Gene therapy approach on Charcot-Marie-Tooth type 1A rats

La myeline est une gaine formee par l’enroulement de la membrane plasmique de la cellule de Schwann autour de l’axone dans le nerf peripherique.Lorsque cette gaine est detruite, on parle de demyelinisation, cela provoque de nombreuses maladies, dont les maladies de Charcot Marie Tooth (CMT) de type 1.Les maladies CMT sont hereditaires et atteignent le systeme nerveux peripherique.Les symptomes communs incluent : une faiblesse musculaire, une demarche maladroite, des troubles de l’equilibre et des pieds tres cambres ou tres plats. Le type le plus frequent est la forme autosomique dominante CMT1A.Une duplication du bras court du chromosome 17 contenant le gene PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) induit la CMT1A. La PMP22, une petite proteine exprimee par les cellules de Schwann, est donc en exces et entraine une demyelinisation. Il existe un modele de rats transgeniques PMP22 (ou rats CMT1A) mimant cette pathologie humaine. Les rats CMT1A surexpriment la pmp22 de souris de facon heterozygote. Jusqu’a present, aucun remede n’existe pour les maladies CMT. Un des traitements envisageables est la therapie genique.Le but de mon projet de these etait d’etudier la validite et l'efficacite de la therapie genique chez les rats CMT1A.La strategie consiste a reduire la surexpression de la proteine PMP22 chez le rat CMT1A a l’aide d’ARNsh anti-PMP22. Pour ne pas etre detruits par l’organisme et maintenir une expression longue, ces ARN sh-PMP22 sont transferes chez le rat grâce a des vecteurs viraux derives de virus adeno-associes, ou AAV (pour adeno-associated virus). Nous avons donc injecte un des differents serotypes d'AAV,l'AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 de souris ainsi que la GFP comme marqueur des cellules infectees dans les nerfs sciatiques de rats CMT1A a l’âge de 6 jours ou 7 jours.Nous avons d’abord confirme que les virus therapeutiques infectaient une tres large proportion de cellules de Schwann dans le nerf sciatique de rat CMT1A et ensuite que l’infection de ces cellules par les virus exprimant les ARN sh-PMP22 induisait une diminution significative de l’expression de la proteine PMP22. L'analyse du phenotype moteur des rats CMT1A traites avec les AAV9 exprimant les ARN sh-PMP22 montre que les rats CMT1A traites ne developpent pas la maladie observee dans les controles. Egalement, les rats CMT1A presentent une hypoalgesie, un phenotype qui n’apparait pas dans les CMT1A traites avec les vecteurs therapeutiques. Le traitement par therapie genique empeche la reduction de la vitesse de conduction nerveuse observe dans les rats malades. Concernant la biodistribution des virus, 2,5 mois apres le traitement, en dehors des nerfs sciatiques ou les virus ont ete injectes, le virus etait present dans les muscles qui entourent le nerf et aussi dans quelques ganglion dorsaux. Pour la reponse immunitaire,les rats injectes, a seulement 2 exceptions pres, n’ont pas developpe de facteurs neutralisants anti-AAV9. Cette therapie genique pourrait etre utilisee dans les essais cliniques.Avant de passer aux etudes cliniques pour le traitement de la maladie CMT1A a l’aide d’AAV9 exprimant des ARN sh-PMP22 humain, la dose d’expression de ce ARN sh-PMP22 doit etre tres soigneusement determinee car si la PMP22 est trop reduite, une autre maladie peut se developper, la neuropathie hereditaire avec hypersensibilite a la pression. Il est aussi important d’avoir un outil bien adapte qui permet d’evaluer l’efficacite du traitement. Aucun existant n’est assez fiable pour mesurer la myeline du nerf peripherique. Pour remedier a ce manque, nous avons teste la technique d'imagerie Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) en caracterisant avec succes les defauts de la myeline. Par consequent, le CARS est une technique prometteuse permettant d’evaluer l’avancement des maladies de la myeline et l’efficacite de nouvelles therapies pour les neuropathies peripheriques demyelinisantes.