Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish

Der Zebrabarbling hat sich in den letzten Jahrzehnten als ein beliebter und vielversprechender Modellorganismus herausgestellt. Mit seiner Hilfe werden zunehmend die grundlegenden biologischen Funktionsweisen von Wirbeltieren untersucht und anhand der Erkenntnisse neue Therapien und Medikamente fur Krankheiten entwickelt. Zusatzlich hat sich die Verhaltensforschung als Gebiet mit hohem Potential fur neue Entdeckungen entpuppt, da es hier moglich ist, deutlich feinere Unterscheidungen und Effekte nachzuvollziehen als es bei stark abgegrenzten Endpunkten wie Verformungen oder Toxizitat der Fall ist. Im fruhen Stadium bis funf Tage nach Befruchtung zeigen die Embryonen und Larven des Zebrabarblings einige charakteristische Verhaltensweisen, die durch kunstliche Stimulation hervorgerufen werden konnen. Noch in der Eischale bei einem Alter von nur 30 bis 42 Stunden nach der Befruchtung reagieren die Embryonen auf einen Lichtblitz mit erhohter Bewegung, der sogenannten Photomotor Response. Bei wiederholtem Belichten bleibt diese Reaktion aus, was als ein typisches Verhaltensmuster interpretiert werden kann. Werden die Embryonen jedoch Chemikalien oder Mutationen ausgesetzt, kann sich dieses Muster verandern und es konnen Ruckschlusse uber die Funktionsweise der verursachenden Methoden gewonnen werden. Als zusatzliche Verhaltensweisen lassen sich die beiden Schreckreaktionen auf Vibration und Beruhrung nutzen. Bereits in der Eischale lassen sich die Embryonen durch Beruhrung zum Bewegen bringen. Sobald sie in einem Alter von ca. drei Tagen nach Befruchtung geschlupft sind, wird die Reaktion als C-Krummung bezeichnet, da die Larve eine charakteristische Biegung entlang ihrer Korperachse einnimmt bevor sie davonschwimmt. Dasselbe gilt fur die Vibrationsreaktion ab einem Alter von ca. funf Tagen nach Befruchtung. Um diese Verhalten sinnvoll nutzen zu konnen sind automatisierte Losungen notwendig, die die Vorbereitung, die Ablaufe und die Analyse soweit vereinfachen, dass kaum noch menschliches Eingreifen notwendig ist. Nur so kann der notwendige Durchsatz und die Reproduzierbarkeit gewahrleistet werden um statistisch aussagekraftige Effekte nachzuweisen. Aus diesem Grund wurden drei unabhangige mechatronische Systeme entwickelt, die je eines der drei genannten Verhaltensmuster automatisiert auslosen, aufzeichnen und analysieren konnen. Dazu waren neben der Hard- und Softwareentwicklung auch biologische Vorgehensweisen notwendig um die Systeme zu validieren und sie bereits in ersten biologischen Untersuchungen einzusetzen. Fur das PMR System wurde ein hochautomatisierter Versuchsablauf entwickelt, der anhand eines Roboters die Embryonen zur Vorbereitung sortiert und anschliesend in einem automatisierten Mikroskop mit vollstandig eigenentwickelter Steuerungssoftware die Aufzeichnung der Reaktion gewahrleistet. Anschliesend konnen die Rohdaten in Form von Videos automatisiert analysiert werden um numerische Daten aus den Bildreihen zu extrahieren. Das Vibrationssystem umfasst einen neuentwickelten Vibrationserreger in Form eines modifizierten Lautsprechers, der es erlaubt, mehrere Proben parallel zu untersuchen. Dazu wurde der Erreger ausgiebig charakterisiert um zu gewahrleisten, dass die erzielten Beschleunigungswerte sowie die Impulsdauer und Frequenz den angestrebten Werten von 14 g, 1 ms und 500 Hz entsprechen. Durch den Einsatz von Beschleunigungssensoren wurden die Erreger kalibriert und die Steuerungssoftware an die Ergebnisse so angepasst, dass ein einheitlicher Effekt zwischen den Erregern gewahrleistet ist. Die Implementierung einer Hochgeschwindigkeitskamera erlaubt die Aufzeichnung der Reaktion bei bis zu 1000 Bildern pro Sekunde, was aufgrund der auserst schnellen Reaktionszeit der Larven im Millisekundenbereich notwendig ist um den vollen Umfang der Reaktion abzubilden. Um Hochdurchsatzversuche zur Beruhrung der Larven zu ermoglichen, wurde das erste automatisierte System entwickelt, welches durch den Einsatz einer motorisiert positionierbaren Nadel einen computergesteuerten Beruhrungsvorgang ermoglicht. Ein beruhrungsempfindliches Mehrachsensystem wurde so konstruiert, dass der Nutzer uber eine grafische Oberflache das System fernsteuern kann und so die subjektiven und unnotig langwierigen Aspekte von manuellen Versuchsaufbauten umgangen werden konnen. Das System wurde mit einer digitalen Objekterkennung so erweitert, dass auch autonome Versuche moglich wurden. Die Systeme wurden im Rahmen von mehreren biologischen Untersuchungen am ITG ausgiebig getestet. Mit Hilfe des PMR Systems wurde eine mehrere hundert Proben umfassende Sammlung von Cannabinoid-ahnlichen Substanzen auf ihre neuroaktive Wirkung untersucht. So konnten charakteristische Reaktionsmuster identifiziert werden, die nun dabei helfen konnen, das Verstandnis uber die Struktur- und Wirkungszusammenhange zu erhohen. An den beiden Schreckreaktionen konnte die unterschiedliche Wirkung von Anasthetika auf Phanokopien von genetisch veranderten Zebrabarblingen nachgewiesen werden, was die Einsatzfahigkeit fur chemische sowie genetische Versuche substantiiert.