Le Rein, site d’implantation en Biocompatibilité
= Les auteurs =
Suggestion pour les auteurs : Naim S. 1, Grégoire G. 2, Allabouch A. 1, Salmon R. 3, Colat-Parros J. 4, Meunier J.M. 5.
= Résumés =
En français.
De nombreux sites d’implantation sont définis pour tester la biocompatibilité des matériaux utilisés en odontologie, ce travail propose le rein du rat : un site original par sa structure et sa situation. La zone sous capsulaire rénale juxtapose des éléments conjonctifs (capsule rénale) et des éléments épithéliaux (les tubes rénaux). On y trouve donc les deux types de structures histologiques existant dans la gencive.
La zone sous capsulaire rénale soulevée à l’aide d’une pince à griffes est incisée sur une longueur de x mm, au tiers supérieur de l’organe, dans sa région postérieure et dorsale. À l’aide d’une spatule mousse, la capsule est décollée du parenchyme rénal jusqu’au niveau du tiers inférieur, sur une surface de y mm² (x et y dépendent de la nature et des dimensions de l’implant) ; dans l’espace ainsi délimité, on inclut l’implant. Les réactions entre les tissus et l’implant peuvent être appréciées au terme de l’expérimentation avec les techniques les plus précises.
Dans cette étude nous proposons un modèle biologique expérimental avec l’implantation d’implants en phosphate tricalcique sous la capsule du rein du rat pour une période allant de 1 à 6 mois. Le mode de préparation des implants et la technique chirurgicale sont exposés. L’étude histologique prouve que le phosphate tricalcique utilisé est biocompatible, biorésorbable et bioréactif. Ce travail nécessite des investigations supplémentaires utilisant d’autres animaux et un site osseux. 
En anglais, abstract.
A lot of sites are definite for testing dental materiel biocompatibility, this study purpose the kidney of rat. This site is original because of its situation and its structure. On the kidney, the adrenal gland is made off both connective (capsule) and epithelial structure (renal tubes), the same sort of structures which can be also find in genciva.
The adrenal gland is lifted, a x mm long incision made (on the upper third part and the back of dorsal part of the organ), then the capsule is unlined from the renal parenchyma to the lower third part. An area of about y mm2 is cleared on which the implant is inserted (x and y depend of implant nature and its measurements).The reaction between implant and tissues can be observed after the experimentations with the must precise technics.
We purpose a biological model experimental with the implantation of a tricalcium phosphate under kidney capsule of rat for up to one month to six month. In this study preparation of implant and surgical ethnic are exposed. The histological study improve that tricalcium phosphate used is biocompatible, bioresorbable and bioreactif. This study must be completed by other investigation using other animals and a bone site. 
= Introduction =
Pendant les dernières décennies, l'utilisation des matériaux implantés reposait sur des notions empiriques, trop souvent déduites d'échecs cliniques. De nos jours, l'utilisation d'un matériau n'est envisageable qu'après analyse des réponses à un certain nombre de tests normalisés ; si les notions physiques ont été la préoccupation majeure au départ, la biocompatibilité prend actuellement une place prépondérante et exige un certain nombre d'essais découlant de la complexité biologique (12, 14). Le concept de biocompatibilité oblige à un protocole expérimental. Cependant le coût élevé des différents tests a souvent contraint les auteurs à ne réaliser que des expérimentations in vitro (14). « À défaut de moyens, il faut faire des calculs », nous avons exploité cet adage pour proposer une expérimentation in vivo sur le rat albinos de souche Wistar. Nous avons choisi un site profond (la zone sous capsulaire rénale) pour étudier la tolérance tissulaire d'un phosphate tricalcique.
La justification du choix du rat albinos, de souche Wistar, sélectionné à partir d'une lignée consanguine, s’appuie sur la facilité d’entretien normalisé d’animaux sociables, joueurs et apprivoisés, de faible poids, capables de se reproduire rapidement en captivité dans des conditions parfaitement définies de température, d’humidité et d’éclairage.
La croissance continue de l’animal peut entraîner des déplacements de l’implant s’il est mis dans une zone labile, ce qui est le cas des muscles para-vertébraux. C’est pour cela que la zone sous capsulaire rénale a particulièrement retenu notre intérêt en raison de sa situation profonde, de son accès relativement aisé et de sa double structure épithélio-conjonctive comparable à celle que l’on trouve au niveau de la gencive. 
Notre étude vise à élaborer un modèle d’essai biologique in vivo au niveau de la zone sous capsulaire rénale du rat en vue d’étudier le comportement in vivo d’un produit destiné à la thérapeutique en chirurgie.
Dans ce travail, l'exposé de la technique utilisée précise :
Une question se pose : les réactions inflammatoires observées au niveau de ce site après implantation de biomatériaux pendant un mois (1), vont-elle persister ou bien laisser place à un site parfaitement cicatrisé ?
= La biocompatibilité =
Définition.
Il est bien difficile de définir la biocompatibilité du fait de sa complexité. Un biomatériau est qualifié de biocompatible quand sa mise en place n'a aucune conséquence néfaste pour le receveur, à court, à moyen et à long terme, et lorsqu'il assure parfaitement le rôle qui lui est dévolu, sans perturber les fonctions des organes avec lesquels il est en relation (5).
Il faut distinguer la notion de bio-compatibilité de celle de « tolérance biologique ».
Il y a quelques années le Professeur Marcel Jozefowicz proposait de définir les biomatériaux comme des « matériaux appelés à travailler sous contrainte biologique » (5) (12).
La biocompatibilité est fonction non seulement de la nature constitutive des matériaux, mais encore de la géométrie de la pièce, de son état de surface et de ses caractéristiques physico-chimiques (5-12).
Évolution du concept de biocompatibilité.
Pendant longtemps, l'attitude dominante a été d'utiliser pour la confection de matériels implantables des matériaux initialement conçus pour d'autres applications.
Cette situation n'a pas pleinement satisfait les spécialistes qui préfèrent une véritable symbiose entre l'hôte et l'implant. Ils ont donc cherché des matériaux réellement biocompatibles, comme les matériaux de prothèses orthopédiques qui peuvent être colonisés par les cellules osseuses (5-12).
Facteurs de bio-compatibilité liés au matériau.
