A Cluster of Antimony Resistance Genes on Chromosome 34 of Leishmania infantum and Their Properties

Funfwertige Antimonverbindungen sind die erste Wahl fur die Behandlung von Leishmaniasen. In den letzten Jahrzehnten haben Antimon-resistente Infektionen stark zugenommen, besonders in den Hochendemie-Gebieten Nord-Indiens. Antimon-Resistenz ist ein multifaktorielles Phanomen und nicht vollstandig aufgeklart. Wie hohere Eukaryota besitzen Leishmania spp hochkonservierte Multi Drug-Resistenzgene, die Resistenzen gegen vielfaltige Wirkstoffe verleihen. Leishmania spp besitzen jedoch auch spezifische Resistenzmarker-Gene. Durch Komplementations-genetische Untersuchungen konnten die Gene fur P299 und ARM58 identifiziert werden. ARM58 wurde urspunglich in L. braziliensis identifiziert (Nuhs et al., 2014) und in L. infantum weiter charakterisiert (Schafer et al., 2014). Das L. infantum ARM58-Gen liegt nahe dem Telomer-Ende des Chromosoms 34 und wird von den Genen ARM58rel und HSP23 flankiert. Uberexpression jedes dieser Gene von episomalen Transgenen erhoht in infizierten Makrophagen die Resistenz der Erreger gegen Antimon-Behandlung. Daher wurde ARM58rel in ARM56 umbenannt. Bei Uberexpression landen ARM58- und ARM56-Proteine in der Exosomen-Fraktion, einem wichtigen Teil des Parasiten-Sekretoms. Dies suggeriert, dass eine Bindung von Antimon an diese Proteine, gefolgt von Sekretion, als Entgiftungsmechanismus dient. Trotz einer vermuteten Transmembrandomane ist ARM58 ein loslichens, zytoplasmatisches Protein und zeigt keine stabile Bindung an Lipidmembranen. ARM58 findet sich in der Geisel und nahe der Geiseltasche, wahrend ARM56 zytoplasmatisch lokalisiert. Unter Verwendung eines Cos-Seq-Ansatzes, der Komplementationsgenetik mit Next Generation Sequencing verbindet, konnte fur das ARM58/ARM56/HSP23-Gen-cluster eine spezische Selektion unter Antimon und weniger unter Kupfer, aber nicht unter Arsen-, Cadmium- oder Miltefosine-Exposition gezeigt werden. Diese Selektion war auch in intrazellularen Parasiten unter Antimon-Behandlung (SbV) sichtbar, wenn auch weniger ausgepragt. Die Experimente zeigen die Spezifitat des Drei-Gen-clusters fur Antimon- Resistenz. Pentavalent antimony is the first-line drug used in the treatment of Leishmaniasis. Antimony resistance has increased in the last decades, especially in the highly endemic areas of Northern India. Antimony resistance is a multifactorial phenomenon and it is not completely elucidated. Leishmania spp, like the higher eukaryotes, possess highly conserved Multi-Drug Resistance genes that confer broad resistance to many drugs. However, Leishmania also possess specific resistance marker genes. Functional cloning has been used to look for genes involved in resistance. P299 and ARM58 were described using this approach (Choudhury et al., 2008). ARM58 was first identified in L. braziliensis (Nuhs et al., 2014) and further analysis regarding the domain structure were done in L. infantum (Schafer et al., 2014). The L. infantum ARM58 gene is flanked by ARM58rel and HSP23 genes and is located near the telomeric end of chromosome 34. L. donovani over expressing HSP23 and ARM58rel transgenes gain antimony resistance in infected macrophages; consequently ARM58rel was renamed as ARM56. Upon over expression ARM58 and ARM56 are redirected into the exosomal fraction and secreted, suggesting that sequestration of antimony followed by secretion may lead to antimony detoxification. ARM58 is a soluble protein in the cytoplasmic fraction of promastigotes after lysis, with no stable membrane interaction in spite of the putative transmembrane domain in the third domain. ARM58 localises in the flagellum and flagellar pocket in L. donovani promastigotes; while ARM56 is cytosolic. Using the Cos-seq approach, that combines functional cloning and Next Generation Sequencing, the gene cluster was selected specifically under SbIII challenge, only weakly under Cu2+ pressure, but not under AsIII, Cd2+ or miltefosine exposure. The selection was less pronounced when intracellular amastigotes were selected under sodium stibogluconate (SbV), but still detectable. The data presented show the specificity of the three-gene cluster for antimony resistance.