Funktionelle Charakterisierung von zwei stressinduzierbaren Glutathion S-Transferasen in Caenorhabditis elegans

Aerob lebende Organismen stehen in standigem Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies, die aufgrund ihrer Schadigung von lebensnotwendigen zellularen Molekulen fur den Alterungsprozess eines Individuums bzw. fur die Entstehung von Krankheiten verantwortlich gemacht werden. Das Uberleben unter aeroben Bedingungen kann deshalb nur durch ein effektives antioxidatives Schutzsystem gesichert werden. Glutathion S-Transferasen stellen hierbei wichtige Phase-II-Detoxifikationsenzyme dar, die zur Umsetzung reaktiver Molekule in aeroben Organismen beitragen. In dieser Studie wurden die stressinduzierbaren Glutathiontransferasen Ce-GST-p24 und Ce-GST-p29 aus C. elegans detailliert analysiert. Es konnte ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Expressionslevel der Glutathiontransferasen und der Stresstoleranz von C. elegans nachgewiesen werden. Es wurden transgene C. elegans-Stamme etabliert, die jeweils eine Glutathion S-Transferase uberexpremieren (BL1: Ce-GST-p24, BL2: Ce-GST-p29). Die Toleranz dieser Tiere gegenuber oxidativem Stress lag deutlich uber der Toleranz von Wildtyp-C. elegans. Ein signifikanter Unterschied wurde besonders in Kontakt mit dem Chinon Juglon detektiert. Sowohl in BL1-Wurmern als auch in Wildtyp-Wurmern fuhrte ein verringerter Expressionslevel der transgenen bzw. endogenen Ce-GST-p24 durch RNAi-feeding zu einer deutlich verringerten Stresstoleranz dieser Tiere. Der gleiche Effekt wurde auch in C. elegans mit einem mutierten Ce-GST-p24-Allel beobachtet. Demnach gibt es eine deutliche Korrelation zwischen der GST-Konzentration und der Toleranz gegenuber oxidativem Stress. Ein Einfluss des GST-Levels auf die Lebenspanne unter Normalbedingungen wurde dagegen nicht festgestellt. Die transgene Ce-GST-p24 konnte spezifisch in den Muskeln, in der Hypodermis und im Pharynxbereich des BL1-Stammes nachgewiesen werden, was dem Expressionsmuster von parasitischen GSTs entspricht. Das Protein wurde nach Stressinduktion entwicklungsabhangig starker in Larven als in Adulten des BL1-Stammes expremiert, es konnte jedoch keine erhohte Toleranz der Larven gegenuber oxidativem Stress nachgewiesen werden. Im Ce-GST-p24-Promotor wurden stressinduzierbare regulatorische Elemente gefunden. Eine Stressinduktion des Nematodenpromotors konnte eindeutig im homologen C. elegans-System anhand von zwei unterschiedlich langen Promotorfragmenten nachgewiesen werden. Dabei wurde die Induktion durch unterschiedliche Chemikalien erreicht, die intrazellular erhohte Sauerstoffradikalkonzentrationen freisetzen; durch UV-Licht und Hitzeschock hingegen wurde der Promotor nicht aktiviert. In Saugerzelllinien konnte keine Stressinduktion des GST-Promotors nachgewiesen werden. Die Glutathiontransferasen wurden in Escherichia coli rekombinant expremiert und konnten nativ aufgereinigt werden. Die enzymatische Aktivitat der rekombinanten Proteine wurde mit unterschiedlichen Substraten bestimmt. Aufgrund der Primarstruktur und der umgesetzten Substratmuster konnte die Ce-GST-p24 in eine nematodenspezifische GST-Klasse eingeordnet werden. Ce-GST-p29 wurde aufgrund struktureller Merkmale der Omega-Klasse der GST