Les essais de bio-compatibilité doivent permettre d'évaluer la sécurité, l'efficacité et la durée de vie des matériaux. La servitude biologique soumet l'implant au vieillissement et à la dégradation ; il importe donc de veiller à ce que ses propriétés initiales ne soient pas altérées.
La bio-compatibilité est essentiellement liée au matériau, aux conditions de son utilisation et à son environnement immédiat (5). Cependant les variations des conditions physico-chimiques de l'environnement de l'implant peuvent faire varier cette propriété. L'exemple du pH salivaire est significatif à cet égard ; il joue un rôle très important dans la durée de vie d'un implant, les recherches menées par Sandhaus décèlent des salives acides et des salives alcalines. Toute pathologie au niveau d'une des glandes salivaires peut entraîner un changement de pH et par là même favoriser des réactions néfastes pour l’organisme.
Les essais de biocompatibilité.
Généralités.
La composition chimique de l'implant joue un rôle essentiel dans son interaction avec les tissus. Elle doit être connue de façon la plus complète possible (5).
La prise en compte de la composition du matériau, des impuretés éventuelles ainsi que des produits de dégradation susceptibles de se former et d'être "relargués" est nécessaire à l'interprétation des résultats des essais biologiques (5). D'autres facteurs peuvent influencer l'interaction entre matériaux et tissus :
- l'importance de la surface relative du dispositif,
- la structure poreuse ou non du matériau,
- la forme géométrique,
- le caractère répétitif ou non du contact du tissu avec le même dispositif, etc.
Les essais de biocompatibilité ne sont proposés qu'en relation avec les objectifs poursuivis. Ils doivent tenir compte de l'utilisation clinique finale, du temps de contact et du site d'implantation (5)
Les divers essais (normes AFNOR).
- essai de cytocompatibilité,
- essai d'hémocompatibilité,
- pouvoir mutagène,
- test de toxicité générale,
- essai d'irritation de la peau,
- essai d'irritation de la muqueuse,
- essai de sensibilisation,
- essai d'implantation à court terme,
- essai d'implantation à long terme,
- pouvoir cancérigène,
- autres essais : risques viraux et immunologiques, etc.
Le coût élevé de la recherche "in vivo" et le temps de mise en œuvre obligent le plus souvent à limiter les essais "in vitro"(5). Les essais "in vitro" doivent toujours) être complétés par des essais "in vivo" (5)
= Matériel et méthode =
Choix du matériau : le phosphate tricalcique.
Le chirurgien est souvent confronté au traitement de pertes de substances osseuses, qu'elles soient d'origine congénitale, traumatique, orthopédique, infectieuse ou tumorale. Plusieurs matériaux sont disponibles. Le phosphate tricalcique connu pour ses propriétés de bio-réactivité (21), constitue un matériau de choix pour répondre aux besoins des praticiens, ses applications ont été nombreuses (28).
Le phosphate tricalcique convient pour le comblement des lésions osseuses, pour favoriser la réparation et l'induction tissulaire et pour le traitement de surface d'implants métalliques ou céramiques pour améliorer l'ancrage des matériels implantés.
Le phosphate tricalcique disparaît des lieux d'implantation par deux processus : biodégradation de la céramique par dissolution des joints de grains et bio-résorption des grains de la céramique. Il peut ainsi aider et induire la régénération tissulaire naturelle. La vitesse de bio-résorption est toutefois fonction :
Choix du site d’implantation.
Le développement des structures embryonnaires ou fœtales, la différenciation fonctionnelle d'organes ou de fragments d'organes adultes, la biocompatibilité des matériaux peuvent être étudiés de façon simple chez l'animal.
L'expérimentateur doit disposer d'un site de greffe ou d'implantation bien délimité, facile à identifier même au terme d'une expérience de longue durée, plusieurs semaines, éventuellement plusieurs mois.
De nombreux sites ont été proposés pour étudier le comportement in vivo des matériaux utilisés en Odontologie ; notre travail propose la région sous-capsulaire rénale du rat albinos de souche Wistar, espace virtuel accessible à la microchirurgie sous anesthésie générale (31).
Il nous a paru utile, de connaître d'abord l'animal (il faut se plier à ses exigences pour s'en servir utilement et établir ses caractéristiques pour en faire un sujet d'expérience) et de préciser la structure du site d'implantation.
Choix de l’animal : Le rat albinos de souche Wistar.
Les animaux de laboratoire prennent une importance sans cesse croissante dans la recherche scientifique ; le rat en particulier est très utilisé dans divers domaines. L'élevage des rats dans le laboratoire constitue un exemple frappant ; il est contrôlé, rationalisé, sous alimentation synthétique, dans un milieu artificiel, à température, aération et humidité réglables.
Le rat albinos est l'un des plus petits animaux de laboratoire, il est économique, requiert peu d'espace et peu de nourriture ; on peut aussi en utiliser un grand nombre pour une expérience donnée, sa vie est courte et sa puberté précoce (15, 31).
Malgré des conditions d'existence artificielles le rat albinos continue à vivre et à se reproduire en captivité depuis de nombreuses générations et il joue un rôle d'auxiliaire précieux de la recherche scientifique. Comme chaque espèce animale, le rat présente un intérêt pour l'étude des sciences comparées : anatomie, physiologie, pathologie... Il héberge des parasites et des microbes transmissibles à l'homme et aux animaux et a permis de mieux connaître certains d'entre eux(15, 31).
Le rat albinos de souche Wistar est très utilisé pour l'étude de la biocompatibilité des matériaux. La cancérologie doit beaucoup aux rats ; ces animaux sont sensibles aux tumeurs spontanées ou provoquées (15, 31).
Habitation.
L'habitat des rats nécessite le maintien de la température entre 24°C et 26°C pour permettre la reproduction toute l'année, les écarts brusques de température sont dangereux et risquent de provoquer des pneumonies (15, 31).
Les rats sont soumis à une aération, à l'humidité dont le degré le plus favorable est situé entre 40% et 70% et à un éclairage de 12 heures par jour. La lumière est distribuée par des ampoules électriques ordinaires ou par des lampes émettant des rayons ultraviolets.
Les rats sont entretenus dans des cages disposées, le plus souvent, sur des rayons formés de cornières métalliques, fixées aux murs ou suspendues au plafond. Il semble intéressant de les agencer en blocs mobiles, sur roulettes, de 12 à 15 cages par exemple, ce qui facilite le nettoyage. Pour l'examen des animaux, une table ou une paillasse est réservée à cette indispensable opération périodique.
