Diagnosis of duck circovirus infections by conventional and real-time polymerase chain reaction tests

Development of the first conventional and real-time polymerase chain reaction (PCR) tests for the diagnoses of duck circovirus (DuCV) infections is described. Both tests amplified a 230 bp fragment specific to the DuCV Rep gene. Although both tests had the same detection limit (13×103 target DNA/ml) when the target DNA was diluted in water, the detection limit of the real-time test (13×104 target DNA/ml) was 10-fold less than the conventional test (13×105 target DNA/ml) when the amplifications were performed in the presence of cellular DNA. Using the conventional PCR test, DuCV DNA was detected in 85 (84%) of 101 bursa of Fabricius samples from dead or sick ducks, aged between 1 and 12 weeks, and in samples from 35 (94%) of 37 flocks. Application of the SYBR Green-based real-time PCR test to 54 selected bursa of Fabricius samples indicated that more samples were positive by real-time PCR than by conventional PCR, allowed the numbers of genome copies to be estimated and showed that some bursa of Fabricius samples contained over 1013 genome copies/g tissue. Although DuCV infections were detected in birds aged from 1 to 12 weeks, higher virus DNA levels were detected in ducks aged older than 5 weeks than in ducks younger than 5 weeks. An in situ hybridization method for the detection of DuCV in histological samples was also developed. Additional work is required to determine the clinicopathological significance of DuCV infections. Diagnostic des infections à circovirus du canard par des tests d'amplification en chaîne par polymérase conventionnels et en temps réel Le développement des premiers tests d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) conventionnels et en temps réel pour le diagnostic des infections à circovirus du canard (DuCV), sont décrites. Les deux tests amplifient un fragment de 230 pb spécifique du gène Rep du DuCV. Les deux tests ont présenté la même limite de détection (13×103 ADN cible /ml) lorsque l'ADN cible a été dilué dans l'eau. Par contre, la limite de détection du test en temps réel (13×104 ADN cible/ ml) a été 10 fois inférieure à celle du test conventionnel (13×105 ADN cible/ ml) quand les amplifications ont été réalisées en présence d'ADN cellulaire. En utilisant le test PCR conventionnel, l'ADN du DuCV a été détecté à partir de 84% (85/101) des échantillons de bourse de Fabricius (BF) de canards malades ou morts, âgés entre 1 à 12 semaines et à partir de 94% (35/37) des troupeaux. L'application du test PCR en temps réel, basé sur la technologie SYBR Green, à une sélection de 54 échantillons de BF a révélé un plus grand nombre d'échantillons positifs avec ce test qu'avec le test PCR conventionnel et a permis d'estimer le nombre de copies de génome en montrant que quelques échantillons de BF contenaient plus de 1013 copies de génome/g de tissu. Bien que les infections à DuCV aient été détectées chez des animaux âgés de 1 à 12 semaines, des niveaux supérieurs d'ADN viral ont été détectés chez des animaux âgés de plus de 5 semaines comparés à ceux de moins de 5 semaines. Un test de détection du DuCV par hybridation in situ dans des échantillons destinés à l'histologie a également été développé. Des travaux complémentaires sont nécessaires pour déterminer la signification clinicopathologique des infections à DuCV. Diagnose von Entencircovirusinfektionen durch konventionelle und Real Time-Polymerasekettenreaktionstests Die Entwicklung des ersten konventionellen sowie Real Time-Polymerasekettenreaktions (PCR)-Tests zur Diagnose von Entencircovirus (ECV)-Infektionen werden beschrieben. Beide Tests amplifizieren ein für das ECV-Rep-Gen spezifisches 203bp-Fragment. Obwohl beide Tests bei der Verdünnung derr Ziel-DNS in Wasser die gleiche Nachweisgrenze hatten (13×103 Ziel-DNSs/mL), erwies sich die Nachweisgrenze bei der Amplifizierung in Anwesenheit zellulärer DNS in der Real Time-PCR (13×104 Ziel-DNSs/mL) 10fach niedriger als die im konventionellen Test (13×105 ZielDNSs/mL). Mittels dem konventionellen PCR-Test wurde ECV-DNS in 85 (84%) von 101 Bursa Fabricii (BF)-Proben von toten oder kranken 1-12-wöchigen Enten und in Proben von 35 (94%) von 37 Herden festgestellt. Die Anwendung des auf SYBR-Grün basierenden Real Time-PCR-Tests bei 54 ausgewählten BF-Proben ließ erkennen, dass in der Real Time-PCR mehr positive Proben waren als in der konventionellen PCR, und erlaubte die Schätzung der Zahl der Genomkopien, was zeigte, dass einige BF-Proben über 1013 Genomkopien/g Gewebe beinhalteten. Obwohl die ECV-Infektionen in 1-12-wöchigen Enten nachgewiesen worden sind, wurden in Enten, die älter als 5 Wochen waren, höhere Virus-DNS-Gehalte ermittelt als in denen, die jünger als 5 Wochen waren. Eine in situ-Hybridisierungsmethode für den Nachweis von ECV in histologischen Präparaten wurde ebenfalls entwickelt. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die klinisch-pathologische Bedeutung der ECV-Infektionen zu bestimmen. Diagnóstico de infección por circovirus del pato mediante reacción en cadena de la polimerasa convencional y a tiempo real Se describe el desarrollo de la primera técnica de reacción en cadena de la polimerasa convencional y a tiempo real (PCR) para el diagnóstico de infecciones por circovirus del pato (DuCV). Ambas técnicas amplifican un fragmento de 230pb específico del gen Rep del DuCV. Aunque ambas técnicas presentaron el mismo límite de detección (13×103 ADNs diana/ mL) cuando el ADN diana se diluyó en agua, el límite de detección de la técnica a tiempo real (13×104 ADNs diana/ mL) fue 10 veces menor que la técnica convencional (13×105 ADNs diana/ mL) cuando las amplificaciones se realizaron en presencia de ADN celular. Mediante la técnica convencional de PCR, el ADN DuCV fue detectado en 85 (84%) de 101 bolsas de Fabricio (BF) de patos enfermos o muertos, de edades comprendidas entre 1 y 12 semanas y en muestras de 35 (94%) de 37 lotes. La aplicación de la técnica de PCR basada en SYBR Green en 54 muestras seleccionadas de BF indicó que habían más muestras positivas a la PCR a tiempo real que a la PCR convencional y permitió estimar el número de copias de genoma y mostró que algunas muestras de BF contenían más de 1013 copias de genomas/ g tejido. Aunque las infecciones por DuCV se detectaron en aves con edades de entre 1 a 12 semanas, los niveles más altos de ADN vírico se detectaron en patos de más de 5 semanas de edad, más que en los patos de menos de 5 semanas. Se desarrolló un método de hibridación in situ para la detección de DuCV en muestras histológicas. Se necesitan estudios posteriores para determinar la significación clinicopatológica de las infecciones por DuCV.