STED microscopy in the visible range Confocal

Light microscopy is a key scientific instrument in the life sciences. However, the resolution of far-field light microscopy is limited by diffraction. Exploiting a saturated depletion of the molecular excited state by stimulated emission, stimulated emission depletion (STED) breaks the resolution barrier in the important subfield of fluorescence microscopy. To this end, STED microscopy utilizes a doughnut-shaped beam featuring a central zero which is capable of quenching the fluorescence solely in the focal periphery. While STED microscopy was initially restricted to near infrared-emitting fluorophores, in this thesis STED microscopy is shown to be viable with visible (green-yellow-red) fluorophores. In particular, STED is established with the green and yellow fluorescent proteins (GFP, YFP) which are endogenous cellular markers of outstanding biological importance. The spectral conditions for STED with these fluorophores are given. The expansion of STED to the visible range has enabled the first application to biophysics and to addressing unsolved problems of cell biology. For example, STED microscopy revealed that the synaptic vesicle protein synaptotagmin remains an integral patch following fusion with the plasma membrane. Moreover, membrane microdomains were resolved with unprecedented (65 nm) spatial resolution. Furthermore, a novel doughnut-shape of the STED beam utilizing a helical phase ramp and a central singularity was established for STED. Finally, due to the smaller wavelength for stimulated emission, the viability of STED with visible dyes pushes the resolution down to smaller attainable values. Zusammenfassung Die Lichtmikroskopie ist ein wichtiges Instrument in den Biowissenschaften. Die Auflösung in der Fernfeld-Mikroskopie ist jedoch beugungsbegrenzt. Die Entvölkerung des angeregten molekularen Zustands durch stimulierte Emission, stimulated emission depletion (STED) wird verwendet, um die Auflösungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie zu überwinden. Dazu wird in der STED Mikroskopie ein ringförmiger Strahl mit einer Nullstelle im Zentrum benutzt der die Fluoreszenz in der Peripherie des Fokus löscht. Während STED Mikroskopie anfangs auf infrarot emittierende Fluorophore beschränkt war, wird in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Methode auch mit sichtbaren Farbstoffen (grün gelb rot) möglich ist. Besonders interessant ist die Einführung der grün und gelb fluoreszierenden endogenen Proteine (GFP, YFP), die von außerordentlicher Wichtigkeit in der Biologie sind. Die spektralen Bedingungen für STED an diesen Proteinen werden hier angegeben. Die Ausdehnung von STED auf den sichtbaren Wellenlängenbereich ermöglicht erste Anwendungen in der Biophysik und erlaubt das Herangehen an ungelöste Probleme in der Zellbiologie. Zum Beispiel hat die STED Mikroskopie aufgedeckt, dass Synaptotagmin, ein synaptisches Vesikelprotein, nach der Verschmelzung mit der Membran lokalisiert bleibt, statt zu diffundieren. Darüber hinaus werden Membranmikrodomänen mit bisher beispielloser räumlicher Auflösung (65 nm) aufgenommen. Im weiteren wurde eine neue Doughnutform für den STED Strahl benutzt. Darüber hinaus ermöglicht die kürzere Wellenlänge des sichtbaren STED Lichts kleinere erreichbare Auflösungen.