L'intérieur d'une cage doit être aménagé de façon à permettre l'alimentation et la reproduction des animaux. Une litière est indispensable tant aux jeunes qu'aux adultes (15, 31). Le besoin d'activité est en relation avec les phénomènes vitaux. Un rat doit pouvoir aller, venir et surtout ronger.
Nutrition.
Le régime alimentaire pour les rats de laboratoire doit remplir deux conditions :
Les rats se nourrissent d'aliments composés essentiellement de céréales, de farines de viandes, d'os de poisson, de poudre de lait entier ou écrémé, etc. À ces produits de base sont associés en faible quantité des sels minéraux, de l'huile de foie de morue, de la levure de bière... L'eau de boisson doit être fournie à satiété (15, 31).
Reproduction.
La consanguinité qui permet la création de lignées « pures » est une méthode très utile par son action sur le génotype et sur le phénotype des animaux. Les animaux de laboratoire doivent toujours être choisis dans des lignées issues d'un même couple (31). Le rat albinos est apte à la fécondation et à la reproduction dès l'âge de trois mois mais il est préférable d'attendre quatre mois. On choisit un jeune rat robuste qu'on laisse dans une cage pendant quelques jours avec 3, 4 ou 5 femelles. Dès qu'une femelle est pleine, on l'isole dans une cage à deux compartiments où elle prépare son nid avec des débris de coton ou de copeaux (15, 31).
Dans le laboratoire où nous travaillons, il est de coutume de mettre ensemble deux femelles et un mâle. L'isolement a lieu dans des cages simples.
La durée de gestation est de vingt et un jours, la rate met bas 4 à 5 petits dépourvus de poils et aveugles pendant onze à treize jours. L'allaitement est assuré pendant deux semaines. Moins d'un mois après la naissance, les jeunes rats s'alimentent normalement et peuvent être séparés de leur mère. Dès l'âge de trois à quatre mois ils peuvent servir à l'expérimentation. Une femelle reproduit tous les trois mois, quatre portées sont donc possibles chaque année (15, 31).
Caractères généraux du rein du rat.
Bien qu’il soit organisé différemment de celui de l’homme, chez le rat, comme chez tous les mammifères, le rein est délimité par une capsule conjonctive. Cette formation contient des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses végétatives. À l'intérieur de cette capsule, le parenchyme rénal se répartit en deux zones principales, la zone corticale et la zone médullaire dans laquelle on individualise une portion externe et une portion externe (18).
Dans les deux zones principales des structures épithéliales d'origine mésodermique sont disposées dans un interstitium conjonctif qui est plus abondant dans la zone médullaire. Cet interstitium sert de voie de passage aux vaisseaux sanguins et lymphatiques. L'artère rénale donne naissance à un dispositif en arcade localisé au niveau de la face profonde de la zone corticale : des branches artériolaires se détachent de cette arcade vasculaire pour assurer l'irrigation de la zone corticale d'une part et de la zone médullaire d'autre part. Les dispositifs veineux et lymphatiques présentent la même répartition.
La zone corticale contient les néphrons, unités morphologiques et fonctionnelles, qui élaborent l’urine et contiennent un dispositif endocrine ; la zone médullaire contient principalement les canaux excréteurs qui s'ouvrent dans le bassinet rénal (31).
Structure d’un néphron.
Chaque néphron comprend deux zones, le corpuscule de Malpighi et le tube urinaire dans lequel on individualise trois segments, le tube contourné proximal, l’anse de Henlé, le tube contourné distal.
Structure du corpuscule de Malpighi.
À peu près circulaire sur les coupes, il possède un pôle vasculaire et un pôle urinaire qui s'ouvrent dans le tube urinaire ; il est délimité pas une structure amorphe, la capsule de Bowmann, formation épithéliale pavimenteuse dont la face externe est doublée par une lame basale et un réseau de fibres de réticuline étroitement associé à la charpente fibrillaire de l’interstitium rénal. La face externe de la capsule de Bowmann délimite la chambre glomérulaire, cavité d'autant plus irrégulière qu'elle est occupée par le glomérule rénal, dispositif complexe formé de capillaires étroitement associés à deux groupes de cellules, le mésangium d'une part dans sa portion centrale, les padocytes d'autre part, qui séparent les capillaires de la chambre glomérulaire (31).
Au niveau du pôle vasculaire du corpuscule ou observe une artériole afférente et une artériole efférente. L’artériole afférente se ramifie en branches qui donnent chacune naissance à des capillaire dont le trajet est très sinueux : ils confluent pour donner naissance aux petits vaisseaux origine de l’artériole efférente. L'ensemble des capillaires de ce flocule est occupée par le mésangium où des cellules polymorphes, sécrétoires et phagocytaires sont disposées dans une matrice homogène.
L'endothélium des capillaires est fenêtré, parfois traversé par des expansions cytoplasmiques des cellules mésangiales. En dehors de la zone mésangiale, cet endothélium est doublé par une lame basale constituée de trois feuillets. C'est par l'intermédiaire de cette zone que les capillaires sont associés à un revêtement épithélial continu et plicaturé, paroi interne de la chambre glomérulaire. Ce revêtement est formé par les padocytes cellules qui possèdent des expansions cytoplasmiques ramifiées dont les extrémités sont associées à la lame basale des capillaires. Au niveau du pôle urinaire les cellules de la capsule de Bowmann sont associées aux premières cellules de la paroi du tube urinaire (31). 
Structure du tube urinaire.
Chacun des segments de ce tube a une paroi épithéliale, doublée par une lame basale et un réseau de fibres de réticuline. Le tube contourné proximal possède une lumière délimitée par des cellules légèrement prismatiques : ce sont les néphrocytes dont le pôle apical porte une bordure en brosse très importante dont le glycocalix est riche en enzymes et dont le pôle basal a un aspect strié, aspect lié aux expansions cytoplasmiques occupées chacune par une mitochondrie.
L’anse de Henlé fait suite au tube contourné proximal : elle présente une branche descendante dont la lumière est délimitée par des cellules aplaties dont le pôle apical est hérissé de nombreuses micro-villosités et une branche ascendante à paroi formée de cellules cubiques ou légèrement prismatiques : leur pôle basal est d’aspect strié.
