Oligonukleotidi

Oligonukleotidi ni molekuli fupi za Asidi DeoksiriboNukleini (ADN) au Asidi RiboNukleini (ARN), zilizo na matumizi mbalimbali kama vile katika upimaji wa vinasaba, utafiti na biolojia ya ujasusi. Molekuli hizi hutengenezwa katika maabara kwa usanisi wa kemikali wa solid-phase.  Aidha, zinaweza kutengenezwa kama molekuli zenye strandi moja kwa kuzingatia mfuatano  ulioagizwa na mtumiaji,hivyo basi ni muhimu katika usanisi wa jeni bandia, polymerase mnyororo mmenyuko (PCR), utambuzi mpangilio wa DNA, molecular cloning na kama molecular probes . Katika viumbehai, oligonukleotidi hupatikana kama molekuli ndogo za RNA zinazotumika katika udhibiti wa utengenezaji wa protini kutokana na taarifa iliyopo kwenye jeni (km microRNA ). 

Oligonukleotidi huundwa kwa mpangilio maalum wa nukleotidi . Urefu wa molekuli hizi huonyeshwa kwa " -mer " (kutoka kwa Kigiriki, meros, "sehemu"). Kwa mfano, oligonukleotidi ya nukleotidi (nt) sita  ni heksama, ilhali ya ishirini na tano kwa kawaida huitwa "25-mer". Oligonukleotidi huambata oligonukleotidi zingine mfano wa DNA au RNA , kwa utaratibu mahususi, ili kuunda dupleksi.  Sifa hii ya oligonukleotidi ndio msingi wa matumizi yake kama probes katika kugundua mfuatano maalum wa DNA au RNA. Mifano ya taratibu zinazotumia oligonukleotidi ni pamoja na  DNA microarray, Southern blot, uchambuzi wa oligonukleotidi antisensi,  fluorescent in situ hybridization ( FISH), PCR, na usanisi wa jeni bandia.

Oligonukleotidi huundwa kwa 2'-deoksiribonukleotidi (oligodeoksiribonukleotidi), ambazo zinaweza kurekebishwa kwenye uti wa mgongo au kwenye nafasi ya 2' ya sukari  ili kuafikia athari tofauti tofauti za kifamasia. Marekebisho haya hupatia oligonukleotidi sifa mpya na kuzifanya kuwa kipengele muhimu katika tiba ya antisense .

Usanisi 
Oligonukleotidi hutengenezwa kwa usanisi kemikali unaotumia vitalu vya ujenzi kama vile protected phosphoramidites za asili au nukleosidi zilizoboreshwa kikemikali.  Ujenzi  wa mnyororo wa oligonukleotidi huendelea katika mwelekeo wa 3' hadi 5' kwa kufuata utaratibu wa kawaida unaojulikana kama "synthesis cycle". Kukamilika kwa mzunguko mmoja wa sintetiki husababisha kuongezwa kwa nukleotidi kwenye mnyororo unaokua. Mavuno chini ya 100% ya kila hatua ya syntetiki na tukio la mmenyuko ya upande huwa athari katika ufanisi wa mchakato huu. Kwa kawaida, mlolongo wa oligonukleotidi huwa mfupi (urefu wa nukleotidi 13-25 ).  Nukleotidi 200, mara nyingi, huwa urefu wa juu zaidi wa oligonukleotidi syntetiki. HPLC na njia zingine zinaweza kutumika kutenga oligonukleotidi zilizo na mlolongo wa nukleotidi unaofaa.

Marekebisho ya kemikali 
Kuunda oligonukleotidi fupi fupi zenye uimara wa kemikali ndiyo iliyokuwa changamoto ya kwanza katika kutengeneza tiba za ASO. Oligonukleotidi za asili huharibiwa kwa urahisi na nucleases, vimeng'enya ambavyo hupasua nukleotidi na vinapatikana kwa wingi katika kila aina ya seli.  Oligonukleotidi fupi pia huwa na mshikamano dhaifu, jambo ambalo huchangia kwa kuharibiwa kwake in vivo.

