Analysen zum onkogenen Potenzial des E1B-55K-Proteins von Adenovirus Typ 5

Das 55-kDa Genprodukt der fruhen Region 1B (E1B-55K) von Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im Ad5-vermittelten Transformationsvorgang primarer Zellen einnimmt. Den onkogenen Aktivitaten des E1B-Proteins liegen verschiedene Wirkmechanismen zugrunde. An erster Stelle steht dabei die Inaktivierung des zellularen Tumorsuppressorproteins p53 auf der Ebene der Transkription. Als weitere Faktoren werden schon seit langerem eine intrinsische Kernexportaktivitat und posttranslationale Funktionen vermutet, die uber unterschiedliche Bereiche im viralen Polypeptid reguliert werden. Soweit bekannt, handelt es sich dabei um ein Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) sowie um zwei hoch konservierte Sequenzmotive, die grose Ubereinstimmung zu sog. BC-Boxen oder atypischen RING-Fingerdomanen aufweisen. Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen wurden in der vorliegenden Arbeit weiterfuhrende Untersuchungen zur Funktion des NES, der BC-Box und der RING-Fingerdomane im E1B-55K-induzierten Transformationsvorgang durchgefuhrt. Im Mittelpunkt der Arbeiten standen verschiedene Mutanten des E1B-Proteins, die definierte Aminosaureaustausche in den entsprechenden Sequenzmotiven enthalten. Durch klassische Transformationsexperimente auf der Basis primarer Rattenepithelzellen gelang zunachst der Nachweis, dass die Kernexportfunktion des E1B-Proteins fur seine transformierenden und onkogenen Eigenschaften nicht essenziell ist. Vielmehr zeigen die erzielten Ergebnisse, dass die Inhibition des Kernexportvorgangs die Transformationsrate und Tumorigenitat der transformierten Zellen deutlich steigert. Die erhohte Focus-Bildung und Tumorigenitat der Zellen korreliert mit einem signifikanten Anstieg der E1B-vermittelten Repression p53-stimulierter Transkription, der vollstandigen Umverteilung von p53 und PML-NB-Kerndomanen in grose Proteinaggregate und der Bindung von E1B-55K an die PML-NB-Komponenten daxx und PML. Diese Beobachtungen zeigen erstmalig, dass die Wechselwirkung von E1B-55K mit daxx und PML und die damit verbundene Modulation der PML-NB-Kerndomanen einen wichtigen Schritt in E1B-induzierten Transformationsprozess darstellen. Diese Annahme wird durch die Untersuchungen zur Funktion der BC-Box und RING-Fingerdomane unterstutzt. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass bestimmte Aminosaureaustausche in der BC-Box (E1B-BC1) oder in der RING-Fingerdomane (E1B-RF6) die Transformationsrate deutlich reduzieren. Dabei korreliert der Phanotyp der BC1-Mutante mit dem Verlust der Inhibition p53-stimulierter Transkription in Reportergenanalysen. Im Gegensatz dazu wird die Repression von p53 durch die Mutationen in E1B-RF6 kaum beeintrachtigt. Dieser Befund ist hoch interessant, da er erstmals eine p53-unabhangige Funktion des E1B-Proteins im Ad5-vermittelten Transformationsprozess aufzeigt. Auf molekularer Ebene wird diese Aktivitat hochstwahrscheinlich uber die Wechselwirkung mit dem zellularen PML-NB-assoziierten Protein Mre11 vermittelt, das bekanntermasen eine zentrale Rolle in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbruchen spielt. Interessanterweise verhindern die Mutationen in E1B-RF6 neben der Bindung an Mre11 auch die Umverteilung von PML-NBs und p53 in subnukleare Proteinaggregate. Dies lasst vermuten, dass E1B-55K die Funktion und Lokalisation von PML-NBs bzw. PML-NB-assoziierten Komponenten uber die Bindung an Mre11 moduliert. Ob und in welchem Umfang E1B-55K dabei die Mre11-regulierten Prozesse der DNA-Reparatur und Telomer-Erhaltung verandert, ist noch unklar. Erste Untersuchungen in diese Richtung weisen jedoch darauf hin, dass moglicherweise eine Funktion von Mre11 verandert wird, die im Zusammenhang mit der Zellzykluskontrolle bei G2/M-Phasenubergang stehen konnte. Im Ganzen zeigen diese Ergebnisse dieser Arbeit erstmals, dass Ad5 E1B-55K uber p53-abhangige und -unabhangige Mechanismen zur vollstandigen Transformation primarer Zellen beitragt. Letztere Aktivitat wird zumindest teilweise uber die Wechselwirkung mit Mre11 und uber die Modulation von PML-NBs bzw. den PML-NB-assoziierten Komponenten daxx und PML reguliert. Da alle bislang untersuchten DNA- und RNA-Tumorviren Genprodukte besitzen, die die Integritat von PML-NBs verandern, konnte die Bindung an Mre11 und die Mre11-abhangige Modulation von PML-NBs durch E1B-55K einen allgemein gultigen Mechanismus virusinduzierter Onkogenese darstellen.