Le tube contourné distal est localisé dans la portion la plus externe de la zone corticale. Dans sa portion disposée au voisinage du pôle vasculaire du corpuscule de Malpighi, l’épithélium qui délimite sa lumière est épaissi : c’est la macula densa étroitement associée à une zone épithélioide de la paroi de l’artère afférente, formant ainsi l’appareil juxta-glomérulaire. La paroi du tube contourné distal est constituée de cellules cubiques dont le pôle basal a un aspect strié (18).
Structure des tubes excréteurs.
Ils prennent naissance dans la portion externe de la zone corticale et résultent de la confluence de plusieurs tubes contournés distaux. Ils traversent toute l’épaisseur de la zone corticale et confluent au niveau de la zone médullaire pour donner naissance à des canaux collecteurs de diamètre croissant. Leur paroi est constituée de cellules épithéliales qui deviennent légèrement prismatiques au fur et à mesure qu’augmente le diamètre tubulaire (31).
Notions histophysiologiques.
L’élaboration de l’urine résulte d’un double processus. La filtration glomérulaire donne naissance à l’urine primitive dont la composition est proche de celle du plasma sanguin, sauf en ce qui concerne les protéines. Cette filtration est régulée par les cellules du mésangium.
Les cellules du tube urinaire sont caractérisées par des propriétés de réabsorption et de perméabilité qui permettent la formation de l’urine définitive. Les néphrocytes du tube contourné réabsorbent l’eau, le sodium, le glucose, les acides aminés, des phosphates et des lactases contenus dans l’urine primitive. La branche descendante de l’anse de Henlé est perméable à l’eau et aux électrolytes alors que la branche ascendante, imperméable à l’eau, assure la réabsorption du sodium qui est rejeté dans l’interstitium. La concentration de l’urine se termine au niveau du premier segment des tubes excréteurs. 
L’aldostérone contrôle la fonction de la branche ascendante de l’anse de Henlé : l’hormone antidiurétique contrôle la réabsorption de l’eau au niveau des tubes excréteurs.
L’appareil juxta-glomérulaire élabore la rénine qui provoque la transformation de l’angiotensinogène d’origine hépatique en angiotensine dont la forme définitive angiotensine II a une action vasoconstrictrice.
Le parenchyme rénal élabore au niveau de l’interstitium différentes substances parmi lesquelles l’érythropoïétine qui règle la production de globules rouges. La richesse en vaisseaux de cet interstitium et les cellules conjonctives qu’il contient font que le parenchyme du rein peut être le siège de réactions immunitaires (31).
Structure du site d’implantation.
Chez l'embryon, le blastème méta-nephrogène, portion non segmentée du mésoderme intermédiaire postérieur, donne naissance à deux groupes de structures visibles au terme de l'organisation du rein :
, La capsule rénale, structure conjonctive étroitement appliquée à la surface de l'ensemble de l'organe.
Dans le cas le plus schématique chez le rat, la capsule est constituée de deux plans collagènes, fibres à disposition plexiforme et lames collagènes, le plan le plus interne est séparé du cortex rénal par une couche discontinue de fibroblastes. La même organisation est visible entre les deux plans fibreux dont le plus externe est directement associé au tissu adipeux péri-rénal (18, 31, 45).
Dans certaines zones de la capsule, les cellules conjonctives sont plus nombreuses entre les deux plans fibreux, elles sont alors disposées autour des artérioles et des capillaires (figures 1 in 31).
Technique expérimentale.
Préparation des implants.
Le matériau.
Notre choix s'est orienté vers une poudre de phosphate tricalcique. Nous avons utilisé pour cette étude un produit commercial de grande pureté : Rectapur (pureté supérieure à 99%) des laboratoires PROLABO, les impuretés étant le plomb (0,002%), le fer (0,005%), le chlore (0,02%), l'oxyde sulfurique (0,1%). Avant d'être utilisée la poudre est desséchée à 300 °C.
Mise en forme des échantillons.
La poudre est finement broyée puis additionnée de quelques gouttes d'alcool polyvinylique afin d'assurer la cohésion entre les particules, elle est ensuite
compactée à l'intérieur d'un cylindre d'alumine de 3 mm de diamètre et sur une longueur de 3 à 4 millimètres.
Les cylindres de phosphate tricalcique obtenus sont portés à 600 °C (la montée en température est lente et régulière, elle se fait à la vitesse de 1 °C par minute), les échantillons sont maintenus à cette température durant deux heures, afin d'éliminer le liant organique sans détruire la cohésion de la pièce. Les échantillons sont ensuite portés à 800 °C (la vitesse de montée en température est de 5°C par minute), ils sont maintenus à cette température pendant deux heures pour leur permettre d'acquérir une certaine dureté.
Les bâtonnets cylindriques obtenus ont été usés par des billes d'alumine pour leur donner une forme à peu près sphérique d'environ 2 à 3 millimètres de diamètre. Ainsi mises en forme ces billes subissent alors un dernier traitement thermique à 1 350 °C (la vitesse de montée en température est de 5 °C par minute) qui leur confère leur microstructure finale. La recherche de fissures ou de craquelures résultant du frittage est effectuée et les échantillons endommagés sont éliminés (37).
Analyse par diffraction x.
Pour interpréter les résultats il existe des fiches qui comportent les caractéristiques nécessaires. Les chiffres relevés sur le diffractogramme sont conformes à ceux de la fiche A.S.T.M. ("American Society For Testing Materials") n° 969 a. Le spectre obtenu correspond bien à celui du phosphate tricalcique (37).
Analyse au microscope électronique à balayage.
L'examen au microscopique électronique à balayage du matériau étudié a été réalisé à l'aide d'un microscope JEOL équipé d'un système d'analyse en énergie, sous une tension de 25 kV. L'analyse de la bille de phosphate tricalcique au MEB indique la présence d'une granulométrie évaluée inférieure à 10 micromètres avec prédominance de grains fins. Il en résulte une taille des pores inférieure à 50 micromètres (37).
Analyse par microsonde.
La microanalyse met en évidence le caractère biphasique du matériau et révèle la présence des deux éléments principaux, le calcium et le phosphore (40).
L’implantation sous capsulaire rénale.
Les lots de rats.
Notre choix s’est porté sur le rat albinos de souche Wistar entretenue au Laboratoire d'Histologie et d'Embryologie de l'UFR 3 des Sciences Médicales en lignée consanguine depuis 1966, à partir d'un seul couple. Ces animaux vivent dans des cages collectives. La température du local est maintenue à 24-26 °C, l’éclairage est régulier (12 heures par jour).