Marekebisho ya uti wa mgongo 
Nukleotidi za nukleosidi organothiophosphate (PS) analogs hupatia oligonukleotidi baadhi ya sifa za manufaa. Sifa hizi kuu zinazotokana na uti wa mgongo wa PS kwenye nukleotidi ni utambuzi wa diastereomer kwa kila nukleotidi na uwezo wa kufuatilia kwa urahisi mimenyuko inayohusisha nukleotidi za phosphorothioate, ambayo ni muhimu katika usanisi wa oligonukleotidi.  Maboresho ya uti wa mgongo wa PS hulinda oligonukleotidi dhidi ya uharibifu usiohitajika na vimeng'enya.  Uboreshaji wa uti wa mgongo wa nukleotidi hutumiwa sana kwa ajili ya kuafikiwa kwake  kwa urahisi na usahihi kwenye nukleotidi nyingi.   Kuunganishwa kwa fluorescent kwenye mwisho wa 5' na 3' ya oligonukleotidi yaliripotiwa kutathmini miundo, mienendo na mwingiliano wake kwenye mazingira.

Marekebisho ya pete ya sukari 
Uboreshaji mwingine ambao ni muhimu katika matumizi ya matibabu ya oligonukleotidi ni marekebisho ya 2' ya sukari . Kurekebisha sukari katika nafasi ya 2' huongeza ufanisi wa oligonukleotidi kwa kuongeza uwezo wa kufungamana na oligonukleotidi lengwa, haswa katika tiba za oligonukleotidi antisensi .  Pia hupunguza mshikamano na protini zisizo maalum, na kuongeza usahihi wa uhusiano na protini maalum lengwa .  Marekebisho mawili kati ya yanayotumika sana ni 2'-O-methyl na 2'-O-methoxyethyl.  Marekebisho ya fluorescent kwenye nukleobesi pia yaliripotiwa.

Oligonukleotidi Antisensi 
Oligonukleotidi Antisensi (ASO) ni strandi moja za DNA au RNA zilizo na uwezo wa kushikamana na mpangilio fulani wa DNA au RNA uliochaguliwa.  Katika antisense RNA wao huzuia utengenezwaji wa protini kutoka wa strandi fulani za mjumbe RNA  kwa kuzifungama, katika mchakato uitwao  hybridization .  Oligonucleotidi za Antisense zinaweza kutumika kulenga RNA maalum. Ikiwa ufungamanaji utafanyika, hybrid hii inaweza kuharibiwa na kimeng'enya RNase H .  RNase H ni kimeng'enya ambacho hufanya RNA hidrolisisi, na inapotumiwa katika oligonukleotidi ya antisensi husababisha kupungua kwa kutengenezwa kwa protini kutoka kwa mRNA kwa kiwango cha 80-95%. 

Janet Heasman ndiye aliyekuwa mwanzilishi wa matumizi  ya oligonukleotidi za Morpholino antisensi katika kunyamazisha jeni kwenye wanyama wenye uti wa mgongo, kwa kutumia Xenopus .   Oligonukleotidi hizi  sasa ni mbinu za kawaida katika developmental biology na zinatumiwa kuchunguza mabadiliko ya usemi na utendakazi wa jeni. Dawa za Morpholino zilizoidhinishwa na FDA ni pamoja na eteplirsen na golodirsen . Oligonukleotidi za antisense pia zimetumiwa kuzuia replication ya virusi vya mafua katika seli.  

Magonjwa ya neurodegenerative yanayo sababishwa na protini mutant ni malengo mazuri ya matibabu ya oligonukleotidi antisensi kwa sababu ya uwezo wao wa kulenga na kurekebisha mlolongo maalum wa RNA na kwa uteuzi wa hali ya juu.  Magonjwa mengi ya jenetika ikiwa ni pamoja na ugonjwa wa Huntington, ugonjwa wa Alzeheimer's, ugonjwa wa Parkinson, na ugonjwa wa amyotrophic lateral sclerosis (ALS) yamehusishwa na mabadiliko ya DNA ambayo husababisha mfuatano usio sahihi wa RNA na protini zilizotafsiriwa vibaya ambazo huwa na athari mbaya za kifiziolojia.

