Epidemiología y caracterización molecular de los mecanismos de resistencia a diversos agentes antimicrobianos en aislamientos clínicos de "Salmonella" spp.

INTRODUCCION: Tanto en paises desarrollados como en vias de desarrollo las Salmonellas son responsables de un alto nivel de morbilidad y mortalidad. Este problema es especialmente relevante en areas en vias de desarrollo donde la carencia de fuentes economicas no permite disponer de un amplio potencial antibacteriano. Ademas, en algunas de estas areas tanto la situacion social como la presencia de otras enfermedades favorecen la infeccion por estos microorganismos. El genero Salmonella esta compuesto por 2501 serotipos con diferentes caracteristicas fenotipicas y genotipicas y aunque usualmente produce una infeccion autolimitada, la duracion o la severidad de los sintomas pueden requerir tratamiento antibiotico. Las especies de Salmonella disponen de altos niveles de resistencia natural a los agentes antimicrobianos mas usados, sin embargo la aparicion de cepas de Salmonella mostrando resistencia a uno o mas agentes antibacterianos ha aumentado considerablemente probablemente debido a la continua presion antibiotica, lo cual constituye un importante problema para la salud publica. La resistencia a algunos antibioticos, tales como β-lactamicos, tetraciclina, cloranfenicol, o trimetoprim-sulfametoxazol esta siendo reportada con alta frecuencia. Ademas se ha descrito el desarrollo de resistencia a quinolonas. Una eficiente ruta de adquisicion de esta resistencia es a traves de elementos geneticos tales como, plamidos, transposones e integrones. El principal objetivo de este estudio fue analizar la evolucion de la resistencia en aislamientos de Salmonella de origen clinico, caracterizar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos y analizar el potencial de diseminacion de clones resistentes. MATERIALES Y METODOS: En este estudio se analizaron cepas (n=62) aisladas de muestras de heces procedentes de viajeros que padecian diarrea del viajero y cepas (n=34) aisladas de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis aguda de diferentes regiones de Cuba. El estudio se llevo a cabo en el Laboratorio de Microbiologia Clinica del Hospital Clinic de Barcelona. Los patogenos diarreagenicos encontrados fueron identificados por metodos convencionales. El serotipo se determino utilizando antisueros somaticos y flagelares. La fase flagelar fue determinada por el metodo de inversion de fase descrito por Kauffman y White y siguiendo las recomendaciones de Edward y Ewing. Tambien se identificaron los fagotipos de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar y Virchow. Se determino la susceptibilidad antimicrobiana por el metodo de Kirby-Bauer a diferentes agentes antimicrobianos: ampicilina, amoxicilina-acido clavulanico, acido nalidixico, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, gentamicina, amikacina, espectinomicina, imipenem, norfloxacino, ciprofloxacino y ceftazidima. La interpretacion de los resultados se llevo a cabo segun las normas del CLSI. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se utilizaron como cepas controles. Para determinar los mecanismos moleculares de resistencia a quinolonas se detectaron las mutaciones en los genes gyrA y parC mediante la tecnica de PCR con iniciadores especificos. La presencia de los genes cmlA y floR asociados con la resistencia a cloranfenicol se determino por PCR. La actividad cloranfenicol acetiltransferasa se determino mediante un ensayo colorimetrico. La deteccion de los genes que codifican para beta-lactamasas (tipo tem, carb, shv, y oxa) asi como la determinacion de los mecanismos de resistencia a tetraciclina relacionados con la presencia de los genes tetA, tetB y tetG tambien fue determinada por PCR. Para determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol la presencia de dihidrofolato reductasas fue determinada con primers genericos y analisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccion. La deteccion de integrones Clase 1 tambien se determino utilizando primes especificos ya descritos. Los productos de las diferentes PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%. El producto de la PCR visualizado en el gel fue secuenciado y analizado en un secuenciador automatico usando el kit de secuenciacion Big Dye3.1. La clonalidad de los aislamientos se determino mediante analisis del ADN cromosomico digerido con XbaI y separacion en electroforesis en campo pulsante. RESULTADOS: Los serotipos mas frecuentes fueron Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. La mayoria de las cepas mostraron resistencia al menos a uno de los agentes antimicrobianos utilizados, encontrandose un alto porcentaje de multirresistencia. Los antibioticos frente a los cuales se observo mayor resistencia fueron: tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, acido nalidixico y trimetoprim-sulfametoxazol. Una simple sustitucion de aminoacidos en las posiciones 83 y 87 del gen gyrA ha sido descrita con anterioridad como causa de resistencia frente al acido nalidixico, mientras que sustituciones en ambas posiciones mas sustituciones en el gen parC confieren elevada resistencia a fluoroquinolonas. En nuestro estudio se encontro resistencia al acido nalidixico y sensibilidad disminuida a ciprofloxacino y norfloxacino. Destacandose como principal causa de esta resistencia mutaciones en el gen gyrA. No se encontraron mutaciones en el gen parC. Ocho aislamientos mostraron resistencia a ampicilina provocada por la presencia de beta-lactamasas tipo CARB, TEM y OXA. Es algunas cepas productoras de beta-lactamasas tipo TEM tambien se encontraron niveles intermedios de sensibilidad a amoxicilina-acido clavulanico. Esta demostrado que la sobreexpresion de estas enzimas provoca sensibilidad disminuida o resistencia frente a este antibiotico. El principal mecanismo de resistencia involucrado en la resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol fue la presencia de dihidrofolato reductasas presentes en cuatro aislamientos, especificamente dfrA1, dfrA12, dfrA14 y dfrA17. La resistencia al cloranfenicol estuvo determinada por la presencia de los genes cmlA, floR y la actividad cloranfenicol acetil transferasa (CAT). De los aislamientos resistentes a tetraciclina, el gen tetA fue el principal responsable de la resistencia. Los genes de resistencia localizados en integrones fueron asociados con resistencia a aminoglucosidos, beta-lactamasas, trimetoprim y cloranfenicol. El campo pulsante revelo la existencia y diseminacion de un clon resistente de Salmonella typhimurium en diferentes regiones de Cuba. CONCLUSIONES: Nuestros resultados muestran niveles importantes de resistencia en cepas de Salmonella, principalmente frente al acido nalidixico, ademas de una gran heterogeneidad de mecanismos moleculares de resistencia frente a antibioticos de primera linea. A nuestro parecer con nuestro estudio contribuimos a mantener la vigilancia de esos microorganismos y asi tener informacion de los niveles de resistencia para mejorar el tratamiento y desarrollar estrategias en la prevencion de la diseminacion de la resistencia.