Aproximación metabolómica a los zumos de fruta mediante la cromatografía de líquidos y de gases acoplada a la espectrometría de masas

Durante los ultimos anos, tanto consumidores como diferentes sectores comerciales y politicas de mercado se han orientado hacia la consecucion de habitos alimentarios equilibrados desde el punto de vista nutricional. En este sentido, los metabolitos presentes en las frutas y sus derivados ejercen un papel esencial sobre la salud humana y su buena preservacion. Este grado de continua sofisticacion demanda el desarrollo de nuevos protocolos analiticos que permitan seguir el rastro de un amplio espectro de nutrientes y metabolitos presentes en frutas y sus derivados, de tal forma que sea posible cuantificar y, con ello, minimizar las posibles perdidas que puedan acontecer durante las etapas de postcosecha y procesado industrial. Hay que tener en cuenta que la mayoria de las frutas tienen un perfil metabolomico muy complejo, con una gran numero de metabolitos a evaluar, por lo que se requiere el uso de metodologias de analisis de alto rendimiento para su estudio, fundamentalmente cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS) y cromatografia liquida de alta resolucion acoplada a espectrometria de masas (HPLC-MS). La GC-MS es la metodologia analitica elegida tradicionalmente para la separacion y determinacion (identificacion y cuantificacion) de volatiles presentes en matrices complejas. Ademas, para la determinacion simultanea de azucares, acidos organicos y aminoacidos en vegetales, tambien, se ha empleado el GC-MS, despues de la conversion de estos compuestos en sus correspondientes trimetil-silil (TMS) derivados, pero su determinacion en los zumos de citricos es mas bien escasa. En esta linea, el empleo de potentes plataformas de cromatografia liquida acoplada a masas (HPLC-MS) esta derivando hacia el analisis masivo de metabolitos en detrimento de su tradicional uso orientado unicamente hacia el estudio de compuestos especificos aislados. La alta sensibilidad de los sistemas de MS genera una inmensa cantidad de datos experimentales que necesita ser procesada adecuadamente. Hasta hace poco, este analisis se llevaba a cabo de forma manual o semi-automatica mediante el uso de algoritmos matematicos ofrecidos por los propios fabricantes de las diferentes plataformas de analisis (como XcaliburTM de Thermo Scientific). Estos antiguos algoritmos son, normalmente, bastante caros, tediosos y conlleva mucho tiempo el procesamiento de datos, e incluso podria llegar a ser casi imposible si los espectros adquiridos estan contaminados con iones de picos superpuestos, sangrado de columna o de contaminantes de la camara de ionizacion. Para superar este problema, la bioinformatica nos puede ayudar a llevar a cabo un procesamiento preciso. Idealmente, estos programas de analisis deben ser baratos, faciles de usar, versatiles, rapidos y capaces de deconvolucionar picos solapados, lo que proporcionara unos resultados fiables cualitativa y cuantitativamente. En este contexto, el National Institute of Standards and Technology-Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (NIST-AMDIS) es un software de descarga gratuita (http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/downloads) para el procesamiento de los datos obtenidos por GC-MS, que incorpora capacidades automaticas de alto rendimiento y funciona con casi cualquier archivo de datos de GC-MS, con independencia de su origen. NIST-AMDIS elimina los sesgados y deconvoluciona los iones del TIC (cromatograma de iones totales), extrae una serie de espectros de masas "limpias" ("components"), asi como sus correspondientes tiempos de retencion, e identifica los compuestos presentes en la muestra (? targets? ), haciendo coincidir el espectro de masas de los "componentes" y, opcionalmente, tambien sus tiempos de retencion, frente a una libreria de referencia, ya sea comercial, como es el caso de la libreria NISTTM, o construida por el propio operador. NIST-AMDIS se ha utilizado para la determinacion de marcadores urinarios en trastornos metabolicos, venenos y drogas, de contaminantes en el agua y hortalizas, de los esteroides en la matriz sedimentaria, de los compuestos polares y plaguicidas en hortalizas, y de compuestos volatiles en tomate. Por otro lado, la HPLC es la tecnica de separacion de sustancias mas ampliamente utilizada. Los sistemas HPLC-MS facilitan el analisis de muestras que tradicionalmente han sido dificiles de analizar por GC-MS es decir, analitos poco volatiles. Como resultado, la tecnica es ampliamente utilizada en el analisis de compuestos fenolicos. Los sistemas de ionizacion que han hecho posible este desarrollo son los sistemas API-EI y APCI. De esta forma se pueden analizar compuestos de peso molecular de hasta 100kDa, con un rango de polaridades que va desde analitos no polares hasta los muy polares. Los espectros de masas obtenidos por HPLC-MS suelen ser mas sencillos que los obtenidos en GC-MS debido a que el nivel de fragmentacion de las moleculas es menor. El inconveniente es que los espectros dependen parcialmente de los parametros de ionizacion, es decir, que no pueden ser considerados como ? huella dactilar? del compuesto y, por tanto, la comparacion con colecciones de espectros estandares no es posible. Por esta razon, la comparacion del espectro de masas de analitos con patrones debe realizarse en las mismas condiciones de trabajo. La continua tecnificacion de los sistemas LC-MS y el marketing desmesurado que llevan asociado, hace que en la actualidad amplios sectores de la investigacion tengan el falso convencimiento de que para desarrollar una actividad cientifica competitiva se tenga que recurrir exclusivamente a equipaciones muy complejas y extraordinariamente caras. Ademas, los distintos fabricantes en su afan por ampliar sus mercados tratan de convencer a los potenciales usuarios con sistemas completamente automaticos que trabajan practicamente de manera independiente del operador y sus conocimientos. Sin embargo, es deber de los investigadores, sobre todo de aquellos que utilicen recursos publicos, el tener que maximizar los resultados que puedan obtenerse mediante el empleo de los sistemas MS que esten a su disposicion. En este sentido, la formacion del investigador tanto en su conocimiento de base (background) asi como acerca de los equipos de analisis que este utilizando, es crucial para ejecutar acciones de indole cientifica de calidad. Estas consideraciones son aun mas relevantes si los equipos de analisis empleados son considerados ? obsoletos? frente a los nuevos sistemas de hoy en dia. Teniendo en cuenta todo lo anterior, la presente Tesis Doctoral plantea llevar a cabo una aproximacion metabolomica de diferentes extractos naturales mediante el empleo de ? veteranos? equipos de espectrometria de masas convencionales como lo son los detectores de tipo trampa ionica, tanto de liquido como de masas, de hace una decada. Asi pues, este trabajo trata de demostrar como con una formacion adecuada al respecto de la materia estudiada asi como de los equipos de analisis empleados se pueden llevar a cabo estudios de maxima calidad cientifica.