Investigation on force detection methods for optical trapping and sensing inside living cells

Optical Tweezers (OT) are a light-based non-invasive tool that has played an important role during the last decades in the field of biophotonics, together with the advances in optical microscopy techniques. Optical trapping and micromanipulation of microscopic objects is nowadays possible with tightly focused laser beams, with the capability of measuring forces acting on the trapped particle in the order of piconewtons. OT have found numerous applications in the field of biophysics, and more specifically in molecular motor studies. One of the open challenges in the field is measuring molecular motor forces in their natural (in vivo) environment: the interior of living cells. Due to the complex mechanical properties of the cell cytoplasm, standard trap force calibration methods do not apply in this environment. In this thesis we investigate two recent optical force calibration methods: active-passive calibration in viscoelastic media, and direct force measurements via light momentum changes. The two methods are tested and cross-validated inside living cells, and an application involving intracellular molecular motor stall force measurements is demonstrated. The obtained results prove the possibility of measuring forces inside the cell cytoplasm with holographic tweezers, even with an object-independent trap force calibration when the conditions for the momentum-based technique are fulfilled. We also present an algorithm for manipulating groups of optical traps with minimal computational cost, using random mask multiplexing combined with iterative computer-generated holograms for dynamic holographic optical tweezers. Les pinces optiques son una tecnica no invasiva, basada en llum, que ha tingut un paper important en les ultimes decades en el camp de la biofotonica, en combinacio amb les noves tecniques de microscopia. L’atrapament i manipulacio d’objectes microscopics per mitjans optics es avui en dia una possibilitat real, que permet no nomes desplacar objectes, sino tambe mesurar les forces que actuen sobre aquests. Es per aixo que les trampes optiques han trobat nombroses aplicacions en el camp de la biofisica, i mes concretament, en l’estudi de motors moleculars. Un dels reptes pendents en aquest sentit es la mesura de forca de motors moleculars en el seu entorn natural: l’interior de cel·lules vives. Degut a la complexitat mecanica del citoplasma, els metodes estandard de calibratge de pinces optiques no son valids en aquest entorn. En aquesta tesi s’investiguen dos metodes recents de mesura de forca que tenen el potencial de ser utilitzats a l’interior cel·lular: la calibracio activa-passiva de pinces optiques en medis viscoelastics, i la mesura forca directa a traves de canvis en el moment del feix de llum. Es demostra que els dos metodes, basats en principis teorics totalment diferents, donen resultats compatibles dins de cel·lules, validant aixi la possibilitat de mesurar forces pinces optiques a l’interior cel·lular de forma fiable. La utilitat practica del metode de forca directa, la constant de calibracio del qual es independent de l’objecte atrapat, es demostra amb una aplicacio concreta: la mesura de forca de motors moleculars involucrats en el transport de vesicules en cel·lules animals. Tambe presentem un algoritme per a la manipulacio dinamica de grups de trampes optiques utilitzant holografia digital, amb un cost computacional minim. S’utilitza el multiplexat espacial de mascares aleatories, partint d’hologrames pre-generats amb metodes iteratius, per experiments de manipulacio a temps real.