Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patogenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud publica, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas mas importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicacion de controles microbiologicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infeccion de los consumidores. Los metodos microbiologicos clasicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmacion posterior usando pruebas basadas en la morfologia, bioquimica y serologia propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos metodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, ademas, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologias alternativas para la deteccion identificacion y cuantificacion de microorganismos patogenos de origen alimentario, entre las que destacan los metodos inmunologicos y moleculares. En esta ultima categoria, la tecnica basada en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la tecnica diagnostica mas popular en microbiologia, y recientemente, la introduccion de una mejora de esta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolucion en la metodologia diagnostica molecular, como pude observarse por el numero creciente de publicaciones cientificas y la aparicion continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una tecnica altamente sensible -deteccion de hasta una molecula- que permite la cuantificacion exacta de secuencias de ADN especificas de microorganismos patogenos de origen alimentario. Ademas, otras ventajas que favorecen su implantacion potencial en laboratorios de analisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatizacion y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado tecnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la deteccion, identificacion y cuantificacion de bacterias patogenicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han disenado y optimizado metodos basados en la tecnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y tambien se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un metodo previamente desarrollado para Salmonella spp. Ademas, se ha disenado y optimizado un metodo basado en la tecnica NASBA para la deteccion especifica de M. avium subsp. paratuberculosis. Tambien se evaluo la aplicacion potencial de la tecnica NASBA para la deteccion especifica de formas viables de este microorganismo. Todos los metodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicacion potencial a muestras reales de alimentos. Ademas, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparacion de las muestras en productos carnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado metodos basados en la PCR a tiempo real totalmente especificos y altamente sensibles para la determinacion cuantitativa de L. monocytogenes en productos carnicos y en salmon y productos derivados como el salmon ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Ademas este ultimo metodo ha sido tambien aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohns, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusion, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la deteccion de patogenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rapida e inambigua identificacion de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los metodos microbiologicos de referencia y pueden serusados para la cuantificacion de tanto ADN genomico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinacion con tratamientos de preamplificacion ha resultado ser de gran eficiencia para el analisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia util para la deteccion rapida y sensible de patogenos en alimentos y deberian ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnosticas disponibles para el estudio de patogenos de origen alimentario.