Fluorescence correlation spectroscopy of autofluorescent proteins and its applications in live cell membranes

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is used for investigating the kinetic processes and molecular interactions by means of the statistical analysis of fluorescence fluctuations. These fluorescence fluctuations which arise from the small confocal volume are due to diffusion, rotation, intersystem crossing, conformational changes or other random effects of the fluorescent molecules under study. Therefore the fluorescent intensity from these fluctuations contains photophysical information on the nature of molecules. The aim of the work described in this thesis is to study the applications of FCS. The thesis is divided into 6 chapters. The theory, experimental setup and applications of FCS are outlined in chapter 1. A method of determining the photostability of autofluorescent proteins by Stern-Volmer plot like analysis is described in chapter 2. Photostability of green (GFP) and yellow fluorescent proteins (YFP) with fluorinated chromophores are analysed by intensity dependent FCS measurements. Such a photostability analysis is continued in chapter 3 with F64L containing GFP mutants. In addition, this chapter also explains a thermal relaxation rate constant of EGFP which is accompanied by the transition between the bright state and the dark state. By wavelength dependent FCS measurements, the protonated state of the Thr203 and Glu222 containing GFP mutants are demonstrated in chapter 4. Chapter 5 describes the effect of membrane potential on the lateral diffusion of the K+(Na+)/H+ exchanger on the membrane of live red blood cell (RBC). Characterization of PLGA (polylactic-co-glycolic acid) nanoparticles tagged with oligonucleotides which are potential drug carriers in pharmaceutical applications are studied in chapter 6. Die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) wird benutzt zur Untersuchung kinetischer Prozesse und molekularer Interaktionen auf der Basis einer statistischen Analyse von Fluoreszenz-Fluktuationen. Diese Fluoreszenz-Fluktuationen, die aus einem kleinen konfokalen Volumen stammen, ruhren von Diffusion, Rotation, Intersystemubergangen, Konformationsanderungen oder anderen zufalligen Effekten der untersuchten Fluoreszenzmolekule her. Aus diesem Grund enthalt die Fluoreszenz- Intensitat dieser Fluktuationen photophysikalische Informationen uber die Natur der Molekule. Es ist das Ziel der in dieser Thesis beschriebenen Arbeit die Anwendungen von FCS zu untersuchen. Die Thesis ist unterteilt in 6 Kapitel. Die Theorie, experimenteller Aufbau und Anwendungen von FCS werden in Kapitel 1 vorgestellt. Eine Methode der Bestimmung der Photostabilitat autofluoreszierender Proteine mit Hilfe einer Stern-Volmer-Plot-artigen Analyse ist in Kapitel 2 beschrieben. Die Photostabilitat von grun und gelb fluoreszierenden Proteinen (GFP und YFP) mit fluorierten Chromophoren wird mit Intensitats-abhangigen FCS-Messungen untersucht. Eine derartige Photostabilitats-Analyse wird in Kapitel 3 mit F64L enthaltenden GFP Mutanten fortgefuhrt. Dieses Kapitel erklart auserdem eine Ratenkonstante der thermalen Relaxation von EGFP; diese Relaxation wird begleitet vom Ubergang zwischen Hell- und Dunkelzustand. Der protoniert Zustand der Thr203 und Glu222-enthaltenden GFPMutanten wird in Kapitel 4 durch wellenlangen-abhangige FCS-Messungen demonstriert. Kapitel 5 beschreibt den Effekt des Membranpotentials auf die laterale Diffusion des K+(Na+)/H+-Austauschers auf der Membran von lebenden roten Blutzellen. Die Charakterisierung von mit Oligonukleotiden getaggten PLGA-Nanopartikeln (polylacticco-glycolic acid), die potentielle Drug-Carrier in pharmazeutischen Anwendungen darstellen, wird in Kapitel 6 untersucht.