Biochemical and structural characterization of preformed EGF receptor dimers

Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) sind eine Gruppe von Proteinen, die in die Plasmamem- bran eingebettet und fur die Zell-Signalisierung verantwortlich sind. Im Menschen umfassen RTK 59 Gene,die in 20 Familien eingeteilt werden. Dazu gehort die Familie der Epidermalen-Wachstumsfaktor-Rezeptoren (ErbB oder HER), die wiederum aus vier Mitgliedern besteht: EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2/Neu, ErbB3/HER3 und ErbB4/HER4. Diese binden unterschiedliche Liganden und bilden eine Reihe von Homo- und Heterodimeren um verschiedene zellulare Antworten hervorzurufen. ErbB-Rezeptoren sind verantwortlich dafur, Signalisierung durch Liganden-induzierte Dimerisierung auszulosen und sind in Signalnetzwerke involviert, die mit Zellwachstum und Zelldifferenzierung in Verbindung gebracht werden. Viele Mutationen der ErbB- Rezeptoren fuhren zu Zelltransformation und Krebs. Obwohl vieles uber die Struktur und Aktivierung der ErbB-Rezeptoren bekannt ist, fehlt ein komplettes Bild der molekularen Mechanismen, die zu einer Umwandlung extrazellularer in intrazellulare Signale fuhren (der Aktivierung der Kinase-Domanen). Ein Teil der ErbB-Rezeptoren in der Plasmamembran konnen bei Abwesenheit von Liganden die Form von vorgeformten, nicht-kovalent verbundenen Dimeren annehmen. Im Fall von EGFR bindet der Rezeptor in vivo Liganden mit zwei Affinitaten. Bei einer Aufreinigung des Rezeptors bleibt allerdings nur die Komponente mit niedriger Affinitat ubrig. Es wird vermutet, dass die hohe Affinitatsbindung und die vorgeformten Dimere in einem Zusammenhang stehen und eine Art negative Kooperativitat aufweisen. Aus diesem Grund entwickelte ich eine Methode, die es erlaubt, die strukturelle sowie biochemische Charakterisierung der vorgeformten EGFR-Homodimere durchzufuhren. Die Schwierigkeit lag darin, ein Werkzeug einzufuhren, das die Reinigung der vorgeformten Dimere ermoglicht, ohne auf die Zusetzung kovalenter Modifikationen zuruckgreifen zu mussen, welche die inharente Flexibilitat und Struktur der Rezeptoren verhindern. In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die es erlaubt, die EGF-Rezeptoren bei Abwesenheit der Liganden in einem dimerisierten Zustand wahrend des Reinigungsprozesses zu erhalten. Dieses Werkzeug besteht aus einem de novo konstruierten heterodimerischen ”coiled-coil” (Doppelwenden), das E3/K3 genannt wird. Dieses Paar wurde bereits beschrieben, jedoch noch nicht zu einem Protein fusioniert. Aus diesem Grund testete ich das Verhalten des E3/K3 Paares mit Hilfe der fluoreszierenden Proteinen Venus und ECFP. Durch die Verwendung von Affinitatsreinigungs- und Gelfiltrationstechniken sowie von FRET zeige ich, dass das E3/K3 Paar sehr gut fur die Heterodimerisierung zweier Proteine geeignet ist. Es ist auserordentlich spezifisch und die Interaktion halt dem Reinigungsprozess stand. Anschliesend wurde das E3/K3 Dimerisierungsmodul in EGF-Rezeptoren transplantiert und in CHO-Zellen exprimiert. Die Ergebnisse zeigen, dass EGFR auch bei Abwesenheit des Liganden in dimerischer Form gereinigt werden und weiterhin in vitro Liganden binden kann, ohne Tyrosinkinase-Aktivitat zu verlieren. Auserdem ist die Probe extrem rein und es kann fur strukturelle Studien mit Single-Particle-Negative- Staining benutzt werden. Ich stelle eine dreidimensionale Rekonstruktion eines vorgeformten EGFR Homodimers vor wobei (soweit bekannt) zum ersten Mal eine in der vollen Lange RTK gezeigt werden kann. Uberraschenderweise zeigt der vorgeformte EGFR Dimer Ektodomanenasymmetrie. Eine der Ektodomanen scheint eine ”tethered” (angebundene) Konfiguration aufzuweisen, wahrend sich die andere in einem freieren Zustand befindet. Da die Anwesenheit struktureller Heterogenitat in den Ektodomanen auf die Moglichkeit zweier verschiedener Bindungsstellen deutet, fuhrte ich Ligandenbindung-Assays mit den gereinigten EGFR Dimeren durch. Das Scatchard- Diagramm zeigt eine kurviliniare, konkave Form, die charakteristisch fur in vivo EGFR- Ligandenbindung ist. Es ist daher wahrscheinlich, dass die Ektodomanenasymmetrie direkt in Heterogenitat der Bindungsstellen ubersetzt wird, was wiederum die zwei Affinitaten generiert, die in vivo zu sehen sind. Das ist das erste Mal, dass ein solches Scatchard-Diagramm mit gereinigten EGF-Rezeptoren vorgestellt wird. In dieser Arbeit zeige ich eine unerwartete Architektur des vorgeformten EGFR Dimers. Anstatt symmetrische Dimer zu formen, gehen die Ektodomanen vor der Ligandenbindung in asymmetrischer Weise zusammen. Wir hoffen, dass sich diese Entdeckung als nutzlich fur die zukunftige Entwicklung von Medikamenten bei der Krebsbehandlung zeigt sowie Aufschluss uber die allgemeinen Mechanismen der Signaltransduktion –nicht nur von ErbB, sonder auch von anderen Rezeptoren – geben kann.