Accions de la insulina sobre el transportador de glucosa GLUT4 expressat en el múscul esquelètic dels peixos teleostis

Els transportadors de glucosa de difusio facilitada (GLUTs) son proteines essencials per permetre lentrada de glucosa dins la cellula. Concretament, el GLUT4 sha descrit com la isoforma mes important per al manteniment de la glucemia, ja que es el mediador de laccio de la insulina per incrementar la taxa de captacio de glucosa. Fins ara en peixos nomes shan identificat quatre isoformes de GLUTs, i entre elles hi destaca el GLUT4, el qual va ser clonat per primera vegada en truita comuna (Salmo trutta). A linici daquesta tesi ja existien algunes evidencies sobre la regulacio de la insulina sobre lexpressio daquest transportador in vivo. No obstant, es desconeixia si laccio de la insulina era un efecte directe sobre el teixit muscular o be actuava a traves daltres mediadors. Per altra banda, tampoc es coneixia laccio de la insulina sobre la proteina GLUT4 de truita. Per tant, en aquesta tesi hem intentat resoldre aquestes questions per poder contribuir a un millor coneixement dun dels elements importants que interve en el metabolisme dels carbohidrats en els peixos teleostis. En aquest estudi es va demostrar que els nivells dinsulina circulants son capacos de modular el contingut de proteina GLUT4 in vivo en el muscul esqueletic de truita i que aquesta regulacio es especifica del tipus de fibra muscular. Tambe es va demostrar que els efectes de la insulina sobre lexpressio de GLUT4 en el muscul esqueletic de truita son deguts a laccio directa daquesta sobre les cellules musculars. Lexpressio basal de GLUT4 augmenta al llarg de la diferenciacio de les cellules musculars de truita i, parallelament, tambe augmenta lleugerament lexpressio de GLUT1. La insulina i lIGF-I estimulen lexpressio de GLUT4 i els seus efectes son mes evidents en miotubs. La insulina, en general, promou lacumulacio dARN missatger de GLUT1 en les cellules musculars de truita. Per altra banda, lIGF-I augmenta lexpressio de GLUT1 en mioblasts. En aquesta tesi tambe es va estudiar la regulacio del trafic del GLUT4 de truita per la insulina en cellules musculars L6. Amb aquest objectiu es va generar una linia estable de cellules L6 que expressaven el GLUT4 de truita amb un epitop myc a la seva porcio extracellular (btGLUT4myc). La insulina va estimular laparicio del btGLUT4myc a la membrana plasmatica, augmentant aixi la captacio de glucosa en aquestes cellules. No obstant, en estat basal un major percentatge de btGLUT4myc estava ja present a la superficie cellular comparat amb el GLUT4myc de rata. Els experiments dinternalitzacio de GLUT4myc van demostrar que lendocitosi del btGLUT4myc es mes lenta que la del GLUT4myc de rata. Per tant, aquests resultats suggereixen que les diferencies observades entre el trafic del GLUT4 de truita i el GLUT4 de rata poden ser degudes a diferencies en alguns motius aminoacidics dels quals en mamifers sha demostrat que participen en la internalitzacio i la retencio intracellular del transportador en estat basal. Tambe sha vist que la insulina estimula la translocacio de btGLUT4 en les cellules musculars de truita i com a consequencia augmenta el transport de glucosa en aquestes cellules. Per altra banda, els estudis dimmunofluorescencia van demostrar que en estat basal el btGLUT4 es troba a linterior de les cellules de truita i concentrat a la regio perinuclear, tal i com sha descrit previament en mamifers. En conjunt podem concloure que els mecanismes de regulacio de la insulina sobre el GLUT4 en el muscul esqueletic ja existeixen en els vertebrats inferiors, malgrat que presenten algunes diferencies respecte als mamifers. Aixi, podem veure que al llarg de levolucio sha perfeccionat la regulacio de la captacio de glucosa fins arribar a ser un mecanisme eficient que permet una recuperacio rapida de la glucemia. "SUMMARY: In the present work, we demostrated that insulin plasma levels may modulate GLUT4 protein content in vivo in trout skeletal muscle, but in a fiber-type dependent manner. Furthermore, insulin stimulates GLUT4 gene expression in trout skeletal muscle by acting directly on muscle cells. Basal GLUT4 expression increases throughout differentiation of muscle cells, as well as GLUT1 expression. Insulin and IGF-I increase GLUT4 mRNA levels, but their effects are more pronounced in fully differentiated myotubes. Insulin promotes mRNA accumulation in trout muscle cells. IGF-I increases GLUT1 expression in myoblasts. We also studied the regulation of trout GLUT4 traffic by insulin in L6 muscle cells. To address this issue we generated a stable cell line of L6 cells that express the myc-tagged trout GLUT4 (btGLUT4myc). Insulin stimulates btGLUT4myc translocation to the plasma membrane, resulting in an enhanced glucose uptake in these cells. However, in the basal state a higher percentage of btGLUT4myc is already present at the cell surface compared to rat-GLUT4myc. Internalization experiments of GLUT4myc demonstrated that btGLUT4myc endocytosis is slower than that of rat-GLUT4myc. Therefore, these data suggest that these differences between mammalian and fish GLUT4 in terms of traffic could be related to differences in the sequence of certain protein motifs shown to be important for internalization and intracellular retention of GLUT4. Moreover, insulin also stimulates the translocation of endogenous GLUT4 in trout muscle cells leading to an increased glucose transport activity in these cells. On the other hand, immunofluorescence experiments revealed that under basal conditions btGLUT4 is located in the cytoplasm of trout muscle cells and concentrated in the perinuclear region. Overall, we may conclude that the mechanisms of insulin regulation on GLUT4 in skeletal muscle already exist in lower vertebrates, although they present some differences compared to mammals. Thus, glucose transport regulation has been improved through evolution to become an efficient mechanism that allows a rapid recovery of glycaemia. "