Structural and functional characterization of regulatory metallocarboxypeptidases: Studies on human carboxypeptidases D and Z, and the transthyretin-like domain

Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino acidos del extremo C terminal en proteinas y peptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreatica que hidroliza residuos C terminales hidrofobicos. En las decadas siguientes despues del descubrimiento de la CPA1, docenas de MCPs adicionales han sido descritas en diferentes tejidos y fluidos extrapancreaticos, comprendiendo un amplio rango de funciones fisiologicas que van desde la digestion de los alimentos hasta la produccion de neuropeptidos y hormonas peptidicas o el procesamiento selectivo de la tubulina. La presente tesis tiene como objeto profundizar en el conocimiento de la estructura y funcion biologica de dos MCPs reguladoras. Para este proposito, se aplicaron un amplio espectro de aproximaciones bioquimicas con el fin de elucidar la actividad biologica de las carboxipeptidasas D y Z humanas. Ademas, se decidio estudiar por primera vez la estructura y funciones de los dominios tipo transtiretina (TTL) que se encuentran en todos los miembros de esta subfamilia de proteasas, escogiendose como ejemplo el primer dominio TTL perteneciente al primer dominio catalitico de la carboxipeptidasa D humana (denominada en este trabajo como h-TTL). En el primer capitulo se describe la formacion de estructuras amiloides bajo condiciones fisiologicas por el dominio h-TTL, y se descubre que el motivo de plegamiento transtiretina monomerico tiene una propension inherente a agregar, dada la presencia de elementos estructurales amiloidogenicos preformados. El mecanismo de agregacion que se describe en este trabajo para una proteina nativa monomerica tipo transtiretina, tambien se ha encontrado en diversas proteinas globulares, inicialmente solubles y asociadas con enfermedades conformacionales que se generan por la deposicion de agregados, pudiendo ser un hecho generico para motivos de plegamiento que muestren elementos amiloidogenicos preformados en sus estructuras, esencialmente hojas β. El segundo capitulo muestra la estructura cristalografica resuelta a super alta resolucion de la h-TTL descrita en el primer capitulo. La informacion derivada del presente estudio podria facilitar el conocimiento del papel biologico de los dominios TTL encontrados en todos los miembros de la subfamilia M14B, pudiendo ser utilizada como una herramienta interesante para analizar en detalle las propiedades estructurales y los mecanismos de plegamiento de estos dominios. El tercer capitulo comprende la caracterizacion de la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa D humana, utilizando una combinacion de diferentes aproximaciones peptidomicas cuantitativas. Esta enzima unica con multiples centros cataliticos, podria estar implicada en el procesamiento de neuropeptidos y factores de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de su mecanismo de accion es de especial relevancia para el campo de la biomedicina. En el cuarto capitulo se describe el desarrollo de un metodo simple y barato para mejorar la produccion proteica de carboxipeptidasas que presentan afinidad por heparina usando celulas de mamifero, cogiendo como ejemplo el caso de la carboxipeptidasa Z. La proteina purificada mediante este sistema es enzimaticamente activa y puede ser utilizada para estudios estructurales y funcionales de alto rendimiento. En el ultimo capitulo se utilizan diferentes aproximaciones peptidomicas cuantitativas para caracterizar la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa Z humana. Ademas, en este trabajo se presenta el modelado de su dominio catalitico, asi como el de su dominio tipo frizzled, con el fin de analizar su papel en la via senalizacion de Wnt.