Infection rate based on quantitative real-time PCR of Melissococcus plutonius, the causal agent of European foulbrood, in honeybee colonies before and after apiary sanitation

Since 1999, the incidence of European foulbrood (EFB) in Switzerland has been rising constantly. To understand the reason for this increase, an epidemiological study of the efficacy of sanitation measures was carried out. Workers from brood nests and flight entrances at infected apiaries were collected from colonies with and without clinical symptoms in 2005–2006. In order to quantify bacterial loads, a novel real-time PCR assay was developed for Melissococcus plutonius. Our data show that workers from brood nests have about 20-times higher bacterial loads than those from flight entrances, suggesting that the former are more suitable for EFB-monitoring. Moreover, current sanitation measures appear to be insufficient because only three out of eight apiaries were free of M. plutonius one year after sanitation. While no clinical symptoms are observed below 50 000 CFU of M. plutonius per bee, workers can nevertheless be carriers and likely responsible for bacterial propagation.ZusammenfassungDie europäische Faulbrut (EFB) verursacht in bestimmten Regionen der Schweiz seit 1999 vermehrt Völkerverluste. Die jungen Larven werden vom Bakterium Melissococcus plutonius, dem Verursacher der EFB, infiziert. Die Larven sterben schnell, da sich der Erreger im Mitteldarm vermehrt und die Futteraufnahme behindert (Bailey, 1956, 1983). In der Schweiz ist EFB eine anzeigepflichtige Bienenkrankheit deren Bekämpfung von den amtlichen Veterinärbehörden überwacht wird. Die Völker mit klinischen Symptomen sowie schwache Völker werden eliminiert, die restlichen Brut- und Honigwaben eingeschmolzen und die Kasten sowie das Imkermaterial desinfiziert. In den 30 Jahren vor 1999 lag die jährliche Inzidenz der EFB unter 0,3 %. Dies waren jährlich weniger als 50 neue diagnostizierte Bienenstände. Nach einer stetigen Zunahme lag die Inzidenz 2006 bei 1,5 %. Die Gründe für diese starke Zunahme sind nicht bekannt. Zwei Untersuchungen haben gezeigt, dass Larven und Puppen, welche keine Symptome zeigen, wie auch Bienen Träger von M. plutonius sein können, (Forsgren et al., 2005; Belloy et al., 2007) die innerhalb des Volkes als auch zwischen den Völkern und den Bienenständen zur Ausbreitung des Erregers beitragen.Um die Wirksamkeit der sanitären Massnahmen zur Bekämpfung von EFB zu überprüfen, wurde eine neue Echt-Zeit PCR mit dem Ziel-Gen sodA entwickelt, um den Befall von M. plutonius quantitativ erfassen zu können. Für die epidemiologische Studie wurden 441 Bienenproben auf 11 Bienenständen im Brutnest und am Flugloch vor der Sanierung, ein Monat danach, bei der Einwinterung im Oktober 2005 sowie im Mai 2006 erhoben. Bei drei Ständen wurden wegen des starken Befalls alle Völker vernichtet und konnten nicht mehr beprobt werden. Es zeigte sich, dass die Bienen am Flugloch 20 Mal weniger mit M. plutonius befallen waren als denjenigen aus dem Brutnest, und diese sich daher für epidemiologische Untersuchungen weniger eignen (Fig. 4). Mit der Diagnostik von Brutnestbienen konnten vor der Sanierung 72 von 83 untersuchten Völker als befallen ermittelt werden, aber nur 54 dieser Völker zeigten klinische Symptome. Mit den eingeleiteten Sanierungsmassnahmen konnte der Befall von M. plutonius stark reduziert werden (Fig. 5). Dies reichte aber nicht in allen Fällen aus, um neue Ausbrüche von EFB im kommenden Frühjahr zu verhindern. Auf vier von acht sanierten Ständen konnte erneut mindestens bei einem Volk EFB mit klinischen Symptomen nachgewiesen werden. Bei den Brutnestbienen zeigte sich, dass Völker mit einem Erregerbefall von mehr als 50000 Koloniebildenden Einheiten/Biene mit 91 % Wahrscheinlichkeit klinische Symptome aufweisen (Fig. 6). Dies könnte für die Durchführung einer Frühdiagnose oder die Umgebungskontrolle bei Fällen von EFB auf der Basis von Bienenproben sehr hilfreich sein.