Detection and Differentiation of CVI988 (Rispens Vaccine) from Other Serotype 1 Marek's Disease Viruses

SUMMARY The serotype 1 Marek's disease virus (MDV) is the causative agent for Marek's disease (MD), a lymphoproliferative disease of chickens of great concern to the poultry industry. CVI988 (Rispens vaccine), an attenuated serotype 1 MDV, is currently the most efficacious commercially available vaccine for preventing MD. However, it is difficult to detect and differentiate CVI988 when other serotype 1 MDVs are present. To facilitate the detection of CVI988, we developed two sets of primers for a mismatch amplification mutation assay (MAMA) PCR that targeted the single nulceotide polymorphism associated with the H19 epitope of the phosphorylated protein 38 gene. The PCR was very specific. One primer set (oncogenic primers) amplified DNA from 15 different serotype 1 MDVs except CVI988. The other primer set (CVI988 primers) amplified DNA from CVI988 but not from any of the other 15 serotype 1 MDVs. A real-time PCR assay was developed using MAMA primers, and specificity and sensitivity was evaluated in vitro and in vivo. Mixtures of plasmids (CVI988 plasmid and oncogenic plasmid) at various concentrations were used to evaluate the sensitivity/specificity of MAMA primers in vitro. Both primer sets were able to amplify as little as one copy of their respective plasmid. Oncogenic primers were highly specific and only amplified CVI988 plasmid when the concentration of oncogenic plasmid was very low (1 × 101) and CVI988 plasmid was very high (1 × 106). Specificity of CVI988 primers was not as high because they could amplify oncogenic plasmids when the concentration of CVI988 plasmid was 1 × 103 and the concentration of oncogenic 1 × 102. Validation of MAMA primers in in vivo samples demonstrated that oncogenic primers can be used for both early diagnosis of MD in feather pulp (FP) samples collected at 3 wk of age and confirmation of MD diagnosis in tumors. CVI988 primers could be used to monitor CVI988 vaccination in samples with a low load of oncogenic MDV DNA (latently infected samples or negative) but not in samples with a high load of oncogenic MDV DNA (tumors). Our results suggest that monitoring CVI988 vaccination in FP samples collected at 1 wk of age ensures the specificity of the CVI988 primers. RESUMEN Detección y diferenciación de la cepa CVI988 (Rispens Vacuna) de otras cepas del virus de la enfermedad de Marek pertenecientes al serotipo 1. El serotipo 1 del virus de la enfermedad de Marek (MDV) es el agente causal de la enfermedad de Marek (MD), que es una enfermedad linfoproliferativa de los pollos de gran importancia para la industria avícola. La cepa CVI988 (vacuna Rispens), una vacuna atenuada del serotipo 1 del virus de Marek, es actualmente la vacuna más eficaz disponible comercialmente para prevenir la enfermedad de Marek. Sin embargo, es difícil de detectar y diferenciar la cepa CVI988 cuando otros virus de Marek del serotipo 1 están presentes. Para facilitar la detección de la cepa CVI988, se desarrollaron dos conjuntos de iniciadores para un ensayo de PCR para la amplificación de mutaciones por discrepancia de nucleótidos (con las siglas en inglés MAMA), dirigido al polimorfismo de nucleótido simple asociado con el gene del epítope H19 de la proteína fosforilada (PP) 38. El método de PCR fue muy específico. Un conjunto de iniciadores (primers oncogénicos) amplificó el ADN de 15 virus diferentes pertenecientes al serotipo 1 excepto la cepa CVI988. El otro conjunto de iniciadores (primers CVI988) amplificó el ADN de la cepa CVI988 pero ninguno de los otros 15 virus incluidos en el serotipo 1. Un ensayo de PCR en tiempo real fue desarrollado usando los iniciadores del ensayo MAMA y se evaluó la especificidad y sensibilidad in vitro e in vivo. Se usaron mezclas de plásmidos (plásmido CVI988 y el plásmido oncogénico) con varias concentraciones para evaluar la sensibilidad/especificidad de los iniciadores MAMA in vitro. Ambos conjuntos de iniciadores fueron capaces de amplificar hasta una copia de su respectivo plásmido. Los iniciadores oncogénicos fueron altamente específicos y solo amplificaron al plásmido CVI988 cuando la concentración del plásmido oncogénico fue muy baja (1 × 101) y la concentración del plásmido CVI988 era muy alta (1 × 106). La especificidad de los iniciadores para la cepa CVI988 no fue muy alta, ya que pudieron amplificar plásmidos oncogénicos cuando la concentración de plásmido CVI988 fue de 1 × 103 y la concentración de los plásmidos oncogénico fue de 1 × 102. La validación de los iniciadores MAMA en muestras in vivo demostró que los iniciadores oncogénicos se pueden utilizar tanto para el diagnóstico precoz de la enfermedad de Marek en muestras de pulpa de la pluma (FP) recolectadas a las tres semanas de edad y para el diagnóstico confirmatorio de la enfermedad de Marek en tumores. Los iniciadores CVI988 podrían utilizarse para el seguimiento de la vacunación CVI988 en muestras con una baja carga de ADN del virus oncogénico del virus de Marek (muestras infectadas de forma latente o negativas), pero no en las muestras con una alta carga de ADN del virus oncogénico de Marek (tumores). Estos resultados sugieren que el seguimiento de la vacunación con la cepa CVI988 en muestras de pulpa de la pluma recolectadas en la primera semana de edad asegura la especificidad de los iniciadores CVI988.