinase-abhangige Phosphorylierungsstellen auf 16 potentiellen Substratkomplexen detektieren. Insgesamt haben wir 470 Phosphorylierungsstellen gefunden, von denen 41 PLK1- und 20 AURKB-abhangig waren. Wir haben einen Teil dieser Phosphorylierungsstellen mit Phospho-spezifischen Antikorpern validiert und 17 neue potentielle PLK1 Substrate sowie 18 neue potentielle AURKB Substrate gefunden.