L'alimentation est équilibrée, de qualité constante, composée de blé, d'arachide, de soja cuit, de poisson, de sang, de levure, de lait, de sucre, de graisse : ce complexe est supplémenté en sels minéraux (formule U.A.R.) et enrichi en vitamines. Elle est dure et présentée sous forme de cylindres, elle est mise dans un espace prévu pour cet effet. La dose quotidienne est à peu près 30 grammes. L'eau est fournie à volonté dans des flacons ressemblant aux biberons.
Dans le stock animal mis à notre disposition nous avons utilisé 32 rats adultes et mâles, pour éviter toute perturbation liée au cycle endocrinien. Leur poids varie entre 360 grammes et 450 grammes, ils sont répartis en 4 groupes de 8 rats. Chaque lot comporte quatre individus prélevés dans l'animalerie préopératoire et transférés en salle d'opération.
Instrumentation.
Elle est classique. Le plateau comprend :
- des ciseaux ;
- des presselles ;
- une pince à disséquer mousse ;
- une pince à petites griffes ;
- une aiguille et fils de suture ;
- une poire à air pour réanimation
… etc.
Anesthésie.
L'anesthésie générale de l'animal est réalisée à l'aide de bacs contenant du diéthyloxyde (éther), elle est complétée au moment de l'intervention par de l'isofluorane appliqué à la demande avec un masque de Foren. Deux à trois minutes suffisent pour obtenir une bonne anesthésie. Cette technique se révèle être la meilleure, le taux de mortalité est réduit comparativement à l'anesthésie par injection intra-péritonéale.
Pesée des rats.
Chaque rat a été pesé afin de suivre l'évolution de son poids au terme de l'expérimentation.
Identification des animaux.
Après anesthésie, afin de différencier les animaux, nous avons établi un code selon le nombre dans la série : OI (oreilles intactes), ODF (oreille droite fendue), OGF (oreille gauche fendue), OF (oreilles fendues), ODC (oreille droite coupée), OGC (oreille gauche coupée), OC (oreilles coupées).
Technique chirurgicale.
Après avoir relevé le poids des animaux, nous procédons au rasage et à la désinfection du flanc gauche à l'alcool. Toute l'intervention est ensuite conduite stérilement. Le choix s'est porté sur le rein gauche du fait de l'accès plus facile car son pédicule est plus long, en outre le rein droit est proche du foie.
Après incision des plans cutané et musculaire du flanc gauche, le rein est extériorisé par traction sur le tissu adipeux péri-rénal particulièrement abondant au voisinage du pôle inférieur de l'organe.
Sous examen microscopique, la capsule rénale est incisée sur 5 mm de long, dans une zone non vascularisée, au voisinage du pôle supérieur et sur la face ventrale du rein. À l'aide d'une spatule mousse, elle est décollée du parenchyme rénal sur une longueur de 8 à 10 mm et une largeur de 7 à 8 mm.
La structure conjonctive doit être décollée du parenchyme rénal à la surface duquel elle est apposée. L'incision, le décollement de la capsule rénale et la mise en place de l'implant ne doivent pas provoquer d'hémorragie d'origine capsulaire ou parenchymateuse pour que la cicatrisation ultérieure évolue de façon simple.
La bille de phosphate tricalcique, déposée au niveau de l'incision capsulaire, est poussée à l'aide de la spatule dans l'espace créé entre la capsule et le parenchyme, le rein est ensuite remis en bonne position dans sa loge.
Puis on procède à des sutures en deux plans : pour le plan musculaire nous avons utilisé des fibres résorbables, alors que pour le plan cutané notre choix s'est porté sur du fil en soie.
L'opération a lieu dans des conditions d'asepsie et d'antisepsie optimales. Après intervention, les animaux sont placés dans des cages par groupe de 4 rats et laissés libres de leurs mouvements, ils sont entretenus sans régime alimentaire spécial.
Récupération des reins.
Pesée des rats.
Nous avons pesé régulièrement les rats afin d'étudier le retentissement de l'implantation du matériau sur l'évolution du poids des animaux.
Prélèvement des reins.
Les animaux ont été sacrifiés par groupe de 8 rats à 1 mois, 2 mois, 3 mois et à 6 mois. Les règles d'asepsie sont similaires à celles appliquées pour l'implantation des billes en phosphate tricalcique.
Les rats sont placés dans une enceinte contenant une forte concentration d'éther qui entraîne une syncope terminale en 1 à 2 minutes.
Une incision oblique latéro-dorsale, placée entre l'épine iliaque et le gril costal, parallèle à la première incision, permet de découvrir le plan musculaire puis la loge rénale. Nous examinons attentivement le rein et les différents organes au voisinage immédiat et à distance. Le rein est extériorisé de la cavité abdominale, ensuite nous sectionnons son pédicule, l'organe récupéré, porteur de l'implant, est déposé dans du liquide de Bouin.
Pour la conservation des organes plusieurs liquides sont proposés, mais au cours d'une expérimentation la règle est de se plier aux conditions de travail du laboratoire d'accueil, le liquide utilisé est de manipulation courante.
Préparation des prélèvements.
Chaque prélèvement après sacrifice bénéficie d'un examen macroscopique minutieux. Cet examen intéresse également les billes en phosphate tricalcique.
Préparation des reins.
Pour l'examen au microscope optique, tous les reins sont traités de façon identique.
Fixation.
L'histologie permet d'étudier la morphologie des tissus vivants. Donc le premier problème à résoudre après le prélèvement des tissus est leur fixation. Cette manipulation comprend la mort du tissu et l’immobilisation de ses structures et ses composantes dans un état semblable à l'état vivant.
Nous avons utilisé le liquide de Bouin qui est considéré comme un excellent fixateur, il est d'utilisation courante en histologie. Le liquide de Bouin est composé d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, de formol et d'acide acétique.
Après fixation dans le liquide de Bouin, une coupe sagittale du rein le divise en 2 parties, une des 2 parties comporte l'implant en phosphate tricalcique.
Déshydratation.
Les prélèvements sont déshydratés à l'aide d'alcools, éclaircis par le toluène et imprégnés dans la paraffine.
Enrobage.
