Avaliação neuroquímica do sistema colinérgico de camundongos com o gene do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) modificado geneticamente

O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) e responsavel por armazenar acetilcolina em vesiculas sinapticas, passo importante para a manutencao da transmissao colinergica. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutencao do tonus colinergico, geramos diferentes linhagens de animais em que esse gene foi alterado atraves de recombinacao homologa. Uma estrategia para interferir com a expressao do gene do VAChT foi a insercao de um cassete contendo o gene de resistencia a neomicina na regiao 5 nao traduzida do VAChT. Esta modificacao genetica gerou camundongos com diminuicao HET HOM e KD da expressao do VAChT (VAChT Knockdown). Os animais KD apresentam reducao de aproximadamente 45 e 65% da expressao de VAChT, respectivamente. Observamos acumulo de acetilcolina nao liberada no cerebro dos camundongos KD e isso nao parece ser devido a alteracoes de expressao da choline acetyltransferase ou do transportador de alta afinidade de colina. Ensaios de eletrofisiologia na juncao neuromuscular mostraram que existe uma diminuicao no HET HOM tamanho do quanta nos camundongos KD e KD sendo a diminuicao maior nos HOM HETcamundongos KD que nos KD . Nos tambem produzimos camundongos em que o gene do VAChT foi Flox/Floxflanqueado por sequencias LoxP (camundongos VAChT ) a fim de utiliza-los para o acasalamento com camundongos que expressam a enzima Cre em diferentes regioes do cerebro. Os camundongos gerados, portanto, poderiam apresentar delecao do gene do VAChT em tecidos espeficos. Nossa caracterizacao inicial dos camundongos Flox/Flox VAChT mostrou que eles apresentam reducao em torno de 50% na expressao do mRNA de VAChT, alem de um aumento em torno de 100% na expressao do mRNA da enzima ChAT e um aumento de 6 vezes nos niveis de acetilcolina no cerebro quando WT/WT comparados com os animais VAChT . A amplitude dos potencias miniatura Flox/Flox (MEEPs) de placa motora esta aumentada nos camundongos VAChT , sem Flox/Flox alteracoes na frequencia. Apesar dessas alteracoes, os camundongos VAChT sao fenotipicamente normais. Flox/WT Flox/Flox Camundongos VAChT ou VAChT foram acasalados com camundongos que expressam Cre sob o controle do promotor CAMKII. Os Flox/Flox, cre+ camundongos VAChT gerados sao morfologicamente normais ao nascimento, entretanto, apos cinco dias de vida tornam-se menos ativos e exibem menor crescimento que os animais controle da mesma ninhada. Alem disso, os camundongos Flox/Flox VAChT apresentam fraqueza muscular generalizada, desenvolvimento anormal da coluna espinhal acarretando em cifose e sobrevivem apenas cerca de 8 semanas. Nos tambem geramos uma linhagem de camundongos com a delecao de um dos alelos do Flox/Del, cre+ VAChT. Os camundongos VAChT, apresentaram os mesmos fenotipos dos Flox/Flox, cre+, Flox/Del, cre+ camundongos VAChT porem os camundongos VAChT sobrevivem apenas cerca de 20 dias. Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- Surpreendentemente, os animais VAChT e VAChT embora nao expressem a Cre, apresentam ausencia de VAChT em diversas regioes do SNC. Alem disso, os niveis teciduais de acetilcolina tambem estao aumentados em torno de Flox/Del, cre-. doze vezes nos camundongos VAChT Interessantemente, nenhum dos estudos comportamentais e eletrofisiologicos realizados sugerem que o VAChT esteja alterado, ja que os animais sao fenotipicamente normais. Como os camundongos Flox/Flox,cre- Flox/Del, cre- VAChT e VAChT apresentam mRNA para o VAChT, e possivel que exista um mecanismo regulatorio da expressao do transportador ainda desconhecido. Nossos resultados confirmam a importância de VAChT na regulacao da liberacao de acetilcolina e, consequentemente, na manutencao das funcoes fisiologicas normais do sistema nervoso central e periferico.