Structural and functional characterization of the SUMO proteases SENP6 and SENP7

Intercambiar la especifidad de las isoformas de SUMO1 y SUMO2/3 para SENP6/SENP7 SENP6 y SENP7 son los miembros mas divergentes de la familia de proteasas SENP y los unicos miembros que llevan cuatro inserciones o "loops" localizadas en su dominio catalitico. Al sobreponer el dominio catalitico de SENP7 sobre el complejo SENP2-SUMO podemos ver una posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO. Tambien identificamos diferentes residuos de SUMO1 y SUMO2 que podrian formar parte de la interfaz. Disenamos una serie de mutantes de SUMO1 y SUMO2 donde se intercambian entre ellos los residuos que forman parte de la interfaz. De esta manera fuimos capaces de intercambiar la actividad proteolitica de SENP6 y SENP7 hacia estos substratos. El Loop1 de SENP6 y SENP7 es responsable de la especificidad de la interfaz entre los SUMOs y las SENP6/7 Disenamos una serie de mutantes del Loop1 de SENP7 dentro de la posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO para determinar los papeles estructurales y funcionales de los residuos que estan dentro de esta region. Los mutantes de SENP6/7 sin el Loop1 perdian gran parte de su actividad, esta se podia recuperar un poco al reemplazar las cuatro prolinas del Loop1 por glicinas. De esta manera probamos que el Loop1 tiene un papel por lo menos estructural en el reconocimiento de SUMO. Tambien identificamos el residuo Lys691 del Loop1 de SENP7 como elemento indispensable en la actividad de la enzima ya que al mutar este residuo por un aspartico disminuye la actividad para sustratos con SUMO2. Por otra parte el residuo Asp71 de SUMO2 es uno de los residuos propuestos para el reconocimiento de SUMO2/3. Cuando mutamos este residuo a lisina, vemos una bajada en la actividad de SENP7. Este hecho sugiere que Asp71 de SUMO2 esta interaccionando con Loop1 y quizas con la Lys691, y que la bajada en la actividad es causada por una repulsion de cargas. Por otro lado con el objectivo de estudiar el efecto de Loop1 en la desconjugacion de especies SUMOyladas, insertamos los ocho residuos de SENP6 Loop en el dominio catalitico de SENP2. Esta insercion provoca un aumento de la actividad sustancial de SENP2 contra diSUMO en comparacion con la forma wild type. Complejos con substratos Para ver si SENP6 es capaz de formar algun complejo estable, producimos cantidades en miligramos de los mutantes inactivos de Δ3SENP6C1030S y de Δ2Δ3SENP6C1030S. Incubamos cada proteasa con los precursors de SUMO, con RanGAP1-SUMO2 y con diSUMO2. De todos los substratos que probamos, diSUMO2 fue el unico que podia formar un complejo estable con Δ3SENP6CS y Δ2Δ3SENP6CS por copurificacion en una columna de gel fitracion. Con Δ2SENP6CS no pudimos formar ningun complejo. Con esta informacion llegamos a la conclusion que el Loop3 de SENP6 reduce, quiza por razones de entropia, la capacidad de SENP6 de formar un complejo estable con diSUMO2. Caracterizacion del Loop3 de SENP6 Para descifrar el papel que este loop tiene en el contexto de la proteasa, producimos y purificamos los 185 residuos de Loop3 de SENP6. Analysis 1-H 1-D RMN mostraba una falta de estructura terciaria dentro del loop, pero proteolisis limitada y espectroscopia de masas mostraban un fragmento estable de cerca de 11kDa. Dicroismo circular y FTIR tambien sugieren la presencia de algunos elementos de estructura secundaria. Globalmente, la caracterizacion biofisica del Loop3 de SENP6 muestra que el loop es una proteina desestructurada.