Studies with selected antagonists of the N-methyl-D-aspartate receptor in an in-vitro blood-brain barrier model of ischemia

Die Blut-Hirn-Schranke spielt eine zentrale Rolle in der Regulation des Stofftransports zwischen dem Blut und dem zerebralen Gewebe und regelt dadurch die Homoostase von Elektrolyten, Aminosauren etc. Die Funktion dieser physiologischen Barriere ist aber auch entscheidend fur die Entstehung und die Entwicklung von pathologischen Prozessen und Krankheiten wie Morbus Alzheimer, Morbus Huntington, Epilepsie oder Schlaganfall. Die vorliegende Arbeit beschaftigt sich uberwiegend mit der Veranderung der Funktionalitat der Blut-Hirn-Schranke im Rahmen von zerebraler Ischamie. Die damit verbundenen pathologischen Vorgange sind abhangig von einem extrazellular entstehenden Glutamat-Uberschuss, der zu einer vermehrten Aktivierung von exzitatorischen Glutamat-abhangigen Rezeptoren und schlussendlich zum Zelltod fuhrt. Einer dieser Rezeptoren ist der in dieser Arbeit behandelte N-methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR). Studien der letzten Jahre insbesondere von Vivien et al. (2011-2015) bestatigten die bedeutende Rolle der Glycin-Bindungsstelle NR1 des NMDAR in der Entstehung des Zellschadens im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem auch an dem Blut-Hirn Schranken Endothel. Als weiterer zentraler Regulator dieses Prozesses wurde der tissue-Plasminogen activator (t-PA) identifiziert. Dieser Faktor bindet ebenfalls an die NR1 Untereinheit des NMDAR und aktiviert diesen wiederum. Dieser Mechanismus unterstreicht die Bedeutsamkeit der Glycin-Bindungsstelle an der Entstehung und Entwicklung des zellularen Schadens im Rahmen der zerebralen Ischamie. Dementsprechend sind Glycin-Antagonisten gesucht, die den Schaden durch die Blockade des Rezeptors verhindern konnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden mehrere, am Department fur Pharmazeutische Chemie in Wien vorhandene Glycin-Antagonisten getestet. Die optimale Substanz blockiert den durch OGD (oxygen/glucose deprivation) induzierten Schaden der Barriere des Blut-Hirn Schranken in-vitro Schlaganfallmodells. Zudem sollte sie in den angewandten Konzentrationen nicht toxisch sein und geringe Permeabilitat durch das Blut-Hirn Schranken in-vitro Modell aufweisen. Dies ist besonders wichtig, um die unerwunschten Nebeneffekte der Glycinantagonisten auf Gliazellen und Neuronen im ZNS zu minimieren. Fur die Blut-Hirn Schranken Modelle wurden die Zelllinien cerebEND (immortalisierte, murine Hirnkapillarendothelzellen) und C6 (Rattenglioma) eingesetzt. Die untersuchten Glycinantagonisten konnten die Zellviabilitat (EZ4U assay) unter Normoxie als auch OGD-Bedingungen konzentrationsabhangig reduzieren. Dementsprechend wurden nicht-toxische Konzentrationen der Substanzen fur die nachfolgenden Transportversuche im Blut-Hirn Schranken Modell verwendet und mittels HPLC analysiert. Die Resultate (Clearance, Wiederfindung, Transportrate) wurden auf den internen Standard Diazepam normalisiert und mit physiko-chemischen Parametern wie ClogP korreliert. Die Fahigkeit der Glycinantagonisten den durch die OGD-Behandlung verursachten Barriereschaden zu blockieren, wurde in einem Transwell Ko-Kulturmodell bestehend aus cerebEND und C6 Zellen untersucht und anhand der Anderungen des transendothelialer elektrischer Widerstandsmessung und der Permeabilitat des parazellularen Markers Carboxyfluoreszein bestimmt. Zusammenfassend waren beinahe alle ausgewahlten Glycinantagonisten im Blut-Hirn Schranken in-vitro Schlaganfallsmodell wirksam. Mit Hilfe der zusatzlich ermittelten Toxizitats- und Transportdaten konnten die Substanzen mit dem hochsten Potenzial fur in-vivo Studien ausgewahlt werden.