Identification and Functional Analysis of Membrane Proteins gD, gE, gI, and pUS9 of Infectious Laryngotracheitis Virus

SUMMARY. Herpesvirus envelope proteins are of particular interest for development of attenuated live, marker, and subunit vaccines, as well as development of diagnostic tools. The unique short genome region of the chicken pathogen infectious laryngotracheitis virus (ILTV, Gallid herpesvirus 1) contains a cluster of six conserved alphaherpesvirus genes encoding membrane proteins, of which up to now only glycoproteins gG and gJ have been analyzed in detail. We have now prepared monospecific rabbit antisera against ILTV gD, gE, and gI, and the ILTV type II membrane protein pUS9, each of which showed specific immunofluorescence reactions, and detected proteins of approximately 65 and 70 kDa (gD), 62 kDa (gI), 75 kDa (gE), or 37 kDa (pUS9) in western blot analyses of infected chicken cells. The proteins gD, gI, and gE, but not pUS9, were identified as abundant virion proteins, and gE and gI were shown to be N-glycosylated. We also isolated gE-, gI-, and pUS9-deleted ILTV recombinants, whereas it was not possible to purify gD-negative ILTV to homogeneity, indicating that gD, like in other alphaherpesviruses, is essential for receptor binding and virus entry. The pUS9-deleted ILTV exhibited almost wild-type–like replication properties in cell culture. The gE- and gI-negative viruses showed significantly reduced plaque sizes, whereas virus titers were barely affected. Since homologous gene-deletion mutants of other alphaherpesviruses are in use as live vaccines, the generated ILTV recombinants might be also suitable for this application. RESUMEN. Identificación y análisis funcional de las proteínas de membrana gD, gE, gI, y pUS9 del virus de la laringotraqueitis infecciosa. Las proteínas de la envoltura de los herpesvirus son de particular interés para el desarrollo de vacunas con virus vivos atenuados, con marcadores, o de vacunas subunitarias, así como para el desarrollo de herramientas de diagnóstico. La región corta única del virus patógeno de la laringotraqueitis infecciosa del pollo (Herpesvirus de las gallinas 1, con las siglas en inglés ILTV) contiene un grupo de seis genes conservados de alfaherpesvirus que codifican para proteínas de membrana, de los cuales hasta ahora sólo las glicoproteínas gG y gJ se han analizado en detalle. Se prepararon antisueros de conejo monoespecíficos contra las proteínas de membrana del virus de laringotraquítis gD, gE, y gI, y contra la proteína de membrana del virus de laringotraqueítis tipo II pUS9, la cual mostró reacciones de inmunofluorescencia específicas, y se detectaron proteínas de aproximadamente 65 y 70 kDa (gD), de 62 kDa (gI), 75 kDa (gE), o de 37 kDa (pUS9) en los análisis de inmunoelectrotransferencia de las células de pollo infectadas. Las proteínas gD, gI y gE, con excepción de la pUS9, se identificaron como proteínas abundantes en el virión y las proteínas gE y gI mostraron estar N-glicosiladas. También se aislaron virus de laringotraqueítis recombinantes con los genes gE, gI y pUS9 suprimidos, mientras que no fue posible purificar virus de laringotraqueítis negativos a la presencia de gD, lo que indica que gD, como en otros alfaherpesvirus, es esencial para la unión al receptor y para la entrada del virus. El virus de laringotraqueítis con el gene pUS9 suprimido mostró propiedades de replicación casi similares al virus silvestre de la laringotraqueítis en cultivo celular. Los virus negativos a la presencia de gE y gI mostraron una reducción significativa en el tamaño de las placas, mientras que los títulos virales resultaron apenas afectados. Debido a que virus mutantes con deleciones homólogas de genes de otros alfaherpesvirus están en uso como vacunas vivas, los virus de laringotraqueítis recombinantes generados podrían también ser adecuados para esta aplicación.