Le tissu rénal imprégné de paraffine est inclus dans un bloc de paraffine, le bloc est ensuite sectionné, en coupe d’une épaisseur, au moyen d’un microtome.
Coupes au microtome.
Nous avons utilisé le microtome rotatif de Minot. Le rasoir est fixe et la pièce se déplace verticalement pendant la réalisation des coupes. Sous l'action de la chaleur produite par le frottement avec le rasoir, la paraffine fond légèrement, ce qui permet d'avoir une adhérence des coupes les unes aux autres pour former un ruban, nous obtenons ainsi un grand nombre de coupes à partir d'un même bloc.
Étalement des coupes.
Les tissus inclus dans la paraffine sont fortement comprimés pendant la coupe ; afin d'atténuer cette compression on procède à l'étalement des coupes. On utilise une plaque chauffante dont la température est à 30 °C, sur laquelle on dépose les lames que l'on recouvre de liquide d'étalement à base d'eau distillée et d'albumine. On y place les coupes, puis on les étale, les plis qui demeurent sont enlevés à l'aide d'aiguilles à dissection. À la fin de l'opération on absorbe l'excès de liquide avec un papier buvard et enfin on laisse les lames sécher sur la platine.
Coloration.
On procède d'abord au déparaffinage et à l'hydratation des coupes ; pour que les colorants puissent pénétrer dans le tissu, il faut en retirer la paraffine et l’imprégner d'eau. On commence par passer les coupes dans des bains de toluène pour éliminer la paraffine. La deuxième étape consiste à commencer par des bains de 5 minutes à 10 minutes dans l'éthanol à différents degrés suivis d'un traitement de 5 à 10 minutes dans l'eau.
La coloration permet de mettre en évidence les noyaux, le cytoplasme et les fibres de collagène ; elle permet ainsi de se faire une idée de la topographie générale du tissu. Le temps nécessaire à la coloration varie énormément d'une méthode à l'autre. Dans cette étude nous avons utilisé deux techniques de coloration : le trichrome de Goldner et le trichrome de Masson.
Ces deux méthodes dérivent de la technique du trichrome de Mallory, elles reposent sur les différences de perméabilité qui existent entre les fibres de collagène et les autres éléments acidophiles du tissu. Elles comprennent l'utilisation, en séquence, de fuchsine acide, d'acide phosphomolybdique et du bleu d'aniline (ou vert lumière) et elles permettent la coloration : des noyaux, chromatine et nucléoles en bleu foncé à noir, du cytoplasme en rouge, des globules rouges et granulations éosinophiles en rouge, du collagène en bleu (bleu d'aniline) ou en vert (vert lumière).
Montage.
Les coupes sont montées de façon classique. Les lames sont groupées par lots qui correspondent aux jours des prélèvements et sont observées au microscope optique muni d'un appareil photographique (Reichert-Zetopan-Microstar IV).
Préparation des billes pour l’analyse.
Pour l'analyse des billes de phosphate tricalcique, nous procédons à la métallisation de la surface par un dépôt de carbone pour l'étude au microscope électronique à balayage. Pour l'analyse par microsonde les billes sont incluses dans la résine.
= Résultats =
Suites opératoires.
Tous les animaux ont survécu plusieurs semaines voire des mois jusqu'aux dates prévues pour leurs sacrifices, ils ont gardé tous leurs caractère, la cicatrisation est parfaite, après 20 jours seule la taille des poils atteste que l'animal a été opéré.
Évolution du poids des animaux.
La croissance pondérale moyenne d'un jeune rat albinos est de 44% en 12 jours, soit une prise de 53 grammes pour un rat d'un poids initial de 120 grammes ; cette augmentation de poids rapide chez le jeune devient lente chez l'adulte. Au cours de nos expérimentations, nous avons constaté que d'une manière générale il y a une augmentation du poids des animaux sauf pour un animal qui a gardé son poids initial et pour deux sujets qui ont perdu du poids, ces deux derniers ont fait des syncopes au cours de l'intervention.
Le contrôle et la surveillance régulière des animaux a permis de relever l’augmentation de leurs poids :
- les deux premiers mois, de 5 à 30 grammes ;
- le troisième mois, de 13 à 40 grammes. Un seul animal a gardé le poids initial, les deux rats qui ont fait des syncopes ont perdu 12 à 22 grammes ;
- dans le sixième mois, de 30 à 75 grammes.
L'évolution du poids des animaux relevée au cours de notre expérimentation correspond aux statistiques du laboratoire. Nous pouvons donc constater que l'implantation sous la capsule rénale du rat n'a pas perturbé la croissance des animaux.
Observations macroscopiques.
Les observations macroscopiques au moment des prélèvements des organes ont permis de mettre en évidence :
- L'implant qui apparaît de forme circulaire, de couleur blanche, disposé à la surface du parenchyme rénal, sous la capsule rénale.
- Les organes au voisinage du rein qui présentent une structure normale. Nous avons pu constater l'intégrité de la cavité abdominale dans tous les cas. Parfois il y a adhésion entre le rein et l'un des organes voisins, sans perturbation des résultats. 
Sur les billes de phosphate tricalcique extraites, on note des fragments de tissus accrochés tout autour.
Résultats histologiques.
L'observation des préparations au microscope est une véritable lecture « à livre ouvert » faite à faible grossissement pour se rendre compte de la disposition relative des diverses structures. Le fort grossissement, employé secondairement, permet l'étude de points particuliers intéressant les « zones frontières » entre la capsule et le parenchyme rénal, la capsule et l'implant, et l'implant et le parenchyme rénal.
L'ensemble des coupes a permis un examen microscopique des différentes réactions cellulaires ou fibreuses présentes au voisinage immédiat et à distance du site d'implantation. Les lames ont été observées dans l'ordre chronologique et groupées par lots correspondant aux jours du prélèvement.
Après 28 jours.
Le tissu rénal a un aspect histologique normal, aucune altération n'a été observée au niveau du tissu épithélial avoisinant la zone d'implantation ou à distance.
Le site est circonscrit par un tissu granulomateux bien organisé, riche en fibroblastes, en vaisseaux néoformés, avec prolifération cellulaire autour du site d'implantation.
Après 64 jours.
On note la présence de fragments de l'implant au voisinage immédiat du site d'implantation. Le tissu granulomateux est mieux organisé. On note le nombre restreint de cellules inflammatoires chroniques mononucléées.