Uingiaji katika Seli 
Kikwazo kikuu katika ufanisi wa tiba ya oligonukleotidi ni uchukuaji kwenye seli/uingiaji wa oligonukleotidi katika seli . Uingiaji wa moja kwa moja, kama vile wa dawa nyingi za molekuli ndogo, huzuiwa na uti wa mgongo wa polyanionic na ukubwa wa molekuli ya ON. Mbinu kamili za uchukuaji oligonukleotidi na usafirishaji wake ndani ya seli kuelekea mahali lengwa ili kuleta athari ya tiba bado hazijaelezwa kwa kina. Aidha, tofauti chache katika muundo/uboreshaji wa ON (vide supra) na aina tofauti ya seli huwa na athari kubwa katika uingiaji wa seli. Inaaminika kuwa uchukuaji wa seli hufanyika kwa njia tofauti tofauti baada ya adsorption ya ON kwenye surface ya seli. Tafiti zinaonyesha kwamba seli nyingi za tissue culture huchukua ASOs (uhusiano wa phosphorothiote) kwa njia zisizo na manufaa, ambayo matekeo yake ni kukosekana kwa athari ya antisense inayotarajiwa. Hii ni kinyume na muunganisho wa ASO na ligandi zinazotambuliwa na G-coupled receptors ambazo husababisha kuongezeka kwa uchukuzi uliyo na athari tarajiwa .  Kando ya uainishaji huo, uingiaji ndani ya seli mara nyingi huendelea kwa njia inayotegemea nishati (receptor mediated endocytosis) lakini passive diffusion isiyo hitaji nishati (=gymnosis) pia huweza kutumika. Baada ya kupita utando wa seli, ON huingia kwenye early endosomes  ambazo husafirishwa kuelekea late endosomes  ambazo hatimaye huunganishwa na lysosomes zilizo na vimeng'enya vya uharibifu katika pH ya chini.  Ili kutekeleza utendakazi wake wa matibabu, ON inahitaji kuepuka endosome kabla ya kuharibiwa . Hadi wa leo hakuna njia ya jumla ya kushinda  matatizo ya ufikishaji wa ON katika sehemu lengwa, uchukuaji wa seli na uepukaji kwa endosomes lakini kuna mbinu kadhaa ambazo daima hulengwa kwa seli maalumu (pamoja na receptors zao). 

Muunganisho wa tiba za ON kwa huluki inayohusika na utambuzi/uchukuaji wa seli sio tu huongeza uingiaji (vide supra) bali pia huaaminika kupunguza utata wa uchukuaji wa seli kwani utaratibu mmoja (unaojulikana zaidi) huhusika.  Hili limeafikiwa na viunganishi vidogo vya molekuli-ON kwa mfano vyenye N-acetyl galactosamine ambayo hulenga receptors za  hepatocytes .  Viunganishi hivi ni mfano bora wa kupata ongezeko la uchukuaji wa seli uliunganishwa na uwasilishaji kwani receptors huwa nyingi kupita kiasi kwenye seli lengwa  (linganisha antibody-drug  conjugates ambavyo hutumia receptors zilizonyingi kupita kiasi kwenye seli za saratani).  Antibodies zimetumika sana na kufanyiwa utafiti mkubwa kuhusiana na ufikishaji wa ON katika sehemu lengwa na kuongezeka kwa uchukuzi wazo kwenye seli.

Mbinu za uchambuzi

Chromatografia 
Alkylamides zinaweza kutumika kama chromatographic stationary phases.  Awamu hizo zimechunguzwa kwa utenganishaji wa oligonukleotidi.  Ion-pair reverse-phase high-performance liquid chromatography hutumiwa kutenganisha na kuchanganua oligonukleotidi baada ya usanisi otomatiki.

Mass spectrometry 
Mchanganyiko wa asidi 5-methoxysalicylic na spermine unaweza kutumika kama matrix  kwenye uchanganuzi wa oligonukleotidi katika MALDI mass spectrometry .  ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) pia ni kifaa chenye nguvu katika kubainisha ratili ya oligonucleotidi.

Microarray ya DNA 
DNA microarrays zina matumizi muhimu ya uchambuzi wa oligonukleotidi. Zikilinganishwa na cDNA microarrays, microarrays za oligonukleotidi zina umaalum uliodhibitiwa zaidi kuliko hybridization, na uwezo wa kupima uwepo na kuenea kwa alternatively spliced au poliadenylated sequences.  Aina moja ndogo ya DNA microarrays inaweza kuelezewa kuwa substrates (nylon, kioo, nk) ambapo oligonukleotidi zimeshikiliwa kwa msongamano mkubwa.  Kuna idadi ya matumizi ya DNA microarrays katika sayansi ya maisha.

Marejeo

Kusoma zaidi

Viungo vya nje 
 RNAi Atlas : hifadhidata ya maktaba za RNAi na matokeo yao ya uchanganuzi lengwa
 physorg.com | Chanzo cha maumbile cha dystrophy ya misuli kilichopunguzwa

Kemia