New insights into the MAPK function in meiotic progression and the regulation of osmostress-induced apoptosis in Xenopus oocytes

En el organismo modelo Xenopus laevis, los oocitos de estadio VI estan parados indefinidamente en la profase (G2/M) de la meiosis I hasta que se produce una adecuada estimulacion hormonal. Una red de regulacion positiva alrededor de la cascada Mos/MEK/ERK asegura la maduracion (GVBD) de los oocitos tras la estimulacion con progesterona. Sin embargo, el papel de las MAPK de estres JNK y p38 en la progresion meiotica no es tan claro. Aqui analizamos una proteina de 42 kDa detectada con anticuerpos pJNK (XpJNK-p42) que aparece alrededor del GVBD en oocitos tratados con progesterona. La expresion ectopica de MEKK1 constitutivamente activo acelera la maduracion de los oocitos mediante la activacion de las vias de senalizacion de p38 y ERK, pero no de la cascada JNK. Por otra parte, cuatro transcritos diferentes de JNK3 presentes en los oocitos no sintetizan proteina y no se activan durante la maduracion inducida por progesterona. El analisis de espectrometria de masas indica que XpJNK-p42 es en realidad ERK2 fosforilado. Curiosamente, el anticuerpo pJNK solo reconoce pERK2 en oocitos maduros pero no en oocitos expuestos al shock hiperosmotico, lo que sugiere que una modificacion post-traduccional de pERK2 tiene lugar durante la progresion meiotica. Es importante destacar que ni la sobreexpresion de ERK2 ni el inhibidor de JNK SP600125 afectan a la fosforilacion de c-Jun utilizando extractos de oocitos maduros. En conclusion, las proteinas JNK no estan involucradas en la maduracion de los oocitos de Xenopus, y la fosforilacion de c-Jun detectada en oocitos maduros es independiente de JNK y ERK2. Hemos descrito previamente que el shock hiperosmotico induce apoptosis en oocitos de Xenopus mediante la activacion de cuatro vias independientes: p38, JNK, calpainas y liberacion de Smac/DIABLO. Tambien hemos descrito que la activacion de p38, JNK1-1 y JNK1-2 es claramente pro-apoptotica. Sin embargo, varias horas despues del shock hiperosmotico la isoforma JNK1-2 desaparece, sugiriendo algun tipo de degradacion. Ademas, los estudios anteriores no consideraron el papel de los miembros de la familia de Bcl-2 en la apoptosis inducida por estres osmotico. Aqui mostramos que pJNK1-2 es proteolizada en Asp385 por caspasa-3, y que la proteina resultante acelera la liberacion del citocromo c y la activacion de caspasa-3, creando asi un bucle de retroalimentacion positiva. Tambien mostramos que la sobreexpresion de Bcl-xL en oocitos de Xenopus protege a estos de la apoptosis inducida por shock hiperosmotico. Los oocitos que expresan Bid en combinacion con Bcl-xL, presentan tres formas distintas de Bid: no ubiquitinada, mono- y biubiquitinada. Todas las formas de Bid se localizan en el citosol y la mitocondria. El shock hiperosmotico incrementa ligeramente, y de forma rapida, las formas mono- y biubiquitinadas de Bid en la mitocondria. Posteriormente, una pequena parte de Bid es proteolizada en Asp52, probablemente por una caspasa iniciadora, generando un fragmento N-terminal (nBid) y un fragmento C-terminal altamente pro-apoptotico (tBid). Cuando el citocromo c es liberado y se activa la caspasa-3 se produce una proteolisis masiva de Bid (formas no ubiquitinada y monoubiquitinada) en Asp52, mediada por caspasa-3, creando asi otro bucle de retroalimentacion positiva. Aunque algunos experimentos sugieren que la forma no ubiquitinada de Bid se proteoliza mas rapido y es mas pro-apoptotica que las otras formas, los efectos funcionales de la ubiquitinacion en la regulacion de la apoptosis no son tan claros. Sin embargo, la funcion pro-apoptotica de Bid se atenua notablemente en el mutante Bid-D52N, que no puede ser proteolizado por caspasas. En conclusion, la activacion de caspasa-3 inducida por shock hiperosmotico pone en marcha dos bucles de retroalimentacion positiva mediante la proteolisis de JNK1-2 y Bid, promoviendo asi la muerte irreversible de los oocitos.