Les différentes observations ne révèlent en aucun cas un enkystement, au contraire on observe des plages de tissus qui témoignent d'une excellente cicatrisation. L'observation des tissus situés à distance de l'implant n'a rien révélé d'anormal.
Après 84 jours.
La question qui nous préoccupe le plus est de savoir si au bout de la douzième semaine, le tissu granulomateux et les cellules inflammatoires disséminées vont disparaître pour laisser place à un tissu parfaitement cicatrisé comme le rapportent les travaux de nombreux auteurs (7).
Il est intéressant de constater qu’après trois mois d'implantation le diamètre du site l a diminué, cette diminution ne peut être liée qu'au caractère biorésorbable du phosphate tricalcique.
Au voisinage immédiat de l'implant la réaction conjonctive est beaucoup plus importante que pour les 2 premiers mois. À distance de l’implant les différentes structures rénales sont intactes, toutes ces observations témoignent que l'implant est parfaitement toléré.
Après 168 jours.
On met en évidence une réaction fibreuse importante tout autour du lieu d’implantation. La présence de cette formation fibreuse est vraisemblablement liée aux propriétés d'induction du phosphate tricalcique. La cicatrisation des tissus est parfaite et le site est bien stabilisé.
L'aspect déchiqueté de la périphérie du site d'implantation (dû à l'élimination de la bille avant la coupe) prouve l'adhésion du matériau aux tissus.
Les plages de tissu cicatriciel diffèrent totalement de l'aspect des tissus observés les premiers mois. Le parenchyme rénal avoisinant ou à distance du site d'implantation ne présente aucun signe anormale d'inflammation, on note l'état normal des tubules rénaux et des corpuscules de Malpighi.
Interprétation des résultats histologiques.
Les 32 rats opérés sont restés vivants alors que le pourcentage de perte des animaux dans le laboratoire est de 2 à 5 %.
Il nous faut reconnaître que les conditions idéales d'intervention sont rarement réunies dans une expérimentation animale. Nous avons échappé aux servitudes qui en découlent et restons très satisfaits des résultats positifs obtenus.
La cicatrisation de l'incision est rapide pour tous les animaux opérés, seule la taille des poils au niveau du flanc gauche atteste que les rats ont été opérés.
L'évolution du poids des animaux correspond aux statistiques du laboratoire, la légère diminution observée pour deux rats peut être attribuée au fait que ces deux animaux ont fait des syncopes au cours des interventions, l'augmentation lente pour les autres animaux est normale car nous avons utilisé des rats adultes.
L'aspect normal des organes vitaux au voisinage du rein et les observations déjà citées prouvent que la technique expérimentale utilisée est menée dans des conditions optimales.
La présence de particules de phosphate tricalcique au niveau du site d'implantation témoigne du caractère bio-réactif de ce matériau sous la capsule rénale. La diminution du diamètre des billes en phosphate tricalcique confirme les résultats observés par d’autres auteurs (en milieu biologique ce matériau subit une dissolution). Nous regrettons de ne pas avoir utilisé une poudre à granulométrie grossière et un mode d'usinage qui met en œuvre un produit de liaison calcinable à basse température.
Dans les premières semaines qui suivent l'intervention, la présence de cellules inflammatoires disséminées s'inscrit dans les suites opératoires normales, à l'évidence leur nombre diminue dans le temps pour devenir nul à 12 semaines (7). Il est donc réconfortant de constater que même avec des réactions inflammatoires résiduelles au bout des premières semaines, il se produit des formations collagéniques intéressantes qui apportent la preuve du caractère régressif de l'inflammation à ce stade.
L'aspect déchiqueté des sites d'implantation associé à l'irrégularité des frontières qui rappelle un aspect en carte de géographie est une des preuves qu'il y a eu réaction entre le biomatériau testé et le site receveur.
La mise en évidence de cellules conjonctives et de plages de tissus stabilisés est vraisemblablement liée aux propriétés d'induction cellulaire que possède le phosphate tricalcique.
L'aspect déchiré de la périphérie des sites d'implantation témoigne de l'adhésion à l'interface matériau-tissus et du début de colonisation des vacuités, vacuités résultant de la dissolution de particules du phosphate tricalcique par les cellules conjonctives néoformées. 
Dans tous les cas l'aspect du tissu rénal est resté normal, aucune altération n'a été mise en évidence au niveau des tissus épithéliaux et conjonctifs au voisinage immédiat ou à distance du site d'implantation.
Analyse des implants après expérimentation.
Les échantillons de phosphate tricalcique ont été extirpés après 1, 2, 3 et 6 mois d'implantation, observés et analysés au microscope électronique à balayage (JEOL). La métallisation de la surface des échantillons a été assurée par un dépôt de carbone. La caractérisation au microscope électronique à balayage a été effectuée sur des échantillons fracturés et d'autres non fracturés. 
La microstructure interne du matériau fracturé rappelle singulièrement celle du départ (existence de pores entre les grains) et semble indiquer que le cœur de l'échantillon n'a pas été modifié même après 6 mois d'implantation. Aucun changement n'a été révélé dans la structure interne de la bille (40). 
Les micrographies de la surface des échantillons non fracturés sont extrêmement complexes, toutes les billes sont recouvertes par du tissu rénal ce qui rend difficile l'analyse de la structure de surface de la bille sauf par endroits où nous n'avons pas rencontré de différence significative de la structure externe après implantation par rapport à celle du départ.
L'évaluation de la concentration en éléments calcium et phosphore dans un échantillon après six mois d'implantation a été effectuée par la microsonde EDAX couplée au microscopique électronique à balayage. La microanalyse permet d’évaluer qualitativement et même quantitativement les éléments constitutifs du matériau, elle complète toujours l'observation au microscope électronique à balayage et permet d'obtenir des micrographies qui mettent en évidence les raies cqrqct2ristiaues des différents éléments présents dans le matériau analysé. Parfois une raie est masquée par une autre, la lecture de la micrographie devient alors difficile.
L’analyse des éléments calcium et phosphore a été effectuée sur des échantillons enrobés dans la résine. Cinq zones différentes de dimensions 40 micromètres x 30 micromètres ont été analysées au cœur de l'échantillon et à sa surface.
