Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum Nachweis des Krebspesterregers Aphanomyces astaci SCHIKORA in nordamerikanischen Flusskrebsen (Pacifastacus leniusculus; Orconectes limosus; Procambarus clarkii)

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war den Krebspesterreger Aphanomyces astaci, in den drei nordamerikanischen Flusskrebsarten Signalkrebs (Pacifastacus leniusculus), Kamberkrebs (Orconectes limosus) und Roter Amerikanischer Sumpfkrebs (Procambarus clarkii) nachzuweisen. Diese Flusskrebsarten sind zwar gegen die Krebspest resistent, konnen aber als latent infizierte Tiere Ausscheider des Erregers sein und somit die fur die Krebspest empfanglichen Edelkrebse (Astacus astacus) infizieren. Bei dieser in Europa heimischen Art geht die Erkrankung mit 100 % iger Mortalitat einher. Daher ist die Bestimmung des Trager-Status der nordamerikanischen Krebse von groser Bedeutung um eine weitere Verbreitung dieser hochinfektiosen Erkrankung in europaischen Gewassern zu verhindern. Im Vergleich zu den Edelkrebsen konnten bereits bei der makroskopischen und post sectionem bei der mikroskopischen Betrachtung der nordamerikanischen Flusskrebse Unterschiede festgestellt werden. Die letztgenannten weisen im Bereich der weichen Abdominalkutikula sowie an den dunnen Gelenkhauten der Schreitbeine haufig Melanisierungen auf. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung kann eine Wachstumshemmung der Pilzhyphen durch Melanineinlagerungen beobachtet werden. Unmittelbar nach der Invasion des Pilzes wird das Immunsystem aktiviert und verhindert normalerweise einen Krankheitsausbruch. Lediglich bei Einfluss von Stressoren kommt es zur Immunsuppression nordamerikanischer Krebse und daraufhin nach dem Auftreten der fur die Krebspest typischen Symptome haufig zum Tod. Um mittels PCR Aphanomyces astaci in den nordamerikanischen Krebsen nachzuweisen musste zunachst die Pilz-DNA extrahiert werden. Dazu wurde das DNeasy® Tissue-Kit (Qiagen) verwendet. Es wurden unterschiedliche Flusskrebsgewebe zur DNA-Extraktion eingesetzt um die am besten geeignete Stelle zu finden. Die bereits bei Edelkrebsen verwendete weiche Abdominalkutikula erwies sich auch bei den nordamerikanischen Krebsen als auserst zweckmasig. Des weiteren konnte bei DNA-Extraktionen aus den Beinansatzen, dem dorsalen Abdomen und dem Telson der Erreger in der nachfolgenden PCR nachgewiesen werden. Da die nordamerikanischen Flusskrebse aufgrund ihres angepassten Immunsystems haufig nur sehr geringe Mengen an Pilz-DNA aufweisen, stellt der Nachweis hier ein Problem dar. Bei nur 50 mg eingesetzter Kutikula, laut Insekten-Protokoll des Tissue Kits, ist unsicher ob gerade in diesem kleinen Gewebestuck Pilz-DNA vorhanden ist. Daher wurden auch Zusammenfassung ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 132 Extraktionsversuche vorgenommen bei denen ein kompletter Krebspanzer eines Kamberkrebses (3000 mg) zur DNA-Isolierung eingesetzt wurde. Die benotigte Lysis-Puffermenge wurde dementsprechend erhoht und die Inkubationszeit wurde verlangert. Das Ergebnis der PCR war bei diesem Krebs positiv. Trotzdem wurde beim Grosteil der Kamberkrebse nur die weiche Kutikula in die DNA-Extraktion eingesetzt. Hierfur wurden Kutikula-Segmente ausgewahlt, die bereits im Lichtmikroskop Melanisierungen oder sogar Pilzhyphen aufwiesen. Bei zahlreichen Krebsen war das Ergebnis der nachfolgenden PCR ebenfalls positiv. Zusammenfassend wird somit deutlich, dass der molekularbiologische Nachweis des Krebspesterreger Aphanomyces astaci auch bei nordamerikanischen Flusskrebsen moglich ist. Sowohl die DNA-Extraktion als auch die PCR, mit teilweise neu entwickelten Primern, konnen zur Feststellung des „Carrier-Status“ eines nordamerikanischen Krebses dienen.