Estudio estructural y funcional de las cinamil alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae

En esta memoria se presenta la identificacion y posterior estudio de las caracteristicas cineticas, estructurales y funcionales de dos nuevas alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae con actividad dependiente de NADP(H). Ambos enzimas, que comparten un 64% de identidad, pertenecen a la superfamilia de alcohol deshidrogenasas de cadena media que unen zinc. Este trabajo se ha estructurado en capitulos en base a la publicacion de los datos presentados. En el Capitulo I se presenta la identificacion y caracterizacion de Adh6p con dos publicaciones referentes a la identificacion del ORF YMR318C como el gen ADH6 y la siguiente determinacion de las propiedades fisicoquimicas y cineticas de Adh6p. Se trata de una proteina homodimerica compuesta por subunidades de 40 kD, activa con alcoholes primarios o aldehidos en presencia de NADP(H). En el Capitulo II se presenta la identificacion y caracterizacion de Adh7p con una publicacion en la que se identifica al ORF YCR105W como el gen ADH7. Las propiedades fisicoquimicas y cineticas de Adh7p resultaron muy similares a las ya encontradas para Adh6p, ambas proteinas presentaban una amplia especificidad de sustratos, desde alcoholes/aldehidos alifaticos lineales y ramificados hasta alcoholes/aldehidos aromaticos. Tanto Adh6p como Adh7p son mas eficientes para la reduccion de aldehidos que para la oxidacion de sus correspondientes alcoholes (aproximadamente 50-100 veces), por lo que preferentemente funcionaran como reductasas dependientes de NADPH. Tambien se clasifica a estas dos alcohol deshidrogenasas como miembros de la familia de las cinamil alcohol deshidrogenasas, y dadas sus caracteristicas de secuencia y de especificidad de sustrato, se las clasifica mas concretamente dentro de la subfamilia de las CAD-emparentadas. En el Capitulo III se presenta la estructura tridimensional de Adh6p como publicacion. La resolucion de dicha estructura revelo el patron caracteristico de las ADHs de cadena media: la subunidad de Adh6p esta estructurada en dos dominios, uno estructural y otro de union al cofactor, separados por una profunda hendidura que aloja el centro de union a sustrato. Tambien se han identificado los dos iones de zinc, uno con funcion estructural coordinado por cuatro cisteinas (cisteinas 100, 103, 106 y 113) y otro con funcion catalitica, coordinado por la His68 y las Cisteinas 46 y 143, siendo el cuarto ligando una molecula de agua que sera desplazada por el sustrato en la catalisis. La resolucion de la estructura ha permitido identificar los residuos implicados en la union al coenzima y al substrato. Los datos estructurales obtenidos ponen de manifiesto una heterogeneidad en la union al coenzima. Al parecer, solo una de las dos subunidades de Adh6p presenta una alta afinidad por el cofactor, datos que han sido ratificados por estudios de cuantificacion de la estequiometria de la union Adh6p-NADPH. Los datos obtenidos nos han permitido realizar una hipotesis sobre su mecanismo catalitico, que al parecer presenta 'half-of-the-sites reactivity'. En el Capitulo IV se presentan estudios no publicados sobre la funcion de Adh6p y Adh7p en la levadura. Se ha estudiado la implicacion de estos enzimas en la asimilacion de productos procedentes de la degradacion de la lignina. Los estudios realizados demuestran que Adh6p es la responsable de la desintoxicacion de estos productos. Adh7p tambien tendria un papel en la asimilacion de estos aldehidos, pero seria tan solo un papel de apoyo. Los estudios realizados en condiciones de estres oxidativo demuestran que Adh6p participa en la respuesta al estres oxidativo. Tambien se ha demostrado que Adh6p es la responsable de la reduccion del 3-metilbutanal en la levadura. Finalmente, en estudios comparativos de la cepa silvestre con la cepa adh1? han demostrado la implicacion de Adh6p en el mantenimiento intracelular del balance redox NADP+/NADPH.