Estudio de los mecanismos de inhibición de la actividad carnitina palmitoiltransferasa I

La obesidad y la diabetes tipo 2 son patologias en las cuales se ha demostrado una desregulacion del metabolismo de acidos grasos. Una acumulacion de lipidos en otros tejidos distintos del tejido adiposo, entre los que sobresalen el musculo, pancreas e higado conduce a la aparicion de la resistencia a la insulina en el musculo, una secrecion incontrolada de insulina en el pancreas y al desarollo de una esteatosis hepatica. Estas enfermedades apuntan a la importancia del metabolismo de los acidos grasos. Los acidos grasos se oxidan mayoritariamente en mitocondrias y peroxisomas y este paso esta facilitado por las carnitina acitransferasas. En esta tesis estudiaremos un miembro de esta familia, la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). CPT1 es un enzima que facilita el transporte de acidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, donde seran oxidados. Este proceso esta regulado por malonil-CoA, el inhibidor fisiologico de CPT1. El objetivo de este trabajo es identificar mediante analisis bioinformaticos y cineticos la ubicacion del malonil-CoA en las isoformas hepatica y muscular de CPT1 (CPT1A y CPT1B). Con un buen modelo malonil-CoA/CPT1 se podrian disenar farmacos para regular la β-oxidacion de algunos acidos grasos como palmitato y oleato, ya que sus niveles estan estrechamente relacionados con patologias como la obesidad y la diabetes tipo 2. Aun no se ha resuelto el cristal de CPT1, posiblemente por ser una proteina integral de membrana. Por ello hemos recurrido a una aproximacion bioinformatica y analisis de "Docking" in silico, como metodo predictivo de las posibles interacciones de malonil-CoA con CPT1. El modelo 3D obtenido presenta dos sitios de union de malonil-CoA, situados de forma opuesta en el canal catalitico, sitio A y sitio O. La validez de este modelo de "Docking" ha sido confirmada mediante estudio cinetico de competicion del inhibidor con los sustratos de CPT1A, carnitina y palmitoil-CoA y tambien mediante analisis de mutantes de CPT1A. Malonil-CoA es un inhibidor competitivo de CPT1 respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor mixto lineal de CPT1A respecto a la carnitina. Estos datos estan de acuerdo con el modelo 3D propuesto de interaccion de malonil-CoA, carnitina y palmitoil-CoA. En este trabajo proponemos por vez primera un modelo 3D de la isoforma muscular, CPT1B que ha resultado muy similar, como era de esperar, al de la isoforma hepatica. Mediante estudios de mutagenesis dirigida hemos confirmado la ubicacion de los residuos cataliticos y de un residuo implicado en la sensibilidad a malonil-CoA. Diversos estudios presentan al enzima CPT1 como potencial diana para el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. Tambien el enzima acido graso sintasa (FAS) se ha propuesto como diana para el tratamiento de la obesidad. En este trabajo hemos demostrado que C75, una lactona ciclica de origen sintetico, no solo actua sobre FAS sino tambien sobre CPT1 y hemos aportado nueva informacion sobre el mecanismo de accion de esta molecula sobre la actividad CPT1 in vitro e in vivo. Los analisis por MALDI-TOF y HPLC-MS/MS y los estudios cineticos y estructurales confirman que C75 es transformado in vitro e in vivo en su derivado CoA, el C75-CoA y bajo esta forma actua como un inhibidor potente y reversible de CPT1. Ademas C75-CoA es un inhibidor competitivo respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor competitivo mixto respecto al sustrato carnitina. Los resultados del analisis de Docking de una molecula de C75-CoA en CPT1A confirman los resultados cineticos obtenidos. Este estudio abre las puertas para el diseno de nuevos farmacos basados en la molecula de C75.