Une variation très nette de l'intensité de la raie K de l'élément calcium est observée lorsqu'on passe de la surface de l'échantillon au cœur de celui-ci. Le rapport des intensités des raies K passe de 6,30 (cœur de l'échantillon) à 4,5 (surface) avec une bonne reproductibilité. Bien qu'elles ne correspondent pas au rapport atomique Ca/P, ces valeurs sont toutefois significatives d'une résorption des ions Ca2+ par les tissus environnants (37).
= Discussion =
Le nombre de rats utilisés dans des conditions opératoires identiques, joint au nombre de coupes histologiques réalisées, confirment in vivo, la constance des résultats d'évaluation "en lecture directe".
L'absence de mortalité et l'évolution normale du poids des animaux sont des critères suffisants pour justifier l’intérêt du site choisi.
Il est encourageant de constater que l'implantation du phosphate tricalcique sous la capsule rénale ne perturbe pas la croissance des animaux.
Le site choisi répond aux conditions idéales d'implantation. Quatre à cinq jours après leur implantation, les éléments cellulaires ou tissulaires et les fragments d'organes sont vascularisés à partir de la capsule (31).
Les conclusions de cette expérimentation sont tirées d'observations histologiques qualitatives. La moindre toxicité au niveau de la zone épithéliale et au niveau du tissu conjonctif se serait traduite par des micro-abcès, l'expulsion des implants et des nécroses qui auraient provoqué la mort des animaux (31). Ces états n'ont jamais été observés durant les expérimentations. Au contraire, les structures rénales sont souvent en contact avec l'implant mais rigoureusement intactes.
Contrairement à des implants en alumine et en zircone, implantés sous la capsule rénale de rats pour une période de un mois qui ont laissé place à des sites parfaitement réguliers (1), les billes en phosphate tricalcique que nous avons testées ont entraîné un déchirement des sites d'implantation qui leur donne une allure crénelée. Il est intéressant de constater qu'à proximité des sites les réactions tissulaires sont différentes.
Les réactions tissulaires observées au niveau des sites d’implantation, témoigne la bonne tolérance des implants à morphologie adaptée. Les implants laissées en place pendant un mois sous la capsule rénale de rats n'ont entraîné aucune réaction négative identifiable, alors que pour la même période, des échantillons en zircone et en Dacron qui présentent des bords irréguliers ont provoqué des réactions à cellules géantes (1).
La réaction granulomateuse et les cellules inflammatoires disséminées, ont régressé dans le temps pour laisser place à un tissu parfaitement stabilisé et cicatrisé. Ces observations ont été affirmés, après implantation des matériaux inertes et très stables, l'alumine et la zircone, au niveau des muscles paravertébraux de rats pour une période de douze semaines (7).
La propriété majeure des phosphates tricalciques est leur biorésorption associée à une bioréactivité au contact des tissus vivants (32, 46). Après implantation de phosphates tricalcique dans les fémurs et les muscles para-vertébraux de chiens, on constate que la biodégradation du phosphates tricalcique est plus rapide au niveau du tissu osseux (27).
La diminution du volume des billes de phosphate tricalcique et la diminution de la concentration de calcium à la surface des billes sont des preuves que le site permet d’observer les mêmes réactions que dans les sites standardisés.
Les implants n'ont pas été colonisés, ceci peut être attribué au diamètre insuffisant des pores, car pour une colonisation cellulaire rapide le diamètre souhaité doit être au minimum compris entre 50 micromètres et 150 micromètres (9), or comme nous l'avons cité le diamètre maximum des pores présents dans les billes de phosphate tricalcique implantées est de 50 micromètres.
Ce modèle expérimental confirme les propriétés du phosphate tricalcique. La résorbabilité modulée du matériau, compensée par une activation cellulaire périphérique, situe l'intérêt de ce site d’implantation. La dissolution complète du phosphate tricalcique n'est pas observée dans nos résultats, ceci est vraisemblablement liée au mode d'usinage des billes, nous n'avons pas utilisé au cours de la préparation des billes des produits dégradables pour laisser des pores de diamètres suffisants.
= Conclusion =
La zone sous capsulaire rénale nous a permis d'observer des phénomènes rapportés par d'autres auteurs au niveau des site différents. Nous avons mis en évidence les propriétés du phosphate tricalcique grâce aux coupes histologiques des zones d'implantation après un mois, deux mois, trois mois et six mois.
Aux questions que nous pouvions nous poser au départ nous pouvons répondre :
- l'animal choisi peut être une proposition pour commencer d'autres travaux sur des animaux plus évolués tel le chien, le mouton le porc etc. ;
- la structure du site d'implantation associée aux fonctions de l'organe et à son caractère très réactogène sont des arguments amplement suffisants pour indiquer un tel choix ;
- la présence de tissu collagène est le résultat des propriétés inductrices du phosphate tricalcique mises en évidence par de nombreux auteurs ( 27, 40, 46).
Trente deux animaux ont été opérés, puis sacrifiés, par groupe de 8, à 1, 2, 3 et 6 mois, pour examen macroscopique des reins et des tissus avoisinants, suivi du prélèvement des organes pour l'étude histologique en microscopie optique et de l'extraction des implants pour examen au microscope électronique à balayage. Les suites opératoires ont été normales compte tenu de l'augmentation du poids des animaux et de la bonne cicatrisation des tissus dès les premiers jours.
Les reins ont été traités de manière identique par les techniques histologiques classiques, l'examen des coupes au microscope optique confirme des résultats globaux identiques sur toutes les lames. Nous avons noté l'absence de réaction de rejet, l'absence d'encapsulation semblable à celle qui isole un corps étranger. Dans tous les cas, la tolérance tissulaire est confirmée par la normalité des cellules parenchymateuses et la continuité de la capsule rénale au voisinage immédiat et à distance de l'implant.
La microanalyse met en évidence une diminution de la concentration en calcium à la surface des implants au terme de l'expérimentation.
Nous pouvons conclure que le protocole arrêté, joint à l'exploitation d'un site original d'implantation constitue un modèle expérimental. Comparativement aux autres expérimentations, les résultats obtenus dans notre travail sont satisfaisants et constituent un point de départ pour d'autres travaux utilisant d'autres moyens d'investigation.
La zone sous capsulaire rénale permet de retrouver facilement l'implant, les moyens d'investigations étant en plein progrès il peut paraître intéressant d'analyser l'interface biomatériau-tissu dans le temps au niveau de la zone sous capsulaire rénale d'un animal tout en le conservant vivant.
= Bibliographie =